JP6196613B2 - タンパク質−活性剤コンジュゲートおよびこれを調製するための方法 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、2011年5月8日に出願された米国仮出願第61/483,698号の利益を主張し、その出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
（ａ）技術分野
本開示は、タンパク質−活性剤コンジュゲートに関する。タンパク質（例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、抗体など）は、所望の標的に対する基質特異性を有し、活性剤（例えば、薬物、毒素、リガンド、検出プローブなど）は、特異的な機能または活性を有する。本開示はまた、コンジュゲートを調製するための方法に関する。本開示は、さらに、活性剤を対象における標的細胞に送達するためにコンジュゲートを用いる方法、ならびに、活性剤を必要とする対象（例えば、癌を有する対象）を処置するための方法に関する。
（ｂ）背景技術
抗癌剤の標的化された送達により癌細胞の増殖を阻害するための方法は、提案されている。例えば、抗体−薬物コンジュゲートの標的化された送達が、特定の癌細胞を殺傷することができることが示されている。抗体（または抗体フラグメント）が癌細胞に特異的にバインドすることにより、薬物は標的癌細胞に送達される。標的化された薬物の送達により、当該薬物が正常な宿主細胞の代わりに標的癌細胞に対して作用し、それにより正常細胞への損傷から生じる副作用を最少化することが確実となる。
抗体コンジュゲートは、化学および／または生物学的分子を送達するために用いることができる。例示的な化学および／または生物学的分子として、化学的処置において慣用的に用いられる薬物、細菌のタンパク質毒素（例えば、ジフテリア毒素）、植物タンパク質毒素（例えばリシン）、低分子毒素（例えば、アウリスタチン、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンデシンおよびチューブリシン）、アフィニティーリガンド、検出プローブ（例えば、蛍光プローブ、放射活性プローブ）など（それらの組み合わせを含む）が挙げられる。
これまでに提案されている抗体−薬物コンジュゲートは、薬物部分を、抗体の複数のリジン基に結合させることにより調製される。あるいは、抗体−薬物コンジュゲートは、抗体の鎖間ジスルフィド基の全てまたは一部を還元するか、または全ての鎖間ジスルフィド基を還元した後、部分的に酸化し、それにより遊離のシステインチオール基を生じさせ、次いで、遊離のシステインチオール基を薬物部分と結合させることにより調製される。
しかし、存在する調製方法は、幾つかの問題を有する。例えば、存在する調製方法により調製される抗体−薬物コンジュゲートは均一（均質）でないため、全体的な調製プロセスが複雑である。薬物部分をリジン基と結合させることにより抗体−薬物コンジュゲートを調製する場合、抗体における多数のリジン基（例えば、抗体１つあたり１００個のリジン基）の存在に起因して、多様な型および形態の抗体−薬物コンジュゲートが得られる。同様に、チオール基を薬物部分と結合させることにより抗体−薬物コンジュゲートを調製する場合、チオール基とマレイミド基との間の結合に起因して、ジアステレオマーの混合物が得られる。例えば、ｎ個の薬物をコンジュゲートさせる場合、２ｎ個の立体異性体の混合物が得られる。したがって、薬物分布数が０〜８である場合（例えば鎖間ジスルフィド基を還元する場合）、
個の立体異性体の混合物が得られる。さらに、ｉ個の薬物をｑ個の部位によりコンジュゲートさせる場合、
個の異なる化合物の混合物が得られる。
さらに、リジン基を薬物部分と結合させることにより抗体−薬物コンジュゲートを調製する場合、リジン基の電荷が失われる場合があり、これにより、抗体にそのユニークな抗原特異性を失わせる場合がある。同様に、ジスルフィド基を還元することにより抗体−薬物コンジュゲートを調製し、それにより、抗体が不活化させたり、非特異的抗体になったりすると、抗体の三次または四次構造が維持されないことがある。チオール−マレイミド結合を用いて抗体−薬物コンジュゲートを調製する場合、例えば逆反応を介して薬物がコンジュゲートから（非特異的に）切断される場合がある。
先行する調製方法に関連する問題を解決するために、抗体の特定の位置におけるアミノ酸基をシステイン基で置き換える代替的方法が提案された。この方法は、毒性、活性および安全性に関して、先行する調製方法よりもより良好な結果を示すが、この方法はなお、チオール−マレイミド結合を含み、したがって、チオール−マレイミド結合に関連するジアステレオマーおよび不安定性の問題に苦しむ。抗体のカルボキシ末端にセレノシステイン基を付着させる、別の代替的方法が提案された。
コンジュゲーションの部位を制御するためのシステイン置換の使用に加えて、Ambrx Technology（http://www.ambrx.com）は、リンカー化学のために用いることができる官能基を提供するために、抗体中に非天然のアミノ酸を組み込むことを目的に研究していた。Ambrxの発現系は、元のtRNAを非天然のアミノ酸でアミノアシル化し、それによりアンバー停止に遭遇すればいつでも非天然のアミノ酸を組み込むtRNAシンテターゼを含む。
Redwood Bioscience（http://www.redwoodbioscience.com）の技術は、遺伝子的にコードされるアルデヒドタグを使用し、翻訳後に酵素（すなわちホルミルグリシン産生酵素）により認識されて修飾される特異的配列を利用し、いわゆるアルデヒドケミカルハンドル（aldehyde chemical handle）を生成することを目的とする。抗体中の特異的な位置におけるＣｘＰｘＲ配列の組み込みは、薬物のコンジュゲーションを受け入れられる反応性アルデヒドを生成するための手段を提供する。
しかし、抗体−薬物コンジュゲートを製造することに関する当該分野における前述の問題に関して、新規の抗体−薬物コンジュゲートおよび抗体−薬物コンジュゲートを製造する新規の方法が、高く所望される。この背景セクションにおいて開示される上の情報は、単に本発明の背景の理解の強化のためのものであり、したがって、当業者には既に知られている先行技術を形成しない情報を含む場合がある。
開示の要旨
以下に記載される通り、本発明は、一般に、タンパク質−活性剤コンジュゲート、およびタンパク質−活性剤コンジュゲートを製造するための方法に注目する。本発明はまた、タンパク質−活性剤コンジュゲートを対象における標的細胞に送達するための方法、ならびに、活性剤を必要とする対象を処置するための方法に注目する。本発明のタンパク質−活性剤コンジュゲートは、均質に生成することができ、標的化された疾患の処置のために有利に用いることができる。
側面において、本発明は、タンパク質−活性剤コンジュゲートを提供する。態様において、タンパク質は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有する。態様において、前記活性剤は、前記アミノ酸モチーフにおいて前記タンパク質に共有的に連結されている。
態様において、前記タンパク質は、当該タンパク質のカルボキシ末端における欠失を有する。関連する態様において、修飾は、前記アミノ酸モチーフに付着している。
態様において、タンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加を有する。関連する態様において、修飾は、前記アミノ酸モチーフに付着している。
態様において、タンパク質は、タンパク質のカルボキシ末端における欠失、およびタンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加を有する。関連する態様において、修飾は、前記アミノ酸モチーフに付着している。
態様において、タンパク質は、抗体または抗原性ポリペプチドのフラグメントである。関連する態様において、タンパク質は、モノクローナル抗体である。関連する態様において、モノクローナル抗体の少なくとも１つの軽鎖および／または少なくとも１つの重鎖は、前記アミノ酸モチーフを有するアミノ酸領域を含む。
上の側面または態様のいずれかにおいて、イソプレノイドトランスフェラーゼは、ＦＴアーゼまたはＧＧＴアーゼである。
上の側面または態様のいずれかにおいて、活性剤は、薬物、毒素、アフィニティーリガンド、検出プローブまたはそれらの組み合わせである。
上の側面または態様のいずれかにおいて、アミノ酸モチーフは、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘはイソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす。
上の側面または態様のいずれかにおいて、アミノ酸モチーフは、少なくとも１つのリンカーを介して、活性剤に共有に連結されている。関連する態様において、リンカーは、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るイソプレニル誘導体である。
関連する態様において、リンカーは、以下の式（Ｉ）：
により表わされ、
式中、
Ｐ１およびＹは、独立して、第１の官能基（ＦＧ１）を含む基であり、ＦＧ１は、アセチレン、アジド、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ケトン、ニトロベンゾフラン（ＮＢＤ）、ダンシル、フルオレセイン、ビオチン、およびローダミンからなる群より選択され、
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐであり、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ１−、−（ＣＨ＝ＣＨ）−またはアセチレンであり、
Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり、
ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
ｑは、０〜１の整数であり、および
ｎは、１〜４の整数である。
態様において、活性剤は、ＦＧ１と反応することができる第２の官能基（ＦＧ２）を含む基に付着する。関連する態様において、ＦＧ２は、アセチレン、ヒドロキシルアミン、アジド、アルデヒド、ヒドラジン、ケトンまたはアミンである。さらなる関連する態様において、活性剤は、−（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−を介してＦＧ２を含む基に付着し、ここで、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−またはＳＯ２ＮＲ１−であり、
Ｚは、酸素、硫黄またはＮＲ１であり、
Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり、
ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
ｑは、０〜１の整数であり、および
ｍは、０〜６の整数である。
またさらなる関連する態様において、−（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−は、（ｉ）カテプシンＢにより切断され得るペプチド、または（ｉｉ）β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドに付着する。
態様において、カテプシンＢにより切断され得るペプチドは、
である。
態様において、β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドは、
である。
側面において、本発明は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートのいずれかを調製するための方法を提供する。態様において、方法は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させることを含む。態様において、方法は、発現されたタンパク質と第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質（isosubstrate）とをイソプレノイドトランスフェラーゼにより酵素的に反応させ、それにより官能化されたタンパク質を生成することを含む。態様において、方法は、第２の官能基（ＦＧ２）を活性剤に付着させ、それにより官能化された活性剤を生成することを含む。態様において、方法は、官能化されたタンパク質を官能化された活性剤と反応させ、それによりタンパク質−活性剤コンジュゲートを生成することを含む。
関連する態様において、アミノ酸モチーフは、タンパク質のカルボキシ末端において存在する。
関連する態様において、アミノ酸モチーフは、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす。
関連する態様において、アミノ酸モチーフは、ＣＡＡＸであり、およびここで方法はさらに、工程（ｂ）の後でアミノ酸モチーフからＡＡＸを取り除くことを含む。
関連する態様において、ＦＧ２は、少なくとも１つのリンカーにより活性剤に付着する。
関連する態様において、官能化されたタンパク質と官能化された活性剤との間の反応は、クリックケミストリー反応、またはヒドラゾンおよび／もしくはオキシム形成である。態様において、ＦＧ１はアジド基であり、ＦＧ２はアセチレン基である。態様において、ＦＧ１はアセチレン基であり、ＦＧ２はアジド基である。態様において、ＦＧ１はアルデヒドまたはケトン基であり、ＦＧ２はヒドラジンまたはヒドロキシルアミンである。態様において、ＦＧ１はヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであり、ＦＧ２はアルデヒドまたはケトンである。
側面において、本発明は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートのいずれかを調製するための方法を提供し、方法は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させることを含む。態様において、方法は、イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質を活性剤に付着させることを含む。態様において、方法は、発現されたタンパク質とイソ基質に付着した活性剤とをイソプレノイドトランスフェラーゼにより酵素的に反応させることを含む。
関連する態様において、アミノ酸モチーフは、タンパク質のカルボキシ末端において存在する。
関連する態様において、アミノ酸モチーフは、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす。
関連する態様において、イソ基質は、少なくとも１つのリンカーにより活性剤に付着する。
側面において、本発明は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートのいずれかを含む組成物を提供する。態様において、組成物は、タンパク質−活性剤コンジュゲートの均質な混合物である。態様において、タンパク質は、抗体または抗原性ポリペプチドのフラグメントである。
側面において、本発明は、対象における標的細胞に活性剤を送達するための方法を提供する。態様において、方法は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートまたは組成物の少なくとも１つを投与することを含む。態様において、標的細胞は癌細胞である。
側面において、本発明は、それを必要とする（すなわち、活性剤を必要とする）対象を処置するための方法を提供する。態様において、方法は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートまたは組成物の少なくとも１つを投与することを含む。態様において、対象は癌を有する。態様において、対象は、病原体による感染を有する。病原体は、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫であってよい。
上記のタンパク質−活性剤コンジュゲート、組成物および方法において、一部の態様において、活性剤は、免疫調節性化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗寄生虫剤であってよい。
本発明の上および他の側面、特徴および利点は、添付の図面から明らかであるか、またはそれらにおいてより詳細に記載され、それらは、本明細書において組み込まれ、本明細書の一部を形成し、詳細な説明の後で、それらは一緒に本発明の原理を例により説明するために役立つ。
図１は、ハーセプチンの重鎖のＣ末端にＧＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。 図２は、ハーセプチンの軽鎖のＣ末端にＧＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。 図３は、ハーセプチンの重鎖のＣ末端にＧ５ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。
図４は、ハーセプチンの軽鎖のＣ末端にＧ５ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。 図５は、ハーセプチンの重鎖のＣ末端にＧ７ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。
図６は、ハーセプチンの軽鎖のＣ末端にＧ７ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。 図７は、ハーセプチンの重鎖のＣ末端にＧ１０ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。 図８は、ハーセプチンの軽鎖のＣ末端にＧ１０ＣＶＩＭを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ）のアミノ酸配列を示す。
図９は、ハーセプチンの重鎖のＣ末端にＧ１０ＣＶＬＬを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ）のアミノ酸配列を示す。 図１０は、ハーセプチンの軽鎖のＣ末端にＧ１０ＣＶＬＬを挿入することにより調製される修飾ハーセプチン抗体（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ）のアミノ酸配列を示す。
図１１は、Ｇ７ＣＶＩＭを抗ｃＭＥＴ抗体の重鎖のＣ末端に挿入することにより調製される修飾抗ｃＭＥＴ抗体（抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ）、Ｇ７ＣＶＩＭを抗ｃＭＥＴ抗体の軽鎖のＣ末端に挿入することにより調製される修飾抗ｃＭＥＴ抗体（抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ）、Ｇ１０ＣＶＩＭを抗ｃＭＥＴ抗体の重鎖のＣ末端に挿入することにより調製される修飾抗ｃＭＥＴ抗体（抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ）、およびＧ１０ＣＶＩＭを抗ｃＭＥＴ抗体の軽鎖のＣ末端に挿入することにより調製される修飾抗ｃＭＥＴ抗体（抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ）を分析する、SDS-PAGEゲルを示す。
図１２は、ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いることによるハーセプチン−ＨＣ−ＧｎＣＶＩＭのプレニル化を分析するSDS-PAGEゲルを示す。 図１３は、ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いることによるハーセプチン−ＬＣ−ＧｎＣＶＩＭのプレニル化を分析するSDS-PAGEゲルを示す。 図１４は、ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いることによるｃＭＥＴ−ＨＣ−ＧｎＣＶＩＭのプレニル化を分析するSDS-PAGEゲルを示す。
図１５は、ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いることによるｃＭＥＴ−ＬＣ−ＧｎＣＶＩＭのプレニル化を分析するSDS-PAGEゲルを示す。 図１６は、ＦＴアーゼ／NBD-GPPまたはＧＧＴアーゼＩ／NBD-FPPを用いることによるハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬおよびハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬのプレニル化を分析するSDS-PAGEゲルを示す。 図１７は、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭのLC/MS分析からの結果を示す。 図１８は、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭのLC/MS分析からの結果を示す。
図１９は、LCB14-0104（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ−ＮＣ−ＭＭＡＦ−Ome）のLC/MSおよびデコンボリューション質量分析スペクトル分析からの結果を示す。 図２０は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ、およびLCB14-0101（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ−ＢＧ−ＭＭＡＦ）のHIC-HPLCクロマトグラムを示す。 図２１は、乳癌細胞株MCF-7、MDA-MB-468およびSK-BR-3によるLCB14-0101（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ−ＢＧ−ＭＭＡＦ）の抗増殖アッセイからの結果を示す。 図２２は、乳癌細胞株MCF-7およびSK-BR-3によるLCB14-0102（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ−ＶＣ−ＭＭＡＦ−OMe）の抗増殖アッセイからの結果を示す。
図２３は、乳癌細胞株MCF-7およびSK-BR-3によるLCB14-0103（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ−ＢＧ−ＭＭＡＥ）の抗増殖アッセイからの結果を示す。 図２４は、タンパク質（Ｃ末端ＣＶＩＭ）の翻訳後修飾のプロセスを示す。 図２５は、活性薬物の放出（非切断可能リンカーを除く）の機序を示す。 図２６は、抗体−薬物コンジュゲートLCB14-0101、LCB14-0102、LCB14-0103およびLCB14-0104の化学構造を示す。 図２７は、イソプレノイドトランスフェラーゼおよびそのイソ基質を用いることによりタンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するためのプロセスを表わす模式図であり、ここで、ＣＡＡＸモチーフのシステインはアルキル化されている。
本開示の詳細な説明
ここで本発明の態様について詳細な言及がなされ、本明細書において後に添付される図面においてその例が説明され、図面において、類似の参照数詞は、全体を通して類似の要素を指す。本発明を説明するために、図面を参照して、態様を以下に記載する。
定義
「剤」または「活性剤」により、任意の低分子化合物、抗体、核酸分子またはポリペプチドまたはそれらのフラグメントが意味される。例として、限定されないが、薬物、毒素、アフィニティーリガンド、検出プローブまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
「アナログ」により、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子が意味される。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持しつつ、天然に存在するポリペプチドと比較して当該アナログの機能を増強する特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、当該アナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性または半減期を増大させることができる。アナログは、非天然のアミノ酸を含んでもよい。
本開示において、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、「含む（containing）」および「有する（having）」などは、米国特許法においてそれらに属する意味を有してよく、「含む（include）」、「含む（including）」などを意味してもよい；「から本質的になる（consisting essentially of）」または「本質的になる（consist essentially）」も同様に、米国特許法においてそれらに属する意味を有し、当該用語はオープンエンドであり、列記されるものの基本的なまたは新規の特徴が、列記されるものより多くのものの存在により変更されない限り（ただし先行技術の態様を除外する）、列記されるものより多くのものの存在を許容する。
「細胞を接触させる」とは、本明細書において、細胞、例えば培養中で、ex vivoで、または動物において処置されるべき細胞に、剤が細胞（例えば処置されるべき細胞）と相互作用し、潜在的に細胞により取り込まれ、細胞に対して効果を有することができるように、剤を提供することとして理解される。剤（例えばアジュバント）は、細胞に直接的に（例えば培養培地への剤の添加により、または関心のある細胞もしくは組織中への注入により）送達しても、あるいは、血管系、リンパ系または他の手段による細胞への送達のための局所または非経口の投与の経路により生物への送達によるものであってもよい。当業者は、対象への本発明のタンパク質−活性剤コンジュゲートの投与が、タンパク質−活性剤コンジュゲートを対象の細胞と接触させることを含むことを、容易に理解するであろう。
「疾患」により、細胞、組織または器官の正常な機能に損傷を与えるかまたはこれを妨害する、任意の状態または障害が意味される。
用語「有効量」、「治療有効量」、「有効用量」または「治療有効用量」とは、意図される薬理学的、治療的または予防的結果を提供するための剤の量を指す。例えば、薬理学的に有効な量は、個体において、または集団中の疾患の頻度において、疾患の予防、またはその発症の遅延をもたらす。有効用量を提供するために１回よりも多い用量が必要とされる場合もある。１集団における有効用量は、全集団において十分である場合も、十分ではない場合もある。したがって、剤または免疫原性組成物の投与に関して、剤または免疫原性組成物は、臨床的に適切な様式における投与が、少なくとも対象のうちの統計学的に有意な画分に対して有益な効果（例えば、疾患の発症の予防、症状の改善、治癒、疾患の兆候または症状の軽減、寿命の延長、クオリティ・オブ・ライフの改善、またはその特定の型の疾患または状態を処置することに精通している医師により有意義である（positive）として一般に認識される他の効果）をもたらした場合に、疾患または状態「に対して有効」である。
「増強する（enhance）」により、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはその間の任意の数の正の変更が意味される。
「フラグメント」により、ポリペプチドまたは核酸分子の部分が意味される。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含む。フラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
「ハイブリダイゼーション」は、水素結合を意味し、これは、相補的なヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの水素結合であり得る。例えば、アデニンとチミンとは相補的なヌクレオチド塩基であり、水素結合の形成を通して対となる。
「得る（obtaining）」は、本明細書において、製造すること、購入すること、合成すること、単離すること、精製すること、または他の方法でそれを入手することとして理解される。
句「薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤」は、当該分野において認識されており、本発明の化合物を哺乳動物に投与するために好適な薬学的に受容可能な材料、組成物 またはビヒクルを含む。
本明細書において用いられる場合、用語「薬学的に受容可能な」は、連邦または州政府の監督機関により承認されていること、または米国薬局方、欧州薬局方または他の一般に認識されている薬局方において、哺乳動物、例えばヒトにおける使用について列記されていることを意味する。
「減少させる（reduce）」により、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはその間の任意の数の負の変更が意味される。
「参照（reference）」により、標準的または対照の状態が意味される。
