CN111650267B - 一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法 - Google Patents

一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，该方法包括配制蛋白质溶液，共轭芳香分子溶液，芳香共轭分子–蛋白质分子复合物的制备，蛋白质分子，芳香共轭共轭分子–蛋白质分子的固定，建立掺杂固定后共轭芳香分子–蛋白质复合物的构象，掺杂芳香共轭分子调节蛋白质电子传输的电流电压电化学曲线的建立，掺杂芳香共轭分子调节蛋白质电子传输带隙的微分电导曲线的建立。本发明方法实现了维持蛋白质构象稳定，保持蛋白质本身构象不发生变化，调节电子传输带隙，是一种简单、普适的方法用于调控蛋白质分子的电子传输性能及其带隙大小，为开发新型生物电子器件及探索它们新的应用领域提供重要理论基础。

Description

一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子 传输带隙的方法
技术领域
本发明属于生物电分析化学领域，涉及到一种掺杂系列共轭芳香分子调节蛋白质的带隙的方法，具体涉及一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法。
背景技术
生物电子器件的研究与应用已成为世界生物技术发展的研究热点，成为医药学，化学，生物物理学及工程技术领域等新型高科技产业的重要组成部分。随着电子传输材料的开发与应用，基于蛋白质分子的生物电子器件的研制与开发已引起广泛的专注，已成为生物电子技术领域的研究热点，这是由于蛋白质分子本身的尺寸很小(为纳米级)，因而可将制备的电子器件微型化至纳米级尺寸，这样可降低器件的能耗和提高器件的响应速率，这些特性对于提升电子器件的性能至关重要。蛋白质分子已被广泛用于多种类型生物电子器件的设计和研制，如生物传感器、生物分子电路以及生物燃料电池等。这些基于蛋白质分子电子器件的性能主要受蛋白质分子电子传输(ETp)能力的影响，很大程度上取决于它的带隙大小，即导带(CB)与价带(VB)之间的能量差。因此为了进一步增强蛋白质分子电子器件的性能并扩展其应用领域，有必要对蛋白质分子电子传输带隙进行适当调控。目前急需一种简单普适可行方法调节蛋白质的带隙。
发明内容
发明目的：针对现有存在的调节蛋白质电子传输的技术的问题，如需要改变蛋白质分子的构象、重组蛋白质的中心组成，导致不能维持其原有构象，得到的电子传输性能不能真正反映原有蛋白质分子的特性，并且步骤十分复杂。本发明提供一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节电子传输带隙的方法，即一种掺杂共轭芳香分子调节蛋白质电子传输带隙的方法，该方法可以保持蛋白质本身构象不发生变化，调节电子传输带隙。本发明的方法能进一步拓展到对其它的蛋白质分子的掺杂(包括牛血清白蛋白、细胞色素c、血红蛋白或天青蛋白等)，有望成为一种简单、普适的方法用于调控蛋白质分子的电子传输性能及调控其带隙大小到适当的范围，并且实验方法简单，易于操作，为构建新型生物电子器件提供了理论基础和指导。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节电子传输带隙的方法，包括如下步骤：
(1)配制蛋白质溶液：称取蛋白质溶于磷酸缓冲溶液搅拌得到蛋白质溶液；
(2)配制共轭芳香分子溶液：称取共轭芳香分子溶于二甲基亚砜有机溶剂，再加入磷酸盐缓冲溶液得到共轭芳香分子溶液；
(3)制备共轭芳香分子-蛋白质复合物：将配制好的蛋白质溶液和共轭芳香分子溶液混合，搅拌，待反应完全；
(4)蛋白质，共轭芳香分子-蛋白质复合物的固定：将修饰3-氨基丙基三甲氧基硅烷的硅片分别与蛋白质，共轭芳香分子–蛋白质进行孵育，孵育后淋洗，干燥，分别形成硅片表面固定的层状蛋白质，和硅片表面固定的层状共轭芳香分子–蛋白质复合物；所述复合物包括如菲-牛血清白蛋白、芘-牛血清白蛋白、苝-牛血清白蛋白、氨基芘-牛血清白蛋白、溴基芘-牛血清白蛋白及羟基芘-牛血清白蛋白等，分别对应名称：P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA复合物；
