HU218603B - Célspecifikus antitest-szuperantigén konjugátumok és ezen készítmények előállítása - Google Patents

Célspecifikus antitest-szuperantigén konjugátumok és ezen készítmények előállítása Download PDF

Info

Publication number
HU218603B
HU218603B HU9300148A HU14893A HU218603B HU 218603 B HU218603 B HU 218603B HU 9300148 A HU9300148 A HU 9300148A HU 14893 A HU14893 A HU 14893A HU 218603 B HU218603 B HU 218603B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
conjugate
antibody
cells
sea
mab
Prior art date
Application number
HU9300148A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9300148D0 (en
HUT67502A (en
Inventor
Eva Akerblom
Mikael Dohlsten
Gunnar Hedlund
Terje Kalland
Peter Lando
Original Assignee
Kabi Pharmacia Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9002479A external-priority patent/SE9002479D0/xx
Priority claimed from SE9002484A external-priority patent/SE9002484L/xx
Application filed by Kabi Pharmacia Ab filed Critical Kabi Pharmacia Ab
Publication of HU9300148D0 publication Critical patent/HU9300148D0/hu
Publication of HUT67502A publication Critical patent/HUT67502A/hu
Publication of HU218603B publication Critical patent/HU218603B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány olyan oldható antitestkonjugátumokra vonatkozik, amelyekaz antitestet egy olyan szerkezethez kapcsolva tartalmazzák, amely T-sejtek által felismerhető, és képes a T-sejteket az antitest általfelismert célsejtek lizálására irányítani. A konjugátumban alkalmazottszerkezet egy szuperantigén lehet. A célsejtek lizálása úgy történhet,hogy a célsejteket a konjugátum célsejtlizáló mennyiségével hozzákérintkezésbe. Az említett lízis a rák, autoimmunbetegségek és vírusos,baktériumos, gombás vagy parazitás fertőzések kezelésének részétképezheti. A találmány kiterjed a konjugátumok szintézisére és akonjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is. ŕ

Description

A találmány antitestkonjugátumokra vonatkozik, amelyek a citotoxikus T-sejtek (CTL) aktiválására képesek. A konjugátumok olyan nem kívánt sejtek elroncsolására alkalmazhatók, amelyek többek között rákkal, autoimmunfolyamatokkal, valamint paraziták, baktériumok, vírusok és gombák által okozott fertőzésekkel kapcsolatosak.
Az utóbbi években lépéseket tettek annak érdekében, hogy antitesteket olyan ágensekkel kombinálva alkalmazzanak, amelyek közvetlen toxikus hatást fejtenek ki célsejtekre (citotoxikus szerek, citotoxinok), és így szelektíven hatnak a célsejtekre, ezáltal kiküszöbölődik vagy minimalizálódik a más sejtekre gyakorolt nemspecifikus hatás. A javasolt kombinációk például kovalensen kötött komplexektől, amelyek kötést biztosító molekulákat tartalmaznak, nem kovalensen kötött komplexeken át az egyszerű keverékekig terjednek [például Ghose et al., J. Natl. Cancer Inst. 61, 657-676 (1979); Carlsson et al., Biotechnology 7, 567-73 (1989)]. A javasolt citokinek többek között a diftériatoxin, ricin, ricin A alegysége, gelonin, Pseudomonas aeruginosa A exotoxinja (Takeda Chemical Ind. EP-A-336 406 számon közzétett európai szabadalmi bejelentése, Pastan et al. WO-A-88/00703 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentése).
A hibridómatechnika megjelenésével és így a monoklonális antitestek hozzáférhetőségével lehetővé vált, hogy antitestek és citotoxikus ágensek között kialakított komplexek felhasználásával a citotoxikus ágensek az eddigieknél specifikusabban legyenek irányíthatóak a célba veendő sejtpopulációhoz.
A citotoxikus ágensek célsejtektől eltérő sejtekre gyakorolt felismert károsítóhatása ismeretében javasolták, hogy a citotoxikus ágensek immunstimuláló anyagokkal legyenek helyettesítve, amelyek kiváltják a Tlimfociták képződését és aktiválják a CTL-eket. Egyes javaslatok antitestek olyan konjugátumaira vonatkoznak, amelyekben az antitestek kapcsolva vannak (i) olyan antitestekkel, amelyek T-sejt-receptor ellen irányulnak, vagy olyan vegyületekkel, amelyek képesek T-sejt-receptorhoz kapcsolódni (Mass. Inst. Techn. EP-A1-180171 számon közzétett szabadalmi bejelentése);
(ii) olyan vegyületekkel, például antigénekkel, mitogénekkel, más idegen proteinekkel és peptidekkel, amelyek aktiválják a citotoxikus T-sejteket (Neorex Corp. EP-A1-334 300 számon közzétett szabadalmi bejelentése);
(iii) MHC-antigénekkel (Behringwerke AG EP-A1352 761 számon közzétett szabadalmi bejelentése);
(iv) olyan antigénekkel, amelyek ellen a kezelt személy immunitást mutat (Med. Rés. Counc. WO-A90/11779 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentése);
(v) egy meg nem nevezett baktérium enterotoxinnal (Ochi and Wake, UCKA-Symposium: Cellular Immunity and Immunotherapy of Cancers, 1990. január 27.-február 3., Abstract CE 515,109. oldal).
Az eddig javasolt immunstimulátorok azonban vagy túl specifikusak, vagy hatásukban túl általánosak.
így például a klasszikus antigének a 105 T-sejtből mindössze mintegy 1 T-sejtet aktiválnak, míg a mitogének a
T-sejtek nagy részét képesek potenciálisan aktiválni.
Úgy találták, hogy bizonyos ágensek a T-sejtek kisebb részének aktiválását közvetítik, azaz a T-sejteket viszonylag nagy gyakorisággal, de messze nem 100%-ban aktiválják [Fleischer et al., J. Exp. Med. 167, 1697-1707 (1988); White et al., Cell 56, 27-35 (1989)]. Ezek az ágensek hatékonyabb aktivátorok, mint a klasszikus antigének, így ezeket szuperantigéneknek nevezik [áttekintő összefoglaló: Kapper és Marrack, Science 248, 705 (1990)]. Kimutatták továbbá [Dohisten et al., Immunoi. 71, 96-100 (1990); Hedlund et al., Cell. Immunoi., 129, 426-434 (1990)], hogy az eddig ismert szuperantigének képesek kötődni a célsejtek MHC II típusú molekuláihoz és aktiválni az olyan T-sejteket, amelyek megfelelő Tsejt-receptor V-béta-láncot hordoznak. A nyilvánosságra hozott adatok arra utalnak, hogy az MHC-kötés a Tsejt-kötés és aktiválás létrejöttének előfeltétele. Nem zárható ki, hogy a jövőben olyan szuperantigéneket találnak, amelyek T-sejt-receptor V-alfa-láncon vagy más, a T-sejteknek csak egy szubpopulációjánál megtalálható felületi szerkezeten keresztül hatnak.
A Staphylococcus enterotoxin A (SEA) szuperantigén immunszabályozó hatását szintén ismertették [Platsoucas et al., Cell. Immunoi. 97, 371-85 (1986)].
A legtöbb jelenleg ismert szuperantigént korábban taxinként ismerték, és mindegyik mikrobiális eredetű. A Staphylococcus enterotoxinok például enterálisan toxikusak és aktiválják a T-sejteket, a két hatás megkülönböztethető egymástól [Fleischer et al., Cell. Immunoi. 144, 4501-06 (1990); Infekt. Immun. 59, 2126-34 (1991)].
Korábban javasolták a szuperantigéneket az MHC II típusú antigéneket hordozó sejtek CTL közvetítette lízisének irányítására (Pharmacia AB WO-A91/04053 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentése). A WO-A-91/04053 számon közzétett szabadalmi bejelentés oltalmi körébe tartozik, de konkrétan nem említik az olyan szuperantigéneket, amelyek kovalens immunkonjugátumokat tartalmaznak.
Az olyan sejtek azonban, amelyek nem vagy csak csekély mértékben fejeznek ki MHC II típusú proteineket, nem kötődnek kellő mértékben a szuperantigénekhez, hogy lízisüket a CTL-eken keresztül hatékonyan irányítsák. így az MHC II típusú antigéneket hordozó sejtek általános bősége miatt, továbbá mivel a tumorsejteken az MHC II típusú antigének nincsenek bőségben, a szuperantigének az ilyen nem kívánt sejtek specifikus pusztítása szempontjából csekély értéket mutatnak.
Úgy találtuk azonban, hogy CTL-ek által közvetített specifikus sejtpusztító hatás érhető el szuperantigénekkel, ha kovalensen kapcsolódnak olyan antitesthez, amely egy, az elpusztítandó sejtre specifikus epitóp ellen irányul. Az immunrendszer aktiválása indukálhat olyan célsejteket, amelyek nem fejeznek ki MHC II típusú antigéneket, ami fokozhatja a kívánt litikus hatást.
A találmány tárgya tehát (i) új antitestkonjugátumok, amelyek egyrészt egy, a célsejtek elleni antitestet, másrészt egy szu2
HU 218 603 Β perantigént tartalmaznak, azaz olyan szerkezetet, amelyet a T-sejtek, különösen a CTL-ek felismernek (kölcsönhatásba lépnek vele vagy kapcsolódnak hozzá), és amely aktiválja a T-sejteket, különösen a CTL-eket;
(ii) eljárás célsejtek elroncsolására, különösen emlősökön végzett terápiás kezelések kapcsán, továbbá eljárás T-sejtek, mint például CTL-ek specifikus aktiválására;
(iii) eljárás konjugátumok szintézisére; és (iv) gyógyszerkészítmények, amelyek a konjugátumot tartalmazzák, és eljárás a gyógyszerkészítmények előállítására.
A célsejtek elroncsolására vonatkozó módszer magában foglalja a rák, autoimmunitás, vírusos fertőzések, bakteriális fertőzések, gombás fertőzések, parazitás fertőzések és más betegségek terápiás kezelését, aminek lényege az, hogy bizonyos sejteket nagy pontossággal pusztítunk el. A találmány szerinti konjugátumok olyan gyógyszerkészítmények előállítására alkalmazhatók, amelyek az említett betegségek esetén célsejtek elpusztítására alkalmazhatók. A kezelendő emlős általában állat, elsősorban azonban ember.
A konjugátum szuperantigénrésze
Az új antitestkonjugátumok olyan szerkezettel rendelkeznek, amelyet a szuperantigén-T-sejtek felismernek. A konjugátumok általában fiziológiás pH-nál oldhatók, és szérumban in vitro oldhatók.