「試料」は、本明細書において用いられる場合、その環境（例えば、動物からの血液もしくは組織、細胞、または組織培養からの馴化培地）から単離された生物学的材料を指す。態様において、試料は、関心のあるタンパク質（例えば、抗体、サイトカインなど）などの分析物を含むことが疑われるか、またはこれを含むことが知られている。試料はまた、組織または体液の部分的に精製された画分であってもよい。参照試料は、疾患または状態を有さないドナーからの、あるいは、疾患もしくは状態を有する対象または未処置の対象（例えば、ワクチンで処置されない対象）における正常組織からの、「正常な」試料であってよい。参照試料はまた、細胞または対象を、試験されるべき剤または治療的介入と接触させる前の、「ゼロ時点」において採取してもよい。
「特異的に結合する」により、標的（例えば、ポリペプチド、細胞など）の認識およびこれへの結合が意味されるが、これは、試料、例えば生物学的試料中の他の分子を実質的に認識せずこれに結合しない。
「対象」は、本明細書において用いられる場合、生物を指す。態様において、生物は、動物である。態様において、対象は哺乳動物である。態様において、対象は、家畜化された哺乳動物または非ヒト霊長類を含む霊長類である。対象の例として、限定されないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジおよび鳥類が挙げられる。対象はまた、患者としても言及することができる。
特定の疾患、状態または症候群を「罹患するかまたは罹患することが疑われる」対象は、適格者（competent individual）が、当該対象が当該疾患、状態または症候群を罹患すると診断または疑うのに十分な数の当該疾患、状態または症候群の危険因子を有するか、あるいは十分な数の当該疾患、状態または症候群の兆候または症状またはこれらの組み合わせを提示する。疾患または状態を罹患するかまたはこれを罹患することが疑われる対象の同定のための方法は、当業者の能力の範囲内である。特定の疾患、状態または症候群を罹患する対象と、これを罹患することが疑われる対象とは、必ずしも２つの区別し得る群ではない。当業者はまた、活性剤を必要とする対象もまた、特定の疾患、状態または症候群を罹患するかまたはこれを罹患することが疑われる対象であってもよいことを、容易に理解するであろう。
本明細書において用いられる場合、用語「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、「処置（treatment）」などは、障害および／またはそれに付随する症状（例えば癌または癌に付随する症状）を軽減または緩和することを指す。障害または状態を処置することは、それに付随する障害、状態または症状が完全に取り除かれることを必要としない（ただしこれを妨げない）ことが、理解される。
本明細書において提供される範囲は、当該範囲内の値の全てを短縮するものであると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせおよび部分範囲を含むものと理解される。
特に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において用いられる場合、用語「または（or）」は、包括的（inclusive）であるものと理解される。
特に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において用いられる場合、用語「a」、「an」および「the」は、単数または複数であるものと理解される。
特に記述されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において用いられる場合、用語「約（about）」は、当該分野における正常な耐容性の範囲内であるもの（例えば、平均値の標準偏差２つ以内）として理解される。「約」は、記述される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内であるものとして理解されてもよい。文脈から他に明らかでない限り、本明細書においてて供される全ての数値は、約（about）の用語により修飾されていてもよい。
本明細書における任意の変数の定義における化学基の列記の記述は、任意の単一の基または列記される基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書における一変数または側面についての一態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部との組合せにおける、その態様を含む。
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物または方法のうちの任意のものの１または２以上と組み合わせてもよい。
１．タンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するための方法
本発明のタンパク質−活性剤コンジュゲートおよびそのバリエーションを製造するための方法は、本明細書における開示に基づいて、当業者には容易に明らかとなる。以下に提供されるのは、例示的な方法であり、これらは、説明のために提供され、本発明を限定することを意図されない。
態様１
本発明の一態様によるタンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するための方法は、以下を含む：（ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させること；（ｂ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、発現されたタンパク質を、第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質と酵素的に反応させ、それにより官能化されたタンパク質を生成すること；（ｃ）第２の官能基（ＦＧ２）を活性剤に付着させ、それにより官能化された活性剤を生成すること；ならびに（ｄ）官能化されたタンパク質を官能化された活性剤と反応させ、それによりタンパク質−活性剤コンジュゲートを生成すること。
用語「タンパク質」は、本明細書において用いられる場合、共有結合（例えばペプチド結合）により結びついた、２または３以上の独立して選択される天然または非天然のアミノ酸として理解される。ペプチドは、ペプチド結合により結びついた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれにより多くの天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、本明細書において記載される場合、全長のタンパク質（例えば完全にプロセッシングされたタンパク質）、ならびにより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質のフラグメントまたは合成ポリペプチドのフラグメント）を含む。
タンパク質は、少なくとも１つのＣ末端および少なくとも１つのＮ末端を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。この用語は、本明細書において、完全なオリゴペプチドまたはポリペプチド、その修飾された形態、そのフラグメント、およびそのアナログを含むものとして用いられる。例えば、この用語は、オリゴペプチドまたはポリペプチド、あるいは、それにイソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸配列を付着させることにより修飾されたオリゴペプチドまたはポリペプチドを指してもよい。用語「フラグメント」とは、本明細書において用いられる場合、オリゴペプチドまたはポリペプチドからなるアミノ酸配列の一部を指す。この用語は、本明細書において、オリゴペプチドまたはポリペプチドの基質特異性を有するアミノ酸配列の部分を含むものとして用いられる。用語「アナログ」は、参照オリゴペプチドまたはポリペプチドと、少なくとも７０％または７５％、少なくとも８０％または８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、または少なくとも９６、９７％、９８％または９％の配列同一性を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。
用語「タンパク質」とは、本明細書において用いられる場合はまた、抗体、抗原性ポリペプチドのフラグメント、またはそれらのアナログもしくは誘導体を含む。用語「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、当該免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通して、標的（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせ）を認識してこれに特異的に結合するものを意味する。本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、当該抗体が、所望の生物学的活性を示す限り、完全なポリクローナル抗体、完全なモノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメントなど）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、多選択性抗体（少なくとも２つの完全な抗体から作製した二重特異性抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、およびに任意の他の抗原認識部位を含む修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとして言及されるその重鎖定常ドメインのアイデンティティーに基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれのものであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、かつ周知の、サブユニット構造および三次元立体構造を有する。
用語「抗体フラグメント」は、完全な抗体の部分を指し、完全な抗体の抗原性を決定する可変領域を指す。抗体フラグメントの例として、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメント、直鎖状抗体、一本鎖抗体、および抗体フラグメントから形成された多選択性抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原性決定基またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均質な抗体の集合を指す。これは、典型的には異なる抗原性決定基に対し向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、完全な全長モノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子の両方を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現およびトランスジェニック動物を含む、多数の様式において作製されたかかる抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えばマウス）の抗体の形態であって、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含む特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリンまたはそのフラグメントであるものを指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲからの残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536）。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有する非ヒト種からの抗体中の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、抗体の特異性、アフィニティーおよび／または能力を改善および最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域中および／または置き換えられた非ヒト残基のうちのさらなる残基の置換により、さらに修飾されていてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含む、少なくとも１、および典型的には２または３の、可変ドメインの実質的に全てを含むが、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含んでもよい。ヒト化抗体を作製するために用いられる方法の例は、米国特許第5,225,539号において記載される。
用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体、または、当該分野において公知の任意の技術を用いて作製されるヒトにより産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。このヒト抗体の定義は、完全なまたは全長の抗体、そのフラグメント、ならびに／または、少なくとも１つのヒトの重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などを含む。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２または３以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有する哺乳動物の１つの種（例えばマウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、その種における免疫応答を惹起することを回避するために、別のもの（通常はヒト）に由来する抗体における配列に対して相同である。
用語「エピトープ」または「抗原性決定基」は、本明細書において交換可能に用いられ、特定の抗体により認識されて特異的に結合され得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、近接したアミノ酸、およびタンパク質の三次折りたたみにより配置された近接していないアミノ酸の両方から形成され得る。近接したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性により保持されるが、一方、三次折りたたみにより形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性により失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的立体構造において、少なくとも３、少なくとも５または少なくとも８〜１０個のアミノ酸を含む。
抗体がエピトープまたは抗原性分子に「特異的に結合する」とは、抗体が、無関係なタンパク質を含む代替的な物質に対してよりも、より高頻度に、より迅速に、より長い持続期間により、より高いアフィニティーにより、または上の何らかの組み合わせにより、エピトープまたは抗原性分子と反応または会合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」は、例えば、抗体が、約０．１ｍＭ以下（ただしより一般的には約１μＭより低い）のＫＤによりタンパク質と結合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」とは、抗体が、少なくとも約０．１μＭ以下のＫＤ、および他の場合には少なくとも約０．０１μＭ以下のＫＤにより、タンパク質に結合することを意味する。異なる種における相同なタンパク質間の配列同一性により、特異的結合は、１つより多くの種における特定のタンパク質を認識する抗体を含むことができる。第１の標的に特異的に結合する抗体または結合部分は、第２の標的に特異的に結合しても結合しなくともよい。このように、「特異的結合」は、排他的結合、すなわち単一の標的への結合を、必ずしも必要としない（しかしこれを含んでもよい）。一般に、必ずしもではないが、結合に対する言及は、特異的結合を意味する。
抗体（そのフラグメント／誘導体およびモノクローナル抗体を含む）は、当該分野において公知の方法を用いて得ることができる（McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)；Clackson et al., Nature 352:624-628；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)；Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Waterhouse et al., Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)；Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；Brennan et al., Science 229:81(1985)；Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)；Kohler et al., Nature 256:495 (1975)；米国特許第4,816,567号）；Kilpatrick et al., Hybridoma 16(4):381-389 (1997)；Wring et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 19(5):695-707 (1999)；Bynum et al., Hybridoma 18(5):407-411 (1999), Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)；Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)；Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)；Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Jackson et. al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)；Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)、米国特許第5514548号、同第5545806号、同第5569825号、同第5591669号、同第5545807号；WO 97/17852を参照；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
抗体の非限定的な例として、限定されないが、以下が挙げられる：ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、バシリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、エファリズマブ、トシツモマブ-I131、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、リロナセプト（Rilonacept）、セルトリズマブペゴール、ロミプロスチム、AMG-531、CNTO-148、CNTO-1275、ABT-874、LEA-29Y、ベリムマブ、TACI-Ig、第２世代抗ＣＤ２０、ACZ-885、トシリズマブ（アトリズマブ）、メポリズマブ、ペルツズマブ、Humax CD20、CP-675、206（チシリムマブ）、MDX-010、IDEC-114、イノツズマブオゾガマイシン、HuMax EGFR、アフリベルセプト、VEGFトラップ・アイ、HuMax-CD4、Ala-Ala、ChAglyCD3;TRX4、カツマキソマブ、IGN101、MT-201、プレゴボマブ（Pregovomab）、CH-14.18、WX-G250、AMG-162、AAB-001、モタビズマブ；MEDI-524、エファングマブ（efumgumab）、Aurograb（登録商標）、ラキシバクマブ、第３世代抗ＣＤ２０、LY2469298、ベルツズマブ。
タンパク質がモノクローナル抗体である一部の態様において、当該モノクローナル抗体の少なくとも１つの軽鎖、当該モノクローナル抗体の少なくとも１つの重鎖、または両方は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するアミノ酸領域を含んでもよい。
態様において、軽鎖または重鎖のＣ末端が修飾される。また、Ｆｃ領域のＣＨ２領域は、グリコシル化されていてもよい。
一部の態様において、タンパク質のＣ末端（そのフラグメント、アナログまたは誘導体）は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフに付着していてもよい。他の態様において、Ｃ末端は、修飾されていてもよい。修飾は、（ｉ）タンパク質のカルボキシ末端における欠失, （ｉｉ）タンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加、または（ｉｉｉ）タンパク質のカルボキシ末端における欠失、およびタンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加であってもよい。関連する態様において、修飾は、アミノ酸モチーフに付着していてもよい。
用語「イソプレノイドトランスフェラーゼ」とは、本明細書において用いられる場合、タンパク質のＣ末端におけるまたはその近傍における特定のアミノ酸モチーフを認識して、その特定のアミノ酸モチーフを有するタンパク質に対してイソプレノイド単位を付加することにより、その特定のアミノ酸モチーフのシステイン残基のチオール部位において選択的なアルキル化を行うことができる酵素を指す。
イソプレノイドトランスフェラーゼの例は、ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴアーゼ）およびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴアーゼ）を含み、これらは、それぞれ、標的タンパク質のＣ末端システインへのファルネシルまたはゲラニル−ゲラニル部分の移動を伴う。ＧＧＴアーゼは、ＧＧＴアーゼＩおよびＧＧＴアーゼＩＩに分類することができる。ＦＴアーゼおよびＧＧＴアーゼＩは、ＣＡＡＸモチーフを認識することができ、ＧＧＴアーゼＩＩは、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸモチーフを認識することができ、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす（Nature Rev. Cancer 2005, 5(5), pp. 405-12; Nature Chemical Biology, 2010, 17, pp. 498-506; Lane KT, Bees LS, Structural Biology of Protein of Farnesyltransferase and Geranylgeranyltransferase Type I, Journal of Lipid Research, 47, pp. 681-699 (2006); Patrick J. Kasey, Miguel C. Seabra; Protein Prenyltransferases, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 10, Issue of March 8, pp. 5289-5292 (1996)；これらの参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明において、多様なソース、例えばヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどからのイソプレノイドトランスフェラーゼを用いることができる。一部の態様において、 天然に存在するイソプレノイドトランスフェラーゼを用いてもよい。一部の他の態様において、天然にまたは人工的に修飾されたイソプレノイドトランスフェラーゼを用いてもよい。例えば、天然に変更された少なくとも１つのアミノ酸配列（翻訳後修飾を含む）を有するイソプレノイドトランスフェラーゼ、天然に存在するイソプレノイドトランスフェラーゼの天然にまたは人工的に短縮された形態、ならびに、（His）タグ、GST、GFP、MBP、CBP、Iospeptag、BCCP、Mycタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、HAタグ、マルトース結合タンパク質タグ、Nusタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグ、緑色蛍光タンパク質−タグ、チオレドキシンタグ、Ｓ−タグ、Softag 1、Softag 3、Strep−タグ、SBP−タグ、Ｔｙタグなどの少なくとも１つにより修飾されているイソプレノイドトランスフェラーゼである。
イソプレノイドトランスフェラーゼは、基質と同じようにイソ基質を認識することができる。イソ基質とは、基質のアナログであって、その基質において修飾を有するものを指す。イソプレノイドトランスフェラーゼは、タンパク質のＣ末端において特定のアミノ酸モチーフ（例えば、ＣＡＡＸモチーフ）をアルキル化する（Benjamin P. Duckworth et al, ChemBioChem 2007, 8, 98; Uyen T. T. Nguyen et al, ChemBioChem 2007, 8, 408; Guillermo R. Labadie et al, J. Org. Chem. 2007, 72(24), 9291; James W. Wollack et al, ChemBioChem 2009, 10, 2934；これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。イソプレノイドトランスフェラーゼおよびイソ基質を用いて、Ｃ末端システインにおけるアルキル化を通して、官能化されたタンパク質を生成することができる。
例えば、Ｃ末端ＣＡＡＸモチーフのシステイン残基は、イソプレノイドトランスフェラーゼを用いてイソ基質と反応させることができる。ある場合において、ＡＡＸを、次いで、プロテアーゼにより取り除くことができる。結果として生じるシステインを、次いで、カルボキシ末端において酵素によりメチル化することができる（Iran M. Bell, J. Med. Chem. 2004, 47(8), 1869；これは参照により本明細書に組み込まれる）。
一部のタンパク質の場合、翻訳後修飾により、ジスルフィド結合形成を通してのシステイン付加およびグルタチオン付加が起こり得る。かかるジスルフィド結合は、しかし、イソプレノイドトランスフェラーゼによりかかるアルキル化が起こる場合は減少し得る。
本発明のタンパク質は、当該分野において周知の任意の分子生物学または細胞生物学の方法を用いて製造することができる。例えば、一過性形質転換方法を用いてもよい。標準的なＰＣＲ技術を用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得る特定のアミノ酸モチーフをコードする遺伝子配列を、そのＣ末端において特定のアミノ酸モチーフを有するタンパク質（そのフラグメントまたはアナログ）を発現させるために、既知のプラスミドベクター中に挿入してもよい。このようにして、少なくとも１つのイソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させることができる。発現されたタンパク質を、次いで、イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質と酵素的に反応させて、官能化されたタンパク質を生成することができる。イソ基質は、官能基を含む。
イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させた後、これを、イソプレノイドトランスフェラーゼおよび第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質を用いて酵素的に反応させて、それにより官能化されたタンパク質を生成してもよい。
用語「官能基」とは、本明細書において用いられる場合、例えば以下をもたらし得る基を指す：１，３−双極性環化付加反応、ヘテロ−ディールス（hetero-diels）反応、求核置換反応（例えば、エポキシド、アジリジン、環状硫酸およびアズイリジウムなどの複素環式求電子剤の開環反応）、非アルドール型カルボニル反応（例えば、オキシムエーテル、尿素、チオ尿素、芳香族複素環、ヒドラゾンおよびアミドの形成）、炭素−炭素多重結合の付加、酸化反応（例えば、エポキシ化、アジリジン化およびスルフェニルハライド付加）、ならびにクリック・ケミストリー。官能基として、限定されないが、蛍光タグ、トリアゾール、マレイミドおよび放射性アイソトープを挙げることができる（Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021; Drug Discovery Today, 2003, 8(24), 1128-1137; Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015；これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。態様において、官能基は、アセチレン基およびアジド基であってよい。
