KR100246681B1 - 종양, 탄수화물 항원에 특이한 모노클로날 항체 및 세포계 - Google Patents

종양, 탄수화물 항원에 특이한 모노클로날 항체 및 세포계 Download PDF

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아그네타 시그리드 탠너펠트
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Abstract

본 발명은 CA-242 항원과 반응하는 모노클로날 항체를 제공한다. 이 항체는 ECACC 기탁번호 90012601호의 하이브리도마 세포 C242:Ⅱ 또는, 그의 인공적인 또는 자발적인 변이체를 배양하여 얻을수 있다. 본 발명은 또한, 항체를 생산하는 세포계를 제공한다. 항체는 치료학적및 진단학적 목적에 유용하다.

Description

종양, 탄수화물 항원에 특이한 모노클로날 항체및 세포계
본 발명은 모노클로날 종양항원에 특이한 신규한 항체, 상기 항체를 생산하는 세포계, 상기 모노클로날 항체를 함유하는 제약조성물, 진단과 치료를 위한 상기 항체의 용도및 상기 세포계의 항체 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
쾰러와 밀슈타인(Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975)에 의해 처음 언급된 모노클로날 항체 제조를 위한 하이브리도마 기술은 오늘날 잘 확립되어 있다. 이 기술에 의하여 골수종 세포는 특정한 항원으로 면역되어진 동물의 임파구에 융합된다. 생성된 하이브리도마 세포는 단일 항원성 결정인자에 특이한 항체를 만든다. 그러므로, 모노클로날 항체는 넓은 범위로 면역 분석용 표준 진단키트의 종래의 항혈청들을 대체하기 시작하였다. 또한, 하이브리도마 기술을 치료목적에 적용하기 위해 많은 연구들이 실시되었다.
정상적인 조직세포의 종양세포로의 형질전환이 세포 표면의 탄수화물 구조변화와 결합되어 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. 많은 탄수화물 구조가 항원의 대용이 되고, 종양으로 변성된 구조는 소위 종양 결합형 항원(TAA) 형태를 나타낸다. 세포표면 탄수화물 구조는 지질의 일부와 결합하여 당지질이 되거나 단백질 또는 펩티드와 결합하여 각각 당단백질 또는 당펩티드가 된다. 이러한 2가지 형태의 일반명은 당결합체이다.
종양에 결합된 당결합 항원은 인간 종양질환과 관련이 있는 것으로 이미 알려져 있다. 그러므로, 에피토프 CA 19-9를 보유하는 2개의 암 결합 항원인 태생기암 항원(CEA) 및 위암항원(GICA)이 특히 위암에서 나타나는 반면, 또 다른 세번째 에피토프 CA-50은 일반적인 암항원인 것으로 보인다. 이들 항원 모두는 종양세포 표면에서 분비되고 혈청에서 볼 수 있다. 이러한 발견은 종양 특이성 항원을 인식하여 여러가지 암질환의 면역위치및 면역치료에 사용될 수 있는 모노클로날 항체에 대한 연구를 고무하였다.
췌장암과 결장직장암 특이성을 가지는 모노클로날 항체는 이전의 몇몇의 문헌과 C242(항원 CA-242에 해당하는)하의 회의초록에 언급되어 있다(Larsson L. N. 등, Int. J. Cancer 42 (1988) 877-882; Lindholm L. 등, "An Immuno-radiometric Assay (IRMA) for the CA-50 antigen", Tumor Marker Antigens, Ed. Jan Holmgren, Studentlitteratur 1985, Haglund C. 등, Br. J. Cancer 60 (1989) 845-51, Sell S., Human Pathology 21:10 (1990) 1003-19, Johansson C. 등, Int. J. Cancer 48 (1991) 757-763, 및 Kuusela P. 등, Br. J. Cancer 63 (1991) 636-640). 그러나, 이러한 C242 항체는 이전에는 보다 상세하게 또는 이 분야의 기술에 숙련된 사람들에 의해 제조될수 있을 정도로 기재된 적이 없었고, 지금까지는 공공연하게 입수할 수도 없었다.
본 발명은 위장, 특히 췌장및 결장직장 암세포에 대해 상당한 특이성을 가지는 이하에서 C242:Ⅱ로 표시되는 신규한 특이 모노클로날 항체에 관한 것이다.
C242:Ⅱ는 이하의 실시예 1에 상세하게 기재된 바와 같이 인체의 결장 선암세포계로 면역화된 쥐의 비장세포를 쥐의 골수종 세포계 Sp2/0와 융합하여 얻어진 하이브리도마 세포를 적절한 배지에서 배양하여 생상된 IgG 클래스의 쥐의 모노클로날 항체이다. C242:Ⅱ 항체를 생산하는 하이브리도마 세포계는 부다페스트조약에 따라 1990년 1월 26일자로 영국 샐리스베리 윌셔어 포톤 다운의 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research에 기탁번호 90012601호로 기탁되었다. 이 기탁에 대한 첨부서는 1990년 7월 20일자의 국제특허출원 PCT/SE91/00496(국제공개-A-9201470)에서 작성되었다.
본 발명은 모노클로날 항체 C242:Ⅱ 또는 실질적으로 동일한 특성을 가지는 항체, 즉 작용등가물인 이하에서 "본 발명에 따른 항체"로 기재한 신규한 모노클로날 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 생산할수 있는 세포계, 특히 상기한 기탁번호 90012601호의 하이브리도마 세포계를 제공한다.
"실질적으로 동일한 특성" 및 "작용등가물"이란 항체가 기탁번호 90012601호의 세포계에 의해서 생산되는 것과 적어도 실질적으로 동일한 면역특이성을 가지는 것, 즉 동일한 항원성 결정인자 또는 에피토프에 결합하여 그 부위에 결합을 위해 C242:Ⅱ 항체와 경쟁하는 것을 의미한다.
