CN116115771A - 关于用于在蛋白药物缀合物中使用的接头的材料和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及关于用于在蛋白药物缀合物中使用的接头的材料和方法。本申请涉及蛋白药物缀合物、制备所述蛋白药物缀合物的方法及其在疗法中的用途。具体地,本发明涉及包含球状蛋白、改进的接头和药物的蛋白药物缀合物,用于在靶向药物递送应用中使用。
Description
本申请是申请日为2015年10月27日,申请号为201580052243.2,发明名称为“关于用于在蛋白药物缀合物中使用的接头的材料和方法”的申请的分案申请。
本发明涉及蛋白药物缀合物和制备所述蛋白药物缀合物的方法。更具体地,本发明涉及提供蛋白、接头和药物例如细胞毒素以产生蛋白药物缀合物。另外,本发明提供了用于在蛋白药物缀合物中使用的改进的接头以及将所述接头引入所述蛋白药物缀合物中的方法。更具体地,蛋白药物缀合物可以是抗体药物缀合物(ADC)或含白蛋白和接头的药物缀合物。
已知蛋白药物缀合物,特别是抗体药物缀合物,提供将高效药物靶向递送至特定组织用于治疗。更特别地,已知ADC被用于抗癌治疗,所述ADC通常由抗体组成,所述抗体经由具有不稳定键的化学接头与生物活性的细胞毒性或药物有效荷载(payload)连接。由此类蛋白药物缀合物提供的靶向递送由抗体或类似物在健康和患病组织之间灵敏地辨别、从而确保高效药物的安全递送的能力导致。
因此,抗体,特别是单克隆抗体(mAb)在靶向研究、治疗、诊断和其他生物技术应用中是有用的。更特别地,mAb在靶向治疗和医药的领域中是有用的。mAb可通过以下方式而被利用:通过抗体药物缀合物(ADC)的方式并入到治疗中。如以上讨论的,ADC是除了其他以外,被认为在癌症的治疗中具有特定效用的一类生物活性药物,并且是相对新的技术。通常,(例如)用于治疗癌症的ADC将包含连接至细胞毒性有效荷载或药物的mAb,所述细胞毒性有效荷载或药物可提供细胞杀伤作用。mAb和细胞毒性材料(细胞毒素)之间的连接通常将由化学上稳定的接头分子提供。在本领域已知两种类型的ADC接头系统:可裂解的和不可裂解的。对于可裂解的ADC接头系统,存在优选地酶促驱动的释放机制,尽管化学上不稳定的可选的可裂解系统是已知的,如在由Humana Press出版的Methods in MolecularBiology,第1045卷,2013中详细描述的。在不可裂解的ADC接头系统中,释放途径是由当ADC被使用时通过细胞机制(cellular machinery)的mAb降解引起的。
以下显示的(也被称为brentuximab vedotin)是针对蛋白CD30,所述蛋白CD30在经典霍奇金淋巴瘤(HL)和系统性间变性大细胞淋巴瘤(sALCL)中表达。Brentuximab vedotin由连接至组织蛋白酶可裂解接头(缬氨酸-瓜氨酸)的嵌合单克隆抗体brentuximab(chimeric monoclonal antibody brentuximab)(cAC10,其靶向细胞膜蛋白CD30)、对氨基苄基氨基甲酸酯间隔物和抗有丝分裂剂单甲基奥瑞他汀E(monomethylauristatin E,MMAE)组成。
以下示出的是trastuzumab emtansine,是由连接至细胞毒性剂mertansine(DM1)的单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)组成的ADC。单独的曲妥珠单抗通过与HER2/neu受体结合阻止癌症细胞的生长,而mertansine进入细胞并通过与微管蛋白结合阻止细胞分裂;最后这种结合作用将导致细胞凋亡。缀合物通常被缩写为T-DM1。每个trastuzumab emtansine分子由通过被称为SMCC的交联试剂与若干个mertansine(包含巯基的细胞毒性美登醇(maytansinoid))分子结合的单个曲妥珠单抗分子组成。SMCC为反式-4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯,包含两个反应性官能团即琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺的双官能交联剂。SMCC的琥珀酰亚胺基团与曲妥珠单抗分子中的赖氨酸残基的游离氨基反应,并且SMCC的马来酰亚胺部分与mertansine的游离巯基连接,这在抗体和mertansine之间形成共价键。
尽管ADC是本领域熟知的,但包含具有提供药物有效荷载的靶向递送的能力的球状蛋白(globular protein)的其他蛋白药物缀合物并不被熟知。例如,白蛋白可对此类蛋白药物缀合物中的抗体提供合适的替代方案。
白蛋白由三个结构上同源、大部分螺旋状的结构域(I、II和III)组成,每个结构域由两个亚结构域A和B组成。像其他的哺乳动物白蛋白,人白蛋白包含17个二硫桥(disulfide bridge)和在Cys34处的游离硫醇,在Cys34处的游离硫醇提供了血清中最大比例的游离硫醇。
白蛋白是负责血液的胶体渗透压的主要蛋白并且作为长链脂肪酸、胆红素、金属离子诸如铜(II)和镍(II)、钙和锌的转运媒介物(transport vehicle)发挥作用。白蛋白具有20天的近似血清半衰期,这可归因于蛋白的大小(约67kDa)并且还是通过新生Fc受体(FcRn)再循环的结果。FcRn以pH依赖性的非竞争性方式再循环白蛋白以及抗体(更特别地IgG),保护白蛋白以及抗体两者免于在溶酶体中的蛋白降解。循环白蛋白被内皮细胞内化,在所述内皮细胞中它在早期内体的酸性环境(pH 6)中与FcRn结合。这允许白蛋白被再循环至细胞的表面,并释放回血液(生理pH)中。白蛋白可共价地缀合至细胞毒性药物或可选地融合至基于蛋白的治疗性药物,以增加生物利用度并改善药物药代动力学。
实体肿瘤具有可渗透的脉管系统(vasculature)以及差的淋巴引流,这导致大分子(>40kDa)在肿瘤间质液内的积累和滞留。研究已表明白蛋白在多种恶性实体肿瘤中的滞留。对于白蛋白通过多种受体的特异性结合,还存在新出现的证据,所述多种受体中的一些已示出被高度地表达在恶性肿瘤细胞上。相似地,已知白蛋白由于血液-关节屏障的渗透性的增加而在类风湿性关节炎患者的发炎的关节中积累。白蛋白在药物递送中的已知应用为利用包含半乳糖残基的白蛋白缀合物的肝靶向,所述白蛋白缀合物在与无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)相互作用后进入肝细胞,所述无唾液酸糖蛋白受体仅在这些细胞上以大的量和高的亲和力存在。
因此,这些靶向特性以及其利用度、生物降解能力、缺乏毒性和免疫原性并连同其明显长的半衰期,使白蛋白成为用于药物递送的合适候选物。因此,白蛋白代表对蛋白药物缀合物系统中的抗体的合适的替代方案。
药物或细胞毒性有效荷载向靶组织的成功递送取决于接头与蛋白和药物结合并维持结合直到蛋白药物缀合物到达靶组织的能力。因此,对提供用于提供成功递送的此类蛋白药物缀合物的替代性和/或改进的接头存在需求。
另外,对提供用于细胞毒性药物或治疗性肽或多肽的安全和有效递送的新的和/或改进的蛋白药物缀合物诸如包含白蛋白的那些蛋白药物缀合物存在需求。
在一个实施方案中,对提供可有效提供细胞凋亡性质的替代性和改进的ADC存在需求。更特别地,对提供改进的ADC接头分子以在所述ADC的制备期间确保选择性的和有效的缀合并在使用时提供有效的细胞毒素有效荷载存在需求。
相应地,在本发明的第一方面,提供了蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含球状蛋白、接头和药物。更具体地,本发明提供了蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含:能够经由存在于蛋白上的赖氨酸或半胱氨酸基团提供位点特异性缀合的接头,优选地包含乙烯基取代基的含氮杂环芳环。
本发明提供了用于在蛋白药物缀合物中使用的接头,效用为连接蛋白和药物例如抗体和细胞毒素来提供ADC分子。接头提供了药物的改进的靶向有效荷载。另外地或可选地,接头为蛋白药物缀合物提供与目前已知的用于ADC的接头分子相比增加的稳定性,从而提供具有改进的安全性性质和因此增强的耐受性概况的蛋白药物缀合物。更具体地,在ADC中使用本文公开的接头分子提供了在使用时增加的ADC效力,超过并高于等量的未缀合的抗体。
在本发明的上下文中,术语“球状蛋白”应被解释为覆盖具有靶向能力并因此具有将药物有效荷载递送至特定的靶组织的能力的任何蛋白。因此,“球状蛋白”包括抗体及其片段、白蛋白和转铁蛋白,以及已知用于药物缀合物的任何其他替代物。
“药物”意指对人或动物具有已知生物效应的任何化学物质。特别地,药物可以是用于治疗、治愈、预防或诊断疾病或以其他方式用于增强身体或精神健康的药物。如将被领会到的,药物可以是已获得必要的上市许可的已知药物,或尚未经历测试或获得上市许可的新药物。
在本发明的一个实施方案中,提供了抗体药物缀合物,所述抗体药物缀合物包含抗体、接头和细胞毒素。
优选地,抗体是抗体或其片段、并且更优选地单克隆抗体(mAb)。mAb可选自任何已知的mAb。对用于本发明的mAb的选择的仅有的限制是,它必须有半胱氨酸或赖氨酸残基存在以允许缀合反应发生。特别优选地,mAb包含半胱氨酸残基,因为本发明的接头的一些特别优选的实施方案显示出对半胱氨酸残基中存在的硫醇基团的增加的选择性。然而,在mAb被识别为其正常地不含优选的半胱氨酸残基的情况下,本领域技术人员已知将半胱氨酸引入mAb中的方法。
根据本发明的可选的实施方案(如以下进一步详细描述的),抗体可以被替代为白蛋白。
以下讨论的可以是或可以不是关于含抗体的ADC或白蛋白药物缀合物描述的所有优选实施方案可等同地被认为是蛋白药物缀合物、以及ADC实施方案和白蛋白药物缀合物实施方案的优选实施方案。更具体地,以下药物和接头的描述应被认为等同地应用至蛋白药物缀合物的多种实施方案。
药物可以是细胞毒性有效荷载或治疗性肽或多肽。特别地,当蛋白是抗体或其片段,并且蛋白药物缀合物是ADC时,药物优选地是细胞毒素。可选地,当蛋白是白蛋白时,药物可以是细胞毒素或治疗性肽或多肽。
优选地,细胞毒素是生物活性的细胞毒性物质。更优选地,细胞毒素是抗癌药物。细胞毒素可选自包括以下的组:奥瑞他汀、美登素、加利车霉素(calicheamicin)、蒽环霉素(anthracycline)和吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepene)。更具体地,细胞毒素可以是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、多柔比星或mertansine(DM1)。对于本领域技术人员应该明显的是,MMAE也被称为(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺。
然而,另外地或可选地,细胞毒素还可选自包含蓖麻毒素亚基的其他已知细胞毒素和其他基于肽的细胞毒性材料,尽管此类材料较不常用于本技术领域。
当药物是治疗性肽或多肽时,肽或多肽可以是具有治疗性质,例如抗伤害性(antinociceptive)、抗糖尿病、抗肿瘤或抗病毒活性的任何肽或多肽。
另外地或可选地,药物优选地包含胺基团、硫醇基团或羧酸基团,因为这些类型的基团提供用于缀合药物与本发明的接头的理想位点。
优选地,接头(在本文也被称为接头分子或接头基团)经由蛋白诸如抗体上存在的赖氨酸或半胱氨酸基团提供位点特异性缀合。
更优选地,本发明的接头包含:包含乙烯基取代基的含氮杂环芳环。
非常笼统地说,接头可被认为包括三个部分:乙烯基、含氮杂环芳环、和接头臂。接头臂可被改变以导致不同的末端基团,以为药物或蛋白例如ADC的抗体提供反应位点,以与接头结合。
优选地,含氮杂环芳环是吡啶、嘧啶、咪唑或氮丙啶环。更优选地,含氮杂环芳环是吡啶环或嘧啶环,并且最优选地,它是吡啶环。当采用吡啶环或嘧啶环时,优选地乙烯基在相对于氮杂原子的2位或4位中。4-乙烯基吡啶是特别优选的,因为它们已被发现在某些环境中提供商业上可接受的反应速率,如以下进一步讨论的。
根据本发明的优选接头的实例包括:
在以上显示的实例中,4-乙烯基吡啶结构是特别优选的,并且如[13]显示的结构是最特别地优选的。4-乙烯基吡啶结构是优选的,因为在某些条件中,它们显示出增加的反应性,超过并高于等量的2-乙烯基吡啶结构。
