KR20160122127A - C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법 - Google Patents

C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법 Download PDF

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존 뱁쿡
제임스 알 리치
젠 피터 버크비스트
스튜어트 다니엘 반셔
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Abstract

본 개시내용은 C-말단 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드뿐만 아니라 항체 및 이러한 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 함유하는 항체 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 C-말단 연장부는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 작용제에 컨쥬게이팅된 본 개시내용의 항체를 포함하는 컨쥬게이트가 또한 제공된다. 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공되며, 본 개시내용의 변형된 항체 및 컨쥬게이트의 제조방법 및 용도가 제공된다.

Description

C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법{ANTIBODIES COMPRISING C-TERMINAL LIGHT CHAIN POLYPEPTIDE EXTENSIONS AND CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e))에 의하여, 본 출원은 2013년 12월 23일자로 출원된 미국 가출원 특허 일련번호 제61/920,425호의 출원일에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
치료 중인 특정 질환의 병인의 근원이 되는 세포에 대해 개선된 선택성을 지니는 치료제를 개발하기 위한 상당한 진보가 최근에 이루어졌다. 항체의 항원 선택성은 약물 페이로드(drug payload)의 항원-특이적 전달을 제공하도록 이용되었다.
이러한 약물-보유 항체는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서 지칭된다. ADC는 일반적으로 종종 링커를 통해 약물(예를 들어, 세포독성 약물)에 화학적으로 또는 효소적으로 결합된 항체로 구성된다. ADC는 전형적으로 순환에서 안정하게 되고 항원-특이적 결합 후 세포내 약물 방출을 달성하고, 일부 경우에 ADC의 내재화(internalization)를 달성하도록 설계된다. ADC는 세포 표적에 "페이로드"(예컨대 세포독성 약물)를 전달하도록 설계될 수 있기 때문에, 작용제에 의한 표적 세포 조절의 효율(예를 들어, 표적 세포 사멸)은 대응하는 항체 또는 약물 단독에 비해 ADC와 관련하여 훨씬 더 클 수 있다.
항체의 선택된 부위(들)에서 약물 페이로드의 컨쥬게이션을 제공하는 ADC는 항체 약물 컨쥬게이트 제조에서 생성물의 균질성에 대한 요망을 포함하는 다수의 이유로 관심 대상이다. 이를 위하여, 일부 그룹은 부위-특이적 페이로드 부착을 용이하게 하는 한편 항체 구조 및 기능을 유지하는 시도에서 항체 내의 특이적 부위에서의 아미노산 치환을 탐구하였다. 예를 들어, 셴(Shen) 등은 컨쥬게이트 안정성 상에서 부위 선택의 영향을 나타내기 위해 항체 중쇄 및 경쇄 내의 다양한 위치에서 시스테인 치환을 조직적으로 시험하였다(예를 들어, Nat. Biotech., 30:184-189, 2012). 특히, 이들 연구는 항체 상의 부착 부위의 접근성이 얻어진 ADC의 안정성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타내었다.
더 나아가, 중쇄와의 경쇄 결합을 포함하는 항체 안정성에 부정적으로 영향을 미치는 변형은 ADC 안정성과 마찬가지로 항원에 대해 항원 친화도를 손상시킴으로써 독성을 증가시키고, 특이성을 감소시키며 효용을 감소시킬 수 있다. 얻어진 ADC의 항체 친화도 또는 안정성을 상당히 손상시키는 일 없이 부위-특이적 방식으로 페이로드 부착될 수 있는 위치결정 또는 생성 부위가 고도로 요망된다.
항체의 항원 특이성은 또한 진단 또는 예후 결정인자 및 치료법의 과정에 영향을 미치는, 표지된 작용제를 혼입하고 에피토프 및/또는 세포를 인식하는 진단 및 영상화 도구를 제공하기 위해 이용되었다. 이러한 진단 및 예후 도구는 항원 검출을 위한 도구 항체의 친화도에 의존하며, 특이적 신호전달을 위한 도구 항체에 의해 표지된 작용제의 체류에 의존한다. 따라서, ADC와 같이, 얻어진 컨쥬게이트의 항체 친화도 또는 안정성을 손상시키는 일 없이 부위 특이적 방식으로 표지 부착될 수 있는 위치결정 또는 생성 부위가 고도로 요망된다.
본 개시내용은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체 및 항체 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 C-말단 연장부는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 작용제에 컨쥬게이팅된 본 개시내용의 항체를 포함하는 컨쥬게이트가 또한 제공된다. 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공되며, 본 개시내용의 항체 및 컨쥬게이트의 제조방법 및 용도가 제공된다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 C-말단의 아미노산 연장부는 항원에 특이적으로 결합하지 않는다(예를 들어, 연장부는 항체의 항원-결합 부분 또는 항체 단편의 항원-결합 부분을 포함하지 않는다).
특정 양상에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 모노에피토프 항원-결합 이량체를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 모노에피토프 항원-결합 이량체는 중쇄 폴리펩타이드 및 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하며, 이때 연장부는 시스테인 잔기를 포함한다. 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 동일한 에피토프에 결합될 수 있다. 다른 양상에서, 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 상이한 에피토프에 결합한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 요약한 임의의 항체의 C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 아미노산 스페이서를 포함한다. 특정 양상에서, 스페이서는 1 내지 30개의 아미노산, 3 내지 20개의 아미노산, 또는 4 내지17개의 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 글리신(G) 잔기 및 세린(S) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 하나 이상의 글리신(G) 잔기 및 하나 이상의 세린(S) 잔기로 이루어질 수 있다. 이러한 스페이서는 선택적으로 서열 GGGS를 가진다. 특정 실시형태에서, 연장부는 내인성 인간 아미노산 서열 또는 변형된 인간 아미노산 서열을 포함한다. 이들은 인간 항체 힌지 영역 서열, T-세포 수용체 서열 또는 다른 인간 서열을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 연장부는 세포외 단백질 아미노산 서열 및/또는 세포 표면 상에 존재하는 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 연장부는 하나 이상의 천연 유래 시스테인 잔기를 포함하는 내인성 인간 아미노산 서열을 포함한다. 이들은 인간 항체 힌지 영역 서열, T-세포 수용체 서열 또는 다른 인간 단백질 시스테인 함유 서열을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 연장부는 세포외 단백질 아미노산 서열 및/또는 세포 표면 상에 존재하는 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 연장부는 변형된 인간 아미노산 서열을 포함하되, 하나 이상의 시스테인은 삽입 또는 치환에 의해 내인성 인간 아미노산 서열 내로 도입되었다.
본 개시내용의 항체의 C-말단의 아미노산 연장부는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 예를 들어, C-말단의 아미노산 연장부는 2 내지 10개의 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다른 양상에서, 적어도 2개의 스페이서의 아미노산 서열은 상이하다. 특정 실시형태에 따르면, 시스테인은 각각의 스페이서 사이에 존재한다. 대안적으로, 적어도 2개의 스페이서는 연속적일 수 있으며, 예를 들어, C-말단의 아미노산 연장부 내 적어도 2개의 스페이서는 스페이서 사이에 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 시스테인)을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인에서 종결된다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 항체의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인은 환원된 설프하이드릴기를 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, 항체는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함한다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 직접 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 링커를 통해 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에에 간접적으로 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기를 거쳐서 경쇄의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인에 우선적으로 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 항체의 경쇄의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인을 통해 항체에 배타적으로 컨쥬게이팅된다. 특정 양상에서, 작용제는 치료제(예를 들어, 세포독성제) 또는 표지제(예를 들어, 생체내 조영제(imaging agent))이다. 특정 실시형태에 따르면, C-말단의 아미노산 연장부는 치료제 및 표지제로부터 독립적으로 선택된 작용제에 각각 컨쥬게이팅된 2 이상의 시스테인을 포함한다.
일 실시형태에서, 2 이상의 작용제는 독립적으로 2 이상의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기를 거쳐서 경쇄의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인에 우선적으로 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 항체의 경쇄의 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인을 통해 항체에 배타적으로 컨쥬게이팅된다.
본 개시내용의 항체는 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 항체는 IgG, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv, 이중특이성 항체 등일 수 있다.
또한 본 개시내용에 의해 컨쥬게이트가 제공된다. 일부 실시형태에 따르면, 컨쥬게이트는 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
특정 양상에서, 컨쥬게이트는 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 C-말단의 아미노산 연장부는 항원에 특이적으로 결합하지 않는다(예를 들어, 연장부는 항체의 항원-결합 부분 또는 항체 단편의 항원-결합 부분을 포함하지 않는다).
일부 실시형태에서, 컨쥬게이트는 적어도 하나의 모노에피토프 항원-결합 이량체를 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 모노에피토프 항원-결합 이량체는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는데, 연장부는 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 컨쥬게이트의 항체는 2개의 모노에피토프 항원-결합 이량체를 포함할 수 있다. 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 동일한 에피토프에 결합될 수 있다. 다른 양상에서, 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 상이한 에피토프에 결합한다.
컨쥬게이트는 추가로 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 항체에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함한다. 본 개시내용의 컨쥬게이트의 항체 및 작용제는 상기 요약하거나 또는 본 명세서에서 이하의 상세한 설명 및 실시예 부문에 기재하는 임의의 항체 또는 작용제 특징을 가질 수 있고, 본 명세서에 기재된 컨쥬게이션 전량 또는 동일한 컨쥬게이션 결과를 제공하는 임의의 다른 적합한 전략을 이용하여 컨쥬게이팅될 수 있다.
본 개시내용의 양상은 본 개시내용의 항체의 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제공된다. C-말단의 아미노산 연장부는 본 개시내용의 항체에 대해 상기 약술한, 그리고 본 명세서에서 이하의 상세한 설명 및 실시예 부분에 기재하는 바와 같은 임의의 특징을 포함할 수 있다. 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 본 개시내용의 핵산 및 벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주 세포)가 또한 제공된다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 약제학적 조성물은 본 개시내용의 항체 및 컨쥬게이트에 대해 상기 약술한, 그리고 본 명세서에서 이하의 상세한 설명 및 실시예 부분에 기재하는 바와 같은 임의의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 또한 치료가 필요한 환자에게 치료적 유효량의 임의의 약제학적 조성물, 본 개시내용의 항체 및 컨쥬게이트에 대해 상기 약술한, 그리고 본 명세서에서 이하의 상세한 설명 및 실시예 부분에 기재하는 바와 같은 임의의 항체 또는 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
항체 경쇄의 제조방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부의 외부의 시스테인 잔기의 환원을 거쳐서 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기의 우선적인(또는 "편재된") 환원을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부의 외부의 시스테인 잔기의 환원을 거쳐서 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기의 배타적인 환원을 포함한다.
특정 양상에서, C-말단의 아미노산 연장부는 2 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 양상에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부의 외부의 시스테인 잔기의 환원을 거쳐서 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기의 우선적인(또는 "편재된") 환원을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부의 외부의 시스테인 잔기의 환원을 거쳐서 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기의 배타적인 환원을 포함한다.
본 개시내용의 양상은 항체 컨쥬게이트의 제조방법을 포함한다. 상기 방법은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체에 작용제를 컨쥬게이팅하는 단계를 포함하며, 여기서 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다. 항체 컨쥬게이트의 제조방법은 항체에 대한 작용제의 컨쥬게이팅 전에 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 컨쥬게이팅은 말레이미드 반응 화학, 할로아세틸 반응 화학, 비닐 설폰 반응 화학 또는 피리딜 다이설파이드 반응 화학을 이용하여 환원된 설프하이드릴기에 작용제를 가교시키는 단계를 포함한다. 특정 양상에 따르면, C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된 작용제는 치료제 또는 표지제이다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기를 거쳐서 우선적으로 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다(C-말단의 아미노산 연장부 외부의 임의의 시스테인 잔기에는 컨쥬게이팅되지 않음).
특정 양상에서, C-말단의 아미노산 연장부는 2 이상의 시스테인 잔기를 포함하고, 2 이상의 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다. 이러한 항체 컨쥬게이트의 제조방법은 항체에 작용제를 컨쥬게이팅하기 전에 C-말단의 아미노산 연장부에서 시스테인의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 컨쥬게이팅은 말레이미드 반응 화학, 할로아세틸 반응 화학, 비닐 설폰 반응 화학 또는 피리딜 다이설파이드 반응 화학을 이용하는 환원된 설프하이드릴기에 작용제를 가교하는 단계를 포함한다.
특정 양상에 따르면, C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된 작용제는 치료제 및/또는 표지제이다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기를 거쳐서 우선적으로 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅되고, 임의의 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기에 대해서는 컨쥬게이팅되지 않는다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 포함하는 항체의 개략적 도시.
도 2는 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 컨쥬게이트의 개략적 도시.
도 3은 본 개시내용의 실시형태에 따른 2개의 예시적 항체 컨쥬게이트에 대한 암세포 생존도 데이터를 제공하는 도면.
도 4는 패널 A 및 B가 본 개시내용의 특정 실시형태에 따른 비컨쥬게이팅된 항체에 대한 항체 결합 데이터를 나타내는 도면.
도 5는 패널 A 및 B가 본 개시내용의 특정 실시형태에 따른 항체-약물 컨쥬게이트에 대한 항체 결합 데이터를 나타내는 도면.
도 6은 본 개시내용의 일 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체에 대한 시차주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC) 데이터를 도시한 도면.
도 7은 본 개시내용의 실시형태에 따른 항체에 대한 알렉사488(Alexa488) 컨쥬게이션을 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면.
도 8은 본 개시내용의 특정 양상에 따라 항체 또는 항체 컨쥬게이트가 투여된 마우스에서 시간에 따른 생체내 종양 용적 변화를 도시한 도면.
도 9는 패널 A 내지 C는 본 개시내용의 실시형태에 따라 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-VLcys1) 에 대한 크기 배제 크로마토그래피-질량분석법(SEC-MS) 데이터를 제공한 도면.
도 10은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-VLcys2)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 11은 패널 A 및 B가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-VLcys4)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 12는 패널 A 및 B가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP2)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 13은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP3)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 14은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP4)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 15는 패널 A 및 B가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP5)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 16은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP6)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 17은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP7)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 18은 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP10)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 19는 패널 A 내지 C가 본 개시내용의 실시형태에 따른 C-말단의 경쇄 연장부를 갖는 항체(T-SP11)에 대한 SEC-MS 데이터를 제공하는 도면.
도 20은 Tsp2-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.92였다.
도 21은 Tsp3-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.12였다.
도 22는 Tsp4-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.16이었다.
도 23은 Tsp5-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.46이었다.
도 24는 Tsp6-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 0.98이었다.
도 25는 Tsp9-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.64였다.
도 26은 Tsp10-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 2.0이었다.
도 27은 Tsp11-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 2.66이었다.
도 28은 TVLCys1-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 2.66이었다.
도 29는 TVLCys2-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 0.22였다.
도 30은 TVLCys4-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 0.70이었다.
도 31은 Tsp10-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 2.12였다.
도 32는 Tsp10-독소 4에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 3.76이었고, 여기서 평균 부착은 1.88이었다.
도 33은 Tsp10-독소 1에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 1.94였다.
도 34는 Tsp4-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 2.46이었다.
도 35는 Tsp6-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면(보다 대규모). 평균 약물 부하 값은 1.82였다.
도 36은 T-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 0.16이었다.
도 37은 Bsp10-MCvcPABC-MMAE에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면, 여기서 "B"는 브렌툭시맙 항-CD30 항체에 대한 약어임. 평균 약물 부하 값은 2.12였다.
도 38은 Bsp10-독소 4에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.96이었다.
도 39는 Bsp10-독소 5에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 2.18이었다.
도 40은 Bsp10-독소 3에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.98이었다.
도 41은 Bsp10-독소 6에 대한 컨쥬게이션 반응 생성물의 HIC 크로마토그래피를 도시한 도면. 평균 약물 부하 값은 1.87이었다.
도 42는 Tsp4-독소3, Tsp3-독소3, Tsp2-독소3 및 유리 독소1로 처리한 Her2 발현 HCC1954 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 43은 Tsp5-독소3, Tsp6-독소3, Tsp9-독소3 및 유리 독소1로 처리한 Her2 발현 HCC1954 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 44는 Tsp10-독소3, Tsp11-독소3, TVLCys1-독소3 및 유리 독소1로 처리한 Her2 발현 HCC1954 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 45는 Tsp4-독소3, Tsp3-독소3, Tsp2-독소3 및 유리 독소1로 처리한 HER2 항원 음성 주카트(Jurkat)에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 46은 Tsp5-독소3, Tsp6-독소3, Tsp9-독소3, 및 유리 독소1로 처리한 HER2 항원 음성 주카트에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 47은 Tsp10-독소3, Tsp11-독소3, TVLCys1-독소3, 및 유리 독소1로 처리한 HER2 항원 양성 HCC1954 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 48은 Tsp10-독소3, Tsp11-독소3, TVLCys1-독소3, 및 유리 독소1로 처리한 HER2 항원 음성 주카트에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 49는 Tsp10-독소3, Tsp11-독소3 및 TVLCys1-독소3으로 처리한 HER2 항원 양성 N87 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 50은 Tsp10-독소1 및 Tsp10-독소4로 처리한 HER2 항원 양성 N87 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 51은 Tsp10-독소1, 및 Tsp10-독소4로 처리한 HER2 항원 음성 주카트 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 52는 Tsp5-독소3, Tsp6-독소3 및 Tsp9-독소3으로 처리한 HER2 항원 양성 N87 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 53은 Tsp2-독소3, Tsp3-독소3 및 Tsp4-독소3으로 처리한 HER2 항원 양성 N87 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 54는 브렌툭시맙, 및 Bsp10으로 처리한 CD30 항원 양성 카르파스(Karpas) 299 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석의 플롯을 도시한 도면.
도 55는 Bsp10-독소5로 처리한 CD30 항원 양성 카르파스 299 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석의 플롯을 도시한 도면.
도 56은 Bsp10-독소3 및 Bsp10-독소4로 처리한 CD30 항원 양성 카르파스 299 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석의 플롯을 도시한 도면.
도 57은 Bsp10-독소6으로 처리한 CD30 항원 양성 카르파스 299 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석의 플롯을 도시한 도면.
도 58은 Bsp10-MCvcPABC-MMAE로 처리한 CD30 항원 양성 카르파스 299 세포에 의한 시험관내 세포 증식 분석의 플롯을 도시한 도면.
도 59는 고정 단백질 A 상에서 정제 후에 트라스투주맙 경쇄 연장부 변이체의 비-환원 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)을 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 좌에서 우로, 레인 1 내지 12: 분자 크기 마커; TSp2; TSp3; TSp4; TSp5; TSp6; TSp9; Tsp10; TSp11; TVLCys1; TVLCys2; TVLCys4. 레인 1의 크기 마커 사다리는 무결함 단백질이 약 150kDa이라는 것을 나타낸다.
