LT3909B - Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose - Google Patents

Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose Download PDF

Info

Publication number
LT3909B
LT3909B LTIP1632A LTIP1632A LT3909B LT 3909 B LT3909 B LT 3909B LT IP1632 A LTIP1632 A LT IP1632A LT IP1632 A LTIP1632 A LT IP1632A LT 3909 B LT3909 B LT 3909B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
conjugate
antibody
superantigen
group
cell
Prior art date
Application number
LTIP1632A
Other languages
English (en)
Inventor
Terje Kalland
Gunnar Hedlund
Mikael Dohlsten
Peter Lando
Eva Akerblom
Original Assignee
Kabi Pharmacia Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Pharmacia Ab filed Critical Kabi Pharmacia Ab
Publication of LTIP1632A publication Critical patent/LTIP1632A/xx
Publication of LT3909B publication Critical patent/LT3909B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/04—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C217/06—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted
    • C07C217/08—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted the oxygen atom of the etherified hydroxy group being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/50—Ethers of hydroxy amines of undetermined structure, e.g. obtained by reactions of epoxides with hydroxy amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C255/00—Carboxylic acid nitriles
    • C07C255/01—Carboxylic acid nitriles having cyano groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C255/11—Carboxylic acid nitriles having cyano groups bound to acyclic carbon atoms containing cyano groups and singly-bound oxygen atoms bound to the same saturated acyclic carbon skeleton
    • C07C255/13—Carboxylic acid nitriles having cyano groups bound to acyclic carbon atoms containing cyano groups and singly-bound oxygen atoms bound to the same saturated acyclic carbon skeleton containing cyano groups and etherified hydroxy groups bound to the carbon skeleton

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Tirpstantis antikūno konjugatas, turintis antikūną, sujungtą su struktūra, kurią atpažįsta T-ląstelės, sugebančia nukreipti T-ląsteles ląstelių-taikinių, atpažįstamų antikūnu, ūžavimui. Konjugatas pasižymi tuo, kad nurodyta struktūra yra superantigenas. Svarbiu aspektu yra ląstelių-taikinių ūžavimo būdas, pagal kurį ląstelės-taikiniai kontaktuoja su efektyviu ląstelių-taikinių ūžavimui konjugato kiekiu. Lizavimo būdas yra efektyvaus vėžio, autoimuninių susirgimų, užkrėtimų parazitais ir infekcijų, sukeltų grybeliais, virusais ir bakterijomis gydymo režimo dalis. Aprašyme pateikiami taip pat tokie aspektai, kaip konjugato sintezė, farmacinės kompozicijos ir jų paruošimas.