"본 발명에 따른 항체"의 범위에는 항원에 결합한 항체의 절편들도 포함된다. 이러한 절편들은 분절되지 않은 면역글로부린의 결합능력과 특이성을 유지하고, 예를들면 펩신 등의 단백질 가수분해효소에 의해 항체를 분해하여 얻을 수 있다. 후자의 방법은 F(ab')2분자와 상기한 항원결합 절편의 일예인 더작은 펩티드 F(ab')2부분을 발생시킨다. 또한, 항체의 유도된 또는 인체화된 형태뿐만 아니라 유전자 조작기술에 의해 생산된 상응하는 항체 또는 절편도 포함된다. 쥐 또는 기타의 동물로부터 유도된 항체및 동일한 특이성을 가지는 상이한 Ig 클래스/서브클래스도 포함된다. 항체에 활성인 절편과 재조합방법으로 생산된 변이체와 관련하여 독특한 클래스/서브클래스 특이 결정인자는 구조내에서 다소 생략될수 있으므로 본 발명에 따른 항체의 클래스/서브클래스는 덜 중요하게 된다. 그러므로, 본 발명의 개념은 인체이외의 항체 전체와 인체 항체 전체에 이르며 상이한 키메라 형태를 포함한다. 인체 항체 전체는 고정된 인체 항체를 생산하는 세포를 배양하여 얻을 수 있다.
본 발명은 기탁된 하이브리도마 세포계에 의해 생산된 항체의 결합친화력/화합력이 10+1배, 어떤 경우 10-1배인 CA-242 항원/에피토프를 가지는 항체를 포함한다. 문제의 교차반응성은 일반적으로 이 분야에서 생각될수 있는 차단/결합분석법에 의해 측정된다. 이들 친화력/화합력 범위는 특히 분절되지 않은 비유도성 인체이외 항체에 적용한다.
상기한 유전자 조작기술과 관련하여, C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 라이트및 헤비사슬의 가변영역중의 cDNA는 이하의 실시예 4에 기재한 바와 같이 클론되었다. 이것을 보다 상세하게 기술하기 전에 항체, 즉 클래스 G의 면역글로부린의 일반적 구조를 나타낸 첨부도면중 제1도를 참고하여 기본적인 면역글로부린 구조단위에 대하여 간단한 일반적인 설명을 하는 것이 적절할 것이다.
제1도와 관련하여, 면역글로부린은 디설파이드 결합과 "Y"자형 대칭구조내의 다양한 비공유결합력에 의하여 결합되어 있는 4개 사슬, 즉 2개의 동일한 라이트(L) 폴리펩티드 사슬과 2개의 동일한 헤비(H) 폴리펩티드 사슬로 이루어져 있다. 헤비사슬 각각은 가변분역(VH)을 가지며 일군의 불변분역(CH)이 뒤따르고 있고, 각각의 라이트사슬은 한쪽 말단에는 가변분역(VL)을, 다른쪽 말단에는 불변분역(CL)을 가진다. 라이트사슬은 각각 카파(kappa)와 람다(lambda)로 표시되는 2가지 유형이 있다. 라이트사슬의 가변분역은 헤비사슬의 가변분역과 일직선으로 맞추어져 있고, 라이트사슬의 불변분역은 헤비사슬의 제1 불변분역과 일직선으로 맞추어져 있으며 라이트사슬과 헤비사슬의 가변분역은 항원 결합부위를 이룬다.
라이트사슬과 헤비사슬의 가변분역은 4개의 프레임 영역 또는 FR들 사이에 끼어있는 상보성 결정영역 또는 CDR이라고 불리우는, 각각 3개의 초가변영역을 함유하는 동일한 일반구조를 가진다. 각 가변분역의 CDR은 프레임 영역에 근접하여 있고 CDR의 2개 세트는 모두 항체의 특이성을 나타낸다.
C242:Ⅱ 항체의 라이트사슬및 헤비사슬의 가변부분의 cDNA를 클론하기 위해서, 먼저 cDNA 파아지 라이브러리를 기존의 방법으로 C242:Ⅱ로부터 제조하였다. 헤비사슬과 카파 라이트사슬의 불변부분에 해당하는 혼성화 프로브 각각이 폴리머라제 사슬 반응(PCR)과 적절한 프라이머를 이용하여 마우스 게놈 DNA로부터 제조되었다. 생성된 프로브는 C242:Ⅱ 항체의 헤비사슬과 카파사슬을 코드하는 DNA 시퀀스를 함유하는 cDNA 클론에 대해 cDNA 라이브러리를 선별하는데 사용되었다. 양성적으로 혼성화한 파아지 클론을 증식시키고 cDNA를 플라스미드 형태로 절제하였다. 후자는 제한효소 맵핑에 의해 특성화되었고, 예상된 크기의 삽입물을 함유하는 플라스미드가 시퀀스되었다. CDR 영역을 결정하기 위해서, 예를들면 Kabat E. A. 등(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, 1987)이 규명한 바와 같이 CDR 영역의 염기성 위치를 고려하여 시퀀스된 삽입물에 의해 코드된 아미노산 시퀀스를 기지의 마우스 카파및 헤비사슬과 비교하였다. 그 결과, 각 사슬의 CDR이 다음과 같은 아미노산 시퀀스를 가지는 것을 알았다(제 3도및 제 4도):
카파사슬/라이트사슬
CDR1:
ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
(TrpPhe)
CDR2:
ArgMetSerAsnLeuValSer(GlyVal)
CDR3:
LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr(PheGly)
헤비사슬
CDR1:
(PheThr)TyrTyrGlyMetAsn
CDR2:
(MetGly)TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLys
Gly(ArgIle)
CDR3:
(AlaArg)ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal(TrpGly)
말단의 괄호안에 있는 디펩티드 잔기는 CDR 시퀀스중의 임의로 변이될수 있는 것이다. 제3도의 카파사슬은 그 CDR의 아미노말단 한계가 잘 규명된 것을 의미하는 cys 잔기를 함유하였다.