도 60은 트라스투주맙 경쇄 연장부 변이체의 환원(+DTT) 변성 PAGE를 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 좌에서 우로, 레인 1 내지 12: 분자 크기 마커; TSp2; TSp3; TSp4; TSp5; TSp6; TSp9; Tsp10; TSp11; TVLCys1; TVLCys2; TVLCys4. 레인 1에서 크기 마커 사다리는 환원된 단백질이 약 50kDa의 중쇄 단편 및 약 25kDa의 경쇄 단편을 함유한다는 것을 나타낸다.
도 61은 트라스투주맙 경쇄 연장부 항체 약물 컨쥬게이트의 비환원 변성 PAGE를 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 좌에서 우로, 레인 1 내지 12: 분자 크기 마커; Tsp2-독소3(DAR 1.92); Tsp3-독소3(DAR 1.88); Tsp4-독소3 (DAR2.06); Tsp5-독소3(DAR 1.46); Tsp6-독소3(DAR 1.80); Tsp9-독소3(DAR 1.32); Tsp10-독소3(DAR 2.12); Tsp10-독소4(DAR 1.66); Tsp10-독소 1(DAR 2.04); Tsp11-독소3(DAR 2.02); TVLCys1-독소3(DAR 1.06).
도 62는 트라스투주맙 경쇄 연장부 항체 약물 컨쥬게이트의 환원(+DTT) 변성 PAGE를 나타내는 겔 이미지를 도시한 도면. 좌에서 우로, 레인 1 내지 12: 분자 크기 마커; Tsp2-톡신3(DAR 1.92); Tsp3-독소3(DAR 1.88); Tsp4-독소3(DAR 2.06); Tsp5-독소3(DAR 1.46); Tsp6-독소3(DAR 1.80); Tsp9-독소3(DAR 1.32); Tsp10-독소3(DAR 2.12); Tsp10-MP-독소4(DAR 1.66); Tsp10-독소 1(DAR 2.04); Tsp11-독소3(DAR 2.02); TVLCys1-독소3(DAR 1.06).
도 63은 열 안정성 분석을 이용하여 결정한 바와 같은 트라스투주맙 경쇄 연장부 항체 약물에 대한 안정성 데이터를 제공한 도면.
항체 경쇄 사이의 구조적 차이 및 항체 안정성에 대한 이의 영향을 평가하는 연구자들은 항체 경쇄의 C-말단에 대한 아미노산 첨가가 탈안정화 효과를 가질 것으로 예측하였다(Shen et al., mAbs 5:3, 418-431, 2013). 사실, 다른 연구자들은 다중 특이성 항체를 생성하기 위한 IgG 경쇄의 C 말단에 대한 scFv 및 단일 도메인 단백질 스캐폴드의 결합이 경쇄-중쇄 다이설파이드를 탈안정화시켜 부분적으로 조립된 IgG 융합 분자의 증가를 야기한다는 것을 보고하였다(Orcutt et al., Prot. Eng. Des. Sel, 23:221-228, 2010; Spangler et al., J Mol Biol, 422:532-544, 2012). 추가로, 페이로드 부착 부위의 용매 접근성은 ADC 안정성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다는 것이 보고되었다(Shen et al., Nat. Biotech., 30:184-189, 2012). 이들 보고와 대조적으로, 본 발명은 연장부로서 항체 경쇄의 C-말단에 공유적으로 연결된 C-말단의 아미노산 연장부(또한 본 명세서에서 "페이로드 어댑터"로서 지칭됨)는 페이로드의 안정한 부착지점을 제공하여 안정하고 항원에 대해 친화도를 보유하는 항체 페이로드를 생성할 수 있다는 놀라운 발견으로부터 부분적으로 유래된다.
따라서, 본 개시내용은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체 및 항체 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 C-말단 연장부는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 작용제에 컨쥬게이팅된 본 개시내용의 항체를 포함하는 컨쥬게이트가 또한 제공된다. 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공되며, 본 개시내용의 변형된 항체 및 컨쥬게이트의 제조방법 및 용도가 제공된다.
본 개시내용의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법을 더 상세하게 기재하기 전에, 본 개시내용의 이러한 양상은 기재된 특정 실시형태로 제한되지 않으며, 물론 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태의 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 개시내용의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법의 범주는 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 달리 문맥에서 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 범위의 상한과 하한 사이의 하한 단위의 1/10로 각각의 사이에 있는 값 및 언급된 범위에서 임의의 언급된 또는 사이에 있는 값은 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법에 포함된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한과 하한은 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위내에서 임의의 구체적으로 제한된 한계를 받는 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 해당되는 포함 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법에 포함된다.
수치적 값 앞에 용어 "약"이 선행되는 특정 범위가 본 명세서에서 제공된다. 용어 "약"은 본 명세서에서 그것이 선행하는 정확한 수뿐만 아니라 상기 용어가 선행하는 거의 또는 대략의 수에 대한 문자 그대로의 뒷받침을 제공하기 위해 사용된다. 수가 구체적으로 인용된 수의 거의 또는 대략인지를 결정함에 있어서, 거의 또는 대략의 비인용 수는 그것이 제시된 문맥에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 동등하게 제공되는 수일 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 임의의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법이 또한 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법을 이제 기재한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개개 간행물 및 특허가 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시되고, 간행물을 인용하는 것과 관련한 방법 및/또는 물질을 개시 또는 기재하기 위해 본 명세서에서 참고로 포함되는 것과 같이 본 명세서에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 전에 그의 개시내용에 대한 것이며, 본 발명이 선행 발명때문에 이러한 간행물보다 선행한다는 자격을 부여하지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공된 공개일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제의 공개일과 상이할 수 있다.
본 명세서에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 명확하게 언급되지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것을 주의한다. 예를 들어, "시스테인을 포함하는", 또는 "시스테인을 포함"으로서 기재되는 본 명세서에서 사용되는 C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 함유할 수 있다(즉, 연장부는 적어도 하나의 시스테인을 포함한다). 청구범위는 임의의 선택적 구성요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것이 추가로 주목된다. 이런 언급은 청구범위 구성요소의 인용과 관련하여 "유일하게", "단지" 등으로서 이러한 배타적 용어의 사용 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행사건 기초로서 작용하도록 의도된다.
명확함을 위해 별도의 실시형태와 관련하여 기재될 수 있는 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법의 특정 특징은 또한 단일 실시형태에서 조합으로 제공될 수 있다는 것이 인식된다. 대조적으로, 간략함을 위해 단일 실시형태와 관련하여 기재될 수 있는 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법의 다양한 특징이 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 구체적으로 포괄되며, 각각 및 모든 조합이 개개로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 이러한 조합이 조작 가능한 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법을 포괄하는 정도로 본 명세서에 개시된다. 추가로, 이러한 변수를 기재하는 실시형태에서 열거된 모든 하위 조합은 또한 본 발명의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법에 의해 구체적으로 포괄되며, 각각의 및 모든 이러한 하위 조합이 본 명세서에서 개개로 및 명확하게 개시된 것과 같이 본 명세서에 개시된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본 명세서에 기재되고 예시된 각각의 개개 실시형태는 본 발명의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 약제학적 조성물 및 방법의 범주 또는 정신으로부터 벗어나는 일 없이 임의의 다른 몇몇 실시형태의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 조합될 수 있는 별도의 구성성분 및 특징을 가진다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
정의
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 임의의 아이소타입, 즉, 전체 항체(예를 들어, 결국 전체 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체를 포함하는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 2개의 이형이량체로 구성되는 사량체로 구성되는 항체); 절반 항체(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 단일 이량체를 포함하는 항체); Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv, 이중특이성 항체 및 다이어바디를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 관심대상의 항원에 대해 특이적 결합을 보유하는 항체 단편(예를 들어, 전체 항체의 단편, 예컨대 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 단편); 키메라 항체; 단클론성 항체; 인간화된 항체(예를 들어, 인간화된 단클론성 항체 또는 인간화된 항체 단편); 또는 전체 인간 항체(인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체)의 항체 또는 면역글로불린을 포함한다. 또한 V-D-J 재배열의 결과로서 체세포 돌연변이 및/또는 N- 또는 P-뉴클레오타이드 첨가 및 결실을 갖는 인간 단클론성 항체가 포함된다. 또한 합성 서열이 CDR 내로 삽입된 인간 항체가 포함된다(예를 들어, 문헌[Miersch S & Sidhu SS (2012) Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods 57(4):486-98; 및 Knappik et al. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J. Mol . Biol . 296(1):57-86] 참조). 특정 양상에서, 본 개시내용의 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체), Fab, F(ab')2, 및 Fab'로부터 선택된다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각은 단일 항원-결합 부위, 및 잔여 "Fc" 단편을 지니고, 표기는 용이하게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원 조합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 수득한다.
"Fv"는 경쟁 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 포함한다. 이 영역은 단단한 비공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이는 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 정하도록 상호작용하는 입체배치이다. 총괄적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에도 불구하고, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
"Fab" 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서의 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 이들 도메인이 단일 폴리펩타이드쇄에 존재하는 경우, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하는데, 이는 sFv가 항원 결합을 위해 목적으로 하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다.
용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 지니는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 두 도메인을 짝짓게 하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝지어지게 되고, 2개의 항원-결합 부위를 생성한다.
본 명세서에 사용하는 바와 같은 "경쇄 폴리펩타이드"는 적어도 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 경쇄 폴리펩타이드는 부분적 또는 전장 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 포함할 수 있다. "전장 경쇄 폴리펩타이드"는 전장 경쇄 가변 영역(VL) 및 전장 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.
경쇄 폴리펩타이드는 임의의 척추동물 종(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간, 설치류 등)으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "중쇄 폴리펩타이드" 또는 "중쇄"는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 중쇄 폴리펩타이드는 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 부분적 또는 전장 항체 중쇄 불변 영역(CH)을 포함할 수 있다. "전장 중쇄 폴리펩타이드"는 전장 중쇄 가변 영역(VL) 및 전장 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 임의의 척추동물 종(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 설치류, 인간 등)으로부터의 항체(면역글로불린)의 중쇄 폴리펩타이드 및 면역글로불린의 임의의 부류가 포함된다. 중쇄 폴리펩타이드, 및 이러한 중쇄를 함유하는 항체는 중쇄 폴리펩타이드의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한 부류로 범주화된다. 5가지의 주된 부류의 면역글로불린이 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 이들 중 몇몇은 추가로 하위 부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나누어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합" 항체는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 항체, 예컨대 (i) 숙주 세포 내로 형질감염되는 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체; (ii) 재조합체, 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; (iii) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 이식된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체; 또는 (iv) 예를 들어, 시험관내 번역 기법을 포함하는 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Yin et al. (2012) Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system, Landes Bioscience, Volume 4, Issue 2] 참조)를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 항체는 인간화된, CDR 접합된, 키메라, 탈면역화 및 시험관내 생성 항체를 포함하며; 선택적으로 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 포함할 수 있다.
용어 "인간화된 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린, 절반 항체, 면역글로불린 쇄(예를 들어, 경쇄 폴리펩타이드) 또는 이들의 단편(예컨대 Fv, ScFv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)을 지칭한다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)일 수 있으며, 이때 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기는 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 라마, 낙타 또는 래트의 CDR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체에서도 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.
인간 경쇄 폴리펩타이드는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 더 나아가, 인간 중쇄 폴리펩타이드는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
"치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 질환 또는 장애 및/또는 수반되는 증상 중 적어도 하나를 완화시키거나 없애는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 질환 또는 장애를 "완화시키다"는 질환 또는 장애의 중증도 및/또는 증상의 발생 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"에 대한 본 명세서의 언급은 치유적, 일시적 및 예방적 치료에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"치료적 유효량" 또는 "효능있는 양"은 목적으로 하는 결과를 생성하기에 충분한 투약량, 예를 들어, 대조군에 비해 질환(예를 들어, 암 또는 관심대상의 임의의 다른 질환)의 증상의 감소와 같은 유리한 또는 목적으로 하는 치료적(예방적을 포함) 결과를 달성하기에 충분한 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 항체 또는 컨쥬게이트, 질환 및 그의 중증도 및 치료될 환자의 연령, 체중 등에 따라서 다를 것이다.
C-말단 연장부("페이로드 어댑터")를 갖는 경쇄 폴리펩타이드
일 양태에서, 본 개시내용은 항체뿐만 아니라 페이로드 어댑터를 포함하는 항체에 페이로드의 부착을 위한 페이로드 어댑터(또한 본 명세서에서 "C-말단의 아미노산 연장부" 또는 "C-말단 연장부"로서 지칭됨)를 제공한다.
본 개시내용의 페이로드 어댑터는 페이로드의 공유 부착을 위한 기질로서 작용하는 단백질이며, 각각의 페이로드 어댑터는 항체 경쇄의 C-말단 연장부를 구성함으로써 항체에 하나 이상의 페이로드를 연결한다. 페이로드 어댑터는 페이로드 부착을 위한 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다.
페이로드 및 페이로드 어댑터를 포함하는 항체가 안정성을 나타내고 항원에 대한 친화도를 보유하도록 본 개시내용의 페이로드 어댑터는 항체 경쇄의 C-말단의 연장부로서 발현될 수 있고, 적절한 화학의 사용에 의해 매우 다양한 페이로드에 대한 공유적 컨쥬게이션을 할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 페이로드 어댑더를 포함하는 항체는 그의 천연 항체 서열 내에서 시스테인 치환을 포함하지 않는데, 이는 경쇄의 C-말단에 대한 폴리펩타이드의 첨가에 부응하는 상보적 다이설파이드 결합을 달리 제공하도록 도입될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용의 페이로드 어댑터를 포함하는 항체는 모 항체에 존재하는 모든 시스테인 잔기를 함유한다. 일 실시형태에서, 페이로드 어댑터는 분자내 다이설파이드 결합 또는 다른 페이로드 어댑터를 지니는 다이설파이드 결합을 형성하지 않는 다중 시스테인 잔기를 포함한다.
일 실시형태에서, 페이로드 어댑터는 항원에 특이적으로 결합하지 않는다. 일 실시형태에서, 페이로드 어댑터는 본 발명의 항체 또는 항체 컨쥬게이트에 대한 에피토프 결합 활성에 기여하지 않는다. 이 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 및 항체 컨쥬게이트에 의한 항원 결합은 페이로드 어댑터 이외의 구성요소에 의해 결정된다. 일 실시형태에서, 페이로드 어댑터는 성장 인자 수용체, 예컨대 EGF 수용체)의 리간드 결합 도메인을 함유하지 않는다. 다른 실시형태에서, 페이로드 어댑터는 성장 인자 수용체의 리간드를 함유하지 않는다(예를 들어, EGF 수용체의 리간드를 함유하지 않는다).
특히 구체적으로, 상기 요약한 바와 같이, 본 개시내용은 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 C-말단 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 이러한 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체를 제공한다. C-말단 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드는 임의의 유형의 경쇄 폴리펩타이드(예를 들어, 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 폴리펩타이드)의 아미노산 서열을 함유할 수 있고, 임의의 유래의 관심 대상, 예를 들어, 임의의 척추동물 종(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 설치류, 인간, 등)의 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
용어 "C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부", "C-말단의 경쇄 아미노산 연장부", "C-말단 연장부", "페이로드 어댑터" 및 이들의 동등물은 본 명세서에서 다르게는 연장부가 없는 모 경쇄 폴리펩타이드에서 C-말단의 잔기를 구성하는 경쇄 폴리펩타이드의 잔기에 대해 C-말단에 위치된 아미노산(예를 들어, 시스테인) 또는 2 이상의 아미노산의 연속적 신장부를 지칭하기 위해 사용된다.
특정 양상에서, 연장부가 모 경쇄 폴리펩타이드에서 VL의 C-말단을 달리 구성하는 잔기에 대해 C-말단이 되도록(예를 들어, 잔기로부터 연장되도록) 모 경쇄 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역(VL)(예를 들어, 모 항체는 ScFv일 수 있음)만을 포함한다. 다른 양상에서, 연장부가 모 경쇄 폴리펩타이드에서 부분적 CL의 C-말단을 달리 구성하는 잔기에 대해 C-말단이 되도록(예를 들어, 잔기로부터 연장되도록), 모 경쇄 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역(VL) 및 부분적 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 연장부가 모 경쇄 폴리펩타이드에서 전장 CL의 C-말단을 달리 구성하는 잔기에 대해 C-말단이 되도록(예를 들어, 잔기로부터 연장되도록), 모 경쇄 폴리펩타이드는 전장 경쇄 가변 영역(VL) 및 전장 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 전장 경쇄 폴리펩타이드이다. 일 실시형태에 따르면, 모 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단을 연장시키는 것이 "연장부"의 부분으로서 모 서열을 "다시 첨가하는 것"을 포함하도록, 연장부의 N-말단 부분은 전장 모 경쇄 폴리펩타이드 내에 달리 존재하는 서열의 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 경쇄 연장부는 C-말단의 시스테인이 결실되는 위치에 대해 바로 N-말단의 잔기에 대해 C-말단이 되도록(예를 들어, 잔기로부터 연장되도록), 모 경쇄 폴리펩타이드는 전장 야생형 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단에 정상적으로 존재하는 말단의 시스테인의 결실을 포함한다. 일 실시형태에서, 모 경쇄 폴리펩타이드는 전장 야생형 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단에 정상적으로 존재하는 말단의 시스테인의 치환을 포함한다.
특정 양상에서, 모 항체는 절단된 중쇄 폴리펩타이드, 예를 들어, 중쇄 가변 영역(VH)만을 포함하는 중쇄 폴리펩타이드, 또는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)의 일부를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드를 가진다. 이들 양상에 따르면, C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부는 중쇄 폴리펩타이드 서열과 짝지어지지 않은(절단에 기인) 천연(예를 들어, 야생형) 경쇄 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 이러한 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부는 하나 이상의 비천연 아미노산(예를 들어, 모 경쇄 폴리펩타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 시스테인)을 추가로 포함할 수 있는데, 특정 양상에서 이는 2 이상의 아미노산의 비천연 서열일 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하며, 이 C-말단의 아미노산 연장부는 항원에 특이적으로 결합하지 않는다(예를 들어, 연장부는 항체의 항원-결합 부분 또는 항체 단편의 항원-결합 부분을 포함하지 않는다).