官能基は、少なくとも１つのリンカーを介して、タンパク質または活性剤に付着していてもよい。一部の態様において、リンカーは直鎖状リンカーである。一部の他の態様において、リンカーは分枝状リンカーである。リンカーが分枝状リンカーである場合、活性剤は、その分枝の全てに付着していもよい。各分枝は、同じまたは異なる活性剤を有することができる。一部の態様において、リンカーは切断可能であってよい。一部の他の態様において、それは切断不能であってもよい。
一部の態様において、第２の官能基（ＦＧ２）を活性剤に付着させることにより、官能化された活性剤を製造する。例示的な活性剤として、限定されないが、薬物、毒素、アフィニティーリガンド、検出プローブまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
例示的な薬物として、限定されないが、以下が挙げられる：エルロチニブ（TARCEVA；Genentech/OSI Pharm.）、ボルテゾミブ（VELCADE；MilleniumPharm.）、フルベストラント（FASLODEX；AstraZeneca）、スーテント（SU11248；Pfizer）、レトロゾール（FEMARA；Novartis）、メシル酸イマチニブ（GLEEVEC；Novartis）、PTK787/ZK 222584（Novartis）、オキサリプラチン（Eloxatin；Sanofi）、5-フルオロウラシル（5-FU、ロイコボリン、ラパマイシン（Sirolimus、RAPAMUNE；Wyeth）、ラパチニブ（TYKERB、GSK572016；GlaxoSmithKline）、ロナファーニブ（SCH 66336）、ソラフェニブ（BAY43-9006；Bayer Labs.）、ゲフィチニブ（IRESSA；Astrazeneca）、AG1478、AG1571（SU 5271；Sugen）、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；エチレンイミン、ならびにアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファミドおよびトリメチロールメラミンを含むメチルアミルアミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるKW-2189およびCB1-TM1を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えばカリチュアマイシン、特にカリチュアマイシンガンマ１ＩおよびカリチュアマイシンオメガＩ１（例えばAgnew, Chem Intl ed Engl., 33: 183-186（1994）を参照）、ならびにダイネマイシンAを含むダイネマイシン；
クロドロナートなどのビホスホナート；エスペラミシン、ネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ADRLIMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝薬；デノプテリン、メトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタンおよびトリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン（diaziquone）；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシンおよびアンサミトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばTAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.）ABRAXANETM（クレモフォアフリーのアルブミン処理されたパクリタキセルのナノ粒子形成）（American Pharmaceutical Partners, Schaumber, I11.）、およびTAXOTERE（登録商標）ドセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド、イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；およびこれらの薬学的に受容可能な塩、溶媒和物、酸または誘導体。
さらなる薬物として、限定されないが、以下が挙げられる：（ｉ）腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン（NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン（droloxifene）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストンおよびFAREATON（登録商標）トレミフェンを含む、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM）など；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲンの産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE（登録商標） 酢酸メゲストロール、AROMASIN（登録商標）エキセメスタン、FEMARA（登録商標）レトロゾールおよびARIMIDEX（登録商標）アナストロゾールなど；（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；およびトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；（ｉｖ）アロマターゼ阻害剤；（ｖ）タンパク質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与すると考えられるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばPKC-アルファ、Raf、H-Rasなど；（ｖｉｉｉ）リボザイム、例えば、ANGIOZYMEリボザイムおよびHER2発現阻害剤などのVEGF阻害剤；（ｉｘ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン；ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTINワクチンおよびVAXIDワクチン；PROLEUKIN（登録商標）rlL-2；LURTOTECAN（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX（登録商標）rmRH；（ｘ）ベバシズマブ（AVASTIN、Genentech）などの抗血管新生剤；および（ｘｉ）その薬学的に受容可能な塩、溶媒和物、酸または誘導体。
一部の態様において、 サイトカインは、薬物として用いることができる。サイトカインは、多数の細胞により分泌される低分子の細胞シグナル伝達タンパク質分子であって、細胞間の連絡において広範に用いられるカテゴリーのシグナル伝達分子である。それらは、モノカイン、リンフォカイン、伝統的なポリペプチドホルモンなどを含む。サイトカインの例として、限定されないが、以下が挙げられる：ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）および黄体ホルモン（LH）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび-β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；NGF−βなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；TGF−αおよびTGF−βなどのトランスフォーミング増殖因子（TGF）；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（EPO）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；マクロファージ−CSF（M-CSF）、顆粒球−マクロファージ−CSF（GM-CSF）および顆粒球−CSF（G-CSF）などのコロニー刺激因子（CSF）；IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12などのインターロイキン（IL）；TNF−αおよびTNF−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにLIFおよびkitリガンド（KL）を含む他のポリペプチド因子。本明細書において用いられる場合、用語「サイトカイン」はまた、天然のソースからの、または組換え細胞培養物からのタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
用語「毒素」は、生細胞または生体内において産生される毒性の物質を指す。毒素は、身体組織と接触するかまたはこれにより吸収される場合に、酵素または細胞受容体などの生物学的高分子と相互作用して疾患を引き起こすことができる、低分子、ペプチドまたはタンパク質であってよい。毒素は、植物毒素および動物毒素を含む。動物毒素の例として、限定されないが、ジフテリア抗毒素、ボツリヌス毒素、破傷風抗毒素、赤痢毒素、コレラ毒素、テトロドトキシン、ブレベトキシン、シガトキシンが挙げられる。植物毒素の例として、限定されないが、リシンおよびAM毒素が挙げられる。
低分子毒素の例として、限定されないが、以下が挙げられる：アウリスタチン、ゲルダナマイシン（Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784）、マンタンシノイド（EP 1391213、ACR 2008, 41, 98-107）、カリケアマイシン（US 2009105461、Cancer Res. 1993, 53, 3336-3342）、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、SG2285（Cancer Res. 2010, 70(17), 6849-6858）、ドラスタチン、ドラスタチン類似体のアウリスタチン（US563548603）、クリプトフィシン、カンプトテシン、リゾキシン誘導体、CC-1065類似体または誘導体、デュオカルマイシン、エンジイン抗生物質、エスペラマイシン、エポチロンおよびトキソイド。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、トポイソメラーゼ抑制などにより、細胞傷害性および細胞増殖阻害活性を示し得る。
用語「リガンド」は、標的生体分子と複合体を形成することができる分子を指す。リガンドの一例は、標的タンパク質の予め決定された位置に付着してシグナルを伝達する分子である。それは、基質、阻害剤、刺激因子、神経伝達物質または放射性同位体であってもよい。
「検出可能な部分」または「標識」は、分光学的に、光化学的に、生化学的に、免疫化学的に、放射活性により、または化学的手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識として、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばELISAにおいて一般的に用いられるように）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、および抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質、または標的に対して相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な部分はしばしば、試料中の結合した検出可能な部分の量を定量するために用いることができる、放射活性、発色または蛍光シグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。シグナルの定量は、例えば、シンチレーションカウント、デンシトメトリー、フローサイトメトリー、ELISA、または、完全なもしくはその後に消化されたペプチドの質量分析による直接分析（１または２以上のペプチドを評価することができる）により達成される。当業者は、関心のある化合物を標識するための技術、および検出のための手段に精通している。かかる技術および方法は、慣用的であり、当該分野において周知である。
用語「プローブ」は、本明細書において用いられる場合、以下のことができる材料を指す：（ｉ）検出可能なシグナルを提供すること、（ｉｉ）第１のプローブまたは第２のプローブと相互作用して、第１または第２のプローブにより提供される検出可能なシグナルを改変すること（蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）など）、（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化させるか、または結合アフィニティーを増大させること、（ｉｖ）電荷、疎水性などの物理学的パラメーターにより、電気泳動移動度または細胞侵入活性に影響を及ぼすこと、あるいは、（ｖ）リガンドアフィニティー、抗原−抗体結合、またはイオン性複合体形成を制御すること。
官能化されたタンパク質および官能化された活性剤を生成した後で、それらを互いに反応させ、それによりタンパク質−活性剤コンジュゲートを生成する。態様において、官能化されたタンパク質と官能化された活性剤との間の反応は、クリックケミストリー反応であっても、ヒドラゾンおよび／またはオキシム形成を介するものであってもよい。態様において、ＦＧ１はアジド基であり、ＦＧ２はアセチレン基であるか、またはその反対である。他の態様において、ＦＧ１はアルデヒドまたはケトン基であってもよく、ＦＧ２はヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであるか、またはその反対である。
クリックケミストリー反応は、穏和な条件において行い、このことにより、タンパク質を取り扱うことを容易にすることができる。クリックケミストリー反応は、非常に高い反応特異性を示す。したがって、タンパク質が他の官能基（例えば、側鎖の残基またはＣ末端もしくはＮ末端において）を有する場合であってすら、これらの官能基は、クリックケミストリー反応により影響を受けない。例えば、タンパク質のアセチレン基とアジド基との間のクリックケミストリー反応は、当該タンパク質の他の官能基がクリックケミストリーにより影響を受けることなく行うことができる。さらに、クリックケミストリー反応は、関与するリガンドの種類により影響を受けることなく特異的に行うことができる。一部の場合において、リガンドは、全体的な反応効率を改善するように選択してもよい。例えば、アジド−アセチレンクリックケミストリーは、高い収率においてトリアゾールを生成することができる（Rhiannon K. Iha et al, Chem. Rev. 2009, 109, 5620; Morten Meldal and Christian Wenzel Tornoe, Chem Rev., 2008, 108, 2952; Hartmuth C. Kolb et al, Angew. Chemie Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004；これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）。
アジドおよびアセチレン基は、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列中に存在しない官能基である。これらの官能基を用いてコンジュゲーション反応を行う場合、側鎖残基のいずれも、およびＮ末端またはＣ末端の官能基のいずれも、クリックケミストリー反応により影響を受けない。したがって、標的位置において活性剤がコンジュゲートしているタンパク質−活性剤コンジュゲートを生成することができる。
タンパク質が抗体である場合、抗体の全てまたは一部は、イソプレノイドトランスフェラーゼによるアルキル化の間に一本鎖に減少していてもよい。一本鎖は、クリックケミストリー反応において用いられる酸化剤により、酸化されてH2L2形態の抗体を形成する場合がある。
抗体は４本の鎖（２Ｈ＋２Ｌ）を有するので、アルキル化は、抗体１つごとに１〜４か所の位置において行い得る。複数の活性剤がリンカーに付着し得るので、活性剤の数は４個より多くなってもよい。
イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフがＣＡＡＸである特定の態様において、方法はさらに、ＡＡＸを取り除くことを含んでもよい。他の態様において、方法はさらに、ＡＡＸを取り除いた後でＣ末端にメチル基を付加することを含んでもよい（Journal of Lipid Research, 2006, 47, 681-699；これは参照により本明細書に組み込まれる）。
態様２
別の態様によるタンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するための方法は、以下を含む：（ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させること；（ｂ）イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質を活性剤に付着させること；ならびに（ｃ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、発現されたタンパク質をイソ基質に付着した活性剤と酵素的に反応させること。
この態様において、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させた後、タンパク質を、イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質に付着した活性剤と反応させる。この場合、チオール−マレイミドコンジュゲーションが起こり得る。しかし、チオール−マレイミドコンジュゲーションが起きたとしても、活性剤は、本発明によってのみ、標的とされる位置においてコンジュゲートされる。したがって、不均質な混合物が精製されるという先行技術に付随する問題は回避される。
２．タンパク質−活性剤コンジュゲート
別の側面において、本発明は、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を含むタンパク質−活性剤コンジュゲートを提供し、ここで、活性剤は、前記アミノ酸モチーフにおいてタンパク質に共有的に付着する。
当業者は、関心のある標的（例えば対象における標的細胞）に選択的に結合するタンパク質を容易に選択することができる。例示的なタンパク質として、限定されないが、関心のある標的に特異的に結合する抗体または抗原性のフラグメントが挙げられる。
ＣＡＡＸタンパク質（ＣＡＡＸ抗体）
本発明の方法により調製されるタンパク質−活性剤コンジュゲートの例は、以下の式（Ｉ）により表わされ、ここで、タンパク質は、抗体（そのフラグメントまたはアナログ）（Ａｂ）であり、活性剤は薬物（Ｄ）であり、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフはＣＡＡＸである。
Ａｂ（Ｍ）は、抗体またはそのフラグメントを表わし、これは修飾を含んでもよい。修飾は、以下であってよい：（ｉ）抗体またはそのフラグメントのカルボキシ末端の欠失；（ｉ）抗体またはそのフラグメントのカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加；ならびに（ｉｉｉ）抗体またはそのフラグメントのカルボキシ末端の欠失、および抗体またはそのフラグメントのカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加。Ｑは、リンカーを表わす。リンカーは、直鎖状リンカーまたは分枝状リンカーであってよい。一態様において、リンカーは、第１の官能基（ＦＧ１）を含んでもよい。ｎ１、ｎ２およびｍは、抗体、アミノ酸モチーフ、リンカー、活性剤などに依存して適切に決定することができる。 好ましくは、ｎ１およびｎ２は、独立して１〜４の整数であり、ｍは１〜１６の整数である。
一部の態様において、リンカーは、以下の式（ＩＩ）：
により表わすことができる。
Ｐ１およびＹは、独立して、第１の官能基（ＦＧ１）を含む基である。ＦＧ１は、アセチレン、アジド、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ケトン、ニトロベンゾフラン（ＮＢＤ）、ダンシル、フルオレセイン、ビオチンおよびローダミンからなる群より選択することができる。Ｌ１は（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐであり、ここで、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ１−、−（ＣＨ＝ＣＨ）−またはアセチレンであり；Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり；ｒおよびｐは独立して０〜６の整数であり；ｑは０〜１の整数であり；ならびに、ｎは１〜４の整数である。
一部のある態様において、薬物（Ｄ）は、ＦＧ１と反応することができる第２の官能基（ＦＧ２）を含む基を介して、リンカーに付着することができる。ＦＧ２は、アセチレン、ヒドロキシルアミン、アジド、アルデヒド、ヒドラジン、ケトンおよびアミンからなる群より選択することができる。
一部のある態様において、薬物（Ｄ）は、−（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−を介して、ＦＧ２を含む基に付着することができ、ここで、Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−または−ＳＯ２ＮＲ１−であり；Ｚは、酸素、硫黄またはＮＲ１であり；Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり；ｒおよびｐは独立して０〜６の整数であり；ｑは０〜１の整数であり；ならびに、ｗは０〜６の整数である。
一部のある態様において、（ｉ）カテプシンＢにより切断され得るペプチド、または（ｉｉ）β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドが、−（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−に付着していてもよい。
一部のある態様において、非自壊性（non self-immolative）の基または自壊性（self-immolative）の基が、（ｉ）カテプシンＢにより切断され得るペプチドまたは（ｉｉ）β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドに付着していてもよい。自壊性の基の非限定的な例は、アミノフェニルメチルオキシカルボニルおよびヒドロキシフェニルメチルオキシカルボニルであってよい。
一部のある態様において、カテプシンＢにより切断され得るペプチドは、以下の式（ＩＩＩ）：
により表わされる。
一部のある態様において、β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドは、以下の式（ＩＶ）：
により表わされる。
３．組成物
またさらなる側面において、本発明は、本明細書において記載されるタンパク質−活性剤コンジュゲートを含む組成物を提供する。態様において、組成物は、対象における標的細胞に活性剤を送達するために用いられる。態様において、組成物は、それを必要とする（すなわち、活性剤を必要とする）対象を処置するために用いられる。
かかる組成物の調製は、当業者には公知であり、かかる組成物は、in vivoで対象に送達することができる。
側面において、組成物は、注射可能な形態において、溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。注射のための固体の形態もまた、乳液として、またはリポソーム中に封入されたポリペプチドにより調製される。タンパク質−活性剤コンジュゲートは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせてもよく、これは、キャリアを投与される対象にとって有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。好適なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物などの、ゆっくりと代謝される大きな高分子を含む。かかるキャリアは、当業者には周知である。
本発明の組成物はまた、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの希釈剤を含んでもよい。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などの補助的な物質もまた存在してもよい。タンパク質は、中性または塩の形態として、ワクチンへと処方してもよい。組成物は、非経口的に、注射により投与することができる。かかる注射は、皮下または筋肉内のいずれかであってもよい。さらなる処方は、坐剤または経口などによる、他の投与の形態のために好適である。経口組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセルまたは持続放出処方物として投与することができる。
組成物は、用量処方物に適合する様式において投与する。組成物は、治療有効量のタンパク質−活性剤コンジュゲートを含む。治療有効量により、疾患または障害の処置または予防のために有効である、単一の用量、または複数用量のスケジュールにおいて投与される組成物が意味される。投与される用量は、処置されるべき対象、当該対象の健康および身体的状態、所望される保護の程度、および他の関連する要因に依存して変化するであろう。必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存するであろう。
４．タンパク質−活性剤コンジュゲートおよび組成物を用いる方法
さらなる側面において、本発明は、対象における標的細胞に活性剤を送達するための方法を提供し、方法は、タンパク質−活性剤コンジュゲートまたは組成物を投与することを含む。またさらなる側面において、本発明は、それを必要とする対象（すなわち活性剤を必要とする対象）を処置する方法を提供し、方法は、タンパク質−活性剤コンジュゲートまたは該コンジュゲートを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。
態様において、治療有効量におけるタンパク質−活性剤コンジュゲート（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）または該コンジュゲートを含む組成物を、癌または腫瘍を罹患する患者に、癌または腫瘍を処置するために投与することができる。
態様において、治療有効量におけるタンパク質−活性剤コンジュゲート（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）または該コンジュゲートを含む組成物を、病原体（例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫など）による感染を処置または予防するために、患者に投与することができる。かかる方法は、哺乳動物に、疾患または障害が予防または処置されるような状況下で、疾患または障害またはそれらの症状を処置するために十分な治療的または予防的量のコンジュゲートを投与するステップを含む。
一部の態様において、タンパク質−活性剤コンジュゲートまたは組成物は、その薬学的に受容可能な塩または溶媒和物の形態において投与することができる。一部の態様において、それは、薬学的に受容可能なキャリア、薬学的に受容可能な賦形剤および／または薬学的に受容可能な添加物と共に投与してもよい。薬学的有効量および薬学的に受容可能な塩または溶媒和物の型、賦形剤および添加物は、標準的な方法を用いて決定することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１８版、1990年）。
癌または腫瘍に関しての用語「治療有効量」は、癌細胞の数を減少させること；癌細胞のサイズを低下させること；癌細胞が周辺の系に侵入することを禁止すること、もしくは侵入を低減すること；癌細胞が他の系へと拡散することを禁止すること、もしくは拡散を低減すること；癌細胞が増殖することを禁止すること；および／または癌に関連する少なくとも１つの症状を緩和することができる量を意味する。癌の処置において、薬物の有効性は、腫瘍進行までの時間（TTP）および／または応答率（RR）により評価することができる。
病原体による感染に関しての用語「治療有効量」は、感染に関連する症状を予防、処置または低減することができる量を意味する。