상기 CDR을 코드하는 DNA 시퀀스를 제4도에 나타내었다. 이러한 CDR 아미노산및/또는 DNA 시퀀스에 대한 지식으로 이 분야에 숙련된 사람들은 종래 기술에서 알려진 바와 같은 부분 돌연변이법을 이용하여 C242:Ⅱ 항체의 CDR영역을 다른 항체 또는 항체절편의 클론된 가변부분에 삽입할 수 있을 것이다. "CDR 이식(Grafting)"이라고 알려진 이러한 방법은 수용항체 또는 절편의 시퀀스를 코드하는 CDR을 C242:Ⅱ 항체의 시퀀스를 코드하는 CDR의 DNA 레벨로의 치환을 포함하며, 그 결과 C242:Ⅱ 모노클로날 항체에 해당하는 특이성을 가지는 항체 또는 항체절편을 생성하였다. 그러므로, 본 발명에 따른 항체의 범위에는 상기에서 정의된 CDR 시퀀스나 작용항체 프레임 영역에 이식되어 기탁번호 ECACC 90012601호의 하이브로도마 세포에 의해 생산되는 항체와 교차 반응하는 임의의 CDR 아미노산 시퀀스를 함유하는 항체 또는 항체절편이 포함된다.
본 발명에 따른 항체는 CA-242로 표시되는 종양에 결합된 항원에 대한 것으로, 이것은 상기한 항원 CA-50과 같은 거대분자로 발현된 시알릴레이트된 탄수화물 항원인 것으로 보인다. 구조적으로, 이 항원은 본 발명에 따른 항체가 시알레이트된 루이스(Lewis)-물질 또는 시알로실락토-N-테트라오스와 반응하지 않는데 있어서 CA-50 에피토프와는 다르다. 그러나, CA-50에 대한 모노클로날 항체는 CA-50에 본 발명의 항체의 결합을 저해할수 있고 CA-50과 본 발명에 따른 항체에 의해 인지되는 항원 사이에 구조적 관련성을 나타낸다. 종양에 결합된 항원 CA-242는 결장-직장 종양 거의 대부분에서 발현되고 정상적인 결장조직에서는 약하게 발현되거나 없다.
본 발명에 따른 항체의 세포결합 항원에로의 결합에 따르면, 이렇게 생성된 항원-항체 복합체는 세포로 엔도사이토스되거나 내부이행될수 있다. 이것이 기탁된 C242:Ⅱ 항체의 탁월한 특성이다.
본 발명의 항체에 의해 인지되는 항원이 정상적인 췌장조직과 결장조직에서 매우 빈약하게 발현되기는 하나 췌장암 세포와 결장선암 세포에서는 강력하게 발현된다. 그러므로, 본 발명의 항체는 인체의 췌장암과 결장암의 치료뿐만 아니라 국소면역에 사용될수 있다.
본 발명은 면역성 분석이나 면역요법에 있어서 본 발명에 따른 신규한 항체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 함유하는 제약조성물을 제공한다.
본 발명의 신규한 항체에 근거한 시험관내 시험용 면역성 분석은 이 분야에서 일반적인 면역학적 기술에 따라 설계될 수 있는데, 즉 본 발명의 항체를 표지화 또는 비표지화된 형태로 사용하는 것과 시험될 샘플중의 특이성 항원종과 항체의 복합체 생성물을 정량하는 것이다. 전자의 경우에 항체는 방사성 표지물, 화학적 발광물질, 형광물질 또는 효소표지물 등의 검출용 표지물로 표시될수 있는 반면, 후자의 경우에 항체는 표지화된 기질과의 복합체에 의해서 또는, 예를들면 표면 세포질 유전자 공명에 근거한 바이오센서법 등의 비표지화 기술에 의해 검출된다. 샘플은 혈청 등의 체액 또는 조직 제조물(조직화학적 분석)형태 모두 가능하다.
생체내 진단목적을 위해서, 본 발명의 항체는 방사능 표지물이나 중금속원자 등의 외부에서 검출가능한 적절한 표지물과 함께 준비하여 환자에게 투여한 후에 인체중에서 이 국소화된 항체의 축적량을 정량한다.
치료학적 용도를 위해 본 발명의 신규한 항체는 물과 같은 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 다양한 제약조성물및 제제 형태로 제조될수 있고 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 등, 여러가지의 종래 경로로 투여될수 있다.
다음의 비제한적인 실시예에서는 본 발명에 따른 신규한 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조, 면역해부학적 평가에 있어서 이들의 용도, 이들의 엔도사이토시스및 C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 라이트사슬과 헤비사슬을 코드하는 cDNA의 클로닝 등을 기재하였다.
참고로 첨부된 도면에서,
제 1도는 일반적인 면역글로부린 G의 구조를 도해한 것이고,
제 2도는 C242:Ⅱ 세포의 엔도사이토시스를 나타낸 그래프이고,
제 3도는 상응하는 아미노산 시퀀스를 따라 C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 카파사슬의 가변분역을 코드하는 상세한 cDNA 시퀀스를 나타낸 것이고,
제 4도는 상응하는 아미노산 시퀀스를 따라 C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 헤비사슬의 가변분역을 코드하는 상세한 cDNA 시퀀스를 나타낸 것이다.