특정 양상에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 모노에피토프 항원-결합 이량체를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 모노에피토프 항원-결합 이량체는 중쇄 폴리펩타이드 및 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하며, 이때 연장부는 시스테인 잔기를 포함한다. 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 동일한 에피토프에 결합될 수 있다. 다른 양상에서, 각각의 2개의 모노에피토프 이량체는 상이한 에피토프에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "모노에피토프 항원-결합 도메인"은 중쇄 폴리펩타이드의 CDR과 경쇄 폴리펩타이드의 CDR의 상호작용에 의해 형성된 항원-결합 도메인을 나타낸다. 모노에피토프 항원-결합 도메인"은, 예를 들어, 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 이량체, 또는 단쇄 항체(ScFv)의 경우에 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 단량체 융합 단백질로서 정의될 수 있다. 따라서, 경쇄 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 모노에피토프 항원-결합 도메인에서, 경쇄 폴리펩타이드의 아미노산 연장부는 항원에 특이적으로 결합하지 않는다. 본 개시내용의 항체는 동일 또는 상이한 모노에피토프 항원-결합 이량체를 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 이형이량체의 이량체(즉, 사량체)를 포함하는 항체는 하기를 포함할 수 있다: 1) 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 제1 모노에피토프 항원-결합 도메인, 및 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 제2 모노에피토프 항원-결합 도메인(여기서 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하고, 제1 및 제2 모노에피토프 항원-결합 도메인은 동일한 에피토프에 결합함); 또는 2) 제1 및 제2 모노에피토프 항원 결합 도메인(여기서, 도메인의 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하며, 제1 모노에피토프 항원-결합 도메인의 항원-결합 영역은 제2 모노에피토프 항원-결합 도메인에 의해 결합되는 것과 상이한 에피토프에 결합한다.
C-말단 연장부는 임의의 목적으로 하는 길이일 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 연장부는 길이로 1 내지 200개의 아미노산, 1 내지 150개의 아미노산, 1 내지 100개의 아미노산, 1 내지 75개의 아미노산, 1 내지 50개의 아미노산, 1 내지 25개의 아미노산, 1 내지 20개의 아미노산, 1 내지 15개의 아미노산, 1 내지 10개의 아미노산, 또는 1 내지 5개의 아미노산이고, 길이로 5 내지 200개의 아미노산, 5 내지 150개의 아미노산, 5 내지 100개의 아미노산, 5 내지 75개의 아미노산, 5 내지 50개의 아미노산, 5 내지 25개의 아미노산, 5 내지 20개의 아미노산, 5 내지 15개의 아미노산, 또는 5 내지 10개의 아미노산일 수 있다. 특정 양상에서, 연장부는 길이로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산이다.
C-말단 연장부는 임의의 목적으로 하는 수의 시스테인, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 시스테인을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, C-말단 연장부는 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 시스테인을 함유한다. 일부 실시형태에서, C-말단 연장부는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 시스테인을 함유한다. 특정 양상에서, 연장부는 1 내지 5개 시스테인, 6 내지 10개 시스테인, 11 내지 15개 시스테인, 또는 16 내지 20개 시스테인을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, C-말단 연장부는 2 이상의 연속적 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 연장부는 2개의 인접한 시스테인에 대해 N-말단 및 C-말단의 비시스테인-함유 스페이서 서열을 갖는 2개의 인접한 시스테인을 포함할 수 있다. C-말단 연장부에서 연속적 시스테인(예를 들어, 2개의 인접한 시스테인)을 갖는 것은, 예를 들어, 컨쥬게이션 또는 표지 전략이 금속 킬레이션을 포함할 때, 컨쥬게이션 또는 표지 전략이 "브릿징"을 수반할 때(예를 들어, 다이할로-말레이미드 컨쥬게이션 화학 등에 의한 경우와 같이)의 용도를 발견한다. 특정 양상에서, 본 개시내용은 작용제(예를 들어, 약물 또는 표지제)가 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 다중의 연속적 시스테인(예를 들어, 2개의 인접한 시스테인)에 부착되는 컨쥬게이트 및 이의 제조방법을 제공한다.
일 실시형태에서, C-말단 연장부는 모 경쇄 말단의 시스테인과 함께 취해질 때 상기 기재한 바와 같은 용도를 발견하는 2개의 인접한 시스테인을 제공하는 N-말단의 시스테인을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 작용제(예를 들어, 약물 또는 표지제)가 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 다중의 비-연속적 시스테인에 부착된 컨쥬게이트 및 이의 제조방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 시스테인이 C-말단 연장부의 연속적 잔기가 아니도록, C-말단 연장부의 시스테인은 하나 이상의 스페이서에 의해 분리된다. "스페이서"는 연장부 내 2개의 시스테인 잔기 사이에 배치된 하나 이상의 구성적 비-시스테인 아미노산; 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단의 잔기를 달리 구성하는 것, 또는 경쇄 가변 영역 및 적어도 일부의 경쇄 불변 영역을 함유하는 이의 단편과 C-말단 연장부 내의 제1 시스테인 잔기 사이; 및/또는 선택적으로 연장부 내 대부분의 C-말단의 시스테인에 대해 C-말단에 배치된 하나 이상의 구성적 비-시스테인 아미노산을 의미한다. 다수의 스페이서가 C-말단 연장부에 제공될 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, C-말단 연장부는 1 내지 50개의 스페이서, 1 내지 40개의 스페이서, 1 내지 30개의 스페이서, 1 내지 20개의 스페이서, 1 내지 10개의 스페이서(예를 들어, 2 내지 10개의 스페이서) 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 스페이서를 포함할 수 있다.
C-말단 연장부가 2개 이상의 스페이서를 포함할 때, 각각의 스페이서는 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 연장부가 2개 이상의 스페이서를 포함할 때, 적어도 2개의 스페이서의 아미노산 서열은 상이할 수 있다. 연장부가 다중 스페이서를 포함할 때, 시스테인은 각각의 스페이서 사이에 존재할 수 있다. 다른 양상에서, 연장부가 다중 스페이서를 포함할 때, 적어도 2개의 스페이서는 연속적이며, 예를 들어, 스페이서는 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 분리되지 않는다.
스페이서는 임의의 20개의 비-시스테인, 천연 유래, 유전적으로 암호화가능한 아미노산(알라닌(A), 알기닌(R), 아스파라긴(N), 아스팔트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 글리신(G), 히스티딘(H), 아이소류신(I), 류신(L), 라이신(K), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및/또는 발린(V)) 또는 이들의 변이체(예를 들어, 번역후 변형의 결과로서 생기는 변이체), 천연 유래 비-암호가능한 또는 비-천연 아미노산을 포함할 수 있으며, 임의의 목적으로 하는 서열 및 길이를 가질 수 있다. 특정 양상에서, 스페이서는 1 내지 30개의 아미노산, 예컨대 3 내지 20개의 아미노산, 3 내지 15개의 아미노산, 3 내지 10개의 아미노산, 3 내지 5개의 아미노산을 포함하고, 예를 들어, 4 내지 17개의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 이상의 아미노산을 함유할 수 있고, 일부 예에서 30 이하 또는 25개 이상의 아미노산을 함유할 수 있으며, 임의의 목적으로 하는 아미노산 서열일 수 있고, 단, 스페이서는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다.
특정 양상에서, 스페이서는 적어도 하나의 글리신(G) 잔기 및 적어도 하나의 세린(S) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 하나 이상의 글리신 잔기 및 하나 이상의 세린 잔기를 함유할 수 있다.
관심 대상의 스페이서의 예는 서열 GGGS(서열번호 1)를 갖는 스페이서이다. 다른 양상에서, 스페이서는 임의의 다음의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이루어질 수 있다: AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 3); AKTTPKLGG(서열번호 4); SAKTTPKLGG(서열번호 5); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 6); SAKTTP(서열번호 7); SAKTTPKLGG(서열번호 8); RADAAP(서열번호 9); RADAAPTVS(서열번호 10); RADAAAAGGPGS(서열번호 11); RADAAAA(G4S)4(서열번호 12), SAKTTP(서열번호 13); SAKTTPKLGG(서열번호 14); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 15); ADAAP(서열번호 16); ADAAPTVSIFPP(서열번호 17); TVAAP(서열번호 18); TVAAPSVFIFPP(서열번호 19); QPKAAP (서열번호 20); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 21); AKTTPP(서열번호 22); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 23); AKTTAP(서열번호 24); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 25); ASTKGP(서열번호 26); ASTKGPSVFPLAP(서열번호 27); GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 28); GENKVEYAPALMALS(서열번호 29); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 30); GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 31); AA; GGGGS(서열번호 128); GGGGSSGGGGSS;(서열번호 131); 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체.
특정 양상에서, 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부는 내인성 인간 아미노산 서열 또는 변형된 인간 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 이들은 인간 항체 힌지 영역 서열, T-세포 수용체 서열, 또는 관심 대상의 임의의 다른 인간 단백질 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 아미노산 서열은 세포외 단백질 아미노산 서열뿐만 아니라 세포 표면 상에 존재하는 단백질의 세포외 도메인의 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 연장부는 하나 이상의 천연 유래 시스테인 잔기를 포함하는 내인성 인간 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 천연 인간 서열이 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함할 때, 서열 변형 없이, 시스테인 잔기에 대해 N-말단 및 C-말단의 비-시스테인-함유 아미노산 서열은 C-말단 연장부의 스페이서 서열을 구성한다. 일 실시형태에서, 연장부는 변형된 인간 아미노산 서열을 포함하며, 이때 하나 이상의 시스테인은 삽입 또는 치환에 의해 내인성 인간 아미노산 서열 내로 도입되었다. 천연 유래 시스테인 잔기는 또한 이러한 서열과 관련하여 치환 또는 결실될 수 있다.
특정 실시형태에 따르면, C-말단 연장부가 내인성 인간 아미노산 서열 또는 변형된 인간 아미노산 서열을 포함할 때, 환자에 투여될 때의 항체(또는 이의 컨쥬게이트)의 면역원성은 인간 아미노산 서열 또는 변형된 인간 아미노산 서열이 없는 대응하는 연장부에 비해 환원된다.
바람직한 스페이서는 야생형 IgM, IgG, IgA, IgE 또는 IgD 항체 분자 또는 T 세포 수용체의 야생형 서열, 예컨대 힌지 영역의 일부, 또는 이의 단편에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함한다. 일 양태에서, "힌지" 영역은 중쇄 폴리펩타이드, 예를 들어, IgG, IgA 또는 IgD 항체의 중쇄 폴리펩타이드의 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치된 항체(예컨대 도 1 및 도 2의 예에 도시한 바와 같음)의 아미노산 서열을 지칭한다. 본 개시내용의 작제물의 힌지 영역은 길이 및 아미노산 서열이 다를 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역은 길이로 12 내지 15개의 아미노산인 반면, 인간 IgG3은 62개의 아미노산 힌지 영역을 가진다. 인간 IgD 항체 분자는 64개의 아미노산 힌지 영역을 가진다. 특정 실시형태에 따르면, C-말단 연장부가 힌지 영역 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함할 때, 환자에 대해 투여 시, 항체(또는 이의 컨쥬게이트)의 면역원성은 힌지 영역 서열이 없는 대응하는 연장부에 비해 감소되고, 연장부의 가요성은 힌지 영역 서열이 없는 연장부에 비해 증가될 수 있다.
힌지 영역 아미노산 서열의 비제한적 예(이들 모두 또는 이들의 일부(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 연속적 잔기)는 본 개시내용의 C-말단 연장부에 포함될 수 있음)는 ESSCDVKLVEKSFET(서열번호 32)(T 세포 수용체 알파 상수); DCGFTS(서열번호 33)(T 세포 수용체 베타 상수); DVITMDPKDNCSKDAN(서열번호 34)(T 세포 수용체 감마 상수); DHVKPKETENTKQPSKSCHKPK(서열번호 35)(T 세포 수용체 델타 상수); EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 36)(IgCHG1); ERKCCVECPPCP(서열번호 37)(IgCHG2); ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호 38)(IgCH3-H1); EPKSCDTPPPCPRCP(서열번호 39)(IgCH3-H2, IgCH3-H3 및 IgCH3-H4); ESKYGPPCPSCP(서열번호 40)(IgH4); VPPPPP(서열번호 41)(IgA2) 및 ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(서열번호 42)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
힌지 영역 아미노산 서열로부터 유래된 비-시스테인-함유 아미노산 서열(이들 모두 또는 이들의 일부(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 연속적 잔기)는 본 개시내용의 C-말단 연장부에서 스페이서로서 사용될 수 있음)은 ESS(서열번호 43); DVKLVEKSFET(서열번호 44); GFTS(서열번호 45); DVITMDPKDN(서열번호 46); SKDAN(서열번호 47); DHVKPKETENTKQPSKS(서열번호 48); HKPK(서열번호 49); EPKS(서열번호 50); DKTHT(서열번호 51); ERK(서열번호 52); ELKTPLGDTTHT(서열번호 53); DTPPP(서열번호 54); VE(서열번호 55); PR(서열번호 56); PP(서열번호 57); PS(서열번호 58); ESKYGPP(서열번호 59); 및 DVKLV(서열번호 91)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부는 하나 이상의 스페이서(또는 스페이서 없음) 및 하나 이상의 시스테인 잔기의 임의의 목적으로 하는 조합을 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한, 본 개시내용의 양상은 하나 이상의 시스테인을 갖는 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단에서 연장부를 제공하기 위한 것이며(예를 들어, 서로로부터 이격되거나 또는 서로로부터 이격되지 않음; 모 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단으로부터 이격되거나 또는 모 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단으로부터 이격되지 않음; 및/또는 경쇄 연장부의 C-말단으로부터 이격되거나 또는 경쇄 연장부의 C-말단으로부터 이격되지 않음), 따라서 이러한 항체의 컨쥬게이팅된 생성물에서 이러한 시스테인(들)에 연결된 작용제(예를 들어, 세포독성제, 표지제 등)의 대응하는 수 및 이격을 제어할 수 있다.
특정 실시형태에 따르면, C-말단 연장부는 N-말단으로부터 C-말단까지 화학식 I로 표시될 수 있는 아미노산 서열을 포함한다:
(XaCb)c(X'dCe)f (I)
식 중,
X 및 X'는 하나 이상의 아미노산의 스페이서를 표시하고, 각각의 X 및 X'의 아미노산 서열은 본 명세서에 제공된 스페이서 아미노산 서열의 임의의 예를 포함하는 관심 대상의 임의의 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택되며;
C는 시스테인 잔기를 표시하고,
a, b, c, d, e 및 f는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택된 정수이되, b와 e의 합은 적어도 1이고, c와 f의 합은 적어도 1이다. X 및 X'는 동일 또는 상이할 수 있다. c가 1 초과인 경우, (XaCb)c의 각각의 X는 (XaCb)c의 각각의 반복 단위 내에서 동일 또는 상이한 아미노산 서열일 수 있다. d가 1 초과인 경우, (X'dCe)f의 각각의 X'는 (X'dCe)f의 각각의 반복 단위 내에서 동일 또는 상이한 아미노산 서열일 수 있다.
본 개시내용은 또한 화학식 I의 C-말단 연장부를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 화학식 I의 C-말단 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
특정 실시형태에서, C-말단 연장부는 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 화학식 I로 표시될 수 있으며, 여기서 b 및 e는 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택된 정수이고, b와 e의 합은 적어도 1이며, a, c, d 및 f는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택된 정수이고, c와 f의 합은 적어도 1이다.
특정 실시형태에서, C-말단 연장부는 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 화학식 I로 표시될 수 있으며, 여기서 b 및 e는 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택된 정수이고, b와 e의 합은 적어도 2이며, a, c, d 및 f는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택된 정수이고, c와 f의 합은 적어도 1이다.
특정 실시형태에서, C-말단 연장부는 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 화학식 I로 표시될 수 있으며, 여기서 b 및 e는 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택된 정수이고, b와 e의 합은 적어도 1이며, a 및 d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 독립적으로 선택된 정수이고, c 및 f는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 독립적으로 선택된 정수이며, 여기서 c와 f의 합은 적어도 1이다.
특정 실시형태에서, C-말단 연장부는 N-말단으로부터 C-말단까지 상기 화학식 I로 표시될 수 있으며, 여기서 b 및 e는 0, 1 및 2로부터 독립적으로 선택된 정수이고, b와 e의 합은 적어도 2이며, a 및 d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 독립적으로 선택된 정수이고, c와 f는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 독립적으로 선택된 정수이며, 여기서 c와 f의 합은 적어도 1이다.
예로서, 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X는 서열 GGGS(서열번호 1)을 갖는 스페이서이고; a, b 및 c는 각각 = 1이며; f = 0이라면, C-말단 연장부는 서열 GGGSC (서열번호 60)(또한 본 명세서에서 "Cys1"로서 지칭됨)을 가진다. 이 실시형태에 따른 C-말단 연장부를 지니는 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체의 예를 도 1에 개략적으로 도시한다. 나타낸 바와 같이, 항체(100)는 각각의(CL) 도메인의 C-말단의 잔기로부터 연장되는 서열 GGGSC를 갖는 경쇄 가변(VL) 및 불변(CL) 도메인, 및 C-말단 연장부(102 및 104)를 포함하는 2개의 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, X가 GGGS(서열번호 1)일 때, a는 1이고, c는 1이며, f는 0이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, X는 예시의 목적을 위해 서열 GGGS(서열번호 1)를 갖는 스페이서이고; 및 c가 각각 = 1, b = 2, 그리고 f = 0이면, C-말단 연장부는 서열 GGGSCC(서열번호 61)을 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X는 GGGS(서열번호 1)이며, a = 2, b = 1, c = 1, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때 C-말단 연장부는 서열 GGGSGGGSC(서열번호 62)를 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X는 GGGS(서열번호 1)이며, a = 1, b = 1, c = 2, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때 C-말단 연장부는 서열 GGGSCGGGSC(서열번호 63)(또한 본 명세서에서 "Cys2"로서 지칭됨)를 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X는 GGGS(서열번호 1)이고, a = 1, b = 1, c = 4, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 GGGSCGGGSCGGGSCGGGSC(서열번호 64)(또한 본 명세서에서 "Cys4"로서 지칭됨)을 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X가 GGGS(서열번호 1)이고, a = 1, b = 1, c = 1, d = 3, e = 1 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 GGGSCGGGSGGGSGGGSC(서열번호 65)를 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X가 GGGS(서열번호 1)이고, a = 2, b = 1, c = 1, d = 1, e = 1, 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 GGGSGGGSCGGGSC(서열번호 66)를 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X가 GGGS(서열번호 1)이고, a = 1, b = 1, c = 1, d = 2, e = 1, 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 GGGSCGGGSGGGSC(서열번호 67)을 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시의 목적을 위해 X가 GGGS(서열번호 1)이고 X'가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이며, a = 1, b = 1, c = 1, d = 2, e =1, 그리고 f = 1인 경우, 연장부는 서열 GGGSCAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 89)를 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 (XaCb)c의 제1 경우와 관련하여 c = 2이고 X는 GGGS(서열번호 1)이며, (XaCb)c의 제2 경우와 관련하여 X는 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, X'은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이며, a = 1, b = 1, c = 2, d = 2, e = 1 및 f = 1인 경우, 연장부는 서열 GGGSCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 90)를 가질 것이다.
예로서, 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 서열 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)을 갖는 스페이서이고, a, b 및 c는 각각 =1이며; f = 0이면, C-말단 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 68)를 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 2, b = 1, c = 1, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때 C-말단 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 69)를 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 1, b = 1, c = 2, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, C-말단 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 70)를 가진다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 1, b = 1, c = 4, 그리고 f = 0인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 71)을 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 1, b = 1, c = 1, d = 3, e = 1, 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 72)을 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 2, b = 1, c = 1, d = 1, e = 1, 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 73)를 가질 것이다.
