JP7455188B2

JP7455188B2 - コンジュゲーションのためのポリペプチド複合体及びその応用

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Publication number: JP7455188B2
Application number: JP2022503470A
Authority: JP
Inventors: ジン，ミンジー; チェン，シャオユエ; ジャン，ユエ; ジャン，チェン; イン，リィ; ツァイ，ジエシン; ワン，ジュン; ジョウ，ウェイチャン
Original assignee: Wuxi Xdc Singapore Private Ltd
Current assignee: Wuxi Xdc Singapore Private Ltd
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2024-03-25
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: EP3999544A4; CA3147690A1; WO2021013068A1; CN114127117B; US20220267467A1; CN114127117A; AU2020318112A1; KR20220041851A; EP3999544A1; JP2022540946A; TW202116808A

Description

技術分野
本発明は、一般的に、免疫、細胞生物学、分子生物学と医薬品分野に関する。より具体的に、本発明は、コンジュゲーションのためのポリペプチド複合体及びその応用の関する。

背景技術
抗体は、標的抗原に対する独自の結合特異性と、一連の非抗原依存性免疫相互作用を備えた多機能免疫グロブリンであり、免疫系において重要な役割を果たす。現在使用されている治療用バイオ薬物、診断試薬、および研究試薬の多くは、対象となる病理学的、免疫的、または生物学的メカニズムに関連する抗原に対する抗体である。

近年、薬物負荷抗体コンジュゲートを開発するために多くの努力がなされてきた。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の場合、ＡＤＣには、ターゲティング用の抗体、薬物付着用のリンカー、およびエフェクターとしての強力な薬物負荷を含む。抗体またはそれらの関連する形式は、抗体－抗原相互作用によって、抗原を発現する細胞または他の標的細胞に細胞毒性薬物をもたらす。同時に、抗体とのコンジュゲーション後、薬物の毒性が大幅に低下する。したがって、ＡＤＣは、最小有効量（ＭＥＤ）を減らし、最大耐用量（ＭＴＤ）を増やすことにより、治療ウィンドウを拡大する。ＦＤＡによって承認されたＡＤＣ薬の例として、Ｍｙｌｏｔａｒｇ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ、Ｋａｄｃｙｌａ、Ｂｅｓｐｏｎｓａ、Ｐｏｌｉｖｙ、Ｐａｄｃｅｖ、Ｅｎｈｅｒｔｕ、およびＴｒｏｄｅｌｖｙがある。

ＡＤＣ研究・開発の成功は、抗体の選択、リンカー－薬物負荷の選択、リンカー－薬物負荷のコンジュゲーション方式、およびコンジュゲーションプロセスの開発に依存する。抗体中のシステインチオールは、強い求核試薬として理想的なコンジュゲーション反応基である。抗体の天然形式では、システイン残基が、ジスルフィド結合の形式で存在し、そして、抗体の軽鎖と重鎖及び重鎖と重鎖の間のジスルフィド結合の還元は、コンジュゲーションに理想的な遊離システインチオールを提供する。好ましい負荷－抗体比（ＰＡＲ）およびコンジュゲーション部位を得るというチャンスと課題に対処するために、当技術分野では、多くのコンジュゲーション方法が開発されてきた。理想的には、適度な量の負荷を抗体に接続して、ＡＤＣ製品を不均質にする必要がある。低ＰＡＲコンジュゲーション製品は十分な治療効果を欠くが、高ＰＡＲ製品は毒性が高くて且つ不安定である。したがって、ＡＤＣの不均質性は、治療ウィンドウの拡大を妨げる。したがって、人々は、ＡＤＣ製品の均質性を改善するために、抗体の工学的改変などの努力がなされてきた。

１つの方法では、抗体の点突然変異を使用し、コンジュゲーション用の反応性の高い残基を持つアミノ酸の生成を誘導する。ＴｈｉｏｍａｂＴＭ技術はＧｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発され、抗体にシステイン変異を導入することができる（ＪａｇａｔｈＲＪｕｎｕｔｕｌａら、「細胞毒性薬と抗体の部位特異的コンジュゲーションは治療指数を改善できる（Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｏｆａｃｙｔｏｔｏｘｉｃｄｒｕｇｔｏａｎａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｎｄｅｘ）」、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８、２６（８）：９２５－９３２）。Ｔｈｉｏｍａｂコンジュゲーションは、還元後に操作されたシステイン残基で発生し、それによって非常に均質なコンジュゲーション生成物が得られる。非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）技術も、均質なコンジュゲートを生成するために使用される。例えば、ケトン基やアジド基を持つ非天然アミノ酸は、コンジュゲーション部位として抗体に導入される（ＪｕｎＹ．Ａｘｕｐら、「非天然アミノ酸を使用した部位特異的抗体薬物コンジュゲートの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｕｓｉｎｇｕｎｎａｔｕｒａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）」、ＰＮＡＳ、２０１２、１０９（４０）：１６１０１－１６１０６；ＭｉｃｈａｅｌＰ．ＶａｎＢｒｕｎｔら、「哺乳類細胞にアミノ酸を含む遺伝的にコード化されたアジドは、クリック環状付加化学を使用して部位特異的抗体薬物コンジュゲートを形成できる（ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｃｏｄｅｄＡｚｉｄｅＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＡｍｉｎｏＡｃｉｄｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓＥｎａｂｌｅｓＳｉｔｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｂｏｄｙ－ＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓＵｓｉｎｇＣｌｉｃｋＣｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，２０１５、２６（１１）：２２４９－２２６０）；このコンジュゲーション方法では、特定の反応により非常に均質な産物も得られる。

部位特異的変異誘発に基づく方法には、欠点がある。まず、突然変異部位を注意深く選択する必要があり、そうしないと、抗体の安定性とコンジュゲーション効率が影響を受ける。第二に、点突然変異抗体の発現レベルは、通常、非常に低く、これは化学、製造、管理（ＣＭＣ）の段階に、問題になる恐れがある。

もう一つの方法は、酵素によって認識できるコンジュゲーション部位として短いポリペプチドタグを導入することである。グルタミンタグ（ＬＬＱＧ）をｍＴＧの認識モチーフとして（ＰａｖｅｌＳｔｒｏｐら、「部位の重要性：コンジュゲーション部位が抗体薬物コンジュゲートの安定性と薬物動態を調節する（ＬｏｃａｔｉｏｎＭａｔｔｅｒｓ：ＳｉｔｅｏｆＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＭｏｄｕｌａｔｅｓＳｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３、２０（２）：１６１－１６７）、ＬＰＥＴＧを選別酵素Ａの認識モチーフとして（ＲｏｇｅｒＲ．Ｂｅｅｒｌｉら、「選別酵素は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで非常に効果的な部位特異的抗体薬物複合体の形成を仲介する」（ＳｏｒｔａｓｅＥｎｚｙｍｅ－ＭｅｄｉａｔｅｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＳｉｔｅ－ＳｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅｓｗｉｔｈＨｉｇｈＩｎＶｉｔｒｏａｎｄＩｎＶｉｖｏＰｏｔｅｎｃｙ）”，ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１５，１０（７）：ｅ０１３１１７７）、およびＬＣｘＰｘＲをホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）の認識モチーフとして（ＰｅｎｇＷｕら、「遺伝的にコード化されたアルデヒドタグを使用することによる哺乳類細胞で産生された組換えタンパク質の部位特異的化学修飾」、ＰＮＡＳ、２００９、１０６（９）：３０００－３００５）、コンジュゲーションに使用し、均質性の高い製品を得た；ただし、薬物がポリペプチドタグに連結する。

短いポリペプチドタグの欠点は、部位特異的変異誘発に基づく方法と似ている。ポリペプチドタグの挿入部位をスクリーニングする必要があり、通常、ポリペプチドタグの利用可能な部位は限りがある。さらに、この戦略を使用する場合、タグ付き抗体の発現力価も難しい点である。

抗体コンジュゲートを生成する最も直接的な方法は、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドに天然システインのチオール基を使用することである。強力な求核試薬として、チオール基は水相で迅速かつ効果的にコンジュゲーション反応を行うことができる。ＦＤＡによって承認されたＡＤＣ薬ＡｄｃｅｔｒｉｓとＰｏｌｉｖｙでは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、システイン残基のチオール基と、ＭＭＡＥのリンカーに使用されるマレイミド基との反応による鎖間ジスルフィド結合の部分的還元によって生成されたシステイン残基にコンジュゲーションする。ここでは、薬物の疎水性と、すべてのシステイン残基が薬物に接続されている場合の立体障害により、ＡＤＣ薬物が血漿中で不安定になる可能性があるため、完全な還元ではなく、部分的な還元が好まれる。ただし、部分的に還元された生成物の均質性が劣る。報告によると、ＡＤＣの薬物－抗体比（ＤＡＲ）が４の場合、ＡＤＣはインビボで最高の治療指数を有するため、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体は部分的還元後に平均で４つの遊離チオール基を有することが好ましい。

ジスルフィド結合構造に関して、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の間には多くの類似点と相違点がある。治療用生物製剤として最も一般的に使用されているＩｇＧ１とＩｇＧ４を例にとると、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の２つの重鎖は２つのジスルフィド結合で接続され、合計１２個の鎖内ジスルフィド結合がある；一方、ＩｇＧ１の軽鎖は、軽鎖の最後の残基と重鎖の５番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して重鎖に接続され、ＩｇＧ４の軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基と重鎖の３番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して重鎖に接続される（図１を参照）。一般に、鎖内ジスルフィド結合と鎖間ジスルフィド結合の溶媒曝露レベルは異なる。鎖内ジスルフィド結合は、各ドメインの二次構造の間に埋め込まれ、溶媒に曝露されない。ヒンジ領域に位置する鎖間ジスルフィド結合（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の重鎖－重鎖間ジスルフィド結合およびＩｇＧ１の重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合を含む）は、溶媒に高度に曝露される。ＩｇＧ４の重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合は、比較的アクセスしにくいＶＨとＣＨ１ドメインの界面の間に位置するため、溶媒との接触度は高くない。曝露されたシステイン残基は、曝露されていないシステイン残基よりも反応性が高いと考えられているため、異なるジスルフィド結合間の溶媒曝露の違いは、抗体の生物学的コンジュゲーションにとって非常に重要である（ＨｏｎｇｃｈｅｎｇＬｉｕとＫｉｍｂｅｒｌｙＭａｙ、「ＩｇＧ分子のジスルフィド結合構造：構造変化、化学修飾、および安定性と生物学的機能への影響の可能性（ＤｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＩｇＧｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，ｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄｐｏｓｓｉｂｌｅｉｍｐａｃｔｓｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ｍａｂｓ，２０１２，４（１）：１７－２３）。実験により、ＩｇＧ１の重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と重鎖－重鎖間ジスルフィド結合は両方とも非常に反応性が高いことが示される。

