TW202116808A - 用於偶聯的多肽複合物及其應用 - Google Patents

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Abstract

本文一般涉及免疫、細胞生物學、分子生物學和藥學領域。更具體地說，本發明涉及用於偶聯的多肽複合物及其應用。本文提供一種多肽複合物，它從N末端至C末端包含Fab結構域和與之操作性連接的鉸鏈區，其中，所述Fab結構域和所述鉸鏈區源自不同的IgG亞型或其部分。所述多肽複合物還包含與鉸鏈區操作性相連的Fc多肽。本文提供包含本文所述多肽複合物的抗體藥物偶聯物。本文還提供包含本文所述抗體藥物偶聯物和藥學上可接受的運載體或賦形劑的藥物組合物，製備抗體藥物偶聯物的方法，所述多肽複合物用於製造抗體藥物偶聯物的應用，用治療有效量的所述抗體藥物偶聯物為有需要的物件治療疾患的方法。本文所述發明改善生物偶聯反應中的藥物負載-抗體之比，對於治療性應用尤其有益。

Description

用於偶聯的多肽複合物及其應用
本發明一般涉及免疫、細胞生物學、分子生物學和醫藥領域。更具體地說，本發明涉及用於偶聯的多肽複合物及其應用。
抗體是多功能的免疫球蛋白，具有對靶抗原的獨特結合特異性以及一系列非抗原依賴性免疫相互作用，由此使它們在免疫系統中發揮著重要作用。許多當前使用的治療用生物藥物、診斷試劑和研究試劑是針對感興趣的病理、免疫或生物學機制相關抗原的抗體。
近年來，人們為開發帶有藥物負載的抗體偶聯物做出了大量的努力。就抗體藥物偶聯物(ADC)而言，ADC包含用於靶向的抗體，用於藥物附接的接頭和作為效應物的高效的藥物負載。抗體或其相關形式通過抗體-抗原相互作用將細胞毒性藥物帶入表達抗原的細胞或其他靶細胞。同時，藥物與抗體偶聯後毒性顯著下降。因此，ADC通過降低最小有效劑量(MED)和提高最大耐受劑量(MTD)擴大了治療視窗。已獲得FDA批准的ADC類藥物的例子有Mylotarg、Adcetris、Kadcyla、Besponsa、Polivy、Padcev、Enhertu和Trodelvy。
ADC研發成功取決於抗體的選擇、接頭-藥物負載的選擇、接頭-藥物負載的偶聯的方式以及偶聯過程的研發。抗體中的半胱氨酸硫醇作為強親核試劑是理想的偶聯反應基團。抗體的天然形式中，半胱氨酸殘基以二硫鍵形式存在，因此，抗體輕鏈與重鏈以及重鏈與重鏈之間的二硫鍵還原為偶聯提供了理想的游離半胱氨酸巰基。在本領域中已經開發出許多偶聯方法來應對獲取優選負載-抗體比(PAR)和偶聯位置所提出的機遇與挑戰。理想情況下，應將中等數量的負載連接到抗體，由此得到的是異質性的ADC產品。低PAR的偶聯產品缺乏足夠的療效，高PAR的產品則毒性高且不穩定性。所以，ADC的異質性阻礙了治療視窗的擴大。因此，人們致力於採用如抗體的工程改造等方法來提高ADC產品的均質性。
一種方法採用對抗體的點突變來誘導產生具有高反應性殘基的胺基酸供偶聯之用。ThiomabTM技術是由Genentech開發的，可引入抗體的半胱氨酸突變(Jagath R Junutula等，“細胞毒性藥物與抗體的位點特異性偶聯可改善治療指數(Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index)”，Nature Biotechnology，2008，26(8)：925-932)。Thiomab偶聯發生在還原後的工程化半胱氨酸殘基上，由此得到高均質的偶聯產物。非天然胺基酸(NNAA)技術也被用於生產均質性的偶聯物。例如，在抗體中引入帶有酮基或疊氮基的非天然胺基酸作為偶聯位點(Jun Y.Axup等，“用非天然胺基酸合成位點特異性抗體-藥物偶聯物(Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids)”，PNAS，2012，109(40)：16101-16106；Michael P. VanBrunt等，“哺乳動物細胞中基因編碼的含疊氮胺基酸可通過點擊環加成化學形成位元點特異性抗體-藥物偶聯物(Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody–Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry)”，Bioconjugate Chem.，2015，26(11)：2249- 2260)，此種方法的偶聯由於特異性的反應也獲得了高均質性的產物。
基於定點誘變的方法有缺點。首先，需要仔細選擇突變位元點，否則抗體的穩定性和結合效率都會受到影響。其次，點突變抗體的表達水準通常很低，這在化工、製造與控制(CMC)階段可能成為問題。
另一種方法是引入短的多肽標籤作為酶可識別的偶聯位點。穀氨醯胺標籤(LLQG)作為mTG識別基序(Pavel Strop等，“位點的重要性：結合位點調節抗體藥物偶聯物的穩定性和藥代動力學(Location Matters: Site of Conjugation Modulates Stability and Pharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates)”, Chemistry & Biology, 2013, 20(2): 161-167)、LPETG作為分選酶A識別基序(Roger R. Beerli等，“分選酶介導形成體外體內高效力的位點特異性抗體藥物偶聯物(Sortase Enzyme-Mediated Generation of Site-Specifically Conjugated Antibody Drug Conjugates with High In Vitro and In Vivo Potency)”，PLOS ONE, 2015, 10(7): e0131177)、以及LCxP xR作為甲醯基甘胺酸生成酶(FGE)識別基序(Peng Wu等，“用遺傳編碼醛標籤在哺乳動物細胞中產生的定點化學修飾的重組蛋白(Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag)”，PNAS, 2009, 106(9): 3000-3005)用於偶聯獲得了高度均質的產物，其中，藥物連接於多肽標籤。
短多肽標籤的缺點類似於基於定點誘變的方法。需要篩選多肽標籤的插入位點，通常多肽標籤可用的位點是有限的。並且，使用該策略時帶標籤抗體的表達力價(Titer)也是個難點。
產生抗體偶聯物最直接的方法是利用抗體重鏈和輕鏈多肽中天然半胱氨酸的巰基。巰基作為強親核試劑能在水相中發生快速有效的偶聯反應。在FDA批准的ADC藥物Adcetris和Polivy中，通過半胱氨酸殘基上的巰基與用於單甲基澳瑞他汀E(MMAE)的接頭中的馬來醯亞胺基團反應將MMAE偶聯在部分還原鏈間二硫鍵產生的半胱氨酸殘基上。這裡，優選部分還原而不是全部還原，因為藥物的疏水性和所有半胱氨酸殘基都連接藥物時的位阻會導致ADC藥物在血漿中不穩定。但是，部分還原產物的均質性很差。據報導，優選IgG1型抗體部分還原後平均有四個游離巰基，因為ADC的藥物-抗體比率(DAR)為4時在體內具有最佳的治療指數。
IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之間在二硫鍵結構方面有許多相似之處和不同之處。以最常用作治療用生物藥的IgG1和IgG4為例，IgG1和IgG4的兩條重鏈都通過兩個二硫鍵連接並且總共有12個鏈內二硫鍵；然而，IgG1的輕鏈通過其最後一個殘基與重鏈第五個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵與重鏈相連，而IgG4的輕鏈通過其最後一個半胱氨酸殘基與重鏈第三個半胱氨酸殘基之間二硫鍵與重鏈相連(見第1圖)。通常，鏈內二硫鍵和鏈間二硫鍵的溶劑暴露水準是不同的。鏈內二硫鍵都埋在各結構域的二級結構之間，不暴露在溶劑中。位於鉸鏈區的鏈間二硫鍵都高度暴露在溶劑中，包括IgG1和IgG4的重鏈-重鏈間二硫鍵和IgG1的重鏈-輕鏈間二硫鍵。IgG4重鏈-輕鏈間二硫鍵位於比較不易觸及的VH和CH1結構域介面之間，因此與溶劑的接觸度不高。不同二硫鍵之間溶劑暴露程度差異對抗體的生物偶聯具有重要意義，因為暴露的半胱氨酸殘基被認為比不暴露的半胱氨酸殘基更具反應性(Hongcheng Liu和Kimberly May，“IgG分子的二硫鍵結構：結構變化、化學修飾以及對穩定性和生物學功能可能的影響(Disulfide bond structures of IgG molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function)”, Mabs, 2012, 4(1): 17-23)。有實驗表明，IgG1的重鏈-輕鏈間二硫鍵和重鏈-重鏈間二硫鍵均為高反應性。
鉸鏈區是抗體Fab與Fc之間的柔性接頭。在IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之間，鉸鏈區的長度和柔性差異很大。以最常用作治療用生物藥的IgG1和IgG4為例，IgG1的鉸鏈區有15個胺基酸且非常柔性，而IgG4的鉸鏈區較短，只有12個胺基酸(“IgG亞類和同種異型：從結構到效應著功能(IgG Subclasses and Allotypes from Structure to Effector Functions)”，Gestur Vidarsson等，Frontiers in Immunology，2014年十月20日，5:520)。野生型IgG1和IgG4在核心鉸鏈區(EU編號226-229)相差一個胺基酸：IgG1中為Cys-Pro-Pro-Cys而IgG4中為Cys-Pro-Ser-Cys。天然IgG4在核心鉸鏈區存在鏈間半胱氨酸與鏈內半胱氨酸二硫鍵之間的平衡，因此可以觀察到重鏈臂交換和分泌後IgG4半抗體分子的存在。業已證實，IgG4的S228P突變可通過防止自然臂交換來顯著穩定IgG4重鏈之間的共價相互作用(S.Angal等，“單個胺基酸取代消除了嵌合小鼠/人類(IgG4)抗體的異質性(A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody)”，Molecular Immunology, 1993, 30(1): 105-108；John-Paul Silva等，“新型定量免疫測定法聯合生理基質製備證明S228P突變可防止體內和體外IgG4 Fab臂交換(The S228P Mutation Prevents in Vivo and in Vitro IgG4 Fab-arm Exchange as Demonstrated using a Combination of Novel Quantitative Immunoassays and Physiological Matrix Preparation)”，Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(9): 5462-5469)，因此已廣泛用於IgG4抗體的開發和生產。S228P突變在IgG4鉸鏈中形成多脯氨酸螺旋(下鉸鏈區中的5個Pro)，配合較短的IgG4鉸鏈長度，與IgG1鉸鏈(下鉸鏈區中有3個Pro)相比進一步限制了其柔性。不同鉸鏈之間的柔性差異對抗體的生物偶聯具有重要意義，因為位於柔性鉸鏈片段中的半胱氨酸殘基被認為比位於剛性鉸鏈中的半胱氨酸殘基更具反應性。有實驗表明，S228P IgG4的重鏈-輕鏈間二硫鍵和重鏈-重鏈間二硫鍵均為弱反應性。
利用天然半胱氨酸進行抗體偶聯的缺點是IgG1和IgG4中四個鏈間二硫鍵之間的反應性相似，導致偶聯產物高度異質。而如前所述，這種異質性縮小了偶聯藥物臨床應用的治療視窗。例如，通過部分還原IgG1抗體中天然鏈間二硫鍵產生的ADC產生具有正態分佈的產物混合物。具有最佳治療指數的種類即偶聯數為4(PAR4)的種類僅占總混合物的40%。低偶聯數的種類(PAR0和PAR2)缺乏治療功效，而高偶聯數的種類(PAR6和PAR8)則表現出高毒性和不穩定性(Kevin J. Hamblett等，“載藥量對單株抗體偶聯物抗腫瘤活性的影響(Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate)”，Clinical Cancer Research, 2004, 10(20): 7063-7070；Yilma T. Adem等，“澳瑞他汀抗體藥物偶聯物理不穩定性和藥物載量的作用(Auristatin Antibody Drug Conjugate Physical Instability and the Role of Drug Payload)”, Bioconjugate Chem., 2014, 25(4): 656-664)。IgG4抗體部分還原產物的異質性甚至更高，當完全還原的抗體的水準已經很高時仍有許多未還原的抗體(第1圖)。
因此，仍然需要改善抗體生物偶聯的PAR，特別是對於治療應用而言，從而儘量消除上述一些或全部缺點。
本文提供用於偶聯的多肽複合物及其應用。
第一個方面，本文提供多肽複合物，所述多肽複合物從N末端至C末端包含Fab結構域和與之操作性連接的鉸鏈區，其中，所述Fab結構域或其部分和所述鉸鏈區或其部分源自不同的IgG亞型或其部分。
某些實施方式中，多肽複合物是或包含免疫球蛋白。某些實施方式中，多肽複合物是或包含抗體。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型鉸鏈區或其部分。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分是人類IgG1或IgG4型鉸鏈區或其部分。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分是人類IgG1型鉸鏈區或其部分。某些實施方式中，鉸鏈區或其部分為IgG1型而Fab結構域為IgG4型。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 1)中所示序列或其片段；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個突變，所述突變選自插入、缺失和取代，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：EPKSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 2)或EPKDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 3)中所示的序列；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個突變，所述突變選自插入、缺失和取代，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：SEQ ID NO: 12至14中任一所示的序列或其片段；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個突變，所述突變選自插入、缺失和取代，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分是人類IgG4型鉸鏈區或其部分。某些實施方式中，鉸鏈區或其部分為IgG4型而Fab結構域為IgG1型。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：EPKSCESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO: 4)中所示序列或其片段；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個突變，所述突變選自插入、缺失和取代，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID No. 5)或EPKSCKYGPPCPPCP (SEQ ID No. 6)或EPKSCYGPPCPPCP (SEQ ID No. 7)或EPKCESKYGPPCPPCP (SEQ ID No. 11)中所示序列；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個選自插入、缺失和取代的突變，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：EPKSCSKYGHTCPPCP (SEQ ID No. 8)或EPKSCSKYGHPCPPCP (SEQ ID No. 9)或EPKSCSKYGPTCPPCP (SEQ ID No. 10)中所示序列；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個選自插入、缺失和取代的突變，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
某些實施方式中，鉸鏈區或其部分包含：(a)：SEQ ID NO: 15至17中任一所示的序列或其片段；或者(b)：與(a)至少85%相同的序列；或者(c)：(a)或(b)的變體，所述變體具有一個或多個突變，所述突變選自插入、缺失和取代，或者所述變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
另一方面，本文還包括還含有與鉸鏈區操作性連接的Fc多肽的多肽複合物或者還含有與鉸鏈區操作性連接的其他多肽的多肽複合物。
某些實施方式中，所述Fc多肽是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型Fc多肽。
某些實施方式中，Fc多肽是人類IgG1或IgG4型Fc多肽。
另一相關方面中，本文包括抗體藥物偶聯物，其中包含本文所述的多肽複合物。
一相關方面中，本文包括藥物組合物，其中包含本文所述的藥物抗體偶聯物和藥學上可接受的運載體或賦形劑。
另一相關方面中，本文包括試劑盒，其中包含本文所述的多肽複合物、或本文所述抗體藥物偶聯物、或本文所述藥物組合物。這樣的試劑盒可用於科研目的，或者用作治療或診斷藥劑或用作預防性治療藥。
另一方面，本文包括製備本文所述抗體藥物偶聯物的方法，包括：提供本文所述多肽複合物中任一種；馬來醯亞胺基或鹵代乙醯基部分與鏈間二硫鍵還原產生的半胱氨酸殘基上的游離巰基進行邁克爾加成反應(Michael addition reaction)。
某些實施方式中，所述游離巰基是用溫和還原劑例如TCEP或DTT部分還原鏈間二硫鍵產生的；較好的是，所述部分還原反應在pH約4.0至8.0的緩衝液中進行，還原劑(例如TCEP)/mAb之比約3至10，反應溫度約4 °C至37 °C，反應時間約1至24小時。
某些實施方式中，可以用溫和還原劑例如TCEP或DTT部分還原鏈間二硫鍵來產生游離巰基。某些實施方式中，部分還原在pH約4.0至8.0 (例如pH 5.0至7.0、pH 5.0至6.0、pH 5.5或pH 6.0)的緩衝液中進行，還原劑/mAb之比約1至20、1至15、1至10、1至5、3至20、3至16、3至6或4至8，反應溫度約4 °C至37 °C、4 °C至20 °C、4 °C至15 °C、4 °C至10 °C或15 °C至37 °C，和/或還原時間約1小時至24小時、2至16小時、2至5小時或3至5小時。
某些實施方式中，部分還原的溫度約15 °C至37 °C，和/或還原劑/mAb之比約3至6，其中，多肽複合物的鉸鏈區或其部分源自IgG1型鉸鏈區或IgG4型鉸鏈區，可選地，所述多肽複合物還具有IgG1或IgG4型Fc多肽。某些實施方式中，多肽複合物的鉸鏈區具有SEQ ID NOs: 1至3和12至14中任一項所示的序列。某些實施方式中，多肽複合物的鉸鏈區具有SEQ ID NOs: 15至17中任一項所示的序列。
某些實施方式中，部分還原的溫度約4 °C至25 °C，優選約4 °C至20 °C、4 °C至15 °C或4 °C至10 °C，和/或還原劑/mAb之比約1至20，優選約1至15、3至16、3至8、1至6或3至5，其中，多肽複合物的鉸鏈區或其部分源自具有後文結構式II的鉸鏈區，可選地，所述多肽複合物還具有IgG1或IgG4 Fc多肽。某些實施方式中，多肽複合物的鉸鏈區具有SEQ ID NOs: 4至11中任一項所示的序列。
某些實施方式中，偶聯反應在pH約4.0至8.0的緩衝液中進行，有機添加劑(例如有機溶劑或有機助溶劑)約0.0%至20.0%(重量百分比)，藥物/mAb之比約7至20，反應溫度約4 °C至37 °C，反應時間約1至4小時。
另一方面，本文包括所述多肽複合物用於製造抗體藥物偶聯物的應用。
另一方面，本文包括為有需要的物件治療疾患的方法，包括給予所述物件治療有效量的本文所述抗體藥物偶聯物。
通過以下詳細說明，本發明的其他目的、特徵和優點將顯而易見。然而，應當明白，詳細說明和具體實施例雖然提示某些優選實施方式但僅僅是舉例說明，本領域普通技術人員通過閱讀詳細說明可以容易地得出本發明精神和範圍之內的各種變換形式。
定義
本文中，例如“一(個)/中”、“該/所述”等冠詞表示數量為一或一以上(即至少為一)的該冠詞所屬賓語。例如，“一個或一種多肽複合物”表示一個或一種多肽複合物或者多於一個或多於一種多肽複合物。
本文中，術語“約”或“大約”指量、水準、值、數目、頻率、百分比、維度、尺寸、量、重量或長度相對於參考量、水準、值、數目、頻率、百分比、維度、尺寸、量、重量或長度相差至多30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。以下具體實施方式中，數值前有“約”或“大約”表示該數值加減15%、10%、5%或1%的範圍。
本文中，術語“示例性”表示“用作示例、實例或說明”。本文中被描述為“示例性”的任何內容都不一定表示比其他內容更為優選或有利。
本文各處，除非上下文需要，術語“包括”、“包含”和“含有”應理解為指示包括所述步驟或元素或者步驟組或元素組但不排除任何其他步驟或元素或者步驟組或元素組。“由……組成”指包括並限於“由……組成”中所列舉的內容。因此，“由……組成”指所列元素是必須的或強制的，並且沒有其他元素存在。“基本由……組成”指包括在該片語中所列舉的任何元素並且還包括不干擾或有助於所列舉元素的活性或作用的其它元素。因此，片語“基本由……組成”指所列元素是必需的或強制而其他元素是可選的，其他元素是否可以存在取決於它們是否實質性影響所列元素的活性或作用。
文中各處的“實施方式之一”、“實施方式”、“具體實施方式”、“相關實施方式”、“某(一/些)實施方式”、“其他實施方式”或“另外的實施方式”或其組合表示與所述實施方式相關的特定特徵、結構或特性包含于本文所述實施方式至少其一之中。因此，本說明書不同位置出現的上述術語不一定指向同一實施方式。而且，所述特定特徵、結構或特性可在一個或多個實施方式中以任意合適方式組合。
本文中，術語“多肽”、“肽”和“蛋白(質)”可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物。這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基為相應天然產生胺基酸的人造化學類比物的胺基酸聚合物以及天然胺基酸聚合物和非天然胺基酸聚合物。本文中，術語“胺基酸”指天然的和合成的胺基酸，以及作用方式類似于天然胺基酸的胺基酸類似物和胺基酸類比物。天然胺基酸是由遺傳密碼編碼的胺基酸以及後期修飾的胺基酸如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物指具有與天然胺基酸相同的基本化學結構的化合物，所述基本化學結構即與氫、羧基、胺基和R基結合的α碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。這種類似物具有修飾的R基(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然胺基酸相同的基本化學結構。α碳指與官能團例如羰基相連的第一個碳原子。β碳指與α碳相連的那第二個碳原子，然後系統繼續按字母順序用希臘字母對碳命名。胺基酸類比物指結構不同於胺基酸通用化學結構但作用方式類似于天然胺基酸的化合物。“蛋白質”一般指較大的多肽。“肽”一般指較短的多肽。通常將多肽序列的左端稱為氨基末端(N-terminus)而將多肽序列的右端稱為羧基末端(C末端)。本文中，“多肽複合物”指複合物包含一個或相互聯合以行使特定功能的一個以上多肽的複合物。某些實施方式中，多肽是免疫相關多肽。
本文中，術語“抗體”涵蓋任何與特定抗原結合的免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多特異性抗體或雙特異性(二價)抗體。天然全抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由可變區(“HCVR”)和第一、第二和第三恆定區(CH1、CH2和CH3)組成，每條輕鏈由可變區(“LCVR”)和恆定區(CL)組成。哺乳動物的重鏈被分類為α、δ、ε、γ和μ，哺乳動物輕鏈被分類為λ或κ。抗體呈“Y”形，Y的幹部由兩條重鏈的第二和第三恆定區組成，它們通過二硫鍵相互結合。Y的臂各自包括與一條輕鏈的可變區和恆定區結合的一條重鏈的可變區和第一恆定區。輕鏈和重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈的可變區通常均包含三個高度可變的環，稱為互補決定區(CDR)(包括LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕(L)鏈CDR，包括HCDR1、HCDR2、HCDR3的重(H)鏈CDR)。可根據Kabat、Chothia或Al-Lazikani約定定義或識別抗體的CDR邊界(Al-Lazikani, B.，Chothia, C.，Lesk, A. M.，J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.等，J Mol. Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C.和Lesk, A.M.，J.Mol. Biol.，196,901 (1987)；Chothia, C.等，Nature. Dec 21-28; 342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。三個CDR插在稱為框架區(FR)的側翼序列之間，框架區與CDR相比高度保守並形成了支撐高變環的支架。每一VH和VL通常包括三個CDR和四個FR，其從氨基端到羧基端按照以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的恆定區不參與抗原結合，但是表現出各種效應功能。根據抗體重鏈恆定區的胺基酸序列將抗體分類。抗體的五個大類或同種型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特徵分別是具有α、δ、ε、γ和μ重鏈。有幾個大類的抗體又分為亞類，例如IgG1(γ1重鏈)，IgG2(γ2重鏈)，IgG3(γ3重鏈)，IgG4(γ4重鏈)，IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)。據此，本發明中，某特定IgG亞型例如“IgG1”或“IgG1(亞)型”表示屬於該指定亞類的IgG同種型，不同的IgG亞型則表示不同亞類的IgG同種型。
本文中，就抗體而言的“可變結構域”指包含一個或多個CDR的抗體可變區或其片段。儘管可變結構域可以包含完整可變區(例如HCVR或LCVR)，但也可以包含非完整可變區但保留與抗原結合或形成抗原結合位點的能力。
本文中，術語“抗原結合部分”指由包含一個或多個CDR的抗體部分形成的抗體片段，或與抗原結合但不包含完整天然抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合部分的例子包括但不限於可變域、可變區、雙抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫化物穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫化物穩定的雙抗體(ds雙抗體)、多特異性抗體、駝源化單域抗體、納米抗體、結構域抗體和二價結構域抗體。抗原結合部分能夠與親本抗體結合相同的抗原。某些實施方式中，抗原結合部分可包含來自特定人類抗體的一個或多個CDR，與來自一種或多種非人類抗體的框架區嫁接。有關抗原結合部分的更多具體形式，可參見Spiess等，2015年(同上)和Brinkman等，mAbs，9(2)，第182-212頁(2017年)，在此通過引用全文納入本文。
“Fab”指免疫球蛋白(如抗體)中由一條輕鏈(可變區和恆定區)通過二硫鍵與一條重鏈的可變區和第一恆定區結合而成的部分。某些實施方案中，輕鏈和重鏈的恆定區均被TCR恆定區代替。Fab部分負責抗原結合。
“Fab'”指包括抗體輕鏈與由可變區(VH)和第一恆定區(CH1)構成的重鏈部分共價結合的片段和部分鉸鏈區。
“Fc”指免疫球蛋白(如抗體)中由第一重鏈的第二(CH2)和第三(CH3)或者還有第四(CH4，例如在IgM中)恆定區與第二重鏈的第二和第三或者還有第四恆定區結合構成的部分，或者指免疫球蛋白(如抗體)中由第一重鏈的部分鉸鏈區、第二(CH2)和第三(CH3)或者還有第四(CH4，例如在IgM中)恆定區與第二重鏈的部分鉸鏈區、第二和第三或者還有第四恆定區結合構成的部分。抗體的Fc部分負責各種效應功能，例如ADCC和CDC，但在抗原結合中不起作用。
本文中，術語抗體的“鉸鏈區”包括連接CH1結構域與CH2結構域的重鏈分子部分。鉸鏈區包含約12至62個胺基酸並且是柔性的，因此允許兩個N末端抗原結合區獨立地移動。
本文中，術語“CH2結構域”包括這樣的重鏈分子的部分，即按照常規編號方案IgG抗體約第244位胺基酸至第360位胺基酸(胺基酸244至360，Kabat編號系統；胺基酸231至340，EU編號系統；參見Kabat EA等，美國衛生與公共服務部(U.S. Department of Health and Human Services)(1983))。
“CH3結構域”從IgG分子的CH2結構域延伸至C末端，包含大約108個胺基酸。某些免疫球蛋白類別，例如IgM，還有CH4區。
抗體的“Fv”指帶有完整抗原結合位點的最小抗體片段。Fv片段由與單條重鏈的可變域結合單條輕鏈的可變域構成。已經有許多Fv設計，包括dsFv，其中通過引入二硫鍵增強兩個結構域之間的聯合；可用肽接頭將兩個結構域連成單個多肽而形成scFv。已經生產出了含有與相應免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變區和恆定區相關聯的重免疫球蛋白鏈或輕免疫球蛋白鏈可變區的Fvs構建體。並且，已有人將Fv多聚化成雙抗體和三抗體(Maynard等，Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000))。
胺基酸序列(或核酸序列)的“百分比(%)序列同一性”定義為將序列對齊並根據需要引入空位以實現相同胺基酸(或核酸)數量最大化後，候選序列中與參考序列中胺基酸(或核酸)相同的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。胺基酸殘基的保守取代可以認為或不認為是相同的殘基。為了確定胺基酸(或核酸)序列同一性百分比定的比對可以採用公開的工具如BLASTN、BLASTp(可在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)的網站上獲得)，另見Altschul SF等，J. Mol. Biol., 215:403–410 (1990)； Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2(可在歐洲生物資訊學研究所網站上找到)，另見Higgins DG等，Methods in Enzymology，266:383-402 (1996)；Larkin MA等，Bioinformatics(英國，牛津)，23(21): 2947-8 (2007))，以及ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可使用工具的默認參數，或者可以定制適合比對的參數，例如通過選擇合適的演算法。
本文中，“抗原”或“Ag”指能刺激細胞培養物或動物產生抗體或T細胞活化的化合物、組合物、肽、多肽、蛋白質或物質，包括加入細胞培養物中(例如雜交瘤)或注射至或吸收至動物體內的組合物(例如包含癌特異性蛋白的組合物)。抗原與特定體液免疫或細胞免疫產物(例如抗體)—包括由異源抗原誘導的產物—反應。
“表位”或“抗原決定區”指結合劑(例如抗體)結合的抗原區域。表位既可以由連續胺基酸形成(亦稱線性表位元或連續表位)，也可以通過蛋白質三級折疊並置的非連續胺基酸形成(亦稱構型或構象表位)。由連續胺基酸形成的表位通常沿蛋白質的一級胺基酸殘基線性排列，這些連續胺基酸小片段可以從與主組織相容性複合物(MHC)分子結合的抗原中消化出來或在暴露於變性溶劑中時得以保留，但是由三級折疊形成的表位通常因變性溶劑處理而丟失。表位通常包含呈現獨特空間構象的至少3個、更通常至少5個、約7個或約8-10個胺基酸。
本文至，術語“特異性結合”指兩個分子之間的非隨機結合反應，例如抗體和抗原之間。某些實施方案中，本文中的多肽複合物和雙特異性多肽複合物特異性結合抗原的結合親和力(KD) ≤ 10-6 M (例如 ≤ 5x10-7 M、≤ 2x10-7 M、≤ 10-7 M、≤ 5x10-8 M、≤ 2x10-8 M、≤ 10-8 M、≤ 5x10-9 M、≤ 2x10-9 M、≤ 10-9 M或≤ 10-10 M)。本文中，KD指解離速率與結合速率之比(koff /kon)，可以用表面等離子共振法例如用Biacore等儀器來測定。
本文中，術語“操作性連接”或“可操作地連接”指兩個或更多個目標生物序列的並置，有或沒有間隔子或接頭，並置的方式使得它們處於允許各自以預期方式起作用的關係中。用於多肽時表示多肽序列以允許連接產物具有預期生物功能的方式連接。例如，抗體可變區可以操作性連接恆定區以提供具有抗原結合活性的穩定產物。該術語也可以用於多核苷酸。例如，當編碼多肽的多核苷酸操作性連接調控序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，指多核苷酸以允許調控多核苷酸的多肽表達的方式連接。
鉸鏈區是連接免疫球蛋白CH1的C末端與CH2結構域N末端的連續胺基酸殘基區域。人類IgG1中，鉸鏈區按照EU編號為殘基216至230。人類IgG4中，鉸鏈區按照EU編號為殘基219至230。。
本文中，胺基酸殘基“取代”指在肽、多肽或蛋白質中自然發生或誘導的一個或多個胺基酸被另一個或多個胺基酸取代。多肽內的取代可能會導致多肽功能的減弱、增強或消除。
胺基酸序列中的取代也可以是“保守取代”，指用側鏈理化性質相似的不同胺基酸殘基進行取代，或取代那些對多肽的活性而言不重要的胺基酸。例如，可以在具有非極性側鏈的胺基酸殘基(例如Met、Ala、Val、Leu與Ile、Pro、Phe、Trp)之間，在具有不帶電極性側鏈的殘基(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)之間，具有酸性側鏈的殘基(例如Asp、Glu)之間，具有鹼性側鏈的胺基酸(例如His、Lys和Arg)之間，具有β支鏈的胺基酸(例如Thr、Val和Ile)之間，具有含硫側鏈的胺基酸(例如Cys和Met)之間，或是具有芳族側鏈的殘基(例如Trp、Tyr、His和Phe)之間製造保守取代。某些實施方案中，取代、缺失或添加也可以被認為是“保守取代”。插入或缺失的胺基酸數目可以在約1至5的範圍內。保守取代通常不會引起蛋白質構象結構的顯著變化，因此能夠保持蛋白質的生物學活性。
本文中，胺基酸殘基“突變”指胺基酸殘基的取代、插入、缺失或添加。
本文中，“同源序列”指與另一序列進行選擇性比對時同一性至少80% (例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的多核苷酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列。
本文中，術語“物件”或“個體”或“動物”或“患者”指需要疾病或紊亂的診斷、預後、改善、預防和/或治療的人類或非人類動物，包括哺乳動物或靈長類動物。哺乳動物物件包括人類、家養動物、家畜和動物園動物、競技動物或寵物，如犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、豬、奶牛、熊等。
發明詳述
以下描述僅為說明本文的各種實施方式。因此，在此討論的具體修飾、改換等不應被解釋為對本文公開範圍的限制。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文公開範圍的情況下，可以得出各種等同形式、改變和修改，應當明白，這樣的等同實施方式均包括在本文範圍之內。本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利和專利申請，都通過引用全文納入本文。
本文提供一種多肽複合物，所涉多肽複合物從N末端至C末端包含Fab結構域和與之操作性連接的鉸鏈區，其中，所述Fab結構域或其部分和所述鉸鏈區或其部分源自不同的IgG亞型或其部分。發明人出乎意料地發現，這種不同在所述多肽複合物生物偶聯反應中改善了藥物負載(payload)-抗體之比(PAR)，造成還原劑對鏈間二硫鍵可及性有差異。因此，當用於製備和/或摻入ADC時，本文所述的多肽複合物顯著改善產物的均質性，特別是PAR為4的產物收集濃化(enrichment)。另一方面，還發現本文所述的多肽複合物具有更好的藥物動力學和/或藥效學特性。
多肽複合物
本文提供新型多肽複合物，所述多肽複合物從N末端至C末端包含Fab結構域和與之操作性連接的鉸鏈區，其中，所述Fab結構域或其部分和所述鉸鏈區或其部分源自不同的IgG亞型或其部分。
實施方式之一中，多肽複合物或其部分包含至少兩條重鏈和兩條輕鏈，兩條重鏈通過位於鉸鏈區中的兩個二硫鍵連接。鉸鏈區或其部分是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型鉸鏈區或其部分。
實施方式之一中，通過對IgG1和IgG4免疫球蛋白的Fab C端鉸鏈區或其一部分在天然結構位置上的互換，這種不同在生物偶聯反應中改善了藥物負載-抗體之比(PAR)，因為它造成還原劑對鏈間二硫鍵可及性有差異。後文中更可見本文多肽複合物和構建體的更多優點。
就本發明而言，所述Fab結構域可以源自任意抗體，尤其是那些具有臨床意義的抗體。一些實施方式中，所述Fab結構域源自特異性結合腫瘤抗原(TA)例如腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA)的抗體。其中，腫瘤抗原的例子包括但不限於：CD20、CD38、CD123；ROR1、ROR2、BCMA；PSMA；SSTR2；SSTR5、CD19、FLT3、CD33、PSCA、ADAM17、CEA、Her2、EGFR、EGFR-vIII、CD30、FOLR1、GD-2、CA-IX、Trop-2、CD70、CD38、間皮素、EphA2、CD22、CD79b、GPNMB、CD56、CD138、CD52、CD74、CD30、CD123、RON和ERBB2。TA-特異性抗體的例子包括但不限於：曲妥珠單抗(Trastuzumab) (例如後文實施例9和10中所述)、利妥昔單克(Rituximab) (例如後文實施例11和12中所述)、西妥昔單抗(Cetuximab)(例如後文實施例13和14中所述)、貝伐單抗(Bevacizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、馬妥珠單抗(Matuzuma)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、波拉妥珠單抗(Polatuzumab)、英妥珠單抗(Inotuzumab)等。
鉸鏈區
鉸鏈區是抗體Fab與Fc之間的柔性接頭。在IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之間，鉸鏈區的長度和柔性差異很大。以最常用作治療用生物藥的IgG1和IgG4為例，IgG1的鉸鏈區有15個胺基酸(例如EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 18)並且非常柔性，而IgG4的鉸鏈區較短，只有12個胺基酸(“IgG亞類和同種異型：從結構到效應著功能(IgG Subclasses and Allotypes from Structure to Effector Functions)”，Gestur Vidarsson等，Frontiers in Immunology，2014年十月20日，5:520)。野生型IgG1和IgG4在核心鉸鏈區(EU編號226-229)相差一個胺基酸：IgG1中為Cys-Pro-Pro-Cys而IgG4中為Cys-Pro-Ser-Cys。天然IgG4在核心鉸鏈區存在鏈間半胱氨酸與鏈內半胱氨酸二硫鍵之間的平衡，因此可以觀察到重鏈臂交換和分泌後IgG4半抗體分子的存在。業已證實，IgG4的S228P突變ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 19)可通過防止自然臂交換來顯著穩定IgG4重鏈之間的共價相互作用，因此已廣泛用於IgG4抗體的開發和生產。S228P突變在IgG4鉸鏈中形成多脯氨酸螺旋(PPCPPCP)，配合較短的IgG4鉸鏈長度，與IgG1鉸鏈相比進一步限制了其柔性。不同鉸鏈之間的柔性差異對抗體的生物偶聯具有重要意義，因為位於柔性鉸鏈片段中的半胱氨酸殘基被認為比位於剛性鉸鏈中的半胱氨酸殘基更具反應性。有實驗表明，S228P IgG4的重鏈-輕鏈間二硫鍵和重鏈-重鏈間二硫鍵均為弱反應性。
一些實施方式中，Fab結構域與鉸鏈區操作性連接，其中，鉸鏈區或其部分衍生自IgG1或其部分，所述Fab結構域衍生自IgG4。通過對IgG1和IgG4免疫球蛋白的Fab C端鉸鏈區在天然結構位置上的互換，這種不同在生物偶聯反應中由於還原劑對鏈間鍵(例如二硫鍵)可及性差異改善了藥物負載-抗體之比(PAR)。
一些實施方式中，修飾鉸鏈區包含具有以下結構式(I)的序列： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 CPPCP………….(I) 其中，X1 =無或E；X2 =無或P；X3 =無或K；X4 =無或S或E；X5 =無或C或S，優選無；X6 = D或K；X7 = K或Y；X8 = T或G；和/或，X9 X10 =HT、HP、PT或PP，優選PT或PP。
一些實施方式中，修飾鉸鏈區包含具有以下結構式(II)的序列： EPK x1 C x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 CPPCP…………(II) 其中，x1 = 無或S；x2 = 無或E或S，優選無；x3 = 無或S或C；x4 = 無或K或D；x5 = Y或K；x6 = G或T；和/或x7 x8 = PP、PT、HP或HT。
一個或多個實施方式中，示例性修飾鉸鏈區序列如表1中所示。 表1：本文公開的修飾鉸鏈區序列示例
鉸鏈區序列 SEQ ID NO.
DKTHTCPPCP 1
EPKSDKTHTCPPCP 2
EPKDKTHTCPPCP 3
EPKSCESKYGPPCPPCP 4
EPKSCSKYGPPCPPCP 5
EPKSCKYGPPCPPCP 6
EPKSCYGPPCPPCP 7
EPKSCSKYGHTCPPCP 8
EPKSCSKYGHPCPPCP 9
EPKSCSKYGPTCPPCP 10
EPKCESKYGPPCPPCP 11
EPKSCDKTPPCPPCP 12
EPKSCDKTHPCPPCP 13
EPKSCDKTPTCPPCP 14
ESKYGHTCPPCP 15
ESKYGHPCPPCP 16
ESKYGPTCPPCP 17
可以在重鏈恆定區中包含上述修飾鉸鏈區，重鏈恆定區通常包括CH2和CH3結構域，並且可以在指定區域之側具有另外的鉸鏈區段(例如上鉸鏈)，還有CH1區域。這些另外的恆定區區段如果存在則通常是同型的，優選人類同種型，雖然也可以是不同亞型的雜合。所述另外的人類恆定區區段的同種型優選人類IgG1型，但也可以是人類IgG2、IgG3或IgG4型或其雜合即包含不同亞型的結構域。
本文中，“鉸鏈區(或其部分)”與“修飾鉸鏈區(或其部分)”指本發明的鉸鏈區時可互換使用，都指具有0或1、2、3、4、5、6、7、8、9和10處取代、缺失或內部插入的鉸鏈區。如果鉸鏈區與某指定亞型野生型的差異在於0或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處取代，缺失或內部插入，則將該鉸鏈區認為是該指定亞型的。本文中，當鉸鏈區、Fab、Fc片段或多肽複合物的任何其他組分跟在一指定亞型之後時，例如“IgG1鉸鏈區”，表示鉸鏈區、Fab、Fc片段或多肽複合物的任意其他組分屬於該指定亞型，但不一定是野生型。
鏈間鍵形成於鉸鏈區一條單鏈上的一個胺基酸殘基與鉸鏈區另一單鏈上的另一胺基酸殘基之間。某些實施方式中，非天然鏈間鍵可以是能夠將鉸鏈區兩條單鏈締合成二聚體的任何鍵或相互作用。非天然鏈間鍵合適的例子有二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋或疏水-親水相互作用、杵-進入-臼(knobs-into-holes)或它們的組合。
本文中，“二聚體”指兩個分子例如多肽或蛋白質通過共價或非共價相互作用形成的締合(associated)結構。均二聚體或均二聚化由兩個相同的分子形成，異二聚體或異二聚化由兩個不同的分子形成。
“二硫鍵”指具有R-S-S-R'結構的共價鍵。半胱氨酸具有巰基，能與另一巰基例如另一半胱氨酸殘基的巰基形成二硫鍵。分別位於兩條多肽鏈上的兩個半胱氨酸巰基之間可以形成二硫鍵，由此形成鏈間橋或鏈間鍵。
靜電相互作用是非共價相互作用，對於蛋白質折疊、穩定性、柔性和功能很重要，包括離子相互作用、氫鍵和鹵素鍵。多肽內會形成靜電相互作用，例如Lys與Asp之間、Lys與Glu之間、Glu與Arg之間，或是一條鏈上的Glu、Trp與另一條鏈上的Arg、Val或Thr之間。
鹽橋是一種近距離靜電相互作用，主要發生在Asp或Glu的陰離子羧酸根和Lys的陽離子銨或Arg的胍鹽，是天然蛋白質結構中相反電荷殘基的空間近距離配對。疏水性為主介面中的帶電殘基和極性殘基可成為結合熱點。其中，帶有可電離側鏈的殘基(例如His、Tyr和Ser)也會參與鹽橋的形成。
疏水相互作用可形成於一條鏈的一個或多個Val、Tyr和Ala與另一條鏈的一個或多個Val、Leu和Trp之間或一條鏈的His和Ala與另一條鏈的Thr和Phe之間(參見Brinkmann等，2017，同上)。
當氫原子與高電負度原子(例如氮、氧或氟)共價結合時，兩個極性基團之間的靜電吸引形成氫鍵。氫鍵可分別形成於多肽內兩個殘基的主鏈氧(例如硫屬元素基團)與醯胺氫(氮基團)之間，例如Asn的氮基團和His的氧基團，或Asn的氧基團和Lys氮基團。氫鍵強於凡德瓦力，但弱於共價鍵或離子鍵，對於維持二級結構和三級結構至關重要。例如，胺基酸殘基間距為規則的i位元到i+4位時形成α螺旋，而β折疊則是兩條肽由至少兩個或三個主鏈氫鍵相連、形成扭轉、波紋狀的片層時形成的3-10個胺基酸長的肽段。
本文中，杵臼結構“(knobs-into-holes)”指兩條多肽之間這樣的相互作用：其中一條多肽由於存在大側鏈胺基酸殘基(例如酪氨酸或色氨酸)而具有突起(即“杵”)，另一條多肽具有小側鏈胺基酸殘基(例如丙氨酸或蘇氨酸)所在的一個腔穴(即“臼”)，所述的突起可定位到所述腔穴中，由此促進兩條多肽之間的相互作用從而形成異二聚體或複合物。形成具有杵臼結構多肽的方法是已知的，例如美國專利U.S. Pat. No. 5,731,168中所述。
某些實施方式中，鉸鏈區具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鏈間鍵。可選地，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鏈間鍵中至少一個是二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋或疏水-親水相互作用、或其任意組合。
鏈間二硫鍵的形成可以通過本領域所知合適的方法來測定。例如，可以分別對表達的蛋白質產物進行還原和非還原SDS-PAGE，然後比較所得條帶以鑒定可能的差異，由可能的差異指示鏈間二硫鍵存在與否。
某些實施方式中，多肽複合物包含人類IgG1型的抗原結合片段Fab，其後是人類IgG4型且具有S228P突變以防臂交換的修飾鉸鏈區，其後是包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或其組合)的CH2-CH3結構域的恆定區，其中Fab和鉸鏈區的IgG1與IgG4亞類互換改變了還原劑對重鏈-重鏈間二硫鍵相對於重鏈-輕鏈間二硫鍵的天然可及性，引導還原反應和藥物負載偶聯反應優先發生於重鏈-輕鏈間巰基。
一個或多個實施方式中，示例性鉸鏈區序列及其技術效果如表2中所示。 表2：本文示例性鉸鏈區序列及其技術效果
mAb ID Fab型 Fc型 鉸鏈區序列 D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-2 IgG4 IgG1 DKTHTCPPCP (SEQ No. 1) 4.2 10.4 58.4 24.7 2.4 4.2
886-3 IgG1 IgG4 EPKSCESKYGPPCPPCP (SEQ No. 4) 1.3 14.5 68.2 6.6 9.5 4.2
886-4 IgG1 IgG1 EPKSCESKYGPPCPPCP (SEQ No. 4) 1.5 17.8 62.0 13.9 4.7 4.1
886-5 IgG4 IgG4 DKTHTCPPCP (SEQ No. 1) 5.8 17.8 65.7 2.2 8.6 3.8
886-8 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.6 4.3 91.0 4.1 0.0 4.0
886-9 IgG1 IgG4 EPKSCKYGPPCPPCP (SEQ No. 6) 1.3 5.6 87.7 4.7 0.7 4.0
886-10 IgG1 IgG4 EPKSCYGPPCPPCP (SEQ No. 7) 0.8 10.7 82.0 5.4 1.1 3.9
886-12 IgG1 IgG1 EPKCESKYGPPCPPCP (SEQ No. 11) 2.1 21.3 61.1 13.6 2.0 3.8
886-13 IgG1 IgG1 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 1.0 6.8 85.5 6.7 0.0 4.0
886-14 IgG1 IgG1 EPKSCKYGPPCPPCP (SEQ No. 6) 1.2 3.8 84.9 10.2 0.0 4.1
886-15 IgG1 IgG1 EPKSCYGPPCPPCP (SEQ No. 7) 0.8 7.4 79.5 10.7 1.6 4.1
886-16 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.6 5.5 87.5 5.7 0.7 4.0
886-17 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.4 3.2 89.8 5.8 0.8 4.1
886-18 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.3 3.0 89.0 6.6 1.1 4.1
886-19 IgG1 IgG1 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 1.2 7.5 85.6 5.3 0.4 3.9
886-20 IgG1 IgG1 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.6 6.8 86.2 6.0 0.4 4.0
886-21 IgG1 IgG1 EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ No. 5) 0.7 7.1 80.2 9.8 2.2 4.1
886-22 IgG1 IgG1 EPKSCDKTPPCPPCP (SEQ No. 12) 2.1 20.8 56.9 15.2 5.0 4.0
886-23 IgG1 IgG1 EPKSCDKTHPCPPCP (SEQ No. 13) 4.2 20.6 44.4 24.1 6.7 4.2
886-24 IgG1 IgG1 EPKSCDKTPTCPPCP (SEQ No. 14) 3.6 24.1 49.9 14.8 7.6 4.0
886-25 IgG4 IgG4 ESKYGHTCPPCP (SEQ No. 15) 8.4 18.4 57.2 3.2 12.8 3.9
886-26 IgG4 IgG4 ESKYGHPCPPCP (SEQ No. 16) 7.5 14.7 59.8 3.1 14.9 4.1
886-27 IgG4 IgG4 ESKYGPTCPPCP (SEQ No. 17) 11.0 15.7 52.0 2.4 19.1 4.1
886-28 IgG4 IgG4 EPKSDKTHTCPPCP (SEQ No. 2) 6.8 10.6 75.1 0.0 7.4 3.8
886-29 IgG4 IgG4 EPKDKTHTCPPCP (SEQ No. 3) 5.3 8.2 78.1 0.0 8.4 4.0
886-32 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGHTCPPCP (SEQ No. 8) 1.3 13.9 73.4 8.1 3.3 4.0
886-33 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGHPCPPCP (SEQ No. 9) 1.5 13.4 76.5 5.0 3.6 3.9
886-34 IgG1 IgG4 EPKSCSKYGPTCPPCP (SEQ No. 10) 1.0 11.8 82.5 4.7 0.0 3.8
抗體藥物偶聯物
i.抗體
本文提供新型抗體，所述抗體從N末端至C末端包含Fab結構域和與之操作性連接的鉸鏈區，其中，所述Fab結構域或其部分和所述鉸鏈區或其部分源自不同的IgG亞型。抗體包含至少兩條重鏈和兩條輕鏈，兩條重鏈通過鉸鏈區或其部分中的兩個二硫鍵相連，所述鉸鏈區或其部分是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型鉸鏈區或其部分。
另一方面內容中，抗體還包含與鉸鏈區操作性相連的Fc多肽，或者還包含與鉸鏈區操作性相連的其他多肽。
某些實施方式中，所述Fc多肽是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型Fc多肽。
某些實施方式中，Fc多肽是人類IgG1或IgG4型Fc多肽。
另一相關方面中，本文包括抗體藥物偶聯物，其中包含本文所述的多肽複合物。
就本發明而言，所述Fab結構域可以源自任意抗體，尤其是那些具有臨床意義的抗體。一些實施方式中，所述Fab結構域源自特異性結合腫瘤抗原(TA)例如腫瘤特異性抗原(TSA)和腫瘤相關抗原(TAA)的抗體。其中，腫瘤抗原的例子包括但不限於：CD20、CD38、CD123；ROR1、ROR2、BCMA；PSMA；SSTR2；SSTR5、CD19、FLT3、CD33、PSCA、ADAM17、CEA、Her2、EGFR、EGFR-vIII、CD30、FOLR1、GD-2、CA-IX、Trop-2、CD70、CD38、間皮素、EphA2、CD22、CD79b、GPNMB、CD56、CD138、CD52、CD74、CD30、CD123、RON和ERBB2。TA-特異性抗體的例子包括但不限於：曲妥珠單抗(Trastuzumab) (例如後文實施例9和10中所述)、利妥昔單克(Rituximab) (例如後文實施例11和12中所述)、西妥昔單抗(Cetuximab)(例如後文實施例13和14中所述)、貝伐單抗(Bevacizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、馬妥珠單抗(Matuzuma)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、波拉妥珠單抗(Polatuzumab)、英妥珠單抗(Inotuzumab)等。
ii.藥物
用於本發明的藥物(亦稱“藥物負載”)沒有特別限制。用於本發明的藥物包括細胞毒性藥物，尤其是用於癌症治療的那些。這些藥物一般包括但不限於DNA破壞劑，DNA結合劑，抗代謝劑，酶抑制劑(如胸苷酸合酶抑制劑和拓撲異構酶抑制劑)，微管蛋白抑制劑和毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的毒素)。例如，具體例子包括紫杉醇，氨甲蝶呤，甲氨喋呤，二氯氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-巰基嘌呤，阿糖胞苷，美法侖，環氧長春堿，長春西定，放線菌素，柔紅黴素，多柔比星，絲裂黴素C，絲裂黴素A，洋紅黴素，氨基蝶呤，他利黴素，鬼臼及鬼臼衍生物如足葉乙甙或磷酸足葉乙甙，長春花堿，長春新堿，長春地辛，紫杉烷包括紫杉醇，多西他賽視黃酸，丁酸，N8-乙醯基亞精胺，喜樹堿，卡奇黴素，埃斯培拉黴素，烯-二炔，多卡黴素A，多卡黴素SA，卡奇黴素，喜樹堿，哈米特林，美登木素（包括DM1，DM2，DM3，DM4）和澳瑞他汀類(包括單甲基澳瑞他汀E（MMAE）、單甲基澳瑞他汀F（MMAF）、單甲基澳瑞他汀D (MMAD))。一些實施方式中，優選澳瑞他汀類，例如MMAE。可用任意合適的本領域所知方法將藥物與接頭連接。一些實施方式中，用於偶聯時藥物的提供方式為接頭-藥物中間體，例如“MC-vc-PAB-MMAE”。
iii.接頭
本發明中所用藥物可以通過接頭與抗體連接。本領域已知有多種用於ADC的接頭。可用於本發明的接頭沒有特別限制，只要它具有能夠與抗體提供的巰基反應的部分從而與抗體連接。本發明中特別有用的是馬來醯亞胺或鹵代乙醯基官能化的接頭。例子包括但不限於-MC-vc-PAB- (MC：馬來醯亞胺-己醯基；vc：纈氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)二肽；PAB：對氨基苄基)，-MC-vc-，-MC-和-SMCC- (琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯)。
一相關方面中，本文包括藥物組合物，其中包含本文所述的藥物抗體偶聯物和藥學上可接受的運載體或賦形劑。
另一相關方面中，本文包括試劑盒，其中包含本文所述的多肽複合物、或本文所述抗體藥物偶聯物、或本文所述藥物組合物。
另一方面，本文包括製備本文所述抗體藥物偶聯物的方法，包括： 提供本文所述多肽複合物中任一種； 使馬來醯亞胺基或鹵代乙醯基部分與鏈間二硫鍵還原產生的半胱氨酸殘基上的游離巰基進行邁克爾加成反應(Michael addition reaction)。
某些實施方式中，所述游離巰基是用溫和還原劑例如TCEP或DTT部分還原鏈間二硫鍵產生的；較好的是，所述部分還原反應在pH約4.0至8.0的緩衝液中進行，還原劑(例如TCEP)/mAb之比約3至10，反應溫度約4 °C至37 °C，反應時間約1至24小時。
某些實施方式中，偶聯反應在pH約4.0至8.0的緩衝液中進行，有機添加劑(例如有機溶劑或有機助溶劑)約0.0%至20.0%(重量百分比)，藥物/mAb之比約7至20，反應溫度約4 °C至37 °C，反應時間約1至4小時。
另一方面，本文包括所述多肽複合物用於製造抗體藥物偶聯物的應用。
另一方面，本文包括用於製備治療疾患之藥物，以在有需要之個體中治療，包括給予該個體治療有效量之抗體藥物偶聯物。治療的疾患包括但不限於癌症，包括實體瘤和造血系統惡性腫瘤。這些癌症的例子包括但不限於乳腺癌、胃癌、肺癌(如NSCLC)、頭頸癌、結直腸癌、B細胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤(NHL))和白血病等。
本發明至少部分基於對兩種免疫球蛋白重鏈鉸鏈區序列的應用。通過對IgG1和IgG4免疫球蛋白的Fab C端的鉸鏈區在天然結構位置上的互換，這種不同在生物偶聯反應中改善了藥物負載-抗體之比(PAR)，因為它造成了還原劑對鏈間二硫鍵可及性的差異。
本發明描述了用工程化鉸鏈區、Fab結構域和Fc結構域構建的抗體類型。工程化鉸鏈區肽用天然胺基酸構建，包括用於在兩條重鏈之間形成兩個二硫鍵的半胱氨酸殘基。具體而言，將IgG1和IgG4中的鉸鏈區序列截短、組合，由此獲得保留了兩個二硫鍵的工程抗體鉸鏈區。該工程抗體的Fab結構域可以是IgG1型或IgG4型的，可對Fab結構域進行任意突變，所述突變包括但不限於半胱氨酸突變、非天然胺基酸或肽延伸或插入。並且，Fc結構域可以是IgG1型或IgG4型的，有或沒有突變。
本發明的工程抗體可在用溫和還原劑還原二硫鍵後用於半胱氨酸殘基處的生物偶聯。工程改造的肽改變了鉸鏈區中二硫鍵的還原特性，造成用溫和還原劑(如TCEP或DTT)部分還原時二硫鍵的選擇性還原。如此部分還原的抗體用於偶聯使得具有四個接在特定位點的接頭-藥物負載的偶聯物成為主要產物。本發明中，根據Fab結構域、鉸鏈區和Fc結構域的不同組合，接頭-藥物接在Fab區或者鉸鏈區。某些選定實施例中，具有接在特定位置的四個接頭-藥物負載的偶聯物在產物混合物中占比超過90%。
本文還描述了將所述工程抗體應用於生物偶聯反應的方法。總體偶聯反應包括兩個步驟：部分還原和偶聯。還原劑類型、還原劑/mAb之比、緩衝液成分和pH值、反應溫度和時間會對部分還原和特定位置還原有影響。偶聯條件與目前常用的常規條件基本相同，取決於待要接到抗體上的接頭-藥物負載的性質。理想地，在還原緩衝液中以有機溶劑作為添加劑進行偶聯，以説明溶解接頭-藥物負載。
在一個方面，提供了一種抗原結合性免疫球蛋白G，從N末端至C末端包含人類IgG4型的抗原結合片段Fab，其後是人類IgG1型的修飾鉸鏈區，其後是包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或其組合)的CH2-CH3結構域的恆定區；其中Fab和鉸鏈區的IgG1與IgG4亞類互換改變了還原劑對重鏈-重鏈間二硫鍵相對於重鏈-輕鏈間二硫鍵的天然可及性，引導還原反應和藥物載入偶聯反應優先發生於重鏈間巰基。
在另一個方面，提供了一種抗原結合性免疫球蛋白G，從N末端至C末端包含人類IgG1型的抗原結合片段Fab，其後是人類IgG4型且具有S228P突變以防臂交換的修飾鉸鏈區，其後是包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，或其組合)的CH2-CH3結構域的恆定區；其中Fab和鉸鏈的IgG1與IgG4亞類互換改變了還原劑對重鏈-重鏈間二硫鍵相對於重鏈-輕鏈間二硫鍵的天然可及性，引導還原反應和藥物載入偶聯反應優先發生於重鏈-輕鏈間巰基。
實施方式之一中，互換鉸鏈的CH1-鉸鏈接頭在上鉸鏈區(例如EU編號216-223)有1、2或3-胺基酸的缺失。一些具體實施方式中，鉸鏈區片段選自SEQ ID NO: 1-17。
本文還描述了用馬來醯亞胺基或鹵代乙醯基部分實現的偶聯方法，馬來醯亞胺基或鹵代乙醯基部分能夠與鏈間二硫鍵還原產生的半胱氨酸殘基的巰基進行邁克爾加成反應。
一些實施方式中，可以用溫和還原劑例如TCEP或DTT部分還原鏈間二硫鍵來產生游離巰基。二硫鍵部分還原可在pH約4.0至8.0的緩衝液中進行，還原劑(例如TCEP)/mAb之比約3至10，反應溫度約4 °C至37 °C，反應時間約1至24小時。
某些實施方式中，部分還原的抗體與馬來醯亞胺官能化的接頭-藥物負載之間的偶聯可以在pH範圍約4.0至8.0的緩衝液中進行，其中，有機添加劑(例如有機溶劑或有機助溶劑)約0.0%至20.0%，藥物/mAb之比約7至20，反應溫度約4°C至37°C，偶聯時間約1至4小時。
縮寫 ADC：抗體藥物偶聯物 CH: 重鏈恆定區 CMC：化工、製造與控制 DAR：藥物-抗體之比 DMA：N,N’-二甲基乙醯胺 DTT：1,4-二硫蘇糖醇 EGFR:表皮生長因數受體 Fab：抗原結合片段 Fc：可結晶片段 FDA：食品藥物監管局 FGE：甲醯甘胺酸生成酶 HIC：疏水作用色譜 HPLC:高效液相色譜 IC50:半數最大抑制濃度 IgG：免疫球蛋白G MC：馬來醯亞胺-己醯基 MED：最小有效劑量 MMAE：單甲基澳瑞他汀E MTD：最大耐受劑量 MWCO：截留分子量 NaCl：氯化鈉 NNAA：非天然胺基酸 mTG：微生物轉穀氨醯胺酶 PAB：對氨基苄基 PAR：藥物負載-抗體之比 RP：反相 SEC：排阻色譜 TCEP：三(2-羧基乙基)膦 CH：重鏈可變區 eq：還原劑/mAb摩爾比
方法
抗體的製備
本文中全部抗體分子均進行了灰倉鼠(Cricetulus griseus)密碼子優化，按照標準分子生物學方法合成並選殖(克隆，clone)到自有生產載體中，然後由TOP10大腸桿菌中質粒大抽製得。
轉染前72小時，將CHO K1宿主細胞按2-4E5個細胞/mL接種在CD CHO培養基中。用Vi-CELL計點宿主細胞計算細胞密度，290g離心7分鐘，然後在轉染前重新懸浮於預熱的新鮮CD CHO培養基中。重新懸浮的宿主細胞在Kuhner搖床中培養(36.5°C，75%濕度，6%CO2 ，120 rpm)，直至使用。
將總共4 mg編碼目標抗體的質粒加入重新懸浮的宿主細胞，然後加12 mg聚醚醯亞胺。經轉染的培養物在Kuhner搖床中於36.5°C、75%濕度、6% CO2 、120rpm培養4小時。加入自有補充物後，轉染後的培養物在Kuhner搖床中於31°C、75%濕度、6% CO2 、120rpm培養9-10天。
在收穫日，經轉染的培養物先1,000g離心10分鐘再10,000g離心40分鐘澄清化，然後通過0.22 µm篩檢程式無菌過濾。取上清液用ProA色譜純化並測定力價。ProA洗脫物通過加入1-2%中和緩衝液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和，然後配製在pH 5.5的20 mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中。
偶聯之前所有蛋白質均經過品質控制檢測，包括還原和非還原SDS-PAGE、SEC-HPLC、通過LAL凝塊法(LAL gel clot assay )檢測內毒素水準，並通過質譜進行分子鑒定。
HIC-HPLC
HPLC參數
裝置 Agilent 1260系列HPLC
柱 TSKgel Butyl-NPR, (2.5) 4.6*35, 0014947
柱溫 25 °C
流動相： A: 1.5M (NH4 )2 SO4 , 50mM K2 HPO4 , PH 7.0 B: 50mM K2 HPO4 , 25% IPA, PH 7.0
流速 0.5-0.8 mL/min
進樣溫度 23 °C
進樣量 40-50 µg
檢測波長 280 nm
梯度 時間(min) A% B% 流速(ml/min)
0 100 0 0.5
12 0 100 0.8
17 0 100 0.8
18 100 0 0.8
30 100 0 0.8
SEC-HPLC
HPLC參數
裝置 Agilent 1260系列HPLC
柱 TSKgel G3000SWXL ((5) 7.8*300)
柱溫 25 °C
流動相 A: 200mM KPi, 250mM KCl, 15% IPA, PH 7.0
流速 0.75 mL/min
進樣溫度 4 °C
進樣量 50ug
檢測波長 280nm, 252 nm, 248nm
梯度 時間(min) A% B%
0 100 0
18 100 0
RP-HPLC測藥物加載
過程：將20ul的ADC樣品與75ul 8M 鹽酸胍和5ul Tris-HCl、pH 8.0混合。向混合物中加入1ul的0.5M TCEP溶液。37 °C反應30分鐘(min)，然後用RP-HPLC測定抗體上的藥物載入。
HPLC參數
裝置 Agilent 1260系列HPLC
柱 Agilent, PLRP-S 2.1 × 150mm, 8μm或與之相當
柱加熱溫度 80 °C
流動相 A: 0.05% (v/v) 的TFA水溶液 B: 0.05% (v/v)的TFA乙腈溶液
流速 0.8 mL/min
進樣量 20 µl
檢測波長 280nm
梯度編排： 時間(min) %A %B
0 75 25
3 75 25
28 50 50
30 5 95
32 5 95
33 75 25
40 75 25
RP-HPLC測定游離藥物
過程：85ul ADC溶液與15ul DMA混合，然後用100ul沉澱緩衝液(NaCl飽和的37.5% v/v甲醇/乙腈溶液)沉澱蛋白質，22 °C以1400rpm漩渦攪拌10分鐘(min)。
樣品以16000rpf離心10分鐘。取上清液與標準樣品一起進行RP-HPLC檢測以測定游離藥物。
HPLC參數
裝置 Agilent 1260系列HPLC
柱 Agilent poroshell 120SB-C18 2.7um, 4.6*100mm
柱溫 40 °C
流動相 A: 0.05% (v/v) 的TFA水溶液 B: 0.05% (v/v)的TFA乙腈溶液
流速 0.6ml/min
進樣溫度 10 °C
進樣量 40ul
檢測波長 248nm
梯度 時間(min) A% B%
0 55 45
1 55 45
11 30 70
12.5 5 95
14 5 95
14.1 55 45
16 55 45
實施例
實施例1
一般偶聯方法
向pH 4.0-8.0緩衝液例如組氨酸-乙酸鹽儲液中濃度為1mg/ml至20mg/ml的抗體溶液加入1至20 eq(例如，有些實施方式中是3-10eq)的還原劑例如TCEP或DTT。在4-37 °C溫和振盪或攪拌反應0.5至24小時。不純化，將有機助溶劑(例如DMA)添加到部分還原的抗體中至濃度為0%至20%，馬來醯亞胺或鹵代乙醯基官能化的接頭-藥物負載當量為7-20eq在4-37 °C伴隨溫和振盪或攪拌進行偶聯反應0.5至4小時。最終的偶聯產物鑒定包括UV-vis測濃度，HIC-HPLC測偶聯物分佈和DAR，RP-HPLC測輕鏈上和重鏈上的藥物載入以及游離藥物殘留，SEC-HPLC測凝聚和純度，動力學比濁法測內毒素水準。
本文中全部抗體分子均進行了灰倉鼠(Cricetulus griseus)密碼子優化，按照標準分子生物學方法合成並選殖到自有生產載體中，然後由TOP10大腸桿菌中質粒大抽製得。
轉染前72小時，將CHO K1宿主細胞按2-4E5個細胞/mL接種在CD CHO培養基中。用Vi-CELL計點宿主細胞計算細胞密度，290g離心7分鐘，然後在轉染前重新懸浮於預熱的新鮮CD CHO培養基中。重新懸浮的宿主細胞在Kuhner搖床中培養(36.5°C，75%濕度，6%CO2 ，120 rpm)，直至使用。
將總共4 mg編碼目標抗體的質粒加入重新懸浮的宿主細胞，然後加12 mg聚醚醯亞胺。經轉染的培養物在Kuhner搖床中於36.5°C、75%濕度、6% CO2 、120rpm培養4小時。加入自有補充物後，經轉染的培養物在Kuhner搖床中於31°C、75%濕度、6% CO2 、120rpm培養9-10天。
在收穫日，經轉染的培養物先1,000g離心10分鐘再10,000g離心40分鐘澄清化，然後通過0.22 µm篩檢程式無菌過濾。取上清液用ProA色譜純化並測定力價。ProA洗脫物通過加入1-2%中和緩衝液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和，然後配製在pH 5.5的20 mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中。
偶聯之前所有蛋白質均經過品質控制檢測，包括還原和非還原SDS-PAGE、SEC-HPLC、通過LAL凝塊法(LAL gel clot assay )檢測內毒素水準，並通過質譜進行分子鑒定。
如前所述製備無亞型互換的IgG1抗體和IgG4抗體。所述IgG1抗體具有序列為EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 18)的鉸鏈區序列，所述IgG4抗體具有序列為ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 19)的鉸鏈區序列。將兩抗體各自溶於含50mM NaCl、2mM EDTA、pH 7.0的磷酸緩衝液(PB)和含50mM NaCl、2mM EDTA、pH 6.5的PB緩衝液，抗體濃度均為8.0 mg/ml。對於IgG1抗體，加入2.7eq的TCEP，混合物在37 °C培養2小時。對於IgG4抗體，加入4.1 eq的TCEP，混合物在37 °C培養24小時。
然後，在各混合物中，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後分別加入7 eq (對IgG1)和9 eq (對IgG4)的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。用40KD MWCO脫鹽柱純化偶聯產物，於pH 5.5的20 mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分別的HIC-HPLC進行終產物特徵鑒定(第1圖)。
實施例2
將抗體886-5 (IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1))溶於含150mM NaCl、pH 6.0的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為7.0 mg/ml。向抗體溶液中加入3.5 eq的TCEP，混合物於15 °C培養18小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈來進行最終產物特徵鑒定(第2圖)。
實施例3
將抗體886-5 (IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1))溶於pH 6.0的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為7.0 mg/ml。向抗體溶液中加入3.3 eq的TCEP，混合物於15 °C培養18小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-5 3.3/15°C 6.9 18.6 57.6 3.5 13.4 4.0
實施例4
將抗體886-5 (IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 1))溶於pH 8.0的HEPES，抗體濃度為5.7 mg/ml。向抗體溶液中加入2.6 eq的TCEP，混合物於15 °C培養16小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-5 2.6/15°C 7.5 19.2 57.8 1.2 14.3 3.9
實施例5
將抗體886-8 (IgG1-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為4mg/ml。向抗體溶液中加入7eq的TCEP，混合物於4 °C培養3小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入12eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在22°C進行0.5小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈來進行最終產物特徵鑒定(第3圖)。
實施例6
將抗體886-13 (IgG1-Fab，IgG1-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為4.0mg/ml。向抗體溶液中加入4.4eq的TCEP，混合物於10 °C培養3小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入10eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈來進行最終產物特徵鑒定(第4圖)。
實施例7
將抗體886-29 (IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為EPKDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 3))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為7.8mg/ml。向抗體溶液中加入6.0 eq的TCEP，混合物於37 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈來進行最終產物特徵鑒定(第5圖)。
實施例8
將抗體886-34 (IgG1-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPTCPPCP (SEQ ID NO: 10))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為6.2mg/ml。向抗體溶液中加入5.0 eq的TCEP，混合物於4 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4 °C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈來進行最終產物特徵鑒定(第6圖)。
實施例9
將抗Her2抗體886-16 (IgG1-Fab，IgG4-Fc；鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)；輕鏈(LC)序列：SEQ ID NO: 20，重鏈(HC)序列：SEQ ID NO: 21)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為9.2mg/ml。向抗體溶液中加入5eq的TCEP，混合物於4 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4 °C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第7圖)。
實施例10
將抗Her2抗體886-19 (IgG1-Fab，IgG1-Fc；鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)；LC序列：SEQ ID NO: 26，HC序列：SEQ ID NO: 27)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為7.7mg/ml。向抗體溶液中加入3eq的TCEP，混合物於4 °C培養3小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第8圖)。
實施例11
將抗CD20抗體886-17 (IgG1-Fab，IgG4-Fc；鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)；LC序列：SEQ ID NO: 22，HC序列：SEQ ID NO: 23)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為8.9mg/ml。向抗體溶液中加入5eq的TCEP，混合物於4 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第9圖)。
實施例12
將抗CD20抗體886-20 (IgG1-Fab，IgG1-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)，LC序列：SEQ ID NO: 28，HC序列：SEQ ID NO: 29)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽，抗體濃度為7.2mg/ml。向抗體溶液中加入3eq的TCEP，混合物於4 °C培養3小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第10圖)。
實施例13
將抗EGFR抗體886-18 (IgG1-Fab，IgG4-Fc；鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)；LC序列：SEQ ID NO: 24，HC序列：SEQ ID NO: 25)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽，抗體濃度為7.5mg/ml。向抗體溶液中加入5eq的TCEP，混合物於4 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4 °C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第11圖)。
實施例14
將抗EGFR抗體886-21 (IgG1-Fab，IgG1-Fc；鉸鏈區序列為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 5)；LC序列：SEQ ID NO: 30，HC序列：SEQ ID NO: 31)溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽，抗體濃度為7.0mg/ml。向抗體溶液中加入3eq的TCEP，混合物於4 °C培養3小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4 °C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。進行最終產物特徵鑒定，包括HIC-HPLC測定DAR和藥物分佈，SEC-HPLC測定純度和凝聚物水準，RP-HPLC測定藥物載入，RP-HPLC測定游離藥物殘留和動態比濁法測定內毒素水準(第12圖)。
實施例15
將抗體886-28 (IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為EPKSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 2))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度為7.2mg/ml。向抗體溶液中加入6.0 eq的TCEP，混合物於37 °C培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-28 6/37°C 6.8 10.6 75.1 0.0 7.4 3.8
實施例16
將抗體886-22 (IgG1-Fab，IgG1-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCDKTPPCPPCP (SEQ ID NO: 12))、抗體886-23(IgG1-Fab，IgG1-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCDKTHPCPPCP (SEQ ID NO: 13))和抗體886-24(IgG1-Fab，IgG1-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCDKTPTCPPCP (SEQ ID NO: 14))溶於pH 5.5的20mM 組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度分別為6.9mg/ml，7.8mg/ml和7.8mg/ml。向各抗體溶液中加入TCEP，TCEP/抗體之比分別為5.2、3.2和4.6。混合物在下表所示溫度(T)培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-22 5.2/37 °C 2.1 20.8 56.9 15.2 5.0 4.0
886-23 3.2/37 °C 4.2 20.6 44.4 24.1 6.7 4.2
886-24 4.6/37 °C 3.6 24.1 49.9 14.8 7.6 4.0
實施例17
將抗體886-25(IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為ESKYGHTCPPCP (SEQ ID NO: 15))、抗體886-26(IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為ESKYGHPCPPCP (SEQ ID NO: 16))和抗體886-27(IgG4-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為ESKYGPTCPPCP (SEQ ID NO: 17))溶於pH5.5的20mM 組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度分別為4.8mg/ml，7.2mg/ml和7.5mg/ml。向各抗體溶液中加入TCEP，TCEP/抗體之比分別為3.5、4.0和5.5。混合物在下表所示溫度(T)培養16小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4 °C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-25 3.5/37 °C 8.4 18.4 57.2 3.2 12.8 3.9
886-26 4.0/37 °C 7.5 14.7 59.8 3.1 14.9 4.1
886-27 5.5/37 °C 11.0 15.7 52.0 2.4 19.1 4.1
實施例18
將抗體886-32 (IgG1-Fab，IgG4-Fc鉸鏈區序列為EPKSCSKYGHTCPPCP (SEQ ID NO: 8))和抗體886-33 (IgG1-Fab，IgG4-Fc，鉸鏈區序列為EPKSCSKYGHPCPPCP (SEQ ID NO: 9))溶於pH 5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液，抗體濃度分別為9.5mg/ml和7.5mg/ml。向各抗體溶液中加入TCEP，TCEP/抗體之比分別為1.5和2.0。混合物在下表所示溫度(T)培養2小時。然後，向還原抗體中加入DMA至濃度為10%，然後加入7eq的MC-vc-PAB-MMAE。偶聯反應在4°C進行1小時。偶聯產物用40KD MWCO脫鹽柱純化，於pH5.5的20mM組氨酸-乙酸鹽緩衝液中保存。用測定DAR和藥物分佈的HIC-HPLC進行最終產物特徵鑒定。結果如下所示：
mAb TCEP比/T D0 D2 D4 D6 D8 DAR
886-32 1.5/4 °C 1.3 13.9 73.4 8.1 3.3 4.0
886-33 2.0/4 °C 1.5 13.4 76.5 5.0 3.6 3.9
實施例19
體外(in vitro)細胞毒性實驗：測試了靶向Her2、CD20和EGFR的抗體藥物偶聯物分別對HCC1954細胞，Raji細胞和HCC827細胞的細胞毒性。三種細胞系均培養在補充了10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。將HCC1954細胞按4000個細胞/孔接種在96孔板中，Raji細胞按10000個細胞/孔接種在96孔板中，HCC827細胞按3000個細胞/孔接種在96孔板中。細胞鋪板結束後即用ADC處理Raji細胞，鋪板結束後24小時用ADC處理HCC1954和HCC827細胞。37 °C下ADC處理4天後分析Raji細胞的活力，37 °C下ADC處理5天後分析HCC1954細胞和HCC827細胞的活力。計算抑制百分比和最大抑制百分比(第13圖)。
實施例20
雄性SD大鼠籠養至給藥時體重約330g。單次靜脈內給予10mg/kg曲妥珠單抗(Trastuzumab)-MMAE、886-16-MMAE和886-19-MMAE，設重複組，然後分別在5分鐘、6小時、24小時、48小時、72小時、144小時和312小時採集大鼠血漿。
用ELISA法測定不同時間點採集的血漿中的總抗體濃度：將96孔板用1ug/mL濃度的重組人類ErbB2(HER2)包被，4°C，24小時。然後37°C下用pH7.2、含2%BSA的PBS封閉1小時。用清洗緩衝液(含0.05%吐溫Tween20的PBS，pH7.2)洗板3次，然後將不同稀釋度的樣品與經包被的96孔板培養，將血漿濃度歸一化至0.1%。用0.1%血漿稀釋的ADC制做濃度範圍1ng/ml至1500ng/ml的標準曲線。37°C培養1小時後用清洗緩衝液清洗3次，然後加入山羊抗人類IgG(Fc特異性)抗體-過氧化物酶，37°C反應1小時。清洗3次後，向各孔加入TMB，培養5分鐘後用0.5M H2 SO4 終止反應。測定450nm吸光度，並用標準曲線計算總抗體的濃度。
用ELISA法測定不同時間點採集的血漿中的(ADC)偶聯抗體濃度：將96孔板用1ug/mL濃度的重組人類ErbB2(HER2)包被，4°C，24小時。然後37°C下用pH7.2、含2%BSA的PBS封閉1小時。用清洗緩衝液(含0.05%吐溫Tween20的PBS，pH7.2)洗板3次，然後將不同稀釋度的樣品與經包被的96孔板培養，將血漿濃度歸一化至0.1%。用0.1%血漿稀釋的ADC制做濃度範圍0.05ng/ml至200ng/ml的標準曲線。37°C培養1小時後用清洗緩衝液清洗3次，然後加入小鼠抗vc-PAB-MMAE抗體，37°C培養1小時。用清洗緩衝液清洗3次，加入抗小鼠IgG (Fc特異性)抗體-過氧化物酶，然後37°C反應1小時。洗板3次後向各孔加入TMB，培養5分鐘後用0.5M H2 SO4 終止反應。測定450nm吸光度，並用標準曲線計算偶聯抗體的濃度。
第14圖中，分別用虛線和實線表示總抗體和(ADC)偶聯抗體的清除情況。虛線顯示，總抗體血漿濃度隨時間降低。實線顯示，(ADC)偶聯抗體血漿濃度隨時間降低。虛線顯示，三個ADC的總抗體清除率相近。實線顯示，與曲妥珠單抗-MMAE相比，886-16-MMAE和886-19-MMAE的清除較慢。
無
以下所述附圖屬於說明書的一部分，包括於此用以進一步說明本文某些方面的內容。參照這些附圖中的一幅或者多幅並結合具體實施方式的詳細描述可更好地理解本發明。 第1圖顯示IgG1和IgG4的結構，以及用IgG1和IgG4抗體經部分還原並經游離巰基與MC-vc-PAB-MMAE偶聯反應所得偶聯抗體藥物偶聯物的HIC-HPLC結果。 第2圖顯示抗體886-5的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC結果。通過對鉸鏈區的工程改造，用基於IgG4的該抗體製得的ADC其均質性顯著改進。 第3圖顯示抗體886-8的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC結果。通過對鉸鏈區的工程改造並將IgG1-Fab與IgG4-Fc組合，用該抗體製得的ADC均質性顯著改善。 第4圖顯示抗體886-13的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC結果。通過對鉸鏈區的工程改造，用基於IgG1的該抗體製得的ADC其均質性顯著改進。 第5圖顯示抗體886-29的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC結果。通過對鉸鏈區的工程改造，用基於IgG4的該抗體製得的ADC其均質性顯著改進。 第6圖顯示抗體886-34的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC結果。通過對鉸鏈區的工程改造，用該抗體製得的ADC均質性顯著改進。 第7圖顯示抗體886-16的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-16-MMAE的特徵鑒定顯示886-16-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第8圖顯示抗體886-19的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-19-MMAE的特徵鑒定顯示886-19-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第9圖顯示抗體886-17的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-17-MMAE的特徵鑒定顯示886-17-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第10圖顯示抗體886-20的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-20-MMAE的特徵鑒定顯示886-20-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第11圖顯示抗體886-18的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-18-MMAE的特徵鑒定顯示886-18-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第12圖顯示抗體886-21的結構，以及與MC-vc-PAB-MMAE偶聯後的HIC-HPLC和PLRP-HPLC結果。對886-21-MMAE的特徵鑒定顯示886-21-MMAE能夠用於體外(in vitro)和體內(in vivo)研究。 第13圖顯示偶聯MMAE的ADC對HCC1954細胞、HCC827細胞和Raji細胞的細胞毒性。各ADC的IC50 值顯示，偶聯MMAE的各ADC對細胞生長有強抑制。 第14圖顯示886-16-MMAE和886-19-MMAE與曲妥珠單抗-MMAE在大鼠中的藥代動力學特徵比較。分別用虛線和實線表示血漿中總抗體和偶聯抗體(ADC)的清除速率。
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Claims (26)

  1. 一種多肽複合物，該多肽複合物從N末端至C末端包含一Fab結構域以及與之操作性連接的一鉸鏈區，其中，該Fab結構域或其部分和該鉸鏈區或其部分源自不同的IgG亞型或其部分。
  2. 如請求項1所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型鉸鏈區或其部分。
  3. 如請求項2所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分是人類IgG1或IgG4型鉸鏈區或其部分。
  4. 如請求項1所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區包含以下式(I)所示的序列： X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 CPPCP                      (I) 其中，X1 = 無或E；X2 = 無或P；X3 = 無或K；X4 = 無或S或E；X5 = 無或C或S，優選無；X6 = D或K；X7 = K或Y；X8 = T或G；和/或，X9 X10 = HT、HP、PT或PP，優選PT或PP。
  5. 如請求項1所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區包含以下式(II)所示的序列： EPKx1 C x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 CPPCP                       (II) 其中，x1 = 無或S；x2 = 無或E或S，優選無；x3 = 無或S或C；x4 = 無或K或D；x5 = Y或K；x6 = G或T；和/或x7 x8 = PP、PT、HP或HT。
  6. 如請求項3所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分是人類IgG1型鉸鏈區或其部分。
  7. 如請求項6所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 1)所示的序列或其片段；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  8. 如請求項7所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為EPKSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 2)或EPKDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 3)所示的序列；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  9. 如請求項6所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為SEQ ID NOs: 12至14中任一項所示的序列；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  10. 如請求項3所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分是人類IgG4型鉸鏈區或其部分。
  11. 如請求項10所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為EPKSCESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO: 4)所示的序列或其片段；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  12. 如請求項11所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為EPKSCSKYGPPCPPCP (SEQ ID No. 5)、或EPKSCKYGPPCPPCP (SEQ ID No. 6)、或EPKSCYGPPCPPCP (SEQ ID No. 7)、或EPKSCSKYGHTCPPCP (SEQ ID No. 8)、或EPKSCSKYGHPCPPCP (SEQ ID No. 9)、或EPKSCSKYGPTCPPCP (SEQ ID No. 10)所示的序列；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  13. 如請求項5所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為SEQ ID NO: 11所示的序列；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  14. 如請求項10所述的多肽複合物，其中，該鉸鏈區或其部分包含： (a)，為SEQ ID NO: 15至17中任一項所示的序列；或者 (b)，為與(a)至少85%相同的序列；或者 (c)，為(a)或(b)的一變體，該變體具有一個或多個突變，該突變選自插入、缺失和取代，或者該變體包含一個或多個非天然胺基酸殘基。
  15. 如請求項1所述的多肽複合物，其中該多肽複合物更包含與該鉸鏈區操作性相連的一Fc多肽，或者，該多肽複合物更包含與該鉸鏈區操作性相連的一其他多肽。
  16. 如請求項15所述的多肽複合物，其中該Fc多肽是人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型Fc多肽。
  17. 如請求項15或16所述的多肽複合物，該Fc多肽是人類IgG1或IgG4型Fc多肽。
  18. 一種抗體藥物偶聯物，包含如請求項1至17中任一項所述的多肽複合物。
  19. 一種藥物組合物，包含如請求項18所述的抗體藥物偶聯物和藥學上可接受的運載體或賦形劑。
  20. 一種試劑盒，包含如請求項1至請求項17中任一項所述的多肽複合物、或請求項18所述的抗體藥物偶聯物、或請求項19所述的藥物組合物。
  21. 一種製備請求項18所述抗體藥物偶聯物的方法，該方法包括： 提供如請求項1至17中任一項所述的多肽複合物；以及 使馬來醯亞胺基或鹵代乙醯基部分與鏈間二硫鍵還原產生的半胱氨酸殘基上的一游離巰基進行邁克爾加成反應。
  22. 如請求項21所述的方法，其中，該游離巰基是用溫和還原劑例如TCEP或DTT部分還原鏈間二硫鍵產生的；優選地，該部分還原反應在pH 4.0至8.0的緩衝液中進行，還原劑/mAb之比為3至10，反應溫度為4°C至37°C，反應時間為1至24小時。
  23. 如請求項22所述的方法，其中，該部分還原反應的TCEP/mAb之比為3至10。
  24. 如請求項22所述的方法，其中，偶聯反應在pH 4.0至8.0的緩衝液中進行，有機添加劑按重量百分比計為0.0%至20.0%，藥物/mAb之比為7至20，反應溫度為4°C至37°C，反應時間為1至4小時。
  25. 一種如請求項1至17中任一項所述多肽複合物用於製造藥用偶聯物的用途。
  26. 一種為有需要的物件治療疾患的方法，包括給予所述物件治療有效量的請求項18所述抗體藥物偶聯物。
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