일 예에서, 상기 화학식 I에 대해, 예시적 목적을 위해 X가 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 2)이고, a = 1, b = 1, c = 1, d = 2, e = 1, 그리고 f = 1인 경우, 각각의 스페이서 서열이 동일할 때, 연장부는 서열 AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARC(서열번호 74)를 가질 것이다.
다른 예에서, 본 개시내용의 C-말단 연장부는 화학식 II로 표시될 수 있다:
(XaCb)c(X'dCe)f(X"gCh)i (II)
식 중,
X, X' 및 X"은 하나 이상의 아미노산의 스페이서를 표시하며, 각각의 X, X' 및 X"의 아미노산 서열은 본 명세서에 제공된 스페이서 아미노산 서열의 임의의 예를 포함하는, 관심 대상의 임의의 아미노산 서열로부터 독립적으로 선택되고;
C는 시스테인 잔기이며:
a, b, c, d, e, f, g, h 및 i는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 독립적으로 선택된 정수이고, b, e와 h의 합은 적어도 1이고, c, f와 i의 합은 적어도 1이다. X, X' 및 X"은 동일 또는 상이할 수 있다. c가 1 초과인 경우, (XaCb)c의 각각의 X는 (XaCb)c의 각각의 반복 단위 내에서 동일 또는 상이한 아미노산 서열일 수 있다. d 또는 f가 1 초과인 경우, (X'dCe)f의 각각의 X'는 (X'dCe)f의 각각의 반복 단위 내에서 동일 또는 상이한 아미노산 서열일 수 있다. g 또는 i가 1 초과인 경우, (X"gCh)i의 각각의 X"은 (X"gCh)i의 각각의 반복 단위 내에서 동일 또는 상이한 아미노산 서열일 수 있다.
본 개시내용의 C-말단 연장부는 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 이루어질 수 있다): EPKSCDKTHTC(서열번호 92)(또한 본 명세서에서 연장부 1로서 지칭됨); EPKSCDKTHTCPPC(서열번호 93)(또한 본 명세서에서 연장부 2로서 지칭됨); EPKSC(서열번호 94)(또한 본 명세서에서 연장부 3으로서 지칭됨); ESKYGPPC(서열번호 95)(또한 본 명세서에서 연장부 4로서 지칭됨); ERKCCVECPPC(서열번호 96)(또한 본 명세서에서 연장부 5로서 지칭됨); ERKC(서열번호 97)(또한 본 명세서에서 연장부 6으로서 지칭됨); DVITMDPKDNC(서열번호 98)(또한 본 명세서에서 연장부 7로서 지칭됨); DHVKPKETENTKQPSKSCHKPK(서열번호 99)(또한 본 명세서에서 연장부 8로서 지칭됨); ESSC(서열번호 100)(또한 본 명세서에서 연장부 9로서 지칭됨); ESSCDVKLV(서열번호 101)(또한 본 명세서에서 연장부 10으로서 지칭됨); DHVKPKETENTKQPSKSC(서열번호 102)(또한 본 명세서에서 연장부 11로서 지칭됨); DVITMDPKDNCSKDAN(서열번호 103)(또한 본 명세서에서 연장부 12로서 지칭됨); CAA, CCAA(서열번호 128), AACAA(서열번호 129), 및 GGGGSCAA(서열번호 130).
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 C-말단 연장부(예를 들어, 화학식 II의 C-말단 연장부 등)를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 임의의 경쇄 폴리펩타이드(예를 들어, 화학식 II의 C-말단 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드 등)를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 C-말단 연장부를 갖는 적어도 하나의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항체는 본 개시내용 C-말단 연장부를 갖는 2개의 경쇄 폴리펩타이드를 가진다. 일부 실시형태에서, 이러한 항체는 항체의 경쇄 폴리펩타이드 중 적어도 하나에 존재하는 C-말단 연장부에서 적어도 하나의 시스테인에 대한 공유 부착을 통해 작용제/페이로드(예를 들어, 약물)에 컨쥬게이팅될 수 있다. 일 실시형태에서, 페이로드는 C-말단 연장부의 시스테인에 직접 부착된다. 다른 실시형태에서, 페이로드는 C-말단 연장부의 시스테인에 링커를 통해 부착된다. 일 실시형태에서, 페이로드는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인을 거쳐서 C-말단 연장부의 시스테인에 우선적으로 부착된다. 일 실시형태에서, 페이로드는 C-말단 연장부의 시스테인에 배타적으로 부착된다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 개시내용은 C-말단의 아미노산 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드(편의를 위해 본 명세서에서 "변형된 경쇄 폴리펩타이드"로서 지칭됨)를 암호화하는 핵산뿐만 아니라 이러한 핵산을 함유하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 핵산에 의해 암호화된 변형된 경쇄 폴리펩타이드는 임의의 조합을 상기 기재한 임의의 특징들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부 일부는 연장부의 길이에 대해 상기 기재한 임의의 C-말단 연장부 특징, 연장부의 아미노산 서열, 연장부 및 이의 아미노산 서열에서 스페이스의 수, 하나 이상의 스페이서 및 하나 이상의 시스테인 잔기의 조합에 기반한 연장부 입체배치, 및 상기 그리고 본 명세서의 다른 곳에 기재한 C-말단 연장부의 임의의 다른 양상을 포함할 수 있다.
C-말단 연장부-함유 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)은 숙주 세포(예를 들어, 암호화된 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 합성하도록 유전자 변형된 세포)에서 핵산을 발현시키는 하나 이상의 조절 구성요소, 예컨대 프로모터 및 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다.
예를 들어, 숙주 세포가 원핵 숙주 세포인 경우, 프로모터의 예는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 혼성 프로모터, 예를 들어, lac/tac 혼성 프로모터, tac/trc 혼성 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터, 등; araBAD 프로모터; 생체내 조절 프로모터, 예컨대 ssaG 프로모터 또는 관련된 프로모터, pagC 프로모터; nirB 프로모터; 시그마70(sigma70) 프로모터, 예를 들어, 공통 시그마70 프로모터; 정지상 프로모터, 예를 들어, dps 프로모터, spv 프로모터, 등; 병원성 유전자균 SPI-2로부터 유래된 프로모터; actA 프로모터; rpsM 프로모터; tet 프로모터; SP6 프로모터; 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 원핵생물, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli )에서 사용하기 위한 강한 프로모터의 예는 Trc, Tac, T5, T7 및 P람다를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 비제한적 예는 락토스 프로모터 오퍼레이터(LacI 리프레서 단백질이 락토스와 접촉될 때 입체구조가 변화되고, 이에 의해 LacI 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합하는 것을 방지함), 트립토판 프로모터 오퍼레이터(트립토판과 복합체화될 때, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하는 입체구조를 가지고; 트립토판이 없을 때, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 입체구조를 가짐), 및 tac 프로모터 오퍼레이터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, 효모 세포에서 발현을 위해, 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 ADH1 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터, 예컨대 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터 및 AOX1(예를 들어, 피키아(Pichia)에서 사용하기 위함)일 수 있다.
변형된 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 이것이 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다른 폴리펩타이드 구성성분을 발현시키는데, 예를 들어, 본 개시내용의 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체를 제공하는데 바람직할 때, 2 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 대응하는 뉴클레오타이드 서열은 동일 또는 별개의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 선택가능한 마커, 복제기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로 이종성 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치된 편리한 제한 부위를 가진다. 발현 벡터의 예는 바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스; 아데노연관 바이러스; SV40; 단순포진바이러스; 인간 면역결핍바이러스; 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터, 예컨대 라우스육종 바이러스, 하비(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스)에 기반한 바이러스 벡터; 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
또한 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 양상에서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포이다. 숙주 세포는 본 개시내용의 핵산을 지니는 유전자 변형된(예를 들어, 형질전환 또는 형질감염된) 단리된 유전자 변형 숙주 세포(예를 들어, 시험관내 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 유전자 변형된 숙주 세포는 본 개시내용의 변형된 경쇄 폴리펩타이드를 생성할 수 있는데, 항체 경쇄 폴리펩타이드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 특징을 가질 수 있다.
숙주 세포의 예는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유류 세포, 곤충 숙주 세포, 효모 세포; 및 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포를 포함한다. 숙주 세포 내로 핵산의 도입은, 예를 들어 인산칼슘 침전, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 전기천공법, 또는 다른 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
포유류 숙주 세포의 예는 1차 세포 및 불멸 세포주를 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비-인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 헬라(HeLa) 세포(예를 들어, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC) No. CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC No. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC No. CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC No. CCL10), PC12 세포(ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC No. CRL1651), RATI 세포, 마우스 L 세포(ATCC No. CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포(ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
효모 숙주 세포의 예는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 노클라마(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 오푼티애(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨러란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿰(Pichia guercuum), 피키아피페리(Pichiapijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아종(Pichia sp.), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 한세뉼라폴리몰파(Hansenulapolymorpha), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 크리소소포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp .), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
원핵 세포의 예는 에스케리키아 콜라이, 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 살모넬라 종(Salmonella sp.), 쉬겔라 종(Shigella sp.) 등의 임의의 다양한 실험실 균주를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예는 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 쉬겔라 균주는 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 및 쉬겔라 디스엔테리애(Shigella disenteriae)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전형적으로, 실험실 균주는 비-병원성인 것이다. 다른 적합한 박테리아의 비제한적 예는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 퓨디타(Pseudomonas pudita), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도코커스 종(Rhodococcus sp.) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체 경쇄 폴리펩타이드 및 항체를 생성하는 방법
상기 논의한 바와 같이, 본 개시내용은 변형된 경쇄 폴리펩타이드(즉, 본 개시내용의 C-말단 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드)뿐만 아니라 이러한 변형된 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 이상을 함유하는 항체의 제조방법을 제공한다.
일 실시형태에 따르면, 항체의 경쇄 폴리펩타이드의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 숙주 세포에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 경쇄 폴리펩타이드는 임의의 편리한 방법, 예를 들어, 단백질 합성을 위한 전통적인 합성 방법, 재조합 DNA 방법 등에 의해 생성될 수 있다. C-말단의 아미노산 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드는 관심 대상의 중쇄 폴리펩타이드의 생성과 조합하여 생성될 수 있거나, 또는 생성 후에 (예를 들어, 본 개시내용의 경쇄 폴리펩타이드와 중쇄 폴리펩타이드를 별도로 발현시키는 재조합 세포의 융합에 의해) 중쇄 폴리펩타이드와 조합될 수 있다.
재조합 방법은 경쇄 폴리펩타이드의 생성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 세그먼트는 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장하는 발현 벡터에서 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터 (예를 들어, 자연적으로 결합된 또는 이종성 프로모터), 신호 서열, 인핸서 구성요소 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포(예를 들어, COS 또는 CHO 세포)를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터에서 진핵 프로모터 시스템일 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되었다면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 목적으로 하는 발현 수준 및 경쇄 폴리펩타이드의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다.
유전자 암호의 퇴축 때문에, 다양한 핵산 서열이 목적으로 하는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화시킬 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 C-말단의 아미노산 연장부가 없는 모 항체의 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 돌연변이유발(예를 들어, 중합 PCR)에 의해 드노보 고체상 DNA 합성에 의해 생성될 수 있다. C-말단의 아미노산 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 생성하기 위해 중첩 PCR을 이용하는 예시적 접근은 본 명세서에 기재된 실시예 부문에서 상세하게 기재된다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 필수 부분으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적으로 하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 해당 세포가 검출되게 하기 위해 선택 마커(예를 들어, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성)를 함유한다. 발현 벡터 및 숙주 세포의 예는 상기 논의된다. 예를 들어, 숙주 세포는 원핵 세포(예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 바실리(예컨대, 바실러스 서브틸리스), 살모넬라, 세라티아(Serratia), 슈도모나스 종 등), 효모 세포(예를 들어, 사카로마이세스(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애), 피키아 등) 및 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포주, Cos 세포주, 헬라 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 혼성세포 등)일 수 있다.
경쇄 폴리펩타이드가 화학적으로 합성된 경우, 합성은 액체상 또는 고체상을 통해 진행될 수 있다. 고체상 폴리펩타이드 합성(SPPS)(이때 서열의 C-말단의 아미노산은 불용성 지지체에 부착된 다음에 서열 내 남아있는 아미노산이 순차적으로 첨가됨)은 경쇄 폴리펩타이드의 화학적 합성을 위한 적합한 방법의 예이다. 다양한 형태의 SPPS, 예컨대 Fmoc 및 Boc가 경쇄 폴리펩타이드를 합성하는데 이용가능하다. 고체상 합성을 위한 기법은 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 작은 불용성, 다공성 비드는 펩타이드 쇄가 구성된 기능성 단위로 처리된다. 결합/탈보호의 반복된 주기 후에, 부착된 고체상의 유리 N-말단의 아민은 단일 N-보호 아미노산 단위에 결합된다. 이어서, 단위는 탈보호되어, 추가 아미노산이 부착될 수 있는 새로운 N-말단의 아민을 나타낸다. 펩타이드는 고체상 상에 고정된 채로 남아있고, 절단되기 전에 여과를 겪는다.
일단 합성되면(재조합적으로 또는 화학적으로), 단독으로 또는 항체의 부분으로서 변형된 경쇄 폴리펩타이드는 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 단독으로 또는 항체의 부분으로서 변형된 경쇄 폴리펩타이드는 실질적으로 순수할 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 80% 내지 85% 순수, 적어도 약 85% 내지 90% 순수, 적어도 약 90% 내지 95% 순수 또는 98% 내지 99% 이상으로 순수하고, 예를 들어, 세포 파편, 경쇄 폴리펩타이드 이외의 거대 분자 등과 같은 오염물질이 없을 수 있다.
특정 실시형태에 따르면, 경쇄 폴리펩타이드는 시험관내 번역에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌[Yin et al. (2012) Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system, Landes Bioscience, Volume 4, Issue 2] 참조.
항체는 재조합 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화된, 전체 인간, 이중특이성, 탈면역화 및/또는 시험관내 생성 항체일 수 있다.
컨쥬게이트
본 개시내용은 C-말단 연장부를 갖는 적어도 하나의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체를 제공하며, 여기서 C-말단 연장부의 적어도 하나의 시스테인은 작용제(예를 들어, 약물)에 컨쥬게이팅된다.
본 개시내용의 컨쥬게이트의 항체 부분의 C-말단 연장부를 갖는 경쇄 폴리펩타이드는 상기 기재한 임의의 특징 및 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트의 항체 일부의 C-말단 연장부는 연장부의 길이에 대해 상기 기재한 임의의 C-말단 연장부 특징, 연장부의 아미노산 조성, 연장부 및 이의 아미노산 서열에서 스페이스의 수, 하나 이상의 스페이서 및 하나 이상의 시스테인 잔기의 조합에 기반한 연장부 입체배치, 및 상기 그리고 본 명세서의 다른 곳에 기재한 C-말단 연장부의 임의의 다른 양상을 포함할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 항체 컨쥬게이트는 C-말단 연장부를 갖는 적어도 하나의 경쇄 폴리펩타이드를 가지며, 여기서 C-말단 연장부의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 작용제에 컨쥬게이팅된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 컨쥬게이트의 각각의 경쇄 폴리펩타이드는 C-말단 연장부를 가지며, 여기서 각각의 변형된 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 작용제에 컨쥬게이팅된다. 예를 들어, 제1 작용제는 제1 변형 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅될 수 있고, 제2 작용제는 제2 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부의 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅될 수 있다. 일 실시형태에서, 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기보다는 C-말단 연장부의 시스테인 잔기에 우선적으로 부착된다. 특정 양상에서, 작용제는 C-말단 연장부의 시스테인 잔기에 배타적으로 부착된다. 본 개시내용의 항체 컨쥬게이트는 컨쥬게이션에 대해 이용가능한 C-말단 연장부에서 시스테인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 이상의 시스테인에 따라 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅되는 다수의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 C-말단 연장부는 C-말단 연장부의 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 시스테인에 대한 공유결합을 통해 작용제 또는 작용제들에 컨쥬게이팅된다. 일부 실시형태에서, 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 C-말단 연장부는 C-말단 연장부의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 시스테인에 대한 공유 결합을 통해 작용제 또는 작용제들에 컨쥬게이팅된다. 특정 양상에서, 연장부는 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 연장부 내 2개의 인접한 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함한다. 예를 들어, 연장부는 연장부에서 2개의 인접한 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅된 작용제의 수는 약물 대 항체 비(DAR)에 의해 특성규명될 수 있다. 일부 예에서, 복수의 항체 컨쥬게이트의 분포는 분포에서 항체 컨쥬게이트의 평균 DAR을 측정함으로써 특성규명될 수 있으며, 여기서, 평균 DAR은 분포에서 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅된 작용제의 평균 수를 나타낸다. "평균"은 산술평균을 의미한다. 특정 경우에, 평균 DAR은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 분석된다. 따라서, 평균 DAR은 DAR 분석에 의해 제공된 분포에서 항체 컨쥬게이트의 평균 약물-대-항체비의 표시를 제공한다.