用語「薬学的に受容可能な塩」とは、本明細書において用いられる場合、有機塩および無機塩を含む。その例として、限定されないが、以下が挙げられる：塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸、サッカリン酸塩、蟻酸、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホナート、エタンスルホナート、ベンゼンスルホナート、ｐ−トルエンスルホナート、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレンビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトアート））。薬学的に受容可能なは、別の分子（例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンおよび他の対イオンなど）を含んでもよい。それはまた、少なくとも１つの荷電した原子を含んでもよい。それはまた、少なくとも１つの対イオンを含んでもよい。
本発明による化合物の薬学的に受容可能な溶媒和物に対して用いることができる例示的な溶媒和物として、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
例
以下の例は、本発明を説明するものであり、これを限定することは意図されない。
例１：Ａｂ（Ｍ）−ＣＡＡＸの調製
１−１．ハーセプチン−ＣＡＡＸの構築、発現および精製
標準的な組換えＤＮＡ技術およびＰＣＲクローニングプロトコルを用いて、pNATABH：：ハーセプチンＨＣプラスミドまたはpNATABL：：ハーセプチンＬＣプラスミドにより、修飾ハーセプチン抗体を作製した。組換えプラスミドを、HEK293E細胞株において一過性形質転換により発現させた。タンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより抗体を分離および精製した。
ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭの構築
標準的なＰＣＲクローニングプロトコルを用いて、修飾ハーセプチン抗体を作製した。一般に、ＣＡＡＸモチーフをコードするＤＮＡ配列（例えば、ＧＣＶＩＭ、Ｇ５ＣＶＩＭ、Ｇ７ＣＶＩＭ、Ｇ１０ＣＶＩＭまたはＧ１０ＣＶＬＬ）を、pNATABH：：ハーセプチンＨＣまたはpNATABH：：ハーセプチンＬＣプラスミドにおいてコードされる重鎖または軽鎖のＣ末端に挿入することにより、ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭプラスミドを構築した。
例えば、SacII認識配列は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域のＣ末端におけるアミノ酸１７２において存在する。したがって、フォワードプライマーを、Ｆｃ領域におけるSacII部位に結合するように設計した。挿入されるべきＤＮＡ配列（例えば、ＧＣＶＩＭの５マーの配列をコードする１５マー）を、Ｆｃ−Ｃ末端に特異的なリバースプライマーに付加した。フォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲ生成物を増幅し、生じた生成物を、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。リバースプライマーはXhoI部位を含むので、ＰＣＲ生成物を、SacIIおよびXhoIで消化した。同様に、pNATABH：：ハーセプチンＨＣプラスミドを、SacIIおよびXhoIで消化した。消化された骨格を、ゲル精製キットを用いて精製し、消化されたＰＣＲ生成物とライゲーションした。ライゲーションは、ベクターとインサートとの比を適切に調節することにより行い、ライゲーション生成物は、スクリーニングのためにコンピテント細菌細胞中にトランスフォームした。配列決定されたクローンから、ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭプラスミドを調製した。
生じたプラスミドからのアミノ酸配列を、図１〜１０において示す。以下のセクション１〜４および１〜７は、コンストラクトの各々の詳細な説明を提供する。
ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭの発現および精製
HEK293E細胞を、１５０ｍｍのプレート（# 430599、Corning USA）上でDMEM／１０％ＦＢＳ培地中で７０〜８０％コンフルーエンシーまで培養した。１３μｇのＤＮＡおよび２６μｇのＰＥＩ（#23966、Polysciences、USA）を１：２の比において混合し、ＲＴで２０分間インキュベートし、次いで、HEK193E細胞に添加した。１６〜２０時間後に培地を無血清培地（No FBS DMEM（#SH30243.01、Hyclone Thermo.,USA））により交換し、２日または３日毎に上清を収集した。
上清を０．２２ｕｍのトップフィルター（#PR02890、Millipore、USA）で濾過し、次いで、５ｍＬカラム中に充填された５００μｌのタンパク質Ａビーズ（#17-1279-03、GE healthcare Sweden）に結合させた。蠕動ポンプを用いて、０．９ｍＬ／分において４℃で一晩の結合を行った。カラムを、１００ｍＬ以上のＰＢＳ（#70011、Gibco、USA）で洗浄した。結合したタンパク質を、次いで、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（#G7126、Sigma、USA）で６画分中に溶離させ、１ＭのTris（#T-1503、Sigma、USA）（ｐＨ９．０）で中和した。タンパク質を定量した。タンパク質を含む２または３画分を収集し、Amicon Ultraフィルターユニット（#UFC805024、Millipore、USA）で濃縮した。バッファーを、１×ＰＢＳ（#70011、Gibco、USA）で約１０回交換した。ウェスタンブロットにより、タンパク質生成物がハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭまたはハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭであることを確認した。ハーセプチンを含むタンパク質のバンドを同定するために、ヤギ抗ヒトIgG FcにコンジュゲートされたImmunoPureペルオキシダーゼ（#31413、Pierce、USA）を用いた。精製の後で、１Ｌの細胞培養培地から１〜２ｍｇのハーセプチン−ＨＣ−ＣＧＶＩＭまたはハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭが得られた。
ハーセプチン−ＨＣ−ＣＧＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭ生成物をまた、Agilentバイオアナライザーにより分析した。簡単に述べると、８μｌの精製されたタンパク質試料（約１ｍｇ／ｍｌ）を、Agilent Protein 230 Kit（5067-1515 Agilent Technologies, USA）を用いて分析した。タンパク質試料を２画分に分離した（各４μｌ）。２μｌの非還元性バッファーまたは還元性バッファーを各試料に添加した。試料を９５〜１００℃で５分間加熱し、４℃まで氷冷した。スピンダウンした後、８４μｌの脱イオン化水を試料およびラダーに添加し、ボルテックスした。その後、試料をロードし、製造者の説明書に従ってキットで分析した。
１−２．ｃＭＥＴ−ＣＡＡＸの構築、発現および精製
修飾された抗ｃＭＥＴ−ＣＡＡＸ抗体もまた、上記の方法により調製した。例えば、標準的な組換えＤＮＡ技術およびＰＣＲクローニングプロトコルを用いて、pPMC-C1A5プラスミドにより、修飾された抗ｃＭＥＴ−ＣＡＡＸ抗体を作製した。組換えプラスミドを、HEK293T細胞株において一過性形質転換により発現させた。タンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより抗体を分離および精製した。
１−３．ハーセプチン−ＨＣ−ＧｎＣＶＩＭ
ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を調製した。抗体はそれぞれ、重鎖のＣ末端において、５マー（ＧＣＶＩＭ）、９マー（Ｇ５ＣＶＩＭ）、１１マー（Ｇ７ＣＶＩＭ）、または１４マー（Ｇ１０ＣＶＩＭ）の配列を有する（図１、３、５および７）。
１−４．ハーセプチン−ＬＣ−ＧｎＣＶＩＭ
ハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を調製した。抗体は、それぞれ、軽鎖のＣ末端において５マー（ＧＣＶＩＭ）、９マー（Ｇ５ＣＶＩＭ）、１１マー（Ｇ７ＣＶＩＭ）、または１４マー（Ｇ１０ＣＶＩＭ）の配列を有する（図２、４、６および８）。
１−５．ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ
ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ抗体を調製した。抗体は、重鎖のＣ末端において１４マー（Ｇ１０ＣＶＬＬ）の配列を有する（図９）。
１−６．ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ
ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ抗体を調製した。抗体は、軽鎖のＣ末端において１４マー（Ｇ１０ＣＶＬＬ）の配列を有する（図１０）。
１−７．抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−ＧｎＣＶＩＭ
抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を調製した。抗体は、それぞれ、重鎖のＣ末端において１１マー（Ｇ７ＣＶＩＭ）、または１４マー（Ｇ１０ＣＶＩＭ）の配列を有する（示さず）。図１１は、抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を分析するSDS-PAGEゲルを示す。
１−８．抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−ＧｎＣＶＩＭ
抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を調製した。抗体は、それぞれ、軽鎖のＣ末端において１１マー（Ｇ７ＣＶＩＭ）、または１４マー（Ｇ１０ＣＶＩＭ）の配列を有する（示さず）。図１１は、抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を分析するSDS-PAGEゲルを示す。
例２：ＡＢ（Ｍ）−ＣＡＡＸの官能化
２−１．ゲラニルアルキンジホスファート（Ｂ、LCB14-0501）
上で言及される化合物を、ChembioChem 207, 8, 98-105（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法と同様の方法により、６工程において、ゲラニオールを出発材料として用いて調製した。
(B) 1H NMR (600MHz, D2O) δ 5.38 (t, J = 7.8Hz, 1H), 5.30 (t, J = 7.8Hz, 1H), 4.31 (brs, 2H), 3.96 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 2.70 (bs, 1H), 2.07 (m, 2H), 1.98 (m, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.48 (s, 3H)
２−２．デカジエニルプロパルギルエーテルジホスファート（Ｆ、LCB14-0511）およびデカジエニルアジドジホスファート（Ｇ、LCB14-0512）
アセトキシデカジエニルアルデヒド（Ｃ）は、ファルネソールから、５工程において調製した。化合物（Ｃ）から、化合物（Ｄ）および（Ｅ）を、それぞれ６工程および５工程において調製した。化合物（Ｄ）および（Ｅ）から、上で言及される化合物（Ｆ）および（Ｇ）を、上のセクション２−１において記載される方法と同様の方法により調製した。化合物（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）は、JOC 2007, 72(24), 9291-9297（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法と同様の方法により調製した。
(F): 1H NMR (600MHz, D2O) δ 5.44 (t, J = 6Hz, 1H), 5.22 (t, J = 6Hz, 1H), 4.46 (t, J = 8.4Hz, 2H), 4.16 (t, J = 2.4Hz, 2H), 3.55 (m, 2H), 2.85 (m, 1H), 2.15 (m, 2H), 2.09 (t, J = 7.2Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.2Hz, 2H), 1.70~1.65 (m, 5H), 1.60 (s, 3H)
(G): 1H NMR (600MHz, D2O) δ 5.43 (t, J = 6.6Hz, 1H), 5.23 (t, J = 6.6Hz, 1H), 4.40 (t, J = 6Hz, 2H), 3.26 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.15 (m, 2H), 2.10~2.04 (m, 4H), 1.70~1.65(m, 5H), 1.60 (s, 3H)
２−３．NBD-GPP
トリス−アンモニウム［３，７−ジメチル−８−（７−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−オクタ−２，６−ジエン−１］ピロホスファート（NBD-GPP）を、JACS 2006, 128, 2822-2835（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法と同様の方法により調製した。
1H NMR (600MHz, D2O) δ 8.51 (d, J = 9Hz, 1H), 6.37 (d, J = 9Hz, 1H), 5.50 (t, J = 6.6Hz, 1H), 5.42 (t, J = 6.6Hz, 1H), 4.43 (t, J = 6.6Hz, 2H), 4.08 (s, 2H), 2.22 (m, 2H), 2.10 (t, J = 7.2Hz, 2H), 1.69 (s, 6H)
２−４．グルクロニドリンカー−ＭＭＡＦ（LCB14-0592）
化合物２
メタノール（２５０ｍＬ）中のＤ−グルクロノ−６，３−ラクトン（１９ｇ、１０７．８８ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下において、メタノール（１００ｍＬ）中のＮａＯＨ（１００ｍｇ）の溶液にゆっくり加えた。生じた混合物を２時間撹拌した。メタノール（１５ｍＬ）中のＮａＯＨ（２００ｍｇ）の溶液を加えた。生成物を３時間撹拌した。減圧下においてメタノールを取り除いた。１０℃以下において、ピリジン（５０ｍＬ）および無水酢酸（Ａｃ２Ｏ、５４ｍＬ）を、連続的に加えた。生じた混合物を、室温において４時間撹拌した。反応が完了した後、生じた混合物を、減圧下において濃縮し、カラムクロマトグラフィーに供し、固体として化合物２を得た（２０ｇ、５０％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.77 (d, J= 7.8Hz, 1H), 5.31 (t, J= 9.6Hz, 1H), 5.24 (t, J= 9.6Hz, 1H), 5.14 (m, 1H), 4.17 (d, J= 9Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.04 (m, 9H)
化合物３
化合物２（５ｇ、１３．２８ｍｍｏｌ）を、ＡｃＯＨ（２０ｍＬ）中３３％のＨＢｒの溶液に、０℃において加えた。生じた混合物を、室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、生じた混合物を、トルエン（５０ｍＬ）で希釈した。生じた混合物を減圧下において濃縮した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）を添加して、有機層を抽出した。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、化合物３を得た（５．２７ｇ、１００％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 6.64 (d, J= 3.6Hz, 1H), 5.61 (t, J= 3.6Hz, 1H), 5.24 (t, J= 3.6Hz, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.58 (d, J= 10.2Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H)
化合物４
アセトニトリル（３０ｍＬ）中の化合物３（４ｇ、１０．０７ｍｍｏｌ）および２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（１．６７ｇ、１２．０８４ｍｍｏｌ）の溶液を、モレキュラーシーブ（５ｇ）およびＡｇ２Ｏ（９．３３ｇ、４０．２８ｍｍｏｌ）で連続的に処置した。生じた混合物を３時間、室温において撹拌した。反応が完了した後、固体を濾過除去し、濾過物を減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物４を得た（２ｇ、４３．５％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 11.38 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 7.48 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.61 (dd, J= 8.4, 2.0Hz, 1H), 6.53 (d, J= 2.0Hz, 1H), 5.36~5.25 (m, 4H), 4.23 (m, 1H), 3.73 (s, 1H), 2.06 (s, 9H)
化合物５
アセトン（１０ｍＬ）中の化合物４（１ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）溶液を、炭酸カリウム（７６０ｍｇ、５．５０ｍｍｏｌ）およびトルエン中の８０％臭化プロパルギル（７３５μＬ、６．６０ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、４５℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物５を得た（９３０ｍｇ、８７％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 10.33 (s, 1H), 7.83 (d, J= 9Hz, 1H), 6.75 (d, J= 1.8Hz, 1H), 6.67 (dd, J= 9, 1.8Hz, 1H), 5.39~5.34 (m, 2H), 5.31~5.26 (m, 2H), 4.79 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.23 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.59 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H)
化合物６
イソプロピルアルコール（２ｍＬ）およびクロロホルム（１０ｍＬ）中の化合物５の溶液（９３０ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）を、０℃において、シリカゲル（５ｇ）およびＮａＢＨ４（１７８ｍｇ、４．７９ｍｍｏｌ）で連続的に処置した。生じた混合物を３時間撹拌した。反応が完了した後、シリカゲルを濾過除去した。反応物をジクロロメタン（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物６を得た（６１０ｍｇ、６５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.23 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.72 (d, J= 2.4Hz, 1H), 6.61 (dd, 8.4, 2.4Hz, 1H), 5.35~5.32 (m, 2H), 5.27 (m, 1H), 5.13 (d, J= 7.8Hz, 1H), 4.72 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.63 (d, J= 5.4Hz, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H)
化合物７
ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中の化合物６（２５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を、ビス（４−ニトロフェニル）カルボナート（３０８ｍｇ、１００ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、１３２μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、反応物を減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物７を得た（３１０ｍｇ、９４％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J= 9Hz, 2H), 7.37 (d, J= 9Hz, 2H), 7.34 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.77 (d, J= 1.8Hz, 1H), 6.64 (dd, 7.8, 2.4Hz, 1H), 5.37~5.33 (m, 2H), 5.30~5.27 (m, 3H), 5.17 (d, J= 7.2Hz, 1H), 4.74 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.18 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.54 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H)
化合物８
ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の化合物７（１５０ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）、MMAF-OMe（１６９．６ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール無水物（ＨＯＢｔ、６．２ｍｇ、０．０４５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（０．８ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物８を得た（１４６ｍｇ、５０％）。
EI-MS m/z: 1067(M + )
US61/483,698、ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718、US7423116、US7498298、およびWO2002/088172（これらの参考文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法に従って、MMAF-OMeを調製した。
LCB14-0592
メタノール（２ｍＬ）中の化合物８（８５ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃において、蒸留水（１ｍＬ）中のＬｉＢＨ４（２８．２ｍｇ、０．６７０ｍｍｏｌ）の溶液で処置した。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下においてメタノールを取り除いた。残渣を蒸留水（５０ｍＬ）中に溶解し、酢酸でｐＨ＝３まで酸性化した。反応物をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で３回抽出した。組み合わせた有機層を減圧下において濃縮して固体を得、これをジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄して、化合物LCB14-0592を得た（６２ｍｇ、８３％）。
EI-MS m/z: 1112(M + )
２−５．グルクロニドリンカー−MMAE（LCB14-0598）
化合物３
ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の、例２〜４の化合物７（１５０ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）、MMAE（１６３ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ；ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718、US7423116、WO2002/088172）および無水１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、６．２ｍｇ、０．０４５４ｍｍｏｌ）の溶液を、ピリジン（０．８ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ、０．２２７ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、室温において２４時間撹拌した。反応が完了した後、生じた混合物を、酢酸エチル（１００ｍＬ）、０．５ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）で希釈した。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（３０ｍｇ、１０％）。
EI-MS m/z: 1238(M + )
LCB14-0598
メタノール（３ｍＬ）中の化合物３（３０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃において、蒸留水（０．５ｍＬ）中のＬｉＯＨ（１０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）により処置した。生じた混合物を３時間、室温において撹拌した。反応が完了した後、有機溶媒を減圧下において取り除いた。生じた生成物を蒸留水（５０ｍＬ）で希釈し、０．５ＮのＨＣｌでｐＨ＝３まで酸性化した。ジクロロメタン（５０ｍＬ］による抽出およびその後の減圧下における濃縮により、化合物LCB14-0598を得た（２１ｍｇ、７９％）。
EI-MS m/z: 1098(M + )
２−６．グルクロニドリンカー−MMAF−メチルアミド（LCB14-0600）
化合物２
ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の化合物１（Z-MMAF、５５８ｍｇ、０．６４４ｍｍｏｌ、ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718）の溶液を、塩酸メチルアミン（１３０ｍｇ、１．９３２ｍｍｏｌ）、ジエチルシアノホスホナート（DEPC、１４４ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２７０μＬ、１．９３２ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（４９０ｍｇ、８６％）。
EI-MS m/z: 879(M + )
LCB14-0601（MMAF−メチルアミド）
化合物２（４７０ｍｇ、０．５３ｍＭ）を、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ、８ｍＬ）および蒸留水（０．８ｍＬ）中に溶解した。０℃で、１０％のＰｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を、Ｈ２ガス中で２時間撹拌した。反応が完了した後、セライトを用いてＰｄ／Ｃを濾過した。生じた濾過溶液を減圧下において濃縮し、化合物LCB14-0601を得た（３４０ｍｇ、８５％）。
EI-MS m/z: 745(M + )
化合物３
ジメチルアミド（３ｍＬ）中の例２〜４の化合物７（１３３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、LCB14-601（１５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）および無水１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、５．４４ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を、ピリジン（０．８ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、３５μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および０．５ＮのＨＣｌ溶液（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（１２３ｍｇ、４８％）。