Előnyös szuperantigének például a Staphylococcus enterotoxinok (SE), mint például a SEA, SEB, SEC, SÉD és SEE, toxoidok, azon aktív fragmensei vagy peptidjei, és más olyan anyagok, amelyek lényegében véve így hatva aktiválják a CTL-eket. Szuperantigének lehetnek más mikrobiális (bakteriális, valamint víruseredetű) termékek is, mint például Staphylococcus törzsek termékei, például toxikussokkszindróma-toxinok (TSST-1), Streptococcusok termékei, például pirogén exotoxin A, és bakteriális exoproteinek, és proteinek, amelyeket Mycoplasma arthridis termel, amely hasonlóan lép kölcsönhatásba a T-sejtekkel, mint a szuperantigének. A szuperantigének úgy állíthatók elő, hogy azok természetes termelőjét vagy genetikailag (rekombináns technikával) manipulált sejteket tenyésztünk, vagy a peptidet szintetizáljuk. A találmány szerinti módszerben alkalmazott szuperantigénnek, ha a bemutatott kísérleti modellben alkalmazzuk, analóg hatást kell kifejtenie, mint amit a kísérleti részben bemutatunk.
Az előnyös szuperantigének potenciálisan képesek a polimorf T-sejtek CTL-ek aktiválásával kapcsolatos felületi proteinjei izomorf alakjainak mintegy 1-40%-ához, különösen a T-sejt-receptor V-béta-lánchoz kötődni.
A konjugátum antitestrésze
Az antitest előnyösen monoklonális (Mab) antitest, bár poliklonális antitest is használható, ha kellően szűk specifitással rendelkezik. Az expressziós antitest kifejezésen általában antitesteket értünk, így idetartoznak az antitestek aktív fragmensei és más olyan molekulák, amelyek egy antitest kötődőképességét utánozzák, feltételezve, hogy megfelelő specifitással, aviditással és a kérdéses célsejtek irányában megfelelő affinitással rendelkeznek. Idetartoznak a genetikailag manipulált (rekombináns úton előállított) antitestek és antitestszármazékok vagy más, hasonlóan kötődő szerkezetek. A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja esetén az antitest tumorsejtek antigéndeterminánsára egy vastagbél-karcinómával kapcsolatos determinánsra (epitópra, szerkezetre) specifikus. Az is elképzelhető, hogy az antitest olyan antigéndeterminánsokra specifikus, amelyek autoimmunitásért felelős sejteken, vírussal fertőzött sejteken, baktériumokon, parazitákon vagy gombákon vagy más, nem kívánt sejteken fordulnak elő. A konjugátum hatékonyságától függően az antitest egy olyan antigén ellen irányulhat, amely belsőleg kapcsolódik az antitesthez a kötődés után, feltételezhető azonban, hogy az ilyen antitestspecifitás nem előnyös.
A találmány kidolgozása kapcsán vizsgált antitestek: a C215 antitest, amely egy, a GA-733 csoportba tartozó antigén ellen irányul [lásd EP-A-376 746 és az abban említett hivatkozások; és Larsson et al., Int. J. Canc. 42, 877-82 (1988)], a C242 antitest [Larsson et al., Int. J. Canc. 42, 877-82 (1988)], valamint a Thy-1.2 antitest [Mab C, Opitz et al., Immunobioi. 160, 438 (1982)]. Feltételezhetően olyan monoklonális antitestek is használhatók, amelyek más célsejtfelületi szerkezetekre specifikusak. Az olyan monoklonális antitestek előállítása, amelyek a kiválasztott célsejtekre egyedi epitópok ellen irányulnak, jól ismert, lásd például a fenti publikációkat. A C242 epitóp vagy C215 epitóp ellen irányuló monoklonális antitest kifejezésen olyan antitesteket értünk, amelyek keresztreagáló epitópokkal reagálnak.
A három eddig vizsgált monoklonális antitest közül a C215-konjugátumok valószínűleg kevésbé fontosak, mivel ezek egy tumorantigénen levő olyan epitóppal reagálnak, amely túl gyakran fejeződik ki normál sejteken. Úgy tűnik, hogy a C242-konjugátumokra vonatkozóan több specifitási adat van, bár eredményeink azt mutatják, hogy ezeket magasabb dózisban kell alkalmazni. A Thy-1.2 ellen irányuló Mab C a humán ráksejtek célzására valószínűleg kevésbé értékes, mivel a Thy-1.2 antigén egy nem humán emlőstumorsejtre specifikus.
A C242 monoklonális antitestet termelő hibridómasejtvonal 1990. január 26-án ECACC 90012601 számon került letétbe helyezésre az European Collection of Animal Cell Culture (Porton Down, Salisbury, Wilst, Nagy-Britannia) intézetnél.
A szuparantigént az antitesthez kapcsoló szerkezet
A találmány szerinti előnyös konjugátumban a szuperantigén kovalensen van kapcsolva az antigénhez egy kovalens összekötő elemen (-B-) keresztül. Ha fontos, hogy a konjugátum az elpusztítandó sejthez adagolva, például egy állatnak adagolva ne bomoljon, a kötésnek az elérendő hatáshoz szükséges ideig metabolikusan stabilnak kell lennie. Előnyös továbbá, ha a kötés maga nem okoz immunológiai reakciókat. Általában elmondható, hogy a kötésnek inertnek kell lennie olyan értelemben, hogy emellett a konjugátum hatékony célsejtkötő specifitással (antitumor, antivírus stb.) és a
HU 218 603 Β citotoxikus T-sejteket aktiváló hatékony kapacitással rendelkezzen.
A tudományos és szabadalmi szakirodalomban számos olyan funkciós csoportot ismertettek, amelyek immunkonjugátumok összekötő elemében alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti új konjugátumokban levő -B- összekötő elem olyan szerkezeteket tartalmazhat, amelyek lehetnek (i) amidok és hidrazidok (amidok=-CONR!- vagy -NRjCO- képletű csoportot tartalmazó vegyületek, ahol a szabad vegyértékek telített szénatomhoz kapcsolódnak, és Rj hidrogénatomot vagy alkilcsoportot, például rövid szénláncú (1-6 szénatomos) alkilcsoportot vagy egy, a természetes α-aminosavakban, előnyösen hidrofil aminosavakban előforduló a-N-helyettesítőt jelenthet; hidrazidok=-CONHNH- vagy -NHNHOC- képletű csoportot tartalmazó vegyületek, ahol a szabad vegyértékek telített szénatomhoz kapcsolódnak);
(ii) tioéterek és diszulfidok (-Sr- képletű csoportot tartalmazó vegyületek, ahol r értéke 1 vagy 2, és a szabad vegyértékek közvetlenül kapcsolódnak telített szénatomokhoz);
(iii) egyenes, elágazó szénláncú vagy ciklusos telített szénhidrogénlánc, amely adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal vagy aminocsoporttal lehet helyettesítve;
(iv) éterek (-O- képletű csoportot tartalmazó vegyületek, ahol a szabad vegyértékek közvetlenül kapcsolódnak telített szénatomokhoz);
(v) primer aminok vagy diszubsztituált hidrazinok (-NH- vagy -NH-NH- képletű csoportot tartalmazó vegyületek, ahol a szabad vegyértékek közvetlenül kapcsolódnak telített szénatomokhoz).
Az összekötő csoport hosszának a szakterületen szokásosnak kell lennie, azaz 180 atomnál rövidebbnek, például 100 atomnál kevesebbnek, de 3-6 atomnál hoszszabbnak, előnyösen 16 atomnál hosszabbnak kell lennie.
Az alkalmazott összekötő csoport előnyösen hidrofil és nem tartalmaz aromás gyűrűt. A -B- összekötő csoport részét képező előnyös hidrofil szerkezetek például: (i) természetben előforduló α-aminosavak polipeptidláncai (például aszparaginsav és amidja, glutaminsav és amidja, lizin, arginin, glicin, treonin, szerin és adott esetben hisztidin); (ii) oxaalkilénláncok, például [-O(CH2)n-]n-- képletű csoportok, ahol n értéke 2-5 egész szám, előnyösen 2-3, n’ értéke 1-20; (iii) —S— (tioéterek), -O- (éterek) és -CONH- csoportok (nem helyettesített aminok), amelyek rövid (1-4 szénatomos), előnyösen 1 vagy 2 szénatomos nem helyettesített szénhidrogénlánchoz kapcsolódnak.
Az [F-(Pro)n]mF típusú hidrofil szerkezetben hidrofil aminosavak lehetnek jelen. A képletben F aminosavszekvenciát, előnyösen 4-8 maradékból álló szekvenciát képvisel, és a jelen levő aminosavak lehetnek szerin, glicin vagy treonin, m értéke 1-4, n értéke 4-8 (Cetus Corp. WO-A-85/03508 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentése).
A -B- összekötő csoport a konjugátum antitestvagy szuperantigénrészének vagy egy bizonyos helyéhez, vagy véletlenszerűen kapcsolódhat. Potenciális kapcsolódási helyek az aminoterminális és karboxiterminális vég és egy lizinmaradék (omega-aminocsoport). Ha az antitest vagy szuperantigén tiocsoportot vagy diszulfidcsoportot tartalmaz (cisztin, illetve cisztein), ezek a csoportok szintén alkalmazhatók a kovalens kötés kialakítására, hacsak ezek nem esszenciálisak a konjugátum aktív részének aktivitása szempontjából. Ha vannak jelen szénhidrogén-szerkezetek, ezek oxidálhatok aldehidcsoportokká, amelyek azután alkalmazhatók a konjugátum más csoportjainak kapcsolásához (vesd össze Cetus Corp. EP-A-240 200 számú szabadalmi bejelentése).
A találmány szerinti konjugátumok nem tartalmazhatnak jelentősebb mennyiségben észterkötéseket és labilis amidkötéseket, különösen tirozin- és hisztidinmaradékkal alkotottakat nem. Ha a szintézis során ilyen kötések képződtek, ezek hidroxil-aminnal eltávolíthatók [Endo et al., Cancer Rés. 48, 3330-3335 (1988)].
Az aktív antitestrészenként jelen levő szuperantigén csoportok száma normálisan 1-5, előnyösen 1 vagy 2.
A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a konjugátum az antitestre számított szuperantigén és/vagy az alkalmazott kötési helyek és/vagy a -B- összekötő csoport stb. szempontjából lényegében véve homogén. Más szóval a konjugátumban az egyes konjugátummolekuláknak ezen változók szempontjából azonosnak kell lenniük.
A konjugátumnak nemkonjugált antitestektől és nemkonjugált szuperantigénektől lényegében véve mentesnek kell lennie.
A szuperantigén és antitest aránya, az összekötő elem stb. az optimális konjugátumban a választott monoklonális antitesttől (beleértve a típust, altípust, termelőklónt, specifitást) és a választott szuperantigéntől függ. A leírásunkban adott kísérleti modellek alapján ki lehet választani az optimális paramétereket és más szuperantigéneket és más antitesteket.