일부 예에서, 본 개시내용에 따른 항체 컨쥬게이트의 DAR은 0 내지 20, 예컨대 1 내지 17, 또는 1 내지 15, 또는 1 내지 12, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 9, 또는 1 내지 8, 또는 1 내지 7, 또는 1 내지 6, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3의 범위에 있다. 예를 들어, DAR 0은 항체가 비컨쥬게이팅임을 나타내고; DAR 1은 하나의 작용제(예를 들어, 약물)가 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내며; DAR 2는 2개의 작용제가 항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 하나 이상의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내고; DAR 3은 항체의 3개의 작용제가 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 하나 이상의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내며; DAR 4는 4개의 작용제가항체의 변형된 경쇄 폴리펩타이드(들)의 하나 이상의 C-말단 연장부에 컨쥬게이팅되는 것 등을 나타낸다. 일부 예에서, 본 개시내용에 따른 항체 컨쥬게이트의 DAR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
일부 예에서, 본 개시내용에 따른 항체 컨쥬게이트 분포의 평균 DAR은 0 내지 20, 예컨대 1 내지 17, 또는 1 내지 15, 또는 1 내지 12, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 9, 또는 1 내지 8, 또는 1 내지 7, 또는 1 내지 6, 또는 1 내지 5, 또는 1 내지 4, 또는 1 내지 3의 범위에 있다. 예를 들어, 평균 DAR 0은 평균적으로 분포에서의 항체가 비컨쥬게이팅임을 나타내고; 평균 DAR 1은 평균적으로, 하나의 작용제(예를 들어, 약물)가 분포에서 각각의 항체에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내며; 평균 DAR 2는 평균적으로, 2개의 작용제가 분포에서 각각의 항체에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내고; 평균 DAR 3은 평균적으로, 3개의 작용제가 분포에서 각각의 항체에 컨쥬게이팅되는 것을 나타내고; 평균 DAR 4는 평균적으로, 4개의 작용제가 분포에서 각각의 항체에 컨쥬게이팅되는 것 등을 나타낸다. 일부 예에서, 본 개시내용에 따른 항체 컨쥬게이트 분포의 평균 DAR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 항체 컨쥬게이트를 함유하는 샘플은 비컨쥬게이팅 및 컨쥬게이팅(예를 들어, 모노-컨쥬게이팅, 다이-컨쥬게이팅, 트라이-컨쥬게이팅 등) 항체의 분포의 혼합물을 포함한다. 항체 컨쥬게이트의 각각의 분포의 평균 DAR은 (예를 들어, HIC에 의해) 분석될 수 있다. 예를 들어, 항체 컨쥬게이트를 함유하는 샘플은 비컨쥬게이팅 항체의 분포(즉, 평균 DAR = 0인 항체 컨쥬게이트), 모노-컨쥬게티이팅된 항체의 분포(즉, 평균 DAR = 1인 항체 컨쥬게이트), 다이-컨쥬게이팅된 항체의 분포(즉, 평균 DAR = 2인 항체 컨쥬게이트), 트라이-컨쥬게이팅된 항체의 분포(즉, 평균 DAR = 3인 항체 컨쥬게이트) 등을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 실시형태에 따른 예시적 항체 컨쥬게이트는 도 2에서 개략적으로 도시된다. 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이트(200)는 경쇄 가변(VL) 및 불변(CL) 도메인, 및 각각의 (CL) 도메인의 C-말단의 잔기로부터 연장되는 서열 GGGSC를 갖는 C-말단 연장부를 포함하는 2개의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체를 포함한다. 컨쥬게이트(200)는 링커를 통해 연장부의 시스테인 잔기에 연결된 작용제(202 및 204)를 추가로 포함한다.
링커
특정 양상에서, 작용제는 링커를 통해 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된다. 본 개시내용의 컨쥬게이트에서의 용도를 발견한 링커는 말레이미드 또는 말레이미드계 링커; 발린-시트룰린 링커; 하이드라존 링커; N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)뷰티레이트(SPDB) 링커; 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 링커; 비닐설폰계 링커; 시스테인에 배위된 금속 원자(들)를 수반하는 링커; 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 테트라에틸렌 글리콜을 포함하는 링커; 프로판산을 포함하는 링커; 카프롤레산을 포함하는 링커; 플렉시머(Fleximer)(등록상표) 중합체(매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 메르사나 쎄라퓨틱스(Mersana Therapeutics))를 포함하는 링커 또는 플렉시머 Fleximer) 중합체에 약물을 부착하기 위해 사용되는 링커(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 USPN 8,524,214 참조); 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커를 포함한다.
특정 양상에서, 링커는 화학적으로 불안정한 링커, 예컨대 중성 pH(혈류 pH 7.3 내지 7.5)에서 안정하지만 약한 산성 엔도솜(pH 5.0 내지 6.5) 및 표적 세포(예를 들어, 암세포)의 리소좀(pH 4.5 내지 5.0) 내로 내재화 시 가수분해를 겪는 산-절단성 링커이다. 화학적으로 불안정한 링커는 하이드라존계 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에 따르면, 링커는 효소-불안정 링커, 예컨대 혈류에서 안정하지만, 예를 들어 표적 세포(예를 들어, 암세포)의 리소좀에서 리소좀 프로테아제(예컨대, 카텝신 또는 플라스민)에 의해 표적 세포 내로 내재화 시 효소적 절단을 겪는 효소-불안정 링커이다. 효소-불안정 링커는 펩타이드 결합을 포함하는 링커, 예를 들어, 발린-시트룰린 링커, 예컨대 말시미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질(MC-vc-PAB) 링커 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 양상에서, 링커는 비-절단성 링커, 예컨대 비-절단성 티오에터 결합을 포함하는 링커이다. 화학적으로-불안정한 링커, 효소 불안정 및 비-절단성 링커는 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Ducry & Stump (2010) Bioconjugate Chem . 21:5-13]에 상세하게 기재되어 있다.
특정 실시형태에 따르면, 링커는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기(들)의 하나 이상의 환원된 설프하이드릴기(또는 티올, -SH)와 반응할 수 있는 설프하이드릴-반응성 화학기이다(또는 포함한다). 작용제 C-말단 연장부의 시스테인을 연결함에 있어서 용도를 발견하는 설프하이드릴-반응성 화학기는 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜 다이설파이드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐설폰, TNB-티올, 금속 및 다이설파이드 환원제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 기는 알킬화(예를 들어, 티오에스터 결합의 형성에 의함), 다이설파이드 교환(다이설파이드 결합의 형성) 등에 의해 설프하이드릴에 컨쥬게이팅될 수 있다.
작용제
본 개시내용의 항체 컨쥬게이트의 페이로드인 작용제는 임의의 적합한 작용제일 수 있다. 본 개시내용의 항체 컨쥬게이트에서 사용을 위해 선택되는 작용제는 컨쥬게이트가 사용되는 적용분야(예를 들어, 사멸, 세포 증식의 예방, 호르몬 요법, 표적 영상화 및/또는 유전자 요법 등)에 따라 다를 것이다. 관심대상의 작용제는 치료제(예를 들어, 약물(예를 들어, 세포독성제)), 검출가능한 작용제(예를 들어, 생체내 조영제) 및/또는 관심 대상의 특정 항체 기반 적용분야에 유용한 임의의 다른 작용제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이러한 작용제의 비제한적 예는 독소, 독소의 단편, 렉틴, 알킬화제, 효소, 항생제(예컨대 항박테리아제, 항진균제, 항마이코플라스마제 등), 항바이러스제, 항대사물질, 항증식 또는 항신생물제, DNA, 방사선비투과 염료, 방사성 동위원소(예를 들어, I123, I131뿐만 아니라 방사성 금속 이온), 금속 이온, 형광원 화합물, 마커 화합물 및 세포막 침투성을 변경시키는 화합물을 포함한다. 특정 양상에서, 작용제는 특이적 결합쌍의 구성원, 예를 들어, 바이오틴(아비딘/스트렙타비딘과의 특이적 결합쌍을 형성함)이다(또는 포함한다).
특정 실시형태에 따르면, 작용제는 치료제이다. 관심대상의 치료제는 컨쥬게이트가 세포/조직의 표면 상에서 항원에 대해 컨쥬게이트가 컨쥬게이트의 항체 일부의 특이적 결합을 통해 결합하는 세포/조직의 기능에 영향을 미칠 수 있는 작용제를 포함한다. 예를 들어, 작용제는 컨쥬게이트가 특이적으로 결합하는 세포/조직의 기능을 신장시킬 수 있다. 대안적으로, 세포/조직의 기능이 병원성일 때, 세포/조직의 기능을 감소시키는 작용제가 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 컨쥬게이트는 세포 증식을 저해하고/하거나 세포/조직을 사멸시킴으로써 표적 세포/조직의 기능을 감소시키는 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 다양하며 세포분열억제제 및 세포독성제(예를 들어, 표적 세포 내로 내재화됨과 함께 또는 내재화되지 않고 표적 세포 조직을 사멸시킬 수 있는 작용제)를 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 치료제는 엔다이인, 렉시트롭신, 듀오카르마이신, 탁산, 퓨로마이신, 돌라스타틴, 메이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드로부터 선택된 세포독성제이다. 일부 실시형태에서, 세포독성제는 파클리탁셀, 도세탁셀, CC-1065, CPT-11(SN-38), 토포테칸, 독소루비신, 몰폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노몰폴리노-독소루비신, 돌라스타틴-10, 에키노마이신, 콤브레스타틴, 칼케아마이신, 메이탄신, 메이탄신 DM1, 메이탄신 DM4, DM-1, 아우리스타틴 또는 다른 돌라스타틴 유도체, 예컨대 아우리스타틴 E 또는 아우리스타틴 F, AEB(AEB-071), AEVB(5-벤조일발레르산-AE 에스테르), AEFP(항체-엔도스타틴 융합 단백질), MMAE(모노메틸아우리스타틴 E), MMAF(모노메틸아우리스타틴 F), 피롤로벤조다이아제핀(PBD), 엘레우테로빈, 네트롭신 또는 이들의 임의의 조합물이다.
특정 실시형태에 따르면, 작용제는 헤미아스텔린 및 헤미아스텔린 유사체(예컨대 HTI-286(예를 들어, USPN 7,579,323; WO 2004/026293; 및 USPN 8,129,407 참조, 이들 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨), 아브린, 브루신, 시쿠톡신, 디프테리아 독소, 바트라코톡신, 보툴리눔 독소, 시가 독소, 내독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 내독소, 파상풍 독소, 백일해 독소, 탄저병 독소, 콜레라 독소, 팔카리놀, 푸모니신 B1, 푸모니신 B2, 아플라톡신, 마우로톡신, 아기톡신, 카리브도톡신, 마르가톡신, 슬로톡신, 스킬라톡신, 헤푸톡신, 칼시셉틴, 타이카톡신, 칼시클루딘, 겔다나마이신, 젤로닌, 로타우스트랄린, 오크라톡신 A, 파툴린, 리신, 스트리크닌, 트리코테센, 제를레논 및 테트라도톡신으로부터 선택되는 단백질 독소이다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 비터 멜론(Momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 저해제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다.
특정 양상에서, 작용제는 표지제이다. "표지제"(또는 "검출가능한 표지")는 항체가 관심 대상의 적용분야(예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내 연구 및/또는 임상 적용분야)에서 검출될 수 있도록 항체를 검출가능하게 표지하는 작용제를 의미한다. 관심대상의 검출가능한 표지는 방사성동위원소, 검출가능한 생성물을 생성하는 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼린 포스파타제 등), 형광 단백질, 상자성 원자 등을 포함한다. 특정 양상에서, 항체는 검출가능한 표지의 특이적 결합 상태에 컨쥬게이팅된다(예를 들어, 검출이 아비딘/스트렙타비딘을 포함하는 검출가능한 표지를 통해 일어날 수 있도록 바이오틴에 컨쥬게이팅됨).
특정 실시형태에 따르면, 작용제는 생체내 영상화, 예컨대 근적외선(NIR) 광학 영상화, 단일-광자 방출 단층 촬영(SPECT)/CT 영상화, 양전자 방출 단층촬영(PET), 핵자기 공명(NMR) 분광학 등에서의 용도를 발견하는 표지제이다. 이러한 적용분야에서 용도를 발견한 표지제는 형광 표지, 방사성 동위원소 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 양상에서, 표지제는 2 이상의 영상화 접근을 이용하여 생체내 영상화를 허용하는 다모드 생체내 조영제이다(예를 들어, 문헌[Thorp-Greenwood and Coogan (2011) Dalton Trans. 40:6129-6143] 참조).
특정 양상에서, 표지제는 근적외선(NIR) 영상화 분야에서의 용도를 발견한 생체내 조영제이며, 이 작용제는 코닥(Kodak) X-SIGHT 염료, Pz 247, 다이라이트(DyLight) 750 및 800 플루오르즈(Fluors), Cy 5.5 및 7 플루오르즈, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 680 및 750 염료, IR염료 680 및 800CW 플루오르즈로부터 선택된다. 특정 실시형태에 따르면, 표지제는 SPECT 영상화 분야에서의 용도를 발견한 생체내 조영제이며, 이 작용제는 99mTc, 111In, 123In, 201Tl 및 133Xe로부터 선택된다. 특정 양상에서, 표지제는 양전자방출 단층촬영(PET) 영상화 분야에서의 용도를 발견한 생체내 조영제이며, 이 작용제는 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124I, 76Br, 82Rb 및 68Ga으로부터 선택된다.
컨쥬게이션 방법
본 개시내용은 또한 항체 컨쥬게이트의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체에 작용제를 컨쥬게이팅하는 단계를 포함하며, 연장부는 시스테인 잔기를 포함하고, 여기서 작용제는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에(직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해)) 컨쥬게이팅된다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 C-말단 연장부 외부의 시스테인 잔기보다는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기에 작용제의 우선적인(또는 "편재된") 컨쥬게이션을 수반한다. 특정 양상에서, 컨쥬게이션은, 예를 들어, 말레이미드 반응 화학, 할로아세틸 반응 화학, 피리딜 다이설파이드 반응 화학 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 적합한 반응 화학을 이용하여 시스테인 잔기의 설프하이드릴기에 링커를 컨쥬게이팅하는 것을 포함한다. 컨쥬게이트의 제조방법은 컨쥬게이팅 단계 전에, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 적합한 환원제 및 반응 조건을 이용하여 시스테인 잔기를 설프하이드릴기(즉, 티올)로 환원시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 환원제는 DTPA, 시스테아민, TCEP(트리스트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드), 이들의 조합물 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 컨쥬게이트의 제조방법은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 환원제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 컨쥬게이트의 제조방법은 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함하는 항체를 제1 환원제와 접촉시킨 다음, C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제2 환원제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 대안의 실시형태는 경쇄 연장부 내에서 시스테인이 합성 생성물로서 이미 환원 상태이기 때문에 환원 단계를 필요로 하지 않는다. 특정 실시형태에서, 환원된 항체는 적합한 산화제와 접촉될 수 있다. 적합한 산화제는 데하이드로아스코르브산(DHAA) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체에 컨쥬게이팅된 작용제는 임의의 유용한 작용제일 수 있다. 특정 양상에서, 작용제는 치료제 또는 표지제이며, 이 작용제는 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.
특정 양상에서, 작용제는 말레이미드 반응 화학을 이용하여 C-말단 연장부의 시스테인에 연결된다. 반응 혼합물의 pH가 pH 6.5 내지 7.5일 때 말레이미드기는 설프하이드릴기와 특이적으로 반응하여, 안정한 티오에터 결합의 형성을 야기할 수 있다. 예를 들어, 말레이미딜-변형제(예를 들어, 약물)는 C-말단의 아미노산 연장부의 환원된 시스테인(예를 들어, 설프하이드릴 또는 티올기)과 반응하여 작용제와 항체 사이의 티오에터 결합을 형성할 수 있다. 더 알칼리성 조건에서(pH > 8.5), 1차 아민은 말레이미드와의 반응을 위해 티올과 경쟁할 수 있고, 또한 말레이미드기의 비-반응성 말레암산으로의 가수분해 속도를 증가시킨다. 말레이미드는 티로신, 히스티딘 또는 메티오닌과 반응하지 않는다. 말레이미드계 링커를 사용하는 바이오컨쥬게이션 접근은, 예를 들어, 문헌[Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, 2nd ed. San Diego, CA Academic Press 2008; Aslam & Dent, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, London Macmillan Reference Ltd 1998; Kalia & Raines, Advances in Bioconjugation, Curr . Org . Chem . 14(2): 138-147]에 기재되어 있다. 본 개시내용의 실시형태에 따른 말레이미드계 링커를 이용하는 적합한 컨쥬게이션 접근의 예는 본 명세서의 실시예 부문에 상세하게 기재되어 있다.
특정 실시형태에 따르면, 작용제는 할로아세틸 반응 화학을 이용하여 C-말단 연장부의 시스테인에 연결된다. 특정 양상에서, 요오도아세틸 또는 브로모아세틸기를 포함하는 할로아세틸 링커가 사용된다. 특정 실시형태에서, 할로아세틸은 생리적 pH에서 설프하이드릴기와 반응한다. 요오도아세틸기의 반응은 요오드의 설프하이드릴기로부터의 황 원자로의 친핵성 치환에 의해 진행되어 안정한 티오에터 결합을 생성한다.
특정 양상에서, 작용제는 피리딜 다이설파이드 반응 화학을 이용하여 C-말단 연장부의 시스테인에 연결된다. 특정 실시형태에서, 피리딜 다이설파이드는 넓은 pH 범위(pH 4 내지 5가 최적임)에 걸쳐 설프하이드릴기와 반응해서 다이설파이드 결합을 형성한다. 반응 동안, 다이설파이드 교환은 항체의 설프하이드릴기와 2-피리딜다이티올-변형제의 2-피리딜다이티올기 사이에 일어난다. 그 결과, 피리딘-2-티온은 방출되고, 반응 진행을 모니터링하기 위해 분광학적측정에 의해(Amax = 343㎚) 측정될 수 있다.
작용제가 부착될 수 있는(예를 들어, 링커를 통해) C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인에서 환원된 설프하이드릴을 생성하기 위해, 시스테인은 환원된 설프하이드릴기를 생성하기에 충분한 조건 하에서 적합한 환원제와 접촉될 수 있다. 특정 양상에서, 환원제는 시스테아민 하이드로클로라이드, 2-머캅토에탄올, 다이티오트레이톨(DTT), 2-머캅토에틸아민, 트리스(2-카복시)포스핀(TCEP), 시스테인 HCl, N-에틸말레이미드, 나시스텔린, 도마제 알파, 티모신 β4, 구아이페네신 TCEP HCl 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 이러한 환원제에 대한 반응 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 모 항체에 존재하는 시스테인 잔기(예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 CL과 CH1 사이, 및/또는 중쇄의 힌지 영역 사이의 다이설파이드 결합에 참여하는 시스테인 잔기)와 대조적으로 C-말단 연장부에 존재하는 시스테인(들)의 환원의 선택성 또는 "편재"를 촉진시키기 위해 최적화될 수 있다. 본 발명의 대안의 실시형태는 경쇄 연장부 내에서 시스테인이 합성 생성물로서 이미 환원 상태이기 때문에 환원 단계를 필요로 하지 않는다.
하나 이상의 C-말단의 아미노산 연장부 외부의 시스테인 잔기에 걸친 c-말단의 아미노산 연장부의 시스테인(들)의 우선적 환원(또는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인(들)의 배타적 환원)은 적합한 환원 조건의 선택에 의해 달성될 수 있다. 특정 양상에서, 적합한 환원 조건은 다음 중 하나 이상의 적합한 선택을 포함한다: 약한 환원제 및/또는 환원제에 대해 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인을 환원시키기 위한 선호도를 부여하는 입체 벌크를 갖는 환원제; 환원제 및 기질의 농도; 환원 반응이 수행되는 온도, 환원 반응 혼합물의 pH; 환원 반응에서 사용되는 완충제; 및/또는 연장된 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드를 발현시키는 세포가 배양되는 조건(예를 들어, C-말단 연장부 상에서 유리 티올을 얻고/얻거나 용이하게 환원되는 분자내 다이설파이드를 생성하기 위함).