EI-MS m/z: 1265(M + )
LCB14-0600（グルクロニドリンカー−MMAF−メチルアミド）
メタノール（３ｍＬ）中の化合物３（６０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃において、蒸留水（０．５ｍＬ）中のＬｉＯＨ（２０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、有機溶媒を、減圧下において取り除いた。残渣を蒸留水（５０ｍＬ）で希釈し、０．５ＮのＨＣｌでｐＨ＝３まで酸性化した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）による抽出およびその後の濃縮により、化合物LCB14-0600を得た（２５ｍｇ、４７％）。
EI-MS m/z: 1125(M + )
２−７．アジド−リンカー−NBD：LCB14-0529
化合物２
テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の化合物１（４ｇ、１２．６７ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（１．６ｍＬ、１４．５７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において−１５℃で、イソブチルクルロロギ酸（１．８ｍＬ、１３．９４ｍｍｏｌ）でゆっくりと処置した。生じた混合物を、同じ温度において３０分間撹拌した。生じた混合物を、テトラヒドロフラン／メタノール（３６ｍＬ／１２ｍＬ）中の水酸化ホウ素ナトリウム（９５９ｍｇ、２５．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、−７８℃において、十分撹拌しながら、ゆっくりと濾過しつつ添加した。反応物を、２時間撹拌しながらゆっくりと室温まで温めた。反応が完了した後、酢酸（４ｍＬ）を添加して、１５分間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（３．６９ｇ、９６．５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.50 (s,1H), 3.64 (q, J= 6.6Hz, 2H), 3.11 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.44 (m, 11H), 1.29 (m, 10H)
化合物３
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の化合物２（４５０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（３８１μＬ、３．４６ｍｍｏｌ）の溶液を、を、メタンスルホン酸無水物（３６３ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）で、窒素雰囲気下において０℃でゆっくりと処置した。生じた混合物を、撹拌しながら１時間、ゆっくりと室温まで温めた。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として化合物３を得た（５２０ｍｇ、８９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.50 (s, 1H), 4.22 (t, J= 6.6Hz, 2H), 3.11 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 1.74 (m, 2H), 1.44-1.36 (m, 13H), 1.29 (m, 8H)
化合物４
ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の化合物３（５２０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において、アジ化ナトリウム（１２０ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）で処置し、生じた混合物を、７０℃で３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮し、液体の形態において化合物４を得た（４３０ｍｇ、９８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.49 (s, 1H), 3.26 (t, J= 6.9Hz, 2H), 3.09-3.12 (m, 2H), 1.59 (m,2H), 1.44 (m, 11H), 1.33 (m, 10H)
化合物５
ジクロロメタン（６ｍＬ）化合物４（４３０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において０℃で、１，４−ジオキサン（４ｍＬ）中の４Ｍ−ＨＣｌで処置した。生じた混合物を３時間撹拌し、減圧下において濃縮し、化合物５を得た（３３０ｍｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.29 (s, 2H), 3.26 (t, J= 6.9Hz, 2H), 2.98 (m, 2H), 1.46 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.31-1.39 (m, 10H)
LCB14-0529
アセトニトリルと２５ｍｍｏｌの炭酸水素ナトリウムとの混合溶媒（１０ｍＬ）中の化合物５の溶液（３２６ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラン（４４２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を３時間、室温において撹拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0529を得た（２５０ｍｇ、４９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.48 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.16 (d, 8.4Hz, 1H), 3.47 (q, 6.6Hz, 2H), 3.24 (t, 6.9Hz, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.42-1.48 (m, 2H), 1.20-1.37 (m, 8H)
２−８．アジド−リンカー−NBD：LCB14-0530
化合物２
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のトリ（エチレン）グリコール（５ｇ、３３．２９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において０℃で、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１３．９６ｇ、７３．２４ｍｍｏｌ）および水酸化カリウム（８．９６ｇ、１５９．７９ｍｍｏｌ）により処置した。生じた混合物を３時間０℃で撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として化合物２を得た（１３．２ｇ、８６．５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.79 (m, 4H), 7.35 (m, 4H), 4.14 (m, 4H), 3.65 (m, 4H), 3.53 (s, 4H), 2.44 (s, 6H)
化合物３
ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中の化合物２（４．５ｇ、９．８１ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において、アジ化ナトリウム（１．６ｇ、２４．５２ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を、６５℃で１０時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（１．９６ｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.68-3.66 (m, 8H), 3.37 (t, J=4.8Hz, 4H)
化合物４
ジエチルエーテル、テトラヒドロフランおよび１ＮのＨＣｌの６．６ｍＬの混合溶媒（Ｖ：Ｖ：Ｖ＝３：０．６：３）中の化合物３（５００ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）の溶液。ジエチルエーテル（３．５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（６５５ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、５分間かけてゆっくりと加えた。生じた混合物を、室温において５時間撹拌した。生じた混合物を、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）で希釈し、１ＮのＮａＯＨ溶液で中和した。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物４を得た（３７０ｍｇ、８５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.69-3.63 (m, 6H), 3.52 (t, J=5.1Hz, 2H), 3.40 (t, J=4.8Hz, 2H), 2.87 (t, J=5.1Hz, 2H)
LCB14-0530
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中の化合物４（２００ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、トリエチルアミン（３２０μＬ、２．２８ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の４−クロロ−７−ニトロベンゾフラン（４４２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液で連続的に処置した。生じた混合物を、室温において１時間撹拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0530を得た（３０５ｍｇ、７８．８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.47 (d, J=8.4Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.17 (d, J=8.4Hz, 1H), 3.86 (t, J=4.8Hz, 2H), 3.66-3.73 (m, 8H), 3.41 (t, J=4.8Hz, 2H)
２−９．アジド−リンカー−薬物：LCB14-0505、-0531および-0510
化合物２
ChemPharmBull, 1995, 43(10), 1706-1718（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法を参照して、化合物１を調製した。ｔｅｒｔ−ブタノール（６ｍＬ）および水（０．６ｍＬ）中の化合物１（０．５０ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液を、水素雰囲気下においてＰｄ／Ｃ（６ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）と共に、４時間撹拌した。セライトパッドを通して、反応溶液を濾過し、濾過物を減圧下において濃縮し、白色固体として化合物２を得た（０．４２ｇ）。
EI-MS m/z: 747(M + )
化合物９
クロム（ＶＩ）三酸化物（ＣｒＯ３、７ｇ、０．０７ｍｏｌ）を、０℃で蒸留水（１０ｍＬ）中に溶解した。溶液に、１８ＭのＨ２ＳＯ４（６．１ｍＬ、０．１１ｍｏｌ）および蒸留水（２０ｍＬ）を連続的に加えた。生じた混合物を５分間撹拌した（＝Jones試薬）。アセトン（２５０ｍＬ）中の９−ブロモ−１−ノナノール（５ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）の溶液を、‐５℃においてJones試薬（１８ｍＬ）でゆっくりと処置した。生じた混合物を３時間室温において撹拌した後、緑色を帯びた固体を濾過除去し、濾過物を濃縮した。残渣をジエチルエーテル（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濾過および濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、化合物９を得た（４．９５ｇ、９３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.40 (t, J= 6.6Hz, 2H), 2.35 (t, J= 7.2Hz, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.41 (m, 2H), 1.32 (m, 6H)
化合物１０
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中の化合物９（４ｇ、１６．８６ｍｍｏｌ）の溶液を、アジ化ナトリウム（１．６４ｇ、２５．２９ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を６時間撹拌しながら８０℃まで加熱した。反応が完了した後で、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濾過および濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーに供し、化合物１０を得た（３．３ｇ、９８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.26 (t, J=7.2Hz, 2H), 2.35 (t, J=7.2Hz, 2H), 1.64~1.57 (m, 4H), 1.35~1.32 (m, 8H)
LCB14-0505
塩化メチレン（３ｍＬ）中の化合物２（０．１６ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）および９−アジド−ノナン酸（１０）（４７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃においてDIPEA（０．０６ｍＬ、０．３２ｍｍｏｌ）およびPyBOP（０．１５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を３時間撹拌した。生じた混合物を塩化メチレン（１００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）で抽出した。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として化合物LCB14-0505を得た（０．１２ｇ、５９％）。
EI-MS m/z: 928(M + )
LCB14-0531
上記の方法に類似の方法において、化合物LCB14-0531（６５％）を調製した。
EI-MS m/z: 917(M + )
LCB14-0510
BioconjugateChem. 2002, 13, 855-869 and US2005238649（これらの参考文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法を用いて、化合物６を調製した。DMF（２ｍＬ）中の化合物６（６９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）および化合物２（１００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃において、DIPEA（０．０４ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）およびPyBOP（０．０９ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を３時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（３０ｍＬ）を用いて有機層を抽出し、これを減圧下において濃縮した。残渣を塩化メチレンおよびメタノールによるカラムクロマトグラフィーに供し、褐色固体として化合物LCB14-0510を得た（９４ｍｇ、６４％）。
EI-MS m/z: 1199(M + )
２−１０．アセチレン−リンカー−NBD：LCB14-0532
化合物２
１０ｍＬのジメチルホルムアミド中の化合物１（１ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下において、アジ化ナトリウム（５７８ｍｇ、８．８９ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を８０℃で３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮し、化合物２を得た（１．０３ｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 3.75 (m, 2H), 3.69 (m, 6H), 3.62 (m, 2H), 3.41 (t, J=3.5Hz, 2H), 2.30 (m, 1H)
化合物３
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（鉱油中５５％、２５０ｍｇ、５．７ｍｍｏｌ）の懸濁液を、０℃において、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の化合物２（５００ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。生じた混合物を１時間撹拌した。生じた混合物を、次いで室温まで温め、２時間撹拌した。臭化プロパルギル（トルエン中８０％、８００μｌ、７．１２ｍｍｏｌ）を添加し、生じた混合物を室温において１２時間撹拌した。塩化アンモニウム溶液（２０ｍＬ）およびジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮し、化合物３を得た（５３０ｍｇ、８６．６％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21 (d, J=2.4Hz, 2H), 3.66-3.72 (m, 10H), 3.39 (t, J=5.1Hz, 2H), 2.43 (t, J=2.4Hz, 1H)
化合物４
３ｍＬのテトラヒドロフランおよび蒸留水（Ｖ：Ｖ＝２：１）の混合溶液中の化合物３の溶液（２５０ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（４６１ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）で、５分間かけてゆっくりと処置した。生じた混合物を室温において撹拌した。反応が完了した後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）および蒸留水（３０ｍＬ）を加えた。生じた混合物を１ＮのＨＣｌで酸性化し、有機層を分離除去した。水層をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、１ＮのＮａＯＨ溶液で中和した。このようにして得られた有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮し、明黄色の化合物４を得た（２００ｍｇ、９１．３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.18 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.59-3.69 (m, 8H), 3.48 (t, J=5.4Hz, 2H), 2.84 (s, 2H), 2.40 (m, 1H)
LCB14-0532
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中の化合物４（１９５ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液を、トリエチルアミン（２９０μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）で処置した。テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の４−クロロ−７−ニトロベンゾフラン（２７０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた混合物を、室温において１時間撹拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮し、化合物LCB14-0532を得た（２８０ｍｇ、７７％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.50 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.19 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.19 (d, J=2.4Hz, 2H), 3.89 (t, J=5.1Hz, 2H), 3.68-3.75 (m, 10H), 2.41 (t, J=2.4Hz, 1H)
２−１１．アセチレン−リンカー−MMAF−OMe（LCB14-0536）
化合物Ａ
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のＮａＨ（鉱油中５５％、３９０ｍｇ、１６．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で窒素雰囲気下において、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のトリエチレングリコール（４ｇ、２６．６３ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと加えた。トルエン中の８０％の臭化プロパルギル（１．９７ｇ、１３．３１ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。生じた混合物を、同じ温度において２時間撹拌した。反応が完了した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、水性形態の化合物（Ａ）を得た（１ｇ、４３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21-4.20 (m, 2H), 3.74-3.66 (m, 10H), 3.62-3.61 (m, 2H), 2.43 (t, J=2.4Hz, 1H)
化合物Ｂ
アセトン中の化合物Ａの溶液（１ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下において‐５℃で、５．３ｍＬのJones試薬をゆっくりと加えた。生じた混合物を、ゆっくりと室温まで温めながら３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を濃縮し、黄色の液体として化合物（Ｂ）を得た（８８６ｍｇ、８２％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 4.21 (d, J=2.4,2H), 4.18-4.17 (m, 2H), 3.78-3.77 (m, 2H), 3.74-3.70 (m, 6H), 2.44(t, J=2.4Hz, 1H)
LCB14-0536
アセトニトリル（２ｍＬ）中の化合物（Ａ）（MMAF-OMe、１００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、化合物（Ｂ）（２７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、PyBOP（１０４ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）およびDIPEA（０．０３ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、減圧下において濃縮した。残渣をジクロロメタンおよびメタノールによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物LCB14-0536を得た（８２ｍｇ、６８％）。
EI-MS m/z: 930(M + )
２−１２．アセチレン−リンカー（ペプチド配列）−MMAF−OMe（LCB14-0589）
化合物１（Fmoc-Val-Cit-PAB）
WO2007/008603（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法に従って、Fmoc-Val-Cit-OHを調製した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）およびメタノール（２０ｍＬ）中のFmoc-Val-Cit-OH（４．８９ｇ、９．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下において、パラ−アミノベンジルアルコール（２．４３ｇ、１９．７０ｍｍｏｌ）および１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（１．９８ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を１２時間室温において撹拌した。反応が完了した後、溶媒を濃縮した。生じた固体をジエチルエーテルで複数回洗浄し、黄色固体として化合物１を得た（４．１２ｇ、７０％）。
1H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.00 (s, 1H), 8.12 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.89 (d, J=7.8Hz, 2H), 7.75-7.72 (m, 2H), 7.55(d, J=7.8Hz, 2H), 7.44-7.41(m, 2H), 7.33-7.31(m, 2H), 7.23(d, J=8.4Hz, 2H), 6.02(bs,1H), 5.41-5.38(m,2H), 5.09(bs, 1H), 4.42(bs,2H), 4.30-4.28(m, 1H), 4.24-4.23(m, 2H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.02-2.99(m, 1H), 2.94-2.93(m, 1H), 2.00-1.99(m, 1H), 1.7(bs, 1H), 1.60(bs, 1H), 1.43(bs, 1H), 1.36(bs, 1H) , 0.88-0.84(m, 6H)
化合物２（Fmoc-Val-Cit-PABC-PNA)
ＤＭＦ（８ｍＬ）中の化合物１（２ｇ、３．３２ｍｍｏｌ）の溶液を、ビス（４−ニトロフェニル）カルボナート（２．０２ｇ、６．６４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．６４７ｍＬ、４．９８ｍｍｏｌ）で、窒素雰囲気下において連続的に処置した。生じた混合物を１２時間室温において撹拌した。反応が完了した後、凝固のためにジエチルエーテルを加えた。生じた固体をジエチルエーテルおよび水で複数回洗浄し、黄色固体として化合物２を得た（１．５２ｇ、６０％）。
1H NMR (600MHz, DMSO-d6) δ 10.19 (s, 1H), 8.31 (d, J=9.6Hz, 2H), 8.15 (d, J=7.8Hz, 1H), 7.89 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.75-7.72(m, 2H), 7.66(d, J=8.4Hz, 2H), 7.57(d, J=9.0Hz, 2H), 7.43-7.39(m, 4H), 7.32(t, J=7.2Hz, 2H), 6.05-6.04(m,1H), 5.42(m, 2H), 5.24(s,2H), 4.42(m, 1H), 4.30-4.28(m, 1H), 425-4.23(m, 2H), 3.94-3.91(m, 1H), 3.01-3.00(m, 1H), 2.96-2.94(m, 1H), 2.00-1.99(m, 1H), 1.70(m, 1H), 1.59(m, 1H), 1.45(m, 1H) , 1.37(m, 1H), 0.89-0.83(m, 6H).