[실시예 1] 하이브리도마 세포계의 구축 및 C242:Ⅱ의 제조
[구축된 비장 세포의 제조]
American Type Culture Collection(ATCC, 록크빌, Md., 미국)에 기탁번호 CCL 222호로 기탁되어 시중에서 구입가능한 인체 결장직장암 세포계, COLO 205를 10% 소태아 혈청(FCS)을 첨가한 아이스코브(Iscove)의 MEM에서 배양하였다. 서브배양후 보통 2 내지 3일에 합류전에 세포를 거두어서 면역용 인산 완충식염수로 3회 세척하였다.
4 내지 6주된 BALB/c 마우스를 PBS 0.1㎖에 현탁된 3×107COLO 205 세포를 복막내로 투입하여 면역시켰다. 그리고 나서, 이 쥐에 다시 3×107COLO 205 세포 현탁액 0.1㎖를 투여하고 4일후 희생시켜 비장을 분리하였다. 분리한 비장을 단일세포 현탁액으로 분해하였다.
[하이브리도마의 제조]
상기한 세포 현탁액으로부터 얻어진 1.2×108의 비장세포를 2개의 시험관에 분배하였다. 각각의 시험관에 마우스 골수종 세포계 Sp2/0(ATCC-CRL 1581)의 골수종 세포 108을 추가로 첨가하였다. 2개의 시험관을 원심분리하고, 액체를 따라내었다. 그리고 나서 각각의 시험관에 37℃의 PEG 용액(Mw 4000 PEG 10g, DMSO 1㎖및 모노클로날 식염수 10㎖) 2㎖를 교반하면서 1분동안 천천히 첨가하였다. 이 시험관들을 물중탕조에 옮겨 37℃에서 90초동안 천천히 교반하였다. 각각의 시험관에 다음과 같이 생리완충액을 첨가하여 융합을 중단시켰다: 최초 30초동안 2㎖, 다음 30초동안 6㎖, 그 다음 1분동안 32㎖, 배양배지중의 세포 현탁액을 세척한후, 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘(HAT)을 보충한 배양배지 총100㎖중에 현탁하였다. 배양배지는 10% FCS, L-아스파라긴(36㎎/ℓ), L-아르기닌-Hcl(116㎎/ℓ), 폴린산(10㎎/ℓ), L-글루타민(292.3㎎/ℓ), 피루베이트산 나트륨(110.1㎎/ℓ)및 머캡토에탄올(3.49㎕/ℓ)이 첨가된 아이스코브 MEM이다. 분액 50㎕를 96-웰 조직배양 접시의 웰에 분배하였다. 이 웰들을 HAT를 첨가한 배양배지중의 BALB/c 마우스(2×104세포/㎖)의 대식세포 현탁액 250㎕로 먼저 덮었다. 배지를 융합 6일후에 교환하였다.
[항체 분비 하이브리도마의 선별]
사용된 상기 6일째의 배지를 Kennett R. H.("염화폴리비닐 플레이트에 부착된 세포를 이용한 효소에 결합된 항체 분석", Monoclonal Antibodies, Hybridomas, A new dimension in biological analyses, Eds. H. R. Kennett, T. J. McKevin, K. B. Bechtol, Plenum Press, New York, 1980)가 기재한 바와 같이 COLO 205 양성항체에 대해 시험하였다. 요약하면, Nunc 면역플레이트 Ⅱ F형의 웰을 웰당 2×105세포, 즉 50㎕의 COLO 205 세포(1㎎/100㎖ PBS)로 피복하였다. 상기한 6일째의 사용된 배양배지를 피복된 웰 50㎕/웰에 첨가하였다. 실온에서 하루밤동안 항온처리한 후 1% BSA-PB에 희석시킨(1/500) 항-마우스Ig를 접합시킨 퍼옥시다제(Dakopatts P260, Dakopatts A/S, 코펜하겐, 덴마크) 100㎍/웰을 첨가하여 실온에서 하루밤동안 항온처리하였다. 30% 과산화수소 5㎕를 첨가한, pH5.0, 시트르산 완충액 12㎖에 용해시킨 4 OPD-tablets Dako S2000형태의 기질 100㎖/웰을 첨가하여 항온처리한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
대략 600개의 하이브리도마 클론이 시험되었다. 먼저, 이들중 190개가 COLO 205 세포와 반응하였다. 이들중에서 177개는 노르웨이, Nyegaard A/S의 Lymphoprep로 제조된 정상적인 인체 림프구와 반응하였고 이들은 페기되었다. 남아있는 클론들중 하나에서 구축된 클론을 하이브리도마 C242로 표시하였고 IgG1류와 동형상이었다. 다음으로, 수회의 서브클로닝 단계를 실시하여 C242:Ⅱ로써 표시되는 클론을 생산하는 안정한 최종 모노클로날 항체를 제조하였다.
따라서, C242 하이브리도마를 먼저 클론하여 C242:5 클론을 생성하였다. 이 클론을 차례로 클론하여 C242:5:2 클론을 제조하였다. 이 클로닝 모두에서 하이브리도마 현탁액은 4 세포/㎖의 밀도로 하이포크산틴/티미딘(HT)을 보충시킨 배양배지로 희석되었다. HT가 보충된 배지중의 BALB/c 마우스 대식세포 현탁액(5×103대식세포/웰) 250㎕로 미리 피복된 96-웰 배양접시의 각 웰에 50㎕(0.2세포)를 분배하였다. 2 내지 5일후 단일세포 클론들이 현미경의 외관검사로 검출되었다. 6일째에 배지를 교환하고 사용한 배지의 분액을 상기한 ELISA에 의해서 정상적인 인체 세포가 아니라 COLO 205 세포에 결합하는 항체량을 분석하였다. 정상세포 ELISA에서 음성반응을 유지하면서 COLO 205 ELISA에서 양성반응함에 의하여 가장 우수한 클론을 선택하여 다음 단계를 위해 액체질소하의 바이알중에 동결시켰다.