(5)建立掺杂固定后共轭芳香分子–蛋白质复合物的构象方法：检测步骤(4)中得到的硅片表面固定的层状蛋白质分子和硅片表面固定的层状共轭芳香分子–蛋白质复合物，检测固定后蛋白质分子和固定后共轭芳香分子-蛋白质复合物的构象变化；
(6)建立检测电子传输的电流-电压曲线：室温下，以滴汞电极作为顶部电极，通过电化学工作站采用两电极系统记录电流-电压响应，测量固定蛋白样品：硅片表面固定的层状蛋白质分子的电流-电压曲线，测量制备固定复合物样品：硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物的电流-电压曲线，并进行对比；
(7)建立检测电子传输能级的微分电导曲线：室温下，分别对步骤5所测定的固定蛋白质样品，固定复合物进行微分处理得到微分电导曲线，并进行对比。
其中，步骤(1)所使用的蛋白质为牛血清白蛋白、细胞色素c、血红蛋白或天青蛋白，溶其于磷酸缓冲溶液后的浓度为5～6μM。
其中，步骤(2)所述共轭芳香分子包括菲，芘，苝，氨基芘、溴芘或羟基芘，(即P1、P2、P3、AP、BP、HP)，所配制的共轭芳香分子溶液中菲，芘，苝，羟基芘，溴芘，氨基芘的物质的量浓度为2×10-4～4×10-4M。
作为优选，步骤(2)共轭芳香分子的制备是先溶于二甲基亚砜溶剂，超声完全溶解后，再加入PBS缓冲溶液，再次超声至溶液完全均一稳定。进一步地，完全溶解的六种芳香共轭分子需要避光保存。
其中，步骤(3)所述的搅拌为磁力搅拌，反应时需要室温条件下缓慢搅拌时间4～6h。
作为优选，步骤(4)所述硅片先进行预处理再修饰3-氨基丙基三甲氧基硅烷，具体为：用有机溶剂乙酸乙酯，丙酮，乙醇依次50W超声3-5min，处理后放入加热的水虎鱼溶液80℃水浴加热30min，洗涤，氟化氢刻蚀90～100s，水虎鱼再次洗涤5～8s，去离子水洗涤，干燥；置入3-氨基丙基三甲氧基硅烷中反应过夜，甲醇50W超声淋洗3～5min，去离子水洗涤，干燥；所述干燥都是在氮气流下干燥完全。
作为优选，步骤(4)所述硅片分别与蛋白质，共轭芳香分子–蛋白质室温条件下进行孵育6～8h。
其中，步骤(5)所述构象变化的检测为通过圆二色光谱测量构象，选择-208nm，-222nm为位置信号作为研究对象，波长扫描范围为185–280nm，光谱带宽为1nm，扫描步长为1nm，以120nm/min的扫描速率分别测量收集光谱。
其中，步骤(6)所述电流电压曲线的电压范围设置为-2.5～+2.5V。
本发明所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节电子传输带隙的方法在构建新型生物电子器件中的应用。本发明中采用的共轭芳香分子具有良好的热稳定性，高的亲和能，有利于电子的传输和注入，共轭芳香分子掺杂蛋白质可以在保证蛋白质构象不变的条件下，调节电子传输带隙，为研究与开发新型生物电子器件及探索它们新的应用领域提供重要理论基础。本发明对比传统调节电子传输带隙的方法，本发明一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节电子传输带隙的方法，不仅方法简单，可行对于大部分蛋白质都可进行并能保持构象不发生变化，通过选择不同的掺杂分子能使蛋白质分子的带隙调控至所需要的范围，并且形成的蛋白质复合物还能用于各种电子器件的制作，不需要像传统调节蛋白质电子传输带隙的方法那样，如改变蛋白质分子的构象、重组蛋白质的中心组成，而不能维持其原有构象，得到的电子传输性能不能反映原有蛋白质分子的特性，并且步骤十分复杂。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过共轭芳香分子对蛋白质进行掺杂，掺杂芳香共轭分子调节蛋白质的电子传输带隙的方法实现了维持蛋白质构象稳定，该方法可以保持蛋白质本身构象不发生变化，调节蛋白质的电子传输带隙，同时掺杂芳香共轭分子调节蛋白质建立的电化学曲线方法，简便，高效，快速，灵敏调节蛋白质带隙，可为研究与开发新型生物电子器件及探索它们新的应用领域等提供重要理论基础。
具有包括如下的优点：
1、本发明采用芳香分子掺杂蛋白质的方法改变电子传输带隙与改变蛋白质分子的构象这一普通方法相比，本发明使用的方法可以保持蛋白质构象稳定，蛋白质的构象不发生改变。
2、本发明采用芳香分子掺杂蛋白质的方法改变电子传输带隙与重组蛋白质分子的中心这一普通方法相比，本发明所使用的方法步骤简单，从实验的角度易于操作。
3、本发明所采用的芳香共轭分子与其他普通分子相比，芳香共轭分子具有良好的热稳定性，高的亲和能，有利于电子的传输和注入，更适用于用作掺杂分子优选材料。
4、本发明所使用的蛋白质分子为牛血清白蛋白分子(BSA)，该种牛血清白蛋白与其他复杂蛋白质相比是血浆中最丰富的单纯蛋白质，易于获取，组分和氨基酸序列结构最早被明确。
5、本发明所使用的系列芳香共轭分子掺杂蛋白质调节电子传输带隙建立的电化学曲线方法简便，快速，高效，灵敏。
6、本发明的方法能进一步拓展到对其它的蛋白质分子的掺杂(如细胞色素c、血红蛋白或天青蛋白等)，成为一种简单、普适的方法用于调控蛋白质分子的电子传输性能及其带隙大小，通过选择适当的掺杂分子，能使蛋白质电子传输性能得到改变，且能使其电子传输带隙的大小调控到适当的范围。
附图说明
图1为本发明中修饰硅片，固定的六种不同复合物的原子力显微图；
图2为本发明中蛋白质及芳香共轭分子掺杂蛋白质的圆二色谱图；
图3为本发明中蛋白质及芳香共轭分子掺杂蛋白质电子传输曲线；
图4为本发明中蛋白质及芳香共轭分子掺杂蛋白质的电子传输微分电导曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、蛋白质溶液的制备
称取0.02g的牛血清白蛋白溶于60mL 10mM的磷酸盐缓冲溶液中，缓慢搅拌5min至完全溶解，牛血清白蛋白的最终浓度为5μM，至于4℃冰箱保存。
2、芳香共轭分子的制备
分别称取0.0053g，0.0076g，0061g，0.0065g，0.0084g，0.0065g的菲，苝，芘，氨基芘，溴芘，羟基芘，先用1mL的二甲基亚砜溶解，超声至完全溶解，随后加入PBS(10mM,pH7.4)定容至100mL，再次超声至溶液完全溶解均匀，得到芳香共轭分子溶液，共轭分子的浓度均为300μM。避光条件下保存。
3、芳香共轭分子–蛋白质分子复合物的制备
制备芳香共轭分子–蛋白质复合物的具体方法是：同样地，按上述配制的300μM的菲，苝，芘，氨基芘，溴芘，羟基芘共轭分子溶液。按照物质的量浓度比为1:1的比例，分别取6mL的蛋白质溶液与100μL的菲，苝，芘，氨基芘，溴芘和羟基芘溶液分别混合，磁力反应搅拌6h(200rpm)，P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA复合物均形成。
实施例2
基于修饰硅基底的蛋白质，芳香共轭分子，芳香共轭分子–蛋白质的固定
1、基于3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰硅基底的构建
首先将硅片(半抛光111面，长宽为4cm×1cm，厚度约为380μm，电阻率小于0.005Ωcm)，分别用乙酸乙酯，丙酮，乙醇50W超声三分钟，随后放入水虎鱼溶液中80℃水浴加热30min，冷却至室温，去离子水洗涤1min，氢氟酸刻蚀90s，再用水虎鱼溶液洗涤8s，再用去离子水洗涤，氮气流干燥。将处理好的光滑硅片置入40mL体积比为10％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液反应过夜，后用甲醇50W超声3分钟，去离子水洗涤30分钟，最后在氮气流下干燥完全。备用。
2、蛋白质分子，芳香共轭共轭分子–蛋白质分子的固定
将第一步中处理好的硅片分别置入实施例1中制备好的蛋白质分子溶液，芳香共轭共轭分子–蛋白质4mL室温孵育6h，依次用PBS(pH 7.4)，去离子水淋洗，淋洗至表面光滑，氮气流干燥，分别形成硅片表面固定的层状蛋白质分子，硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物(如图1所示，A-F为P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA的原子力显微图，G-H为Si基底和修饰3-氨基丙基三甲氧基硅烷的原子力图)，图1说明了所有的硅片基底上均形成了一层致密的蛋白质分子层，并且分子层的排布是相对整齐规则的，表明蛋白质及复合物固定到硅片上。
实施例3
掺杂固定后共轭芳香分子–蛋白质复合物的构象评价
通过圆二色光谱仪检测实施例2制备的硅片表面固定的层状蛋白质分子，硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物的构象变化；其中圆二色光谱将温度控制在25℃的范围内，精度为±0.1℃。测量前对空气进行扫描校正，对pH为7.4的PBS缓冲溶液进行基线扫描。使用1cm路径长度的比色皿，波长扫描范围为185–280nm，光谱带宽为1nm，扫描步长为1nm，以120nm/min的扫描速率分别测量收集,选取处-208nm，-222nm为位置信号作为研究对象。收集固定在硅片表面的BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的圆二色光谱，如图2所示(BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的圆二色光谱)，结果表明天然蛋白质的α-helix含量为67％，这也与之前文献报道的一致(E.Beilis,B.Belgorodsky,L.Fadeev,H.Cohen and S.Richter,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,6151.)。与天然蛋白质相比，掺杂共轭分子后，其α-helix的含量仍然维持在65.5％、65.9％、65.5％、65.6％、65.0％、65.2％，基本维持不变，六种共轭分子与蛋白质掺杂固定后其构象基本不发生变化。说明本发明蛋白质掺杂共轭分子这种方法可以维持蛋白质构象。
实施例4
建立掺杂芳香共轭分子调节蛋白质电子传输的电流电压(I-V)电化学曲线
通过电流电压响应来评价掺杂共轭分子蛋白质电子传输。电流-电压曲线是在室温下Autolab电化学站使用双电极测量所得的，其中使用受控生长的悬挂汞滴作为顶部电极，电压测量范围为-2.5～+2.5V，分别测量实施例2中硅片表面固定的层状蛋白质分子，硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物体系的电流电压响应，测量其电流-电压曲线。实验结果表明，与原始天然蛋白质相比，如图3(A为BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的的电流-电压响应，B为BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的电流电压半对数图)，图中表明与硅片表面固定的蛋白质分子相比，硅片表面固定的共轭芳香分子-蛋白质复合物的电流均增大，即掺杂共轭分子蛋白质复合物的电流密度明显增加，并且共轭程度越大，电流密度越大，电子传输速率越快。说明本发明这种系列掺杂芳香共轭分子可保持蛋白质构象不变的条件下，提高电子传输速率。
实施例5
建立掺杂芳香共轭分子调节蛋白质电子传输带隙的dI/dV–V曲线
通过dI/dV–V曲线来评价掺杂共轭分子蛋白质电子传输带隙大小。dI/dV–V是在实施例4的基础上测得的实施例2中硅片表面固定的层状蛋白质分子，硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物体系获得的电流电压曲线进行微分得到的。如图4(A-G分别为BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的微分电导谱，H中按顺序为BSA及P1-BSA、P2-BSA、P3-BSA、AP-BSA、BP-BSA、HP-BSA不同体系的带隙分布图)，图中结果表明，蛋白质本身的电子传输带隙为1.56eV，掺杂芳香共轭分子之后，其电子传输带隙均减小，并且共轭程度越大，电子传输带隙越小，电子传输速率快。表明本发明掺杂芳香共轭分子可以维持蛋白质的基本构象，通过降低电子传输带隙来提高电子传输速率。可为新型生物电子器件的开发提供理论依据。
实施例6
实施例6与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：其中采用血红蛋白溶其于磷酸缓冲溶牛血清白蛋白后的的浓度为6μM，所配制的共轭芳香分子溶液的中菲，芘，苝，羟基芘，溴芘，氨基芘的物质的量浓度为2×10-4mol/L，磁力缓慢反应搅拌4h。其结果与实施例3-5类似。
实施例7
实施例7与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：其中采用天青蛋白溶其于磷酸缓冲溶牛血清白蛋白后的的浓度为5μM，所配制的共轭芳香分子溶液的中菲，芘，苝，羟基芘，溴芘，氨基芘的物质的量浓度为4×10-4mol/L，磁力缓慢反应搅拌6h。其结果与实施例3-5类似。

Claims (10)

1.一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制蛋白质溶液：称取蛋白质溶于磷酸缓冲溶液搅拌得到蛋白质溶液；步骤(1)所使用的蛋白质为牛血清白蛋白、细胞色素c、血红蛋白或天青蛋白；
(2)配制共轭芳香分子溶液：称取共轭芳香分子溶于二甲基亚砜有机溶剂，再加入PBS缓冲溶液得到共轭芳香分子溶液；步骤(2)所述共轭芳香分子包括菲，芘，苝，羟基芘，溴芘或氨基芘；
(3)制备共轭芳香分子-蛋白质复合物：将配制好的蛋白质溶液和共轭芳香分子溶液混合，搅拌，待反应完全；
(4)蛋白质，共轭芳香分子-蛋白质复合物的固定：将修饰3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-APTMS)的硅片分别与蛋白质，共轭芳香分子–蛋白质进行孵育，孵育后淋洗，干燥，分别形成硅片表面固定的层状蛋白质，和硅片表面固定的层状共轭芳香分子–蛋白质复合物；
(5)建立掺杂固定后共轭芳香分子–蛋白质复合物的构象：分别检测步骤(4)中得到的硅片表面固定的层状蛋白质分子和硅片表面固定的层状共轭芳香分子–蛋白质复合物，检测固定后蛋白质分子和固定后共轭芳香分子-蛋白质复合物的构象变化；
(6)建立检测电子传输的电流-电压曲线：室温下，采用两电极系统记录电流电压响应，测量固定蛋白样品：硅片表面固定的层状蛋白质的电流-电压曲线，测量制备固定复合物样品：硅片表面固定的层状共轭芳香分子-蛋白质复合物的电流-电压曲线，并进行对比；
(7)建立检测电子传输能级的微分电导曲线：室温下，分别对步骤5所测定的固定蛋白质样品，固定复合物样品的电流-电压曲线进行微分处理得到微分电导曲线，并进行对比。
2.根据权利要求1所述的共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(1)所使用的蛋白质，溶其于磷酸缓冲溶液中，浓度为5～6μM。
3.根据权利要求1所述的共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(2)所配制的共轭芳香分子溶液中菲，芘，苝，羟基芘，溴芘，氨基芘的物质的量浓度为2×10-4～4×10-4mol/L。
4.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(2)共轭芳香分子的制备是先溶于二甲基亚砜溶剂，超声完全溶解后，再加入PBS缓冲溶液，再次超声至溶液完全均一稳定。
5.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(3)所述的搅拌为磁力搅拌，反应时需要缓慢搅拌时间4～6h。
6.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(4)所述硅片先进行预处理再修饰3-氨基丙基三甲氧基硅烷，具体为：用有机溶剂乙酸乙酯，丙酮，乙醇依次超声，处理后放入加热的水虎鱼溶液水浴加热，洗涤，氟化氢刻蚀，水虎鱼再次洗涤，去离子水洗涤，干燥；置入3-氨基丙基三甲氧基硅烷中反应过夜，甲醇超声淋洗，去离子水洗涤，干燥。
7.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(4)所述硅片分别与蛋白质，共轭芳香分子–蛋白质室温条件下进行孵育6～8h。
8.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(5)所述构象变化的检测为通过圆二色光谱测量构象，选择-208nm，-222nm为位置信号作为研究对象，波长扫描范围为185–280nm，光谱带宽为1nm，扫描步长为1nm，以120nm/min的扫描速率分别测量收集光谱。
9.根据权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法，步骤(6)所述电流电压曲线的电压范围设置为-2.5～+2.5V。
10.一种权利要求1所述的系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法在构建新型生物电子器件中的应用。
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