EI-MS m/z: 767(M+)
化合物３（Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAF-OMe)
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２（２００ｍｇ、０．２６１ｍｍｏｌ）およびMMAF-OMe（１９４ｍｇ、０．２６１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＨＯＢｔ（７．１ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１ｍＬ）およびDIPEA（０．０４５ｍＬ、０．２６１ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水溶液（３０ｍＬ）を用いて有機層を抽出した。このようにして得られた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物３を得た（１５３ｍｇ、４２％）。
EI-MS m/z: 1375(M + )
化合物４（Val-Cit-PABC-MMAF-OMe）
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の化合物３（１５３ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）の溶液に、室温においてピペリジン（０．２ｍＬ）を添加した。生じた混合物を、同じ温度において２時間撹拌した。反応が完了した後、エーテルおよびヘキサンで再結晶化を行い、明黄色固体として化合物４を得た（８５ｍｇ、６６％）。
EI-MS m/z: 1152(M + )
LCB14-0589（アセチレンリンカー−Val-Cit-PABC-MMAF-OMe)
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物４（８５ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）および例２〜１１の化合物Ｂ（１８ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）の溶液に、DIPEA（０．０３ｍＬ、０．１４８ｍｍｏｌ）およびPyBOP（５８ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）を添加した。生じた混合物を、室温において５時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）で抽出を行った。生じた粗生成物を、カラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として化合物LCB14-0589を得た（３５．４ｍｇ、３６％）。
EI-MS m/z: 1336(M + )
２−１３．アセチレン−リンカー−Val-Cit-PABC-MMAE（LCB14-0602）
化合物２（Fmoc-Val-Cit-PABC-MMAE）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のFmoc-Val-Cit-PABC-PNP（２００ｍｇ、０．２６１ｍｍｏｌ）およびMMAE（１８７ｍｇ、０．２６１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＯＢｔ（７．１ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）、ピリジン（１ｍＬ）およびDIPEA（０．０４５ｍＬ、０．２６１ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）および食塩水溶液（３０ｍＬ）を用いて有機層を抽出した。このようにして得られた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物２を得た（５０ｍｇ、１４．３％）。
EI-MS m/z: 1346(M + )
化合物３（Val-Cit-PABC-MMAE）
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の化合物２（５０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温においてピペリジン（０．１ｍＬ）を加えた。生じた混合物を、同じ温度において２時間撹拌した。反応が完了した後、エーテルおよびヘキサンで再結晶化を行い、明黄色固体として化合物３を得た（３７ｍｇ、８９％）。
EI-MS m/z: 1124(M + )
LCB14-0602 (アセチレン リンカー-Val-Cit-PABC-MMAE)
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物３（３５ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）および例２〜１１の化合物Ｂ（７．６ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、DIPEA（０．０１１ｍＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）およびPyBOP（２４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を５時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）で抽出を行った。生じた粗生成物をカラムクロマトグラフィーに供し、白色固体として化合物LCB14-0602を得た（２８．５ｍｇ、７０％）。
EI-MS m/z: 1308(M + )
２−１４．アジドリンカー−ＰＢＤ（ピロロベンゾジアゼピン）二量体（LCB14-0577）
化合物２
テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の化合物１（１．２２ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ、２．２３ｇ、８．５０ｍｍｏｌ）およびヘキサエチレングリコール（２ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で窒素雰囲気下において、ジイソプロピルアゾカルボナート（DIAD、１．６７ｍＬ、８．５０ｍｍｏｌ）を添加した。生じた混合物を１時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（１．４ｇ、４５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, J= 8.4Hz, 2H), 6.80 (d, J= 8.4Hz, 2H), 4.09 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.72(t, J= 4.8Hz, 4H), 3.68~3.65 (m, 14H), 3.60 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.85 (bs, 1H)
化合物３
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中の化合物２（３００ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸カリウム（２００ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（２８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）およびビス（ピナコラト）二ホウ素（１７４ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。生じた混合物を７０℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（３００ｍｇ、９０％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.73 (d, J= 8.4Hz, 2H), 6.90 (d, J= 8.4Hz, 2H), 4.15 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.86 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.73~3.72 (m, 4H), 3.68~3.64 (m, 14H), 3.60 (t, J= 4.8Hz, 2H), 1.33 (s, 12H)
化合物４
WO2006/111759 A1、WO2010/043880 A1およびWO2010/ 010347 A1（これらの参考文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法に従って、化合物４を調製した。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (s, 1H), 7.29 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.77 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 5.91 (m, 2H), 5.23 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 9Hz, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.17~4.13 (m, 4H), 3.96~3.91 (m, 8H), 3.82 (s, 3H), 3.33 (m, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.44 (m, 2H), 0.90(2s, 18H), 0.27 (2s, 12H)
化合物５
化合物４（８３ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１０ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＴＰＰ）４（３．４ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を、エタノール／トルエン／蒸留水の混合溶媒（０．３ｍＬ／０．３ｍＬ／０．３ｍＬ）中に連続的に溶解した。トルエン（３ｍＬ）中の化合物３（３１．６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた混合物を室温において１時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物５を得た（７９ｍｇ、７４％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m 2H), 7.31~7.27 (m, 6H), 6.92~6.89 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.16~4.13 (m, 6H), 3.97~3.94 (m, 8H), 3.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.74~3.64 (m, 18H), 3.61 (m, 2H), 3.34 (m 2H), 2.82 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
化合物６
テトラヒドロフラン（３ｍＬ）中の化合物５（２５０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、４−メチルモルホリン（３４．２μＬ、０．３１０ｍｍｏｌ）およびメタンスルホン酸無水物（Ｍｓ２Ｏ、２．５ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物６を得た（２２０ｍｇ、８４％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.33 (m, 2H), 7.28~7.23 (m, 6H), 6.89~6.86 (m, 4H), 6.76 (s, 2H), 5.88 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.35 (m , 2H), 4.26 (m, 2H), 4.13~4.11 (m 6H), 3.92 (s, 6H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.74~3.60 (m, 20H), 3,31 (m, 2H), 3.06 (s, 3H), 2.80 (m, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.23(2s, 12H)
化合物７
ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中の化合物６（１００ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）の溶液に、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３、４．６ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を５５℃で４時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物７を得た（８５ｍｇ、８８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.33 (bs, 2H), 7.28~7.24 (m, 6H), 6.89~6.87 (m, 4H), 6.76 (s, 2H), 5.88 (d, J= 9Hz, 2H), 5.21 (d, J= 12.6Hz, 2H), 4.26 (m, 2H), 4.13~4.11 (m, 6H), 3.92 (m, 8H), 3.84 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.64 (m, 16H), 3.36 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.31 (m, 2H), 2.80 (m, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.23 (2s, 12H)
LCB14-0577
テトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）中の化合物７（８０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｎ−酢酸アンモニウム（１ｍＬ）および１０％カドミウム／鉛のカップル（１２０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を、室温において４時間撹拌した。反応が完了した後、ジクロロメタン（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0577を得た（９ｍｇ、１８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J= 4.2Hz, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.31~7.23 (m, 6H), 6.89~6.80 (m, 6H), 4.34~4.22 (m, 6H), 4.11(m, 2H), 3.92 (m, 6H), 3.84~3.77(m, 5H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.63 (, 18H), 3.36 (m, 2H), 3.03 (m, 2H), 2.44~2.40 (m, 2H)
EI-MS m/z: 1017(M+)
２−１５．アセチレン−リンカー−ＰＢＤ二量体（LCB14-0578）
化合物２
アセトニトリル（１ｍＬ）中の例２〜１４の化合物６（９５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（１８μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）および蒸留水（５００μＬ）中の炭酸ナトリウム（１８ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた混合物を４０℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（４５ｍｇ、４８％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.27 (m, 6H), 6.91~6.89 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 5.91 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (d, J= 11.4Hz, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.16~4.11 (m, 6H), 3.94 (s, 6H), 3.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.73 (m, 2H), 3.69~3.60 (m 18H), 3.45 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.33 (m, 2H), 2.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.82 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 2.22 (t, J= 4.4Hz, 1H), 0.90 (s, 18H), 0.24 (2s, 12H)
LCB14-0578
テトラヒドロフラン（７５０μＬ）中の化合物２（４０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｎ−酢酸アンモニウム（０．５ｍＬ）および１０％カドミウム／鉛のカップル（７０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を室温において４時間撹拌した。反応が完了した後、ジクロロメタン（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0578を得た（１３ｍｇ、５２％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.88 (d, J= 4.2Hz, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.33~7.28 (m, 6H), 6.91~6.86 (m, 6H), 4.38~4.20 (m, 6H), 4.13 (m 2H), 3.94 (s, 6H), 3.88~3.80 (m, 5H), 3.73 (m, 2H), 3.69~3.61 (m, 16H), 3.46 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.39(m, 2H), 3.30 (m, 2H), 2.88 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.43 (m, 2H), 2.23 (t, J= 4.4Hz, 1H) )
EI-MS m/z: 1028(M + )
２−１６．アセチレン−リンカー−ＰＢＤ二量体（ピリジンバージョン）（LCB14-0582）
化合物２
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中のＮａＨ（鉱油中５５％、１８４ｍｇ、４．２２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で窒素雰囲気下において、テトラヒドロフラン（３ｍＬ）中のヘキサエチレングリコール（２．４ｇ、８．４４ｍｍｏｌ）を添加した。生じた混合物を１０分間０℃で撹拌した。化合物１（１ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中に溶解することにより調製した混合溶液を、ゆっくりと加えた。生じた混合物を、室温において１時間撹拌し、次いで７０℃で１２時間撹拌した。生じた混合物を０℃まで冷却した後で、蒸留水（２ｍＬ）を加えた。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（１．５ｇ、８１％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.13(d, J= 2.4Hz, 1H), 7.61 (dd, J= 8.4, 2.4Hz, 1H), 6.67 (d, J= 9Hz, 1H), 4.41 (m, 2H), 3.81 (m, 2H), 3.70~3.61 (m, 18H), 3.58 (m, 2H), 2.71 (bs, 1H)
化合物３
ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の化合物２（５００ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、酢酸カリウム（３３６ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（４６．５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）およびビス（ピナコラト）二ホウ素（３１８ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）で連続的に処置した。生じた混合物を、７０℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（２５０ｍｇ、４５％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 7.90 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.74 (d, J= 8.4Hz, 1H), 4.50 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.74~3.70 (m, 20H), 1.33 (s, 12H)
化合物５
化合物４（２４５ｍｇ、０．１７５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２８ｍｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＴＰＰ）４（１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を、エタノール／トルエン／蒸留水の混合溶液（１．５ｍＬ／１．５ｍＬ／１．５ｍＬ）中に連続的に溶解した。トルエン（１．５ｍＬ）中の化合物３の溶液（９４ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、室温において１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物５を得た（１００ｍｇ、３５．５％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J= 2.4Hz, 1H), 7.66 (m, 1H), 7.38(s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.29 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.80 (d, J= 8.4Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.23 (dd, J= 11.4, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.29 (m, 2H), 4.17~4.12(m, 2H), 3.4 (m, 8H), 3.86 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.82 (m, 4H), 3.74~3.65 (m, 18H), 3.61(m, 2H), 3.33(m, 2H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
化合物６
テトラヒドロフラン（３ｍｌ）中の化合物５（１８０ｍｇ、０．１１ｍＭ）の溶液に、４−メチルモルホリン（ＮＭＭ、６１．５μＬ、０．５５ｍＭ）およびメタンスルホン酸無水物（Ｍｓ２Ｏ、２２ｍｇ、０．１２１ｍＭ）を添加した。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を添加して、有機層を抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物６を調製した（８０ｍｇ、４３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J= 2.4Hz, 1H), 7.66 (dd, J= 7.8, 2.4Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.30 (d, J= 9Hz, 2H), 7.27 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.80 (d, , J= 9Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.22 (dd, J= 12, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.38 (m, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.15 (m, 3H), 3.99~3.93 (m, 7H), 3.86 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.76 (m, 2H), 3.71 (m, 2H), 3.69~3.63 (m, 16H), 3.34 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
化合物７
アセトニトリル（４ｍＬ）中の化合物６（８０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（３０μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）および蒸留水（５００μＬ）中の炭酸ナトリウム（２０ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた混合物を５０℃で１２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物７を得た（２５ｍｇ、３２％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J= 1.8Hz, 1H), 7.66 (dd, J= 8.4, 2.4Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.30 (d, J= 8.4Hz, 2H), 7.28 (m, 2H), 6.89 (d, J= 9Hz, 2H), 6.79 (d, J= 9Hz, 1H), 6.78 (s, 2H), ), 5.90 (d, J= 9Hz, 2H), 5.22 (dd, J= 12, 4.2Hz, 2H), 4.47 (m, 2H), 4.30 (m, 2H), 4.17~4.14 (m, 3H), 3.98~3.93 (m, 7H), 3.86 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.72 (m, 2H), 3.69~3.60 (m, 18H), 3.45 (d, J= 2.4Hz, 2H), 3.34 (m, 2H), 2.87 (t, J= 4.8Hz, 2H), 2.83 (m, 2H), 2.45 (m, 2H), 2.22 (m, 1H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
LCB14-0582
テトラヒドロフラン（７５０μＬ）中の化合物７（２５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｎ−酢酸アンモニウム（０．５ｍＬ）および１０％カドミウム／鉛のカップル（５０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、ジメチルクロロメタン（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0582を得た（６ｍｇ、３８．４％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 8.00 (m, 1H), 7.88 (m, 2H), 7.60 (m, 1H), 7.41~7.28 (m, 6H), 6.90~6.71 (m, 5H), 4.46 (m, 2H), 4.35~4.24 (m, 4H), 3.95~3.79 (m, 11H), 3.70 (m, 2H), 3.68~3.61 (m, 18H), 3.47 (m, 2H), 3.38 (m, 2H), 3.04 (m, 2H), 2.89 (t, J= 5.4Hz, 2H), 2.40 (m, 2H), 2.23 (bs, 1H)
EI-MS m/z: 1029(M + )
２−１７．アミノ−Peg5−ＰＢＤ二量体（LCB14-0594）
化合物１
テトラヒドロフラン中の例２〜１４の化合物５（４５６ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１０８ｍｇ、０．４１１ｍｍｏｌ）およびフタルイミド（５０ｍｇ、０．３４１ｍｍｏｌ）を加えた。DIAD（０．０５８ｍＬ、０．３４０ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと加えた。生じた混合物を室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、ジクロロメタン（４０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）で抽出を行った。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物１を得た（４９２ｍｇ、定量的）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.84-7.82 (m, 2H), 7.70-7.69 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.29-7.25 (m, 6H), 6.90(d, J=7.2, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J=9.0, 2H), 5.21(d, J=12.6, 2H), 4.28(m, 2H),4.19-4.10(m, 4H), 3.93(m, 6H), 3.89-3.87(m, 2H), 3.86-3.84(m, 2H), 3.82(s, 3H), 3.74-3.71(m, 4H), 3.67-3.66(m, 2H), 3.63-3.62(m, 6H), 3.59-3.58(m, 6H), 3.33(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.42(m, 2H), 0.91(s, 18H) , 0.27(2s, 12H)
化合物２
エチルアルコール（２ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の化合物１（４９２ｍｇ、０．２８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（０．０７ｍＬ、１．４１７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を６０℃で５時間撹拌した。反応が完了した後、２ｍＬの酢酸エチルを加えた。固体を濾過除去した。濾過物を濃縮し、カラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物２を得た（３８０ｍｇ、８３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (bs, 2H), 7.29-7.26 (m, 6H), 6.92-6.88 (m, 4H), 6.79 (bs, 2H), 5.92 (d, J=8.4, 2H), 5.21 (d, J=12, 2H), 4.29-4.28 (m, 2H), 4.19-4.17 (m, 6H), 3.93-3.90(m, 6H), 3.89-3.87 (m, 2H), 3.82(s, 3H), 3.75-3.73 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 12H), 3.35-3.31 (m, 2H), 2.96 (bs, 2H), 2.85 (d, J=16.8, 2H), 2.43 (m, 2H), 0.91 (s, 18H), 0.27 (2s, 12H).
EI-MS m/z: 1606(M+)
LCB14-0594
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の化合物２（２５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｎの酢酸アンモニウム（０．４ｍＬ）および１０％カドミウム／鉛のカップル（４０ｍｇ）を添加した。生じた混合物を同じ温度において１２時間撹拌した。反応が完了した後、生じた混合物をジクロロメタンで濾過した。濾過溶液を濃縮し、カラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体としてLCB14-0594を得た（４ｍｇ、２６％）。
EI-MS m/z: 990(M + )
２−１８．グルクロニド−リンカー−ＰＢＤ単量体（LCB14-0596）
化合物（Ｂ）
テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の化合物（Ａ）（３００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、Ｎ−メチルモルホリン（０．１６ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）およびメタンスルホン酸無水物（１２０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を４時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、化合物（Ｂ）を得た（３３０ｍｇ、９６％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.53(s, 1H), 7.40(s, 1H), 7.39-7.37(m, 2H), 7.33(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.89(m, 2H), 5.47(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.81(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.62(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 4.49-4.41(m, 2H), 3.97-3.93(m, 1H), 3.92(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.68-3.64(m, 1H), 3.17-3.10(m, 3H), 2.96(s, 3H), 0.98(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H).
EI-MS m/z: 603(M + )
化合物（Ｃ）
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物（Ｂ）（３３０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、アジ化ナトリウム（４３ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を６０℃で３時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物（Ｃ）を得た（３０７ｍｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.54(s, 1H), 7.38-7.37(m, 3H), 7.34(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.88(m, 2H), 5.49(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.76(d, J = 10.2Hz, 1H), 4.63(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 3.96-3.93(m, 1H), 3.92(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.79-3.75(m, 1H), 3.69-3.65(m, 1H), 3.52-3.50(m, 2H), 3.16-3.12(m, 1H), 3.03-2.99(m, 1H), 2.96-2.91(m, 1H), 0.99(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H).
EI-MS m/z: 550(M + )
化合物（１−１）
テトラヒドロフラン（２ｍＬ）および蒸留水（０．５ｍＬ）中の化合物（Ｃ）（５００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、トリフェニルホスフィン（２８５ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、４０℃で１３時間撹拌した。酢酸エチル（２００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物（１−１）を得た（４３５ｍｇ、９３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.50(s, 1H), 7.38-7.36(m, 3H), 7.33(t, J = 1.8Hz, 1H), 6.90-6.88(m, 2H), 5.47(d, J = 9.6Hz, 1H), 4.81(d, J = 9.6Hz, 1H), 4.67(dd, J = 7.2, 3.0Hz, 1H), 3.95-3.92(m, 1H), 3.91(s, 3H), 3.83(s, 3H), 3.76-3.72(m, 1H), 3.68-3.64(m, 1H), 3.15-3.10(m, 2H), 3.06-2.96(m, 2H), 2.94-2.88(m, 1H), 2.86-2.80(m, 1H), 0.98(t, J = 8.4Hz, 2H), 0.02(s, 9H).