A találmány szerinti megoldás legtöbbet tanulmányozott megvalósítási módja szerint a -B- összekötő csoport a következő (I) képletű szerkezettel rendelkezik:
-SrRCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY- (I)
Az (I) képletben a szabad vegyértékek aktív részekhez kapcsolódnak. Ez vagy közvetlenül, vagy további kétértékű inért szerkezeteken keresztül történik, amelyek beleértendők a -B- összekötő csoportba;
n értéke 0-nál nagyobb egész szám, például 1-20, előnyösen 2 vagy ennél nagyobb szám, a legtöbb esetben 10-nél kisebb egész szám;
m értéke 1 vagy 2;
S jelentése kénatom, amely mindkét vegyértékével közvetlenül kapcsolódik egy-egy telített szénatomhoz (-Sr- jelentése tioéter vagy diszulfidcsoport);
r értéke 1 vagy 2;
Y jelentése -NH-, -NHNH- vagy -NHN=CHképletű csoport, amely a bal oldali végével egy, az (I) képlet jobb oldali végén látható CO-csoporthoz, míg a jobb oldali végével egy telített szénatomhoz vagy egy
HU 218 603 Β karbonilcsoporthoz (csak akkor, ha Y jelentése -NHNH- csoport) kapcsolódik;
R előnyösen egy (1-4 szénatomos, gyakran 1 vagy 2 szénatomos) alkiléncsoportot képvisel, amely adott esetben helyettesítve lehet egy vagy több (1-3, előnyösen kettőnél kevesebb) hidroxilcsoporttal.
Az antitest-szuperantigén konjugátum előállítása
A találmány szerinti antitestkonjugátumokat úgy állíthatjuk elő, hogy az ezeket termelő sejtek tenyészközegéből vagy más olyan közegből kinyerjük és tisztítjuk, amelyben ezeket szintetizáltuk.
A találmány szerinti új konjugátumokat a technika állása szerinti ismert konjugátumszintetizáló módszerekkel szintetizálhatjuk, azaz géntechnikai módszerekkel (rekombináns technikákkal) vagy a megfelelő antitest és szuperantigén felhasználásával megfelelő funkciós csoportokon keresztül, klasszikus kapcsolási reakciókkal. A proteinekben jelen levő és normál esetben alkalmazható funkciós csoportok lehetnek:
(i) Szénhidrátszerkezetek. Ez a szerkezet aldehidcsoportokká oxidálható, amelyek azután H2NNHcsoportot tartalmazó vegyülettel reagáltatható a -C=NH-NH- csoport kialakítására.
(ii) Tiolcsoport (HS-). A tiolcsoportot olyan vegyülettel reagáltathatjuk, amely tiolcsoporttal reaktív csoportot tartalmaz a tioétercsoportok vagy a diszulfidcsoportok kialakítására. Proteinek szabad tiolcsoportjai cisztinmaradékban vannak jelen, és tiolozással vagy natív ciszteinmaradékokban levő diszulfidhidak hasításával vihetők be proteinekbe.
(iii) Szabad aminocsoportok (H2N-) aminosavmaradékokban. Az aminocsoportok amidcsoportok kialakítására olyan vegyületekkel reagáltathatók, amelyek elektrofil csoportokat, például aktivált karboxilcsoportot tartalmaznak. A szabad aminocsoport előnyösen egy aminoterminális aminocsoport vagy a lizinmaradék omega-aminocsoportja.
(iv) Aminosavmaradékok szabad karboxilcsoportja. A karboxilcsoportok reaktív (aktivált) karboxilcsoportokká alakíthatók, majd aminocsoportot tartalmazó vegyületek reagáltathatók amidcsoport kialakítására. Ilyenkor azonban elővigyázatossági intézkedéseket kell tenni, hogy minimalizáljuk az olyan aminocsoportokkal képződő amidcsoportok kialakulását, amelyek ugyanazon proteinen jelen levő karboxilcsoportokkal reagálnak. A szabad karboxilcsoport előnyösen egy karboxiterminális karboxilcsoport vagy egy a-amino-dikarbonsav karboxilcsoportja.
A H2NNH- csoportot, tiolreaktív csoportot, aktivált karboxilcsoportot vagy aminocsoportot tartalmazó vegyületek lehetnek bifunkcionális kapcsolóreagensek vagy antitest, vagy egy szuperantigén. A csoportok közvetlenül kapcsolódnak telített szénatomokhoz, kivéve a H2NNH- csoportot, amely karbonilszénatomhoz is kapcsolódhat. A csoportok lehetnek antitestbe vagy szuperantigénbe szokásos módszerekkel bevitt csoportok.
A rekombináns technika megfelelő segédeszközt biztosít az olyan konjugátumok előállítására, amelyben a részek speciálisan kapcsolódnak, az egyik terminális karboxilcsoportja a másik terminális aminocsoportjához. Egy, az alkalmazott módszerhez illő összekötő csoportot ezek közé lehet iktatni.
Az alkalmazott reagenseket úgy választjuk meg, hogy azok biztosítsák a -B- összekötő csoport bevitelét. A szokásos bifunkcionális reagens a következő képlettel jellemezhető:
Z-B’-Z’ ahol
Z és Z’jelentése olyan funkciós csoportok, amelyek kölcsönösen összeférhetőek egymással, és a proteineken jelen levő funkciós csoportokkal kovalens kötést tesznek lehetővé (lásd fent),
B’ jelentése olyan inért összekötő csoport, amely ugyanazt a szerkezetet foglalhatja magában, mint a fent említett -B- összekötő csoport.
Közelebbről Z és Z’ lehet azonos vagy eltérő, és jelenthet tiolcsoportot, tiolcsoporttal reaktív csoportot, aktivált karboxilcsoportot, -CONHNH2- stb. csoportot. E csoportok részletesebb ismertetését lásd az „Új reagensek” címszó alatt.
A találmány szerinti konjugátumok kialakítására a következő - a kísérleti részben részletesen ismertetett - módszert alkalmazzuk:
(i) az antitestet vagy szuperantigént egy tiolcsoporttal reaktív csoportot, valamint aminocsoporttal reaktív csoportot tartalmazó szerves reagenssel reagáltatjuk olyan antitest vagy szuperantigén kialakítására, amely tiolcsoporttal reaktív csoportot hordoz, (ii) az antitest, illetve szuperantigén maradék részét tiolcsoportot vagy védett tiolcsoportot és aminocsoporttal reaktív csoportot tartalmazó szerves reagenssel reagáltatjuk olyan antitest vagy szuperantigén kialakítására, amely tiolcsoportot vagy védett tiolcsoportot hordoz, majd (iii) az (i), illetve (ii) lépéssel kapott terméket egymással reagáltatjuk olyan konjugátum kialakítására, amelyben a szuperantigén az antitesthez diszulfid- vagy tioétercsoportokon keresztül kapcsolódik.
Az egyes csoportok kapcsolásának körülményei a peptidkémia szerint ismertek. A kapcsolás történhet lépésenként vagy egy lépésben, intermedier funkcionális csoportok kialakításával, amelyek inért térköztartó csoportokkal kapcsolhatók a kiindulási anyaghoz. A konjugátum szintézise és tisztítása/kinyerése a részt vevő proteinre nézve mindig nem denaturáló körülmények között történik. Ez rendesen vizes közeget, 3 és 10 közötti pH-értéket és 0 °C és 50 °C közötti hőmérsékletet jelent. A konkrét értékek a reagáltatandó csoportoktól és a kinyerendő konjugátumtól függnek. Lásd részletesebben az „Új reagensek” cím alatt.
Új reagensek (a találmány szerinti megoldással kapcsolatban kidolgozva)
A -B- összekötő csoportot tartalmazó konjugátum kémiai szintéziséhez új heterobifünkcionális reagense5
HU 218 603 Β két fejlesztettünk ki, amelyek a következő általános képlettel jellemezhetők:
Z1RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mZ1 ’ (II) ahol m és n az (I) képieméi megadottakkal megegyezik,
Z[ jelentése tiolcsoporttal reaktív elektrofil csoport, tiolcsoport (-SH) vagy védett tiolcsoport (például AcS-), azzal a feltétellel, hogy tiolcsoport és hidroxilcsoport az R csoportban levő ugyanazon szénatomhoz nem kapcsolódhat. Tiolcsoporttal reaktív elektrofil csoportok lehetnek például (i) halogénatom, amely egy telített szénatomhoz kapcsolódik, előnyösen a-halogén-alkil-karbonilszármazék formájában;
(ii) aktivált tiolcsoport, előnyösen egy úgynevezett reaktív diszulfid (-SSRJ, amely egy telített szénatomhoz kapcsolódik;
(iii) 3,5-dioxo-1 -azaciklopent-3-én-1 -il-csoport.
A reaktív diszulfidszármazékok definícióját lásd az EP-A-128 885 számon közzétett szabadalmi bejelentésben.
Zf jelentése aktivált karboxilcsoport, azaz egy elektrofil csoport. Ilyenek például a karbonsav-halogenidek (-COC1, -COBr és COI), a vegyes karbonsavanhidridek (-CO-O-CO-Rj), reaktív észterek, mint például N-szukcinimidoil-oxi-karbonil-észter, -C(=NH)-OR2, 4-nitro-fenil-karboxilát (-CO-OC6H4NO2) stb., ahol Rj és R2 rövid szénláncú alkilcsoport vagy R2 lehet még benzilcsoport is.
A találmány szerinti új reagensek előnye, hogy egyenletes konjugátumokat eredményeznek, tekintettel az (OCH2CH2)n szerkezetben levő n egész számra, azaz n értéke az adott konjugátum minden egyes molekulájában azonos.
A Zj’ és Zj csoportokkal reagáló funkciós csoportok natív antitestként aktív molekulákon vagy natív szuperantigéneken lehetnek jelen vagy ezekbe bevihetők. A Zj’ és Zj csoportok azután szelektíven reagáltathatók a megfelelő antitesttel vagy szuperantigénnel, a technika állása szerint ismert módon.
Ismert módszer például a lánchosszabbítás módszere, akár a találmány szerinti új reagensekből, akár a konjugálandó vegyületből kiindulva.
A találmány szerinti reagensekből kiindulva végzett lánchosszabbítással olyan konjugátumokat kaphatunk, amelyekben -B- jelentése (1) -COR’-Sr-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY-, ahol CO NH-csoporthoz kapcsolódik, (2) -COR’-Sr-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCONHNH-R”NHV= -, ahol N= rendszerint egy sp2-hibridizációs állapotban levő szénatomhoz kapcsolódik, amely egy antitestben vagy (glikozilezett) szuperantigénben levő oxidált szénhidrogénszerkezetből származik, (3) -CO(CH2)mO(CH2CH2O)nCH2CH2NHCOR’-Sr- (folytatás) (folytatás) -RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY-, ahol CO NH-csoporthoz kapcsolódik, (4) -CO(CH2)mO(CH2CH2O)nCH2CH2NHCOR’-Sr- (folytatás) (folytatás) -RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH,)mCONHNH R”NELV=, ahol N= a (2) pontban meghatározott módon kapcsolódik,
R, R’ és R” jelentése az (I) általános képlet esetén R jelentéseként megadottakkal megegyezik, r jelentése a fenti.
A (II) általános képletű reagensek az
NH2CH2CH2(CH2CH2)nO(CH2)mCOOH (III) általános képletű vegyületekból állíthatók elő, ahol m értéke 1 vagy 2, n értéke 1-20, például 2-20 vagy 3-9.