如技术人员将领会到的,以上示例的结构中的每种主要地在接头臂上设有末端羧酸基团。然而,这些结构可优选地以被取代的形式提供,以使得优选的乙烯基吡啶结构包含优选的聚(亚烷基二醇)基团、最优选地PEG分子。当寻求获得蛋白药物缀合物制备方法中所需的药物与蛋白的比率时,已发现在接头分子臂上存在PEG基团是最优选的,因为它增强了反应效率。
此类优选的接头分子包括以下实例:
在本发明优选的实施方案中,接头包括具有以下通式的分子:
其中:
-X和Y独立地选自CH或N。
-R1选自:
■(CH2)n-C(O)-R,或,
■(CH2)m–Z–R,或,
■(CH2)m–Z-C(O)-R,或,
■(CH2)n–C(O)–Z-R,或,
■(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–R,或,
■(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–Z–R,或,
■(CH2)m-Z–C(O)–(CH2)n–Z–(CH2)n–C(O)–Z–R,或
■(CH2)n–CH(CO2R)2,或
■(CH2)m–Z–(CH2)2CH(CO2R)2,或
■(CH2)n–Z1。
-R2和/或R3可选自与R1相同的分子基团(group of molecules)。然而,优选地R2和/或R3选自氢或吸电子基团,诸如卤素(F、Cl、或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5,其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基;或,
-R2和/或R3可选自氢、烷基或苯基,当接头分子包含吡啶环时这是特别优选的,因为替代性吸电子基团可对接头的反应性具有负面影响;或
-R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基,所述稠合(杂)芳环取代基可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤。
当R2和/或R3选自烷基时,甲基(CH3)或叔丁基((CH3)3C)是优选的。在接头分子上存在烷基是优选的,因为此类基团的存在增加环结构中存在的氮的碱性并导致接头结构具有超过并高于等量的接头分子的增加的反应性。
当R2和/或R3选自吸电子基团时,CF3是优选的。CF3的存在增加接头分子中存在的乙烯基的反应性,并且在生理条件下是稳定的。
可选地,预期的是,在一些实施方案中,采用更扩展的稠合杂环芳环体系诸如吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤是可能的。
在以上给出的式中,
-Z可独立地选自NH、O或S,
-Z1是N3基团或OH基团
-n可以是从0至10的任何整数。在一些优选的实施方案中,n是从0至5的值。
-m可以是从0至10的任何整数。优选地,m是从0至5,并且最优选地m是从0至3,如以上给出的实例中示出的。另外地或可选地,在接头分子中,当在(CH2)m基团后的Z基团是O基团并且R1(以及当它们选自相同分子基团时的R2和/或R3)在环结构上的2或6位时,则m优选地为至少3,因为O基团应与环结构的氮间隔开。这是由于已发现氧基团对接头分子结构的反应性具有降低效应。当氧基团被进一步与环结构间隔开时,该效应不被察觉。这种情况被反映在以上的示例性结构中。
-R可以是氢(H)、氢氧化物(OH)、胺或聚(亚烷基二醇)基团。优选地,R是聚(亚烷基二醇),并且最优选地它是PEG。如技术人员将领会到的,当R基团是PEG时,它可优选地在以NH形式的Z基团后面,这是由于PEG的加成的反应产物。该选择在以上给出的R1的通式中详细描述。通常,聚(亚烷基二醇)分子与R1和/或R2基团直接共价结合,如以上的式中示出的。接头基团臂可具有不同的长度以保持聚(亚烷基二醇)分子更靠近或进一步远离蛋白,例如抗体。
优选地,药物例如细胞毒性的药物,与接头R1基团结合。在其中如以上描述的R2和/或R3选自与R1相同的分子基团的情况下,可能的是,这些基团还将与药物诸如细胞毒素结合以提供在其结构中具有多个药物存在的蛋白药物缀合物诸如ADC。该类型的一些实施方案可被称为将药物对称地装载在蛋白药物缀合物中。
另外地或可选地,当R1以及任选地R2和/或R3选自(CH2)n–CH(CO2R)2、或(CH2)m–Z–(CH2)2CH(CO2R)2时,即当接头臂是支化的时,则药物与接头臂的每个末端基团结合是可能的。因此,多个药物存在于蛋白药物缀合物中并可被描述为非对称地装载药物。
优选地,含氮杂环芳环为被取代的吡啶环(X和Y两者均为CH)或被取代的嘧啶环(X和Y之一为CH并且另一个为N)。最优选地,含氮杂环芳环是吡啶环。
在一个特别优选的实施方案中,R1为:
(CH2)n–C(O)–R,或,
(CH2)n–C(O)–Z-R,或,
(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–R,或
(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–Z–R。
在本发明的另外的实施方案中,在以上描述的接头分子内包含延伸物接头(extender linker)可以是合意的。此类延伸物接头可以是必需的,以改变官能化基团的溶解度或免疫原性性质。更特别地,在将在以下更详细描述的可裂解ADC接头系统中,此类延伸物接头将是有用的。用于在本发明中使用的合适的延伸物接头对于本领域技术人员将是明显的,并且在美国专利号7,659,241和美国专利号5,609,105中描述了特别优选的延伸物接头。最优选地,延伸物接头是酶可裂解的延伸物接头,所述酶可裂解的延伸物接头包含可被细胞内蛋白酶裂解的氨基酸的集合。
在本发明的另外的实施方案中,提供修饰形式的接头,以使得其包含酯基团以利于接头与蛋白药物缀合物的蛋白的结合可以是合意的。以下将进一步描述该方面。
根据本发明的优选的接头可被表示为下式,
其中:
R1选自:
■(CH2)n-C(O)-R,或
■(CH2)m–Z–R,或
■(CH2)m–Z-C(O)-R,或
■(CH2)n–C(O)–Z-R,或
■(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–R,或
■(CH2)m–Z–(CH2)n–C(O)–Z–R,或
■(CH2)m-Z–C(O)–(CH2)n–Z–(CH2)n–C(O)–Z–R,或
■(CH2)n–CH(CO2R)2,或
■(CH2)m–Z–(CH2)2CH(CO2R)2,或
■(CH2)n–Z1
-R2可选自与R1相同的分子基团。然而,优选地R2选自氢或吸电子基团,诸如卤素(F、Cl、或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5,其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基;或,
-R2可选自氢、烷基或苯基,这是特别优选的,因为替代性吸电子基团可对接头的反应性具有负面影响。
当R2选自烷基时,甲基(CH3)或叔丁基((CH3)3C)是优选的。在接头分子上存在烷基是优选的,因为此类基团的存在增加环结构中存在的氮的碱性并导致接头结构具有超过并高于等量的接头分子的增加的反应性。
当R2选自吸电子基团时,CF3是优选的。CF3的存在增加接头分子中存在的乙烯基的反应性,并且在生理条件下是稳定的。
在以上给出的式中,
-Z可独立地选自NH、O或S,
-Z1独立地选自N3或OH,
-n可以是从0至10的任何整数。在一些优选的实施方案中,n是从0至5的值。
-m可以是从0至10的任何整数。优选地,m是从0至5,并且最优选地m是从0至3,如以上给出的实例中示出的。另外地或可选地,在式(III)的接头分子中,当在(CH2)m基团后的Z基团是O基团时,则m优选地为至少3,因为O基团应与环结构的氮间隔开。这是由于已发现氧基团对接头分子结构的反应性具有降低效应。当氧基团被进一步与环结构间隔开时,该效应不被察觉。这种情况被反映在以上的示例性结构中。
-R是氢(H)、氢氧化物(OH)、胺或聚(亚烷基二醇)基团。优选地,R是聚(亚烷基二醇),并且最优选地它是PEG。如技术人员将领会到的,当R基团是PEG时,它可优选地在以NH形式的Z基团后面,这是由于PEG的加成的反应产物。该选择在以上给出的R1的通式中详细描述。通常,聚(亚烷基二醇)分子与R1和/或R2基团直接共价结合,如以上的式中示出的。接头基团臂可具有不同的长度以保持聚(亚烷基二醇)分子更靠近或进一步远离蛋白,例如抗体。
优选地,药物例如细胞毒性的药物,与接头R1基团结合。在其中如以上描述的R2选自与R1相同的分子基团的情况下,可能的是,这些基团还将与药物诸如细胞毒素结合以提供在其结构中具有多个药物存在的蛋白药物缀合物诸如ADC。该类型的一些实施方案可被称为将药物对称地装载在蛋白药物缀合物中。
另外地或可选地,当R1以及任选地R2选自(CH2)n–CH(CO2R)2、或(CH2)m–Z–(CH2)2CH(CO2R)2时,即当接头臂是支化的时,则药物与接头臂的每个末端基团结合是可能的。因此,多个药物存在于蛋白药物缀合物中并可被描述为非对称地装载药物。
在本发明的一个实施方案中,接头被表示为式(III)。
另外地或可选地,当存在聚(亚烷基二醇)基团时,基本的聚(亚烷基二醇)结构可设有一个或更多个反应性官能团,诸如羟基、胺、羧酸、烷基卤、叠氮化物、琥珀酰亚氨基或硫醇基团,以利于聚(亚烷基二醇)分子与药物或蛋白的反应。特别优选的聚(亚烷基二醇)分子包括在一个或更多个羟基位置处用化学基团诸如具有在一个和四个碳原子之间的烷基取代的那些聚(亚烷基二醇)分子。如以上提到的,根据本发明的用于使用的最优选的聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(“PEG”)分子,尽管技术人员将能够结合其他聚(亚烷基二醇)分子诸如聚丙二醇或聚乙烯-聚丙二醇共聚物来使用本文公开的技术。聚(亚烷基二醇)分子包括PEG,通常具有在约200Da和约80kDa之间的分子量。优选的聚(亚烷基二醇)分子具有在约200Da和1kDa之间的分子量。根据本发明可使用的聚(亚烷基二醇)分子是本领域所熟知的并且是例如从商业上可得的来源诸如Sigma Aldrich公众可得的。
在本发明的另外的方面中,提供了不可裂解的和/或可裂解的蛋白药物缀合物(例如ADC)接头系统。
可提供不可裂解的蛋白药物缀合物(例如ADC)接头系统,所述接头系统包含蛋白(例如抗体)、接头和药物(例如细胞毒素)。在该类型的一个系统中,抗体上的胺基团的缀合经由接头上存在的活化的酯完成,然后所述接头转而经由乙烯基与细胞毒素结合。在该不可裂解的系统中,抗体优选地为mAb。另外地,接头优选地包含聚(亚烷基二醇)分子、最优选地聚乙二醇(PEG)分子,并且细胞毒素包含硫醇。如将被领会到的,在以上描述的系统中,抗体被作为蛋白的实例提供,并且可被替代为白蛋白,并且细胞毒素被作为药物的实例提供并且可被替代为治疗性肽或多肽。
在该类型的可选系统中,抗体上的硫醇基团的缀合经由接头的乙烯基完成,所述接头转而经由接头臂上存在的聚(亚烷基二醇)基团与药物结合。
在可选的实施方案中,提供了可裂解的蛋白药物缀合物(例如ADC)接头系统,所述接头系统包含蛋白(例如抗体)、接头、延伸物接头和药物(例如细胞毒素)。
在可裂解的ADC接头系统中,接头分子的乙烯基取代基特别地适合于与天然存在的或已被引入到抗体中的一个或更多个硫醇基团(例如通过采用存在于抗体上的一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基团)反应。然后将接头侧臂连接至延伸物接头,优选地经由聚(亚烷基二醇)分子;延伸物接头对该实施方案中的ADC提供“可裂解”功能。然后细胞毒素经由延伸物接头与接头结合。优选地,抗体是mAb。更优选地,接头包含聚(亚烷基二醇)分子、最优选地聚乙二醇(PEG)分子。如在以上更详细描述的,优选的是,延伸物接头是酶可裂解的。如将被领会到的,在以上描述的系统中,抗体被作为蛋白的实例提供,并且可被替代为白蛋白,并且细胞毒素被作为药物的实例提供并且可被替代为治疗性肽或多肽。
应理解,在本申请中,术语“可裂解的”被用于包括能够自我破坏(self immolate)或可被操作以释放其药物(例如细胞毒性的)有效荷载的蛋白药物缀合物(例如ADC)。该术语的使用意图将此类蛋白药物缀合物(例如ADC)与那些“不可裂解的”蛋白药物缀合物(例如ADC)区分开,“不可裂解的”蛋白药物缀合物被理解为仅在存在于靶细胞中后释放其药物(例如细胞毒性的)有效荷载。