EI-MS m/z: 524(M + )
化合物３
ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の例２〜４の化合物７（１２６ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）および化合物（１−１）（１００ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ、８０μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。生じた混合物を室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（１７８ｍｇ、８９％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.46 (s, 1H), 7.37 (d, J= 8.8Hz, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.22 (m, 1H), 6.87 (d, J= 8.8Hz, 2H), 6.71(d, J= 2.0Hz, 1H), 6.60 (m, 1H), 5.44 (d, J= 10.4Hz, 1H), 5.34 (m, 2H), 5.27 (m, 1H), 5.16 (d, J= 7.6Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.82~4.77 (m, 2H), 4.68 (d, J= 2.0Hz, 2H), 4.60 (m, 1H), 4.19 (d, J= 9.2Hz, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.72~3.61 (m, 5H), 3.45 (m, 2H), 3.11 (m, 1H), 2.93~2.84 (m, 2H), 2.51 (bs, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 0.97 (t, J= 7.2Hz, 2H), 0.01 (s, 9H)
化合物４
メタノール（５ｍＬ）中の化合物３（１００ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、蒸留水（２ｍＬ）中の水酸化リチウム（４０ｍｇ、１．８８０ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、減圧下においてメタノールを取り除いた。残渣を蒸留水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸でｐＨ＝３までゆっくりと酸性化した。ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で３回、抽出を行った。生じた生成物を減圧下において濃縮し、固体化合物を得た。固体化合物を、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、化合物４を得た（８６．５ｍｇ、１００％）。
1H NMR (600MHz, CD3OD) δ 7.43 (s, 1H), 7.41 (d, J= 9Hz, 2H), 7.30 (d, J= 10.2Hz, 2H), 7.14 (d, J= 7.8Hz, 1H), 6.90 (d, J= 9Hz, 2H), 6.86 (m, 1H), 6.66 (m, 1H), 5.22 (m, 2H), 4.98~4.94 (m, 3H), 4.71~4.67 (m, 3H), 3.96 (m, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.75 (m, 1H), 3.59~3.47 (m, 5H), 3.36 (m, 2H), 3.25 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 2.90 (bs, 1H), 2.85 (m, 2H), 0.83 (m, 2H), 0.01 (s, 9H)
EI-MS m/z: 904(M + )
LCB14-0596
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）およびエタノール（１ｍＬ）中の化合物４（８６．５ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、水酸化ホウ素リチウムの２Ｍ−テトラヒドロフラン溶液（９４０μＬ、１．８８ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を室温において１２時間撹拌した。さらなる水酸化ホウ素リチウム２Ｍ−テトラヒドロフラン溶液（１．４１ｍＬ、２．８２ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を５時間撹拌した、０℃まで冷却した。１％ギ酸溶液（３３ｍＬ）の添加により反応をクエンチした。生じた混合物を３時間撹拌した。反応が完了した後、蒸留水（５０ｍＬ）および酢酸エチル（２０ｍＬ）とメタノール（１０ｍＬ）との混合溶液で抽出を行った。残渣を、クロロホルム／メタノール／ギ酸（Ｖ：Ｖ：Ｖ＝９：１：０．０５）を用いるカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0596を得た（５０ｍｇ、６９％）。
EI-MS m/z: 756(M + )
２−１９．グルクロニドリンカー−ＰＢＤ二量体（LCB14-0597）
化合物３
ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の例２〜４の化合物７（１５０ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）および例２〜１７の化合物２（３６５ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９５μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を室温において２時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（１００ｍＬ）および蒸留水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物３を得た（３１０ｍｇ、６４％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.25 (m, 7H), 6.90 (m, 4H), 6.78 (s, 2H), 6.73 (d, J= 2.4Hz, 1H), 6.60 (dd, 8.4, 1.8Hz, 1H), 5.90 (d, J= 2.4Hz, 2H), 5.36~5.32 (m, 2H), 5.27 (m, 2H), 5.22 (m, 2H), 5.13 (d, J= 7.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.69 (d, J= 2.4Hz, 2H), 4.29 (m 2H), 4.17~4.13 (m, 6H), 3.94 (m, 8H), 3.85 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.71 (m, 2H), 3.67~3.59 (m, 14H), 3.54 (t, J= 4.8Hz, 2H), 3.39~3.31 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.52 (t, J= 2.4Hz, 1H), 2.44 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 0.91 (s, 18H), 0.26 (2s , 12H)
化合物４
メタノール（３ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）中の化合物３（１００ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、蒸留水（１．５ｍＬ）中の水酸化リチウム（２０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、有機溶媒を、減圧下において取り除いた。残渣を蒸留水（５０ｍＬ）で希釈し、０．５ＮのＨＣｌ溶液でｐＨ＝３までゆっくりと酸性化した。ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で３回、抽出を行った。抽出物を減圧下において濃縮し、化合物４を得た（９３．４ｍｇ、１００％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 7.35 (m, 2H), 7.30~7.24 (m, 7H), 4.89 (m, 4H), 6.78 (m, 3H), 6.64 (m, 1H), 5.91 (m, 2H), 5.65 (m, 1H), 5.21 (m, 2H), 5.07 (m, 2H), 4.89 (m, 1H), 4.67 (m, 2H), 4.28 (m, 2H), 4.18~4.12 (m, 6H), 3.93 (m, 8H), 3.85~3.82 (m, 5H), 3.72 (m, 2H), 3.65~3.54 (m, 20H), 3.34~3.32 (m, 4H), 2.82 (m, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.44 (m, 2H), 0.90 (2s, 18H), 0.25 (2s, 12H)
LCB14-0597
テトラヒドロフラン（１．５ｍＬ）中の化合物４（９０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｎ−酢酸アンモニウム（１．２ｍＬ）および１０％カドミウム／鉛のカップル（１２０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を室温において３時間撹拌した。反応が完了した後、酢酸エチル（５０ｍＬ）および蒸留水（５０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物LCB14-0597を得た（１６．４ｍｇ、２６％）。
EI-MS m/z: 1371(M + )
２−２０．アミノ−Peg1−ＰＢＤ二量体（LCB14-0599）
化合物１
エタノール（１８ｍＬ）中の４−ブロモフェノール（４．０ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、水素化ナトリウム（１．０ｇ、２５．４０ｍｍｏｌ）および２−ブロモエタノール（１．７ｍＬ、２３．１０ｍｍｏｌ）を加えた。酢酸エチル（５００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、液体形態の化合物１を得た（４．３ｇ、８６％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.39-7.36(m, 2H), 6.81-6.78(m, 2H), 4.05-4.03(m, 2H), 3.95(t, J = 4.2Hz, 2H), 2.18(bs, 1H).
化合物２
１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）中の化合物１（０．３ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、ビス（ピナコラト）二ホウ素（０．３５ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（０．４１ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（５６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を、７０℃で１２時間撹拌し、次いで減圧下において濃縮した。酢酸エチルで濾過を行った。濾過溶液を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、化合物２を得た（０．３６ｇ、９７％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.76-7.75(m, 2H), 6.92-6.91(m, 2H), 4.11(t, J = 4.2Hz, 2H), 3.97-3.96(m, 2H), 1.99(bs, 1H), 1.33(s, 12H).
化合物３
トルエン（２ｍＬ）中の化合物（Ａ）（８５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）（これは、WO2006/111759、WO2010/043880およびWO2010/010347（これらの参考文献の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される方法に従って調製された）および化合物２（３５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸ナトリウム（１７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、蒸留水（１ｍＬ）およびエタノール（１ｍＬ）を加えた。生じた混合物を５分間撹拌した後で、Ｐｄ（ＴＰＰ３）４（２２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を２時間撹拌した。酢酸エチル（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮し、残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物３を得た（７９ｍｇ、５３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.36-7.35(m, 2H), 7.32-7.25(m, 6H), 6.92-6.89(m, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J = 9.0Hz, 2H), 5.22(d, J = 12.0Hz, 2H), 4.30-4.28(m, 2H), 4.17-4.10(m, 6H), 3.98-3.94(m, 4H), 3.94(s, 6H), 3.83(s, 3H), 3.37-3.32(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.46-2.44(m, 2H), 1.98(bs, 1H), 0.91(s, 18H), 0.26(2s, 12H).
EI-MS m/z: 1387(M + )
化合物４
テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の化合物３（７７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、トリフェニルホスフィン（１８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、フタルイミド（１０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびDIAD（１３ｕｌ、０．０７ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。生じた混合物を１２時間撹拌した。酢酸エチル（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物４を得た（７２ｍｇ、８７％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.88-7.86(m, 2H), 7.77-7.75(m, 2H), 7.39-7.36(m, 2H), 7.30-7.24(m, 6H), 6.90-6.86(m, 4H), 6.78(d, J = 1.8Hz, 2H), 5.92- 5.88(m, 2H), 5.24-5.22(m, 2H), 4.28-4.24(m, 4H), 4.17-4.11(m, 6H), 3.98-3.90(m, 8H), 3.83(s, 3H), 3.36-3.29(m, 2H), 2.85-2.78(m, 2H), 2.47-2.43(m, 2H), 0.91(d, J = 1.8Hz, 18H), 0.27-0.24(m, 12H).
EI-MS m/z: 1516(M + )
化合物５
エタノール（２ｍＬ）中の化合物４（７０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液を、室温において、ヒドラジン一水和物（１２μｌ、０．２３ｍｍｏｌ）で処置した。生じた混合物を６０℃で５時間撹拌した。酢酸エチル（１０ｍＬ）を用いて固体を濾過除去した。濾過物を減圧下において濃縮した。残渣をジクロロメタンおよびメタノールによるカラムクロマトグラフィーに供し、化合物５を得た（６４ｍｇ、６３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ: 7.36-7.35(m, 2H), 7.32-7.25(m, 6H), 6.92-6.89(m, 4H), 6.78(s, 2H), 5.92(d, J = 9.0Hz, 2H), 5.22(d, J = 12.0Hz, 2H), 4.30-4.28(m, 2H), 4.17-4.10(m, 6H), 3.98-3.94(m, 4H), 3.94(s, 6H), 3.83(s, 3H), 3.37-3.32(m, 2H), 2.85-2.82(m, 2H), 2.46-2.44(m, 2H), 1.98(bs, 1H), 0.91(s, 18H), 0.26(2s, 12H).
EI-MS m/z: 1386(M + )
LCB14-0599
テトラヒドロフラン（２ｍＬ）中の化合物５（３０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、１Ｎの酢酸アンモニウム溶液（０．６ｍＬ）およびカドミウム／鉛のカップル（６０ｍｇ）を加えた。生じた混合物を４時間撹拌した。酢酸エチル（１０ｍＬ）を用いて固体を濾過除去した。濾過物を減圧下において濃縮した。残渣をジクロロメタンおよびメタノールによるカラムクロマトグラフィーに供し、黄色固体として化合物LCB14-0599を得た（９．０ｍｇ、６０％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3, CD3OD_1drop) δ: 7.54-7.49(m, 3H), 7.35-7.30(m, 5H), 7.26(s, 1H), 6.93-6.86(m, 5H), 6.51(s, 1H), 6.29(s, 1H), 4.67-4.59(m, 2H), 4.28-4.09(m, 6H), 3.85(s, 9H), 3.31-3.27(m, 1H), 3.07-3.03(m, 2H), 2.92-2.89(m, 1H), 2.39-2.30(m, 2H), 2.05-2.03(m, 2H).
EI-MS m/z: 770(M + )
２−２１．カルボニル基を含む修飾GPP誘導体（LCB14-0606）
化合物２
ピリジン中の化合物１（３ｇ、１９．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において無水酢酸（７．９ｍＬ、７７．８ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を２時間撹拌した。石油エーテル（１００ｍＬ）および０．１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮し、水性形態の化合物２を得た（３．８１ｇ、１００％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.35-5.33 (m, 1H), 5.08-4.58 (m, 1H), 4.59 (d, J=6.6Hz, 2H), 2.11-2.03(m, 4H), 2.05(s, 3H), 1.70(s, 3H), 1.68(s, 3H), 1.60(s, 3H)
化合物３
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の化合物２（３．８１ｇ、１９．４１ｍｍｌ）の溶液に、室温において、二酸化セレン（６５ｍｇ、０．５８ｍｍｌ）および７０％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（６．７２ｍＬ、４８．５２ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。生じた混合物をにまる２０時間撹拌した。反応が完了した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、液体として化合物３を得た（１．８ｇ、４３％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.38-5.30(m, 2H), 4.59 (d, J=7.2Hz, 2H), 4.00-3.99 (d, J=6Hz, 2H), 2.18-2.15(m, 2H), 2.10-2.06(m, 2H), 2.05(s, 3H), 1.70(s, 3H), 1.66(s, 3H)
化合物４
ジクロロメタン（１８ｍＬ）中の化合物３（１．８ｇ、８．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、トリフェニルホスフィン（３．３３ｇ、１２．７２ｍｍｏｌ）および四臭化炭素（３．３７ｇ、１０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を０℃で４時間撹拌した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、液体形態の化合物４を得た（２．３３ｇ、１００％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.57-5.55(m, 1H), 5.35-5.32 (m, 2H), 4.59 (d, J=7.2Hz, 2H), 3.96(s, 2H), 2.18-2.15(m, 2H), 2.10-2.07(m, 2H), 2.05(s, 3H), 1.75(s, 3H), 1.70(s, 3H)
化合物５
テトラヒドロフラン（３５ｍＬ）中の水素化ナトリウム（３４８ｍｇ、８．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中のエチルアセト酢酸（１．８５ｍＬ、１４．５２ｍｍｏｌ）の溶液を、一滴ずつ加えた。生じた混合物を０℃で３０分間撹拌した後、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解した化合物４（２ｇ、７．２６ｍｍｏｌ）を、０℃でゆっくりと加えた. 生じた混合物を８０℃で４時間撹拌した。酢酸エチル（８０ｍＬ）および水（８０ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣を酢酸エチルおよびヘキサンによるカラムクロマトグラフィーに供し、白色液体として化合物５を得た（１．５６ｇ、６６％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.34-5.31(m, 1H), 5.17-5.14 (m, 1H), 4.60-4.58 (m, 2H), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.61 (t, J=7.2Hz, 2H), 2.55-2.51 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.12-2.02 (m, 4H), 2.06 (s, 3H), 1.27(t, J=7.2Hz, 3H)
化合物６
エタノール（２０ｍＬ）中の化合物５（１．５６ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム（２．１６ｇ、３８．４７ｍｍｏｌ）を、エタノール（２０ｍＬ）と共に加えた。生じた混合物を１００℃で４時間撹拌し、エチルエーテル（１００ｍＬ）および０．１ＮのＨＣｌ溶液（５０ｍＬ）で希釈し、次いで、Ｎａ２ＣＯ３溶液で中和した。このようにして得られた有機層を減圧下において濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーに供し、化合物６を得た（８１９ｍｇ、８１％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.39-5.37(m, 1H), 5.09-5.07 (m, 1H), 4.15 (d, J=6.6Hz, 2H),2.53-2.51 (m, 2H), 2.27-2.24(m, 2H),2.13 (s, 3H), 2.12-2.09 (m, 2H), 2.04-2.01 (m, 2H),1.66 (s, 3H), 1.60(s, 3H)
化合物７
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ−クロロコハク酸イミド（２１０ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下において、ジメチルスルフィド（１２６μＬ、１．７１ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。生じた混合物を、０℃において５分間撹拌した。ジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解した化合物６（３００ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ）の溶液を、３０℃において加えた。生じた混合物を、０℃において２時間撹拌した。反応が完了した後、ｎ−ペンタン（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。このようにして得られた有機層を、減圧下において濃縮し、化合物７を得た（３２５ｍｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 5.42 (m, 2H), 5.09 (m, 2H), 4.11 (d, J= 8.4Hz, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.24 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.11 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.60 (s, 3H).
LCB14-0606
JACS, 2010, 132(12), 4281（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される類似の方法に従って、化合物lcb14-0606を調製した。７ｍＬのアセトニトリル中の化合物７（３２０ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、アセトニトリル（７ｍｌ）中のトリス（テトラブチルアンモニウム）ピロリン酸水素（２．２５ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）の溶液を、ゆっくりと加えた。生じた混合物を１時間撹拌した。反応が完了した後、生じた混合物を減圧下において２５℃未満において濃縮した。残渣を、アンモニア水：希釈水（ｖ：ｖ＝３：１）および２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム：イソプロピルアルコール（ｖ：ｖ＝５０：１）によるカラムクロマトグラフィー（BioRad AG 50w-x8樹脂、水素形態、１５ｇを充填）に供し化合物LCB14-0606を得た（５８５ｍｇ、９９％）。
1H NMR (600MHz, D2O) δ 5.42 (m, 1H), 5.16 (m, 1H), 4.46 (t, J= 6.6Hz, 2H), 2.66 (t, J= 7.2Hz, 2H), 2.25 (t, J= 7.2Hz, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.14 (m,2H), 2.06 (m, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.60 (s, 3H)
例３：Ａｂ（Ｍ）−ＣＡＡＸのプレニル化
３−１．プレニル化方法
NBD-GPP（トリス−アンモニウム［３，７−ジメチル−８−（７−ニトロ−ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−オクタ−２，６−ジエン−１］ピロホスファート）およびＦＴアーゼ（#344146、Calbiochem、USA）、またはNBD-FPP（#LI-013、Jena Bioscience、Germany）およびＧＧＴアーゼＩ（#345852, Calbiochem, USA）を用いて、Ａｂ（Ｍ）−ＣＡＡＸのプレニル化を行った。
プレニル化反応は、３０℃で３時間、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ２および５ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファー溶液を用いて行った。反応が完了した後、SDS-PAGE分析を行った。イメージアナライザー（ChemiDoc XRS+、BioRad、USA）を用いて、蛍光タンパク質のバンドを同定し、プレニル化反応が起こったことを確認した。
３−２．ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いるハーセプチン−ＨＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
ハーセプチン−ＨＣ−ＧＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ（示さず）、ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよびハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を、上記の方法においてNBD-GPPおよびＦＴアーゼを用いてプレニル化した。それぞれの抗体の重鎖に対応するタンパク質バンド（約５０Ｋダルトン）において蛍光を検出した。この結果は、各々が多様な長さのスペーサーを有するハーセプチン−ＨＣ−ＣＡＡＸ抗体を、プレニル化することができたことを確認した（図１２）。
３−３．ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いるハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
ハーセプチン−ＬＣ−ＧＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ５ＣＶＩＭ、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭよびハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を、上記の方法においてNBD-GPPおよびＦＴアーゼを用いて、プレニル化した。それぞれの抗体の軽鎖に対応するタンパク質バンド（約２５Ｋダルトン）において蛍光を検出した。この結果は、各々が多様な長さのスペーサーを有するハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸ抗体を、プレニル化することができたことを確認した（図１３）。
３−４．ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いる抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を、上記の方法においてNBD-GPPおよびＦＴアーゼを用いてプレニル化した。それぞれの抗体の重鎖に対応するタンパク質バンド（約５０Ｋダルトン）において蛍光を検出した。この結果は、各々が多様な長さのスペーサーを有する抗ｃＭＥＴ−ＨＣ−ＣＡＡＸ抗体を、プレニル化することができたことを確認した（図１４）。
３−５．ＦＴアーゼおよびNBD-GPPを用いる抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよび抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を、上記の方法においてＮＢＤ−ＧＰＰおよびＦＴアーゼを用いてプレニル化した。それぞれの抗体の軽鎖に対応するタンパク質バンド（約２５Ｋダルトン）において蛍光を検出した。この結果は、各々が多様な長さのスペーサーを有する抗ｃＭＥＴ−ＬＣ−ＣＡＡＸ抗体を、プレニル化することができたことを確認した（図１５）。
３−６．ＧＧＴアーゼＩおよびNBD-FPPを用いるハーセプチン−ＨＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
ハーセプチン−ＨＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ抗体を、上記の方法においてNBD-FPPおよびＧＧＴアーゼＩを用いてプレニル化した。Ｃ末端においてＧ１０スペーサーを介してＣＡＡＸ−モチーフに結合した抗体の重鎖に対応するタンパク質バンド（約５０Ｋダルトン）において、蛍光を検出した。この結果は、ハーセプチン−ＨＣ−ＣＡＡＸ抗体をＧＧＴアーゼＩによりプレニル化することができたことを確認した（図１６）。
３−７．ＧＧＴアーゼＩおよびNBD-FPPを用いるハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
上記の方法においてNBD-FPPおよびＧＧＴアーゼＩを用いて、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＬＬ抗体をプレニル化した。Ｃ末端においてＧ１０スペーサーを介してＣＡＡＸ−モチーフに結合した抗体の軽鎖に対応するタンパク質バンド（約２５Ｋダルトン）において蛍光を検出した。この結果は、ハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸ抗体をＧＧＴアーゼＩによりプレニル化することができたことを確認した（図１６）。
３−８．ＦＴアーゼおよびイソ基質を用いるハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸのプレニル化
ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ ７ ＣＶＩＭ
上記の方法においてLCB14-0512およびＦＴアーゼを用いて、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ抗体をプレニル化した。プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ抗体を、ＰＮＧアーゼＦで処置することなく還元条件においてLC/MS分析に供する場合、重鎖および軽鎖の理論上の分子量が、それぞれ、５０，５９７ダルトンおよび２４，４８０ダルトンとなることが予測された。図１７において示すとおり、重鎖および軽鎖の実験による分子量は、それぞれ、５０，６００ダルトンおよび２４，４７９ダルトンであると測定された。理論上の分子量値と実験による分子量値との間の差異は、標準誤差範囲内であった。この結果は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ抗体がＦＴアーゼおよびイソ基質（LCB14-0512）によりプレニル化されたことを確認した。
ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ １０ ＣＶＩＭ
上記の方法においてLCB14-0512およびＦＴアーゼを用いて、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体をプレニル化した。プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体を、ＰＮＧアーゼＦで処置することなく還元条件においてLC/MS分析に供する場合、重鎖および軽鎖の理論上の分子量が、それぞれ、５０，５９６ダルトンおよび２４，６５１ダルトンとなることが予測された。図１８において示すとおり、重鎖および軽鎖の実験による分子量は、それぞれ、５０，６０１ダルトンおよび２４，６５１ダルトンであると測定された。理論上の分子量値と実験による分子量値との間の差異は、標準誤差範囲内であった。この結果は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ１０ＣＶＩＭ抗体がＦＴアーゼおよびイソ基質（LCB14-0512）によりプレニル化されたことを確認した。
例４：クリックケミストリーを用いることによる薬物コンジュゲーション
４−１．プレニル化されたＡｂ（Ｍ）−ＣＡＡＸの再酸化
ダイアフィルトレーションを行って、上記の方法に従って調製されたプレニル化ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ中の過剰な試薬を取り除いた。ＣｕＳＯ４を用いて抗体を再酸化した。ダイアフィルトレーションを行って、ＣｕＳＯ４を取り除いた。
４−２．クリックケミストリーおよびリンカー-薬物を用いるＡｂ（Ｍ）−ＣＡＡＸの薬物コンジュゲーション
再酸化されたプレニル化ハーセプチン-LC-G7CVIMと化合物LCB14-0536との間のクリックケミストリー反応を１０分間行った。生じたコンジュゲート（LCB14-0104）（図２６）を、LC/MS分析に供した。抗体を、ＰＮＧアーゼＦで処置することなく還元条件においてLC/MS分析に供する場合、重鎖および軽鎖の理論上の分子量が、それぞれ、４９，１５３ダルトンおよび２５，４１０ダルトンとなることが予測された。図１９において示すとおり、重鎖および軽鎖の実験による分子量は、それぞれ、４９，１５４ダルトンおよび２５，４０８ダルトンであると測定された。理論上の分子量値と実験による分子量値との間の差異は、標準誤差範囲内であった。この結果は、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ抗体が、クリックケミストリー反応により薬物とコンジュゲートを形成したことを確認した。
４−３．ハーセプチン−ＬＣ−ＣＡＡＸ−薬物コンジュゲートの分析
コンジュゲートLCB14-0101を、Ether-5PWカラム（７．５×７５ｍｍ、１０μｍ、Tosoh Bioscience、USA）による疎水性相互作用クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィーに供した。１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）をバッファーＡとして用い、２０％イソプロピルアルコールを含む５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）をバッファーＢとして用いた。９０％Ａ／１０％Ｂを５分間保持した。９０％Ａ／１０％Ｂから１０％Ａ／９０％Ｂまでの直線勾配を用いて、次の３０分間、溶離を行った。流速および温度は、それぞれ、０．８ｍＬ／分および２５℃として設定した。その後、２５４および２８０ｎｍの両方において、検出を行った。未修飾のハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよびプレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭを、対照として用いた。未修飾のハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭ、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭおよびコンジュゲートLCB14-0101の反応時間は、それぞれ、９．６、１１．７および１２．４分間であった（図２０）。
例５：ADCの抗増殖性
５−１．細胞株
市販のヒト乳癌細胞株MCF-7（HER2陰性〜正常）、MDA-MB-468（HER2陰性）およびSK-BR-3（HER2陽性）を用いた。市販の細胞株について提供される推奨規格に従って、細胞株を培養した。
５−２．試験試料
抗体として、市販のハーセプチン抗体およびハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭを用いた。薬物として、LCB14-0537（MMAF）、LCB14-0508（MMAF-OMe）およびLCB14-0562（MMAE）を用いた。タンパク質−活性剤コンジュゲートとして、LCB14-0101、LCB14-0102およびLCB14-0103（図２６）を用いた。LCB14-0512を用いてハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭをプレニル化した。LCB14-0592を用いて、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭをクリック反応に供し、β−グルクロニドリンカー(BG)-MMAFをコンジュゲートし、それによりLCB14-0101を調製した。加えて、LCB14-0589を用いて、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭをクリック反応に供し、Val-Citリンカー(VC)-MMAF-OMeをコンジュゲートし、それによりLCB14-0102を調製した。さらに、LCB14-0598を用いて、プレニル化されたハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭをクリック反応に供し、β−グルクロニドリンカー(BG)-MMAEをコンジュゲートし、それによりLCB14-0103を調製した。
５−３．試験方法
癌細胞株に関する抗体、薬物およびコンジュゲートの抗増殖活性を測定した。９６ウェルの組織培養プレート中に、１ウェルあたり１×１０４細胞において細胞を播種した。２４時間のインキュベーションの後で、抗体、薬物およびコンジュゲートを多様な濃度において添加した。７２時間後の生細胞の数をSRB色素を用いて係数した。吸光度を５４０ｎｍにおいてSpectraMax 190（Molecular Devices, USA）を用いて測定した。
５−４．試験結果
LCB14-0101（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ ７ ＣＶＩＭ−ＢＧ−ＭＭＡＦ）
ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭは、MCF-7、MDA-MB-468およびSK-BR-3について、１０μｇ／ｍＬ以上のＩＣ５０を有した。LCB14-0101（MMAFコンジュゲート）は、HER2を発現しない化合物または低いレベルにおいて発現するMCF-7およびMDA-MB-468について、それぞれ８．０９μｇ／ｍＬおよび４．１８μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有したが、HER2を過剰発現するSK-BR-3については、０．１１μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した。その優れた阻害活性に加えて、LCB14-0101は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭよりも約４０〜８０倍選択性が高い。したがって、LCB14-0101が細胞傷害性の薬効力および抗HER2選択性の両方を有することが確認される（図２１）。
LCB14-0102（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ ７ ＣＶＩＭ−ＶＣ−ＭＭＡＦ−ＯＭ）
ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭは、MCF-7およびSK-BR-3について１０μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した。LCB14-0102（MMAF-OMeコンジュゲート）は、MCF-7について４．３８μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有し、一方、SK-BR-3については０．１５μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した。その優れた阻害活性に加えて、LCB14-0102は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭよりも約３０倍選択性が高い。したがって、LCB14-0102が細胞傷害性の薬効力および抗HER2選択性の両方を有することが確認される（図２２）。
LCB14-0103（ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ ７ ＣＶＩＭ−ＢＧ−ＭＭＡＥ）
LCB14-0103（MMAEコンジュゲート）は、MCF-7について７．２５μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有し、一方、SK-BR-3については０．０７２μｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した。その優れた阻害活性に加えて、LCB14-0103は、ハーセプチン−ＬＣ−Ｇ７ＣＶＩＭよりも約１００倍選択性が高い。したがって、LCB14-0103が細胞傷害性の薬効力および抗HER2選択性の両方を有することが確認される（図２３）。
他の態様
前述の記載から、本明細書において記載される本発明に対して、それを多様な用途および条件に対して適応させるために、変形および改変が行われてもよいことが理解されるであろう。かかる態様もまた、以下の請求の範囲の範囲内である。
本明細書における変数の任意の定義における要素の列記の記述は、列記される要素のうちの任意の単一の要素または組み合わせ（または部分的組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様として、または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせにおけるものとしてのその態様を含む。
本明細書において記載される全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が具体的におよび個々に参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
[１] イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を含むタンパク質−活性剤コンジュゲートであって、前記活性剤が、前記アミノ酸モチーフにおいてタンパク質に共有的に連結されている、前記コンジュゲート。
[２] タンパク質が、
（ｉ）タンパク質のカルボキシ末端における欠失；
（ｉｉ）タンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加；ならびに
（ｉｉｉ）タンパク質のカルボキシ末端における欠失、およびタンパク質のカルボキシ末端におけるオリゴペプチドまたはポリペプチドの付加；
から本質的になる群より選択される修飾を含み、該修飾が、前記アミノ酸モチーフに付着している、１に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[３] タンパク質が、抗体または抗原性ポリペプチドのフラグメントである、１または２に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[４] タンパク質がモノクローナル抗体である、３に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[５] モノクローナル抗体の少なくとも１つの軽鎖および／または少なくとも１つの重鎖が、アミノ酸モチーフを有するアミノ酸領域を含む、４に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[６] イソプレノイドトランスフェラーゼがＦＴアーゼまたはＧＧＴアーゼである、１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[７] 活性剤が、薬物、毒素、アフィニティーリガンド、検出プローブまたはそれらの組み合わせである、１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[８] アミノ酸モチーフが、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす、１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[９] アミノ酸モチーフが、少なくとも１つのリンカーを介して活性剤に共有的に連結されている、１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１０] リンカーが、イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るイソプレニル誘導体である、９に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１１] リンカーが、以下の式（Ｉ）：
式中、
Ｐ １ およびＹは、独立して、第１の官能基（ＦＧ１）を含む基であり、ＦＧ１は、アセチレン、アジド、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ケトン、ニトロベンゾフラン（ＮＢＤ）、ダンシル、フルオレセイン、ビオチン、およびローダミンからなる群より選択され、
Ｌ １ は、（ＣＨ ２ ） ｒ Ｘ ｑ （ＣＨ ２ ） ｐ であり、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ １ −、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ １ −、−ＮＲ １ Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ １ ＳＯ ２ −、−ＳＯ ２ ＮＲ １ −、−（ＣＨ＝ＣＨ）−またはアセチレンであり、
Ｒ １ は、水素、Ｃ １−６ アルキル、Ｃ １−６ アルキルアリールまたはＣ １−６ アルキルヘテロアリールであり、
ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
ｑは、０〜１の整数であり、および
ｎは、１〜４の整数である
により表わされる、９または１０に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１２] 活性剤が、ＦＧ１と反応することができる第２の官能基（ＦＧ２）を含む基に付着しており、ここでＦＧ２は、アセチレン、ヒドロキシルアミン、アジド、アルデヒド、ヒドラジン、ケトンおよびアミンからなる群より選択される、９〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１３] 活性剤が、−（ＣＨ ２ ） ｒ Ｘ ｑ （ＣＨ ２ ） ｐ −または−［ＺＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ（ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ） ｗ ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｚ］−を介してＦＧ２を含む基に付着しており、ここで、
Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ １ −、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ １ −、−ＮＲ １ Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ １ ＳＯ ２ −または−ＳＯ ２ ＮＲ １ −であり
Ｚは、酸素、硫黄またはＮＲ １ であり、
Ｒ １ は、水素、Ｃ １−６ アルキル、Ｃ １−６ アルキルアリールまたはＣ １−６ アルキルヘテロアリールであり、
ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
ｑは、０〜１の整数であり、ならびに
ｗは、０〜６の整数である、
１２に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１４] −（ＣＨ ２ ） ｒ Ｘ ｑ （ＣＨ ２ ） ｐ −または−［ＺＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ（ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ） ｗ ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｚ］−が、（ｉ）カテプシンＢにより切断され得るペプチドまたは（ｉｉ）β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドに付着する、１３に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１５] カテプシンＢにより切断され得るペプチドが、
である、１４に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１６] β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドが、
である、１４に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート。
[１７] １に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するための方法であって、以下：
（ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させること；
（ｂ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、発現されたタンパク質を、第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質と酵素的に反応させ、それにより官能化されたタンパク質を生成すること；
（ｃ）第２の官能基（ＦＧ２）を活性剤に付着させ、それにより官能化された活性剤を生成すること；ならびに
（ｄ）官能化されたタンパク質を官能化された活性剤と反応させ、それにより、１に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲートを生成すること
を含む、前記方法。
[１８] アミノ酸モチーフが、タンパク質のカルボキシ末端において存在する、１７に記載の方法。
[１９] アミノ酸モチーフが、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす、１７または１８に記載の方法。
[２０] アミノ酸モチーフがＣＡＡＸであり、およびここで方法がさらに、工程（ｂ）の後でアミノ酸モチーフからＡＡＸを取り除くことを含む、１９に記載の方法。
[２１] ＦＧ２が、少なくとも１つのリンカーにより活性剤に付着する１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
[２２] 官能化されたタンパク質と官能化された活性剤との間の反応が、クリックケミストリー反応、またはヒドラゾンおよび／もしくはオキシム形成である、１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
[２３] ＦＧ１がアジド基でありＦＧ２がアセチレン基であるか、またはＦＧ１がアセチレン基でありＦＧ２がアジド基である、２２に記載の方法。
[２４] ＦＧ１がアルデヒドまたはケトン基でありＦＧ２がヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであるか、ＦＧ１がヒドラジンまたはヒドロキシルアミンでありＦＧ２がアルデヒドまたはケトンである、２２に記載の方法。
[２５] １に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲートを調製するための方法であって、以下：
（ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを有するタンパク質を発現させること；
（ｂ）イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質を活性剤に付着させること；ならびに
（ｃ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、発現されたタンパク質をイソ基質に付着した活性剤と酵素的に反応させること
を含む、前記方法。
[２６] アミノ酸モチーフが、タンパク質のカルボキシ末端において存在する、２５に記載の方法。
[２７] アミノ酸モチーフが、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘは、イソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす、２５または２６に記載の方法。
[２８] イソ基質が、少なくとも１つのリンカーにより活性剤に付着する、２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
[２９] １〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲートを含む組成物。
[３０] タンパク質−活性剤コンジュゲートの均質な混合物である、２９に記載の組成物。
[３１] タンパク質が、抗体または抗原性ポリペプチドのフラグメントである、３０に記載の組成物。
[３２] 対象における標的細胞に活性剤を送達するための方法であって、１〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート、または２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
[３３] 標的細胞が癌細胞である、３２に記載の方法。
[３４] 標的細胞が、病原体を含む細胞である、３２に記載の方法。
[３５] 病原体が、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫である、３４に記載の方法。
[３６] それを必要とする対象を処置する方法であって、１〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲートまたは２９〜３１のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
[３７] 対象が癌を有する、３６に記載の方法。
[３８] 対象が、病原体による感染を有する、３６に記載の方法。
[３９] 病原体が、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫である、３８に記載の方法。
[４０] 活性剤が、免疫調節性化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗寄生虫剤である、１〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質−活性剤コンジュゲート、組成物または方法。

Claims (23)

  1. イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフに連結されたＣ末端を有する抗体を含む抗体−活性剤コンジュゲートであって、前記活性剤が、前記アミノ酸モチーフのシステイン残基のチオール部位に連結されている、前記イソプレノイドトランスフェラーゼにより認識され得るイソプレノイド単位に共有的に連結されている、前記コンジュゲート。
  2. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
  3. アミノ酸モチーフが、モノクローナル抗体の少なくとも１つの軽鎖および／または少なくとも１つの重鎖のＣ末端に存在する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
  4. アミノ酸モチーフが、ＣＡＡＸ、ＸＸＣＣ、ＸＣＸＣまたはＣＸＸであり、ここで、Ｃはシステインを表わし、Ａは脂肪族アミノ酸を表わし、Ｘはイソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸を表わす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
  5. イソプレノイド単位が、イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質であり、および少なくとも１つのリンカーによって活性剤に付着されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
  6. 活性剤が、薬物、毒素、アフィニティーリガンド、検出プローブ、免疫調節性化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗寄生虫剤またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲートを調製するための方法であって、
    （ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフに付着された抗体を、第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質と酵素的に反応させ、それにより官能化された抗体を生成すること；および
    （ｂ）官能化された抗体を、第１の官能基（ＦＧ１）と反応する第２の官能基（ＦＧ２）に付着された官能化された活性剤と反応させ、それにより抗体−活性剤コンジュゲートを生成すること
    を含む、前記方法。
  8. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲートを調製するための方法であって、
    （ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフに付着された抗体を、第１の官能基（ＦＧ１）を有する少なくとも１つのイソ基質と酵素的に反応させ、それにより官能化された抗体を生成すること；
    （ｂ）第２の官能基（ＦＧ２）を活性剤に付着させ、それにより官能化された活性剤を生成すること；および
    （ｃ）官能化された抗体を、官能化された活性剤と反応させ、それにより抗体−活性剤コンジュゲートを生成すること
    を含む、前記方法。
  9. ＦＧ２が、少なくとも１つのリンカーによって活性剤に付着されている、請求項７または８に記載の方法。
  10. リンカーが、−（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−を含み、ここで、
    Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−または−ＳＯ２ＮＲ１−であり
    Ｚは、酸素、硫黄またはＮＲ１であり、
    Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり、
    ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
    ｑは、０〜１の整数であり、ならびに
    ｗは、０〜６の整数である、
    請求項９に記載の方法。
  11. −（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐ−または−［ＺＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｗＣＨ２ＣＨ２Ｚ］−が、（ｉ）カテプシンＢにより切断され得るペプチドまたは（ｉｉ）β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドに付着する、請求項１０に記載の方法。
  12. カテプシンＢにより切断され得るペプチドが、
    である、請求項１１に記載の方法。
  13. β−グルクロニダーゼにより切断され得るグルクロニドが、
    である、請求項１１に記載の方法。
  14. 抗体がモノクローナル抗体であり、および抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖が、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフに付着されている、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. リンカーが、式（Ｉ）：
    式中、
    Ｐ１およびＹは、独立して、第１の官能基（ＦＧ１）を含む基であり、
    Ｌ１は、（ＣＨ２）ｒＸｑ（ＣＨ２）ｐであり、
    Ｘは、酸素、硫黄、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１−、−ＮＲ１Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ１ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ１−、−（ＣＨ＝ＣＨ）−またはアセチレンであり、
    Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアリールまたはＣ１−６アルキルヘテロアリールであり、
    ｒおよびｐは、独立して、０〜６の整数であり、
    ｑは、０〜１の整数であり、および
    ｎは、１〜４の整数である、
    により表わされる構造を有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 官能化された抗体と官能化された活性剤との間の反応が、クリックケミストリー反応、またはヒドラゾンおよび／もしくはオキシム形成である、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 請求項１６に記載の方法であって、
    （ｉ）ＦＧ１がアジド基でありＦＧ２がアセチレン基であるか、またはＦＧ１がアセチレン基でありＦＧ２がアジド基である；または
    （ｉｉ）ＦＧ１がアルデヒドまたはケトン基でありＦＧ２がヒドラジンまたはヒドロキシルアミンであるか、ＦＧ１がヒドラジンまたはヒドロキシルアミンでありＦＧ２がアルデヒドまたはケトンである、
    前記方法。
  18. イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフに付着された抗体を、活性剤に付着されたイソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質と酵素的に反応させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲートを調製するための方法。
  19. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲートを調製するための方法であって、
    （ａ）イソプレノイドトランスフェラーゼのイソ基質を活性剤に付着させること；および、
    （ｂ）イソプレノイドトランスフェラーゼを用いて、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識され得るアミノ酸モチーフに付着された抗体を、イソ基質に付着された活性剤と酵素的に反応させること
    を含む、前記方法。
  20. 請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法によって調製される、抗体−活性剤コンジュゲート。
  21. 薬学的に受容可能な賦形剤ならびに請求項１〜６および２０のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲートを含む、組成物。
  22. 治療に使用するための請求項１〜６および２０のいずれか一項に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
  23. 治療が、癌、疾患、または病原体による感染の予防または処置である、請求項２２に記載の抗体−活性剤コンジュゲート。
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