약제학적 조성물
상기 요약한 바와 같이, 본 개시내용은 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 조성물은 상기 기재한 임의의 항체, 컨쥬게이트, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 양상은 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 항체(예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체) 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재한 임의의 컨쥬게이트(예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체 구성성분을 포함하는 컨쥬게이트), 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 약제학적 조성물 내에 존재하는 항체 또는 컨쥬게이트는 임의의 조합으로 본 개시내용의 항체 또는 본 개시내용의 컨쥬게이트에 대해 상기 기재한 임의의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트의 항체 또는 항체 일부의 C-말단 연장부는 연장부의 길이에 대해 상기 기재한 임의의 C-말단 연장부 특징, 연장부의 아미노산 구성, 연장부 및 이의 아미노산 서열에서 스페이스의 수, 하나 이상의 스페이서 및 하나 이상의 시스테인 잔기의 조합에 기반한 연장부 입체배치, 및 상기 그리고 본 명세서의 다른 곳에 기재한 C-말단 연장부의 임의의 다른 양상을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 일반적으로 본 개시내용의 치료적 유효량의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함한다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트는 목적으로 하는 치료 효과 또는 진단 효과를 초래할 수 있는 임의의 편리한 수단을 이용하여 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 항체 또는 컨쥬게이트는 치료적 투여를 위해 다양한 제형 내로 혼입될 수 있다. 더 구체적으로, 항체는 적절한, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와의 조합에 의해 약제학적 조성물 내로 제형화될 수 있고, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 주사, 흡입제 및 에어로졸의 제제로 제형화될 수 있다.
환자에 대한 투여에 적합한(예를 들어, 인간 투여에 적합한) 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트의 제형은 일반적으로 멸균이고, 추가로 선택된 투여 경로에 따라 환자에 대한 투여를 위해 검출가능한 발열원 또는 다른 오염물질이 없을 수 있다.
약제학적 제형에서, 항체는 그들의 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있거나, 또는 그들은 또한 단독으로 또는 다른 약제학적 활성 화합물과의 적절한 결합뿐만 아니라 조합으로 사용될 수 있다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시적이며, 어떤 방법으로 제한되지 않는다.
경구 제제에 대해, 항체 또는 컨쥬게이트는 단독으로 또는 적절한 첨가제와 조합하여 사용되어, 예를 들어 통상적인 첨가제, 예컨대 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 함께; 결합제, 예컨대 결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 함께; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 또는 카복시메틸셀룰로스나트륨과 함께; 윤활제, 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 함께; 그리고 요망된다면, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향미제와 함께 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조할 수 있다.
항체 또는 컨쥬게이트는 그들을 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고차 지방족산의 에스터 또는 프로필렌 글리콜 중에서; 그리고 요망된다면, 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제와 함께 용해, 현탁 또는 에멀전화시킴으로써 주사용 제제로 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 목적으로 하는 순도를 갖는 항체 또는 컨쥬게이트를 선택적인 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정제, 계면활성제, 완충제 및/또는 등장제와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 안정제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌 및 시트르산을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 염화벤즈알코늄 또는 이들의 조합물); 아미노산, 예컨대 알기닌, 글리신, 오르니틴, 라이신, 히스티딘, 글루탐산, 아스팔트산, 아이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린 및 이들의 조합물; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 젤라틴 또는 혈청 알부민; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 트레할로스, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프럭토스, 솔보스, 라피노스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민 및 뉴라민산; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween), Brij 플루로닉스(Pluronics), 트리톤-엑스(Triton-X) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
약제학적 조성물은 액체 형태, 동결건조 형태 또는 동결건조 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있되, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액에 의해 재구성되어야 한다. 동결건조된 조성물을 재구성하기 위한 표준 절차는 다시 순수한 물의 용적(전형적으로 동결건조 동안 제거되는 용적과 동등함)에 첨가하는 것이지만; 그러나 항박테리아제를 포함하는 용액은 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물의 생산을 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물 내 예시적 항체 또는 컨쥬게이트 농도는 약 1㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖ 또는 약 50㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖ 또는 약 150㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖의 범위일 수 있다.
항체 또는 컨쥬게이트의 수성 제형은, 예를 들어, 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 대안적으로 약 5.5 범위의 pH로 pH-완충 용액 중에서 제조될 수 있다. 이 범위 내의 pH에 적합한 완충제의 예는 인산염-, 히스티딘-, 시트르산염-, 숙신산염-, 아세트산염-완충제 및 다른 유기산 완충제를 포함한다. 완충제 농도는, 예를 들어, 완충제 및 제형의 목적으로 하는 등장성에 따라서 약 1mM 내지 약 100mM, 또는 약 5mM 내지 약 50mM일 수 있다.
등장제는 제형의 등장성을 조절하기 위해 항체 또는 컨쥬게이트 제형에 포함될 수 있다. 예시적 등장제는 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린 및 아미노산 그룹으로부터의 임의의 구성성분, 당뿐만 아니라 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 고장성 또는 저장성 용액이 적합할 수 있지만, 수성 제형은 등장성이다. 용어 "등장성"은 그것이 비교되는 일부 다른 용액, 예컨대 생리식염수 용액 또는 혈청과 동일한 등장성을 갖는 용액을 의미한다. 등장제는 약 5mM 내지 약 350mM, 예를 들어의 양으로, 100mM 내지 350mM의 양으로 사용될 수 있다.
계면활성제는 또한 항체 또는 컨쥬게이트 제형에 첨가되어 제형화된 항체 또는 컨쥬게이트의 응집을 감소시키고/시키거나 제형 내 미립자 형성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시키기 위해 첨가될 수 있다. 예시적 계면활성제는 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스터(트윈), 폴리옥시에틸렌 알킬 에터(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에터(트리톤-X), 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머, 플루로닉), 및 도데실 황산나트륨(SDS)을 포함한다. 적합한 폴리옥시에틸렌솔비탄-지방산 에스터의 예는 폴리솔베이트 20, (상표 트윈 20(상표명) 하에 시판됨) 및 폴리솔베이트 80(상표 트윈 80(상표명)하에 시판됨)이다. 적합한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체의 예는 명칭 플루로닉(등록상표) F68 또는 폴록사머188(Poloxamer 188)(상표명) 하에 시판되는 것이다. 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에터의 예는 상표명 Brij(상표명) 하에 시판되는 것이다. 계면활성제의 예시적 농도는 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 범위에 있을 수 있다.
동결건조보호제는 또한 동결건조 과정 동안 탈안정화 조건에 대해 활성 성분(예를 들어, 항체 또는 컨쥬게이트)을 보호하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 공지된 동결건조보호제는 당(글루코스 및 수크로스를 포함); 폴리올(만니톨, 솔비톨 및 글리세롤을 포함); 및 아미노산(알라닌, 글리신 및 글루탐산을 포함)을 포함한다. 동결건조보호제는 약 10mM 내지 500nM의 양으로 첨가될 수 있다.
특정 양상에서, 제형은 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트, 및 상기 동정한 작용제 중 하나 이상(예를 들어, 계면활성제, 완충제, 안정제, 등장제)을 포함하고, 하나 이상의 보존제, 예컨대 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 염화벤즈알코늄 및 이들의 조합물이 본질적으로 없다. 다른 실시형태에서, 보존제는, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 2% (w/v) 범위의 농도에서 제형에 포함된다.
예를 들어, 제형은 비경구 투여에 적합한 액체(예를 들어, 수용액 또는 에멀전) 또는 이의 동결건조 제형일 수 있고, 대상 항체 또는 컨쥬게이트 약 1㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖; 적어도 하나의 계면활성제 약 0.001% 내지 약 1%; 완충제 약 1mM 내지 약 100mM; 선택적으로 안정제 약 10mM 내지 약 500mM; 및 등장제 약 5mM 내지 약 305mM을 포함할 수 있으며; 약 4.0 내지 약 7.0의 pH를 가진다.
본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트는 흡입을 통해 투여될 에어로졸 제형에서 이용될 수 있다. 항체는 가압된 허용가능한 추진제, 예컨대 다이클로로다이플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 제형화될 수 있다.
경구 투여를 위한 단위 제형, 예컨대 시럽, 엘릭시르 및 현탁액이 제공될 수 있되, 각각의 투약 단위, 예를 들어, 티스푼, 테이블스푼 또는 정제는 하나 이상의 저해제를 함유하는 사전결정된 양의 조성물을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 제형은 멸균수, 정상 식염수 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체 중에서 용액으로서 조성물 내에 항체 또는 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단위 제형"은 인간 및 동물 대상체에 대한 일원화된 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 목적으로 하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 사전결정된 양의 본 발명의 화합물을 함유한다. 관심 대상의 항체 또는 컨쥬게이트에 대한 사항은 사용되는 특정 항체 및 달성될 효과 및 숙주에서 각각의 항체와 관련되는 약동학에 의존할 수 있다.
특정 양상에서, 약제학적 조성물(선택적으로 단위 제형으로 제공됨)은 약 10㎎/㎖ 내지 약 1000㎎/㎖, 예를 들어, 약 25㎎/㎖ 내지 약 500㎎/㎖, 약 50㎎/㎖ 내지 약 250㎎/㎖, 약 75㎎/㎖ 내지 약 200㎎/㎖, 또는 약 100㎎/㎖ 내지 약 150㎎/㎖ (예를 들어, 약 125㎎/㎖)의 농도로 존재하는 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 컨쥬게이트는 제어 방출 제형으로 제형화된다. 지속 방출 제제는 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 포함하며, 이때 기질은 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 기질의 예는 폴리에스터, L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드로겔, 폴리락타이드, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다.
본 발명의 범주 내의 제어 방출은 다수의 연장 방출 제형 중 임의의 하나를 의미하기 위해 취해질 수 있다. 다음의 용어는 본 발명의 목적을 위해 제어 방출과 실질적으로 동일한 것으로 고려될 수 있다: 연속 방출, 제어 방출, 지연 방출, 데포, 점진적 방출, 장기간 방출, 프로그램된 방출, 연장 방출, 비례적 방출, 연장 방출, 저장, 지연, 서방출, 이격된 방출, 지속 방출, 시간 코트, 지효성, 연장 작용, 층상화-시간 작용, 장기 작용성, 연장된 작용, 반복 작용, 느린 작용, 지속 작용, 지속 작용 의약 및 장시간 방출.
적합한 투약량은 다양한 임상 인자에 기반하여 담당의사 또는 다른 자격을 갖춘 의료인에 의해 결정될 수 있다. 의학분야에서 잘 공지된 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 항체 또는 컨쥬게이트, 환자의 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여될 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트는 1ng/㎏ 체중 내지 25㎎/㎏ 체중/용량, 예를 들어 0.1㎎/㎏ 체중 내지 10㎎/㎏ 체중, 예를 들어 0.5㎎/㎏ 체중 내지 8㎎/㎏ 체중, 예를 들어 1㎎/㎏ 체중 내지 6㎎/㎏ 체중, 예를 들어 2㎎/㎏ 체중 내지 5㎎/㎏ 체중의 양으로 투여될 수 있으며; 그러나, 특히 앞서 언급한 인자를 고려하여 이들 예시적 범위 미만 또는 초과의 용량이 생각된다. 요법이 연속적 주입이라면, 이는 또한 1㎍ 내지 10㎎/킬로그램 체중/분의 범위에 있을 수 있다.
당업자는 용량 수준이 구체적 항체의 기능, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 대상체의 민감성에 따라 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투약량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
통상적이고 약제학적으로 허용가능한 투여 경로는 정맥내, 동맥내, 근육내, 비강내, 기관내, 피하, 진피내, 국소 적용, 비강, 경구 및 다른 장용 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 요망된다면 조합될 수 있거나, 또는 항체 또는 컨쥬게이트 및/또는 목적으로 하는 효과에 따라 조절될 수 있다. 약제학적 조성물은 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 흡입 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 비강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 국소로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 두개내로 투여된다.
치료방법
본 개시내용은 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료가 필요한 환자에게 본 명세서의 다른 곳에 기재된 치료적 유효량의 임의의 항체, 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 항체 또는 컨쥬게이트는 단독으로(예를 들어, 단일요법으로) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여(예를 들어, 병용요법으로) 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유효량의 항체 또는 컨쥬게이트는 1회 이상의 용량에서 단독으로 투여될 때(예를 들어, 단일요법에서) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여(예를 들어, 병용요법으로) 투여될 때, 항체 또는 컨쥬게이트에 의한 치료가 없는 개체에서의 증상에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 이상만큼 개체에서 질환 또는 장애의 증상을 감소시키는데 효과적이다.
본 개시내용의 방법은 관심 대상의 임의의 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 상기 방법은 암을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트는 항체 또는 컨쥬게이트가 유효량으로 투여될 때, 숙주에서 암세포(들)의 성장, 전이 및/또는 침입을 저해한다. "암세포"는, 예를 들어, 비정상 세포 성장, 비정상 세포 증식, 밀도 의존적 성장 저해의 손실, 앵커리지-독립적 성장 잠재력, 종양 성장을 촉진시키는 능력 및/또는 면역손상된 비-인간 동물 모델에서의 발생, 및/또는 세포 형질전환의 임의의 적합한 지표 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있는 신생물 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미한다. "암세포"는 본 명세서에서 "종양 세포", "악성 세포" 또는 "암성 세포"와 상호호환적으로 사용될 수 있고, 고형 종양, 반고형 종양, 원발성 종양, 전이성 종양 등의 암세포를 포함한다.
특정 양상에서, 상기 방법이 암치료를 위한 것일 때, 컨쥬게이트의 항체 또는 항체 구성성분은 암세포의 표면 상에서 항원에 특이적으로 결합된다. 용어 "항원" 및 "에피토프"는 잘 이해되며, 면역계의 구성성분, 예를 들어, 항체 또는 T-세포 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 거대분자의 일부(예를 들어, 폴리펩타이드)를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "항원"은 항원성 에피토프, 예를 들어, 항원성 에피토프인 항원의 단편을 포함한다. 합텐은 또한 항원의 예이다. 에피토프는, 예를 들어 다른 분자가 없는 용액 중에서 항체에 의해 인식될 수 있다. 에피토프가 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합 분자와 결합될 때, 에피토프는 T 세포 항원에 의해 인식될 수 있다.
암치료에 관련하여 관심대상의 항원은 종양-특이적 항원, 예를 들어, 악성 세포 표면 상에 존재하고 비악성 세포 상에 존재하지 않는 항원을 포함한다. 다른 양상에서, 항체에 의해 결합되는 항원은 종양 관련 항원이다. "종양 관련 항원"은 정상 조직의 세포 상에서 제한된 발현을 지니는 악성 세포 상에서 발현된 항원, 정상 세포에 대해 악성 종양 상에서 훨씬 더 높은 밀도로 발현된 항원, 또는 발생적으로 발현된 항원을 의미한다.
임의의 종양 관련 항원 또는 종양-특이적 항원은 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트에 의해 표적화될 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 방법이 암치료에 대한 것일 때, 항원은 항체에 의해 특이적으로 결합되거나 또는 본 개시내용의 컨쥬게이트의 항체 구성성분은 HER2, CD19, CD22, CD30, CD33, CD56, CD66/CEACAM5, CD70, CD74, CD79b, CD138, 넥틴-4(Nectin-4), 메소텔린(Mesothelin), 막관통 당단백질 NMB(GPNMB), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), SLC44A4, CA6, CA-IX 또는 관심대상의 임의의 다른 종양 관련 또는 종양-특이적 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체의 특징과 관련하여 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하다"는 상이한 항원의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 특이적 결합 상호작용은, 일부 실시형태에서 샘플 또는 유기체(예를 들어, 인간)에서 약 10 내지 100배 이상(예를 들어, 약 1000- 또는 10,000-배 초과)으로 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원(또는 "표적" 및 "비표적" 항원)을 차별할 것이다. 특정 실시형태에서, 항체와 항원 사이의 친화도는, 그들이 항체-항원 복합체에 특이적으로 결합될 때에, 10-6M 미만, 10-7M 미만, 10-8M, 10-9M 미만, 10-10M 미만, 10-11M 미만, 또는 약 10-12M 미만의 KD(해리 상수)를 특징으로 한다.
본 개시내용의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암은 고형 종양, 유방암, 전립선암, 췌장암, 결장직장암종, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 역형성 대세포성 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 및 항체 기반 또는 항체-컨쥬게이트 기반 요법을 이용하여 치료될 수 있는 임의의 다른 유형의 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
키트
본 개시내용은 또한 키트를 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 키트는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 특징을 갖는 본 개시내용의 임의의 항체, 컨쥬게이트, 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 키트는 본 개시내용의 항체 또는 이의 경쇄 폴리펩타이드, 또는 본 개시내용의 임의의 컨쥬게이트를 생성하는데 유용한 임의의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 시스테인-함유 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어, 하나 이상의 항체 경쇄 및/또는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 이미 보유하는 적격 세포 또는 세포, C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부에서 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 환원시키기 위한 환원제, 시스테인 잔기의 환원된 설프하이드릴에 작용제를 컨쥬게이팅하기 위한 링커, 작용제(링커에 부착되거나 또는 링커로부터 분리될 수 있음), 시약, 완충제, 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이트를 생성함에 있어서 용도를 발견한 정제 칼럼 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 키트는, 예를 들어, 본 개시내용의 방법, 예컨대 질환 또는 장애의 치료방법, 항체 경쇄 폴리펩타이드, 및/또는 항체 컨쥬게이트의 제조방법의 제조방법을 실행하는 것을 가능하게 하는 것에서의 용도를 발견한다.
방법을 실행하기 위한 키트는 본 명세서에 기재된 항체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 이와 같이, 키트는 하나 이상의 단위 투약량으로서 존재하는 단일 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 2 이상의 별도의 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.
키트의 구성성분은 별도의 용기에 존재할 수 있고, 또는 다수의 구성성분이 단일 용기 내에 존재할 수도 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조 형태로 구성성분을 제공하는 것이 편리할 수 있으며, 따라서 그들은 바로 사용할 수 있고, 실온에서 편리하게 저장될 수 있다.
상기 언급한 구성성분에 추가로, 본 개시내용의 키트는, 예를 들어, 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이터를 이용하여 질환 또는 장애를 치료하기 위해 또는 본 개시내용의 항체 또는 컨쥬게이터를 제조하기 위해 키트의 구성성분을 이용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체 상에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 기재, 예컨대 종이 또는 플라스틱 등 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 키트 또는 이의 구성성분의 용기의 라벨 등으로(즉, 패키징 또는 부분패키징과 관련됨) 포장 삽입물로서 키트 내에 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 저장 매체, 예를 들어 CD-ROM, 디스켓, 하드 디스크 드라이브(Hard Disk Drive: HDD) 등 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 실제 설명서는 키트 내에 존재하지 않지만, 원거리 공급업자로부터 설명서를 얻기 위한 수단이, 예를 들어 인터넷을 통해 제공된다. 이 실시형태의 예는 설명서를 볼 수 있고/있거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹주소를 포함하는 키트이다. 설명서에 따르면, 설명서를 얻기 위한 이런 수단은 적합한 기재 상에 기록된다.
다음의 실시예는 예시의 방법으로 제공되며, 제한의 방법이 아니다.