Description

Šis išradimas skirtas antikūnų konjugatams, kurie gali aktyvinti. ..citotoksines ... T-ląsteles . (CTL) . Konjugatai naudojami suardymui nepageidaujamų ląstelių, susijusių su įvairiomis vėžio formomis, autoimuniniais procesais, parazitiniais užkrėtimais ir bakterinėmis, virusinėmis ir grybelinėmis infekcijomis.
Žinomi bandymai panaudoti antikūnus derinyje su agentais, darančiais tiesioginį toksinį poveikį ląstelėmstaikiniams (citotoksiniai agentai, citotoksinai), užtikrinant selektyvinį ląstelių-taikinių paveikimą ir užkertant kelią bei sumažinant nespecifinį poveikį kitoms ląstelėms. Pasiūlytos kombinacijos apima sritį nuo kovalentiškai sujungtų kompleksų, panaudojant molekulestiltelius, ir nekovalentiškai sujungtų kompleksų iki paprastų mišinių (pvz., Ghose et ai., J. Nate. Cancer Inst. 61 (1979)657-676; Karlsson et ai., Biotechnology 7(1989)567-73). Žinomi tokie citotoksinai, kaip difterijos toksinas, ricinas, ricino domenas A, geloninas ir Pseudomonas aeruginoso egzotoksinas A (Takada Chemical Ind., EP-A-336405 ir Pastan ir kt., WO-A-38/00703; abu šaltiniai pacituoti ryšium su prioritetine paraiška SE9002479).
Pasirodžius hibridomų technologijai ir ją lydintiems monokloniniams antikūnams tapo galimu panaudoti kompleksus, sudarytus iš antikūnų ir citotoksinių junginių tam, kad specifiškiau nukreipti citotoksinius agentus į reikalingą ląstelių-taikinių populiaciją.
Kadangi žinomas citotoksinių ląstelių pažeidžiantis poveikis kitoms ląstelėms, besiskiriančioms nuo ląsteliųtaikinių, pasiūlyta citotoksinius agentus pakeisti imunostimuliatoriais, stimuliuojančiais T-limfocitus ir aktyvuojančiais CTL. Konkretūs pasiūlymai lietė antikūnus, konjuguotus su:
(i) antikūnais, nukreiptais prieš T-ląstelių receptorius, arba junginiais, sugebančiais jungtis su Tląstelių receptoriais (Mass. Inst. Techn., EP-AI180171);
(ii) junginiais, tokiais kaip antigenai, mitogenai, kiti svetimi baltymai ir peptidai, kurie aktyvina citotoksines T-ląsteles (Noereks Korp., EP-AI334300);
(iii) Pagrindinio audinių suderinamumo komplekso antigenais (PASKA) (Begringverco AG EP-AI-352761);
(iv) antigenais, prieš kuriuos gydomasis asmuo turi imunitetą (Med. Ros. Counc. WO-A-90/II779 (skelbt. 1990.10.18)); ir (v) neįvardintu bakteriniu enterotoksinu (Ochi ir Wake, Simpoziumas UCLA: Ląstelinis imunitetas ir vėžio terapija, 1990 m. sausio 27-vasario 30 d.d., pranešimo CE 515 tezės, 109 psl.).
Tačiau iki šiol pasiūlyti imunostimuliatoriai savo veikimu buvo arba labai specifiški, arba labai bendri. Pvz., klasikiniai antigenai aktyvina tik apie I iš 105 T-ląstelių, tuo tarpu kai mitogenai potencialiai gali aktyvinti daugumą iš jų.
Buvo nustatyta, kad kai kurie agentai aktyvina T-ląsteles saikingai, t.y. jie aktyvina T-ląsteles gana aukštu dažnumu, tačiau toli gražu ne 100%. /Fleisher et ai., J. Exp. Med., 157 (1988)1697-1707; Wait et ai.,
Cell, 56(1989)27-35; abu straipsniai įtraukti į šį aprašymą kaip nuorodos/. Šio tipo agentai yra efektyvesni aktyvintojai, negu klasikiniai antigenai, ir todėl jie gavo pavadinimą superantigenai/apžvalgai žr.: Keccler ir Marrac, Science 248:705, (1990)/. Toliau, buvo paLT 3909 B rodyta/Doglsten et ai., Immunol. 71(1990)96-100; Chedlund et ai., Cell Immunol. 129(1990)426-34/, kad ži-nomi superantigenai gali ant ląstelių-taikinių susijungti su pagrindinio audinių suderinamumo komplekso (PASK) II Klasės molekulėmis ir aktyvinti citotoksines T-ląsteles, turinčias T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandinę. Paskelbti duomenys rodo, kad jungimasis su PASK yra būtina išankstinė sąlyga tam, kad įvyktų T-ląstelių surišimas ir aktyvacija. Negalima atmesti ir tai, kad ateityje bus rasti superantigenai, veikiantys per T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos alfa-grandinę, arba per kitas paviršiaus struktūras, esančias T-ląstelių subpopuliacijose.
Superantigeno-Staphylococcus enterotoksino A imunomoduliuojantis poveikis taip pat buvo aprašytas Platsokus et ai., /Cell Immunol., 97(1986)371-85/.
Daugumai dabar žinomų superantigenų anksčiau buvo nustatyta, kad jie yra toksinai ir yra mikrobinės kilmės. Stafilokokų enterotoksinai, pvz., yra enterotoksiški ir aktyvina T-ląsteles, ir šie du efektai skiriasi vienas nuo kito/Fleisher et ai., Cell Immunol., 118(1989)92101; Alber et ai., J. Immunol., 144 (1990) 4501-06; ir Infact. Immun. 59(1991)2126-34/.
Anksčiau buvo pasiūlyta panaudoti superantigenus tam, kad nukreipti CTL vykdomą ūžavimą ląstelių, turinčių II Klasės pagrindinio audinių suderinamumo komplekso antigenus (PASKA), (Farmacia AB, WO-A-91/04053, paskelb. 1991.04.04). WO-A-91/04053 apima superantigenus, bet nemini įjungtų į kovalentinius imunokonjugatus. Ląstelės, neturinčios II Klasės PASK baltymų, arba ekspresuojančios šių baltymų slenkstinius kiekius, nesuriša pakankamų superantigenų kiekių, kad efektyviai nukreiptų jų ližę CTL. Tokiu būdu, dėl didelio bendro kiekio ląstelių, nešančių II Klasės PASKA ir dėl mažo kiekio II Klasės PASKA ant daugumos vėžinių ląstelių, superantigenai neturi turėti didelės vertės tokių nepageidaujamų ląstelių specifinio sunaikinimo požiūriu.
Tačiau, mūsų buvo aptikta, kad ląstelių naikinimo, vykdomo CTL, specifinis efektas gali būti pasiektas superantigenų pagalba, jeigu jie kovalentiškai sujungti su antikūnu prieš epitopą, kuris yra specifinis naikinamąja! ląstelei. Imuninės sistemos aktyvacija gali iššaukti II Klasės PASKA ekspresiją ląstelėmis-taikiniais, neturinčiomis šių antigenų, kas, savo ruožtu, gali padaryti galimu pageidaujamą lizuojantį efektą.
Trumpas išradimo esmės išdėstymas
Šis išradimas apima (i) naujus antikūnų konjugatus, turinčius (I) antikūną prieš ląsteles-taikinius, ir (2) superantigeną. t.y. struktūrą, kuri atpažįsta (sąveikauja ir/arba susijungia) ir aktyvina T-ląsteles, ypatingai CTL;
(ii) ląstelių-taikinių suardymo būdus, ypatingai ryšium su terapiniais žinduolių gydymo metodais, ir T-ląstelių, tokių kaip CTL, specifinio aktyvumo būdus;
(iii) konjugatų sintezės būdus; ir (iv) turinčias konjugatus farmacines kompozicijas ir šių kompozicijų paruošimo būdus.
Ląstelių-taikinių sunaikinimo būdai apima terapinio vėžio, virusinių, bakterinių, grybelinių infekcijų, parazitinių užkrėtimų ir kitų susirgimų gydymo metodus, kuriuose pagrindinis tikslas yra tam tikrų ląstelių sunaikinimas, pasiekiant aukštą tikslumo laipsnį. Sutinkamai su šiuo išradimu, konjugatai gali būti panaudojami gaunant farmacines kompozicijas, skirtas ląsLT 3909 B telių-taikinių, susijusių su aukščiau paminėtais susirgimais, suardymui. Gydymo objektai yra žinduoliai, pirmoje eilėje žmonės.
Superantigeninė konjugato dalis
Nauji antikūnų konjugatai pasižymi struktūra, kurią atpažįsta T-ląstelės, kadangi ji yra superantigenas. Paprastai konjugatai tirpsta prie fiziologinių pH reikšmių, o ir vitro jie tirpsta serume.
Geriausiu atveju superantigenus renka iš stafilokokų enterotoksinų (SE) grupės, tokius, kaip SEA, SEB, SEC, SĖD, ir SEE, toksoidų, jų aktyvių fragmentų arba peptidų, ir kitų junginių, pasižyminčių iš esmės tokiu pat veikimo charakteriu CTL aktyvinime. Į superantigenus gali įeiti kiti mikrobiniai produktai (bakteriniai ir virusiniai) , tokie, kaip produktai iš stafilokokinių štamų, pvz., toksinio šoko sindromo toksinai (TSST-I) iš Strept. okocci, pvz., pirogeninis egzotoksinas A, ir bakteriniai ekzoproteinai ir baltymai, gaminami pleuropneumonioidinių mikroorganizmų, turinčių panašų sugebėjimą sąveikauti su T-ląstelėmis taip, kaip sąveikauja su jomis superantigenai. Superantigenai gali būti gaunami auginant jų gamtinius gamintojus arba ląsteles, gautas geninės inžinerijos metodais (rekombinantiniais metodais), ir potencialiai - taip pat peptidine sinteze. Superantigenas, naudojamas šio išradimo rėmuose, bandant jį ant pateikiamo šiame aprašyme eksperimentinio modelio, turi parodyti veikimą, analogišką tam, kuris pristatytas šio aprašymo eksperimentinėje dalyje.
Optimalūs superantigenai turi potencialų sugebėjimą susijungti su T-ląstelių paviršiaus 1-40 % izoformų polimorfinio baltymo, susijusio su CTL aktyvacija, optimaliausia - su T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandine.
Konjugato antikūninė (AK) dalis
Antikūnas geriausiu atveju yra monokloninis antikūnas (monAK), nors gali būti panaudoti ir polikloniniai antikūnai, jei jie turi pakankamai siaurą specifiškumo intervalą. Terminas antikūnas yra taikomas antikūnams visumoje, ir, tokiu būdu, apima antikūnų aktyvuosius fragmentus ir kitas molekules, imituojančias antikūnų surišamąjį sugebėjimą, su sąlyga, kad jie pasižymi atitinkamu specifiškumu, aviditetu ir giminingumu duotos ląstelės-taikinio atžvilgiu. Į čia įeina genų inžinerijos metodais (rekombinantiniais metodais) gauti antikūnai, antikūnų dariniai, ir kitos struktūros su panašiu surišimo sugebėjimu. Viename išradimo realizavimo variante antikūnas yra specifinis vėžinių ląstelių antigeninei determinantei, pvz., determinantei, susijusiai su storosios žarnos vėžiu (epitopas, struktūra). Taip pat suprantama, kad antikūnas gali būti specifinis antigeninei determinantei ant atsakingų už autoimuninę reakciją ląstelių, ląstelių, užkrėstų virusu, bakterijų, parazitų, grybelių arba kitų nepageidaujamų ląstelių. Priklausomai nuo konjugato efektyvumo, antikūnas gali būti nukreiptas prieš antigeną, internalizuojantį antikūną po sujungimo, nors ir yra požiūris, kad tokie specifiniai antikūnai nėra optimaliausi.
Ryšium su šiuo išradimu, ištirtais monokloniniais antikūnais yra antikūnas C215 prieš GA-733 šeimos antigeną /žr. pvz., EP-A-376746 ir cituotas šiame šaltinyje nuorodas, ir Larsson et ai., Int. J. Canc. 42(1988)87782/, antikūnas C242 /Larsson et ai. Int. J. Canc. 42(1988)877-82/ ir antikūnas Thy-1.2 /monAK C, Opitz et ai., Immunobiol. 160(1982)438-/. Suprantama, kad gali būti panaudoti monokloniniai AK, specifiški kitoms ląstelių-taikinių paviršinėms struktūroms. Paruošimas monokloninių antikūnų prieš epitopus, unikalių pasirinktoms ląstelėms-taikiniams, gerai žinomas. Žiūrėk, pvz., anksčiau minėtas publikacijas. Tokie išsireiškimai, kaip monokloniniai antikūnai prieš C242-epito_pą arba C215-epitopą, apima antikūnus, reaguojančius su kryžmai reaguojančiais epitopais.
Iš trijų išbandytų monokloninių antikūnų C125-konjugatai, pagal viską, mažiausiai įdomūs, kadangi jie reaguoja su epitopu vėžio antigene, kuris labai dažnai ekspresuojasi normaliose ląstelėse. C242-konjugatai, išeinant iš specifiškumo duomenų, atrodo labiau perspektyvūs, nors mūsų rezultatai rodo, kad jie gali pareikalauti didesnių dozių. MonAK C prieš Thy-1.2, galbūt, nebus vertingi kovoje su žmogaus vėžinėmis ląstelėmis, kadangi antigenas Thy-1.2 yra specifiškas ne žmogaus, o kitų žinduolių vėžio ląstelėms.
Linija hibridomos ląstelių, gaminančių monokloninį antikūną C242, buvo padėta saugoti į Europos Gyvulinių ląstelių kultūrų kolekciją, Porton Down, Selisberi, Wilts, England, 1990.01.26, Nr. ECACC 90012601.
Struktūra, sujungianti superantigeną su antikūnu
Sutinkamai su šiuo išradimu, tinkamame konjugate superantigenas kovalentiškai sujungtas su antikūnu per kovalentinę jungtį-tiltelį (-B-) . Svarbu, kad konjugatas nesuirtų panaudojant jį prieš ląsteles, skirtas sunaikinimui, pvz., įvedant gyvuliui. Todėl tiltelis turi būti metaboliškai atsparus gana ilgą laiką, kad būtų pasiektas efektas. Be to, reikia, kad pats tiltelis nesukeltų imunologinių reakcijų. Bendrai, tiltelis turi būti inertinis ta prasme, kad konjugatas išsaugotų aukš-tą specifiškumą susirišant su ląstelėmis-taikiniais (priešvėžinį, priešvirusinį ir t.t.) ir didelį sugebėjimą aktyvinti citotoksines T-ląsteles.
Mokslinėje ir patentinėje literatūroje buvo pasiūlyta keletas funkcinių grupių, galinčių atlikti tiltelių vaidmenį imunokonjugatuose. Atitinkamai, tiltelis -Bsiūlomuose naujuose konjugatuose gali turėti struktūras, pasirinktas iš grupės, sudarytos iš: (i) amidų ir hidrazidų (amidai -CONRX arba -NRXCO-, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų sujungtas su sočiuoju anglies atomu, o Rx gali būti vandenilis ar alkilas, toks, kaip žemesnioji alkilo grupė (Cx.6) arba gamtinės alfa-aminorūgšties alfa-N-pakaitas, geriausiai, hidrofilinės aminorūgšties; ir hidrazidai -CONHNH- arba -NHNHOC-, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų sujungtas su sočiuoju anglies atomu;
(ii) tioeterių ir disulfidų (—Sr—, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu, S yra sieros atomas, ir r yra sveikas skaičius, lygus 1 arba 2);
(iii) nešakotų, šakotų arba ciklinių angliavandenilių, kurie yra sotūs ir gali turėti vieną ar keletą hidroksilo ar aminogrupės pakaitų;
(iv) eterių (-0-, kur kiekvienas laisvas valentingumas betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu); ir (v) pirminių aminų arba dipakeistų hidrazinų (-NH- arba -NH-NH-, atitinkamai, kur kiekvienas iš laisvų valentingumų betarpiškai sujungtas su sočiuoju anglies atomu) .