Az olyan (III) általános képletű vegyületek, amelyekben m értéke 1 és 2 és n értéke 1-10, ismertek [Juliién et al., Tetrahedron Letters, 29, 3803-06 (1988); Houghton and Southby, Synth. Commun. 19 (18), 3199-3209 (1989); EP-A-410 280; Slama and Rando, Carbohydrate Research, 88, 213-221 (1981); Biochemistry 19,4595-4600 (1980)].
A (II) általános képletű vegyületek úgy állíthatók elő, hogy egy (III) általános képletű vegyületet egy ismert
Z-B’-Z’ általános képletű bifunkcionális vegyülettel reagáltatunk, ahol Z megegyezik Zj jelentésével, B’ jelentése megegyezik R” jelentésével, ahogyan korábban R és R’ esetén meghatároztuk, és Z’ egy aktivált karboxilcsoportot jelent.
A reakció után a karboxilcsoportot aktivált karboxilcsoporttá, például Zj’=aktivált észtercsoporttá, például N-szukcinimidoil-oxi-karbonil-csoporttá, 4-nitro-feniloxi-karbonil-csoporttá, 2,4-dinitro-fenil-oxi-karbonilcsoporttá stb. alakítjuk.
A (III) általános képletű új vegyületek és új származékaik a következő általános képlettel jellemezhetők:
XCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2Y (IV) ahol n értéke 2-20, előnyösen 3-20 vagy 3-9,
X jelentése H2N-csoport, beleértve a protonált formát is (+H2N-) vagy adott esetben helyettesített H2N-csoport, amely H2N-csoporttá alakítható, előnyösen hidrolízissel vagy redukcióval. X jelenthet például nem helyettesített aminocsoportot, nitrocsoportot, amidocsoportot (karbamidocsoportot), így például (rövid szénláncú acil)-amido-csoportot (formil-amido-, acetil-amido-, hexanoil-amido-csoportot), az acilcsoport α-helyzetű szénatomján elektronvonzó csoporttal helyettesített acil-amido-csoportokat, különösen CF3CONH-, CH3COCH2CONH- stb. csoportokat, ftálimidoilcsoportot, amely adott esetben a gyűrűn helyette6
HU 218 603 Β sítve lehet, karbamátocsoportot [különösen R/OCONH- és (R1’OCO)(R2’OCO)N csoportot, mint például N-(terc-butil-oxi-karbonil)amino-csoportot (Boc), N-(benzil-oxi-karbonil)amino- és di{N-(benzil-oxi-karbonil)}-aminocsoportot (Z, illetve diZ), amelyek adott esetben a gyűrűben helyettesítve lehetnek], alkil-aminocsoportot, amelyben a nitrogénatomhoz kapcsolódó szénatom egy aromás rendszerhez képest ahelyzetű, mint például az N-monobenzil-aminoés dibenzil-amino-, tritil-amino-csoport (trifenilmetil-amino-csoport) stb., beleértve az olyan analóg csoportokat is, ahol a metilszénatom (beleértve a benzilcsoport ilyen szénatomját is) helyett szilíciumatom van jelen, így például lehet N,Ndi(terc-butil-szilil)-amino-csoport, továbbá 4oxo-l,3,5-triazin-l-il-csoportot, amely adott esetben 3- és/vagy 5-helyzetben rövid szénláncú alkilcsoporttal lehet helyettesítve,
Rf és R2’ jelentése rövid szénláncú alkilcsoport, különösen szekunder vagy tercier alkilcsoportok, továbbá 1-3 fenilcsoporttal helyettesített metilcsoport, ahol a fenilcsoportok adott esetben helyettesítve lehet,
Y jelentése karboxilcsoport (-COOH, beleértve -COO) vagy olyan csoport, amely egyszerűen átalakítható karboxilcsoporttá, előnyösen hidrolízissel vagy oxidációval. A legfontosabb csoportok az olyan észtercsoportok, amelyek karbonilszénatomja vagy ortoészterekben az annak megfelelő atom az (I) általános képlet jobb oldali terminálisán levő metiléncsoporthoz kapcsolódik. Ilyenek az alkil-észter-csoportok (-COOR/); ortoésztercsoportok [-C(OR3’)3] és a reaktív észtercsoportok. Y jelenthet még -CHO-, -CN-, -CONH2-, -CONR,’R2’ csoportot, ahol R’, és R’2 jelentése a fenti,
R3’ jelentése megegyezik R/ jelentésével.
A leírásban említett rövid szénláncú alkil- és acilcsoportok 1-6 szénatomot tartalmazhatnak.
A (IV) általános képletű vegyületek ismert kiindulási vegyületekből ismert módszerekkel állíthatók elő. Alkalmas szintetikus utak:
A) lánckialakítás,
B) terminális funkcionális csoportok átalakítása,
C) szimmetrikus poliéter átalakítása nemszimmetrikus éterré,
D) biszimmetrikus lánc hasítása két azonos fragmenssé.
Az ismétlődő -OCH2CH2-csoportot tartalmazó, előnyösen alkalmazható kiindulási anyagok kereskedelemben kaphatók. Ilyenek például a 2-6 ismétlődő egységet tartalmazó oligoetilénglikolok. Hasonló terminális csoportokat tartalmazó alkalmas vegyületek még a megfelelő dikarbonsavak és diaminok.
Más terminális csoportokat tartalmazó alkalmas kiindulási anyagok az olyan ómega-hidroxi-monokarbonsavak, amelyekben a terminális csoportok térben meszszebb vannak a poli(etilén-oxi)-hídtól. Ilyen, 1-5 ismétlődő egységet tartalmazó vegyületeket ismertet például Nakatsuji, Kawamura és Okahara; Synthesis (1981) 42. oldalán.
Gyógyszerkészítmények és előállításuk
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények az új konjugátumokat tartalmazzák. Ezek a készítmények lehetnek liofilizált szemcsés anyagok, steril vagy aszeptikusán készített oldatok, tabletták, ampullák stb. és tartalmazhatnak vivőanyagokat, például vizet (előnyösen fiziológiásán elfogadható pH-ra pufferolt formában, például PBS-t) vagy más inért folyékony vagy szilárd anyagokat. A készítményeket úgy állítjuk elő, hogy a konjugátumot egy vagy több, vízben oldhatatlan vagy vízoldható vizes vagy nemvizes vivőanyaggal keveijük, kívánt esetben más alkalmas adalékanyagokkal együtt. Feltétlenül szükséges, hogy a vivőanyagok és az alkalmazott körülmények ne befolyásolják károsan a konjugátumok aktivitását. A vizet önmagában a vivőanyagok közé értjük.
Adagolás és a használat módja
A konjugátumokat normál esetben feloldjuk és előre elkészített adagolási formában adagoljuk. Minden egyes adag tartalmazza a konjugátum hatékony mennyiségét, ami a mellékelt eredmények alapján feltételezhetően 10 pg és 50 mg közötti. A konkrétan adagolandó mennyiség esetenként változó, és függ a kezelendő személy testtömegétől és korától, az adagolás módjától, a betegség típusától, az antitesttől, a szuperantigéntől, a -B- összekötő csoporttól stb.
Az adagolás a technika állása szerint ismert módon történhet, azaz a találmány szerinti konjugátumot egy, a célsejt lízisét előidéző mennyiségben vagy terápiásán hatékony mennyiségben érintkezésbe hozzuk a célsejtekkel. A fentiekben említett indikációk esetén legtöbbször parenterálisan, így például injekciós vagy infúziós (szubkután, intravénás, intraartériás, intramuszkuláris) úton adagoljuk emlősöknek, például embernek. A konjugátumot a kezelendő egyednek adagolhatjuk lokálisan vagy szisztemikusan is.
A „célsejt lízisét előidéző mennyiség” kifejezésen olyan mennyiséget értünk, amely elegendő ahhoz, hogy a CTL-eket a célsejt elroncsolására aktiválja.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal mutatjuk be közelebbről a korlátozás szándéka nélkül. A kísérleti rész I. részében bemutatjuk a konjugátum szintézisét, a II. részben pedig a 4. példa szerinti módon készített konjugátum hatását T-sejtek célsejtek lízisére történő aktiválására.
I. KÍSÉRLETI RÉSZ
Omega-amino-PEG-karbonsav előállítása
1. Izopropil-8-hidroxi-3,6-dioxa-oktanoát
500 ml dietilénglikolhoz nitrogénatmoszférában részletekben hozzáadunk 23 g (1,0 mól) feldarabolt nátriumot. Amikor a nátrium teljesen elreagált, az elegyet szobahőmérsékletre lehűtjük, és keverés közben hozzáadunk 76 g (0,5 mól) bróm-ecetsavat. Az elegyet 18 óra hosszat 100 °C-on keverjük, majd a dietilénglikol fölöslegét 530 Pa nyomáson ledesztilláljuk. Ezután hozzáadunk 400 ml izopropil-alkoholt és részletekben 51 g (0,65 mól) acetil-kloridot. Az elegyet 65 °C-on 18 óra hosszat keverjük, majd szobahőmérsékletre lehűtjük, és
3,5 g (0,15 mól) nátrium-acetáttal semlegesítjük. Az
HU 218 603 Β elegyet leszűrjük és majdnem szárazra pároljuk, majd 200 ml vízben feloldjuk. A vizes fázist 3-szor 50 ml 1,1,1-triklór-etánnal extraháljuk. Az összegyűjtött szerves fázist 20 ml vízzel mossuk. A terméket az összegyűjtött vizes fázisból 50 ml diklór-metánnal extraháljuk, amelyből bepárlással 55 g olajos terméket kapunk.
2. Izopropil-1 l-hidroxi-3,6,9-trioxa-undekanoát
700 ml trietilénglikolhoz nitrogénatmoszférában részletekben hozzáadunk 23 g (1,0 mól) feldarabolt nátriumot. Amikor a nátrium teljesen elreagált, az elegyet szobahőmérsékletre lehűtjük, és keverés közben hozzáadunk 76 g (0,5 mól) bróm-ecetsavat. Az elegyet 18 óra hosszat 100 °C-on keverjük, majd a trietilénglikol fölöslegét 530 Pa nyomáson ledesztilláljuk. Ezután hozzáadunk 400 ml izopropil-alkoholt és részletekben 51 g (0,65 mól) acetil-kloridot. Az elegyet 65 °C-on 18 óra hosszat keverjük, majd szobahőmérsékletre lehűtjük, és
3.5 g (0,15 mól) nátrium-acetáttal semlegesítjük. Az elegyet leszűrjük és majdnem szárazra pároljuk, majd 200 ml vízben feloldjuk. A vizes fázist 3-szor 50 ml 1,1,1-triklór-etánnal extraháljuk. Az összegyűjtött szerves fázist 20 ml vízzel mossuk. A terméket az összegyűjtött vizes fázisból 50 ml diklór-metánnal extraháljuk, amelyből bepárlással olajos terméket kapunk.
Ή-NMR (CDC13) δ: 1,26 (d, 6H); 3,07 (s, 2H); 3,6-3,8 (m, 12H); 4,11 (s, 2H); 5,09 (m, IH).