실시예
실시예 1 - C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 시스테인-함유 연장부를 갖는 항체를 암호화하는 핵산의 클로닝
인간 IgG1C 및 인간 IgGkC 클로닝 벡터를 생성하기 위해, 인간 IgGC 및 IgkC 영역을 pTT5 벡터 내로 클로닝시켰다(도 1). 불변 영역을 지니는 프레임 내 가변 영역의 클로닝을 용이하게 하기 위해, 제한 부위를 불변 영역의 5' 말단 내로 도입하였다. 중쇄 불변 영역 서열을 GCC TCC로부터 NheI 제한 부위를 도입한 GCT AGC로 변화시키는 한편, 본래의 아미노산 서열을 유지하였다. 경쇄 폴리펩타이드 불변 영역 서열을 CGA ACT로부터 CGT ACG로 변화시켜 BsiWI 제한 부위를 생성하는 한편 본래의 아미노산 서열을 유지하였다. 오페론-유로 핀스(Operon - Euro fins)로부터 구입한 미스매치 PCR 프라이머를 설계함으로써 변화를 도입하였다. pTT5 벡터는 BsiWI 부위를 함유하지 않았기 때문에, 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 5' NheI 돌출부를 지니는 IgkC 5' 프라이머를 설계하였다. 정지 코돈의 BamHI 제한 부위 3 '을 지니는 3' 프라이머를 설계하였다.
PCR 반응에 대한 cDNA 주형을 생성하기 위해, 퀴아젠(Qiagen)(등록상표) RNeasy(등록상표) 미니프렙 키트를 이용하여 인간 말초 혈액으로부터 RNA를 추출하였고, 올리고dT 프라이머 및 인비트로젠(Invitrogen)(상표명)으로부터의 슈퍼스크립트(Superscript)(등록상표) III 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
PCR 후에, 적절한 제한 효소를 이용하여 단편 및 벡터를 분해하고, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다. 분해된 단편을 퀴아젠 겔 추출 키트를 이용하여 겔로부터 추출하였고, T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 이용하여 벡터 내로 결찰시켰다. 적격 DH5α 이콜라이(E-coli)(인비트로젠)를 형질전환시키고, 단일 세포 콜로니를 암피실린 선택적 LB 플레이트 상에서 37℃로 밤새 성장시켰다. 플라스미드를 단리시키기 위해, 단일 세포 콜로니를 액체 LB-암피실린 배지 내로 접종하고 나서, 37℃에서 밤새 성장시키고, 플라스미드를 퀴아젠(등록상표) QIAprep(등록상표) 스핀 미니프렙 키트를 이용하여 단리시켰다. 클론을 미니프렙 DNA 분해물에 의해 선별하고 나서, 바이오매터스(Biomatters)로부터의 제니오스(Geneious) 서열 정렬, 어셈블리 및 분석 소프트웨어를 이용하는 서열 분석에 의해 확인하였다. 클로닝을 위해 사용한 프라이머 서열을 표 1에 제공한다.
Figure pct00001
ERBB 특이적 항체를 생성하기 위해, 4D5 인간화된 변이체 8인 허셉틴 V-유전자를 IDT(등록상표)(인터그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies))로부터의 g블록스(gBlocks)(등록상표) 유전자 단편으로서 합성하였다. 합성한 서열을 표 2에 제공한다.
Figure pct00002
단편을 중쇄에 대해 EcoRI 및 NheI 분해물을 이용하고 상기 기재한 바와 같은 경쇄 폴리펩타이드에 대해 EcoRI 및 BsiWI 분해물을 이용하여 언급한 불변 영역 pTT5 벡터 내로 클로닝시켰다.
경쇄 폴리펩타이드에 (GGGSC)x 연장부를 첨가하기 위해, (여기서 x는 첨가한 반복부의 수임) 3' 말단 프라이머를 설계하고 표 3에 나타내는 목적으로 하는 서열을 지니는 유로핀스 MWG 오페론으로부터 순위를 매겼다. PCR 반응에서 주형으로서 앞서 기재한 허셉틴 VK 작제물을 이용하여 표준 클로닝 절차를 수행하였다. 4개의 시스테인 작제물을 생성하기 위해, 2단계 중복 접근을 취하였으며, 여기서 프라이머 Igk_역방향_3_cys을 첫 번째 PCR에서 사용한 다음, 프라이머 Igk_역방향_4_cys_Bam 및 주형으로서 첫 번째 PCR로부터의 PCR 산물을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응에서 사용한 5' 프라이머는 pTT5_정방향이었다(표 3). PCR 단편을 결찰시키고, 클로닝시키고 나서, 상기 기재한 바와 같이 분석하였다.
Figure pct00003
실시예 2 - 항체 생성 및 정제
상기 실시예 1에서 생성한 플라스미드의 퀴아젠 맥시프렙을 실행하여 형질감염 준비 플라스미드를 단리시켰다. HEK293 세포를 293 펙틴(인비트로젠)을 이용하여 허셉틴 중쇄 및 허셉틴 경쇄-cys 작제물과 함께 공동혈질감염시켰다 . 세포를 5일 동안 0.1% 플루로닉 F68(깁코) 용액으로 보충한 프리스타일 293 발현 배지(깁코)에서 성장시켰다. 형질감염 후 24시간에, 세포를 0,5% 트립톤으로 보충하였다. 상청액을 수집하고 나서, 분비된 항체를 단백질 A 세파로스 배취 중력 프로토콜(GE헬스케어(GEHealthcare))를 이용하여 정제한 다음, 30kDa MW 컷오프(밀리포어(Millipore))를 지니는 아미콘(Amicon)(등록상표) 울트라 15 필터를 이용하여 PBS PH 7.4로 완충제 교환하였다.
실시예 3 - 허셉틴- VLCysX 다이설파이드 결합의 환원
PBS 중의 허셉틴 및 허셉틴-VLCysX(X = 1, 2 또는 4)의 샘플(1 내지 5㎎)을 100mM 인산염, 50mM NaCl, 2mM DTP A, pH 6.1로 사전조건화한 제바(Zeba)(상표명) 스핀 칼럼(피어스(Pierce) 카탈로그 #87767)에 적용하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 완충제 교환하였다. 단백질 농도를 확립하기 위한 표준으로서 허셉틴을 이용하여 바이신코닌산(피어스, #23225)을 이용하여 용출액을 분석하고, 표준으로서 시스테인을 이용하는 엘만 시약으로 유리 티올기가 없음을 확립하였다.
허셉틴 또는 허셉틴 VLCysX(100mM 인산염 중의 5 내지 30μM, 50mM NaCl, 2mM DTPA, pH 6.1)를 동일한 완충제 중에서 1.0M 저장액으로부터 시스테아민 하이드로클로라이드(5 내지 10mM)의 첨가에 의해 환원시켰고, 실온 또는 37℃에서 40 내지 180분 동안 인큐베이션시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에, 시스테아민을 100mM 인산염, 50mM NaCl, 2mM DTPA, pH 6.1로 사전조건화시킨 제바(상표명) 스핀 칼럼을 거친 통과에 의해 반응 혼합물로부터 제거하였다(40KDa MWCO). 과량의 시스테아민이 제거되었음을 보장하기 위해, 시스테인 연속 희석의 분석에 의해 생성한 표준 곡선을 사용하여 엘만 시약을 이용하여 용출액을 분석하였다. 이 분석은 또한 단백질 당 평균 티올 함량의 일부 측정을 제공하였다.
실시예 4 - 세포독성제에 대한 허셉틴- VLCysX의 컨쥬게이션
얼음 상에서 상기 실시예 3으로부터의 용출액을 냉각시킨 후에, 말레이미드 독소(독소 1 또는 독소 2)를 10mM DMSO 저장 용액(일반적으로 티올 당 2.0eq., 환원된 허셉틴 대조군(허셉틴-독소 2)에 첨가된 양과 동일함)으로부터 첨가하였다. 컨쥬게이션 반응을 얼음 상에서 30 내지 70분 동안 진행시킨 후에, 정제하고, 20mM 시트르산 나트륨, pH 5.5로 완충제 교환하였다. 정제한 컨쥬게이트를 멸균 여과시켰고(코스타(Costar)(등록상표) 스핀-엑스(Spin-X)(등록상표) 0.22㎛ 원심분리 필터, # 8161) 총 단백질 함량에 대해 BCA 시약을 이용하여 분석하였다.
본 명세서에서 사용한 바와 같은 "독소 1"은 MC-vc-PABC-독소이고, 여기서 독소는 (S,E)-N-(4-(아미노메틸)벤질설폰일)-2,5-다이메틸-4-((S)-N,3,3-트라이메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)-3-페닐부탄아미도)부탄아미도)헥스-2-엔아마이드이다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "독소 2"는 MC-vc-독소이며, 여기서 독소는 (S,E)-N-(4-아미노벤질설폰일)-2,5-다이메틸-4-((S)-N,3,3-트라이메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)-3- 페닐부탄아미도)부탄아미도)헥스-2-엔아마이드이다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "독소 3"은 MT-vc-독소이며, 여기서 독소는 (S,E)-N-(4-아미노페닐설폰일)-2,5-다이메틸-4-((S)-N,3,3-트라이메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)-3- 페닐부탄아미도)부탄아미도)헥스-2-엔아마이드이다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "독소 4"는 MP(T-vc-독소)2이며, 여기서 독소는 (S,E)-N-(4-아미노페닐설폰일)-2,5-다이메틸-4-((S)-N,3,3-트라이메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)-3-페닐부탄아미도)부탄아미도)헥스-2-엔아마이드이다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "독소 5"는 MT-vc-PABC-독소이고, 여기서 독소는 (S,E)-N-(4-(아미노메틸)벤질설폰일)-2,5-다이메틸-4-((S)-N,3,3-1다이메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)-3-페닐부탄아미도)부탄아미도)헥스-2-엔아마이드이다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "독소 6"은 MT-vc-독소이고, 여기서 독소는 하기와 같다:
Figure pct00004
실시예 5 - 암세포 생존도에 대한 허셉틴 VLCysX의 효과 시험
상기 실시예 4에서 생성한 항체 약물 컨쥬게이트를 Her2 양성 인간 유방 암종 세포주 HCC1954에 대해 상이한 농도에서 시험하였다. 화합물을 첨가하기 전날에, 2500개 세포/100㎕의 배지 밀도로 완전 성장 배지를 이용하여 불투명-벽 투명 바닥 96-웰 조직 배양-처리 마이크로타이터 플레이트에 HCC1954 세포(100㎕)를 첨가하였다. HCC1954 세포를 37℃/5% CO2에서 밤새 인큐베이션시켜 마이크로타이터 플레이트 표면에 세포를 부착시켰다. 항체 약물 컨쥬게이트를 목적으로 하는 최종 최대 농도의 5배에서 완전 성장 배지에서 희석시키고, 이어서, 화합물을 동일한 배지에서 8단계로 1:3으로 적정하였다. 화합물이 없는 대조군(성장 배지 단독)을 6회 중복해서 각각의 마이크로타이터 플레이트 상에 포함시켰다. 준비한 화합물 적정을 HCC1954 세포에 3회 중복해서 첨가하였다(25㎕/웰). 세포 및 화합물 적절을 37℃/5% CO2에서 3 또는 5일밤 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 각각의 분석 웰에 30㎕의 준비한 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)(등록상표)를 첨가함으로써 셀타이터-글로(등록상표) 시약을 이용하여 세포 생존도를 측정하였다. 마이크로플레이트 루미노미터(500ms 노출 시간)를 이용하는 발광 측정 전 최소 20분 동안 혼합물을 인큐베이션시켰다. 수집한 상대적 발광 단위(relative luminescence unit: RLU)를 상기 언급한 성장 배지 단독 대조군을 이용하여 세포독성%로 전환한다(세포독성% = 1 - [웰 RLU/평균 배지 단독 대조군 RLU]). 데이터를 프리즘 그래프 패드 소프트웨어에 의한 비-선형 회귀 방법을 이용하여 곡선에 적합화시켰다. 이 연구로부터의 데이터를 나타내는 그래프를 도 3에 제공한다. Her-VLCys2-독소 2, Her- VLCys1-독소 1 및 허셉틴-독소 2의 EC50 값을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00005
실시예 6 - C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 시스테인-함유 연장부를 갖는 추가적인 항체를 암호화하는 핵산의 클로닝
추가적인 경쇄 연장부를 생성하기 위해, IDT(등록상표)로부터의 합성 g블록스(등록상표) 유전자 단편을 목적으로 하는 서열을 이용하여 정렬하고, 깁슨(Gibson) 어셈블리 클로닝 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 이용하는 허셉틴 VK 내로 프레임내 클로닝시켰다. 모든 클론을 서열 확인하고 나서, 실시예 1에서 상기 기재한 바와 같이 분석하였다.
경쇄 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열을 이하의 표 5에 제공한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 7 - 항체 생성 및 정제
상기 실시예 6에서 생성한 클론의 퀴아젠 맥시프렙을 실행하여 형질감염 준비 플라스미드를 단리시켰다. HEK293 세포를 293 펙틴(인비트로젠)을 이용하여 허셉틴 중쇄 및 허셉틴 경쇄-cys 작제물과 함께 공동혈질감염시켰다. 세포를 5일 동안 0.1% 플루로닉 F68(깁코) 용액으로 보충한 프리스타일 293 발현 배지(깁코)에서 성장시켰다. 형질감염 후 24시간에, 세포를 0.5% 트립톤으로 보충하였다. 상청액을 수집하고 나서, 분비된 항체를
Figure pct00016
기계 및 HiTrap Mab 셀렉트(Select) SuRe 칼럼(카탈로그# 11-0034-93)을 이용하여 상청액으로부터 정제한 다음, 30kDa MW 컷오프(밀리포어(Millipore))를 지니는 아미콘(Amicon)(등록상표) 울트라 15 필터를 이용하여 PBS PH 7.4로 완충제 교환하였다.
실시예 8 - 이중 환원 및 컨쥬게이션
2.5mM, pH 6.7 저장 용액으로부터 PBS 중의 1.25mM 다이에틸렌트라이아민펜타아세테이트(DTPA)의 첨가에 의해 허셉틴 VLSpacerX (PBS 중의 30μM)를 환원시킨 다음, 1.0 M 저장액으로부터 시스테아민 하이드로클로라이드(최종 농도 1mM)를 첨가하였다. 샘플을 120분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에, PBS+1mM DTPA pH7.3으로 사전조건화한 제바(Zeba)(상표명) 스핀 칼럼(40KDa MWCO)을 거친 통과에 의해 반응 혼합물로부터 시스테아민을 제거하였다.
용출액을 냉각시킨 후에, 말레이미드 독소(독소 1, 독소 3 또는 독소 4)를 10mM DMSO 저장 용액으로부터 첨가하였다(일반적으로 환원된 허셉틴 대조군에 첨가한 양과 동등한 양으로 항체 농도에 기반하여 5.0eq.). PBS로 사전 조건화한 제바(상표명) 스핀 칼럼(40KDa MWCO)을 거쳐 통과하기 전에 얼음 상에서 30 내지 70분 동안 컨쥬게이션 반응을 진행시켰다.
더 높은 약물 부하를 달성하기 위해, 출발 물질로서 컨쥬게이팅한 물질을 이용하여 상기 설명한 환원 및 컨쥬게이션 절차를 반복하였다.
실시예 9 - 환원 및 재산화에 의한 컨쥬게이션을 위한 경쇄 연장부 항체의 제조
전장, 경쇄 연장 단클론성 항체를 최종 항체 농도 2.5㎎/㎖로 PBS 및 1mM DTPA 중에서 37℃로 2시간 동안 약 12배의 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드로 환원시켰다. 환원된 경쇄 연장부 항체를 제바(상표명) 스핀 탈염 칼럼(40K MWCO)상에 장입하고 나서, PBS로 용리시켰다. 용리시킨 환원된 항체를 PBS 중에서 실온에서 30분 동안 10mM 데하이드로아스코르브산(DHAA) 10당량으로 처리하였다.
실시예 10 - 경쇄 연장부 항체의 컨쥬게이션
실시예 9로부터의 재산화된 항체를 항체에 대해 3.5 몰 당량과 조합하고 나서, 혼합하고, 실온에서 약 1시간 동안 두어서 컨쥬게이션을 달성하고, Tsp2-독소 3, Tsp3-독소 3, Tsp4-독소 3, Tsp5-독소 3, Tsp6-독소 3, Tsp9-독소 3, Tsp10-독소 3, Tsp10-독소 4, Tsp10-독소 1, Tsp 11-독소 3, TVLCys1-독소 3 (DAR 1.06), Bsp10-독소 3, Bsp10-독소 4, Bsp10-독소 1, Bsp10-독소 6, 및 Bsp10-MC-vc-PABC-MMAE를 포함하는 경쇄 연장부 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 형성한다. 컨쥬게이션 혼합물을 제바(상표명) 스핀 탈염 칼럼(40K MWCO) 상에 장입하고 나서, PBS로 용리시켰다.
실시예 11 - 항체 결합 분석
HER2 발현 MDA-MB-231 세포를 트립신 처리하고 나서 계수화하고, 50,000개 세포/샘플을 비컨쥬게이팅 MAb과 함께 또는 컨쥬게이팅한 ADC와 함께 4℃에서 50㎕ 총 용적으로 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 항체를 10% 소 태아 혈청으로 보충한 레보비츠 LI5 배지에서 20000, 4000, 800, 160, 32, 6.4, 1.28 및 0.256ng/㎖로 적용하였다. 인큐베이션시킨 후에, 세포를 빙랭 PBS+1% FBS로 2회 세척하고 나서, 알렉사 647 표지 염소 항 인간 IgGFc(2㎍/㎖) 2차 항체 + 2.5㎍/㎖ 7-아미노악티노마이신 D와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 30분 동안 인큐베이션시키고 나서, 2회 세척하고, 50㎕ PBS+1%FBS 중에서 재현탁시키고 나서, 유세포분석기에 의해 분석하였다. 비컨쥬게이션 항체에 대한 결합 결과를 도 4(패널 A 및 B)에 나타내는 한편, ADC에 대한 결합 결과를 도 5(패널 A 및 B)에 나타낸다. "TSP2"는 서열번호 105의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP3"은 서열번호 106의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP4"는 서열번호 107의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP5"는 서열번호 108의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP6"은 서열번호 109의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP9"는 서열번호 112의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP10"은 서열번호 113의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. "TSP11"은 서열번호 114의 경쇄 폴리펩타이드를 갖는 항체이다. VLcys1은 C-말단의 경쇄 연장부 GGGSC(서열번호 60)를 갖는 트라스투주맙이다.