ヒンジ領域は、抗体ＦａｂとＦｃの間の柔軟なリンカーである。ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の間で、ヒンジ領域の長さと柔軟性は大きく異なる。たとえば、治療用生物製剤として最も一般的に使用されているＩｇＧ１とＩｇＧ４を例として、ＩｇＧ１のヒンジ領域は１５個アミノ酸で非常に柔軟性があるが、ＩｇＧ４のヒンジ領域は短く１２個アミノ酸しかない（「ＩｇＧのサブクラスとアロタイプ：構造からエフェクター機能まで（ＩｇＧＳｕｂｃｌａｓｓｅｓａｎｄＡｌｌｏｔｙｐｅｓｆｒｏｍＳｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏＥｆｆｅｃｔｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎｓ）」，ＧｅｓｔｕｒＶｉｄａｒｓｓｏｎら，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４年１０月２０日，５：５２０）。野生型ＩｇＧ１とＩｇＧ４は、コアヒンジ領域（ＥＵ番号２２６－２２９）で１つのアミノ酸が異なる：ＩｇＧ１ではＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓで、ＩｇＧ４ではＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓである。天然のＩｇＧ４は、コアヒンジ領域では鎖間システインジスルフィド結合と鎖内システインジスルフィド結合のバランスが取れているため、重鎖アームの交換と、分泌後のＩｇＧ４半抗体分子の存在が見られる。ＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ変異は、自然アームの交換を防ぐことにより、ＩｇＧ４の重鎖間の共有結合相互作用を著しいく安定化できることが確認されたので（Ｓ．Ａｎｇａｌら、「単一のアミノ酸置換により、キメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の不均質性が排除される（Ａｓｉｎｇｌｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｂｏｌｉｓｈｅｓｔｈｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ（ＩｇＧ４）ａｎｔｉｂｏｄｙ）」，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１）：１０５－１０８；Ｊｏｈｎ－ＰａｕｌＳｉｌｖａら、「生理学的マトリックスの調製と組み合わせた新しい定量的イムノアッセイは、Ｓ２２８Ｐ変異がｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏでのＩｇＧ４Ｆａｂアームの交換を防ぐことができることを証明する（ＴｈｅＳ２２８ＰＭｕｔａｔｉｏｎＰｒｅｖｅｎｔｓｉｎＶｉｖｏａｎｄｉｎＶｉｔｒｏＩｇＧ４Ｆａｂ－ａｒｍＥｘｃｈａｎｇｅａｓＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｕｓｉｎｇａＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮｏｖｅｌＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｔｒｉｘＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，２９０（９）：５４６２－５４６９）、ＩｇＧ４抗体の開発と製造に広く使用される。Ｓ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４ヒンジでポリプロリンヘリックス（下部ヒンジ領域の５つのＰｒｏ）を形成し、それとＩｇＧ４ヒンジの比較的に短い長さとの組み合わせにより、ＩｇＧ１ヒンジ（下部ヒンジ領域の３つのＰｒｏ）と比較して柔軟性がさらに制限される。柔軟なヒンジフラグメントにあるシステイン残基は、堅いヒンジにあるシステイン残基よりも反応性が高いと考えられているため、異なるヒンジ間の柔軟性の違いは、抗体の生物学的コンジュゲーションにとって非常に重要である。実験により、Ｓ２２８ＰＩｇＧ４の重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と重鎖－重鎖間ジスルフィド結合は両方とも非常に反応性が弱いことが示される。

抗体コンジュゲーションに天然システインを使用することの欠点は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の４つの鎖間ジスルフィド結合間の反応性が類似し、非常に不均質なコンジュゲーション生成物をもたらすことである。先に述べたように、この不均質性は、コンジュゲート薬物の臨床応用のための治療ウィンドウを狭める。例えば、ＩｇＧ１抗体の天然の鎖間ジスルフィド結合の部分的還元によって生成されたＡＤＣは、正規分布の生成物混合物を生成する。最高の治療指数を持つタイプ（つまり、コンジュゲーション度が４であるタイプ（ＰＡＲ４））は、混合物全体のわずか４０％を占める。コンジュゲーション度が低いタイプ（ＰＡＲ０およびＰＡＲ２）は治療効果がないが、コンジュゲーション度が高いタイプ（ＰＡＲ６およびＰＡＲ８）は高い毒性と不安定性を示している（ＫｅｖｉｎＪ．Ｈａｍｂｌｅｔｔら、「モノクローナル抗体コンジュゲートの抗腫瘍活性に対する薬物負荷の影響（ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤｒｕｇＬｏａｄｉｎｇｏｎｔｈｅＡｎｔｉｔｕｍｏｒＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆａＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅ）」，ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１０（２０）：７０６３－７０７０；ＹｉｌｍａＴ．Ａｄｅｍら、「オーリスタチン抗体の薬物コンジュゲーションの物理的不安定性と薬物負荷の影響（ＡｕｒｉｓｔａｔｉｎＡｎｔｉｂｏｄｙＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅＰｈｙｓｉｃａｌＩｎｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅＲｏｌｅｏｆＤｒｕｇＰａｙｌｏａｄ）」，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，２０１４，２５（４）：６５６－６６４）。ＩｇＧ４抗体の部分的に還元された生成物の不均質性はさらに高く、完全に還元された抗体のレベルがすでに高い場合でも、還元されていない抗体がまだたくさん残る（図１）。

したがって、上記の欠点のいくつかまたはすべてを可能な限り排除するために、特に治療用途のために、抗体バイオコンジュゲーションのＰＡＲを改善する必要が依然としてある。

発明の内容
本明細書が、コンジュゲーションのためのポリペプチド複合体及びその応用を提供する。

第一の様態では、本明細書が、ポリペプチド複合体を提供し、上記のポリペプチド複合体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、ただし、上記のＦａｂドメイン又はその部分と、上記のヒンジ領域又はその部分は、異なるＩｇＧアイソタイプ又はその部分から由来する。

ある実施形態において、ポリペプチド複合体は、免疫グロブリンであり、又は免疫グロブリンを含む。ある実施形態において、ポリペプチド複合体は、抗体であり、又は抗体を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒンジ領域又はその部分である。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のヒンジ領域又はその部分である。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域又はその部分である。ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ＩｇＧ１アイソタイプであるが、Ｆａｂドメインは、ＩｇＧ４アイソタイプである。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示された配列又はそのフラグメント；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、一つ又は複数の突然変異を有し、上記の突然変異は、挿入、欠失と置換から選ばれ、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）又はＥＰＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に示された配列；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、一つ又は複数の突然変異を有し、上記の突然変異は、挿入、欠失と置換から選ばれ、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２～１４のいずれか一つに示された配列又はそのフラグメント；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、一つ又は複数の突然変異を有し、上記の突然変異は、挿入、欠失と置換から選ばれ、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域又はその部分である。ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、ＩｇＧ４アイソタイプであるが、Ｆａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプである。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＥＰＫＳＣＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）に示された配列又はそのフラグメント；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、一つ又は複数の突然変異を有し、上記の突然変異は、挿入、欠失と置換から選ばれ、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）又はＥＰＫＳＣＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．６）又はＥＰＫＳＣＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）又はＥＰＫＣＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１１）に示された配列；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、挿入、欠失と置換から選ばれる一つ又は複数の突然変異を有し、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）又はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．９）又はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１０）に示された配列；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、挿入、欠失と置換から選ばれる一つ又は複数の突然変異を有し、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

ある実施形態において、ヒンジ領域又はその部分は、以下を含む：（ａ）：ＳＥＱＩＤＮＯ：１５～１７のいずれか一つに示された配列又はそのフラグメント；又は（ｂ）：（ａ）と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）のバリアント、上記のバリアントは、一つ又は複数の突然変異を有し、上記の突然変異は、挿入、欠失と置換から選ばれ、又は上記のバリアントは、一つ又は複数の非天然アミノ酸残基を含む。

もう一つの様態では、本明細書は、さらに、ヒンジ領域と作動可能に連結されるＦｃポリペプチドをさらに含有するポリペプチド複合体、又は、ヒンジ領域と作動可能に連結される他のポリペプチドをさらに含有するポリペプチド複合体を含む。

ある実施形態において、上記のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである。

ある実施形態において、Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドである。

もう一つの関連する様態では、本明細書は、抗体薬物コンジュゲートを含み、ただし、本明細書に記載されたポリペプチド複合体を含む。

一つの関連する様態では、本明細書は、薬物組成物を含み、ただし、本明細書に記載された薬物抗体コンジュゲートと薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。

もう一つの関連する様態では、本明細書は、キットを含み、ただし、本明細書に記載されたポリペプチド複合体、又は本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲート、又は本明細書に記載された薬物組成物を含む。このようなキットは、科学研究の目的で、または治療薬剤や診断薬剤として、あるいは予防的治療薬剤として使用できる。

もう一つの様態では、本明細書は、本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲートを調製する方法を含み、当該方法は、以下を含む：
本明細書に記載されたポリペプチド複合体のいずれか一つを提供する；
マレイミド基又はハロアセチル基部分は、鎖間ジスルフィド結合の還元によって生成されたシステイン残基の遊離チオール基とマイケル付加反応（Ｍｉｃｈａｅｌａｄｄｉｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う。

ある実施形態において、遊離チオール基は、ＴＣＥＰやＤＴＴなどのマイルドな還元剤で、鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元することによって生成される；好ましいのは、上記の部分的還元反応は、ｐＨ約４．０～８．０のバッファーで行い、還元剤（例えばＴＣＥＰ）／ｍＡｂの比は、約３～１０であり、反応温度は、約４℃～３７℃であり、反応時間は、約１～２４時間である。