3차 클로닝을 실시하기 위하여 세포를 융해하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(5% FCS)에서 배양하였다. 웰당 평균밀도가 3세포가 되도록 96-웰 조직배양 플레이트의 웰에 세포를 접종하였다. 클로닝은 5% FCS와 공급용 세포로써 사용된 마우스 대식세포를 포함하는 DMEM에서 실시되었다. 이 플레이트에서 비탁법에 의한 IgG 생성및 상기한 ELISA에 의한 항체의 특이성에 대한 16개 클론의 시험에서 30개 클론이 발생하였다. 이들중 12개의 클론은 IgG를 생상하는 것이 발견되었다. IgG 제조와 특이성에 대해 사용된 배지를 시험한 24-웰 조직배양 플레이트에서 10개의 클론을 증식시켰다. 이러한 선택은 비교적 높은 생산성으로 4개의 클론이 절약되었다. 이들 4개 클론의 최종 생산성 시험을 이중 조직배양 플라스크에서 실시하였다. 가장 높은 생산성을 보이는 클론을 선택하여 C242/CL 510 A1으로 표시하였다. 다음에 사용하기 위해 이것을 액체질소중에 동결하였다.
클론 C242/CL 510 A1의 1차 클로닝은 일반적인 마우스 IgG ELISA에서 희석도 1:1000에서의 흡광도 0.1 이하에 의해 판단할 때 ⅓의 세포가 IgG를 생산하지 않았음을 나타내었다. 5개의 양성 서브클론을 모아서 클론 C242:I을 제조하였다. 이 클론의 생산성을 일반적인 HPLC 분석으로 정량한 결과, 1㎖당 마우스 IgG 150㎍이었다.
이어서, 클론 C242:I을 96-웰 접시에서 클론하여 마우스 IgG 생산에 대해 모두 양성인 33개 클론을 얻었다. ㎖당 150㎍ 이상을 얻는, 상기 클론중 5개를 모아 안정한 IgG 생산성을 가지는 C242:Ⅱ로 표시되는 최종 클론을 얻었다. HPLC 분석한 결과, C242:Ⅱ의 생산성은 ㎖당 마우스 IgG 196㎍이었다. 세포를 동결하여 액체질소중의 바이알에 보관하였다. 제조된 C242:Ⅱ 하이브리도마 샘플을 기탁번호 90012601호로 ECACC에 기탁하였다.
[C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 제조]
상기에서 제조된 하이브리도마의 처음 세포 현탁액을 동결된 바이알로부터 얻었다. 2×104세포/㎖(C242:Ⅱ 하이브리도마)의 밀도로 총면적 6000㎠의 Nunc A/S를 가지는 조직배양 챔버에 세포를 접종하였다. 세포를 아이스코브(Iscove N. N. 및 Melchers F., J. Exp. Med., vol.147, p923 (1978))에 따라 변성된 DMEM에서 배양하고 겐타마이신 1%, 아미노산 보충물 1%및 소태아혈청 5%를 첨가하였다. 그리고 나서 세포를 8% CO2를 함유하는 가습된 대기중에서 37℃로 4 내지 5일동안 항온처리하였다. 항온처리를 끝낸후 세포수를 세고 샘플은 모노클로날 항체 농도결정에 사용되었다. 세포배양 상징액을 따라버리고 현탁된 세포를 제거하기 위해 셀룰로오스 필터로 여과하였다. 분자량 30,000을 끊는 막을 이용하여 밀리포어 펠리칸 한외여과 세포로 한외여과하여 상징액을 20 내지 30배로 농축하였다. 농축물로부터의 샘플을 C242:Ⅱ 모노클로날 항체 농도및 항원 반응성 분석에 사용하였고, 이때 모노클로날 항체 농축물은 정제할때까지 -70℃에 보관하였다.
[C242:Ⅱ 모노클로날 항체의 정제]
프로테인-A-세파로스R4B(파마시아 AB, 읍살라, 스웨덴)를 겔의 팽윤과 세척에 대한 제조업자의 지시에 따라 제조하고, 상기에서 제조된 C242:Ⅱ 항체 농축물을 1.5M 글리신-NaOH, 3M NaCl, pH3.9를 결합 완충액으로 하여 여기에 결합시켰다. 같은 완충액으로 1차 세척한 후에 친화성 컬럼을 0.1M 시트르산 -NaOH, pH 5.0으로 용출하고 C242:Ⅱ 모노클로날 항체를 1몰/ℓ 트리스-HCl, pH 8.0을 함유하는 시험관에 수집하였다. 얻어진 항체를 0.02M 인산 완충액, 0.15M NaCl, pH 7.2, 0.2g/ℓ NaN3용액중에서 투석하였다. 투석된 C242:Ⅱ 항체를 분자량 30,000을 끊는 막을 이용하여 한외여과하여, 농축하였다. 샘플을 취한후에 농축및 품질분석을 위해 C242:Ⅱ 모노클로날을 -20℃로 보관하였다.