应理解,在本发明的该方面中使用的蛋白(例如抗体)、接头和药物(例如细胞毒素)的优选特征如以上关于第一方面描述的。更具体地,接头分子以及其优选特征的描述特别地适合用于所述可裂解系统和不可裂解系统。
尽管优选的是,本发明中使用的蛋白(例如抗体)包含至少一个或更多个含硫醇的半胱氨酸基团,但还预期的是,蛋白(例如抗体)可包含一个或更多个赖氨酸基团。在这种情况时,预期的是,技术人员可优选将本发明的接头附接至作为半胱氨酸基团的替代物的赖氨酸基团。在该情况中,优选修饰接头分子以使得其为活化酯形式的接头。在该实施方案中,修饰的接头的酯基团能够经由接头臂与蛋白(例如抗体)上存在的赖氨酸结合。在该实施方案中,蛋白(例如抗体)将经由赖氨酸基团与酯修饰的接头结合,并且该酯修饰的接头将转而经由乙烯基与药物(即细胞毒素)结合。该修饰的接头可包含聚(亚烷基二醇)分子、最优选地聚乙二醇(PEG)分子。
在本发明的第三方面中,提供了产生蛋白药物缀合物的方法,所述方法包括使蛋白与接头接触,所述接头能够提供经由存在于蛋白上的赖氨酸或半胱氨酸基团的位点特异性缀合,所述接头优选地包含含有乙烯基取代基的含氮芳杂环,其中接头被结合至药物。在可选的方面中,提供了产生蛋白药物缀合物的方法,所述方法包括使蛋白与接头接触,所述接头能够提供经由存在于蛋白上的赖氨酸或半胱氨酸基团的位点特异性缀合,所述接头优选地包含含有乙烯基取代基的含氮芳杂环,以及随后使接头与药物结合。
优选地该方法包括使具有至少一个反应性硫醇基团的蛋白(例如抗体)与接头接触,所述接头包含官能化试剂,所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环,所述乙烯基取代基能够与蛋白(例如抗体)的至少一个硫醇基团反应,其中接头官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子共价连接,以使得接头官能化试剂的乙烯基取代基与蛋白(例如抗体)的硫醇基团反应,从而使接头聚(亚烷基二醇)分子与蛋白(例如抗体)共价连接。
另外,本发明的方法可包括除了使官能化试剂和蛋白(例如抗体)反应以将它们连接在一起的步骤之外的一个或更多个步骤。例如,该方法可包括使前体官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子反应以产生官能化试剂的初始步骤,所述前体官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环。
在本发明的其中蛋白(例如抗体)不包含合适的硫醇基团或在其多肽链的期望的位置中不包含合适的硫醇基团的实施方案中,本发明可包括例如通过化学反应或定点诱变(site directed mutagenesis)修饰蛋白(例如抗体)以产生在多肽的一个或更多个期望的位置处具有硫醇基团的变体多肽的初始步骤。优选地,这通过用半胱氨酸残基替代蛋白(例如抗体)的多肽链中的一个或更多个氨基酸完成。
优选地,反应性硫醇基团是半胱氨酸氨基酸残基的一部分,不管它是天然地存在于蛋白(例如抗体)中还是已被引入。
另外地或可选地,本发明提供了与接头组合的白蛋白,其中接头如以上关于本发明的第一实施方案描述的。
如将被领会到的,被意图用于本发明的白蛋白是血清白蛋白,所述血清白蛋白是在肝脏中产生的血浆蛋白。优选地,白蛋白是人白蛋白。
优选地,接头包含聚(亚烷基二醇)分子、最优选地包含聚乙二醇(PEG)分子。
另外地或可选地,本发明提供了蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含白蛋白、接头和药物(例如细胞毒素),其中接头和药物(例如细胞毒素)如以上关于蛋白药物缀合物和/或ADC发明描述的。特别地,优选的是,接头包含与药物(例如细胞毒素)结合的聚(亚烷基二醇)分子,最优选地聚乙二醇(PEG)分子。
本发明还提供了蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含白蛋白、接头和治疗性肽或多肽。接头和治疗性肽或多肽如以上描述的,并且优选的是,接头包含与治疗性肽或多肽结合的聚(亚烷基二醇)分子,最优选地聚乙二醇(PEG)分子。
另外地或可选地,如以上描述的,基本的聚(亚烷基二醇)结构可设有一个或更多个反应性官能团,诸如羟基、胺、羧酸、烷基卤、叠氮化物、琥珀酰亚氨基或硫醇基团,以利于聚(亚烷基二醇)分子与药物即细胞毒性或治疗性肽或多肽的反应。
另外地,接头聚(亚烷基二醇)结构还可经由接头臂与第二接头反应以提供同型双官能接头(homobifunctional linker),以使得一个接头的乙烯基可与药物即细胞毒性或治疗性肽或多肽的硫醇基团反应,并且另一个接头的乙烯基可被缀合至蛋白例如白蛋白的硫醇基团。在该实施方案中,蛋白药物缀合物例如白蛋白药物缀合物将包含两个接头分子,所述两个接头分子将利于白蛋白与含硫醇的细胞毒素、治疗性肽或治疗性多肽的连接。
在本发明的另外的实施方案中,提供了方法,所述方法包括使白蛋白与接头接触,所述接头包含官能化试剂,所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环,所述乙烯基取代基能够与白蛋白的游离硫醇基团反应,其中接头官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子共价连接,以使得接头官能化试剂的乙烯基取代基与白蛋白的硫醇基团反应,从而使接头聚(亚烷基二醇)分子与白蛋白共价连接。
该另外的方法可包括例如通过化学反应或定点诱变修饰白蛋白以产生在多肽的一个或更多个期望的位置处具有硫醇基团的变体、例如以引入溶剂暴露的半胱氨酸残基的初始步骤。优选地,这通过用半胱氨酸残基替代白蛋白的多肽链中的一个或更多个氨基酸完成。
在另外的方面中,本发明提供了如以上定义的蛋白药物缀合物,用于在疗法中使用。
在一个实施方案中,提供了如以上定义的ADC,用于在疗法中使用。优选地,ADC被意图用于在抗癌疗法中使用。
在另外的实施方案中,本发明提供了如以上定义的白蛋白药物缀合物,用于在疗法中使用。优选地,白蛋白药物缀合物被意图用于在抗癌、抗伤害性、抗糖尿病、抗肿瘤或抗病毒疗法中使用。
本申请提供如下内容:
1.一种蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含球状蛋白、接头和药物,其中接头包含含氮杂环芳环,所述含氮杂环芳环包含乙烯基取代基。
2.根据项目1所述的蛋白药物缀合物,其中所述球状蛋白为白蛋白。
3.根据项目2所述的蛋白药物缀合物,其中所述白蛋白为人白蛋白。
4.根据项目1所述的蛋白药物缀合物,其中所述球状蛋白为抗体或其片段。
5.根据项目4所述的蛋白药物缀合物,其中所述抗体为单克隆抗体。
6.根据任一前述项目所述的蛋白药物缀合物,其中所述药物为细胞毒素或治疗性肽或多肽。
7.根据项目6所述的蛋白药物缀合物,其中所述细胞毒素为生物活性的细胞毒性材料。
8.根据项目6或项目7所述的蛋白药物缀合物,其中所述细胞毒素为抗癌药物。
9.根据任一前述项目所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头包括具有以下通式的分子:
其中:
-X和Y独立地选自CH或N,
-R1选自:
■(CH2)n-C(O)-R,或,
■(CH2)m-Z-R,或,
■(CH2)m-Z-C(O)-R,或,
■(CH2)n-C(O)-Z-R,或,
■(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R,或,
■(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R,或,
■(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R,或,
■(CH2)n-CH(CO2R2)2,或,
■(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2,或,
■(CH2)n-Z1,
其中
●Z独立地选自NH、O或S,
●Z1独立地选自N3或OH,
●n是从0到10的任何整数,
●m是从0到10的任何整数,并且
●R是H、OH、胺或聚(亚烷基二醇)基团;
-R2和/或R3选自与R1相同的分子基团,或R2和/或R3选自氢或吸电子基团,诸如卤素(F、Cl、或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5,其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基;或,
-R2和/或R3选自氢、烷基或苯基;或
-R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基,所述稠合(杂)芳环取代基包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤。
10.根据项目9所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头包括具有通式(I)的分子,条件是当Z是O,并且R1和任选地当选自与R1相同的分子基团时的R2和R3在所述环上的2位或6位时,m为至少3。
11.根据前述项目中任一项所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头为4-乙烯基吡啶。
12.根据前述项目中任一项所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头可被表示为下式,
其中:
R1选自:
■(CH2)n-C(O)-R,或
■(CH2)m-Z-R,或
■(CH2)m-Z-C(O)-R,或
■(CH2)n-C(O)-Z-R,或
■(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R,或
■(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R,或
■(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R,或,
■(CH2)n-CH(CO2R2)2,或,
■(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2,或,
■(CH2)n-Z1;
其中,
-R2选自与R1相同的分子基团、氢、吸电子基团、烷基或苯基,
-Z独立地选自NH、O、或S,
-Z1独立地选自N3或OH,
-n是从0至10的任何整数,
-m是在0和10之间的任何整数,
-R是氢(H)、氢氧化物(OH)、胺或聚(亚烷基二醇)基团。
13.根据项目12所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头包括具有所述通式(III)的分子,条件是当Z为O时,m为至少3。
14.根据任一前述项目所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头包含聚(亚烷基二醇)基团。
15.根据项目14所述的蛋白药物缀合物,其中所述聚(亚烷基二醇)基团为聚乙二醇(PEG)。
16.根据项目14至15中任一项所述的蛋白药物缀合物ADC,其中所述聚(亚烷基二醇)结构设有一个或更多个反应性官能团,所述一个或更多个反应性官能团包括羟基、胺、羧酸、烷基卤、叠氮化物、琥珀酰亚氨基或硫醇基团。
17.根据任一前述项目所述的蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物还包含延伸物接头。
18.根据项目17所述的蛋白药物缀合物,其中所述延伸物接头是酶可裂解的。
19.一种产生任一前述项目所述的蛋白药物缀合物的方法,所述方法包括使所述蛋白与结合至所述药物的接头接触。
20.根据项目19所述的方法,所述方法包括使具有至少一个反应性硫醇基团的蛋白与所述接头接触,所述接头包含官能化试剂,所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环,所述乙烯基取代基能够与所述蛋白的至少一个游离的硫醇基团反应,其中所述接头官能化试剂被共价地连接至聚(亚烷基二醇)分子。