Tiltelio ilgis yra ribose, naudojamose šioje srityje, tai yra mažiau, negu 180 atomų, pvz., mažiau negu 100 atomų, bet turi būti daugiau negu 3-6, geriausia, daugiau, negu 16 atomų.
Tinkamesnis tiltelis yra hidrofilinis ir jame neturi būti kokių nors aromatinių ciklų. Tinkamesnėmis hidrofilinėmis struktūromis, kurios gali sudaryti tiltelio -B- dalį, yra: (i) gamtinių hidrofilinių alfa-aminorūgščių polipeptidinės grandinės (pvz., asparagino rūgšties ir jos amido, gliutamino rūgšties ir jos amido, lizino, arginino, glicino, treonino, serino, ir, gal būt, taip pat histidino) ; (ii) oksialkileninės grandinės, tokios kaip /-0 (CH2) n/n,, kur n yra sveikas skaičius nuo 2 iki 5, geriau 2 arba 3, ir n'gali būti sveikas skaičius nuo I iki 20; ir (iii) -S- (tioeteriai), -0- (eteriai) ir nepakeisti amidai (-CONH-) , kiekvienas iš kurių sujungtas su trumpomis nepakeistomis angliavandenilinėmis grandinėmis (C1_4) , geriau, turinčiomis I ar 2 anglies atomus.
Hidrofilinės aminorūgštys gali būti hidrofilinėse tipo /F-(02o)n/mF struktūrose, kur F yra aminorūgščių seka, geriau, iš 4-8 liekanų, kur kiekviena aminorūgštis pasirenkama iš serino, glicino ir treonino, m yra sveikas skaičius nuo 1 iki 4, ir n yra sveikas skaičius nuo 4 iki 8 (Cetus Corp., WO-A-85/03508).
Tiltelis -B- gali būti pritvirtintas arba konkrečiose vietose antigeno ar superantigeno dalyse konjugate, arba atsitiktinėse vietose. Potencialios vietos yra amino galas, karboksilo galas ir lizino liekana (omega-aminogrupė). Jei antikūne ar superantigene yra merkapto grupė arba disulfido grupė (cistinas arba cisteinas, atitinkamai) , tai šios grupės taip pat gali būti naudojamos kovalentiniam sujungimui, jei tik jos nevaidina esminio vaidmens aktyvių konjugato dalių darbe. Angliavandenių struktūros, jei jos yra, gali būti oksiduotos iki aldehidų grupių, kurios, savo ruožtu, gali būti panaudotos sujungimui su kita konjugato dalimi (Cetus Corp., EP-A-240200).
Konjugate, siūlomame šiame išradime, neturi būti daug esterinių ir labilių amidinių jungčių, ypač sudaromų tirozinų ir histidinų liekanų, atitinkamai. Jei sintezuojant susidarė tokios jungtys, jas reikia pašalinti naudojant hidroksilaminą /Endo et ai., Cancer Res. 48(1988)3330-3335/. Konjugate esančių superantigeninių fragmentų, tenkančių vienam aktyviam AK fragmentui, skaičius, paprastai sudaro 1-5, dažniausiai 1 arba 2.
Gerame variante konjugatas turi būti iš esmės vientisas superantigenas/antikūnas proporcijos atžvilgiu, ir/arba panaudotų surišimo vietų superantigene ir antikūne, atitinkamai, ir/arba tiltelio -B- atžvilgiu, ir pan. Kitaip sakant, visos atskiros konjugato molekulės, sudarančios konjugatą kaip medžiagą, turi būti vienodos šių besikeičiančių charakteristikų atžvilgiu.
Medžiaga turi būti iš esmės laisva nuo nesurištų antikūnų arba superantigenų.
Tikslus santykis superantigenas/antikūnas, tiltelio struktūra ir pan., optimaliame konjugate priklauso nuo pasirinkto monokloninio antikūno (įskaitant klasę, poklasį, produkuojantį kloną, specifiškumą) ir pasirinkto superantigeno. Pateikti šiame aprašyme eksperimentiniai modeliai leidžia atrinkti pagal optimalius parametrus taip pat ir kitus superantigenus ir antikūnus .
Pagal išradimo realizavimo variantą, labiausiai ištirtą iki paraiškos padavimo datos, tiltelis -B- turi struktūrą :
-SrRCONHCH2CH2 (OCH2CH2) nO (CH2)mCOY- (I)
Laisvi valentingumai formulėje I sujungti su aktyviomis dalimis, atitinkamai. Tai yra betarpiškai, arba per kiLT 3909 B tas dvivalentes inertines struktūras, esančias tiltelyje -B-.
n yra sveikas skaičius didesnis už O, pvz., 1-20, geriau 2 arba daugiau 2, ir daugeliu atvejų mažiau 10. m lygus 1 arba 2.
S yra sieros atomas, ir kiekvienu savo valentingumu sujungtas betarpiškai su anglies atomu (-Sr- yra tioeteris ar disulfidas), r lygus 1 ar 2.
Y yra -NH-, -NHNH-, arba -NHN=CH- grupės, kurios savo kairiaisiais galais surištos su CO grupe, pavaizduota dešiniojo I formulės galo dalyje, o savo dešiniuoju galu - su sočiu anglies atomu arba su karboksilo grupe (tiktai, jeigu Y yra -NHNH-).
R, geriau, yra alkileno grupė (turinti nuo 1 iki 4 anglies atomų, dažniausiai, 1 ar 2 anglies atomus), kuri gali būti pakeista viena ar keliomis (1-3, tinkamiausiu atveju mažiau negu 2) hidroksilo grupėmis.
Antikūno-superantigeno konjugato gavimas
Sutinkamai su šiuo išradimu antikūnų konjugatai gali būti gauti prisotinimo keliu ir jų išskyrimo iš produkuojančių juos ląstelių kultivavimo terpės, arba iš kitų terpių, kuriose jie buvo susintetinti.
Naujų konjugatų sintezė gali būti įvykdyta žinomais šioje srityje metodais, pvz., genų inžinerijos metodais (rekombinantiniais metodais) arba iš atitinkamo antikūno ir antigeno, klasikinių kondensacijos reakcijų pagal tinkamas funkcines grupes pagalba. Baltymuose yra ir paprastai naudojamos šios funkcinės grupės:
(i) Angliavandenių struktūros. Ši struktūra gali būti oksiduota iki aldehidų grupių, kurios, savo ruožtu, reaguoja su junginiais, turinčiais H2NNH- grupę, susidarant -C=NH-NH-grupei.
(ii) Merkapto grupė (HS-). Merkapto grupė gali reaguoti su junginiu, turinčiu grupę, galinčią sąveikauti su merkapto grupe, susidarant tioeterio grupei arba disulfido grupei. Laisvos merkapto grupės yra baltymuose cistinų liekanose, ir gali būti įvestos į baltymus tiolinant arba suskaldant disulfidus gamtinių cisteinų liekanose.
(iii) Laisvos aminogrupės (H2N-) aminorūgščių liekanose. Aminogrupės gali reaguoti su junginiais, turinčiais elektrofilinę grupę, tokią kaip aktyvuota karboksilo grupė, susidarant amido grupei. Geriau, laisva aminogrupė yra lizino liekanos galinė aminogrupė arba omega-aminogrupė.
(iv) Laisvos karboksilų grupės aminorūgščių liekanose. Karboksilo grupė gali būti paversta aktyvuota karboksilo grupe, kuri po to reaguoja su junginiu, turinčiu aminogrupę, susidarant amido grupei. Tačiau turi būti imtasi atsargumo priemonių, kad minimaliai susidarytų amidų su aminogrupėmis, kurios yra greta karboksilo grupių tame pačiame baltyme. Dažnai laisva karboksilo grupė yra galinė karboksilo grupė arba karboksilo grupė dvibazinėje alfa-aminorūgštyje.
Junginiai, turintys H2NNH- grupę, galinčią reaguoti su merkapto grupe, aktyvuota karboksilo grupe ar aminogrupe, gali būti bifunkciniu kondensacijos reagentu, arba antikūnu, ar superantigenu. Grupės sujungiamos betarpiškai su sočiu anglies atomu, išskyrus H2NNH- grupę, kuri, kaip alternatyva, gali būti sujungta su karLT 3909 B bonilo anglies atomu. Grupės gali būti įvestos į antikūną arba superantigeną paprasto pakeitimo pagalba.
Rekombinantiniai metodai yra efektyvios priemonės gavimui konjugatų, kuriuose dalys specifiškai sujungtos viena su kita jungtimi tarp galinės karboksilo grupės vienoje dalyje su galine aminogrupe kitoje dalyje. Taip pat gali būti įvesta jungiančioji struktūra, suderinama su naudojamu metodu.
Naudojami reagentai parenkami tokiu būdu, kad gautų apibūdintą anksčiau tiltelį -B-. įprasti bifunkciniai reagentai turi formulę Z -B'-Z', kur Z ir Z' yra funkcinės grupės, suderinamos viena su kita, įgalinančios realizuoti kovalentinį sujungimą su funkcine grupe, esančia baltyme. Žr. aukščiau, B yra inertinis tiltelis, kuris gali turėti tas pačias struktūras, kaip ir anksčiau paminėtas tilteliui -B-. Konkrečiai, Z ir Z' gali būti vienodi ar skirtingi ir parenkami iš merkapto grupės, grupės, galinčios reaguoti su merkapto grupe, aktyvuotos karboksilo grupės, -CONHNH2, ir 1.1. Šių grupių apibūdinimą žr. toliau, poskyriuje Nauji reagentai .
Į mūsų vartojamų konjugatų, naudotų eksperimentinėje dalyje, gavimo būdą įeina:
(i) antikūno ir superantigeno reakcija su organiniu reagentu, turinčiu grupę, galinčią reaguoti su merkapto grupe, ir grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant antikūną arba superantigeną, turintį grupę, galinčią reaguoti su merkapto grupe, ir (ii) superantigeno ir antikūno likusios dalies reakcija su organiniu reagentu, turinčiu merkapto grupę, ir grupę, galinčią reaguoti su amino grupe, gaunant superLT 3909 B antigeną arba antikūną, turintį merkapto grupę arba blokuotą merkapto grupę, po ko (iii) stadijose (i) ir (ii) gauti produktai sąveikauja vienas su kitu, susidarant konjugatui, kuriame superantigenas sujungtas su antikūnu disulfidine ar tioeterine jungtimi.
Kondensacijos sąlygos kiekvienai grupei baltymų chemijoje žinomos. Kondensacija gali vykti stadijomis arba vienoje stadijoje, susidarant tarpinėms funkcinėms grupėms, kurios gali būti prijungtos prie pradinių medžiagų inertiniais speiseriais. Bendru atveju, sąlygos, kuriose vykdoma sintezė ir valymas/konjugato išskyrimas, visuomet yra tokios, kad nesukeltų naudojamų baltymų denatūracijos. Paprastai tai yra vandeninės terpės, pH reikšmių diapazonas - nuo 3 iki 10, ir temperatūra nuo 0 iki 50°C. Konkrečios sąlygos priklauso nuo to, kokios grupės reaguoja ir kokį konjugatą reikia išskirti. Detaliau žr. poskyryje Nauji reagentai.
Nauji reagentai (sukurti ryšium su šiuo išradimu)
Konjugatų, turinčių -B- tiltelį, cheminei sintezei buvo sukurtas naujas heterobifunkcinis reagentas, turintis bendrą formulę II:
Z1RCONHCH2CH2 (OCH2CH2)nO (CH2) „Z'! (II) kur m ir n turi tas pačias reikšmes, kaip ir anksčiau paminėtoje formulėje (I) . Z1 yra elektrofilinė grupė, galinti reaguoti su HS- grupe, merkapto (-SH) arba blokuota merkapto grupe (pavyzdžiui, AcS-), su sąlyga, kad merkapto ir hidroksilo grupės negali būti sujungtos su tuo pačiu anglies atomu R radikale. Elektrofilinės grupės, galinčios reaguoti su HS- grupe, yra šios:
(i) halogenas, sujungtas su sočiuoju anglies atomu, geriau, alfa-halogen-alkilkarbonilo formoje (pvz., ZLCH2CO-) ;
(ii) aktyvuota merkapto grupė, geriau, taip vadinamas reaktingas disulfidas (-SSR!), sujungtas su sočiuoju anglies atomu;
(iii) 3, 5-diokso-I-aza-ciklopent-3-en-I-ilas.
Reaktingo disulfido apibūdinimas, žr. pvz., EP-A-125885, duotas šiame aprašyme nuorodoje.
Ζ'γ yra aktyvuota karboksilo grupė, tai yra, elektrofilinė grupė. Pavyzdžiais yra karboksirūgščių halogenanhidridai (-COC1, -COBr ir -COJ), karboksirūgščių mišrūs anhidridai (-COOCRJ , reaktingi esteriai, tokie kaip N-sukcinimidiloksi karbonilas, -C (=NH)-0R2, 4-nitrofenilkarboksilatas (-CO-OC6H4NO2) ir 1.1. R! ir R2 gali būti žemesnieji alkilo radikalai (Cx-C6) ; be to, R2 gali būti taip pat benzilo grupė.
Vienas iš naujų reagentų pranašumų yra tai, kad jie įgalina gauti vienalytį konjuguotą junginį sveiko skaičiaus n reikšmių struktūroje (OCH2CH2) n atžvilgiu, t.y. n yra vienodas kiekvienai atskirai duoto konjuguoto junginio molekulei.
Funkcinės grupės, reaguojančios su Z\ ir Zx gali būti gamtinėse antikūnų ir superantigenų molekulėse, arba jos gali būti į jas įvestos. Po to galinės Z\ ir Z4 grupės gali selektyviai reaguoti su atitinkamais antikūnu ar superantigenu būdais, žinomais šių tipų grupėms .
Į žinomas metodikas įeina grandinės, kurią pradeda nuo naujo reagento, arba nuo junginių, kuriuos reikia konLT 3909 B juguoti, liginimas. Grandinės liginimas, panaudojant naują reagentą, gali duoti konjugatą, kuriame -B- yra:
(1) -COR'-Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2)nO (CH2)mCOY-;
CO sujungtas su NH (2) -COR ’ -Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) nO (CH2) mCONHNH-R -NHN=;
N= paprastai sujungtas su sp -hibndizuotu anglies atomu, gautu iš oksiduotos struktūros angliavandenio, esančio antikūnyje arba superantigene (kai jie yra glikoproteinai), (3) -CO (CH2) mO (CH2CH2O) nCH2CH2NHCOR1 -Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) n-0 (CH2)mCOY-;
CO - sujungtas su NH, (4) -CO (CH2) mO (CH2CH2O) nCH2CH2NHCOR' -Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) n-0 (CH2) mCONHNH-R NHN= ;
N= sujungtas taip pat, kaip ir anksčiau (2),
R, R' ir R yra alkileno grupės, parenkamos kaip ir R formulėje (I) . r turi tokias pat reikšmes, kaip išvardinta anksčiau.
Reagentą (formulė II) galima gauti, panaudojant junginius, turinčius formulę III:
NH2CH2CH2 (OCH2CH2)O (CH2)mCOOH (III) kur m yra 1 arba 2, n yra sveikas skaičius nuo 1 iki 20, pavyzdžiui, 2-20 arba 3-9.
Kai kurių junginių, turinčių formulę III, kur m = 1 ir 2, ir n = 1-10, sintezė buvo aprašyta anksčiau./Juljen et ai., Tetrahedron Letters, 29(1988)3803-06; Hougton, Saubi, Synth. Commun. 19(18)(1989)3199-3209; ir EP-A410280 (atsp. 20.1.91) ir Šlama and Rando, Carbohydrate Research 88(1981)213-221 ir Biochemistry 19(1980)45954600).
Naujuosius reagentus, turinčius formulę II, galima gauti reaguojant junginiui, turinčiam formulę III, su bifunkciniais reagentais, turinčiais formulę Z-B'-Z', kur Z=ZX, B' =R , turintiems tas pačias reikšmes, kaip ir anksčiau aprašytosios R ir R', ir Z' yra aktyvuota karboksilo grupė pagal anksčiau duotą apibūdinimą. Po reakcijos -COOH grupė tampa aktyvuota karboksilo grupe, pvz., Ζ'γ - aktyvuotas esteris, toks kaip N-sukcinimidiloksikarbonilas, 4-nitrofeniloksikarbonilas, 2,4-dinitrofeniloksikarbonilas, 2,4-dinitrofeniloksikarbonilas, ir t.t.
Nauji junginiai, turintys formulę (III) ir jų naujieji dariniai, yra polieteriai, turintys bendrą formulę
XCH2CH2 (OCH2CH2-)nOCH2Y (IV) kur n yra sveikas skaičius nuo 2 iki 20, geriau, 3-20 arba 3-9; X yra NH2 - grupė, įskaitant jos protonuotą formą (+H3N-) , arba pakeista -NH2 grupė, iš kurios gali būti gauta -NH2 grupė, geriau, hidrolizės ar redukcijos būdu. Pavyzdžiais yra nepakeista aminogrupė (H2N-), nitrogrupė, amido (karbamido) grupė, tokia kaip žemesniojo alkilamido grupė (formilamido) acetilamido... heksanoilamido), įskaitant ir acilamido grupes, turinčias elektronoakceptorinius pakaitus prie anglies alfa-atomo acilinėje dalyje, ypač CF3CONH-, CH3COCH2CONH-, ir t.t.; ftalimidoilo grupė, kuri gali turėti pakaitą žiede; karbamato grupė (ypač R^OCONH- ir (R'į - OCO) (R'2 -OCO) N- taip pat N- (tret-butiloksikarbonil)-amino (Bok), N-(benziloksikarbonil)amino ir di(N-benziloksikarbonil)-amino (Z ir di Z, atitinkamai) , kurie turi pakaitus žiede; alkilamino grupė, kurioje anglies atomas, sujungtas su azoto atomu, yra alfa-padėtyje aromatinės sistemos atžvilgiu, tokia kaip N-monobenzilamino, N,N-dibenzilamino, N-tritilamino (trifenilmetilamino) ir t.t., įskaitant ir analogiškas grupes, kuriose metilo anglies atomas (įskaitant benzilo anglies atomą) pakeistas silicio atomu (Si), tokie kaip N, N-di(tret-butilsilil) amino; ir 4-okso-l,3,5triazin-l-ilas, įskaitant turinčius žemesniuosius alkilo pakaitus 3 ir/arba 5 padėtyje.
Anksčiau ir toliau Rj ir R2 yra žemesniojo alkilo grupė, ypač antrinio ir tretinio alkilo grupė, ir metilo grupė, pakeista 1-3 fenilo grupėmis, kurios, savo ruožtu, gali būti pakeistos. Žemesniojo alkilo ir žemesniojo acilo grupė turi 1-6 anglies atomus.
Y yra karboksilo grupė (-COOH, įskaitant -COO-), arba grupė, kurią galima paversti į karboksilą, geriau hidrolizinant arba oksiduojant. Svarbiausiomis grupėmis yra esterinės grupės, kuriose karbonilo anglies atomas arba atitinkamas atomas ortoesteriuose sujungtas su metilo grupe dešiniajame formulę (I) turinčio junginio gale. Pavyzdžiais yra alkilesterinės grupės (-COOR\); ortoeterinės grupės (-C(OR'3)3) r reaktingos esterinės grupės pagal anksčiau pateiktą apibūdinimą. R'3turi tas pačias reikšmes, kurios buvo apibrėžtos anksčiau R'p
Kitomis grupėmis yra -CHO, -CN, -CONH2, -CONR1R2, kur Rx ir R2 turi tas pačias reikšmes, kaip ir anksčiau.
Formulę IV turintį junginį galima susintetinti panaudojus žinomas pradines medžiagas, žinomų būdų kombinacijų pagalba. Tinkamais sintezės būdais yra:
A) Grandinės formavimas.
B) Galinių funkcinių grupių transformacija.
C) Simetrinio poliesterio transformacija į nesimetrinį eterį.
D) Bisimetrinės grandinės suskaidymas į du vienodus fragmentus.
Tinkami pradiniai junginiai, turintys besikartojančią grandį -OCH2CH2-, yra komerciškai prieinami. Pavyzdžiais gali būti oligoetilenglikoliai, turintys nuo 2 iki 6 pasikartojančių grandžių. Kitais tinkamais junginiais su vienodomis galinėmis grupėmis yra atitinkamos dikarboninės rūgštys ir diaminai.
Tinkamomis pradinėmis medžiagomis, turinčiomis skirtingas galines grupes, yra omega-hidroksimonokarboksirūgštys, kuriose galinės grupės perskirtos grynu polietilenoksidiniu tilteliu. Tokie junginiai, turintys iki 5 pasikartojančių grandžių, buvo aprašyti anksčiau /Nakadzui, Kavamura, Okahara, Synthesis (1981), p. 42 /.
Farmacinės kompozicijos ir jų gavimas
Pagal šį išradimą farmacinės kompozicijos sudarytos iš receptūrų, žinomų šioje srityje, bet jose yra mūsų nauji konjugatai. Kompozicijos gali būti liofilizuotų dalelių pavidalo, sterilių ar aseptiškai paruoštų tirpalų pavidalu, tabletės, ampulės ir 1.1. Jose gali būti nešėjai, tokie kaip vanduo (geriau buferis, fiziologinių pH reikšmių, pavyzdžiui, fosfatinis druskų buferis (FDB)), arba kita inertinė kieta ar skysta medžiaga .
Bendrais bruožais, kompozicija ruošiama maišant, tirpinant, surišant arba kokiu tai kitu būdu kombinuojant konjugatą su vienu ar keletu vandenyje netirpiais ar vandenyje tirpiais, vandeniniais ar nevandeniniais nešėjais, ir, jei reikia, su tinkamais priedais ir adjuvantais. Būtina, kad nešėjai ir sąlygos neturėtų neigiamos įtakos konjugato aktyvumui. Pats vanduo taip pat yra nešėjų tarpe.
Panaudojimas ir panaudojimo būdai
Paprastai konjugatai yra kieti ir naudojami iš anksto paruoštomis dozėmis, kiekvienoje kurių yra efektyvus konjugato kiekis, kuris, remiantis pateiktais rezultatais, yra nuo 10 ųg iki 50 mg. Tiksli dozė keičiasi nuo vieno atvejo iki kito, ir priklauso nuo paciento svorio ir amžiaus, vartojimo būdo, susirgimo pobūdžio, antikūno, superantigeno, tiltelio (-B-), ir t.t.
Vartojimo būdas atitinka žinomiems paminėtoje srityje, t.y. efektyvus ląstelei-taikiniui lizuoti. Konjugato kiekis arba terapiškai efektyvus konjugato kiekis pagal šį išradimą kontaktuoja su ląstelėmis-taikiniais. Anksčiau paminėtuose atvejuose tai dažniausiai reiškia parenteralinį vartojimo būdą, tokį kaip injekcija arba Įšvirkštimas (po oda, į veną, į arteriją, į raumenis) į žinduolio, pvz., žmogaus, organizmą. Konjugatas gali būti įvestas gydymo objektui lokaliai ar sistemiškai.
Efektyviu ląstelių-taikinių ūžavimui kiekiu suprantamas toksai kiekis, kuris efektyviai aktyvuoja ir nukreipia CTL ląstelių-taikinių sunaikinimui.
Išradimas iliustruojamas keletu realizavimo variantų, kurie jokiu būdu neapriboja ši išradimą. Eksperimentinės dalies I skyriuje parodyta konjugatų cheminė sintezė, o II skyriuje - T-ląstelių aktyvacija 4 konjugatų pavyzdžiu ląstelių-taikinių ūžavimui.
EKSPERIMENTINĖ DALIS. I SKYRIUS
Omega-amino-DEG-karboksirūgšties gavimas
Izopropil-8-hidroksi-3,6-dioksa-oktanoatas (I)
Į dietilenglikolį (500 ml) azoto atmosferoje dedamas porcijomis natris drožlių pavidalu (23 g, 1,0 mol). Po to, kai natris pilnai sureaguoja, mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros, ir maišant pridedama bromacto rūgštis (76 g, 0,5 mol) . Reakcija vykdoma 18 valandų 100°C temperatūroje, po to dietilenglikolio perteklius nudistiliuojamas apie 4 mm Hg stulpelio slėgyje. Po to pridedamas izopropilo alkoholis (400 ml) ir porcijomis - acetilchloridas (51 g, 0,65 mol). Maišoma 16 vai. 65°C temperatūroje, po to atšaldoma iki kambario temperatūros ir neutralizuojama natrio acetatu (3,5 g, 0,15 mol). Mišinys filtruojamas, filtratas nugarinamas sausai, ir liekana tirpinama vandenyje (200 ml) . Vandens fazė ekstrahuojama 1,1,1-trichloretanu (3 kartus po 50 ml) . Gautosios organinės fazės praplaunamos vandeniu (20 ml) . Produktas ekstrahuojamas iš apjungtų vandeninių fazių dichlormetanu (50 ml) , kurį išgarinus lieka alyva (55 g) .
Izopropil-II-hidroksi-3,6,9-trioksa-undekanoatas (2)
Į trietilenglikolį (700 ml) azoto atmosferoje porcijomis dedamas natrio (23 g, 1,0 mol) drožlių pavidalu. Po to, kai natris pilnai sureaguoja, mišinys atšaldomas iki kambario temperatūros ir maišant pridedama bromacto rūgšties (76 g, 0,5 mol). Reakcija vykdoma 18 vai. 100°C temperatūroje, po to trietilenglikolio perteklius nugarinamas distiliuojant apie 4 mm Hg stulpelio slėLT 3909 B gyje. Po to pripilamas izopropiloalkoholis (400 ml) ir porcijomis acetilchloridas (51 g, 0,65 mol). Po 18 vai. maišymo 65°C temperatūroje mišinys ataušinamas iki kambario temperatūros ir neutralizuojamas natrio acetatu (3,5 g, 0,15 mol). Mišinys filtruojamas, filtratas nugarinamas beveik sausai, ir liekana tirpinama vandenyje (200 ml) . Vandeninė fazė ekstrahuojama 1,1,1trichloretanu (3 kartus po 50 ml). Gautos organinės fazės praplaunamos vandeniu (20 ml) . Produktas ekstrahuojamas iš apjungtų vandens fazių dichlormetanu (50 ml) , kurį nugarinus gaunama alyva.
1H-BMR (CDC13), δ (m.d.): 1,25 (d, 6H) ; 3,07 (s, 2H) ;
3,6-3,8 (m, 12H) ; 4,11 (s, 2H) ; 5,09 (m, 1H) .
8-(N-ftalimidoil)-3,6-dioksa-oktanolis (3)
8-chlor-3,6-dioksa-oktanolis (365 g, 2,2 mol, gautas iš trietilenglikolio ir SOC12) tirpinamas dimetilformamide (400 ml) ir maišant pridedamas kalio ftalimidas (370 g, 2,0 mol) . Po 16 vai maišymo 110°C temperatūroje dimetilformamidas nugarinamas, esant sumažintam slėgiui. Liekana suspenduojama toluene (1,5 1) 40-50°C temperatūroje ir nufiltruojamas kalio chloridas. Produktas kristalinamas šaldant (-10°C) . Antra frakcija gaunama iš nuovarvų, jas koncentruojant ir kartojant kristalinimo procedūrą.
BMR (CDC13), δ (m.d.): 2,90 (s, 1H) ; 3,51-3,58 (m, 2H) ; 3, 60-3, 68 (m, 6H) ; 3, 73-3,78 (t, 2H) ; 3,89-3,94 (t, 2H) ; 7,70-7,89 (m, 4H) .
Izopropil-17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoatas. (4) į 8-(N-ftalimidoil)-3,6-dioksa-oktanolio (3) (8,5 g, 36 mmol) ir trifluormetano sulforūgšties anhidrido (10,2 g, 36 mmol) tirpalą dichlormetane prilašinamas, maišant apie -5°C temperatūroje, piridinas (2,8 ml, 35 mmol) dichlormetane (30 ml). Maždaug po 30 min organinė fazė praplaunama 0,5 M druskos rūgštimi ir vandeniu. Po džiovinimo natrio sulfatu ir filtravimo pridedamas izopropil-8-hidroksi-3,6-dioksa-oktanoatas (I) (12 g, mmol) ir Na2HPO4 (6,5 g, 46 mmol), ir mišinys intensyviai maišomas kambario temperatūroje 20 valandų. Reakcijos mišinys filtruojamas, ir filtratas nugarinamas. Liekana paskirstoma tarp 1,1,1-trichloretano ir vandens. Nugarinus organinę fazę, gaunama alyva (13 g).
XH BMR (CDC13) , δ (m.d.): 1,26 (d, 6H) ; 3, 58-3, 76 (m, 18H); 3,90 (t, 2H) ; 4,11 (s, 2H) ; 5,09 (m, 1H) ; 7,707,89 (m, 4H) .
17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadekano rūgštis (5)
Izopropil-17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoatas (4) (13 g) tirpinamas tetrahidrofurane (50 ml) ir druskos rūgštyje (kone., 50 ml) . Reakcija vykdoma 16 valandų kambario temperatūroje, po to tirpalas praskiedžiamas vandeniu (200 ml), ir tetrahidrofuranas nugarinamas sumažintame slėgyje. Vandeninė fazė praplaunama toluenu (1 kartą) ir ekstrahuojama dichlormetanu (2 kartus). Džiovinama natrio sulfatu ir, nugarinus organinę fazę, gaunamas alyvos pavidalo produktas (8,5 g).
ςΗ BMR (CDCI3) , δ (m.d.): 3, 57 - 3, 75 (m, 18H) ; 3,91 (t, 2H) ; 4,11 (s, 2H); 4,8 (pi.p, 2H) ; 7,65 - 7,90 (m, 4H) .
Izopropil-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadekanoatas (6)
17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadekano rūgštis (5) (8,5 g) ištirpinama 150 ml etanolio ir 3 ml hidrazino hidrato. Tirpalas maišomas 16 vai kambario temperatūroje, po to pripilama HC1 (100 ml, 3 M) , ir tirpalas kaitinamas 3 vai su grįžtamuoju šaldytuvu. Atšaldžius iki kambario temperatūros ir nufiltravus, pašarminama iki pH 9, pridėjus NaOH, ir filtratas nugarinamas beveik sausai, po to parūgštinama HC1 iki pH 4 ir nugarinama sausai. Produktas apdorojamas izopropanoliu (100 ml) ir acetilchloridu (2 ml) esant kambario temperatūrai visą naktį, ir tirpalas nugarinamas. Liekana tirpinama vandenyje ir ekstrahuojama dichlormetanu esant šarminiam pH (7-11) . Nugarinus, gaunamas produktas (3,3 g).
ΧΗ BMR (CDC13) , δ (m.d.): 1,26 (d, 6H) ; 3,17 (t, 2H) ;
3, 65-3,80 (m, 18H) ; 4,16 (s, 2H) ; 6,07 (m, 1H) .
SINTEZUOTŲ AMINO-DEG-KARBOKSIRŪGŠČIŲ FORMULĖS
H- (OCH2CH2) nCH2CO-OCH (CH3) 2
Junginys 1: n = I
Junginys 2: n = I
PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2) 2OH
Junginys 3, PhtN- = N-ftalimidoilas
PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2) 4CH2CO-OCH (CH3) 2
Junginys 4, PhtN - = N - ftalimidoilas
PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2) 4CH2CO-OH
Junginys 5
H2N-CH2CH2- (OCH2CH2) 4ch2co-oh
Junginys 6
BIFUNKCINIŲ REAGENTŲ IR KONDENSACIJOS PRODUKTŲ GAVIMAS
Pavyzdys 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio gavimas
A. 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptano rūgšties (A) gavimas
JCH2CNHCH2CH2 (OCH2CH2) 4OCH2COOH (A)
II o
Izopropil-17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoatas (žr. Eksperimentinės dalies I skyrių) (1,1 g, 3,2 mmol) ištirpinamas 3 ml 1 M natrio hidroksido tirpalo, ir paliekama kambario temperatūroje 30 minučių. Pripilama 1,6 ml 8 M druskos rūgšties, ir mišinys nugarinamas sausai. Liekana tirpinama dichlormetanu ir filtruojama, ir, nugarinus tirpiklį, gaunama 545 mg 17-amino3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties. 460 mg (1,39 mmol) šio junginio ištirpinama 10 ml boratinio buferio, pH 8,4. Tirpalo deaeracija atliekama dujiniu azotu. Per 1 minutę sulašinamas 432 mg (1,52 mmol) N-sukcinimidil2-jodacetato tirpalas 5 ml dioksano, palaikant pH 8,4, pridedant 5 M NaOH. Reakcijos mišinys maišomas 15 minučių, leidžiant azotą. Plonasluoksnės chromatografijos duomenimis (eliuentas : CH2Cl2-MeOH, 50:35) reakcija baigiasi per keletą minučių. Po 15 minučių parūgštinama iki pH3, tirpalas užšaldomas ir liofilizuojamas. Reakcijos mišinys frakcionuoj amas kolonėlėje su reversinėmis fazėmis PHP-RPC HP 30/26 (Farmacia, Biosystems AB) , naudojant acetonitrilo gradientą nuo 0 iki 13 %, esant 0,1 % trifluoracto rūgšties, su vėlesniu padalinimu 13 % acetonitrilo, 0,1 % TFAR (trifluoracto rūgštis) . Reikiamo piko frakcijos apjungiamos ir liofilizuojamos, gaunama 351 mg 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties (A). Išeiga: 76 %.
Produkto struktūra nustatyta BMR spektroskopijos metodu. XH BMR spektre (D2O) buvo gautos šios δ (m.d.) reikšmės:
JCH2C 4,23 s; OCH2COH 3,76 s; -NHCH2CH2O- 3,41; -OCH2CH2OII
II
3,71 - 3,7 6; -NHCH2CH2O- 3,65 t.
B. 17-jodacetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (B) gavimas
II
JCH2CNHCH2CH2 (OCH2CH2) 4och2con
II
II
(B)
II
Reakcijos ampulėje sveriamas hidroksisukcinimidas (4,5 mg, 39 pmol) . 17-jodacetilamino-3,6,9,12, 15-pentaoksaheptadekano rūgštis (A) (18,3 mg, 39 ųmol) tirpinama 0,55 ml sauso dioksano ir supilama į ampulę. Ampulė deaeruojama dujiniu azotu, po to i, ją lašinamas 0,8 mg (39 ųmol) dicikloheksilkarbodiimidas 0,15 ml sauso dioksano. Ampulė užpildoma dujiniu azotu, užkemšama ir patalpinama tamsoje. Reakcijos mišinys maišomas 3,5 valandos, susidariusios nuosėdos pašalinamos filtruojant. BMR-analizė parodė, kad filtrate gautasis produktas B sudaro 89 %.
Pavyzdys (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekamoilamino)-imunoglobulino (C) gavimas
A. Monokloninis antikūnas monAK C215
IgG-[ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2 J] n (C) ,
II II o o n = 4, 7, 9, 12, 14, 18
Į ampulę pridedamas imunoglobulino klasės Ig62a monokloninis antikūnas (monAK C215) (34 mg, 0,218 ųmol), ištirpintas 17,7 ml 0,1 M boratinio buferio, pH 8,1, kuriame yra 0,9 % natrio chlorido. Į buferini, tirpalą pripilama 146 μΐ dioksano tirpalo, turinčio 3,6 mg (6,4 pmol) 17-jodacetilamino-3, 6, 9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (B) ir reakcija vykdoma iki užbaigimo maišant kambario temperatūroje 25 minutes. Reakcijos ampulė uždengiama folga, kad nepatektų šviesa. Reagento B perteklius pašalinamas frakcionuojant kolonėlėje su Sephadex G 25 K 26/40, naudojant eliuentu 0,1 fosfatinį buferį, pH 7,5, turintį 0,9 % NaCl. Surenkamos ir apjungiamos frakcijos, kuriose yra reikiamas produktas C. Tirpalas (22 ml) koncentruojamas Amicon gardelėje per YM 30 filtrą iki 8 ml tūrio. Koncentracija ir pakeitimo laipsnis nustatomas aminorūgščių analize. Jie sudaro 4,7 mg/ml ir 18 speiserių/monAK C215, atitinkamai.
B. Monokloninis antikūnas monAK C242
Pagal metodiką, aprašytą 2A Pavyzdyje reakcija atliekama imunoglobulininio Ig GI klasės monokloninio antikūno (monAK C242) su 15-, 20- ir 22-kartiniu 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (B) molių pertekliais, gaunant nona-, dodeka-, ir tetradeka(17-jodacetilaminoLT 3909 B
3, 6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)-monAK C242, atitinkamai (C) .
C. Monokloninis antikūnas monAK C
Pagal metodiką, aprašytą 2A Pavyzdyje, imunoglobulinų klasės Ig G 2a monokloninis antikūnas (monAK C) veikiamas 17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio 14- ir
18-kartiniu molių pertekliais, gaunant tetra- ir hepta (17-jodacetilamino-3, 6, 9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)-monAK C, atitinkamai, (C).
Pavyzdys Stafilokokų enterotoksino A (SEA), žymėto 2merkaptopropionilamino-Eu3+ gavimas
A. Eu3+-žymėto SEA (D) gavimas
SEA (liofilizuotas produktas, gautas Toksin technology inc.) (2 mg, 72 nmol) ištirpinamas 722 μΐ vandens ir patalpinamas į 15 ml izopropileno vamzdelį. Pridedama 100 μΐ 0,1 M boratinio buferio, pH 5,6, o po to 2160 nmol Eu3+ komplekso su chelatais (Farmacia Vallac Oi) 178 μΐ milli-Q. Reakcija pilnai įvyksta per naktį kambario temperatūroje. Reagentų perteklius pašalinamas frakcionuoj ant reakcijos mišinį kolonėlėje su Sephadex G 25 PD 10 (Farmacia Biosystems AB), naudojant eliuentu 0,1 M fosfatinį buferį, pH 8,0. Frakcijos, turinčios norimą produktą D, apjungiamos. Tirpalas (3 ml) konLT 3909 B centruojamas Amicon gardelėje per YM5 filtrą iki 0,8 ml tūrio. Koncentracija, nustatyta aminorūgščių analizės būdu, sudarė 1,7 mg/ml. Pakeitimo laipsnis, nustatytas lyginant su standartiniu EuC13 tirpalu, sudarė 0,8 Eu3+/SEA.
SEA (E) gavimas
BI. 3-(2-piridiltio)propionilamino-Eu -žymėto ir 3-merkaptopropionilamino-Eu3+-žymėto SEA (FU
3+ (Eu -SEA-(NHCCH2CH2SS
II
O
) 3-4 (E)
Į 15 ml izopropileno vamzdeli patalpinamas (1,24 mg, 44,5 nmol) 0,75 ml 0,1 M fosfatinio pH 8,0. Į vamzdelį pripilamas 35 μΐ (180 nmol
Eu3+-SEA buferio, ) 1,6 mg
N-sukcinimidil-3-(2-piridiltio)-propionato viename mililitre etanolio tirpalo, ir reakcijos mišinys maišomas 30 min kambario temperatūroje. Gautas produktas E neišskiriamas prieš redukuojant jį į produktą Fx.
Eu3+-SEA-(NHCCH2CH2SH) 3_4 (FJ
II
Į anksčiau paminėtąjį reakcijos mišinį pridedama 20 μΐ 0,2 M Eu3+ citrato tirpalo ir 50 μΐ 2 M acto rūgšties, kad nustatytų pH iki 5,0. Po to pripilama 3,1 mg ditiotrentolo (Merk) 0,1 ml-tre 0,9%-nio natrio chlorido tirpalo, ir reakcijos mišinys maišomas 20 min kambario temperatūroje. Po to bendras tūris padaromas iki 1 ml pridedant 50 μΐ 0,9 % natrio chlorido tirpalo. Reakcijos tirpalas patalpinamas i kolonėlę (1 ml), užpildytą Sephadex G25 NAP 10 (Farmacia Biosystems AB) ir norimas produktas Fx išplaunamas 1,5 ml 0,1 M fosfatiniu buferiu pH 7,5, turinčiu 0,9 % natrio chloridą. Išskirtas produktas F4 surenkamas 15 ml izopropileno vamzdelyje ir tuoj pat panaudojamas produkto G sintezei, kad išvengtų disulfidinio produkto oksidacijos.
B2 . 2-merkaptopropionilaminostafilokokų enterotoksino A (SEA) (F2) gavimas
SEA(NHCCH2CH2SH) lrg (F2)
II o
Gamtinis SEA (liofilizuotas produktas, Toksin Technology Ine.), ar gautas rekombinantiniais metodais SEA (rSEA) veikiami N-sukcinimidil-3-(2-piridiltio)propionato dvigubu molių pertekliumi pagal metodiką, aprašytą 3BI pavyzdyje.
Pakeitimo laipsnis, nustatytas UV analizės metodu pagal Karlsson ir kt. /Biochem. J. 173(1978)723-737/ yra 1,9 merkaptopropionilo grupių vienai SEA molekulei.
Pavyzdys SEA monokloninio antikūno konjugato (Ga arba G2) gavimas
A. Eu3+-SEA konjugatai su monAK C215 (Gx) [ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CNH-EU3+-SEA] m / II II II /0 0 0
IgG (GJ \
[ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2SCH2CH2OH] 18.m
II II o o
Į tirpalą 4-merkaptopropionilamino-Eu3+-žymėto SEA (F) , aprašyto 3B pavyzdyje, pripilama oktadeka (17-jodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C215 (C) (4 mg) 1,2 ml 0,1 M fosfatinio buferio, tuLT 3909 B rinčio 0,9 % natrio chlorido, pH 7,5. Reakcija pasibaigia per naktį kambario temperatūroje. Nesureagavusios jodoalkilo grupės blokuojamos pridedant 5 μΐ (1,2 μιηοΐ) merkaptoetanolio tirpalo, gauto ištirpinus 20 μΐ viename ml vandens. Reakcijos tirpalas paliekamas 4 valandoms kambario temperatūroje, po ko filtruojama. Filtratas frakcionuoj amas kolonėlėje, užpildyta Superos 12 HR 16/50 (Farmacia Biosystems AB) , naudojant eliuentu 0,002 M fosfatinį buferį, pH 7,5, turintį 0,9 % natrio chlorido. Frakcijos, kuriose yra galutinis produktas G, apjungiamos ir analizuojamos. Pagal aminorūgščių analizės duomenis baltymo kiekis sudaro 0,22 mg/ml. Pakeitimo laipsnis, nustatytas pagal Eu3+ kiekį, yra viena SEA molekulė vienai IgG molekulei. Produktas buvo tirtas, kad nustatytų imunostimuliuojančias savybes ir antikūno sujungimo gebą.
Didinant junginio (F) kiekį junginio (C) kiekio atžvilgiu, gaunamas didesnis pakeitimo laipsnis.
B. rSEA konjugatai su monAK C215 (G2) [ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CNH-SEA] / II II II / O 0 0
IgG (G2) [ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHC-CH2SCH2CH2OH] n.
II II o o
Oktadeka (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C215 (C) veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) 1,8-gubu molių pertekliumi, pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje. Konjugato sudėtis analizuojama elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje, esant natrio dodecilsulfatui (DSN-PAGE), esant PhastGel gradientui 4-15, ir juostos, skanuojamos Phast
IMAGE pagalba (Pharmacia Biosystems AB) . Gautas konjugatas yra sudarytas iš 6 % monAK C215 su 3 SEA, 15 % su dviem SEA, 28 % su vienu SEA ir 51 % nepakeisto monAK C215.
Kitame bandyme naudojamas 2,7-gubas F2 molinis perteklius, gaunant šios sudėties konjugatą: 15 % monAK C215 su trim SEA, 25 % su dviem SEA, 34 % su vienu SEA ir 26 % nepakeisto monAK C215.
C. rSEA konjugatai su monAK C242
Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, tetradeka (17— jodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C242 (C) veikiamas 3,2-gubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) molių pertekliumi. Konjugato sudėtis analizuojama, kaip aprašyta 4B pavyzdyje, gaunant šiuos rezultatus: 4 % monAK C242 su keturiais SEA, 12 % su trim SEA, 28 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 20 % nepakeisto monAK C242.
Vykdoma tokia pat reakcija, tik prieš frakcionuojant kolonėlėje, produktas 4 valandas apdorojamas 0,2 M hidroksilamino nestabilių jungčių tarp monAK C242 ir speiserio ir tarp SEA ir merkaptopropionilo grupės pašalinimui. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 1 % monAK C242 su keturiais SEA, 12 % su trim SEA, 27 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 24 % nepakeisto monAK.
C2. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, dodeka (17jodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C242 veikiamas trigubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) molių pertekliumi. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 6 % monAK C242 su trim SEA, 26 % su dviem SEA, 36 % su vienu SEA ir 31% nepakeistas monAK C242 .
C3. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, nona(17jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C242 (C) veikiamas trigubu 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) molių pertekliumi. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 15 % monAK C242 su dviem SEA, 39 % su vienu SEA ir 46 % nepakeisto monAK C242.
D. rSEA konjugatai su monAK C
DI. Pagal metodiką, aprašytą 4A pavyzdyje, hepta(17jodo-acetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) 5,4-kartiniu molių pertekliumi. Konjugato sudėtis analizuojama, kaip aprašyta 4B pavyzdyje, gaunant šiuos rezultatus: 15 % su keturiais SEA, 24 % su trim SEA, 29 % su dviem SEA, 19 % su vienu SEA, 3 % nepakeisto monAK C ir 10 % dimero.
Ta pati reakcija vykdoma esant 0,2 M hidroksilamino nestabilioms jungtims tarp monAK C ir speiserio ir tarp rSEA ir merkaptopropionilo grupės pašalinimui. Gautas konjugatas yra šios sudėties: 11 % monAK C su trim SEA, 24 % su dviem SEA, 30 % su vienu SEA, 18 % nepakeisto monAK C ir 17 % dimero.
D2. Pagal metodiką, aprašytą 4B pavyzdyje, tetra (17 — jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C veikiamas 2-merkaptopropionilamino-rSEA (F2) 5,7-kartiniu molių pertekliumi. Konjugatas yra šios sudėties: 8% monAK C su keturiais SEA, 18 % su trim
SEA, 30 % su dviem SEA, 26 % su vienu SEA, 5% nepakeisto monAK C ir 12 % dimero.
Pavyzdys. /17-(3-merkaptopropionilamino)-3,6,9,12,15pentaoksaheptadekanoilamino/-rSEA (H) gavimas
A. 17-/3-(2-piridiltio)propionilamino/-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino-rSEA (H) gavimas rSEA (NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2CH2SS
(H)
17-/3-(2-piridiltio)propionilamino/-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekano rūgšties N-hidroksisukcinimidinio esterio (0,53 mg, 896 nmol) tirpalas 43 μΐ dioksano įpilamas į 3,65 mg (128 nmol) rSEA tirpalo viename ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlorido. Reakcija baigiasi per 30 min kambario temperatūroje. Paimama 100 μΐ pakeitimo laipsnio analizei. Likusioji dalis saugoma užšaldyta iki jos redukavimo į produktą.
Pakeitimo laipsnis nustatomas pašalinus druskas iš 100 μΐ reakcijos mišinio kolonėlėje, turinčioje Sephadex G50 NICK (Farmacia Biosystems AB) ir analizuojant eliuatą UV-spektroskopijos metodu pagal Karlsson ir kt. /Biochem. J., 173(1978)723-737/. Su rSEA sujungta 2,7 speiserio.
B. /17-(3-merkaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino/-rSEA (I) gavimas rSEA (NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2CH2SH) n (I)
II II o o
Reakcijos tirpalas, turintis produktą H (0,9 ml) parūgštinamas iki pH 4,4 2 M HC1, ir pridedama 2,9 mg ditiotrentolo, ištirpinto 75 μΐ 0,9%-nio natrio chlorido tirpalo. Redukcija įvyksta per 30 min. Reakcijos mišinys tiekiamas į kolonėlę su Sephadex G 25 NAP 10 (Farmacia, Biosystems AB) ir išplaunamas 1,5 ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlo35 rido, po to tuoj pat naudojamas produkto J sintezei pavyzdyje II.
Pavyzdys. SEA-monokloninio antikūno konjugato J su dvigubu speiseriu gavimas
CH2NHCCH2SCH2 CH2 (OCH2CH2) 4O
II [ NHCCH2O(CH2CH2O)4CH2 0 ch2cnhch2
CH2CNH-rSEA] m
II
IgG (J) [ NHCCH2O (CH2CH2O) 4CH2CH2NHCCH2SCH2CH2OH] n_m
II
II
Dodeka (17-jodacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadekanoilamino)monAK C242 (B) (4,2 mg, 27 mmol, 0,1 ml 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,5, turinčio 0,9 % natrio chlorido) 43 valandas tamsoje reaguoja azoto atmosferoje su /17-(3-merkaptopropionilamino)-3,6,9,12,15pentaoksoheptadekanoilamino/-rSEA (I) (1,17 mg 42 nmol
I ml anksčiau nurodyto buferio). Po to pridedama
1,14 μτηοΐ merkaptoetanolio. Dar po 1 vai reakcijos mišinys skirstomas kolonėlėje Superdex 200 HR 16/55. Produktas išplaunamas 2 mM fosfatiniu buferiu, pH 7,5, turinčiu 0,9 % natrio chlorido. Frakcijos, turinčios galutini, produktą J, apjungiamos ir analizuojamos, kaip aprašyta 4B pavyzdyje. Konjugatas susideda iš 9% monAK C242 su dviem SEA, 25 % su vienu SEA ir 60 % nepakeisto monAK C242.
II EKSPERIMENTINIS SKYRIUS
Superantigenas-antikūnas konjugatų poveikis ląstelėms
Sekančiuose eksperimentuose bakteriniu toksinu buvo panaudotas Staphylococcus A enterotoksinas (SEA), gautas iš Toksin Technology (Viskonsin, JAV), arba pagamintas kaip rekombinantinis baltymas E. coli ląstelėse.
Antikūnais buvo C215, C242 ir Thy-1.2 monAK. C215 yra Ig G2a monAK prieš žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių liniją ir ant kai kurių žmogaus storosios žarnos ląstelių linijų reaguoja su baltyminiu antigenu, turinčiu 37 kD masę. Nuorodos šiems monAK buvo pateiktos anksčiau. Konjugatų paruošimas aprašytas pirmame skyriuj e.
Iki paraiškos įteikimo datos (prioriteto datos) buvo tik atlikti tyrimai su Eu3+ - žymėtais konjugatais SEAC215 monAK. Sekančiais metais buvo patvirtinti rezultatai nežymėtiems konjugatams SEA-215, SEA-242 ir SEAThy-1.2 monAK. Čia pateikti rezultatai gauti su nežymėtais konjugatais.
Nustatymui citotoksiškumo, indukuojamo konjugatu SEAC215 monAK ir nekonjuguotais SEA ir C215 monAK, atžvilgiu storosios žarnos vėžio ląstelių, neekspresuojančių II Klasės PASKA, arba ekspresuojančių mažus ir nedetektuojamus II Klasės PASKA kiekius, mes panaudojome įvairias žmogaus T-ląstelių linijas, paveiktas SEA, kaip efektorines ląsteles, ir storosios žarnos ląstelių sluoksnį ir Raji ląsteles, ekspresuojančias II Klasės PASKA (II+ Klasės PASKA), kaip ląsteles-taikinius. Storosios žarnos vėžio ląstelių linijos Colo 205, SW 620 ir WiDr II Klasės PASKA neekspresuoja, kas buvo nustatyta dažymo monAK prieš HLA-DR, HLA-DP ir HLA-DQ ir aktyvuojamos fluorescencija ląstelių analizės pagalba. T-ląstelių linijos, apdorotos SEA, buvo gaunamos iš periferinio kraujo pagalba savaitinių restimuliacijų paveiktomis mitomicinu C II+ PASKA limfomos BSM ląstelėmis, iš anksto padengtomis SEA, Dalyvaujant rekombinantiniam IL-2 (20 vienetų/ml). Šios T-ląstelių linijos pasižymėjo dideliu citotokLT 3909 B siškumu atžvilgiu Raji arba BSM ląstelių, padengtų SEA, bet ne atžvilgiu neturinčių padengimo, arba ląstelių, padengtų stafilokokų enterotoksinu B (SEB). Šis indukuojamas SEA sunaikinimas priklauso nuo SEA sąveikos ant ląstelės-taikinio su II Klasės PASKA, kaip nustatyta panaudojant blokuojančius antikūnus HLA-DR, mutantines Raji ląsteles, neekspresuojančias II Klasės PASKA (II~ Klasės PASKA) ir L-ląsteles, transfektuotas HLA-DR /Doglsten et ai., Immunology 71(1990)96-100/. Šias T-ląstelių linijas pasirodė galima aktyvinti konjugatu C215-SEA, storosios žarnos vėžio C215+II Klasės PASKA ląstelių sunaikinimui. Priešingai, nekonjuguoti SEA ir C215 monAK pasirodė nesugebantys iššaukti daugiau negu marginalinį sunaikinimą T-ląstelėmis storosios žarnos vėžio C215+II Klasės PASKA ląstelių. Indukuotas ląstelėmis citotoksiškumas, priklausomas nuo stafilokoko enterotoksin-antikūnas konjugato, priklauso nuo konjugato SEA-C215 monAK surišimo su C215+vėžinėmis ląstelėmis. Šio surišimo specifiškumas buvo pademonstruotas tuo, jog perteklius nekonjuguoto monAK C215, bet ne C242 ir W8/32 monAK, inhibuoja storosios žarnos vėžio ląstelių ližę. T-ląstelės CD4+ ir CD8+ naikina storosios žarnos vėžio C215+ ląsteles, paveiktas SEA-C215, bet nelizuoja ląstelių, paveiktų SEA. Matomai, T-ląstelių sąveika su konjugatu SEA-C215 monAK, surištu su navikinės ląstelės Il’Klasės PASKA, apima sąveiką su Tląstelės receptoriaus variabilios dalies beta-grandinės specifinėmis sekomis būdu, analogišku anksčiau demonstruotam SEA iššaukiamam II+Klasės PASKA ląstelių sunaikinimui. Tai buvo parodyta SEA-specifinės, bet ne autologinės SEB-specifinės T-ląstelių linijos sąveikos su C215-SEA konjugatu pagalba. Konjugatai C242 monAK ir Thy-1.2 monAK rodo aktyvumą, analogišką konjugato C215 monAK aktyvumui.
Žymėjimas chromu ir ląstelių-taikinių inkubavimas su SEA
0, 75 x 106 ląstelių-taikinių ir 150 ųCi 51Cr (American Corp., Arlington Heits, Anglija) inkubavo 100 μΐ tūryje 45 minutes. Ląsteles laikė pilnoje terpėje, turinčioje RPMI-1640 terpę (Gibko, Peizli, Didžioji Britanija), papildytoje 2,8 % (tūris/tūris) 7,5 NaHCO3, 1 % natrio piruvato, 2 % 200 mM 1 - glutamino, 1 % Hepes, 1 % mg/ml gentamicino ir 10 % veršelio embriono serumo (VES, Gibko, Peizli, Didžioji Britanija). Po inkubavimo ląstelės buvo vieną kartą praplautos pilnoje terpėje be VES, inkubuotos prie 37°C 60 min, praplautos ir resuspenduotos pilnoje terpėje, turinčioje 10 % VES. Į kiekvieną iš lizdelių, 96 lizdelių mikrolitrinėse lėkštelėse U pavidalo dugnu (Costar, Cambridg, JAV) buvo pridėta po 5xl03 ląstelių-taikinių.
Citotoksiškumo išbandymas
Į lizdelius buvo pridėta Įvairiais santykiais ląstelėsefektoriai/ląstelės-taikiniai efektorinių ląstelių. Kiekviename lizdelyje galinis tūris sudarė 200 μΐ. Kiekvieną išbandymą kartojo tris kartus. Lėkšteles inkubavo 37°C temperatūroje 4 vai, po to buvo surinktas išsiskyręs chromas. 51Cr kiekis buvo nustatytas gamaskaitliuku (Cobra, Auto-gamma, Paccard). Citotoksiškumo procentas buvo nustatinėjamas pagal formulę:
citotoksiškumo % = (Χ-Μ)/(T-M) x 100, kur
X reiškia chromo išsiskyrimą (imp/min vienetais) , gautą bandomajam pavyzdyje, M reiškia spontaninį chromo išskyrimą ląstelėmis-taikiniais, inkubuotomis su terpe, ir T reiškia pilną chromo išsiskyrimą, gautą inkubuojant ląsteles-taikinius su 1 % natrio dodecilsulfatu.
Rezultatai
Konjugatai SEA-C242, SEA-C215 ir SEA-anti-Thy-1.2 monAK susiriša su ląstelėmis, ekspresuojančiomis atitinkamus monokloninių antikūnų epitopus, atitinkamai, ir su II+ Klasės PASKA ląstelėmis. Iš kitos pusės, nekonjuguotas SEA susiriša tiktai su II+ Klasės PASKA ląstelėmis. Nekonjuguoti monokloniniai antikūnai C215, C242 ir Thy-1.2 susiriša su ląstelėmis, ekspresuojančiomis atitinkamus epitopus, tačiau ne su Raj i ląstelėmis ( 1 Lent.).
Žmogaus T-ląstelių linijos lizuoja linijų SW620, Colo 205 ir WiDr II- Klasės PASKA ląsteles, esant konjugatui SEA-C215 monAK, bet nelizuoja esant nekonjuguotiems SEA ir C215 monAK (I pav.). Storosios žarnos vėžio ląstelių ližė vyko prie 10-100 ng/ml SEA-C215 monAK konjugato koncentracijų. Aukšti ližės rodikliai įvairiuose efektorius/taikinys santykiuose buvo stebėti SEA-215 monAK santykyje su SW620 (I pav.). Atvirkščiai, nekonjuguoti SEA arba C215 monAK neindukuoja eitotoksiškumo SW620 ląstelių atžvilgiu visuose bandytuose efektorius-taikinys santykiuose. Šitas rodo, jog sugebėjimas lizuoti Colo 205 linijos II’ Klasės PASKA ląsteles yra susijęs su konjugatu ir neiššaukiamas nekonjuguotais SEA ir C215 monAK. SEA ir konjugatas SEA-C215 monAK, bet ne C215 monAK indukuoja II+ Klasės PASKA Raji ląstelių ir paveiktų interferonu Colo 205 linijos II+Klasės PASKA ląstelių sunaikinimą T-ląstelėmis.
Tam, kad parodyti, jog į indukuojamą SEA-C215 monAK konjugatu ližę įjungiamas specifinis konjugato surišimas su C215 monAK molekule ant ląstelės-taikinio, pravestas inhibavimo tyrimas su nekonjuguotų C215 monAK ir C242 monAK pertekliumi, kuris susijungia su pašaliniu antigenu ant storosios žarnos vėžio ląstelių (C215 monAK surišimo atžvilgiu). monAK C215 pridėjimas stipriai inhibuoja citotoksiškumą, tuo tarpu kai C242 monAK nerodo jokio poveikio (Fig. 2). Analogiškai, ližė SEA-C242 monAK konjugatu specifiškai inhibuojama pertekliumi nekonjuguoto C242 monAK, bet ne C215 monAK.
SEA-C215 monAK konjugato sugebėjimas iššaukti priklausomą nuo T-ląstelių storosios žarnos vėžio SW620 linijos II Klasės PASKA ląstelių ližę buvo stebimas ir CD4+ ir CD8+ T-ląstelių populiacijoms. SEA neaktyvina nei vieno iš šių T-ląstelių poklasio, ir neindukuoja SW620 linijos ląstelių sunaikinimo, bet lizuoja II+Klasės PASKA Raji ląsteles (2 Lentelė).
Konjugatas SEA-C215 monAK sukelia SW620 ir Raji ląstelių ližę linija T-ląstelių, paveiktų SEA, bet ne linija T-ląstelių, paveiktų SEB (Fig. 3) . SEA- ir SEBlinijų selektyvumą rodo jų selektyvinis atsakas atitinkamai, į SEA ir SEB, kontaktuojant su Raji ląstelėmis (Fig. 4) . Tai rodo, jog SEA-C215 monAK konjugatas išsaugo specifiškumą T-ląstelės receptoriaus variabilios dalies beta-grandinės atžvilgiu, analogišką specifiškumui nekonjuguoto SEA.
Paveikslų aprašymas fig. SEA-C215 monAK konjugatas nukreipia CTL prieš storosios žarnos vėžio Il’Klasės PASKA ląsteles. Kairiajame viršutiniame grafike parodytas CTL, jautrių SEA, poveikis SW620 ląstelėms, esant įvairiems efektorius/taikinys santykiams, nedalyvaujant (-) arba dalyvaujant SEA-C215 monAK konjugatui, SEA, C215 ir mišiniui C215 ir SEA (C215+SEA) ·, esant kiekvieno priedo 1 ųg/ml koncentracijai. Kituose grafikuose parodytas SEA-C215 monAK konjugato ir SEA sugebėjimas nukreipti SEA jautrias CTL prieš storosios žarnos vėžio SW620, Colo205 ir WiDr linijų Il’Klasės C215+PASKA ląsteles, paveiktas interferonu Colo 205 II+Klasės PASKA C215+ląstelės ir Raji II+Klasės PASKA C215’ ląsteles. EfekLT 3909 B torius/taikinys santykis lygus 30:1. Pridėjimas nekonjuguoto C215 monAK kai kuriose koncentracijose nenukreipia CTL prieš šių linijų ląsteles. Aktyvuojama fluorescencija ląstelių analizė, naudojama SW620, Colo 205 ir WiDr ląstelėms, panaudojant monAK prieš HLA-DR, -DP, -DQ, neaptiko kokios nors paviršinės II Klasės PASKA ekspresijos, tuo tarpu kai buvo stebima gausi HLA-DR-,-DP, ir -DQ ekspresija ant Raji ląstelių, ir HLA-DR ir -DP ant paveiktų interferonu Colo 205 ląstelių. Colo 205 ląstelės prieš panaudojant CTL-teste, 48 valandų laikotarpyje buvo veiktos 1000 vnt/ml rekombinantiniu gama-interferonu.
fig. Indukuojamo SEA-C215 monAK ir SEA-C242 monAK konjugatais CTL nukreipimo prieš storosios žarnos vėžio ląsteles priklausomybė nuo antigeninio monAK selektyvumo. Colo 205 ląstelių, jautrių SEA CTL, ližė, esant SEA-C215 monAK ir SEA-C242 monAK (3 ųg/ml) konjugatams inhibuojama pridėjus atitinkamai nekonjuguotų C215 ir C242 monAK (30 ųg/ml). Nekonjuguoti monAK arba kontrolinė terpė (-) buvo pridedama ląstelėms-taikiniams 10 min iki konjugatų.
fig. Ližė storosios žarnos vėžio ląstelių, padengtų konjugatu SEA-C215 monAK, indukuojama CTL, duodančių atsaką i, SEA, bet ne į SEB. Buvo panaudotos autologinės T-ląstelių SEA-ir SEB- selektyvios linijos, efektorius/taikinys santykiu, lygiu 10:1, prieš ląstelestaikinius SW620 ir Raji, nedalyvaujant (kontrolė) ir dalyvaujant SEA-C215 monAK konjugatui, o t.p. mišiniui nekonjuguotų C215 monAK ir SEA (C215+SEA) ir nekonjuguotų C215 monAK ir SEA (C215+SEB), esant kiekvieno priedo koncentracijai 1 ųg/ml.
fig. Citotoksiškumas, indukuojamas SEA-C242 monAK ir SEA-anti-Thy-1.2 monAK konjugatais, prieš ląstelesLT 3909 B taikinius (navikines ląsteles Colo 205 ir navikines ląsteles EL-4, atitinkamai).
I Lentelė
SEA-C215 monAK konjugato surišimas su storosios žarnos vėžio C215+ ląstelėmis ir su Raji II+ Klasės PASKA ląstelėmis
Reagentas Ląstelė Fluorescentinė analizė
SEA-C215 monAK Colo205 Teigiama
Ra j i Teigiama
C215 monAK Colo205 Teigiama
Ra j i Neigiama
SEA-C242 monAK Colo205 Teigiama
Ra j i Teigiama
C242 monAK Colo205 Teigiama
Ra j i Neigiama
SEA-anti-Thy-1.2 monAK EL-4 Teigiama
anti-Thy-1.2 monAK EL-4 Teigiama
SEA Colo205 Neigiama
Ra j i Teigiama
Kontrolė Colo205 Neigiama
Ra j i Neigiama
EL-4 Neigiama
Ląstelės buvo inkubuotos su įvairiais priedais prie kontrolės (jaučių serumo albuminas) 30 min ant ledo, praplautos ir apdorotos, kaip aprašyta anksčiau. C215 monAK ir C242 monAK, surištų su Colo205, nudažymą nustatinėjo, panaudojant FITC - žymėtą triušių I g
prieš pelių antigenus. SEA sujungto su Raji ląstelėmis nudažymą nustatinėjo panaudojant triušių antiserumus prieš SEA, o po to - FITC-žymėtą kiaulių I g prieš triušių antigenus. SEA-C215 monAK konjugato, surišto su Colo205 ir Raji ląstelėmis nudažymą nustatinėjo, panaudojant procedūras, aprašytas anksčiau dėl C215 monAK ir SEA. Aktyvuojama fluorescencija analizė buvo atliekama su firmos Becton and Diccinson prietaisu. Fono nustatymui buvo naudojamas nudažymas antrai ir trečiai stadijai.
Lentelė
Apibūdinanti C215-SEA konjugatą storosios žarnos vėžio ląstelių ližė, CD4+ CTL ir CD8+ CTL poveikyje
Efektorius* Taikinys Citotoksiškumo %
kontrolė SEA C215-SEA
CD4 + SW620 2 5 50
CD4 + Raji 0 41 43
CD8+ SW620 0 1 23
CD8+ Raji 2 72 68
* CTL(SEA-3) kinys, lygiu buvo 30:1, naudojamos santykiu efektorius/tai- nedalyvaujant (kontrolė) arba da-
lyvaujant SEA ir C215-SEA 1 ųg/ml koncentracijoje.

Claims (21)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Tirpus antikūno konjugatas, apimantis antikūną ir superantigeną, besiskiriantis tuo, kad (i) nurodytas antikūnas yra specifinis susijusios su susirgimu ląstelės-taikinio paviršinei struktūrai, ir (ii) nurodytas superantigenas atpažįstamas T-ląstelėmis ir sugeba aktyvinti citotoksines T-ląsteles (CTL), ir, dažniausiai, sugeba sąveikauti su T-ląstelės receptoriaus variabilios zonos beta-grandine.
  2. 2. Konjugatas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad ląstelė-taikinys, susijusi su susirgimu, parinktu iš grupės tokių susirgimų kaip vėžys, autoimuniniai susirgimai, parazitiniai užkrėtimai ir mikrobinės infekcijos, tokios kaip virusinė, grybelinė ir bakterinė infekcija, ir antikūnas, specifiškai nukreiptas prieš antigeninę determinantę, esančią ant nurodytos ląstelės-taikinio.
  3. 3. Konjugatas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad susirgimas yra vėžys, ir antikūnas nukreiptas prieš antogeninę determinantę (epitopą), esančią ant navikinės ląstelės, tokios kaip ląstelė, susijusi su storosios žarnos vėžiu.
  4. 4. Konjugatas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad antikūnas specifiškai nukreiptas prieš epitopą C242.
  5. 5. Konjugatas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad antikūnas specifiškai nukreiptas prieš epitopą baltyme, priklausančiam GA-733, būtent prieš epitopą C215.
  6. 6. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad vienam antikūnui tenka mažiausiai 1-5, geriausiu atveju 1-3 superantigenai.
  7. 7. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad kaip antikūną panaudoja monokloninį antikūną.
  8. 8. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad superantigenas yra bakterinės kilmės, ir parenkamas iš grupės, susidedančios iš stafilokokų enterotoksinų.
  9. 9. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-8 punktų, besiskiriantis tuo, kad kaip superantigeną naudoja stafilokokų enterotoksinus SEA.
  10. 10. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-9 punktų, besiskiriantis tuo, kad superantigenas ir antikūnas sujungti vienas su kitu kovalentiniu organiniu tilteliu -B-, kuris, geriausia, turi mažiausiai vieną amidinę struktūrą ir kuris yra hidrofilinis, turintis grandinę, sudarytą iš mažiausiai 6 atomų.
  11. 11. Konjugatas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad tiltelis -B- turi šią struktūrą:
    -SrRCONHCH2CH2 (OCH2CH2) nO (CH2)mCOY- (I) , kurioje: r yra 1 arba 2;
    R yra alkileno grupė, turinti 1-4 anglies atomus;
    n yra sveikas skaičius nuo 1 iki 20;
    m yra 1 arba 2; ir
    Y yra -NH-, -NHNH- arba -NHN=CH-.
  12. 12. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-10 punktų, besiskiriantis tuo, kad jis yra naudojamas ūžavimui ląstelių-taikinių, turinčių paviršiaus struktūrą, prieš kurią nukreiptas konjugato antikūnas.
  13. 13. Ląstelės-taikinio ūžavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad ląstelėms-taikiniams leidžia kontaktuoti su ląstelių-taikinių ūžavimui reikalingu efektyviu antikūno tirpaus konjugato kiekiu, turinčiu antikūną, surištą su superantigenų, priedo, nurodytas antikūnas yra specifinis ląstelėms-taikiniams, ir nurodytas superantigenas atpažįstamas T-ląstelių ir sugeba aktyvinti citotoksines T-ląsteles (CTL).
  14. 14. Lizavimo būdas pagal 13 punktą, besiskiriantis tuo, kad superantigenas, antikūnas ir sujungiantis antikūną su superantigenų tiltelis atitinka apibūdinimams, duotiems bet kuriame iš 1-12 punktų.
  15. 15. Konjugato gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad antikūną ir/arba superantigeną sujungia mažiausiai per vieną struktūrą, parenkamą iš (a) angliavandenių ir (b) funkcinių grupių: merkapto grupių, disulfido grupių, karboksilo grupių ir aminogrupių; toliau išskiria iš terpės gautąjį konjugatą.
  16. 16. Konjugato gavimo būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad kondensacijos reakcijoje dalyvauja aminogrupė, esanti superantigene ir/arba antikūne .
  17. 17. Konjugato gavimo būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad į kondensacijos reakciją Įeina šios stadijos:
    (i) antikūno ar superantigeno reakcija su organiniais reagentais, turinčiais grupę, galinčią reaguoti su merkaptogrupe, ir grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant antikūną ar superantigeną, turintį grupę, galinčią reaguoti su merkaptogrupe, ir (ii) likusios superantigeno ar antikūno dalies reakcijos su organiniais reagentais, turinčiais merkaptogrupę ar blokuotą merkaptogrupę, arba grupę, galinčią reaguoti su aminogrupe, gaunant superantigeną arba antikūną, turintį merkaptogrupę arba blokuotą merkaptogrupę; po to (iii) produktai, gauti (i) ir (ii) stadijose, atitinkamai, reaguoja vienas su kitu, susidarant konjugatui, kuriame superantigenas sujungtas su antikūnu per disulfidinę ar tioeterinę grupę.
  18. 18. Konjugato gavimo būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad junginys, galinti sąveikauti su aminogrupe, ir turintis grupę, galinčią sąveikauti su merkaptogrupe, yra alfa-halogenacetilhalogenidas, ir junginys, turintis merkaptogrupę arba blokuotą merkaptogrupę, yra bifunkcinis sujungiantis reagentas, turintis formulę II:
    Z1RCONHCH2CH2 (OCH2CH2)nO (CH2)n,z' (II) , kurioje: m yra 1 arba 2, n yra sveikas skaičius nuo 1 iki 20, Zx yra HS-reaktinga elektrofilinė grupė, merkaptogrupė (-SH) arba blokuota merkaptogrupe (pvz., AcS-), su sąlyga, kad merkaptogrupe ir hidroksilo grupė neturi būti prijungtos prie vieno ir to paties anglies atomo R radikale; ir z\ yra aktyvuota karboksilo grupė.
  19. 19. Konjugato gavimo būdas pagal bet kurį iš 1518 punktų, besiskiriantis tuo, kad nurodyti superantigenas ir antikūnas atitinka apibūdinimams, duotiems bet kuriame iš 1-9 punktų.
  20. 20. Konjugatas pagal bet kurį iš 1-11 punktų, skirtas gamybai medikamentų žinduolių, tame tarpe ir žmogaus, sergančių susirgimu, parinktu iš grupės, susidedančios iš vėžio, autoimuninių susirgimų, infekcijų, sukeltų
    10 virusų, bakterijų ar grybelių, ir užkrėtimo parazitais, gydymui.
  21. 21. Konjugato pagal bet kurį iš 1-11 punktų panaudojimas pagaminimui farmacinės kompozicijos, skirtos
    15 vėžio, autoimuninių susirgimų, infekcijų, sukeltų virusų, bakterijų ir grybelių, arba užkrėtimo parazitais, gydymui.
LTIP1632A 1990-07-20 1993-12-20 Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose LT3909B (lt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9002484A SE9002484L (sv) 1990-07-20 1990-07-20 Nya substituerade polyetrar

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1632A LTIP1632A (en) 1995-07-25
LT3909B true LT3909B (lt) 1996-04-25

Family

ID=20380036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1632A LT3909B (lt) 1990-07-20 1993-12-20 Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose

Country Status (2)

Country Link
LT (1) LT3909B (lt)
SE (1) SE9002484L (lt)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180171A2 (en) 1984-10-31 1986-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Process for making a targeted cell susceptible to lysis by cytotoxic T lymphocytes
EP0334300A1 (en) 1988-03-21 1989-09-27 Neorx Corporation The use of monoclonal antibodies and conjugates thereof as signals to direct sensitized effector cells to tumor sites
EP0336405A2 (en) 1988-04-08 1989-10-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Anti-human cancer protein complexes, their production and use
EP0352761A2 (de) 1988-07-28 1990-01-31 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Antigenkonstrukte von "Major Histocompatibility Complex" Klasse I Antigenen mit spezifischen Trägermolekülen, ihre Herstellung und Verwendung
EP0376746A2 (en) 1988-12-29 1990-07-04 The Wistar Institute Gene family of tumor-associated antigens
WO1990011779A1 (en) 1989-03-31 1990-10-18 Medical Research Council Heteroconjugates
WO1991004053A1 (en) 1989-09-20 1991-04-04 Pharmacia Ab Pharmaceutical composition that makes cells expressing mhc class ii antigens targets for cytotoxic t-cells

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180171A2 (en) 1984-10-31 1986-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Process for making a targeted cell susceptible to lysis by cytotoxic T lymphocytes
EP0334300A1 (en) 1988-03-21 1989-09-27 Neorx Corporation The use of monoclonal antibodies and conjugates thereof as signals to direct sensitized effector cells to tumor sites
EP0336405A2 (en) 1988-04-08 1989-10-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Anti-human cancer protein complexes, their production and use
EP0352761A2 (de) 1988-07-28 1990-01-31 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Antigenkonstrukte von "Major Histocompatibility Complex" Klasse I Antigenen mit spezifischen Trägermolekülen, ihre Herstellung und Verwendung
EP0376746A2 (en) 1988-12-29 1990-07-04 The Wistar Institute Gene family of tumor-associated antigens
WO1990011779A1 (en) 1989-03-31 1990-10-18 Medical Research Council Heteroconjugates
WO1991004053A1 (en) 1989-09-20 1991-04-04 Pharmacia Ab Pharmaceutical composition that makes cells expressing mhc class ii antigens targets for cytotoxic t-cells

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FLEISCHER B ET AL.: "T lymphocyte activation by staphylococcal enterotoxins: role of class II molecules and T cell surface structures.", CELL IMMUNOL., 1989, pages 92 - 101, XP024002865, DOI: doi:10.1016/0008-8749(89)90177-9
MARRACK P, KAPPLER J.: "The staphylococcal enterotoxins and their relatives", SCIENCE, 1990, pages 705 - 711, XP002138564, DOI: doi:10.1126/science.2185544
PLATSOUCAS CD, OLESZAK EL, GOOD RA.: "Immunomodulation of human leukocytes by staphylococcal enterotoxin A: augmentation of natural killer cells and induction of suppressor cells.", CELL IMMUNOL., 1986, pages 371 - 385, XP024006779, DOI: doi:10.1016/0008-8749(86)90407-7

Also Published As

Publication number Publication date
SE9002484D0 (sv) 1990-07-20
LTIP1632A (en) 1995-07-25
SE9002484L (sv) 1992-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2125889C1 (ru) Растворимый конъюгат антитела, способ лечения онкологического заболевания, фармацевтическая композиция
US6197299B1 (en) Antibody conjugates
EP0510949B1 (en) Cytomodulating conjugates of members of specific binding pairs
JP7295640B2 (ja) アマニタ毒素の誘導体及びそれらと細胞結合分子との共役体
US5116944A (en) Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
JP6196613B2 (ja) タンパク質−活性剤コンジュゲートおよびこれを調製するための方法
JPS6069033A (ja) 免疫毒素複合体
US5858363A (en) Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
JP2018506509A (ja) 細胞透過性Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤との抗体薬物コンジュゲート
CZ5793A3 (en) Thioether conjugates
DK159277B (da) Analogifremgangsmaade til fremstilling af produkter, der er anvendelige til behandling af melanomer
JPH04334377A (ja) 酸−不安定性リンカー分子
JPH10511989A (ja) 特異的結合ペア構成要素の細胞調節性複合体
JPH07223969A (ja) チオエーテル結合体の製造法
JPH05238952A (ja) 抗体を伴う薬物のクラスター複合体
LT3909B (lt) Nauji antikūnio-superantigeno konjugatai, jų gavimo būdas, ląstelės-taikinio ūžavimo būdas ir konjugatų panaudojimas farmacinėse kompozicijose
IE75719B1 (en) Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
PT100568A (pt) Anticorpos monoclonais e antigeneos para o melanoma humano
WO2021064332A1 (fr) Conjugues anti-cd30-medicament et leur utilisation en therapie
GB2282812A (en) Cytotoxic/receptor ligand conjugates linked via lysine radicals
JPH0653682B2 (ja) ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤
JPH0611714B2 (ja) ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤
JPH0782300A (ja) 抗腫瘍物質

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Owner name: ACTIVE BIOTECH AB, SE

Effective date: 20040316

PD9A Change of patent owner

Owner name: PHARMACIA AB, SE

Effective date: 20040316

MM9A Lapsed patents

Effective date: 20071220