3. 8-(N-Ftalimidoil)-3,6-dioxaoktanol
400 ml dimetil-formamidban feloldunk 365 g (2,2 mól trietilénglikolból és SOCl2-ból készített) 8klór-3,6-dioxaoktanolt, és keverés közben hozzáadunk 370 g (2,0 mól) kálium-ftálimidet. Az elegyet 18 óra hosszat 110 °C-on keverjük, majd a dimetil-formamidot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A kapott maradékot 40-50 °C-on 1,5 1 toluolban szuszpendáljuk, és a kálium-kloridot leszűrjük. A terméket -10 °C-ra történő hűtéssel kristályosítjuk. Az anyalúgból koncentrálással és újabb kristályosítással egy második frakciót nyerhetünk.
•Η-NMR (CDClj) δ: 2,90 (s, IH); 3,51-3,58 (m, 2H); 3,60-3,68 (m, 6H); 3,73-3,78 (t, 2H); 3,89-3,94 (t, 2H); 7,70-7,89 (m, 4H).
4. Izopropil-17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoát
2,8 ml (35 mmol) piridin 30 ml diklór-metánnal készült oldatához keverés közben -5 °C-on hozzáadjuk
8.5 g (36 mmol) 8-(N-ftalimidoil)-3,6-dioxaoktanol és 10,2 g (36 mmol) trifluor-metánszulfonsavanhidrid diklór-metánnal készült oldatát. Körülbelül 30 perc múlva a szerves fázist 0,5 mol/l-es sósavval és vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és leszűrjük, majd hozzáadunk 12 g (48 mmol) izopropil-8hidroxi-3,6-dioxaoktanoátot és 6,5 g (46 mmol) Na3PO4-t, és az elegyet szobahőmérsékleten 20 óra hosszat élénken keverjük. Ezután a reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. A maradékot 1,1,1triklór-etán és víz között megosztjuk. A szerves fázis bepárlásával 13 g olajos terméket kapunk.
•Η-NMR (CDClj) δ: 1,26 (d, 6H); 3,58-3,76 (m, 18H); 3,90 (t, 2H); 4,11 (s, 2H); 5,09 (m, IH); 7,70-7,89 (m, 4H).
5. 17-(N-Ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav g izopropil-17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoátot feloldunk 50 ml tetrahidrofurán és 50 ml koncentrált sósav elegyében. Az oldatot 16 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd 200 ml vízzel hígítjuk, és a tetrahidrofuránt csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A vizes fázist egyszer toluollal mossuk és kétszer diklór-metánnal extraháljuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk, így 8,5 g olajos terméket kapunk.
•Η-NMR (CDC13) δ: 3,57-3,76 (m, 18H); 3,91 (t, 2H); 4,11 (s, 2H); 4,8 (br, 2H); 7,65-7,90 (m, 4H).
6. Izopropil-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoát
8,5 g 17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsavat feloldunk 150 ml etanol és 3 ml hidrazinhidrát elegyében. Az oldatot szobahőmérsékleten 16 óra hosszat keverjük, majd hozzáadunk 100 ml 3 mol/l-es sósavat, és az elegyet 3 óra hosszat visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Szobahőmérsékletre történő hűtés és leszűrés után a pH-t nátrium-hidroxiddal 9 értékre állítjuk, majd majdnem szárazra pároljuk. Ezután vizet adunk hozzá és újra majdnem szárazra pároljuk, az oldat pHját sósavval 4 értékre állítjuk. A terméket 100 ml izopropanollal és 2 ml szobahőmérsékleten egy éjszakán át kezeljük, majd bepároljuk. A maradékot vízzel összegyűjtjük és alkalikus pH-nál (7-11) diklór-metánba extraháljuk. Bepárlás után 3,3 g terméket kapunk.
•Η-NMR (CDC13) δ: 1,26 (d, 6H); 3,17 (t, 2H); 3,65-3,80 (m, 18H); 4,16 (s, 2H); 5,07 (m, IH).
A szintetizált amino-PEG-karbonsavak képletei H-(OCH2CH2)nCH2CO-OCH(CH3)2
1. vegyület: n=l
2. vegyület: n=l PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)2OH
3. vegyület, PhtN: N-ftalimidoil PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OCH(CH3)2
4. vegyület
PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OH
5. vegyület
H2N-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OH
6. Vegyület
BIFUNKCIÓS REAGENSEK ÉS KAPCSOLÁSI TERMÉKEK KÉSZÍTÉSE
1. példa
17-Jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter
A lépés: 17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav [(A) termék]
1,1 g (3,2 mmol) izopropil-17-amino-3,6,9,12,15pentaoxaheptadekanoátot (lásd kísérleti rész I. részét) feloldunk 3 ml 1 mol/l-es nátrium-hidroxid-oldatban, és 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután hozzáadunk 1,5 ml 6 mol/l-es sósavat, és az elegyet szárazra pároljuk. A maradékot diklór-metánnal felvesszük és leszűrjük, az oldószer ledesztillálása után 54 mg 17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoátot
HU 218 603 Β kapunk. 460 mg (1,39 mmol) kapott vegyületet feloldunk 10 ml borátpufferben (pH=8,4). Az oldatból a levegőt nitrogéngázzal kihajtjuk. 1 perc alatt cseppenként hozzáadjuk 432 mg (1,52 mmol) N-szukcinimidil2-jód-acetát 5 ml dioxánnal készült oldatát, miközben a pH-t 5 mol/l-es nátrium-hidroxid adagolásával 8,4 értéken tartjuk. A reakcióelegyet nitrogéngáz bevezetése közben 15 percig keveijük. Vékonyréteg-kromatográfiás elemzés szerint (eluálószer: diklór-metán/metanol 60:35) a reakció néhány perc alatt lejátszódik. 15 perc múlva a reakcióelegy pH-ját 3 értékre állítjuk, és az oldatot liofílizáljuk.
A reakcióelegyet PEP-RPC hidrogénatom 30/26 jelű reverz fázisú oszlopon (Pharmacia Biosystems AB) 0,1% trifluor-ecetsav-tartalmú, 0-13% gradiensű acetonitrillel megosztjuk, majd 0,1% trifluorecetsav-tartalmú 13%-os acetonitrillel izokratikusan elválasztjuk. A kívánt csúcstól a frakciókat összegyűjtjük és liofílizáljuk, így 351 mg 17-jód-acetil-amino3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsavat [(A) terméket] kapunk, kitermelés 76%.
A termék szerkezetét NMR-spektrummal igazoljuk. Ή-NMR (D2O) δ: IC//2C 4,23 s
II o
OC7ACOH 3,76 s
II o
OCH2CH2O 3,71-3,76 NHCH2C//2O 3,65 t NHC7/2CH2O 3,41
B lépés: 17-jöd-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter [(B) termék]
4,5 mg (39 pmol) hidroxi-szukcinimidet bemérünk egy lombikba 18,3 mg (39 pmol) 17-jód-acetil-amino3.6.9.12.15- pentaoxaheptadekánsavat [(A) terméket] feloldunk 0,55 ml vízmentes dioxánban, és a lombikba adagoljuk. A lombikból a levegőt nitrogéngázzal kihajtjuk, és cseppenként bemérjük 8,0 mg (39 pmol) diciklohexil-karbodimid 0,15 ml vízmentes dioxánnal készült oldatát. A lombikot nitrogéngázzal töltjük, lezárjuk és sötétbe helyezzük. A reakcióelegyet 3,5 óra hosszat keveijük. A képződött csapadékot leszűijük. A szűrletben a (B) termék mennyisége NMR-analízis alapján 89%.
2. példa (17-Jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-aminoj-immunglobulin [(C) termék]
A. Mab C215 jelű monoklonális antitest mg (0,218 pmol) IgG2a immunglobulinosztályba tartozó monoklonális antitestet (Mab C215) feloldunk 17,7 ml 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó borátpufferben (pH=8,l), és egy lombikba bemérjük. 3,6 mg (6,4 pmol) 17-jód-acetil-amino3.6.9.12.15- pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észtert [(B) termék] tartalmazó 146 pl dioxánoldatot injektálunk a pufferoldatba, és a reakciót 25 percig szobahőmérsékleten folytatjuk. Eközben a lombikot a fényhatás kizárására fóliával burkoljuk. A B reagens fölöslegét Sephadex G 25 K 26/40 oszlopon végzett 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH=7,5) történő eluálással frakcionáljuk. A kívánt C terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A 22 ml oldatot Amicon cellában YM 30 szűrőn 8 ml-re koncentráljuk. A koncentrációt és a szubsztitúció fokát aminosavelemzéssel határozzuk meg. Eredmény: 4,7 mg/ml; Mab C215 molekulánként 18 térközcsoport.
B. Mab 0242jelű monoklonális antitest
IgGl immunglobulinosztályba tartozó monoklonális antitestet (Mab C242) 15-, 20- és 22-szeres moláris fölöslegben 17-j ód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel [(B) tennék] reagáltatunk a 2.A példa szerinti módon, így nona-, dodeka- és tetradeka(17-jód-acetil-amino)3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino-(Mab C242)-t [(C) termék] kapunk.
C. Mab C jelű monoklonális antitest
IgG2a immunglobulinosztályba tartozó monoklonális antitestet (Mab C) 14- és 18-szoros moláris fölöslegben 17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel [(B) termék] reagáltatunk a 2.A példa szerinti módon, így tetra- és hepta(17-jód-acetil-amino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino-(Mab C)-t [(C) termék] kapunk.
3. példa
2-Merkapto-propionil-amino-Eui+-mal jelzett
Staphylococcus enterotoxin A (SEA)
A. Eu3+-mal jelzett SEA [(D) tennék] mg (71 nmol) SEA-t (Toxin Technology Inc. fagyasztva szárított terméke) 722 pl milli-Q vízben feloldunk, és beméijük egy 15 ml-es polipropilén kémcsőbe. Hozzáadunk 100 pl 0,1 mol/l-es borátpuffert (pH=8,6), majd 2160 nmol Eu3+-kelát reagenst (Pharmacia Wallac Oy) 178 pl milli-Q vízben oldva. A reakciót szobahőmérsékleten egy éjszaka alatt hajtjuk végre. A reagens fölöslegét Sephadex G 25 PD 10 oszlopon (Pharmacia Biosystems AB) 0,1 mol/l-es foszfátpuffenel (pH = 8,0) eluálószerrel végzett ffakcionálással távolítjuk el. A kívánt D terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A 3 ml oldatot Amicon cellában YM5 szűrőn 0,8 ml-re koncentráljuk. A koncentrációt aminosavelemzéssel határozzuk meg, ami 1,7 mg/ml-nek adódik. A szubsztitúció foka EuC13standarddal való összehasonlítás alapján SEA-molekulánként 0,8 Eu3+.