[실시예 2] 결장직장암과 정상조직중의 C242:Ⅱ에 대한 면역조직화학 평가
환자에게서 외과적 절제로 초기 결장직장암 조직과 여러가지 정상조직 시편을 얻었다. 이 조직들을 빙냉하에 보관하였고 액체질소로 미리 냉각시킨 이소펜탄중에서 절제후 1시간이내에 동결시켰다. 조직을 박편할 때까지 -70℃로 보관하였다. 동결된 생검조직들을 5㎛의 절편으로 잘라서 +4℃에서 30초동안 50% 아세톤중에 고정하고 이어서 4℃에서 5분동안 100% 아세톤중에 고정하였다. 이 절편들을 공기건조하고 10분동안 PBS로 세척하였다. 모든 절편을 PBS에 용해된 0.3% 과산화수소중에서 5분동안 항온처리하여 내인성 퍼옥시다제를 차단하고 PBS로 2회 세척하였다. 그리고 나서 이 절편들을 정상적인 돼지혈청으로 처리하고 +4℃에서 5분동안 PBS-4% BSA로 1:10으로 희석하여 항체의 비특이적 결합을 차단하였다.
항체를 포함하는 모든 항온처리는 실온에서 30분동안 습윤대기중에서 실시되었다. 절편들은 먼저 실시예 1에서 얻어진 PBS-4% BSA중의 모노클로날 항체 C242:Ⅱ와 항온처리되었고, 다음으로 2% 돼지 항토끼 면역글로부린을 함유하는 PBS-4% BSA중에 1:400으로 희석시킨 바이오틴이 결합된 말 항마우스 IgG(VectastainTM, Vector Laboratories, 버얼링앰, CA, 미국)와 항온처리하였고, 최종적으로 아비딘 DH/바이오틴 결합 호오스래디쉬 퍼옥시다제 H 복합체(Dakopatts A/S, 코펜하겐, 덴마크)와 항온처리하였다. 각각의 항온처리후, 슬라이드를 PBS중에서 15분동안 세척하였다. 그리고 나서 이 절편들을 15분동안 기질로 처리하여 PBS로 세척하고 헤마톡실린(haematoxylin)으로 반염색하여 글리세롤-젤라틴(Merck, 담슈타트, 독일)을 봉입하였다. 기질로는 디메틸설폭시드 6㎖에 용해하여 pH 5.5, 0.02M 아세트산나트륨 50㎖로 희석시킨 30% H2O24㎖를 함유하는 3-아미노-9-에틸카바졸(Sigma, 세인트루이스, MO, 미국)10㎎이 사용되었다. 기질용액은 사용전에 여과되었다. 절편들을 시험하여 그 결과를 다음 표 1에 기재하였다.
표 1에서 보이는 바와 같이, 결장직장 종양의 시험된 생검물중 63%가 모노클로날 C242:Ⅱ로의 염색에서 양성반응을 나타내었다. 정상적인 결장조직에서 항원 CA242의 발현은 일반적으로 종양조직에서 보다 더 약한 것으로 나타났는데 염색은 거의 원주 상피와 배상세포에 국한되었다. 정상 결장조직이 아닌 것은 모노클로날 C242:Ⅱ와 반응성이 거의 없는 반면, 정상적인 흉관, 췌장관, 담즙관 및 한선은 양성으로 나타났으나 염색도는 약하였다.
[실시예 3] COLO 205 인체 결장암에 결합한 C242:Ⅱ의 엔도사이토시스
다음과 같이 엔도사이토시스 분석을 실시하였다: 단일층 배양체로 성장된 COLO 205 세포(실시예 1 참조)로부터 단일세포 현탁액을 제조하였다. 세포의 항트립신성을 파괴하고 잘 세척하여 배양배지에 재현탁하였다. 요오드로 표지화된 실시예 1의 C242:Ⅱ 항체(모노클로날 항체 50ng 대하여 200,000cpm)를 5㎖ 시험관중의 COLO 205(106세포) 단일세포 현탁액에 첨가하였다. 최종부피는 200㎖/시험관이었다.
세포를125I-C242 존재하의 빙냉(0℃)중에서 1시간동안 항온처리하였다. 이 현탁액을 원심분리하고 세포들을 결합되지 않은 모노클로날 항체가 없도록 세척하였다. 미리 항온처리된 세포를 다시 1시간동안 10분간격으로 37℃에서 항온처리하여 세포가 매시간 재냉각되고 펠렛화되었다. 상징액으로부터 배양배지로 방출된 방사능 표지물이 측정되었다(LKB gamma counter, 파마시아 AB, 읍살라, 스웨덴). 또한 상징액에 대하여 TCA 침전을 실시하고 침전물의 방사능을 측정하였다. 표면에 결합된125I-C242를 2.5㎎/㎖ 파파인을 함유하는 pH1.5, 0.2M 글리신-HCl 완충액으로 산세척하여 제거하였고 내화(內化)된125I-C242로 나타나는 방사능을 측정하였다. 37℃에서 항온처리된 매시간후에 표면에 결합된 항체의 양은 표면에 결합된 모노클로날 항체 총량에서 방출되고 내화된 모노클로날 항체를 감하여 계산하였다. 방출된 항체의 분해는 배지 상징액의 TCA 침전으로부터 측정되었다.
그 결과는 COLO 205 세포에 의한125I-C242:Ⅱ의 엔도사이토시스를 도시하여 제 2도에 나타내었고, 세포표면의 방사능("Sur"), 내화된 방사능("Int"), 방출된 방사능("Res")및 분해되어 방출된 방사능("Deg. Re")은 세포표면의 초기 방사능 총량의 퍼센트로 표시되었다. 제 2도에서 C242:Ⅱ의 내화 20%이상이 미리 항온처리된 세포를 37℃에서 항온처리할때 1시간이내에 얻어진 것임을 알 수 있다. 배지 상징액을 TCA 침전하였을 때 항온처리 1시간후에 방출된 방사능의 분절화가 거의 없음을 나타내는 소량의 산용해성 방사능이 있었다.