ある実施形態において、ＴＣＥＰやＤＴＴなどのマイルドな還元剤を使用し、鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、遊離チオール基を生成することができる。ある実施形態において、部分的還元は、ｐＨ約４．０～８．０（例えばｐＨ５．０～７．０、ｐＨ５．０～６．０、ｐＨ５．５又はｐＨ６．０）のバッファーで行い、還元剤／ｍＡｂの比は、約１～２０、１～１５、１～１０、１～５、３～２０、３～１６、３～６又は４～８であり、反応温度は、約４ ℃～３７ ℃、４ ℃～２０ ℃、４ ℃～１５ ℃、４ ℃～１０ ℃又は１５ ℃～３７ ℃であり、及び／又は、還元時間は、約１時間～２４時間、２～１６時間、２～５時間又は３～５時間である。

ある実施形態において、部分的還元の温度は、約１５ ℃～３７ ℃であり、及び／又は還元剤／ｍＡｂの比は、約３～６であり、ただし、ポリペプチド複合体は、ＩｇＧ１のヒンジ領域又はＩｇＧ４のヒンジ領域から由来するヒンジ領域又はその部分を有し、且つ任意的に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドをさらに有する。ある実施形態において、ポリペプチド複合体のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～３と１２～１４のいずれか一つに示された配列を有する。ある実施形態において、ポリペプチド複合体のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５～１７のいずれか一つに示された配列を有する。

ある実施形態において、部分的還元の温度は、約４ ℃～２５ ℃、好ましいのは、約４ ℃～２０ ℃、４ ℃～１５ ℃又は４ ℃～１０ ℃であり、及び／又は還元剤／ｍＡｂの比は、約１～２０、好ましいのは約１～１５、３～１６、３～８、１～６又は３～５であり、ただし、ポリペプチド複合体は、後に記載された構造式ＩＩを有するヒンジ領域から由来するヒンジ領域又はその部分を有し、且つ任意的に、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドをさらに有する。ある実施形態において、ポリペプチド複合体のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４～１１のいずれか一つに示された配列を有する。

ある実施形態において、コンジュゲーション反応は、ｐＨ約４．０～８．０のバッファーで行い、有機添加剤（例えば有機溶媒又は有機共溶媒）が、約０．０％～２０．０％（重量百分率）を占め、薬物／ｍＡｂの比は、約７～２０であり、反応温度は、約４ ℃～３７ ℃であり、反応時間は、約１～４時間である。

もう一つの様態では、本明細書は、抗体薬物コンジュゲートの製造における上記のポリペプチド複合体の応用を含む。

もう一つの様態では、本明細書は、必要が有る対象の疾患を治療する方法を含み、ただし、上記の対象へ治療有効量の本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、特定の好ましい実施形態を示唆しているが、それらは単に例示のための例であることを理解され、当業者は、詳細な説明を読むことにより、本発明の構想および範囲内で様々な修正を容易に得られる。

以下の図面は明細書の一部であり、本明細書の特定の面をさらに説明するために、ここに含まれる。本発明は、特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによって、よりよく理解することができる。

図１は、ＩｇＧ１とＩｇＧ４の構造、およびＩｇＧ１とＩｇＧ４抗体の部分的還元と遊離チオール基とＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥのコンジュゲーション反応によって得られた抗体薬物コンジュゲートのＨＩＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。図２は、抗体８８６－５の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果を示す。ヒンジ領域の工学的改変により、ＩｇＧ４に基づく当該抗体で調製されたＡＤＣの均質性が大幅に改善した。図３は、抗体８８６－８の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果を示す。ヒンジ領域の工学的改変と、ＩｇＧ１－ＦａｂとＩｇＧ４－Ｆｃを組み合わせることにより、当該抗体で調製されたＡＤＣの均質性が大幅に改善した。図４は、抗体８８６－１３の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果を示す。ヒンジ領域の工学的改変により、ＩｇＧ１に基づく当該抗体で調製されたＡＤＣの均質性が大幅に改善した。図５は、抗体８８６－２９の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果を示す。ヒンジ領域の工学的改変により、ＩｇＧ４に基づく当該抗体で調製されたＡＤＣの均質性が大幅に改善した。図６は、抗体８８６－３４の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣの結果を示す。ヒンジ領域の工学的改変により、当該抗体で調製されたＡＤＣの均質性が大幅に改善した。図７は、抗体８８６－１６の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－１６－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－１６－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。図８は、抗体８８６－１９の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－１９－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－１９－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。

図９は、抗体８８６－１７の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－１７－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－１７－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。図１０は、抗体８８６－２０の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－２０－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－２０－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。図１１は、抗体８８６－１８の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－１８－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－１８－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。図１２は、抗体８８６－２１の構造と、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥとのコンジュゲーション後のＨＩＣ－ＨＰＬＣとＰＬＲＰ－ＨＰＬＣの結果を示す。８８６－２１－ＭＭＡＥの特徴に対する特定は、８８６－２１－ＭＭＡＥがｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究で使用できることを示した。図１３は、ＨＣＣ１９５４細胞、ＨＣＣ８２７細胞、およびＲａｊｉ細胞に対するＭＭＡＥ結合ＡＤＣの細胞毒性を示した。各ＡＤＣのＩＣ５０値は、ＭＭＡＥと結合した各ＡＤＣが細胞増殖に対して強力な阻害効果を持つことを示した。図１４は、ラットにおける８８６－１６－ＭＭＡＥと８８６－１９－ＭＭＡＥおよびトラスツズマブ－ＭＭＡＥの薬物動態特性の比較を示した。破線と実線は、それぞれ血漿中の総抗体とコンジュゲート抗体（ＡＤＣ）のクリアランス率を示した。

定義
本明細書中、例えば「一つ（１個）／中」、「当該／上記」などは、一つ又は複数以上（即、少なくとも一つ）の文法的オブジェクトを表す。例えば、「１つまたは一種のポリペプチド複合体」は、１つまたは一種のポリペプチド複合体、または１つまたは一種を超えるポリペプチド複合体を意味する。

本明細書では、「約」または「ほぼ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、目盛り、サイズ、量、重量、または長さに対して、その量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、目盛り、サイズ、量、重量、または長さの差は、最大３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％であることを指す。以下の特定の実施形態において、値の前の「約」または「ほぼ」は、値がプラスマイナス１５％、１０％、５％または１％であることを意味する。

本明細書で使用される場合、「例示的」という用語は、「例、実例、または例示として」ことを意味する。本明細書で「例示的」と記載されている内容は、必ずしも他の内容よりも好ましいまたは有利であることを意味するものではない。

本明細書全体を通して、文脈上必要とされない限り、「含む」、「含有する」、「有する」という用語は、ステップまたは要素またはステップグループまたは要素グループが含まれていることを示すが、他のステップまたは要素またはステップグループまたは要素グループを除外しないことを意味すると理解されるべきである。「からなる」とは、「からなる」に記載されている内容を含み、これに限定されることを意味する。したがって、「からなる」とは、挙げられた要素が必須であり、他の要素が存在しないことを意味する。「実質的にからなる」とは、フレーズに挙げられた要素を含むこと上に、挙げられた要素の活性または効果を妨害または寄与しない他の要素も含むことを意味する。したがって、「実質的にからなる」という表現は、挙げられた要素が必須であり、他の要素は任意的なものであることを意味し、他の要素が存在できるかどうかは、挙げられた要素の活性または機能に実質的に影響するかどうかによって異なる。

「実施形態の１つ」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある（一部の）実施形態」、「他の実施形態」、または「別の実施形態」或いはそれらの組み合わせは、記載された実施形態に関連する特定の特徴、構造、または特性が、本明細書に記載の実施形態の少なくとも１つに含まれることを意味する。したがって、本明細書の異なる場所に現れる上記の用語は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方式で組み合わせることができる。

本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク（質）」という用語は交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー及び天然アミノ酸ポリマーと非天然アミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において、「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に作用するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、並びにヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、Ｏ－ホスホセリンなどの後で修飾されたアミノ酸である。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を持つ化合物を指し、当該基本的な化学構造は、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホン、メチオニンメチルスルホニウムなど、水素、カルボキシル、アミノ、およびＲ基と結合したアルファ炭素である。これらの類似体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）または修飾されたペプチド骨格を持っていますが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保留する。アルファ炭素とは、カルボニル基などの官能基に結合した１番目の炭素原子を指す。ベータ炭素とは、アルファ炭素に接続された２番目の炭素原子を指し、当該システムでは、ギリシャ文字のアルファベット順に、引き続いて、炭素に名前を付ける。アミノ酸模倣物とは、その構造がアミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、その作用機序が天然アミノ酸のそれと類似している化合物を指す。「タンパク質」は、一般に、より大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」は、一般に、より短いポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド配列の左端はアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）と呼ばれ、ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端（Ｃ末端）と呼ばれる。本明細書において、「ポリペプチド複合体」とは、特定の機能を実行するために互いに組み合わされた１つまたは複数のポリペプチドを含む複合体を指す。ある実施形態において、ポリペプチドは、免疫関連ポリペプチドである。

本明細書において、「抗体」という用語は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性（二価）抗体を含む。天然の全抗体には、２本の重鎖と２本の軽鎖が含まれる。各重鎖は、可変領域（「ＨＣＶＲ」）および第１、第２、および第３の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなり、各軽鎖は、可変領域（「ＬＣＶＲ」）と定常領域（ＣＬ）からなる。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμに分類され、哺乳類の軽鎖は、λまたはκに分類される。抗体は「Ｙ」字型であり、Ｙのトランク部分は、ジスルフィド結合を介して互いに結合している２本の重鎖の第２と第３の定常領域からなる。Ｙのアームは、それぞれ、一つの軽鎖の可変領域および定常領域と結合する一つの重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。二つの鎖の可変領域には、通常に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（軽（Ｌ）鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む）と呼ばれる３つの高度に可変なループが含まれる。抗体のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの合意に従って定義または認識できる（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ５；１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．とＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；ＫａｂａｔＥ．Ａ．ら，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる隣接配列の間に挿入され、フレームワーク領域は、ＣＤＲと比較して高度に保存され、超可変ループをサポートするブラケットを形成する。各ＶＨとＶＬは、通常に、三つのＣＤＲと四つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並べる。重鎖と軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示している。抗体は、抗体重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて分類される。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμの重鎖を持つことを特徴とする。抗体のいくつかの主要なクラスは、さらに、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分類される。したがって、本発明において、「ＩｇＧ１」または「ＩｇＧ１アイソタイプ」などの特定のＩｇＧアイソタイプは、指定されたサブクラスに属するＩｇＧアイソタイプを意味し、異なるＩｇＧアイソタイプは、異なるサブクラスのＩｇＧアイソタイプを意味する。