Bl. 3-(2-Piridil-tio)-propionil-amino-Eu3+-mai jelzett
SEA (E) és 3-merkapto-propionil-amino-Eu3+-mal jelzett SEA (F)
1,24 mg (44,8 nmol) Eu3+-SEA-t 0,75 ml 0,1 mol/les foszfátpufferben (pH=8,0) bemérünk egy 15 ml-es polipropilén kémcsőbe. Hozzáadjuk 1,6 mg N-szukcinimidil-3-(2-piridil-tio)-propionát 1 ml etanollal készült oldatának 35 pl-ét (180 nmol), és a reakcióelegyet 30 percig szobahőmérsékleten keverjük. A kapott E terméket izolálás nélkül F termékké redukáljuk.
HU 218 603 Β
A fenti reakcióelegyhez 20 μΐ 0,2 mol/l-es Eu3+citrát-oldatot adunk, és a pH-t 50 pl 2 mol/l-es ecetsavval 5 értékre állítjuk. Ezután hozzáadjuk 3,1 mg ditiotreitol (Merck) 0,1 ml 0,9%-os nátrium-kloriddal készült oldatát, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percig keverjük. Ezután a térfogatot 50 μΐ 0,9%-os nátriumkloriddal 1 ml-re kiegészítjük. Az 1 ml reakcióelegyet Sephadex G 25 NAP-10 oszlopra (Pharmacia Biosystem AB) visszük, és a kívánt F terméket 1,5 ml 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel eluáljuk. Az eluált F terméket 15 ml-es polipropilén kémcsőben összegyűjtjük, és azonnal, a diszulfidszármazékká való újraoxidálódás megakadályozása mellett felhasználjuk a G termék szintéziséhez.
B2. 2-Merkapto-propionil-amino-Staphylococcus enterotoxin A (SEA) [(F2) termék]
Natív SEA-t (Toxin Technology Inc. fagyasztva szárított terméke) vagy rekombináns SEA-t (rSEA) 2szeres mólfölöslegben N-szukcinimidil-3-(2-piridiltio)-propionáttal reagáltatunk a 3.B1 példa szerinti módon.
A szubsztitúció fokát Carlsson et al. módszerével [Biochem. J. 173, 723 -737 (1978)] UV-elemzéssel határozzuk meg, ami SEA-molekulánként 1,9 merkaptopropionil-csoportnak adódik.
4. példa
SEA-monoklonális antitestkonjugátumok (G1 és G2)
A. Eu3+-SEA és Mab C215 konjugátumai (Gl)
A 3.B példa szerinti 4-merkapto-propionil-aminoEu3+-mal jelzett SEA oldatához hozzáadjuk 1,2 ml 4 mg oktadeka(17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C215) 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH=7,5) készült oldatát. A reakció egy éjszaka alatt szobahőmérsékleten lejátszódik. Az el nem reagált jódalkil-csoportokat 20 μΐ merkapto-etanol 1 ml vízzel készült oldatának 5 μΐ-ével (1,2 pmol) blokkoljuk. A reakcióelegyet 4 óra hosszat állni hagyjuk, majd leszűqük. A szűrletet Superose 12 hidrogénatom 16/50 oszlopon (Pharmacia Biosystems AB) 0,002 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH = 7,5) eluálva frakcionáljuk. A kívánt G terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és elemezzük. A proteintartalom aminosavelemzéssel meghatározva 0,22 mg/ml. A szubsztitúció foka az Eu3+-meghatározással IgGmolekulánként egy SEA. A terméket immunstimuláló tulajdonságokra és antitestkötő képességre nézve is vizsgáljuk.
Az (F) termék (C) termékre vonatkoztatott mennyiségének emelésével nagyobb fokú szubsztitúciót érhetünk el.
B. rSEA és Mab C215 konjugátumai (G2)
Oktadeka(17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C215)-t (C) 1,8-szeres mólfölöslegben 2-merkapto-propionil-amino-rSEA-val (F2) reagáltatunk a 4.A példa szerinti módon. A konjugátum összetételét nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) Phast-Gelen 4-15 gradienssel határozzuk meg, és a kötéseket Phast
IMAGE-vel (Pharmacia Biosystems AB) észleljük.
A kapott konjugátum 6% Mab C215-öt három SEA-val,
15%-ot két SEA-val, 28%-ot egy SEA-val és 51% szubsztituálatlan Mab C215-öt tartalmaz.
Egy másik kísérletben, 2,7-szeres mólfölöslegben használt F2-vel olyan konjugátumot kapunk, amely 15% Mab C215-öt három SEA-val, 25%-ot két SEAval, 34%-ot egy SEA-val és 26% szubsztituálatlan MabC215-öt tartalmaz.
C. rSEA és Mab C242 konjugátumai
Cl. Tetradeka( 17-j ód-acetil-amino-3,6,9,12,15 -pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C242)-t (C) 3,2-szeres mólfölöslegben 2-merkapto-propionil-amino-rSEA-val (F2) reagáltatunk a 4.A példa szerinti módon. A konjugátum összetételét a 4.B példa szerinti módon határozzuk meg: 4% Mab C242 négy SEA-val, 12% három SEA-val, 28% két SEA-val, 36% egy SEA-val és 20% szubsztituálatlan Mab C242.
A fenti módon járunk el, azonban a reakcióterméket 4 óra hosszat 0,2 mol/l-es hidroxil-aminnal reagáltatjuk, mielőtt a Mab C242 és térköztartó, valamint a SEA és a merkapto-propionil-csoport közötti instabil kötések eltávolítására oszlopffakcionálást végzünk. A képződött konjugátum összetétele: 1% Mab C242 négy SEA-val, 12% három SEA-val, 27% két SEA-val, 36% egy SEA-val és 24% szubsztituálatlan Mab.
C2. Dodeka(17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C242)-t (C) 3-szoros mólfölöslegben 2-merkapto-propionil-amino-rSEA-val (F2) reagáltatunk a 4.A példa szerinti módon. A kapott konjugátum összetétele: Mab C242 három SEA-val, 26% két SEA-val, 36% egy SEA-val és 31% szubsztituálatlan Mab C242.
D. rSEA és Mab C konjugátumai
Dl. Hepta(17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C)-t 5,4-szeres mólfölöslegben 2-merkapto-propionil-amino-rSEA-val (F2) reagáltatunk a 4.A példa szerinti módon. A kapott konjugátum összetétele a 4.B példa szerinti módon elemezve: 15% négy SEA-val, 24% három SEA-val, 29% két SEA-val, 19% egy SEA-val, 3% szubsztituálatlan Mab C és 10% dimer formában.
Ugyanezt a reakciót folytatjuk le 0,2 mol/l-es hidroxil-amin jelenlétében a Mab C és a térközcsoport, valamint a SEA és a merkapto-propionil-csoport közötti instabil kötések eltávolítására. A kapott konjugátum összetétele: 11% Mab C három SEA-val, 24% két SEA-val, 30% egy SEA-val, 18% szubsztituálatlan Mab C és 17% dimer formában.
D2. Tetra(17-jód-acetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C)-t 5,7-szeres mólfölöslegben 2-merkapto-propionil-amino-rSEA-val (F2) reagáltatunk a 4.A példa szerinti módon. A kapott konjugátum összetétele: 8% négy SEA-val, 18% három SEA-val, 30% két SEA-val, 26% egy SEA-val, 5% szubsztituálatlan Mab C és 12% dimer formában.
5. példa [7 7-(3-Merkapto-propionil-amino)-3,6,9,12,15-pentaoxa-heptadekanoil-aminoJ-rSEA (I)
HU 218 603 Β
A. 17-[3-(2-Piridil-tio)-propionil-amino]-3,6,9,12,15pentaoxaheptadekanoil-amino-rSEA (H)
0,53 mg (896 nmol) 17-[3-(2-piridil-tio)-propionilamino]-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadekánsav-N-hidroxi-szukcinimid-észter (R) 43 pl dioxánnal készült oldatát hozzáadjuk 3,67 mg (128 nmol) rSEA 0,1 mol/les, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH=7,5) készült oldatához. A reakciót szobahőmérsékleten 30 perc alatt folytatjuk le. 100 μΐ mintát kiveszünk, és elemezzük a szubsztitúció mértékét. A maradékot fagyasztva tároljuk I termékké való redukálásig.
A szubsztitúció mértékét úgy határozzuk meg, hogy
100 μΐ reakcióelegyet Sephadex G 50 NICK. oszlopon (Pharmacia Biosystems AB) sómentesítünk, és az eluátumot UV-spektroszkópiával Carlsson és munkatársai módszerével [Biochem. J. 173, Ί23-Τ3Ί (1978)] elemezzük. Az rSEA-hoz kapcsolva 2,7 térközcsoport található.
Β. [17-(3-Merkapto-propionil-amino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadohanoil-amino]-rSEA (I)
0,9 ml, a H terméket tartalmazó reakcióelegy pH-ját n sósavval 4,4 értékre állítjuk, és hozzáadunk 2,9 mg ditiotreitolt 75 μΐ 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban oldva. A redukciót 30 perc alatt folytatjuk le. A reakcióelegyet Sephadex G25 NAP 10 oszlopra (Pharmacia Biosystems AB) visszük, és 1,5 ml 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH=7,5) eluáljuk, és azonnal felhasználjuk a J termék szintézisére.
6. példa
SEA-monoklonális antitestkonjugátum kettős térközcsoporttal (J)
4,2 mg (27 nmol) dodeka(17-jód-acetil-amino3.6.9.12.15- pentaoxaheptadekanoil-amino)-(Mab C242)-t (C) 1,0 ml 0,1 mol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferben 43 óra hosszat reagáltatunk 1,17 mg (42 nmol) [17-(3-merkapto-propionil-amino)3.6.9.12.15- pentaoxaheptadekanoil-amino]-rSEA-val (I) 1 ml fenti pufferben, sötétben, nitrogénatmoszférában. Ezután hozzáadunk 1,14 pmol merkapto-etanolt. További 1 óra reagáltatás után a reakcióelegyet Superdex 200 HR 16/65 oszlopon frakcionáljuk. A terméket 2 mmol/l-es, 0,9% nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel (pH=7,5) eluáljuk. A kívánt J terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a 4.B példa szerinti módon elemezzük. A konjugátum összetétele: 9% Mab C242 két SEA-val, 25% egy SEA-val és 66% szubsztituálatlan Mab C242.
11. KÍSÉRLETI RÉSZ
Szuperantigén-antitestkonjugátumok hatása sejtekre A következő kísérletekben baktériumtoxinként Staphylococcus enterotoxin A-t (SEA) alkalmazunk, amely a Toxin Technologies (WI; USA) intézettől szerezhető be, vagy E. coliban rekombináns fehérjeként termelhető.
Antitestként C215, C242 és Thy-1.2 monoklonális antitesteket használunk. C215 egy IgG2a-osztályba tartozó monoklonális antitest, amely humán vastagbélkarcinóma-sejtvonal ellen képződik, és különböző humán vastagbélkarcinóma-sejtvonalak 37 kD-s protein antigénjeivel reagál. A konjugátumot az előzőekben ismertetett módon állítjuk elő.