실시예 12 - 시차주사 열량측정법( DSC )
시차주사 열량측정법(DSC) 실험을 샘플 상에서 수행하였다: 연장부 10(TSP10)을 지니는 트라스트주맙 및 PBS pH 7.4 중의 트라스투주맙(T). DSC 세포 중의 샘플을 장입하기 전에, 샘플을 실온에서 평형상태로 만들고, 완충제로 희석시키고 나서, 8분 동안 교반시키면서 진공하에 탈기시켰다. 샘플을 VPCapillary-DSC(마이크로칼(MicroCal))을 이용하여 60℃/시간의 스캔 속도로 10 내지 100℃에서 스캔하였다. 기준 세포는 PBS 완충제를 함유하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
실시예 13 - 알렉사488 컨쥬게이션
5-말레이미도-알렉사488을 상기 기재한 환원/컨쥬게이션 방법을 이용하여 Mab에 컨쥬게이션시켰다. PBS 중에서 100㎍/㎖로 1:15 내지 1:40의 희석으로 샘플을 이용하고 각각의 레인에서 20㎕를 장입하여 SDS PAGE에 의해 항체를 분석하였다. 알렉사488의 형광을 측정하는 타이푼 트리오(Typhoon Trio)(상표명) 이미저(GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences))를 이용하여 겔을 영상화하였다. 결과를 도 7에 나타낸다.
실시예 14 - 생체내 연구 프로토콜
7 내지 8주령 암컷 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스(잭슨(Jackson))을 총 용적 100㎕로 매트리겔과 1:1로 혼합한 5*106 NCI-N87 종양 세포(ATCC 카탈로그 # CRL-5822)로 접종하였다. 종양을 월요일, 수요일 및 금요일마다 측정하였다. 일단 종양의 크기가 150 내지 200㎣에 도달되면, 동물을 이하의 표 6에 나타내는 바와 같은 처리군에 할당하여 그룹에 따라 평균 종양 크기의 균형을 잡았다. "T"는 트라스투주맙에 대한 약어이다.
Figure pct00017
동물을 표 6에서 표시한 농도로 단일 정맥내 주사를 이용하여 그들의 각각의 시험 항목으로 처리하고, 60일까지 또는 종양 크기가 800㎣에 도달될 때까지 월요일, 수요일 및 금요일마다 종양 측정을 계속하였다. 모든 동물에 주사 기록에서 표시한 바와 같은 용량을 투여하였다. 주사 후 임상 관찰 기록(Post Injection Clinical Observation Record: PICOR) 형식을 사용하여 주사 후 급성 독성을 모니터링하였다. 임의의 그룹에서 상당한 체중 손실이 관찰되지 않았고, 주사 후 급성 독성 반응을 PICOR 파일에서 주목하였다. 생체내 연구 결과를 도 8에 나타낸다.
실시예 15 - 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 항체-약물 컨쥬게이트의 분석(HIC)
TSK겔 뷰틸-NPR 칼럼(2.5μM, 4.6㎜ x 3.5㎝)을 이용하여 280㎚에서의 DAD로 HP 1100 시리즈 HPLC 상에서 항체 약물 컨쥬게이트의 HIC 분석을 수행하였다. 상기 방법을 12분에 걸쳐 95% 내지 5% 이동상 A의 선형구배로부터 1㎖/분으로 실행하고 3분 동안 95% A로 다시 재평형상태로 만들었다(A: pH 4.4에서 1,5M 황산암모늄 및 25mM 인산나트륨 1염기성; B: pH 4.73에서 25mM 인산나트륨 중의 25% IPA). 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어를 데이터 수집, 분석 및 피크 면적 정량화를 위해 사용하였다. 결과를 도 20 내지 41에 나타낸다.
실시예 16 - 천연 크기 배제 크로마토그래피에 의한 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 분석
액퀴티(Acquity) UPLC BEH 200 SEC 칼럼(1.7μM, 4.6㎜ x 150㎝)을 이용하여 280㎚에서의 DAD로 HP 1100 시리즈 HPLC 상에서 재조합 항체 및 항체 약물 컨쥬게이트의 비변성 SEC 분석을 수행하였다. pH 6.8에서 25mM 인산나트륨 및 150mM 염화나트륨 완충제를 이용하여 0.2㎖/분으로 20분에 걸쳐 등용매 용리를 이용하여 분석을 수행하였다. 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어를 데이터 수집, 분석 및 피크 면적 정량화를 위해 사용하였다.
PBS, pH 7 중에서 Tsp10, Tsp10-독소 3, Tsp10-독소 1, Tsp10-독소 4, TSp6-독소 3, TSp4-독소 3의 1㎎/㎖ 용액의 개개 분취액을 준비하였다. 비변성 SEC-UV 분석(앞서 기재함)을 37 ℃에서 인큐베이션 전에 0시점에 10㎕의 주사 용적에서 수행하였다. 각각의 샘플의 분취액을 191 시간의 인큐베이션 후에 그리고 330시간의 인큐베이션 후에 비변성 SEC-UV에 의해 분석하였다. 각각의 종의 단량체 피크 면적%를 그들의 각각의 0시점 측정에 대해 조절하였다.
트라스투주맙 대조군에 대해, 99.36%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 하나의 상이한 응집 종은 0.63%로 존재하였다. T-VLCys1에 대해, 98.39%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 응집 종은 1.16%, 0.266% 및 0.175%로 존재하였다. T-SP2에 대해, 96.5%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 두 상이한 응집 종은 0.3%, 1.5% 및 1.8%로 존재하였다. T-SP3에 대해, 98.5%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 두 상이한 응집 종은 1.17% 및 0.35%로 존재하였다. T-SP4에 대해, 98%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 1.4%, 0.39% 및 0.22%로 존재하였다. T-SP5에 대해, 94%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 두 상이한 응집 종은 2.1% 및 3.2%로 존재하였다. T-SP6에 대해, 89%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 1.5% 및 8.8%로 존재하였다. T-SP7에 대해, 95.95%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 3%, 0.51% 및 0.50%로 존재하였다. T-SP9에 대해, 94.5%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 0.6%, 3.8% 및 1%로 존재하였다. T-SP10에 대해, 97.3%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 2.2%, 0.27% 및 0.22%로 존재하였다. T- SP-11에 대해, 77.7%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 6.3%, 8.6%, 2.7% 및 4.5%로 존재하였다. T- SP12에 대해, 87.5%의 단백질 샘플은 단량체 상태인 반면, 다른 상이한 응집 종은 2.2%, 1.6%, 8.6% 및 4.5%로 존재하였다.
실시예 17 - 크기 배제 크로마토그래피-완전 질량 분석에 의한 항체 및 항체-약물 컨쥬게이트의 분석
재조합 항체 및 항체 약물 컨쥬게이트의 변성 SEC-고분해능 질량 분석법(HRMS)을 액퀴티 UPLC BEH 200 SEC 칼럼(1.7μM, 4.6㎜ x 150㎝)을 이용하여 280㎚에서 PDA 검출을 이용하는 워터스 액퀴티 H클래스 UPLC 상에서 수행하였다. 250 내지 4900m/z의 스캔 범위를 이용하는 마이크로매스 Q-TOF 프리미어를 이용하여 고분해능 질량 분석법 검출을 달성하였다. 0.1% TFA 및 0.1% FA와 함께 70/30 H2O/ACN을 이용하여 11분에 걸쳐 0.25㎖/분으로 등용매 용리를 이용하여 분석을 수행하였다. MaxEnt1로 디콘볼루션한 스펙트럼을 이용하는 MassLynx 4.1을 이용하여 데이터 수집 및 분석을 행하였다.
서열번호 60의 연장부를 갖는 항체(T-VLcys1)에 대한 결과를 도 9, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 63의 연장부를 갖는 항체(T-VLcys2)에 대한 결과를 도 10, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 64의 연장부를 갖는 항체(T-VLcys4)에 대한 결과를 도 11, 패널 A 및 B에 나타낸다. 서열번호 105의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 12, 패널 A 및 B에 나타낸다. 서열번호 106의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 13, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 107의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 14, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 108의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 15, 패널 A 및 B에 나타낸다. 서열번호 109의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 16, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 110의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 17, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 113의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 18, 패널 A 내지 C에 나타낸다. 서열번호 114의 경쇄를 갖는 항체에 대한 결과를 도 19, 패널 A 내지 C에 나타낸다.
실시예 18 - 시험관내 세포 증식 분석
HER2 발현 HCC1954 세포, HER2 발현 N87 세포 및 HER2 항원 음성 주카트 세포를 다양한 트라스투주맙("T")-기반 ADC 및 대조군으로 처리함으로써 상기 실시예 5에서 기재한 것과 유사한 절차를 이용하여 시험관내 세포 증식 분석을 수행하였다. "유리 독소 1"은 그의 유리 형태로(즉, 컨쥬게이션되지 않음) 상기 기재한 바와 같은 독소 3이다. 결과를 도 42 내지 53에 나타내고, 이하의 표 7 및 표 8에서 요약한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
CD30 항원 양성 카르파스 299(Karpas 299) 세포를 다양한 브렌툭시맙("B")계 ADC 및 대조군으로 처리함으로써 시험관내 세포 증식 분석을 또한 수행하였다. 결과를 도 54 내지 58에 나타내고, 이하의 표 9에 요약하였다.
Figure pct00020
실시예 19 - 트라스투주맙 C-말단의 경쇄 연장부 변이체의 변성 PAGE
트라스투주맙 경쇄 연장부 변이체를 고정 단백질 A 상에서 정제하고 나서, 비-환원 변성 또는 환원(+DTT) 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)을 실시하였다. 결과를 도 59 내지 62에 나타낸다.
실시예 20 - 컨쥬게이트 안정성
열 안정성 분석을 이용하여 ADC 안정성을 평가하였다. PBS, pH 7 중의 Tsp10, Tsp10-독소 3, Tsp10-독소 1, Tsp10-독소 4, TSp6-독소 3, TSp9-독소 3의 1㎎/㎖ 용액의 개개 분취액을 준비하였다. 비변성 SEC-UV 분석(앞서 기재함)을 37 ℃에서 인큐베이션 전에 0시점에 10㎕의 주사 용적에서 수행하였다. 각각의 샘플의 분취액을 191 시간의 인큐베이션 후에 그리고 330시간의 인큐베이션 후에 비변성 SEC-UV에 의해 분석하였다. 각각의 종의 단량체 피크 면적%를 그들의 각각의 0시점 측정에 대해 조절하였다. 결과를 도 63, 패널 A 및 B에 나타낸다.
앞서 언급한 발명은 이해의 명확함의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재되었지만, 특정 변화 및 변형이 첨부한 청구범위로부터 벗어나는 일 없이 그에 대해 이루어질 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 명확하다.
따라서, 앞의 언급은 단지 본 발명의 원칙을 예시한다. 당업자는 본 명세서에 명확하게 기재하거나 나타내지 않았더라도, 본 발명의 원칙을 구현하고 그의 정신과 범주 내에 포함되는 다양한 방식을 고안할 것으로 인식될 것이다. 더 나아가, 본 명세서에 인용된 모든 실시예 및 조건적 언어는 원칙적으로 본 발명의 원칙 및 기술을 발전시키기 위해 발명자가 기여한 개념을 이해함에 있어서 독자를 돕도록 의도되며, 이러한 구체적으로 인용된 실시예 및 조건에 대한 제한 없이 해석되어야 한다. 게다가, 본 발명의 원칙, 양상 및 실시형태뿐만 아니라 이의 구체적 예를 인용하는 본 명세서의 모든 언급은 이의 구조적 및 기능적 동등물을 둘 다 포괄하는 것으로 의도된다. 추가적으로, 이러한 동등물은 현재 공지된 동등물 및 장래에 개발될 동등물, 즉, 구조와 관계없이 동일한 기능을 수행하도록 개발된 임의의 구성요소를 둘 다 포함하도록 의도된다. 따라서 본 발명의 범주는 본 명세서에 나타내고 기재한 예시적 실시형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 정신은 첨부된 청구범위에 의해 구현된다.

Claims (78)

  1. 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체로서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 항원에 특이적으로 결합하지 않는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 아미노산 스페이서를 포함하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스페이서는 1 내지 30개의 아미노산을 포함하는, 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스페이서는 스페이서는 3 내지 20개의 아미노산을 포함하는, 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스페이서는 4 내지 17개의 아미노산을 포함하는, 항체.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 글리신(G) 잔기 및 세린(S) 잔기를 포함하는, 항체.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 a) 하나 이상의 글리신(G) 잔기 및 b) 하나 이상의 세린(S) 잔기로 이루어진, 항체.
  8. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 서열 GGGS를 포함하는, 항체.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 2 내지 10개의 스페이서를 포함하는, 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 스페이서는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 적어도 2개의 스페이서의 아미노산 서열은 상이한, 항체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인이 각각의 상기 스페이서 사이에 존재하는, 항체.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 스페이서는 연속적인, 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장부는 인간 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 인간 아미노산 서열은 인간 항체 힌지 영역 또는 T 세포 수용체 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인은 환원된 설프하이드릴기를 포함하는, 항체.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 상기 항체에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함하는, 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 작용제는 링커를 통해 상기 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된, 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 작용제는 치료제인, 항체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인, 항체.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 작용제는 표지제인, 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표지제는 생체내 조영제(imaging agent)인, 항체.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기 이외의 시스테인에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함하지 않는, 항체.
  24. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 2 이상의 시스테인을 포함하되, 상기 2 이상의 시스테인 중 적어도 둘은 치료제 및 표지제로부터 독립적으로 선택된 작용제에 컨쥬게이팅된, 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv 및 이중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 결합 단편인, 항체.
  26. 컨쥬게이트로서,
    시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체; 및
    상기 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기를 통해 상기 항체에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함하는, 컨쥬게이트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 작용제는 링커를 통해 상기 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된, 컨쥬게이트.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 아미노산 스페이서를 포함하는, 컨쥬게이트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 스페이서는 1 내지 30개의 아미노산을 포함하는, 컨쥬게이트.
  30. 제28항에 있어서, 상기 스페이서는 3 내지 20개의 아미노산을 포함하는, 컨쥬게이트.
  31. 제28항에 있어서, 상기 스페이서는 4 내지 17개의 아미노산을 포함하는, 컨쥬게이트.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 글리신(G) 잔기 및 세린(S) 잔기를 포함하는, 컨쥬게이트.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 하나 이상의 글리신(G) 잔기 및 하나 이상의 세린(S) 잔기로 이루어진, 컨쥬게이트.
  34. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 서열 GGGS를 갖는, 컨쥬게이트.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 2 내지 10개의 스페이서를 포함하는, 컨쥬게이트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 스페이서는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 컨쥬게이트.
  37. 제35항에 있어서, 상기 적어도 2개의 스페이서의 아미노산 서열은 상이한, 컨쥬게이트.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인이 각각의 상기 스페이서 사이에 존재하는, 컨쥬게이트.
  39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 스페이서는 연속적인, 컨쥬게이트.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장부는 인간 아미노산 서열을 포함하는, 컨쥬게이트.
  41. 제40항에 있어서, 상기 인간 아미노산 서열은 인간 항체 힌지 영역 또는 T 세포 수용체 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하는, 컨쥬게이트.
  42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인은 환원된 설프하이드릴기를 포함하는, 컨쥬게이트.
  43. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 치료제인, 컨쥬게이트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제인, 컨쥬게이트.
  45. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 표지제인, 컨쥬게이트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 표지제는 생체내 조영제인, 컨쥬게이트.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 C-말단의 아미노산 연장부의 시스테인 잔기 이외의 시스테인에 컨쥬게이팅된 작용제를 포함하지 않는, 컨쥬게이트.
  48. 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 2 이상의 시스테인을 포함하되, 상기 2 이상의 시스테인 중 적어도 둘은 치료제 및 표지제로부터 독립적으로 선택된 작용제에 컨쥬게이팅된, 컨쥬게이트.
  49. 제26항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv 및 이중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 결합 단편인, 컨쥬게이트.
  50. 시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  51. 제50항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 아미노산 스페이서를 포함하는, 핵산.
  52. 제51항에 있어서, 상기 스페이서는 1 내지 30개의 아미노산을 포함하는, 핵산.
  53. 제52항에 있어서, 상기 스페이서는 3 내지 20개의 아미노산을 포함하는, 핵산.
  54. 제53항에 있어서, 상기 스페이서는 4 내지 17개의 아미노산을 포함하는, 핵산.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 글리신(G) 잔기 및 세린(S) 잔기를 포함하는, 핵산.
  56. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 하나 이상의 글리신(G) 잔기 및 하나 이상의 세린(S) 잔기로 이루어진, 핵산.
  57. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 서열 GGGS를 갖는, 핵산.
  58. 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단의 아미노산 연장부는 2 내지 10개의 스페이서를 포함하는, 핵산.
  59. 제58항에 있어서, 상기 스페이서는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 핵산.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연장부는 인간 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  61. 제60항에 있어서, 상기 인간 아미노산 서열은 인간 항체 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  62. 제58항에 있어서, 상기 적어도 2개의 스페이서의 아미노산 서열은 상이한, 핵산.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인이 각각의 상기 스페이서 사이에 존재하는, 핵산.
  64. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 스페이서는 연속적인, 핵산.
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, ScFv 및 이중특이성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 이의 결합 단편인, 핵산.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  67. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제66항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  68. 제67항에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포로부터 선택된, 숙주 세포.
  69. 약제학적 조성물로서,
    제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체 또는 제26항 내지 제49항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트; 및
    약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  70. 치료가 필요한 환자에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항체, 제26항 내지 제49항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 또는 제69항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 항체 경쇄의 제조방법으로서,
    시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 항체 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 항체 경쇄의 제조방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 방법은 상기 C-말단의 아미노산 연장부에서 상기 시스테인의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 더 포함하는, 항체 경쇄의 제조방법.
  73. 항체 컨쥬게이트의 제조방법으로서,
    시스테인 잔기를 포함하는 C-말단의 아미노산 연장부를 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체에 작용제를 컨쥬게이팅하는 단계를 포함하되, 상기 작용제는 상기 C-말단의 아미노산 연장부의 상기 시스테인 잔기에 컨쥬게이팅된, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 방법은 상기 항체에 상기 작용제를 컨쥬게이팅하기 전에 상기 C-말단의 아미노산 연장부에서 상기 시스테인의 설프하이드릴기를 환원시키는 단계를 더 포함하는, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 환원시키는 단계는 상기 C-말단의 아미노산 연장부에 있지 않은 시스테인을 거쳐서 상기 C-말단의 아미노산 연장부에서 하나 이상의 시스테인을 우선적으로 환원시키는 단계를 포함하는, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 환원시키는 단계는 상기 C-말단의 아미노산 연장부에서 하나 이상의 시스테인을 환원시키고, 상기 C-말단의 아미노산 연장부에 있지 않은 임의의 시스테인을 환원시키지 않는 단계를 포함하는, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 컨쥬게이팅은 말레이미드 반응 화학, 할로아세틸 반응 화학, 비닐 설폰 반응 화학 또는 피리딜 다이설파이드 반응 화학을 이용하여 상기 환원된 설프하이드릴에 상기 작용제를 가교시키는 단계를 포함하는, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 치료제 또는 표지제인, 항체 컨쥬게이트의 제조방법.
KR1020167019769A 2013-12-23 2014-12-23 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법 KR20160122127A (ko)

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