本明細書において、抗体の「可変ドメイン」とは、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体可変領域又はそのフラグメントを指す。可変ドメインは、完全な可変領域（例えば、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲ）を含んでも良いが、それはまた、不完全な可変領域を含みつつ、抗原に結合するか、または抗原結合部位を形成する能力を保持することができる。

本明細書において、「抗原結合部分」という用語は、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体部分から形成される抗体フラグメント、または抗原に結合するが完全な天然抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントを指す。抗原結合部分の例として、可変ドメイン、可変領域、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、多重特異性抗体、ラキャメル化された単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合部分は、親抗体と同じ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗原結合部分は、特定のヒト抗体から由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み、１つまたは複数の非ヒト抗体から由来するフレームワーク領域とグラフトしても良い。抗原結合部分のより具体的な形態については、Ｓｐｉｅｓｓら、２０１５（上と同じ）およびＢｒｉｎｋｍａｎら、ｍＡｂｓ、９（２）、ページ１８２－２１２（２０１７）を参照されてもよく、これらの全体が、本明細書に組み込まれる。

「Ｆａｂ」とは、免疫グロブリン（抗体など）では、軽鎖（可変領域および定常領域）を、ジスルフィド結合を介して、重鎖の可変領域および第１の定常領域と組み合わせることによって形成される部分を指す。いくつかの実施形態において、軽鎖および重鎖の定常領域は、両方ともＴＣＲ定常領域によって置き換えられる。Ｆａｂ部分は、抗原結合に関与する。

「Ｆａｂ’」は、可変領域（ＶＨ）および第１の定常領域（ＣＨ１）からなる重鎖部分と共有結合する抗体の軽鎖を含むフラグメントと一部のヒンジ領域を指す。

「Ｆｃ」とは、免疫グロブリン（例えば抗体）における、第１の重鎖の第２（ＣＨ２）と第３（ＣＨ３）（又は、さらに第４（ＣＨ４、例えば、ＩｇＭの場合））の定常領域と、第２の重鎖の第２と第３（又は、さらに第４）の定常領域と結合してなる部分を指し、又は、免疫グロブリン（例えば、抗体）における、第１の重鎖の一部のヒンジ領域、第２（ＣＨ２）と第３（ＣＨ３）（又は、さらに第４（ＣＨ４、例えば、ＩｇＭの場合））の定常領域と、第２の重鎖の一部のヒンジ領域、第２と第３（又は、さらに第４）の定常領域と結合してなる部分を指す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣやＣＤＣなどのさまざまなエフェクター機能に関与するが、抗原結合には関与しない。

本明細書において、抗体の「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを接続する重鎖分子部分を含む。ヒンジ領域は、約１２～６２個のアミノ酸を含み、かつ柔軟性があるため、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にできる。

本明細書において、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来の番号付けスキームによれば、ＩｇＧ抗体の約２４４位のアミノ酸から３６０位のアミノ酸まで（アミノ酸２４４～３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；アミノ酸２３１～３４０、ＥＵナンバリングシステム；ＫａｂａｔＥＡなど、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ）（１９８３）を参照）の重鎖分子部分を含む。

「ＣＨ３ドメイン」は、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで伸び、約１０８個のアミノ酸を含む。ＩｇＭなどの特定のクラスの免疫グロブリンには、さらにＣＨ４領域がある。

抗体の「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を持つ最小の抗体フラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、単一の重鎖の可変ドメインと単一の軽鎖の可変ドメインを組み合わせてなるものである。ｄｓＦｖを含む多くのＦｖデザインがあり、ただし、２つのドメイン間の結合は、ジスルフィド結合を導入することによって強化される；ペプチドリンカーの使用で、２つのドメインを単一のポリペプチドに結合し、ｓｃＦｖを形成することができる。対応する免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域および定常領域に関連する重または軽免疫グロブリン鎖可変領域を含むＦｖｓ構築物が作製された。さらに、Ｆｖは、すでに、ダイアボディとトリボディに多量体化された（Ｍａｙｎａｒｄら、ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｍｅｄＥｎｇ２３３９－３７６（２０００））。

アミノ酸配列（または核酸配列）の「パーセント（％）配列同一性」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して同一のアミノ酸（または核酸）の数を最大化した後に、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一の残基と見なされる場合と見なされない場合がある。アミノ酸（または核酸）配列同一性のパーセンテージを決定するアラインメントのために、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴｐ（国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで得られる）などの公的に利用可能なツールを使用することができる；或いは、ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３-４１０（１９９０）；ＳｔｅｐｈｅｎＦ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７））、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトで得られる）、ＨｉｇｇｉｎｓＤＧら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３－４０２（１９９６）；ＬａｒｋｉｎＭＡら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（イギリス、オックスフォード），２３（２１）：２９４７－８（２００７））、及びＡＬＩＧＮやＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアがある。当業者は、ツールのデフォルトパラメータを使用することができ、または適切なアルゴリズムを選択することによってアラインメントに適したパラメータを選定することができる。

本明細書において、「抗原」または「Ａｇ」とは、細胞培養物または動物を刺激し、抗体またはＴ細胞応答を生成させることができる化合物、組成物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または物質（細胞培養物（例えばハイブリドーマ）に添加される組成物、または動物に注射または吸収される組成物（例えば癌特異的タンパク質を含む組成物）を含む）を指す。抗原は、異種抗原によって誘導される産物を含む特定の体液性または細胞性免疫産物（例えば抗体）と反応する。

「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤（例えば、抗体）が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続アミノ酸（線形エピトープまたは連続エピトープとも呼ばれ）によって形成されるか、タンパク質の三次折り畳みに並置された非連続アミノ酸（コンフォメーションエピトープまたは配座エピトープとも呼ばれ）によって形成される。連続アミノ酸によって形成されるエピトープは、通常に、タンパク質の一次アミノ酸残基に沿って線形的に配置され、これらの連続アミノ酸の小さなフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原から消化されるか、変性溶媒に曝露されたときに保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、通常に、変性溶媒処理のために失われる。エピトープは、通常に、少なくとも３個、より通常は少なくとも５個、約７個、または約８～１０個の、独特の空間的コンフォメーションを示すアミノ酸を含む。

ここで、「特異的結合」という用語は、抗体と抗原の間など、２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。特定の実施形態において、抗原に特異的に結合する本明細書のポリペプチド複合体および二重特異性ポリペプチド複合体の結合親和性（ＫＤ）は、≦１０^－６Ｍ（例えば、≦５ｘ１０^－７Ｍ、≦２ｘ１０^－７Ｍ、≦１０^－７Ｍ、≦５ｘ１０^－８Ｍ、≦２ｘ１０^－８Ｍ、≦１０^－８Ｍ、≦５ｘ１０^－９Ｍ、≦２ｘ１０^－９Ｍ、≦１０^－９Ｍまたは≦１０^－１０Ｍ）である。本明細書において、ＫＤは、結合速度に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器で、表面プラズモン共鳴法によって測定することができる。

本明細書において、「作動可能に連結」または「作動可能に連結された」という用語は、スペーサーまたはリンカーの有無にかかわらず、それぞれが所望の方式で生物学的に機能することを可能にする関係にあるような、２つ以上の標的生物学的配列の並置を指す。ポリペプチドで使用される場合、ポリペプチド配列が、連結された生成物が所望の生物学的機能を有することを可能にする方式で連結されることを意味する。例えば、抗体可変領域は、定常領域に作動可能に連結されて、抗原結合活性を有する安定な生成物を提供することができる。この用語は、ポリヌクレオチドにも使用できる。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが制御配列（プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結されている場合、それは、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドのポリペプチド発現の調節を可能にする方式で連結されることを指す。

ヒンジ領域は、免疫グロブリンＣＨ１のＣ末端とＣＨ２ドメインのＮ末端を接続する連続したアミノ酸残基の領域である。ヒトＩｇＧ１では、ＥＵの番号付けに従って、ヒンジ領域は、残基２１６から２３０までである。ヒトＩｇＧ４では、ＥＵの番号付けに従って、ヒンジ領域は、残基２１９から２３０までである。

本明細書において、アミノ酸残基の「置換」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質には、天然に存在するかまたは誘導される１つまたは複数のアミノ酸から別の一つまたは複数のアミノ酸への置換を指す。ポリペプチド内の置換は、ポリペプチドの機能を弱める、増強する、または排除する可能性がある。

アミノ酸配列の置換はまた、「保存的置換」であっても良く、これは、側鎖に類似の物理的および化学的特性を有する異なるアミノ酸残基で置換すること、またはポリペプチドの活性に重要ではないアミノ酸を置換することを指す。例えば、非極性側鎖を有するアミノ酸残基同士（例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕａｎｄＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）間、極性無電荷側鎖を有する残基同士（例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ）間、酸性側鎖を有する残基同士（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）間、塩基性側鎖を有するアミノ酸同士（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）間、β分岐側鎖を有するアミノ酸同士（例えばＴｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）間、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸同士（例えばＣｙｓとＭｅｔ）間、または芳香族側鎖を有する残基同士（例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ）間で、保存的な置換を行うことができる。特定の実施形態において、置換、欠失または付加はまた、「保存的置換」と見なされ得る。挿入または欠失のアミノ酸の数は、約１から５の範囲であっても良い。保存的置換は、通常に、タンパク質のコンフォメーション構造に有意な変化を引き起こさないため、タンパク質の生物学的活性を維持することができる。

本明細書において、アミノ酸残基の「突然変異」は、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失または付加を指す。

本明細書において、「相同配列」とは、選択的にアラインメントされたときに、別の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有するポリヌクレオチド配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。

本明細書において、「対象」または「個体」または「動物」または「患者」という用語は、疾患または障害の診断、予後、改善、予防および／または治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物を指し、哺乳類または霊長類を含む。哺乳類の対象には、人間、家畜および動物園の動物、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、豚、牛、熊などのスポーツ動物またはペットが含まれる。

具体的な実施形態
以下の説明は、本明細書の様々な実施形態を単に例示するものである。したがって、ここで検討された特定の修正、変更などは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく様々な同等の形態、変更および修正が得られることは明らかであり、そのような同等の実施はすべて本開示の範囲に含まれることを理解されたい。出版物、特許および特許出願を含む、本明細書で引用されているすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書が、ポリペプチド複合体を提供し、上記のポリペプチド複合体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、ただし、上記のＦａｂドメイン又はその部分と、上記のヒンジ領域又はその部分は、異なるＩｇＧアイソタイプ又はその部分から由来する。本発明者らは、当該異なりが、鎖間ジスルフィド結合への還元剤のアクセス可能性に違いを引き起こし、上記ポリペプチド複合体のバイオコンジュゲーション反応における薬物負荷（ペイロード）－抗体の比（ＰＡＲ）を改善したことを予期せず発見した。したがって、ＡＤＣを調製するおよび／または組み込むために使用される場合、本明細書に記載されたポリペプチド複合体は、生成物の均質性、特にＰＡＲが４の生成物の豊富化を、著しく改善する。他方、本明細書に記載されたポリペプチド複合体は、より良好な薬物動態学的および／または薬力学的特性を有することも見出された。

ポリペプチド複合体
本明細書が、新たなポリペプチド複合体を提供し、上記のポリペプチド複合体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、ただし、上記のＦａｂドメイン又はその部分と、上記のヒンジ領域又はその部分は、異なるＩｇＧアイソタイプ又はその部分から由来する。

実施形態の一つには、ポリペプチド複合体又はその部分は、少なくとも二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、二つの重鎖が、ヒンジ領域における二つのジスルフィド結合を介して連結する。ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒンジ領域又はその部分である。

実施形態の一つには、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４免疫グロブリンのＦａｂＣ末端のヒンジ領域またはその一部を自然構造の位置で交換することにより、このような異なりが、鎖間ジスルフィド結合への還元剤のアクセス可能性に違いを引き起こすため、バイオコンジュゲーション反応における薬物負荷－抗体の比（ＰＡＲ）を改善する。本明細書のポリペプチド複合体および構築物のさらなる利点は、後で見られる。

本発明において、上記のＦａｂドメインは、任意の抗体、特に臨床的に重要な抗体から由来することができる。いくつかの実施形態において、上記のＦａｂドメインは、腫瘍抗原（ＴＡ）（例えば腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））に特異的に結合する抗体から由来する。ただし、腫瘍抗原の例として、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３；ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＢＣＭＡ；ＰＳＭＡ；ＳＳＴＲ２；ＳＳＴＲ５、ＣＤ１９、ＦＬＴ３、ＣＤ３３、ＰＳＣＡ、ＡＤＡＭ１７、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ－ｖＩＩＩ、ＣＤ３０、ＦＯＬＲ１、ＧＤ－２、ＣＡ－ＩＸ、Ｔｒｏｐ－２、ＣＤ７０、ＣＤ３８、メソセリン、ＥｐｈＡ２、ＣＤ２２、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＲＯＮとＥＲＢＢ２を含むが、これらに限定されない。ＴＡ特異的抗体の例として、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（例えば、後の実施例９と１０に記載された）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（例えば、後の実施例１１と１２に記載された）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（例えば、後の実施例１３と１４に記載された）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）などを含むが、これらに限定されない。

ヒンジ領域
ヒンジ領域は、抗体ＦａｂとＦｃの間の柔軟なリンカーである。ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の間で、ヒンジ領域の長さと柔軟性は大きく異なる。たとえば、治療用生物製剤として最も一般的に使用されているＩｇＧ１とＩｇＧ４を例として、ＩｇＧ１のヒンジ領域は１５個アミノ酸（例えばＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８））で非常に柔軟性があるが、ＩｇＧ４のヒンジ領域は短く１２個アミノ酸しかない（「ＩｇＧのサブクラスとアロタイプ：構造からエフェクター機能まで（ＩｇＧＳｕｂｃｌａｓｓｅｓａｎｄＡｌｌｏｔｙｐｅｓｆｒｏｍＳｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏＥｆｆｅｃｔｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎｓ）」，ＧｅｓｔｕｒＶｉｄａｒｓｓｏｎら，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４年１０月２０日，５：５２０）。野生型ＩｇＧ１とＩｇＧ４は、コアヒンジ領域（ＥＵ番号２２６－２２９）で１つのアミノ酸が異なる：ＩｇＧ１ではＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓで、ＩｇＧ４ではＣｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓである。天然のＩｇＧ４は、コアヒンジ領域では鎖間システインジスルフィド結合と鎖内システインジスルフィド結合のバランスが取れているため、重鎖アームの交換と、分泌後のＩｇＧ４半抗体分子の存在が見られる。ＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ変異ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）は、自然アームの交換を防ぐことにより、ＩｇＧ４の重鎖間の共有結合相互作用を著しいく安定化できることが確認されたので、ＩｇＧ４抗体の開発と製造に広く使用される。Ｓ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４ヒンジでポリプロリンヘリックス（ＰＰＣＰＰＣＰ）を形成し、それとＩｇＧ４ヒンジの比較的に短い長さとの組み合わせにより、ＩｇＧ１ヒンジと比較して柔軟性がさらに制限される。柔軟なヒンジフラグメントにあるシステイン残基は、堅いヒンジにあるシステイン残基よりも反応性が高いと考えられているため、異なるヒンジ間の柔軟性の違いは、抗体の生物学的コンジュゲーションにとって非常に重要である。実験により、Ｓ２２８ＰＩｇＧ４の重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と重鎖－重鎖間ジスルフィド結合は両方とも非常に反応性が弱いことが示される。

いくつかの実施形態において、Ｆａｂドメインは、ヒンジ領域と作動可能に連結され、ただし、ヒンジ領域又はその部分は、ＩｇＧ１又はその部分から誘導され、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ４から誘導される。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４免疫グロブリンのＦａｂＣ末端のヒンジ領域を、自然構造の位置で交換することにより、このような異なりが、鎖間ジスルフィド結合への還元剤のアクセス可能性に違いを引き起こすため、バイオコンジュゲーション反応における薬物負荷－抗体の比（ＰＡＲ）を改善する。

いくつかの実施形態において、修飾されたヒンジ領域は、以下の構造式（Ｉ）を有する配列を含む：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＣＰＰＣＰ（Ｉ）
ただし、Ｘ_１＝ヌル又はＥ；Ｘ_２＝ヌル又はＰ；Ｘ_３＝ヌル又はＫ；Ｘ_４＝ヌル又はＳ又はＥ；Ｘ_５＝ヌル又はＣ又はＳ、好ましいのはヌル；Ｘ_６＝Ｄ又はＫ；Ｘ_７＝Ｋ又はＹ；Ｘ_８＝Ｔ又はＧ；及び／又は、Ｘ_９Ｘ_１０＝ＨＴ、ＨＰ、ＰＴ又はＰＰ、好ましいのはＰＴ又はＰＰ。

いくつかの実施形態において、修飾されたヒンジ領域は、以下の構造式（ＩＩ）を有する配列を含む：
ＥＰＫｘ_１Ｃｘ_２ｘ_３ｘ_４ｘ_５ｘ_６ｘ_７ｘ_８ＣＰＰＣＰ（ＩＩ）
ただし、ｘ_１＝ヌル又はＳ；ｘ_２＝ヌル又はＥ又はＳ、好ましいのはヌル；ｘ_３＝ヌル又はＳ又はＣ；ｘ_４＝ヌル又はＫ又はＤ；ｘ _５＝Ｙ又はＫ；ｘ_６＝Ｇ又はＴ；及び／又はｘ_７ｘ_８＝ＰＰ、ＰＴ、ＨＰ又はＨＴ。

一つ又は複数の実施形態において、例示的な修飾されたヒンジ領域の配列は、表１に示された。

上記の修飾されたヒンジ領域は、重鎖の定常領域に含まれてもよく、重鎖の定常領域は、通常に、ＣＨ２とＣＨ３ドメインを含み、且つ指定された領域の側面に別のヒンジセグメント（例えば、上部ヒンジなど）と、ＣＨ１領域とを含んでも良い。これらの他の定常領域セグメントは、存在する場合、通常は同じアイソタイプ、好ましくはヒトアイソタイプであるが、異なるアイソタイプのハイブリッドであってもよい。上記の他のヒト定常領域セグメントのアイソタイプは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１であるが、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、またはそれらのハイブリッド、すなわち、異なるアイソタイプのドメインを含んでも良い。

本明細書において、「ヒンジ領域（又はその部分）」と「修飾されたヒンジ領域（又はその部分）」が、本発明のヒンジ領域を指す場合、交換可能に使用されてもよく、両方とも０又は１、２、３、４、５、６、７、８、９と１０箇所の置換、欠失又は内部挿入を有するヒンジ領域を指す。ヒンジ領域が指定されたアイソタイプの野生型と０または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所の置換、欠失、または内部挿入によって異なる場合、ヒンジ領域は指定されたアイソタイプであると見なされる。本明細書において、ヒンジ領域、Ｆａｂ、Ｆｃフラグメント、またはポリペプチド複合体の他の任意のコンポーネントが指定されたアイソタイプに先導される場合（例えば、「ＩｇＧ１ヒンジ領域」）、ヒンジ領域、Ｆａｂ、Ｆｃフラグメント、またはポリペプチド複合体の他のコンポーネントが指定されたアイソタイプに属していることを意味するが、必ずしも野生型であるものではない。

鎖間結合は、ヒンジ領域の一方の単鎖上の１つのアミノ酸残基と、ヒンジ領域のもう一方の単鎖上の別のアミノ酸残基との間に形成される。いくつかの実施形態において、非天然の鎖間結合は、ヒンジ領域の２つの単鎖を二量体に結合することができる任意の結合または相互作用であっても良い。非天然の鎖間結合の適切な例としは、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋または疎水性－親水性相互作用、ＫｉＨ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、またはそれらの組み合わせである。

本明細書において、「二量体」とは、ポリペプチドまたはタンパク質などの２つの分子が、共有結合または非共有相互作用によって形成される会合構造を指す。ホモ二量体またはホモ二量体化は、２つの同じ分子によって形成され、ヘテロ二量体またはヘテロ二量体化は、２つの異なる分子によって形成される。

「ジスルフィド結合」とは、Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ’構造を有する共有結合を指す。システインというアミノ酸が、チオール基を有し、別のチオール基（たとえば、別のシステイン残基のチオール基）と、ジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィド結合は、それぞれ２つのポリペプチド鎖にある２つのシステインのチオール基の間に形成されてもよく、それによって鎖間ブリッジまたは鎖間結合を形成する。

静電相互作用は、非共有相互作用であり、タンパク質の折り畳み、安定性、柔軟性、および機能にとって重要であり、イオン相互作用、水素結合、ハロゲン結合を含む。ポリペプチドの内部は、ＬｙｓとＡｓｐの間、ＬｙｓとＧｌｕの間、ＧｌｕとＡｒｇの間、または一方の鎖のＧｌｕ、Ｔｒｐともう一方の鎖のＡｒｇ、ＶａｌまたはＴｈｒの間などで静電相互作用を形成する。

塩橋は、近距離の静電相互作用であり、主にＡｓｐまたはＧｌｕのアニオン性カルボン酸塩と、Ｌｙｓのカチオン性アンモニウムまたはＡｒｇのグアニジン塩で発生し、天然のタンパク質構造における反対に帯電した残基の近接空間ペアリングである。主に疎水性の界面にある荷電および極性残基は、結合のホットスポットとして機能する可能性がある。その中で、イオン化可能な側鎖を持つ残基（例えばＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ）も塩橋の形成に関与する。

疎水性相互作用は、１つの鎖の１つ又は複数のＶａｌ、ＴｙｒおよびＡｌａと別の鎖の１つ又は複数のＶａｌ、ＬｅｕおよびＴｒｐの間、または１つの鎖のＨｉｓおよびＡｌａと別の鎖のＴｈｒおよびＰｈｅの間で形成できる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，２０１７を参照、上と同じ）。

水素原子が電気陰性度の高い原子（例えば、窒素、酸素、フッ素）と共有結合する場合、２つの極性基間の静電引力が水素結合を形成する。水素結合は、ポリペプチド内の２つの残基の主鎖酸素（例えば、カルコゲングループ）とアミド水素（窒素基）の間に形成され、例えば、Ａｓｎの窒素基とＨｉｓの酸素基、またはＡｓｎの酸素基とＬｙｓの窒素基などがある。水素結合は、ファンデルワールス力よりも強力であるが、共有結合やイオン結合よりも弱く、二次および三次構造を維持するために不可欠である。例えば、アミノ酸残基の間隔が位置ｉとｉ＋４の間で規則的であると、アルファヘリックスは形成されるが、ベータシートは、２つのペプチドが少なくとも２つまたは３つの主鎖水素結合によって接続されてねじれた波形シートを形成するときに、形成される長さが３～１０アミノ酸のペプチドセグメントである。

本明細書において、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」構造は、２つのポリペプチド間の以下のような相互作用を指す：１つのポリペプチドには、大きな側鎖を持つアミノ酸残基（チロシンやトリプトファンなど）が存在するため、突起（すなわち、「ｋｎｏｂ」）があり、もう１つのポリペプチドは、小さな側鎖を持つアミノ酸残基（アラニンまたはスレオニンなど）が位置する空洞（すなわち、「ｈｏｌｅ」）を有し、突起を空洞内に配置することができ、それにより、２つのポリペプチド間の相互作用を促進してヘテロ二量体または複合体を形成する。ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ構造を有するポリペプチドを形成する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているように知られている。

いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の鎖間結合を有する。任意的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の鎖間結合の少なくとも１つは、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩橋または疎水性－親水性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせである。
鎖間ジスルフィド結合の形成は、当技術分野で知られている適切な方法によって測定することができる。例えば、発現されたタンパク質産物の還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを別々に実行し、次に得られたバンドを比較し、鎖間ジスルフィド結合の存在を示す可能な差異を特定することができる。

ある実施形態において、ポリペプチド複合体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗原結合フラグメントＦａｂ、続いてアームの交換を防ぐためにＳ２２８Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４の修飾されたヒンジ領域、続いてＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはそれらの組み合わせ）のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む；ただし、Ｆａｂおよびヒンジ領域におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスの交換は、重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と比較して、重鎖－重鎖間ジスルフィド結合への還元剤の自然なアクセス可能性を変化させ、還元反応および薬物負荷コンジュゲーション反応を、重鎖と軽鎖の間のチオール基で優先的に起こるように誘導する。

一つ又は複数の実施形態において、例示的なヒンジ領域の配列及びその技術効果は、表２に示された。

抗体薬物コンジュゲート
ｉ．抗体
本明細書が、新たな抗体を提供し、上記の抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、ただし、上記のＦａｂドメイン又はその部分と、上記のヒンジ領域又はその部分は、異なるＩｇＧアイソタイプから由来する。抗体は、少なくとも２本の重鎖と２本の軽鎖を含み、２本の重鎖は、ヒンジ領域またはその一部における２つのジスルフィド結合によって接続され、上記のヒンジ領域またはその一部は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒンジ領域またはその一部である。

別の態様では、抗体は、さらに、ヒンジ領域と作動可能に連結されたＦｃポリペプチド、或いはヒンジ領域と作動可能に連結された他のポリペプチドを含む。

ｉｉ．薬物
本発明で使用される薬物（「薬物負荷」とも呼ばれる）は、特に限定されない。本発明で使用される薬物は、細胞毒性薬物、特に癌治療に使用される薬物を含む。これらの薬物は、一般に、ＤＮＡ破壊剤、ＤＮＡ結合剤、代謝拮抗剤、酵素阻害剤（例えば、チミジル酸合成酵素阻害剤やトポイソメラーゼ阻害剤）、チューブリン阻害剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の毒素）を含むが、これらに限定されない。例えば、具体的な例として、タキソール（ｔａｘｏｌ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ）、ジクロルメトトレキサート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、レウロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、レウロシデイン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｅｉｎｅ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ）、マイトマイシンＡ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、タリマイシン（ｔａｌｌｙｓｏｍｙｃｉｎ）、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシンの誘導体（例えばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）またはエトポシドホスフェート（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ））、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎ）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）（タキソール（ｔａｘｏｌ）を含む）、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ）、酪酸、Ｎ８－アセチルスペルミジン（Ｎ８－ａｃｅｔｙｌｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、エンジイン（ｅｎｅ－ｄｉｙｎｅｓ）、デュオカルマイシンＡ（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎＡ）、デュオカルマイシンＳＡ（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎＳＡ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ヘミアステルリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎｓ）、メイタンシノイド（ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４を含む）およびオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎＤ）を含む）。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＥなどのオーリスタチンが好ましい。薬物は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によってリンカーに接続することができる。いくつかの実施形態において、コンジュゲーションに使用される薬物の提供形態は、リンカー－薬物中間体であり、例えば「ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ」である。

ｉｉｉ．リンカー
本発明で使用される薬物は、リンカーを介して抗体に接続することができる。ＡＤＣ用の様々なリンカーは、当技術分野で知られている。本発明で使用できるリンカーは、抗体によって提供されるチオール基と反応することができる部分を有して抗体に接続できる限り、特に限定されない。本発明において特に有用なのは、マレイミドまたはハロアセチル官能化リンカーである。例としては、－ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－（「ＭＣ」：マレイミド－カプロイル；「ｖｃ」：バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）ジペプチド；「ＰＡＢ」：ｐ－アミノベンジル）、－ＭＣ－ｖｃ－、－ＭＣ－、および－ＳＭＣＣ－（スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）を含むが、これらに限定されない。

もう一つの関連する様態では、本明細書は、キットを含み、ただし、本明細書に記載されたポリペプチド複合体、又は本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲート、又は本明細書に記載された薬物組成物を含む。

ある実施形態において、コンジュゲーション反応は、ｐＨ約４．０～８．０のバッファーに行い、有機添加剤（例えば有機溶媒又は有機共溶媒）が、約０．０％～２０．０％（重量百分率）を占め、薬物／ｍＡｂの比は、約７～２０であり、反応温度は、約４ ℃～３７ ℃であり、反応時間は、約１～４時間である。

もう一つの様態では、本明細書は、必要が有る対象の疾患を治療する方法を含み、ただし、上記の対象へ治療有効量の本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む。治療される疾患は、固形腫瘍および造血器悪性腫瘍を含む癌が含まれるが、これらに限定されない。これらの癌の例としては、乳がん、胃がん、肺がん（例えばＮＳＣＬＣ）、頭頸部がん、結腸直腸がん、Ｂ細胞リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））および白血病を含むが、これらに限定されない。

本発明は、少なくとも部分的に、２つの免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域配列の応用に基づく。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４免疫グロブリンのＦａｂＣ末端のヒンジ領域を、自然構造の位置で交換することにより、このような異なりが、鎖間ジスルフィド結合への還元剤のアクセス可能性に違いを引き起こすため、バイオコンジュゲーション反応における薬物負荷－抗体の比（ＰＡＲ）を改善する。

本発明は、工学的改変ヒンジ領域、ＦａｂドメインおよびＦｃドメインで構築された抗体のタイプを記載する。工学的改変ヒンジ領域ペプチドは、２つの重鎖の間に２つのジスルフィド結合を形成するために使用されるシステイン残基を含む天然アミノ酸で構築される。具体的には、ＩｇＧ１とＩｇＧ４のヒンジ領域配列を短縮して組み合わせ、２つのジスルフィド結合を保留する工学的改変抗体ヒンジ領域を得る。当該工学的改変抗体のＦａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプであり、Ｆａｂドメインは任意に突然変異させることができ、上記の突然変異は、システイン突然変異、非天然アミノ酸またはペプチドの伸長または挿入を含むが、これらに限定されない。さらに、Ｆｃドメインは、突然変異の有無にかかわらず、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプにすることができる。

本発明の工学的改変抗体は、マイルドな還元剤で、ジスルフィド結合を還元した後、システイン残基でのバイオコンジュゲーションに使用することができる。工学的改変ペプチドは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の還元特性を変化させ、マイルドな還元剤（ＴＣＥＰやＤＴＴなど）で部分的に還元されると、ジスルフィド結合が選択的に還元される。このように部分的に還元された抗体は、特定の部位に結合した４つのリンカー－薬物負荷を有するコンジュゲートが主な産物になるようにコンジュゲーションに使用される。本発明において、リンカー薬物は、Ｆａｂドメイン、ヒンジ領域およびＦｃドメインの異なる組み合わせに従って、Ｆａｂ領域またはヒンジ領域に付着される。特定の選択された実施形態において、特定の部位に結合した４つのリンカー－薬物負荷を有するコンジュゲートは、産物混合物の９０％以上を占める。

本明細書には、工学的改変抗体をバイオコンジュゲーション反応に適用する方法も説明する。全体的なコンジュゲーション反応は、部分的還元とコンジュゲーションの２つのステップで構成される。還元剤の種類、還元剤／ｍＡｂの比、バッファー組成とｐＨ値、反応温度と時間は、部分的還元と特定の部位の還元に影響する。コンジュゲーション条件は、抗体に接続されるリンカー－薬物負荷の性質によるが、基本的に一般的に使用される従来の条件と同じである。理想的には、有機溶媒は、リンカー－薬物負荷の溶解を助けるために、還元バッファーに、コンジュゲーションするための添加剤として使用される。

一つの様態において、抗原結合免疫グロブリンＧを提供し、それが、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒトＩｇＧ４の抗原結合フラグメントＦａｂ、続いてヒトＩｇＧ１の修飾されたヒンジ領域、続いてＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはそれらの組み合わせ）のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む；ただし、Ｆａｂおよびヒンジ領域におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスの交換は、重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と比較して、重鎖－重鎖間ジスルフィド結合への還元剤の自然なアクセス可能性を変化させ、還元反応および薬物負荷コンジュゲーション反応を、重鎖の間のチオール基で優先的に起こるように誘導する。

もう一つの様態において、抗原結合免疫グロブリンＧを提供し、それが、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒトＩｇＧ１の抗原結合フラグメントＦａｂ、続いてアームの交換を防ぐためにＳ２２８Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４の修飾されたヒンジ領域、続いてＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはそれらの組み合わせ）のＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む定常領域を含む；ただし、Ｆａｂおよびヒンジ領域におけるＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスの交換は、重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合と比較して、重鎖－重鎖間ジスルフィド結合への還元剤の自然なアクセス可能性を変化させ、還元反応および薬物負荷コンジュゲーション反応を、重鎖－軽鎖の間のチオール基で優先的に起こるように誘導する。

一つの実施形態において、交換されたヒンジのＣＨ１とヒンジのリンカーは、上部ヒンジ領域（例えば、ＥＵ番号２１６～２２３）に１、２、または３アミノ酸の欠失を有する。いくつかの具体的な実施形態において、ヒンジ領域フラグメントは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１－１７から選ばれる。

本明細書は、さらに、マレイミド基またはハロアセチル基部分を使用したコンジュゲーション方法を説明し、ただし、マレイミド基又はハロアセチル基部分は、鎖間ジスルフィド結合の還元によって生成されたシステイン残基のチオール基とマイケル付加反応を行うことができる。

いくつかの実施形態において、ＴＣＥＰやＤＴＴなどのマイルドな還元剤を使用し、鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元し、遊離チオール基を生成することができる。ジスルフィド結合の部分的な還元は、ｐＨが約４．０～８．０のバッファー中で行うことができ、還元剤（例えばＴＣＥＰ）／ｍＡｂの比は、約３～１０であり、反応温度は、約４℃～３７℃であり、反応時間は、約１～２４時間である。

いくつかの実施形態において、部分的に還元された抗体とマレイミド官能化されたリンカー－薬物負荷との間のコンジュゲーションは、約４．０～８．０のｐＨ範囲の緩衝液中で行うことができ、ただし、有機添加剤（例えば、有機溶媒又は有機共溶媒）は、約０．０％～２０．０％であり、薬物／ｍＡｂの比は、約７～２０であり、反応温度は、約４℃～３７℃であり、コンジュゲーション時間は、約１～４時間である。

略語
ＡＤＣ：抗体薬物コンジュゲート
ＣＨ：重鎖定常領域
ＣＭＣ：化学、製造と制御
ＤＡＲ：薬物－抗体の比
ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド
ＤＴＴ：１、４－ジチオスレイトール
ＥＧＦＲ：上皮成長因子受容体
Ｆａｂ：抗原結合フラグメント
Ｆｃ：結晶化可能なフラグメント
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＦＧＥ：ホルミルグリシン生成酵素
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＣ５０：半数最大阻害濃度
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＭＣ：マレイミド－カプロイル
ＭＥＤ：最小有効量
ＭＭＡＥ：モノメチルアウリスタチンＥ
ＭＴＤ：最大耐用量
ＭＷＣＯ：分子量カットオフ
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
ＮＮＡＡ：非天然アミノ酸
ｍＴＧ：微生物トランスグルタミナーゼ
ＰＡＢ：ｐ－アミノベンジル
ＰＡＲ：薬物負荷－抗体の比
ＲＰ：逆相
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＣＥＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＣＨ：重鎖可変領域
ｅｑ：還元剤／ｍＡｂのモル比

方法
抗体の調製
本明細書において、すべての抗体分子は、タビキヌゲネコ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）のコドンによって最適化され、標準的な分子生物学の方法に従って合成され、独自の生産ベクターにクローン化され、そして、ＴＯＰ１０大腸菌プラスミドから大規模抽出して調製された。

トランスフェクションの７２時間前に、ＣＨＯＫ１宿主細胞を、２－４Ｅ５細胞／ｍＬで、ＣＤＣＨＯ培地に播種した。宿主細胞をＶｉ－ＣＥＬＬでカウントし、細胞密度を計算し、２９０ｇで７分間遠心分離した後、トランスフェクション前に予熱した新鮮なＣＤＣＨＯ培地に再懸濁した。再懸濁された宿主細胞を、使用するまでＫｕｈｎｅｒシェーカー（３６．５℃、湿度７５％、６％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ）でインキュベートした。

再懸濁した宿主細胞に、標的抗体をコードするプラスミドを合計４ｍｇ加えた後、ポリエーテルイミドを１２ｍｇ加えた。トランスフェクトされた培養物を、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー内で、３６．５℃、湿度７５％、６％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで４時間インキュベートした。独自のサプリメントを添加した後、トランスフェクション後の培養物をＫｕｈｎｅｒシェーカー内で３１℃、湿度７５％、６％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで、９～１０日間培養した。

収穫日に、トランスフェクトされた培養物を、まず１，０００ｇで１０分間、次に１０，０００ｇで４０分間遠心分離して清澄化し、０．２２ μｍフィルターで無菌ろ過した。上清をＰｒｏＡクロマトグラフィーで精製し、力価を測定した。ＰｒｏＡ溶出液は、１～２％中和バッファー（１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を添加して中和し、そしてｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーで調製した。

コンジュゲーションの前に、すべてのタンパク質は、還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、エンドトキシンレベルを検出するためのＬＡＬゲルクロットアッセイ、および分子同定のための質量分析を含む品質管理テストを受けた。

ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷を測定
プロセス：２０ｕｌのＡＤＣサンプルを７５ｕｌの８Ｍ塩酸グアニジンおよび５ｕｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０と混合した。混合物に１ｕｌの０．５ＭＴＣＥＰ溶液を加えた。３７℃で３０分間（ｍｉｎ）反応した後、ＲＰ－ＨＰＬＣで抗体への薬物負荷を測定した。

ＲＰ－ＨＬＰＣで遊離薬物を測定
プロセス：８５ｕｌのＡＤＣ溶液を１５ｕｌのＤＭＡと混合し、１００ｕｌの沈殿バッファー（ＮａＣｌで飽和した３７．５％ｖ／ｖメタノール／アセトニトリル溶液）を使用してタンパク質を沈殿させ、１４００ｒｐｍで１０分間（分）２２℃で、ボルテックス攪拌した。

サンプルを１６０００ｒｐｆで１０分間遠心分離した。ＲＰ－ＨＰＬＣ検出用の上清と標準サンプルを採取して、遊離薬物を測定した。

以下、実施例によって本発明を説明する。

実施例１
一般的なコンジュゲーション方法
ＴＣＥＰやＤＴＴなどの還元剤１～２０ｅｑ（例えば、いくつかの実施形態では３－１０ｅｑ）を、ｐＨ４．０～８．０のバッファー（例えば、ヒスチジン－アセテートストック溶液）中の濃度１ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌの抗体溶液に加えた。反応を４～３７℃で、０．５～２４時間穏やかに振とう又は攪拌した。精製せずに、有機共溶媒（例えばＤＭＡ）を、部分的に還元された抗体に、０％～２０％の濃度で添加し、マレイミドまたはハロアセチル官能化のリンカー－薬物負荷当量は７～２０ｅｑであった。４～３７℃で、０．５～４時間穏やかに振とう又は攪拌しつつ、コンジュゲーション反応を行った。ＵＶ－ｖｉｓで濃度、ＨＩＣ－ＨＰＬＣでコンジュゲートの分布とＤＡＲ、ＲＰ－ＨＰＬＣで軽鎖と重鎖の薬物負荷と遊離薬物の残留、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで凝集と純度、キネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベル、を測定することで、最終産物の特徴を特定した。

本明細書において、すべての抗体分子は、タビキヌゲネコ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）のコドンによって最適化され、標準的な分子生物学の方法に従って合成され、独自の生産ベクターにクローン化され、そして、ＴＯＰ１０大腸菌プラスミドから大規模抽出して調製された。

上記のように、アイソタイプを交換せずにＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体を調製した。上記のＩｇＧ１抗体は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰのヒンジ領域配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）を有し、上記のＩｇＧ４抗体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰのヒンジ領域配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）を有する。２つの抗体をそれぞれ、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ７．０の５０ｍＭＰＢおよび５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ６．５の５０ｍＭＰＢに溶解し、抗体濃度は、いずれも８．０ｍｇ／ｍｌであった。ＩｇＧ１抗体の場合、２．７ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。ＩｇＧ４抗体の場合、４．１ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。

そして、各混合物に、還元された抗体に１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑ（ＩｇＧ１の場合）および９ｅｑ（ＩｇＧ４の場合）のＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥをそれぞれ添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図１）。

実施例２
抗体８８６－５（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１））を、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ６．０の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．０ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、３．５ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を１５℃で１８時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図２）。

実施例３
抗体８８６－５（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１））を、ｐＨ６．０の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．０ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、３．３ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を１５℃で１８時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例４
抗体８８６－５（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１））を、ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳに溶解し、抗体濃度は５．７ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、２．６ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を１５℃で１６時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例５
抗体８８６－８（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、７ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で３時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に１２ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は２２℃で０．５時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図３）。

実施例６
抗体８８６－１３（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は４．０ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、４．４ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を１０℃で３時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に１０ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図４）。

実施例７
抗体８８６－２９（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．８ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、６．０ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図５）。

実施例８
抗体８８６－３４（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は６．２ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、５．０ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された（図６）。

実施例９
抗Ｈｅｒ２抗体８８６－１６（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ４－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；軽鎖（ＬＣ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、重鎖（ＨＣ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は９．２ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、５ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベル、を測定することで、最終産物の特徴を特定した（図７）。

実施例１０
抗Ｈｅｒ２抗体８８６－１９（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ１－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ＬＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＨＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．７ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、３ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で３時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベル、を測定することで、最終産物の特徴を特定した（図８）。

実施例１１
抗ＣＤ２０抗体８８６－１７（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ４－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ＬＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＨＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は８．９ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、５ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベルを測定することで、最終産物の特徴を特定した（図９）。

実施例１２
抗ＣＤ２０抗体８８６－２０（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ１－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ＬＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＨＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．２ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、３ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で３時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベルを測定することで、最終産物の特徴を特定した（図１０）。

実施例１３
抗ＥＧＦＲ抗体８８６－１８（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ４－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ＬＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＨＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．５ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、５ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベルを測定することで、最終産物の特徴を特定した（図１１）。

実施例１４
抗ＥＧＦＲ抗体８８６－２１（ＩｇＧ１－Ｆａｂ，ＩｇＧ１－Ｆｃ；ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；ＬＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＨＣ配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．０ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、３ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を４℃で３時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。ＨＩＣ－ＨＰＬＣでＤＡＲと薬物分布、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで純度と凝集レベル、ＲＰ－ＨＰＬＣで薬物負荷、ＲＰ－ＨＰＬＣで遊離薬物の残留、及びキネティックタービジメトリー法でエンドトキシンレベルを測定することで、最終産物の特徴を特定した（図１２）。

実施例１５
抗体８８６－２８（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は７．２ｍｇ／ｍｌであった。抗体溶液に、６．０ｅｑのＴＣＥＰを添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例１６
抗体８８６－２２（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＤＫＴＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２））、抗体８８６－２３（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３））と抗体８８６－２４（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＤＫＴＰＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は、それぞれに、６．９ｍｇ／ｍｌ、７．８ｍｇ／ｍｌと７．８ｍｇ／ｍｌであった。各抗体溶液にＴＣＥＰを添加し、ＴＣＥＰ／抗体の比は、それぞれに、５．２、３．２、４．６であった。下の表に示された温度（Ｔ）で、混合物を２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例１７
抗体８８６－２５（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＳＫＹＧＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５））、抗体８８６－２６（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＳＫＹＧＨＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６））と抗体８８６－２７（ＩｇＧ４－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＳＫＹＧＰＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は、それぞれに、４．８ｍｇ／ｍｌ、７．２ｍｇ／ｍｌと７．５ｍｇ／ｍｌであった。各抗体溶液にＴＣＥＰを添加し、ＴＣＥＰ／抗体の比は、それぞれに、３．５、４．０、５．５であった。下の表に示された温度（Ｔ）で、混合物を１６時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例１８
抗体８８６－３２（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８））と抗体８８６－３３（ＩｇＧ１－Ｆａｂ、ＩｇＧ４－Ｆｃ、ヒンジ領域配列はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９））を、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに溶解し、抗体濃度は、それぞれに、９．５ｍｇ／ｍｌと７．５ｍｇ／ｍｌであった。各抗体溶液にＴＣＥＰを添加し、ＴＣＥＰ／抗体の比は、それぞれに、１．５と２．０であった。下の表に示された温度（Ｔ）で、混合物を２時間インキュベートした。そして、還元された抗体に、１０％の濃度までＤＭＡを添加し、次に７ｅｑのＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥを添加した。コンジュゲーション反応は４℃で１時間行った。コンジュゲーション産物を４０ＫＤＭＷＣＯ脱塩カラムで精製し、ｐＨ５．５の２０ｍＭヒスチジン－アセテートバッファーに保存した。最終産物の特徴は、ＤＡＲおよび薬物分布測定のためのＨＩＣ－ＨＰＬＣで特定された。結果は次のとおりであった：

実施例１９
インビトロ細胞毒性試験：ＨＣＣ１９５４細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＨＣＣ８２７細胞に対するＨｅｒ２、ＣＤ２０およびＥＧＦＲを標的とする抗体薬物コンジュゲートの細胞毒性を試験した。３つの細胞株は、すべて、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。ＨＣＣ１９５４細胞を、９６ウェルプレートに４０００細胞／ウェルで接種し、Ｒａｊｉ細胞を、９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルで播種し、ＨＣＣ８２７細胞を、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルで播種した。細胞プレーティング完了の直後に、Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣで処理し、細胞プレーティングの２４時間後に、ＨＣＣ１９５４およびＨＣＣ８２７細胞をＡＤＣで処理した。３７℃で、４日間のＡＤＣ処理後に、Ｒａｊｉ細胞の生存率を分析し、３７℃で、５日間のＡＤＣ処理後に、ＨＣＣ１９５４細胞とＨＣＣ８２７細胞の生存率を分析した。抑制百分率と最大抑制百分率を計算した（図１３）。

実施例２０
投与時に体重が約３３０ｇになるまで、オスのＳＤラットをケージで飼育した。１０ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）－ＭＭＡＥ、８８６－１６－ＭＭＡＥおよび８８６－１９－ＭＭＡＥを、単回静脈内投与し、重複グループを設定し、その後、５分、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、１４４時間、３１２時間で、ラットの血漿を収集した。

ＥＬＩＳＡ法を使用し、さまざまな時点で収集された血漿中の総抗体濃度を測定した：９６ウェルプレートを、４℃で２４時間、１ｕｇ／ｍＬの濃度の組換えヒトＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）でコーティングした。次に、２％ＢＳＡを含むｐＨ７．２のＰＢＳで、３７℃で１時間ブロックした。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．２のＰＢＳ）で３回洗浄し、コーティングされた９６ウェルプレートで、さまざまな希釈度のサンプルをインキュベートし、血漿濃度を０．１％に正規化した。０．１％血漿で希釈したＡＤＣを用い、１ｎｇ／ｍｌ～１５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の検量線を作成した。３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄バッファーで３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体－ペルオキシダーゼを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢを加え、５分間インキュベートしてから、０．５ＭＨ２ＳＯ４で反応を終了した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、検量線を使用し、総抗体の濃度を計算した。

ＥＬＩＳＡ法を使用し、さまざまな時点で収集された血漿中の（ＡＤＣ）コンジュゲート抗体濃度を測定した：９６ウェルプレートを、４℃で２４時間、１ｕｇ／ｍＬの濃度の組換えヒトＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）でコーティングした。次に、２％ＢＳＡを含むｐＨ７．２のＰＢＳで、３７℃で１時間ブロックした。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．２のＰＢＳ）で３回洗浄し、コーティングされた９６ウェルプレートで、さまざまな希釈度のサンプルをインキュベートし、血漿濃度を０．１％に正規化した。０．１％血漿で希釈したＡＤＣを用い、０．０５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の検量線を作成した。３７℃で１時間インキュベートした後、洗浄バッファーで３回洗浄し、マウス抗ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄バッファーで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異性）抗体－ペルオキシダーゼを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、各ウェルにＴＭＢを加え、５分間インキュベートしてから、０．５ＭＨ２ＳＯ４で反応を終了した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、検量線を使用し、コンジュゲーション抗体の濃度を計算した。

図１４には、破線と実線は、それぞれ総抗体と（ＡＤＣ）コンジュゲート抗体のクリアランス状況を示した。破線は、総抗体の血漿濃度が、時間とともに減少することを示した。実線は、（ＡＤＣ）コンジュゲート抗体の血漿濃度が、時間とともに減少することを示した。破線は、３つのＡＤＣの総抗体クリアランス率が近いことを示した。実線は、８８６－１６－ＭＭＡＥおよび８８６－１９－ＭＭＡＥのクリアランスは、トラスツズマブ－ＭＭＡＥのクリアランスよりも遅いことを示した。

Claims

Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）又はＥＰＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２～１４のいずれか一つに示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＥＰＫＳＣＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）に示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）、又はＥＰＫＳＣＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．６）、又はＥＰＫＳＣＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）、又はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．８）、又はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＨＰＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．９）、又はＥＰＫＳＣＳＫＹＧＰＴＣＰＰＣＰ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１０）に示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ１アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂドメインと、それと作動可能に連結されるヒンジ領域を含み、上記のヒンジ領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５～１７のいずれか一つに示された配列を含み、上記のＦａｂドメインは、ＩｇＧ４アイソタイプであることを特徴とする、ポリペプチド複合体。
さらに、ヒンジ領域と作動可能に連結されたＦｃポリペプチド、或いはヒンジ領域と作動可能に連結された他のポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載されたポリペプチド複合体。
上記のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドであることを特徴とする請求項８に記載されたポリペプチド複合体。
上記のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃポリペプチドであることを特徴とする請求項９に記載されたポリペプチド複合体。
（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２０の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：２１の配列を含む重鎖；
（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２２の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：２３の配列を含む重鎖；
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２４の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：２５の配列を含む重鎖；
（ｉｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２６の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：２７の配列を含む重鎖；
（ｖ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２８の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：２９の配列を含む重鎖；または
（ｖｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０の配列を含む軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：３１の配列を含む重鎖；
を含むことを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載されたポリペプチド複合体。
請求項１～１１のいずれか一つに記載されたポリペプチド複合体を含むことを特徴とする抗体薬物コンジュゲート。
請求項１２に記載された抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含むことを特徴とする薬物組成物。
請求項１～１１のいずれか一つに記載されたポリペプチド複合体を提供することと；
マレイミド基又はハロアセチル基部分は、鎖間ジスルフィド結合の還元によって生成されたシステイン残基の遊離チオール基とマイケル付加反応を行うことと；
を含むことを特徴とする請求項１２に記載された抗体薬物コンジュゲートを調製する方法。
上記の遊離チオール基は、ＴＣＥＰまたはＤＴＴの還元剤で、鎖間ジスルフィド結合を部分的に還元することによって生成される請求項１４に記載された方法。
上記の部分的還元反応は、ｐＨ４．０～８．０のバッファーで行い、還元剤／ｍＡｂの比は３～１０であり、反応温度は４℃～３７℃であり、反応時間は１～２４時間である、請求項１５に記載された方法。
上記の部分的還元反応のＴＣＥＰ／ｍＡｂの比は、３～１０であることを特徴とする請求項１５に記載された方法。
マイケル付加反応は、ｐＨ４．０～８．０のバッファーで行い、有機添加剤が、重量百分比で０．０％～２０．０％を占め、薬物／ｍＡｂの比は、７～２０であり、反応温度は、４℃～３７℃であり、反応時間は、１～４時間であることを特徴とする請求項１４に記載された方法。
抗体薬物コンジュゲートの製造における請求項１～１１のいずれか一つに記載されたポリペプチド複合体の使用。