A SEA-C215 Mab konjugátum és a nemkonjugált SEA és C215 Mab által közvetített, MHC II hiányos vagy kevés és észlelhetetlen mennyiségű MHC ΙΙ-t termelő vastagbélkarcinóma-sejtek elleni citotoxicitás meghatározására különböző humán, SEA-val kiterjesztett T-sejtvonalakat alkalmazunk effektorsejtekként, és vastagbélkarcinóma-sejteket és MHC II+ Raji-sejteket célsejtekként. A Colo205, SW620 és WiDr vastagbélkarcinóma-sejtvonalak nem fejeznek ki MHC II csoportot, amint az a HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ és FACS elleni Mab-k festésével megállapítható. A SEAval kiegészített sejtvonalakat perifériás vérből alakítottuk ki, a SEA-val előre bevont, mitocin C-vel kezelt MHC II+ BSM-limfómasejtekkel, rekombináns IL-2 (20 egység/ml) jelenlétében enyhén stimulálva. Ezek a T-sejtvonalak erősen toxikusak SEA-val bevont Raji- vagy BSM-sejtekre nézve, de a be nem vont vagy staphylococcus enterotoxin B-vel (SEB) bevont sejtekre nézve nem. Ez a SEA-val indukált sejtpusztítás a SEA és a célsejteken levő MHC II közötti kölcsönhatás függvénye, amint az a HLA-DR antitestek blokkolásával, MHC II- Raji mutáns sejtek és HLA-DR-rel átfertőzött L-sejtek [Dohisten et al., Immunology 71, 96-100 (1990)] alkalmazásával megállapítható. Ezek a T-sejtvonalak aktiválhatok a C215+ MHC II- vastagbélkarcinóma-sejtek C215-SEA konjugátummal való pusztítására. Ezzel szemben a nemkonjugált SEA és C215 Mab csak elhanyagolható mértékű C215 + MHC II vastagbélkarcinóma-sejtek elleni T-sejt-pusztítást képes indukálni. A Staphylococcus enterotoxin antitestkonjugátumtól függő sejtek által közvetített citotoxicitása a SEA-C215 Mab konjugátum C215+ tumorsejtekhez való kötődésétől függ. E kötődés specifítása úgy mutatható ki, hogy a nemkonjugált C215 Mab - de nem az irreleváns C242 és w6/32 Mab-k - gátolja a vastagbélkarcinóma-sejtek lízisét. A CD4+ és CD8+ T-sejtek a SEA-C215-tel kezelt C215+ vastagbélkarcinóma-sejtek pusztítását mutatják, de nem lizálják a SEA-val kezelt sejteket. A T-sejtek és MHC II~ tumorsejtekhez kötött SEA-C215 Mab konjugátum közötti kölcsönhatás úgy látszik, hogy magában foglalja a specifikus V-béta TCR-szekvenciákkal való kölcsönhatást, a korábban az MHC II+ sejtek SEA-val indukált pusztítására vonatkozóan bemutatottakhoz hasonlóan. Ezt egy, a SEA-ra specifikus, de SEB-re nem autológ módon specifikus T-sejtvonal és a C215-SEA konjugátum közötti kölcsönhatás igazolta. A C242 Mab és Thy-1.2 Mab konjugátum a C215 Mab konjugátumhoz hasonló aktivitást mutat.
Krómmal való jelölés és a célsejtek inkubálása SEA-val
0,7 xlO6 * * * * 11 célsejtet és 150 pCi 51Cr-t (Amersham Corp., Arlington Hights, Nagy-Britannia) 45 percig 37 °C hőmérsékleten 100 μΐ-ben inkubálunk. A sejteket a következő komplett tápközegben tartjuk: 2,8 térfogat% következő komponensekkel kiegészített RPMI-1640 (Gibco, Paisley, GBR): 7,5% NaHCO3,
HU 218 603 Β
1% nátrium-piruvát, 2% 200 mmol/l-es L-glutamát, 1% 1 mol/l-es Hepes, 1% 10 mg/ml gentamicin és 10% borjúembrió-szérum (FCS, Gibco, Paisley, GBR). A sejteket inkubálás után egyszer mossuk komplett, FCS-t nem tartalmazó komplett tápközeggel, és 60 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 10%> FCS-t tartalmazó komplett tápközeggel mossuk, és újra szuszpendáljuk ilyen tápközegben. 5xl03 célsejtet adagolunk egy U fenekű, 96 nyílásos mikrotitrálólemez (Costar, Cambridge, USA) minden nyílásába. Citotoxicitási vizsgálat
Az effektorsejteket különböző effektor/célsejt arányban adagoljuk a nyílásokba. A nyílásokban a végső térfogat 200 pl. Minden tesztet háromszoros ismétléssel végzünk. A lemezeket 4 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a leadott krómot összegyűjtjük. Az 51Cr mennyiségét egy gamma-számlálóval (Cobra Auto-gamma, Packard) mérjük. A citotoxicitás százalékos arányát a következő képlettel számoljuk :
citotoxicitás%=(X-M)/(T-M) χ 100, ahol X a krómleadás cpm-ben a tesztminta esetén, M a tápközeggel inkubált célsejtek spontán krómleadása, és T az 1% nátrium-dodecil-szulfáttal inkubált célsejtek teljes krómleadása.
Eredmények
SEA-C242, SEA-C215 és SEA-anti-Thy-1,2 Mab konjugátumok kötődnek az olyan sejtekhez, amelyek kifejezik a Mab-k megfelelő epitópjait, illetve az MHC11+ sejtekhez. A nemkonjugált SEA viszont csak az MHC 11+ sejtekhez kötődik. A nemkonjugált C215, C242 és Thy-1.2 Mab a megfelelő sejtekhez kötődik, de Raji-sejtekhez nem (1.1. táblázat).
Humán T-sejtvonalak SEA-C215 Mab konjugátum jelenlétében lizálják, de nemkonjugált SEA és C215 Mab jelenlétében nem lizálják az MHC II~ SW620, Colo205 és WiDr sejteket (lásd 1. ábra). A vastagbélkarcinóma-sejtek lízise 10-100 ng/ml SEA-C215 Mab konjugátumnál látható. A lízis magas foka észlelhető különböző effektor/célsejt arányoknál SEA-215 Mab konjugátumokkal SW620 ellen (lásd
1. ábra). Ezzel szemben a nemkonjugált SEA vagy C215 Mab nem közvetít citotoxicitást SW620 sejtek ellen a vizsgált effektor/célsejt arányoknál. Ez arra utal, hogy az MHC II Colo205 sejtek lízise a konjugátumra korlátozódik, és a nemkonjugált SEA és C215 Mab nem indukálja a lízist. A SEA és SEA-C215 Mab konjugátum közvetíti az MHC II+ Raji-sejtek és az interferonnal kezelt MHC II+ Colo205 sejtek T-sejtek által történő pusztítását, míg a C215 Mab nem (lásd 1. ábra).
Annak igazolására, hogy a SEA-C215 Mab konjugátummal közvetített lízis a konjugátum célsejteken levő C215 Mab molekulákhoz való specifikus kötődését foglalja magában, vizsgálatokat végeztünk, amelyekben fölöslegben vett nemkonjugált C215 Mab-t és C242 Mab-t alkalmaztunk, amelyek (a C215 Mab-hoz való kötődés szempontjából) irreleváns antigénhez kötődnek a vastagbélkarcinóma-sejteken. A C215 Mab adagolása erősen blokkolta a citotoxicitást, míg a
C242 Mab nem fejtett ki ilyen hatást (lásd 2. ábra). Hasonlóképpen a SEA-C242 Mab konjugátum által történő lízist specifikusan blokkolta a nemkonjugált
C242 Mab fölöslege, míg a C215 Mab nem.
A SEA-C215 Mab konjugátum MHC II SW620 vastagbélkarcinóma-sejteket T-sejttől függő lizálóképessége mind CD4+, mind CD8+ T-sejt-populáción látható volt (lásd 2. táblázat).
SEA-C215 Mab konjugátum indukálta az SW620 és Raji sejtek SEA-val kiegészített T-sejtvonal által történő lízisét, míg SEB-bel kiegészített T-sejtvonal által történőt nem (lásd 3. ábra). A SEA- és SEB-vonalak specifitására a SEA-ra, illetve SEB-re adott szelektív válaszuk utal, ha Raji-sejteknek vannak kitéve (lásd 4. ábra). Ez arra utal, hogy a SEA C215 Mab konjugátum megtartja a nemkonjugált SEA-hoz hasonló V-béta TCR specifitását.
A mellékelt 1. ábra a SEA-C215 Mab konjugátum MHC II vastagbélkarcinóma-sejtek elleni CTL-ek irányítását mutatja. A bal felső panel mutatja a SEA-ra válaszoló SW620 sejtek elleni CTL-ek hatását különböző effektor- és célsejt arányoknál 1 pg/ml SEA-C215 Mab konjugátum, SEA, C215, valamint C215 és SEA keveréke (C215 + SEA) jelenlétében vagy a nélkül (-). A többi panel a SEA-C215 Mab konjugátumnak és SEA-nak a SEA-ra válaszoló CTL-ek irányítókapacitását mutatja SW620 C215+MHC II- vastagbélkarcinóma-sejtvonal, Colo205 és WiDr. MHC 11+ C215+ interferonnal kezelt Colo205 sejtek és C215 MHC 11+ Raji sejtek ellen. Az effektor/célsejt arány 30:1. Nemkonjugált C215 Mab adagolása különböző koncentrációknál nem indukált CTL-irányítást ezen sejtvonalak ellen. SW620 sejteken, Colo205 és WiDr sejteken HLA-DR, -DP, -DQ elleni antitestek alkalmazásával végzett FACS nem mutatott ki felületi MHC II expreszsziót, míg a HLA-DR, -DP és -DQ jelentős expreszsziója nem volt észlelhető Raji-sejteken és HLA-DR, -DP interferonnal kezelt Colo205 sejteken. A Colo205 sejteket a CTL-vizsgálatban való felhasználás előtt 48 óra hosszat 1000 egység/ml rekombináns gammainterferonnal kezeltük.
A 2. ábrán látható, hogy a SEA-C215 Mab konjugátum és SEA-C242 Mab konjugátum által indukált CTL-irányítás a vastagbélkarcinóma-sejtek ellen a Mab antigénszelektivitásától függ. A Colo205 sejtek SEA-ra válaszoló CTL-vonal által SEA-C215 Mab és SEA 242 Mab konjugátum (3 pg/ml) jelenlétében okozott lízise nem konjugált C215, illetve C242 Mab adagolásával (30 pg/ml) blokkolható. A konjugátumok adagolása előtt 10 perccel nemkonjugált Mab-ket, illetve kontroliközeget (-) adagoltunk.
A 3. ábrán látható, hogy a SEA-C215 Mab konjugátummal bevont vastagbélkarcinóma-sejtek lízisét SEA közvetíti, míg SEA-ra válaszoló CTL-ek nem. Autológ SEA és SEB szelektív T-sejtvonalakat használtunk 10:1 effektor/célsejt arányban SW620 és Raji-célsejtek ellen SEA-C215 Mab konjugátum, nemkonjugált C215 Mab és SEA keveréke (C215+SEA), valamint nemkonjugált C215 Mab és SEB keveréke
HU 218 603 Β (C215 + SEB) jelenlétében (1 pg/ml), illetve a nélkül (kontroll).