[실시예 4] 모노클로날 항체 C242:Ⅱ의 라이트사슬및 헤비사슬의 cDNA 코딩 부분의 분자 클로닝
A. 총 RNA의 제조
108세포의 총 RNA를 Chomezynksi, P. 및 Sacchi, N. (Anal. Biochem. 162, 156-159, 1987)에 의해 변성된 Chirgwin, J. M. 등(Biochemistry 18, 5294-5299, 1979)의 방법에 따라 제조하였다. 간단히 요약하면, 세포펠렛을 4M 구아니디늄 티오시아네이트, pH7, 25mM 시트르산 나트륨, 0.5% N-라우로일 사코신, 0.1M 2-머캡토에탄올을 함유하는 차가운 분해용액 15㎖에 용해시켰다. 세포를 분해한후, 2M 아세트산나트륨(pH 4.0) 1.2㎖를 첨가하고 이 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(250:49:1)로 추출하였다. 원심분리한후, 총 RNA를 침전시키기 위해서 동 부피의 이소프로판올을 첨가하고 -20℃에서 하룻밤동안 항온처리하여 수성층에서 RNA를 침전시켰다. 원심분리하여 RNA를 재현탁한후, 침전을 반복하고, 추가의 원심분리와 침전을 실시한후, 얻어진 총 RNA는 흡광도에 기초하여 960㎍으로 계산되었다.
B. mRNA의 단리
상기한 총 RNA 제조물로부터 폴리아데닐레이트된 mRNA를 단리하기 위하여 PolyATractTMmRNA 단리시스템(Promega Corporation, 메디슨, 위스콘신, 미국)을 제조업자의 지시(참조: Promega Technical Bulletin, No. 090: 1990)에 따라 이용하였다. 즉, 총 RNA 960㎍을 물에 용해시키고 0.4×SSC(1×SSC=pH7.0, 물 1ℓ당 NaCl 8.77g, 시트르산나트륨 4.41g)에 용해된 바이오티닐레이트된 올리고(dT) 프로브(50 pmoles)로 어닐링하였다. 스트렙트아비딘을 피복시킨 상자성 구슬(Streptavidin MagnesphereTM)을 첨가하고 10분간 항온처리한후, 자성입자들을 제거하고 0.1×SSC 용액으로 수회 세척하였다. 물중에서 항온처리하여 구(球)에서 폴리아데닐레이트된 mRNA를 용출한 결과, 5㎍의 mRNA를 얻었다.
C. 대장균에서 cDNA 파아지 라이브러리의 제조
이중가닥 cDNA의 단방향 클로닝이 가능한 벡터 Uni-ZAPTM(Stratagene Inc. 라 졸라, 캘리포니아)를 변성시킨 Gubler, U.와 Hoffman, B.J.(Gene 25, 263-269, 1983)의 방법에 따라 전단계의 폴리아데닐레이트된 mRNA로부터 cDNA를 제조하였다. 즉, 폴리아데닐레이트된 mRNA 5㎍을 Uni-ZAPTM링커 프라이머(56ng/㎖)로 프라이밍하고 최종농도 0.6mM의 dATP, dGTP, dTTP및 5-메틸-dCTP와 몰론시(Moloncy) 쥐 백혈병 비루스 역전사효소 45U를 첨가하여 단일가닥 cDNA로 전환시켰다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 최종농도 0.15mM의 dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP와 RNA아제 H 3.2U 및 DNA 폴리머라제16.5U를 첨가하고 16℃에서 2.5시간동안 항온처리하여 제2 가닥 cDNA를 합성하였다. 혼합물을 페놀-클로로포름(1:1)으로 추출하고 에탄올 침전하였다. cDNA는 0.16mM dNTP및 T4 DNA 폴리머라제 10U와 함께 37℃에서 30분동안 항온처리하여 그 말단을 둔단하였다. 페놀-클로로포름으로의 추출과 에탄올 침전후에 둔단된 상기 cDNA를 T4 DNA 리가제 3 Weiss U, 1mM ATP를 첨가하고 8℃에서 하루밤동안 항온처리하여 EcoR1 어댑터에 결찰시켰다. 결찰후에 1mM ATP 존재하에 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈 10U를 첨가하고 37℃에서 30분동안 항온처리하여 EcoRI의 점착성 말단에 인산기를 전이시켰다. 인산기가 전이된 EcoRI의 점착성 말단을 가진 상기 cDNA는 Uni-ZAPTM링커 프라이머에 의해 코드되는 시퀀스로부터 Xhol 점착성 말단을 생성하기 위해 Xhol 90U로 분해되었다. 생성된 cDNA를 T4 DNA 리가제 2 Weiss U, 1mM APT 존재하에 Uni-ZAPTMXR EcoRI 및 Xhol이 제조되어 있는 분지 1㎍에 결찰하여 12℃에서 하루밤동안 항온처리하였다. 제조업자의 지시에 따라 Gigapack Ⅱ GoldR패키징 엑스트랙트를 사용하여 결찰 혼합물을 파이지 입자에 채워넣고 생성된 파아지는 대장균 PLK-F' 감염에 사용되었다. 생성된 8.5×104의 독립적인 클론들의 cDNA 라이브러리를 1회 증폭하여 파이지 역가 7.5×108pfu/㎖를 얻었다. 생성된 cDNA 라이브러리를 하기한 바와 같이 대장균 XL1-Blue를 숙주(참조: Bullock. W., Biotechniques 5, 4, 1978)로 하여 선별하였다.
D. 혼성 프로브의 제조
C242:Ⅱ 항체의 IgG1 헤비사슬및 카파사슬을 코드하는 cDNA 클론을 검출하기 위하여 헤비사슬 CHI의 제 1 불변분역과 카파사슬 CK의 불변분역을 덮는 혼성프로브를 Saiki, R. H. 등(Science 239, 487-491, 1988)에 따라 폴리머라제 사슬 반응에 의해 마우스 게놈 DNA로부터 제조하였다. 즉, 상기 면역글로부린 분역을 코드하는 엑손의 5' 및 3' 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로라이머 쌍을 마우스 게놈 DNA의 증식에 사용하였다. 아가로스 겔 전기영동에 의한 정제후에 생성된 DNA 프로브 절편은 Feinberg, A.P. 및 Vogelstein, B.(Anal, Biochem., 132, 6, 1983)에 따른 임의 프라이머 연장법에 의해32P로 표지되었다.
E. 시퀀스를 코드하는 IgG1 헤비사슬과 카파사슬의 선별및 플라스미드에로의 삽입
상기 단계 C의 cDNA 라이브러리는 Sambrook, J. 등(Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 따라 면역글로부린 IgG1및 카파 프로브 각각을 사용하여 단계 D로부터 2개의 분리된 원으로 선별되었다. 2개의 분리된 혼성화물에서 얻어진 양성적으로 혼성화한 파아지 클론들은 처음 선별에서와 같은 프로브를 사용한 재선별에 의해 다시 정제되었다. 양성적으로 혼성화한 파아지 클론들을 대장균 XL1-Blue의 배양체중에서 증식시키고, 생성된 파아지들은 Short, J. M. 등(Nucleic Acids Res., 16, 7583-7600)에 따른 파아지미드 절제및 번식에 의해 pBluescript SK(-) 플라스미드를 제조하는데 사용되었다.
F. 혼성 콜로니에서 플라스미드 cDNA의 특성화
플라스미드를 함유하는 생성된 cDNA를 제한효소 맵핑으로 특성화하고 에상된 크기의 삽입물을 함유하는 플라스미드를 Sanger, F. 등(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463-5467)에 따라 디데옥시 DNA 시퀀싱하였다. Ig 카파 프로브로 혼성화한 플라스미드 pKGE761은 이전에 알려진 마우스 카파 라이트사슬 시퀀스(참조: Kabat, E.A. 등, Sequences of Protein of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health)와 거의 상동인 오픈 리딩 프레임을 코드하는 cDNA 삽입물 시퀀스를 함유하였다. 카파 라이트사슬 가변영역 VK를 코드하는 부분적인 cDNA 시퀀스와 번역된 그 단백질 시퀀스를 제 3도에 기재하였다. 3개의 CDR 시퀀스, CDR1 내지 CDR3를 밑줄로 표시하였다. VK 분절의 아미노터미널 말단앞에 있는 시그널 펩티드는 S로 표시하였다. CK는 VK 시퀀스의 카르복시터미널 말단에 이어진 불변영역을 나타낸다.
IgG1 프로브로 혼성화한 플라스미드 pKGE762는 이전에 알려진 마우스 IgG1 헤비사슬 시퀀스(참조: Kabat, E.A. 등)와 거의 상동인 오픈 리딩 프레임을 코드하는 cDNA 삽입물 시퀀스를 함유하였다. IgG1 헤비사슬 가변영역 VH를 코드하는 부분적인 cDNA 시퀀스와 번역된 그 단백질 시퀀스를 제 4도에 기재하였다. 3개의 CDR 시퀀스, CDR1 내지 CDR3를 밑줄로 표시하였다. VH 분절의 아미노터미널 말단 앞에 있는 시그널 펩티드는 S로 표시하였다. CH1은 VH 시퀀스의 카르복시터미널 말단에 이어진 불변영역을 나타낸다.

Claims (7)

  1. ECACC 기탁번호 90012601호의 하이브리도마 세포계 C242:Ⅱ에 의해 제조되거나 또는 실질적으로 동일한 항원 결합특성인 에피토프 특이성을 가지는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 절편형태인 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 CDR 중에 하기 카파사슬과 헤비사슬을 가지는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
    카파사슬 :
    CDR1 : ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
    CDR2 : ArgMetSerAsnLeuValSer
    CDR3 : LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
    헤비사슬 :
    CDR1 : TyrTyrGlyMetAsn
    CDR2 : TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly
    CDR3 : ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
  4. 항원에 결합된 모노클로날 항체를 함유하는 복합체가 생성될 수 있는 조건하에서 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 하나의 항에 따른 상기 모노클로날 항체와 샘플을 접촉시키는 단계와, 샘플 중에 존재하는 항원의 양과 상관되는 생성된 복합체의 양을 측정하는 단계로 이루어진 시험관 내 진단방법.
  5. 제1항, 제2항 및 제3항중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 그의 항원에 결합한 절편을 생산할 수 있는 세포계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포류가 ECACC 기탁번호 90012601호의 하이브리도마 세포계 C242:Ⅱ, 또는 그의 자발적인 변형체인 세포계.
  7. CDR중에 하기 카파사슬과 헤비사슬을 가지는 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
    카파사슬 :
    CDR1 : ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuTyr
    CDR2 : ArgMetSerAsnLeuValSer
    CDR3 : LeuGlnHisLeuGluTyrProPheThr
    헤비사슬 :
    CDR1 : TyrTyrGlyMetAsn
    CDR2 : TrpIleAspThrThrThrGlyGluProThrTyrAlaGluAspPheLysGly
    CDR3 : ArgGlyProTyrAsnTrpTyrPheAspVal
KR1019930704117A 1991-07-03 1992-07-03 종양, 탄수화물 항원에 특이한 모노클로날 항체 및 세포계 KR100246681B1 (ko)

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