21.根据项目19或20所述的方法,所述方法包括使前体官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子接触以产生所述官能化试剂的初始步骤,所述前体官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环。
22.根据项目19至21中任一项所述的方法,所述方法还包括修饰所述蛋白以产生在多肽的一个或更多个期望的位置处具有硫醇基团的变体多肽的初始步骤。
23.根据项目1至18中任一项所述的药物蛋白缀合物,所述药物蛋白缀合物用于在疗法中使用。
本发明的实施方案现将参照附图,以实例而非限制的方式被描述。
附图简述
图1.根据本发明的示例接头与谷胱甘肽的相对反应速率。
图2.在三种不同的pH(7.0、7.5和8.0)下在24小时后,PL13游离酸与N-乙酰基半胱氨酸(NAC)的反应性的RP-HPLC分析。
图3.表明在pH 7.0下PL-13-NAC加合物的形成的MS数据。
图4.表明在pH 8.0下PL-13-NAC加合物的形成的MS数据。
图5.在pH 8.0下PL13游离酸与NAC反应性的RP-HPLC分析。
图6.在pH 7.0下PL13游离酸与氨基酸的混合物(Tyr/Lys/His/NAC)的反应性的RP-HPLC分析。
图7.表明在pH 7.0下与氨基酸混合物的反应中PL13-NAC的形成的MS数据。
图8.在pH 7.0下PL13游离酸与10当量的赖氨酸的反应性的RP-HPLC分析。
图9.PL13游离酸与10当量的天冬氨酸的反应性的RP-HPLC分析。
图10.PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的结构。
图11.PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的MS分析。
图12.在1小时的反应后曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC和UV-Vis谱。
图13.在与超过硫醇1.25摩尔过量的药物-接头一起孵育1小时、8小时和16小时时,曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的HIC和UV-Vis谱。
图14.在与超过硫醇5摩尔过量的药物-接头一起孵育16小时时,曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的HIC谱。
图15.在16小时的孵育后,经由10摩尔过量的PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合获得的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC谱。
图16.在16小时的孵育后,以10摩尔过量的PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的PLRP谱。
图17.双脱盐的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的PLRP谱。
图18.在0、24和48小时,在NAC的存在下曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的HIC分析。
图19.在0、24和48小时,在NAC的存在下曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的PLRP谱。
图20.在0、24和48小时,在NAC的存在下曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的HIC分析。
图21.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(A)缀合物和曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(B)缀合物通过SEC色谱法的分析。
图22.曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的非还原SDS-PAGE分析。
图23.PL13-NH-PEG4-OSu接头的结构。
图24.PL13-NH-PEG4-COOH接头中间体的ESI-MS分析。
图25.通过还原SDS-PAGE分析曲妥珠单抗经由SMCC或PL13-NH-PEG4-OSu接头的交联。
图26.PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE接头的结构。
图27.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(A)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(B)的HIC谱。
图28.曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(A)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(B)的PLRP谱。
图29.曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE和曲妥珠单抗-mal-val-cit-MMAE的基于图28的PLRP洗脱谱的DAR计算。
图30.曲妥珠单抗-mal-val-cit-MMAE(A)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE(B)的SEC分析。
图31.在1mg规格的工艺优化后,得到的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的代表性HIC(A)和PLRP(B)谱。
图32.以150mg规格获得的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(A)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(B)的HIC谱。
图33.以150mg规格获得的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(A)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(B)的SEC谱。
图34.在pH 7.0(实线)和pH 7.5(虚线)下,Thiomab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE的HIC谱。
图35.表明曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的脱药物化(de-drugging)的PLRP谱。
图36.表明具有3.8的DAR的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的脱药物化的PLRP谱。
图37.以下ADC的体外稳定性:曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE,Mal-ADC(A)相对于曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE,PL13-ADC(B)。
图38.以下ADC的体内稳定性:PL13-ADC相对于Mal-ADC
图39A-39C.SKBR3细胞系(A)、BT474细胞系(B)和JIMT-1细胞系(C)的细胞杀伤数据。
图40.表明ADC毒性的多剂量异种移植物数据。
图41.显示ADC对肿瘤生长的影响的多剂量异种移植物数据。
图42.肿瘤成熟度组织病理学数据
图43.在pH 7.4下20KDa PEG-PL12和PEG-PL13相对于20KDa PEG-马来酰亚胺的与还原的白蛋白的缀合的比较数据。
图44A-44C.PL11(A)、PL12(B)和PL13(C)与白蛋白的缀合的优化
图45.通过ESI-MS分析PL11(A)、PL12(B)和PL13(C)与白蛋白的缀合。
图46.通过ESI-MS表明的白蛋白-PL-12缀合物在1mM GSH的存在下的稳定性。
图47.PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星接头的结构。
图48.PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星接头与白蛋白、硫代白蛋白(单突变体)和硫代白蛋白(双突变体)缀合的比较数据。
图49.白蛋白-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星缀合物的非还原SDS-PAGE分析。(1)硫代白蛋白-双突变体-DOX;(2)硫代白蛋白-单突变体-DOX;(3)白蛋白-DOX;(M)-蛋白标志物。
图50.白蛋白-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星缀合物的SEC分析:白蛋白(A)和白蛋白-DOX缀合物(B);硫代白蛋白(单突变体)(C)和硫代白蛋白-DOX(单突变体)(D);硫代白蛋白(双突变体)(E)和硫代白蛋白-DOX(双突变体)(F)。
本发明的方法能够提供根据本发明的蛋白药物缀合物,诸如ADC或白蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物包含与接头结合的抗体或白蛋白,所述接头转而与药物诸如细胞毒素或治疗性肽或多肽结合。
在本发明中,提及的抗体,包括免疫球蛋白,不管是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还覆盖包含抗原结合结构域的任何多肽或蛋白。还预期包含抗原结合结构域的抗体片段,所述抗体片段包括Fab片段、scFv片段、Fv片段、dAb片段、Fd片段、双体(diabodies)、三体(triabodies)或纳米抗体(nanobodies)。采用单克隆抗体和其他抗体并利用重组DNA技术的技术以产生保留初始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子是可能的。此类技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见,例如EP 0 184 187 A、GB 2,188,638 A或EP0 239 400 A。可以以很多种方式来修饰抗体,并且该术语应被解释为覆盖具有带有期望的特异性的抗体抗原结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此,该术语覆盖抗体片段和衍生物,所述抗体片段和衍生物包括包含不管是天然的还是全部或部分合成的免疫球蛋白结合结构域的任何多肽。包含融合至另一种多肽的免疫球蛋白结合结构域或等效物的嵌合分子因此被包括。嵌合抗体的克隆和表达被描述于EP 0 120 694 A和EP 0 125 023 A中。
在现有技术中,已示出的是,完整抗体的片段可进行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段;(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段;(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.等,Nature 341,544-546(1989));(v)分离的CDR区;(vi)F(ab')2片段,包含两个连接的Fab片段的二价片段;(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接,所述接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,Science,242;423-426,1988;Huston等人,PNAS USA,85:5879-5883,1988);(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双体”,通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804;Holliger等人,P.N.A.S.USA,90:6444-6448,1993)。Fv、scFv或双体分子可通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥而稳定化(Reiter等人,Nature Biotech,14:1239-1245,1996)。还可制备包含连接至CH3结构域的scFv的微抗体(Minibodies)(Hu等人,Cancer Res.,56:3055-3061,1996)。因此,此类结合片段被本发明所预期。
在优选的实施方案中,本文公开的方法采用良好地适合于使蛋白诸如抗体经由接头与药物诸如细胞毒素结合的试剂和条件。特别地,在本方法中使用的反应条件有助于避免当使用现有技术的试剂诸如马来酰亚胺时易于发生的问题,所述现有技术的试剂具有产生具有一系列不同特性的不同产物的混合物的倾向。更特别地,如可从以下实验数据看出的,使用根据本发明的接头产生蛋白药物缀合物诸如ADC的方法避免了与马来酰亚胺交联有关的问题。
如以上提到的,用于蛋白药物缀合物(例如ADC)组合物的感兴趣的蛋白(例如抗体)可利用存在的硫醇基团,或通过在该方法的初始步骤中引入硫醇基团例如通过使蛋白(例如抗体)的一个或更多个官能团反应以产生硫醇基团,或通过将硫醇基团或其前体引入到蛋白(例如抗体)中,来与接头结合。例如,这可包括在期望使接头与蛋白(例如抗体)结合的位点处将半胱氨酸残基引入到蛋白(在该实例中,抗体)中的步骤。在其中在起始或野生型多肽/蛋白中不存在用于根据本发明的反应的便利的半胱氨酸残基的情况中,这可以是有用的。方便地,这可利用蛋白诸如抗体多肽的定点诱变来完成,蛋白的定点诱变的利用在本领域是被良好地确立的。
可选地或另外地,当蛋白是商品级白蛋白时,可以需要初始还原步骤,因为存在的大部分半胱氨酸硫醇被加帽,如以下进一步详细讨论的。
实验数据和讨论
以下实验数据主要使用被识别为并在此被称为如以下示出的以其游离酸或NH-聚乙二醇化形式的PL13的接头分子产生。
1.表明PL11、PL12和PL13接头与谷胱甘肽的反应性
谷胱甘肽包含对于缀合容易地可用的硫醇基团,并且可提供对于蛋白的好的模型以评价用于本发明的接头在蛋白药物缀合物诸如ADC中的效用的合适性。图1示出了根据本发明的三种接头基团实例并表明了其与谷胱甘肽中存在的硫醇基团缀合的能力。图1中的实例为PL11、PL12和PL13,并且以下示出了其结构。
2.PL13游离酸选择性的确定
以下给出的数据表明,根据本发明的接头示出对半胱氨酸基团的特异性。PL13游离酸被识别为:
在pH 7.0、7.5和8.0下,PL13游离酸与N-乙酰基半胱氨酸的反应性
使PL13游离酸在以下三种单独的pH下与2摩尔当量的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)反应:7.0、7.5和8.0。在室温(RT)下在缓冲至适当的pH的甲醇/磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(9:1的比率)中进行反应。进行以在15分钟内1%至50% B(具有0.1% TFA的乙腈)的梯度并在254nm检测的RP-HPLC分析,以监测游离硫醇随时间向PL13的乙烯基的加成。
方法:
将210μL的甲醇中的2.61mM PL13游离酸与22μL的缓冲液中的50mM NAC混合,以给出2.37mM PL13游离酸和4.74mM NAC的最终浓度。
结果:
在24小时后,在所有pH下以5.1分钟的保留时间洗脱PL13-NAC加合物(参见图2)。在pH 7.0和8.0下,产物(PL13-NAC加合物)的量相似。在pH 7.5下,PL13游离酸的反应性较慢。另外,在4分钟,未被识别的峰被洗脱出。
ESI-MS分析证实了在所有分析的pH下,PL13-NAC加合物的存在。在此包括了MS跟踪数据(MS trace data)以示出在pH 7.0(图3)和pH 8.0(图4)下进行的该分析。
在pH 8.0下,PL13游离酸与N-乙酰基半胱氨酸的反应性
使PL13游离酸在甲醇/PBS溶液(9:1),pH 8.0中与2摩尔当量NAC反应。反应的进程通过RP-HPLC利用在15分钟内1%到50% B的梯度以在254nm处检测来监测。在RT下在孵育的0、1、4和72小时分析样品(参见图5)。
方法:
将100μL的甲醇中的2.61mM PL13游离酸与11μL的以pH 8.0的缓冲液中的50mMNAC混合,以给出2.35mM PL13游离酸和5mM NAC的最终浓度。
结果:
在前4小时内,PL13游离酸与NAC的加成是缓慢的。在孵育的72小时后,在pH 8.0下,~70%的PL13游离酸被转化成产物(PL13-NAC加合物)。
在pH 7.0下,PL13游离酸与10当量的酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和N-乙酰基半胱氨酸的反应性
在pH 7.0下,用10当量的每种氨基酸(酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和N-乙酰基半胱氨酸(NAC))挑战PL13游离酸。通过RP-HPLC利用在15分钟内1%到50% B的梯度以设置在254nm处的检测来分析反应。
方法:
将50μL的甲醇中的2.61mM PL13与260μL的缓冲液中的20mM Tyr/His/Lys和NAC混合,以给出0.42mM PL13以及Tyr、His、Lys和NAC各自4.2mM的最终浓度。
结果:
在pH 7.0下,在Tyr、His和Lys的存在下PL13游离酸与NAC选择性地反应(参见图6)。图7示出了MS数据以表明仅形成了PL13 NAC加合物。
在10摩尔过量的氨基酸下,PL13和NAC之间的加成反应显著地增加。PL13游离酸向期望的PL13-NAC加合物的转化在室温(RT)下在4小时后完成90%,并且在<18小时内完全完成。
得到的结果表明根据本发明的接头分子的游离酸形式经由接头分子的乙烯基对半胱氨酸反应性的选择性。
PL13游离酸与赖氨酸反应性的RP-HPLC分析
在RT下用pH 7.4的PBS缓冲液中的10当量赖氨酸挑战PL13游离酸。通过RP-HPLC利用在30分钟内水中的12%到50%乙腈的梯度以设置在270nm处的检测来分析反应。
方法:
将10μL的甲醇中的4mM PL13与50μL的8mM Lys溶液和40μL的pH 7.4的PBS缓冲液混合,以给出0.4mM PL13和4.0mM Lys的最终浓度。通过RP-HPLC利用在30分钟内水中的12%到50%乙腈的梯度以设置在270nm处的检测来分析反应。
结果:
在pH 7.4下,PL13游离酸不与Lys反应,因为在RP-HPLC分析中未观察到对应于PL13-Lys加合物的峰(参见图8)。
得到的结果表明通过使PL13游离酸与Lys一起孵育,无加合物形成。该数据支持本发明的接头的游离酸形式的半胱氨酸基团选择性。应领会到,马来酰亚胺不呈现出此类半胱氨酸特异性,并且因此本发明的接头在这一点上展现益处。
虽然以上数据示出了由本发明的接头呈现的半胱氨酸特异性,但容易地领会到,如果接头通过本领域所熟知的方法而被修饰,则可选地可实现赖氨酸特异性。
PL13游离酸与天冬氨酸的反应性
在pH 7.0下并在RT下,用10当量的天冬氨酸(Asp)处理PL13游离酸。通过RP-HPLC以在15分钟内1%到50% B的梯度以在254nm处的检测来进行分析。
方法:
将50μL的甲醇中的2.61mM PL13游离酸与280μL的缓冲液中的50mM Asp混合,以给出0.42mM PL13游离酸和4.2mM Asp的最终浓度。
结果:
在RT下在pH 7.0下,在Asp的存在下PL13游离酸在18小时内是稳定的(参见图9)。
MS光谱证实通过使PL13游离酸与Asp一起孵育,无加合物形成(数据未示出)。再次,该数据支持本发明的接头的半胱氨酸基团选择性。应领会到,马来酰亚胺不呈现出此类半胱氨酸特异性,并且因此本发明的接头展现优于其的益处。
3.合成PL13-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE细胞毒性药物接头
通过本领域技术人员将熟悉的片段化方法合成PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。
方法:
将PL13游离酸经由HOBt活性酯方法偶联至示例性细胞毒素H-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的游离氨基末端。
结果:
合成了3.1mg的PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(参见图10)。将材料溶解在二甲基乙酰胺(DMA)中以提供50mM的浓度的药物接头溶液。
RP-HPLC证实了PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE接头的纯度(数据未示出)。
ESI-MS分析证实了细胞毒性药物接头的身份(预期的MW为1296.67Da,实验结果给出1296.5Da的MW)(参见图11)。
4.生成曲妥珠单抗-PL13-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE
产生20mg的本发明的示例性ADC曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物和20mg的包含已知的马来酰亚胺接头的ADC曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物。
PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗的缀合
方法:
还原曲妥珠单抗以允许每个曲妥珠单抗分子缀合3-4个药物。未提供用于还原曲妥珠单抗的详细方法,因为这应该是本领域技术人员所熟知的。
在pH 7.0下使马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE以超过游离硫醇1.25摩尔过量与曲妥珠单抗缀合。使反应在RT下进行1小时。通过过量的NAC猝灭缀合反应。通过疏水作用色谱法(HIC)使用Tosoh butyl-NPR(4.6x3.5,2.5μm)柱并通过UV-VIS光谱学完成曲妥珠单抗缀合物的分析。MMAE在248nm处具有特有的UV吸收度(ε248=1500M-1cm,ε280=15900M-1cm)。
使PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE以超过游离硫醇1.25、2.5、5和10摩尔过量与曲妥珠单抗偶联。在pH 7.0下进行反应持续16小时。通过HIC(在Tosoh butyl-NPR柱上的分离)和PLRP色谱法(在PLRP柱-2.1mmx5cm,5μm上的分离)两者来分析缀合反应。通过UV-VIS光谱学检查曲妥珠单抗缀合物。MMAE细胞毒性药物和PL13接头两者均对在248nm处的UV吸收度有贡献。
结果:
利用药物相对于游离硫醇的1.25的比率使马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗的反应在1小时内完成(参见图12)。图12中的数字标示与全长抗体缀合的药物的量。入口是UV-Vis谱,所述UV-Vis谱代表由马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗的缀合引起的在248nm处的吸收度的增加。获得了10mg的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物(药物与抗体比率(DAR)2.2)并留出用于体外研究,如以下进一步讨论的。
由于接头的低溶解度,PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE反应的速率和效率比马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE慢得多(参见图13)。以超过硫醇的1.25摩尔过量的药物-接头进行缀合。入口是UV-Vis谱,所述UV-Vis谱示出了由PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗在16小时内的偶联引起的在248nm处的吸收度的增加。通过应用超过硫醇基团的5摩尔过量的药物-接头,观察到PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗缀合的速率的缓慢增加(参见图14)。在图14中,数字标示了与全长抗体缀合的药物的量。DL指示未缀合的药物。
以10摩尔过量并在50%丙二醇的存在下,PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗的缀合导致在4小时内90%的收率(参见图15和图16)。在图15中,数字标示与全长抗体缀合的药物的量。DL指示未缀合的药物。在图16中,数字标示与抗体的轻链(L)或重链(H)缀合的药物的量。获得了7.2mg的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物(DAR 3.03),并留出用于体外研究,如以下进一步讨论的。
确定曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的药物抗体比(DAR)。
常常应用HIC和PLRP色谱法来表征半胱氨酸连接的ADC的平均药物荷载和药物荷载分布。平均药物荷载和药物荷载分布的确定是关键属性,因为它影响ADC的效力和药代动力学。
结果:
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC表征得到2.2的DAR计算值、以及1.8%未缀合的曲妥珠单抗(参见图12)。来自HIC谱的DAR计算值通过本领域所熟知的方法来确定,如以下针对图27讨论的。
曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC分析得到峰,所述峰无法足够良好地分辨出以支持DAR确定(参见图15)。但是,为了完整性,该数据被包括在此。HIC被用于计算曲妥珠单抗的量,DAR 0被计算为~8.4%。
二硫苏糖醇(DTT)还原的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE经由PLRP柱的分离提供了良好地分辨的峰(图16),所述峰对应于未缀合的或药物缀合的抗体轻链和重链。对于曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE,计算出3.0的DAR(参见图17)。图17中的表格示出了基于未缀合的和药物荷载的轻链和重链的面积百分比,曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的DAR计算。
5.曲妥珠单抗-PL13-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的稳定性研究
在PBS缓冲液中的NAC的存在下,评价了曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的药物-接头的稳定性。
方法:
在37℃下,将每种ADC(以1-2mg/mL的浓度)与1mM PBS缓冲液中的NAC一起孵育持续24小时。
结果:
曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物不受缓冲液中NAC的存在的影响(参见图18和19)。曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE在NAC的存在下示出降低的稳定性(参见图20)。在图18中,数字标示与全长抗体缀合的药物的量。DL指示未缀合的药物。
图19特别地表明对于从被游离硫醇挑战得到的含PL13的ADC,不存在谱的改变,表明了构造的稳定性。
6.曲妥珠单抗-PL13-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-Val-Cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的SDS-PAGE和SEC分析
通过SEC色谱法和非还原SDS-PAGE来评价曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。
结果:
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE作为99.5%单体存在(参见图21的A)。曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE作为93.5%单体存在(参见图21的B)。
在非还原条件下的SDS-PAGE分析示出,由于在用接头-药物部分使半胱氨酸残基烷基化期间在抗体中的链间二硫键的破坏,在曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE样品和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE样品两者中均存在多个条带(参见图22)。在图22中,泳道1代表以1.8mg/mL的浓度装载到凝胶上的5μL的曲妥珠单抗-PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE样品的分析,并且泳道2代表以5mg/mL的浓度装载到凝胶上的5μL的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE样品的分析。由于重链和轻链之间的强的非共价相互作用,全长抗体的完整性仍被保持,这被SEC分析所证实。
7.合成PL13-NH-PEG4-OSu异型双官能接头
将亲水性PEG(PEG4)引入到接头分子接头臂部分,以提供PL13-NH-PEG4-OSu,以改善接头溶解度超过在以上第1部分下给出的实例(参见图23)。
方法:
将PL13游离酸(如以上描述的)偶联至1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸。将羧基活化到期望的琥珀酰亚氨基酯使用在无水二氯甲烷(DCM)中偶联的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)2.5当量/HOSu来进行。经由过滤从冷的DCM去除未反应的DCC和二异丙基脲副产物。
结果:
PL13-NH-PEG4-COOH的ESI-MS(参见图24)证实了接头身份。
PL13-NH-PEG4-OSu和SMCC接头的交叉反应性的比较
曲妥珠单抗经由已知的接头反式-4-(马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯(SMCC)和PL13-NH-PEG4-OSu的交联的程度通过还原SDS-PAGE来评价。
方法:
将2mg/mL的最终浓度的曲妥珠单抗与10倍过量的SMCC或PL13-NH-PEG4-OSu一起孵育。在RT下孵育样品。
结果:
从SDS-PAGE明显的是,PL13-NH-PEG4-OSu示出相比于SMCC接头不那么高的分子量条带(参见图25,泳道5-9)。在PL13-NH-PEG4-OSu SDS-PAGE上存在一些较高分子量的条带,但是这些条带在一定程度上也存在于起始曲妥珠单抗泳道中(参见图25,泳道5)。
与本发明的接头相比,SMCC接头由于马来酰亚胺基团特别地朝向赖氨酸残基的胺侧链的非特异性反应性而诱发曲妥珠单抗交联。
8.合成PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE
为了进一步改进之前合成的PL13-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE细胞毒性药物接头的溶解度,将短的亲水性PEG单元引入到分子(参见图26)。PEG单元还将‘间隔物’引入到了ADC接头臂,将MMAE细胞毒性有效荷载和PL13的抗体附接点的间隔增加了大约39个原子(相对于之前在PL13-vcMMAE中的22个原子)。认为该“间隔物”将增加PL13单元的旋转柔性,所述旋转柔性可影响与游离硫醇的迈克尔加成的动力学。
方法:
纯化40mg粗制Fmoc-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。然后通过氨解移除N-Fmoc基团,并纯化胺官能化的细胞毒性化合物以提供24mg材料。这被用于经由标准HOBt活性酯化学反应偶联PL13-NH-PEG4-COOH。
结果:
合成了PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。该分子代表了根据本发明的可裂解的ADC系统的实例。
9.PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE与曲妥珠单抗的缀合
方法:
在RT下在乙二胺四乙酸(EDTA)的存在下用2.4倍过量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)还原曲妥珠单抗,持续1小时。将抗体再缓冲(re-buffered)到PBS中。在RT在5%v/v DMA的存在下,使20mg/mL的浓度的曲妥珠单抗与20倍过量的PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合,持续16小时。另外地,在RT以6摩尔过量使马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE接头偶联至曲妥珠单抗(20mg/mL),持续1小时。通过HIC、PLRP和SEC色谱法来分析获得的ADC。
结果:
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC表征得到4.29的DAR计算值(参见图27的A)。
曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的HIC表征得到3.15的DAR计算值(参见图27的B)。
在图27的A和B中,数字标示与全长抗体缀合的药物的量。表格展示了来自HIC洗脱谱的每个峰面积的相对百分比。通过将峰面积百分比乘以对应的药物荷载以得到加权的峰面积来计算平均DAR。加权的峰面积被合计并除以100以给出最终的DAR值。
通过PLRP对DTT还原的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的DAR分析证实平均药物荷载为4.3(参见图28的A和图29)。
通过PLRP对DTT还原的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的分析证实平均药物荷载为3.8(参见图28的B和图29)。
在图28的A和B中,数字标示缀合至抗体的轻链(L)或重链(H)的药物的量。
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(HER-MAL-MMEA)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(HER-PL-13-MMEA)两者基于SEC色谱法的分析示出两种样品均表现为单体物质(参见图30的A和B)。图30的A和B下方的表格示出了高分子量物质(HMW)、单体和低分子量物质(LMW)的计算值。
10.PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合物的优化条件
方法:
在RT下用2.4当量的TCEP还原曲妥珠单抗(23.5mg/mL),持续2小时,以得到平均4.5个游离硫醇。在30℃下在10%v/v DMA的存在下,使还原的曲妥珠单抗与20倍过量的PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE缀合,持续18小时。通过HIC和PLRP色谱法来分析缀合物(参见图31的A和B)。
结果:
HIC和PLRP数据示出缀合效率的实质性改进。较高水平的缀合效率还已导致‘异常的(odd)’DAR物质的水平的显著降低,和未缀合的抗体的水平的降低。
11.150mg规格的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(A)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(B)的缀合,表明方法的可扩缩性(scalability)
方法:
在RT下用2.1当量的TCEP还原曲妥珠单抗(24.53mg/mL),持续2小时。在30℃下在10%v/v DMA的存在下,使还原的曲妥珠单抗与20倍过量的PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE缀合,持续18小时。
在RT下用1.95当量的TCEP还原25.68mg/mL的浓度的曲妥珠单抗,持续2小时。在RT下在10%v/v DMA的存在下,使还原的曲妥珠单抗与6倍过量的马来酰亚胺-val-cit-MMAE缀合,持续1小时。
通过HIC和SEC色谱法来分析缀合物(参见图32和33)。
结果:
对于曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(图32的A)和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE(图32的B),HIC谱示出相似的缀合效率。SEC(图33的A和B)证实,两种缀合物均为单体,仅存在少量的高分子量物质(1.4-2.4%)。这表明利用本发明的接头开发的缀合方法的可扩缩性。
12.PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE与Thiomab的缀合,表明与工程化的曲妥珠单抗(Thiomab)的成功缀合
方法:
在pH 7.4的缓冲液中在10% DMA的存在下,具有被引入抗体轻链中的半胱氨酸突变(V205C)的曲妥珠单抗以10mg/ml的浓度与40倍过量的PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE缀合。将缀合反应在35℃下孵育持续48小时。
结果:
曲妥珠单抗(V2015C)-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE的HIC谱表明,PL13可在两种pH下成功地与具有工程化的Cys残基的抗体缀合(图34)。缀合反应的速率和程度表现为受硫醇微环境的影响。
13.根据本发明的ADC作为ADC的效用
使如以上在第8部分描述的ADC缀合产物进一步经受体内和体外测试,以表明其作为商业ADC的效用。
在NAC的存在下,曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的体外稳定性
方法:
在PBS缓冲液中在NAC的存在下,评价曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物的药物-接头的稳定性。
结果:
曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物不受缓冲液中NAC的存在的影响(图36)。在NAC的存在下,曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE示出降低的稳定性(参见图35)。图36特别地表明对于从被游离硫醇挑战得到的含PL13的ADC,不存在谱改变,表明了构造的稳定性。
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE在小鼠血浆中的体外稳定性
比较小鼠血浆中ADC曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE的体外血清稳定性。
方法:
将曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE分别加入(spiked)到过滤的无胸腺裸鼠血浆中至0.2mg/mL的浓度。将该溶液混合,并取一式三份的50μL等份并在液氮中骤冷(时间点-0h)。在37℃下孵育ADC的血浆溶液,持续7天。在以下每个时间点以一式三份抽出50μL等份:1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天,并在-80℃下贮存直至分析。
结果:
通过LC-ESI/MS分析监测ADC稳定性。在MS分析之前,将血浆样品预纯化并用胰蛋白酶/CNBr消化。选择四种未缀合的肽(来自重链的两种和来自轻链的两种)和两种缀合的肽(来自重链的一种和来自轻链的一种)来监测ADC的稳定性。来自未缀合的肽的平均数据对应于小鼠血浆中的抗体组分(总Ab)的稳定性,并且来自缀合的肽的数据示出ADC缀合物的稳定性(LC缀合的肽、HC缀合的肽)
该体外数据揭示了,曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE在轻链和重链两者处均经历脱药物化,而抗体组分是稳定的(图37的A)。当与轻链肽相比时,从重链肽丢失药物更快速,这表明药物丢失的速率受缀合位点的影响。
曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物贯穿7天的孵育时期保留MMAE药物,这示出PL13对两种缀合位点均给予稳定性(图37的B)。对两种缀合物观察到的变化性是由于用于样品分析的ESI-MS方法的样品回收效率。
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE在小鼠中的体内稳定性
方法:
在以5mg/kg的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE缀合物注射的小鼠中,评价体内稳定性。在LC-MS分析之前,将血浆样品预纯化并用胰蛋白酶/CNBr消化。选择两种缀合的肽(来自重链的一种和来自轻链的一种)来监测ADC的稳定性。
结果:
缀合的肽的稳定性是以下两种事件的结果:1)ADC的分解代谢降解和2)由于接头的不稳定性造成的药物丢失。源自曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合的肽在小鼠血浆中在第1天示出比源自曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合的肽更好的稳定性。观察到的差异似乎是由于从源自曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合的肽比从源自曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的缀合的肽更快速的药物释放,这与体外小鼠血浆数据一致,示出为在孵育的前四天内曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的快速脱药物化(图38);在前两天内,约70%的附接至轻链的药物和90%的重链上的药物丢失。相比之下,曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE由于接头的稳定性而在较长的时间段内保留了较多的药物。
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE在多种细胞系中的体外稳定性
在图39A至39C中,示出了以上描述的ADC的SKBR3、BT747和JIMT-1细胞杀伤数据。在该测试中选择SKBR3、BT747和JIMT-1细胞系,因为已知它们表达Her2受体。另外地,已知JIMT-1细胞系对曲妥珠单抗具有耐受性。在图39A至39C中,“ADC mal”涉及曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE,并且“ADC-PL13”涉及曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。测试的缀合物针对三种细胞系的相对体外活性表明曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE的数据比得上曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE。因此,该数据示出,本发明的ADC是有活性的,并且因此PL13的存在对细胞杀伤不具有负面影响。
曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE在呈现乳腺癌细胞肿瘤的小鼠中的体内稳定性
在图40、41和42中,示出了关于ADC对呈现乳腺癌细胞肿瘤的小鼠的影响的异种移植物数据。使用的乳腺癌细胞系是BT474(Her2表达者,对曲妥珠单抗具有高的敏感度)。
利用小鼠重量(如图40中示出的)来测量ADC的体内毒性。从获得的数据可看出,在疗法时期的进程内,曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-mal)(图40的A)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-PL13)(图40的B)对小鼠重量具有可忽略的影响。这表明,本发明的ADC对于商业使用具有合适的毒性水平。
图41示出了在21天的疗法时期内三种剂量(0.1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)的测试的ADC对肿瘤生长的效力。通过肿瘤体积的改变确定肿瘤生长。用两种化合物以0.1mg/kg处理的小鼠相对于未处理组均经历肿瘤生长延迟。相比之下,用曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-mal)和曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-PL13)以5mg/kg和10mg/kg给药的所有动物在疗法时期内示出完全响应。
图42示出了在10天的疗法时期内三种剂量(0.1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)的测试的ADC对肿瘤成熟度组织学表型的效力。在苏木精和曙红染色后,用显微镜检查肿瘤组织并且如下分级:
0:无异种移植物团块;皮下组织或脂肪组织中偶尔地有孤立的肿瘤细胞
1:小的不完整团块;不完全的上皮发育顺序
2:示出显著的细胞丢失的异种移植物
3:带状细胞丢失,具有成熟肿瘤区域
4:完整的异种移植物团块,示出完全的上皮发育顺序和相关病理
对于以0.1mg/kg给药的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-PL13)或曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE(ADC-mal),未观察到肿瘤成熟度的降低,在两种ADC之间未观察到显著差异。然而,以5mg/kg和10mg/kg给药的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE从第3天起表现出显著降低的肿瘤成熟度(分别3级和3/2级)。该效果在第10天更显著(对于5mg/kg1级,以及对于10mg/kg 1/0级),一些样品示出无肿瘤团块。以5mg/kg和10mg/kg给药的曲妥珠单抗-马来酰亚胺-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE从第3天起降低肿瘤成熟度(分别4/3级和4/3/2级),但是与以相应剂量的曲妥珠单抗-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-MMAE给药的动物在第3天时相比,效果较不显著。此外,在第10天,对于5mg/kg和10mg/kg剂量,对于ADC-mal具有比对于ADC-PL13观察到的显著更大的肿瘤异质性。
14.表明PL11-PEG20KDa、PL12-PEG20KDa和PL13-PEG20KDa接头与白蛋白的反应性
如以上表明的,商品级白蛋白中存在的大部分半胱氨酸硫醇被加帽,并且因此在与接头分子缀合之前,还原步骤是必需的。
方法:
在室温(RT)下用含有乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)的pH 7.0磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的二硫苏糖醇(DTT)(1mM)还原白蛋白(221μM)持续1小时,然后在Nap-5柱上脱盐,并通过UV测量定量。在RT下在PBS,pH 7.4、1mM EDTA中进行20KDa PEG-PL-12(10摩尔过量)或20KDa PEG-PL-13(10摩尔过量)与还原的白蛋白(20μM)的缀合,持续1天。相似地,在RT下在含有1mM EDTA的pH 7.4的PBS中进行20KDa PEG-马来酰亚胺(1.1摩尔过量)与还原的白蛋白(20μM)的缀合,持续1天。在SDS-PAGE凝胶上分析反应,并通过利用ImageLab软件(Biorad)分析SDS-PAGE凝胶上的蛋白条带密度进行定量。
结果:
1天后,用还原的商品级白蛋白仅观察到适中的缀合收率。PL13的缀合以比得上马来酰亚胺对照的收率进行,而PL12在相同的时间段内给出了稍微较低的收率。这在图43中示出。
15.优化PL11、PL12和PL13与白蛋白的缀合
对于PL-11在pH 5.5下并且对于PL-12和PL-13在pH 5.5、6.5、7.5、8.0和8.5下确定接头与白蛋白的缀合。
方法:
在37℃下在pH 5.5的50mM乙酸Na中进行PL-11(10摩尔过量)与白蛋白(50μM)的缀合,持续24小时。在以下缓冲液中进行PL-12和PL-13(10摩尔过量)与白蛋白(50μM)的缀合:50mM乙酸Na pH 5.5;PBS 1mM EDTA pH 6.5;PBS 1mM EDTA pH 7.5;100mM磷酸盐;1mMEDTA pH 8.0;和100mM碳酸Na、1mM EDTA pH 8.5;在37℃下持续24小时。
完成之后,将所有的白蛋白样品在Nap-5柱上脱盐到PBS缓冲液(pH 7.4)中。通过Ellman测定定量缀合效率。Ellman测定通过使5,5'-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)与游离硫醇基团反应检测并定量游离半胱氨酸残基。与未缀合的白蛋白对照相比,接头分子与白蛋白中的34Cys的游离硫醇基团的缀合阻断了这些基团通过Ellman试剂的检测。可检测的游离硫醇的浓度的降低被用于定量与白蛋白缀合的接头分子的量。
结果:
PL-11与白蛋白在pH 5.5下的缀合以82%的收率进行。用于PL-12(91%)和PL-13(94%)的缀合的最佳pH被确定为pH 7.5。这些结果示于图44A-44C中。
16.通过ESI-MS表明接头-白蛋白缀合物的稳定性
另外,通过ESI-MS分析白蛋白-PL11、白蛋白-PL12和白蛋白-PL13缀合物。
方法:
在37℃下在pH 6.5下在含有EDTA(1mM)的PBS中进行PL-11(20摩尔过量)与白蛋白(50μM)的缀合,持续24小时。在37℃下在pH 7.5下在含有EDTA(1mM)的PBS中进行PL-12和PL-13(10摩尔过量)与白蛋白(50μM)的缀合,持续24小时。通过ESI-MS分析白蛋白-接头缀合物。
结果:
图45示出了针对白蛋白-PL-11缀合(A)、白蛋白-PL-12缀合(B)和白蛋白-PL-13缀合(C)获得的ESI-MS结果。
基于MS信号强度检测并定量以下白蛋白物质(注意,MW代表分子量):
白蛋白-PL11
·未缀合的白蛋白–6%
未缀合的白蛋白的预期的MW-66440(检测的MW=66445Da)
·白蛋白-PL11缀合物–90%
白蛋白-PL11的预期的MW–66649Da(检测的MW=66650Da)
·缀合至两个PL11的白蛋白~4%
白蛋白-2-PL11的预期的MW–66858Da(检测的MW=66858Da)
白蛋白-PL12
·未缀合的白蛋白–1%
未缀合的白蛋白的预期的MW-66440(检测的MW=66441Da)
·白蛋白-PL12–92%
白蛋白-PL12的预期的MW–66663Da(检测的MW=66664Da)
·缀合至两个PL12的白蛋白-7%
白蛋白-2-PL12的预期的MW–66886Da(检测的MW=66886Da)
白蛋白-PL13
·未缀合的白蛋白–5%
未缀合的白蛋白的预期的MW-66440(检测的MW=66441Da)
·白蛋白-PL13–94%
白蛋白-PL13的预期的MW–66631Da(检测的MW=66632Da)
·缀合至两个PL13的白蛋白-1%
白蛋白-2-PL13的预期的MW–66822Da(检测的MW=66822Da)
特别地,参考图45,峰(4501)、(4504)和(4507)对应于未反应的和氧化的白蛋白,峰(4502)、(4505)和(4508)对应于单缀合白蛋白,并且峰(4503)、(4506)和(4509)对应于双缀合白蛋白。
17.表明白蛋白-接头缀合物在谷胱甘肽中的稳定性
在7天的时期内,在过量谷胱甘肽的存在下确定白蛋白-接头分子缀合物的稳定性并通过ESI-MS分析。
方法:
在37℃下将白蛋白-PL-12缀合物(0.5mg/mL)的样品与PBS(pH 7.4)中的还原的谷胱甘肽(1mM)一起孵育,持续7天。在ESI-MS上分析样品。
结果:
图46示出了对于作为代表性实例的白蛋白-PL-12缀合物获得的结果。对于白蛋白-PL-11缀合物和白蛋白-PL-13缀合物观察到相似的趋势。
图46示出了在第0天、1天、4天和7天的ESI-MS结果。在图46中,峰(4601)、(4603)、(4605)和(4608)对应于白蛋白,峰(4602)、(4604)、(4606)和(4609)对应于白蛋白-PL12缀合物并且峰(4607)和(4610)对应于GSH-白蛋白。因此,示出以下:
·存在的大部分物质是白蛋白-PL12缀合物(MW=~66664Da)
·与1mM谷胱甘肽一起孵育后,从与谷胱甘肽一起孵育的第4天起,白蛋白-GSH信号(~8%,MW=66752Da)存在很缓慢的增加,并在孵育的第7天达到~13%。
可总结出,本发明的白蛋白-接头缀合物在竞争性环境中表现出良好的稳定性。
18.使用根据本发明的接头生成白蛋白-多柔比星缀合物
方法:
使白蛋白、硫代白蛋白(单半胱氨酸突变体)和硫代白蛋白(双半胱氨酸突变体)分别与14、20和30倍过量的PL13-NH-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基-多柔比星接头缀合(图47)。在黑暗中,在37℃,在10%v/v DMA和0.6mM EDTA的存在下,在pH 7.5的147mM磷酸钠中进行反应,持续2天。在这之后,将反应在于pH 7.4的PBS缓冲液中平衡的PD-10柱上脱盐。
通过UV-Vis光谱学使用在495nm处的多柔比星吸收度和消光系数(ε=8030M-1,cm-1)以及在280nm处的白蛋白吸收度和消光系数(ε=34445M-1,cm-1)确定缀合效力,根据以下等式校正在280nm处的多柔比星吸收度:
白蛋白-多柔比星缀合物聚集的程度通过在非还原SDS-PAGE和SEC色谱法上的分析确定。
将10μl的SDS-PAGE装载缓冲液中的每种白蛋白-多柔比星缀合物装载到NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶上并在200V运行持续45分钟。利用多柔比星的天然荧光特性使白蛋白-多柔比星缀合物可视化,然后针对蛋白物质用考马斯染料(Coomassie dye)对凝胶染色。
将5μl的每种缀合物装载到用pH 7.0的150mM磷酸钠缓冲液平衡的SEC HPLC柱上,并以1mL/min的流速洗脱,并在280nm处检测。
结果:
多柔比星与野生型白蛋白和白蛋白突变体的缀合得到对于白蛋白55%的收率,对于硫代白蛋白单突变体32%的收率,以及对于硫代白蛋白双突变体14%的收率(参见图48)。
SDS-PAGE分析表明了少量的高分子量物质(HMWS)在所有白蛋白-多柔比星样品中的存在(参见图49)。该数据与通过SEC分析观察到的数据一致(参见图50)。另外,SDS-PAGE分析证实了通过UV-Vis光谱学观察到的多柔比星与白蛋白的缀合(参见图49,DOX荧光)。
白蛋白-多柔比星缀合物和硫代白蛋白-多柔比星缀合物连同未缀合的白蛋白和未缀合的硫代白蛋白对照一起通过SEC色谱法而被分析。多柔比星缀合物的分析示出,对于白蛋白-DOX单体含量为约97.6%,对于白蛋白-DOX(单突变体)单体含量为86.8%,并且对于白蛋白-DOX(双突变体)单体含量为88.2%(参见图50的B、D和F)。未缀合的白蛋白和硫代白蛋白对照(参见图50的A、C和E)示出与多柔比星缀合物质相似的单体和高分子量物质含量。特别地,图50示出在(5001)、(5003)、(5005)、(5007)、(5009)和(5011)处对应于HMWS的存在的峰,以及在(5002)、(5004)、(5006)、(5008)、(5010)和(5012)处对应于单体含量的峰。
两种硫代白蛋白突变体均示出比野生型白蛋白高的聚集趋势:与天然白蛋白的2.4-2.6%相比,对于硫代白蛋白(单突变体)13.2-14.5%,以及对于硫代白蛋白(双突变体)11.8-16.6%。这些样品的分析证实了,多柔比星经由PL13-PEG4-val-cit-4-氨基苯甲酰基的缀合被良好地耐受并且不产生另外的聚集(参见图50的A、C和F)。
因此,已示出的是,本发明的蛋白药物缀合物提供了对已知蛋白药物缀合物的合适替代物。此外,掺入本发明的蛋白药物缀合物的接头通过将药物成功地与蛋白结合并保留药物直到到达靶组织而使安全且有效的药物递送成为可能。
Claims (18)
2.根据权利要求1所述的蛋白药物缀合物,其中所述抗体为单克隆抗体。
3.根据任一前述权利要求所述的蛋白药物缀合物,其中所述药物为细胞毒素或治疗性肽或多肽。
4.根据权利要求3所述的蛋白药物缀合物,其中所述细胞毒素为生物活性的细胞毒性材料。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的蛋白药物缀合物,其中所述细胞毒素为抗癌药物。
6.根据任一前述权利要求所述的蛋白药物缀合物,其中所述接头包含聚(亚烷基二醇)基团。
7.根据权利要求6所述的蛋白药物缀合物,其中所述聚(亚烷基二醇)基团为聚乙二醇(PEG)。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的蛋白药物缀合物,其中所述聚(亚烷基二醇)基团设有一个或更多个反应性官能团,所述一个或更多个反应性官能团包括羟基、胺、羧酸、烷基卤、叠氮化物、琥珀酰亚氨基或硫醇基团。
9.根据任一前述权利要求所述的蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物还包含延伸物接头。
10.根据权利要求9所述的蛋白药物缀合物,其中所述延伸物接头是酶可裂解的。
11.一种产生任一前述权利要求所述的蛋白药物缀合物的方法,所述方法包括使所述蛋白与所述接头和所述药物接触。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述接头在与所述蛋白接触之前结合至所述药物。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述接头在与所述蛋白接触之后结合至所述药物。
14.根据权利要求11所述的方法,所述方法包括使具有至少一个反应性硫醇基团的蛋白与所述接头接触,所述接头包含官能化试剂,所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环,所述乙烯基取代基能够与所述蛋白的至少一个游离的硫醇基团反应,其中所述官能化试剂被共价地连接至聚(亚烷基二醇)分子。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法,所述方法包括使前体官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子反应以产生所述官能化试剂的初始步骤,所述前体官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮杂环芳环。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法,所述方法还包括修饰所述蛋白以产生在变体多肽的一个或更多个期望的位置处具有硫醇基团的变体多肽的初始步骤。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白药物缀合物,所述蛋白药物缀合物用于在疗法中使用。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白药物缀合物在制备用于在疗法中使用的药物组合物中的用途。
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