A 4. ábrán a SEA-C242 Mab konjugátum és a SEA-anti-Thy-1.2 Mab konjugátum által indukált, célsejtjeik (Colo205 tumorsejtek, illetve EL-4 tumorsejtek) elleni citotoxicitást ábrázoltuk.
1. táblázat
C215+ vastagbélkarcinóma-sejtekhez és MHC II+ Raji-sejtekhez kötött SEA-C215 konjugátum
Reagens Sejt FACS- elemzés
SEA-C215 Mab Colo205 Raji pozitív pozitív
C215 Mab Colo205 Raji pozitív negatív
SEA-C242 Mab Colo205 Raji pozitív pozitív
C242 Mab Colo205 Raji pozitív negatív
SEA-anti-Thy-1.2 Mab EL-4 pozitív
Anti-Thy-1.2 Mab EL-4 pozitív
SEA Colo205 Raji negatív pozitív
Kontroll Colo205 Raji EL-4 negatív negatív negatív
A sejteket 30 percig különböző hozzáadott szabályozóanyagokkal (PBS-BSA) jégen inkubáltuk, mostuk és a következőkben ismertetett módon feldolgoztuk. A Colo205 sejtekhez kötött C215 Mab és C242 Mab, valamint az EL-4 sejtekhez kötött anti-Thy-1.2 festésének detektálását FITC-vel jelzett nyúl anti-egér Igvel végeztük. A Raji-sejtekhez kötött SEA festésének detektálását nyúl anti-SEA szérum segítségével, majd FITC-sertés anti-nyúl lg segítségével végeztük. A Colo205 és Raji-sejtekhez kötött SEA-C215 Mab konjugátum festésének detektálását a C215 és SEA esetén ismertetett módon végeztük. A FACS-elemzést FACS star plus (Becton és Dickinson) segítségével végeztük. A második és harmadik lépésben végzett festést a háttér meghatározására végeztük.
2. táblázat
CD4+ és CD8+ CTL-ek lizálják a C215-SEA konjugátumot mutató vastagbélkarcinóma-sejteket
EffektorA Cél Citotoxicitás, %
Kontroll SEA C215-SEA
CD4+ SW620 2 5 50
CD4+ Raji 0 41 43
EffektorA Cél Citotoxicitás, %
Kontroll SEA C215-SEA
CD8 + SW620 0 1 23
CD8+ Raji 2 72 68
A: A CTL-eket (SEA-3) 30:1 effektor/cclscjt arányban alkalmaztuk 1 pg/ml SEA, illetve C215-SEA jelenlétében vagy a nélkül.

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Oldható antitestkonjugátum, azzal jellemezve, hogy egy antitestből és egy szuperantigénből áll.
2. Az 1. igénypont szerinti oldható antitestkonjugátum, azzal jellemezve, hogy (i) az alkalmazott antitest specifikus egy betegséggel kapcsolatos célsejten levő sejtfelületi szerkezetre, és (ii) az alkalmazott szuperantigén T-sejtek által felismerhető, és képes aktiválni a citotoxikus T-sejteket (CTL).
3. A 2. igénypont szerinti oldható antitestkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a szuperantigén képes kölcsönhatásba lépni egy T-sejt-receptor-komplex részeivel.
4. A 3. igénypont szerinti oldható antitestkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a szuperantigén képes kölcsönhatásba lépni egy T-sejt-receptor V-béta-lánccal.
5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az antitest specifikusan egy betegséggel, célszerűen rákkal, autoimmunitással, parazitás és mikrobiális fertőzéssel, előnyösen vírusos, gombás és baktériumos fertőzéssel kapcsolatos célsejten levő antigéndetermináns ellen irányul.
6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a betegség rák, és az antitest egy tumorsejten levő antigéndetermináns (epitóp) ellen irányul.
7. A 6. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy a tumorsejt egy vastagbél-karcinómával kapcsolatos sejt.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az antitest specifikusan a C242 epitóp ellen irányul.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy antitestcsoportként 1-5 szuperantigéncsoportot tartalmaz.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestet tartalmaz.
11. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy Staphylococcus enterotoxin szuperantigént tartalmaz.
12. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy SEA-szuperantigént tartalmaz.
13. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy az antitestet és a szuperan13
HU 218 603 Β tigént egy -B- kovalens szerves összekötő csoport köti össze, amely előnyösen legalább egy amidszerkezetet tartalmaz.
14. A 11. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy rekombináns úton van előállítva.
15. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy olyan célsejtek lízisére szolgál, amelyek egy olyan sejtfelületi antigént hordoznak, amely ellen a konjugátum antitestcsoportja irányul.
16. A 15. igénypont szerinti konjugátum, azzal jellemezve, hogy rákkal, autoimmunbetegséggel, vírus, baktérium, gomba vagy parazita által okozott fertőzéssel kapcsolatos célsejtek lízisére szolgál.
5 17. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot a gyógyszerkészítésben szokásos vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
HU9300148A 1990-07-20 1991-07-16 Célspecifikus antitest-szuperantigén konjugátumok és ezen készítmények előállítása HU218603B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9002479A SE9002479D0 (sv) 1990-07-20 1990-07-20 Antibody conjugates
SE9002484A SE9002484L (sv) 1990-07-20 1990-07-20 Nya substituerade polyetrar

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9300148D0 HU9300148D0 (en) 1993-04-28
HUT67502A HUT67502A (en) 1995-04-28
HU218603B true HU218603B (hu) 2000-10-28

Family

ID=26660818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300148A HU218603B (hu) 1990-07-20 1991-07-16 Célspecifikus antitest-szuperantigén konjugátumok és ezen készítmények előállítása

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0610179B1 (hu)
JP (1) JP3334130B2 (hu)
KR (1) KR100189024B1 (hu)
AT (1) ATE144145T1 (hu)
AU (1) AU656906B2 (hu)
CA (1) CA2087164C (hu)
DE (1) DE69122777T2 (hu)
DK (1) DK0610179T3 (hu)
ES (1) ES2094231T3 (hu)
GR (1) GR3022202T3 (hu)
HK (1) HK1007955A1 (hu)
HU (1) HU218603B (hu)
LV (1) LV10201B (hu)
NO (1) NO312816B1 (hu)
RU (1) RU2125889C1 (hu)
WO (1) WO1992001470A1 (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6042837A (en) * 1989-09-20 2000-03-28 Kalland; Terje Methods of staphylococcal enterotoxin directed cell-mediated cytotoxicity (SDCC)
US6126945A (en) 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US5728388A (en) * 1989-10-03 1998-03-17 Terman; David S. Method of cancer treatment
US6197299B1 (en) 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
SE9102074D0 (sv) * 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
GB9114399D0 (en) * 1991-07-03 1991-08-21 Ici Plc Conjugates
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
ES2193143T3 (es) * 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
EP0659438A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh Conjugates consisting of peptidic T cell antigens and cell binding groups, and their use for therapy
GB9326574D0 (en) * 1993-12-31 1994-03-02 King S College London Dry power inhalers
SE9402430L (sv) 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
ES2299177T3 (es) 1995-05-10 2008-05-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Conjugados de citotoxinas que contienen dipeptidos.
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
TW517061B (en) 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
JP2002520297A (ja) 1998-07-13 2002-07-09 ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム アミノリン脂質に結合する治療結合体を用いる癌処置方法
US6818213B1 (en) 1998-07-13 2004-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
US4806494A (en) * 1986-07-24 1989-02-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Monoclonal antibody against ovarian cancer cells (OVB-3)
GB8626413D0 (en) * 1986-11-05 1986-12-03 Gilliland L K Antibodies
US4981979A (en) * 1987-09-10 1991-01-01 Neorx Corporation Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity
US5004692A (en) * 1987-12-15 1991-04-02 Protein Design Labs, Inc. Cloning and expression of phosopholipase C genes
IL89504A0 (en) * 1988-03-08 1989-09-10 Univ Wyoming Diphtheria toxin derivative,process for the preparation thereof and pharmaceutical composition containing the same
EP0334300A1 (en) * 1988-03-21 1989-09-27 Neorx Corporation The use of monoclonal antibodies and conjugates thereof as signals to direct sensitized effector cells to tumor sites
JPH02196799A (ja) * 1988-04-08 1990-08-03 Agency Of Ind Science & Technol 抗ヒト癌蛋白複合体

Also Published As

Publication number Publication date
DE69122777T2 (de) 1997-04-10
NO930174L (no) 1993-01-19
AU8294191A (en) 1992-02-18
JP3334130B2 (ja) 2002-10-15
GR3022202T3 (en) 1997-03-31
ATE144145T1 (de) 1996-11-15
KR100189024B1 (ko) 1999-06-01
LV10201A (lv) 1994-10-20
WO1992001470A1 (en) 1992-02-06
CA2087164A1 (en) 1992-01-21
HU9300148D0 (en) 1993-04-28
DK0610179T3 (da) 1997-03-24
RU2125889C1 (ru) 1999-02-10
HK1007955A1 (en) 1999-04-30
AU656906B2 (en) 1995-02-23
NO312816B1 (no) 2002-07-08
ES2094231T3 (es) 1997-01-16
HUT67502A (en) 1995-04-28
JPH05508856A (ja) 1993-12-09
NO930174D0 (no) 1993-01-19
EP0610179B1 (en) 1996-10-16
LV10201B (en) 1995-08-20
EP0610179A1 (en) 1994-08-17
CA2087164C (en) 2002-11-26
DE69122777D1 (de) 1996-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0610179B1 (en) Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
US6197299B1 (en) Antibody conjugates
JP6548579B2 (ja) コンジュゲート化合物
EP0510949B1 (en) Cytomodulating conjugates of members of specific binding pairs
JP3234980B2 (ja) 新規な二官能性化合物を含むコンジュゲートの製法
US5858363A (en) Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
EP0354729B1 (en) Cytotoxic drug conjugates
JPH09503511A (ja) 細胞および血清タンパク質アンカー並びに接合体
AU619614B2 (en) Antibody-drug conjugates
JP3062696B2 (ja) 新規リンカーを有するアントラサイクリンコンジュゲート及びその製造法
JPH10511989A (ja) 特異的結合ペア構成要素の細胞調節性複合体
US5272253A (en) Cluster conjugates of drugs with antibodies
US11207420B2 (en) Cytotoxin and conjugate, uses of same and preparation method therefor
AU657483B2 (en) Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
HU211917A9 (en) Antibody conjugates
LT3909B (lt) Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose
US20240197907A1 (en) Dual-Cleavage Ester Linkers for Antibody-Drug Conjugates
Nagl Chemistry meets Cancer Immunotherapy: Synthesis and Characterization of Hapten-like Compounds for Selective Immunotherapy
Saito Enhanced cytosolic delivery of DNA by a sulfhydryl-activatable listeriolysin O biconjugate: Implication for DNA vaccination

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: ACTIVE BIOTECH AB, SE

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees