JP2018502045A - タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法 - Google Patents

タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2018502045A
JP2018502045A JP2017507012A JP2017507012A JP2018502045A JP 2018502045 A JP2018502045 A JP 2018502045A JP 2017507012 A JP2017507012 A JP 2017507012A JP 2017507012 A JP2017507012 A JP 2017507012A JP 2018502045 A JP2018502045 A JP 2018502045A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
linker
protein
drug
mmae
albumin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2017507012A
Other languages
English (en)
Inventor
デイビット バクスター アンソニー
デイビット バクスター アンソニー
マイケル バーチャル クリストファー
マイケル バーチャル クリストファー
ジェームズ マンセル デイビッド
ジェームズ マンセル デイビッド
ヘレナ ミスリウィー ユスチナ
ヘレナ ミスリウィー ユスチナ
サールウェイ ジェニー
サールウェイ ジェニー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iksuda Therapeutics Ltd
Original Assignee
Glythera Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glythera Ltd filed Critical Glythera Ltd
Publication of JP2018502045A publication Critical patent/JP2018502045A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A61K38/063—Glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、タンパク薬物複合体と、その製造方法と、治療におけるそれらの使用とに関する。特に、本発明は、球状タンパク質と、改良されたリンカーと、薬剤とを含む、標的薬物送達用途における使用のためのタンパク薬物複合体に関する。

Description

本発明は、タンパク薬物複合体と、その製造方法とに関する。より具体的には、本発明は、タンパク質、リンカーおよび薬物、例えば細胞毒素を供給し、タンパク薬物複合体を生成することに関する。加えて、本発明は、タンパク薬物複合体で使用するための改良されたリンカーと、前記リンカーを前記タンパク薬物複合体に導入する方法とを提供する。より具体的には、タンパク薬物複合体は、抗体薬物複合体（ADC）、またはアルブミンとリンカーとを含有する薬物複合体であってもよい。
タンパク薬物複合体、特に抗体薬物複合体は、治療用の非常に強力な薬物の特定組織への標的送達を提供することが知られている。より具体的には、不安定な結合の化学リンカーを介して生物活性のある細胞毒性または薬物ペイロードに結合した抗体から典型的になるADCが、抗がん治療における使用で知られている。そのようなタンパク薬物複合体により提供される標的送達は、健康組織と病変組織とを高感度で識別する抗体などの能力によりもたらされ、このようにして非常に強力な薬物の安全な送達を確保する。
そのような抗体、特にモノクローナル抗体（mAb）は、対象となる研究、治療、診断およびその他のバイオテクノロジー用途において有用である。より具体的には、mAbは、標的治療および薬剤の分野において有用である。mAbを、抗体薬物複合体（ADC）による治療への組み込みを介して利用することができる。上述したように、ADCは、とりわけがんの治療に特に有用であると考えられている生物活性薬剤の一種であり、比較的新しい技術である。通常、（例えば）がんの治療用のADCは、細胞殺傷作用をもたらすことができる細胞毒性ペイロードまたは薬物に結合したmAbを含むことになる。mAbと細胞毒性物質（細胞毒素）との間の連結は、通常、化学的に安定なリンカー分子によりもたらされることになる。2種類のADCリンカー系が、当技術分野で知られている；切断可能型および非切断型。切断可能型ADCリンカー系では、好ましくは酵素的に駆動される放出機構があり、代替の切断可能型の系が知られているが、非特許文献１に詳述されるように化学的に不安定である。非切断型ADCリンカー系においては、放出経路は、ADCが使用された際の細胞機構によるmAbの分解によるものである。
ヨーロッパと米国における、ADCアドセトリス（登録商標）（シアトルジェネティクス／タケダグループ）およびカドサイラ（登録商標）（ジェネンテック／ロシュ）の市場の承認が、このADC部類のバイオ治療薬の研究拡大への道を開いた。
以下に示すアドセトリス（登録商標）（ブレンツキシマブ ベドチンとしても知られる）は、古典的ホジキンリンパ腫（HL）および全身性未分化大細胞リンパ腫（sALCL）において発現されるタンパクCD30に向けられる。ブレンツキシマブ ベドチンは、カテプシン切断可能型リンカー（バリン-シトルリン）と、パラ-アミノベンジルカルバミン酸スペーサーと、抗有糸分裂剤モノメチルアウリスタチンE（MMAE）とに結合しているキメラモノクローナル抗体ブレンツキシマブ（細胞膜タンパクCD30を標的とするcAC10）からなる。
以下に示すカドサイラ（登録商標）は、トラスツズマブ エムタンシンであり、細胞毒性剤メルタンシン（DM1）に結合しているモノクローナル抗体トラスツズマブ（トラスツズマブ）からなるADCである。トラスツズマブは単独で、HER2/neu受容体に結合することによりがん細胞の増殖を停止させ、その一方で、メルタンシンは細胞に入り、チューブリンに結合することにより細胞分裂を阻止する；最終的にこの結合作用は、細胞アポトーシスをもたらすことになる。複合体は、典型的にはT-DM1と略される。トラスツズマブ エムタンシンの各分子は、スルフヒドリル基を含有する細胞毒性メイタンシノイドであるメルタンシンの複数分子に、SMCCとして知られている架橋試薬を介して結合した単一トラスツズマブ分子からなる。SMCCは、スクシンイミジルトランス-4-（マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートであり、2つ反応性官能基、スクシンイミドエステルとマレイミドとを含む二官能性架橋剤である。SMCCのスクシンイミド基は、トラスツズマブ分子のリジン残基の遊離アミノ基と反応し、SMCCのマレイミド部分は、メルタンシンの遊離スルフヒドリル基へ結合し、抗体とメルタンシンとの間に共有結合を形成する。
ADCは当技術分野でよく知られているが、薬物ペイロードの標的送達をもたらす能力のある球状タンパク質を含むその他のタンパク薬物複合体はよく知られていない。例えば、アルブミンは、そのようなタンパク薬物複合体中の抗体の適切な代替を提供し得る。
アルブミンは、3つの構造的に相同で、大部分がらせん状であるドメイン（I、IIおよびIII）で構成され、それぞれが2つのサブドメイン、AおよびBからなる。他の哺乳動物アルブミンと同様に、ヒトアルブミンは17ジスルフィド架橋とCys34の遊離チオールとを含み、血清中の遊離チオールの最大画分を与える。
アルブミンは、血液膠質浸透圧に関与する主要なタンパク質であり、長鎖脂肪酸、ビリルビン、銅(II)およびニッケル(II)、カルシウムならびに亜鉛などの金属イオンの輸送運搬体として機能する。アルブミンは、そのタンパク質の大きさ（約67kDa）と、新生児Fc受容体（FcRn）を経る再循環の結果とに起因する、20日のおおよその血清半減期を有し。FcRnは、アルブミンならびに抗体（特にIgG）を、リソソーム内タンパク質分解から両方を保護するようなpH依存性の非競合的方法で再循環させる。循環アルブミンは、初期エンドソームの酸性環境（pH 6）でそれがFcRnに結合する内皮細胞により内在化される。これは、アルブミンが、細胞の表面に再循環され、血液（生理的pH）に再び放されることを可能にする。アルブミンは、バイオアベイラビリティを増加させ、薬物動態を改善するために、細胞毒性薬物に共有結合されるか、あるいはタンパク質ベースの治療薬に融合され得る。
固形腫瘍は、透過性血管系と、腫瘍間質液中での巨大分子（＞40kDa）の蓄積および保持につながるリンパ排液不良とを有する。研究は、様々な悪性固形腫瘍におけるアルブミンの保持を実証した。様々な受容体によるアルブミンの特異的結合の新たな証拠もあり、そのいくつかは、悪性細胞上で高発現することが示されている。同様に、アルブミンは、血液関節関門の透過性の増加により、関節リウマチ患者の炎症関節に蓄積することが知られている。薬物送達におけるアルブミンの既知用途は、ガラクトース残基を含むアルブミン複合体を使用する肝臓標的であり、肝細胞内へ、これらの細胞上でのみ大量に存在して高親和性であるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）との相互作用後に入る。
したがって、これらの標的特性、ならびにその利用可能性、生分解性、毒性と免疫原性とがないことは、その著しく長い半減期と協調して、アルブミンを薬物送達に適した候補とする。このように、アルブミンは、タンパク薬物複合体系における抗体の適切な代替を象徴する。
標的組織への薬物または細胞毒性ペイロードの送達の達成は、リンカーの、タンパク質および薬物に結合する能力と、タンパク薬物複合体が標的組織に到達するまで結合を維持する能力とに依存する。したがって、送達の達成をもたらすそのようなタンパク薬物複合体で使用される代替のおよび／または改良されたリンカーを提供する必要性がある。
さらに、細胞毒性薬物または治療用ペプチドもしくはポリペプチドの安全かつ効果的な送達のために、アルブミンを含むものなどの新しいおよび／または改良されたタンパク薬物複合体を提供する必要性がある。
米国特許第7659241号明細書 米国特許第5609105号明細書 欧州特許出願公開第0184187号明細書 英国特許出願公開第2188638号明細書 欧州特許出願公開第0239400号明細書 欧州特許出願公開第0120694号明細書 欧州特許出願公開第0125023号明細書 国際公開第93/11161号 国際公開第94/13804号
Methods in Molecular Biology, Volume 1045, 2013, published by Humana Press Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989) Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988 Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988 Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993 Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996 Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996
一実施形態では、効果的に細胞アポトーシス特性をもたらすことができる代替のおよび改良されたADCを提供する必要性がある。特に、改良されたADCリンカー分子を提供し、前記ADCの製造中での選択的かつ効果的な結合を確実にし、使用時に効果的な細胞毒性ペイロードを提供する必要がある。
したがって、本発明の第1の態様では、球状タンパク質と、リンカーと、薬物とを含むタンパク薬物複合体が提供される。より具体的には、本発明は、タンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を与えることが可能なリンカー、好ましくはビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含むタンパク薬物複合体を提供する。
本発明は、タンパク質および薬物、例えば抗体および細胞毒素と結合し、ADC分子を提供する有用性のある、タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーを提供する。リンカーは、薬物の標的ペイロードの改良をもたらす。追加的にまたは代替的に、そのリンカーは、現在ADCにおける使用で知られているリンカー分子と比較して安定性が増したタンパク薬物複合体をもたらし、このようにして安全性特性が改善され、その結果として忍容性プロファイルが向上したタンパク薬物複合体をもたらす。より具体的には、本明細書に開示されるリンカー分子のADCでの使用は、使用時のADCの効力を非結合抗体よりも増加させる。
本発明の文脈において、用語「球状タンパク質」は、標的能力を有し、そのため特定の標的組織に薬物ペイロードを送達する能力を有する任意のタンパク質に及ぶと解釈されるべきである。したがって、「球状タンパク質」には、抗体およびそのフラグメント、アルブミンおよびトランスフェリン、ならびに薬物複合体における使用で知られる任意の他の選択肢が含まれる。
「薬物」とは、ヒトまたは動物に対して既知の生物学的効果を有する任意の化学物質を意味する。具体的には、薬物は、疾患の治療、治癒、予防または診断で使用されるか、あるいは心身の健康を向上させるために使用される医薬品であってもよい。理解されるように、薬物は、必要な販売承認を得ている既知薬剤か、またはまだ試験を受けていないもしくは販売承認を得ていない新薬であってもよい。
本発明の一実施形態では、抗体と、リンカーと、細胞毒素とを含む抗体薬物複合体が提供される。
好ましくは、抗体は、抗体、またはそのフラグメントであり、より好ましくはモノクローナル抗体（mAb）である。mAbは、任意の既知mAbから選択することができる。本発明で使用するためのmAbの選択に関する唯一の制限は、結合反応が起こることを可能にするために存在するシステインまたはリジン残基を有していなければならないということである。本発明のリンカーのいくつかの特に好ましい実施形態が、システイン残基中に存在するチオール基への選択性の増加を示すため、mAbはシステイン残基を含有することが特に好ましい。しかしながら、好ましいシステイン残基を通常含まないmAbが確認される場合、mAbにシステインを導入する方法が当業者に知られている。
本発明の別の実施形態によれば（以下にさらに詳述されるように）、抗体をアルブミンの代わりに使用することができる。
以下に述べる好ましい実施形態の全ては、ADCまたはアルブミン薬物複合体を含む抗体に関連して説明されていてもいなくても、タンパク薬物複合体の好ましい実施形態、ならびにADCの実施形態およびアルブミン薬物複合体の実施形態と等しくみなすことができる。特に、以下の薬物およびリンカーの説明は、タンパク薬物複合体の様々な実施形態に等しく当てはまると考慮されるべきである。
薬物は、細胞毒性ペイロードまたは治療用ペプチドもしくはポリペプチドであってもよい。特に、タンパク質が抗体またはそのフラグメントであり、タンパク薬物複合体がADCである場合、薬物は好ましくは細胞毒素である。あるいは、タンパク質がアルブミンである場合、薬物は細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドであってもよい。
好ましくは、細胞毒素は、生物活性のある細胞毒性物質である。最も好ましくは、細胞毒素は抗がん剤である。細胞毒素は、アウリスタチン、メイタンシン、カリケアマイシン、アントラサイクリンおよびピロロベンゾジアゼペンを含む群から選択され得る。特に、細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、ドキソルビシンまたはメルタンシン（DM1）であり得る。MMAEは、(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-ヒドロキシ-1-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)ピロリジン-1-イル)-3-メトキシ-5-メチル-1-オキソヘプタン-4-イル)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミドとしても知られていることは、当業者に明らかであるはずである。
しかしながら、追加的または代替的に、細胞毒素は、リジンサブユニットおよび他のペプチドベースの細胞毒性物質を含む他の既知細胞毒素からも選択することができるが、そのような材料は、当該分野であまり一般的には利用されていない。
薬物が治療用ペプチドまたはポリペプチドである場合、そのペプチドまたはポリペプチドは、例えば、抗侵害受容、抗糖尿病、抗腫瘍または抗ウイルス活性などの治療的特性を有する任意のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。
追加的に、または代替的に、薬物は、好ましくはアミン基、チオール基、またはカルボン酸基を含むが、これは、これらの種類の基が、薬物と本発明のリンカーとの結合にとって理想的な部位を提供するためである。
好ましくは、リンカー（本明細においてリンカー分子またはリンカー基とも呼ばれる）は、抗体などのタンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を提供する。
より好ましくは、本発明のリンカーは、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む。
ごく一般的な言い方をすると、リンカーは、3つの部分を含むとみなすことができる；ビニル基、窒素含有ヘテロ環式芳香族環、およびリンカーアーム。リンカーアームを変更して異なる末端基をもたらし、薬物、または例えばADCの抗体などのタンパク質のいずれかがリンカーに結合するための反応部位を与えることができる。
好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、またはアジリジン環である。より好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、ピリジン環またはピリミジン環であり、最も好ましくはピリジン環である。ピリジンまたはピリミジン環が使用される場合、好ましくは、ビニル基は、窒素ヘテロ原子に対して2位または4位にある。以下にさらに説明するように、商業的に許容可能な反応速度を特定の状況下でもたらすことが見出されているため、4-ビニルピリジンが特に好ましい。
本発明による好ましいリンカーの例には、以下が挙げられる：
上に示した例のうち、4-ビニルピリジン構造が特に好ましく、[13]として示される構造が最も特に好ましい。4-ビニルピリジン構造が好ましく、条件によっては、それらは同等な2-ビニルピリジン構造よりも増加した反応性を示す。
当業者により理解されるように、上記に例示した構造のそれぞれは、リンカーアームに末端カルボン酸基を主に備える。しかしながら、これらの構造は、好ましいビニルピリジン構造が、好ましいポリ（アルキレングリコール）基、最も好ましくはPEG分子を含むように、好ましくは置換された形態で提供され得る。リンカー分子アーム上のPEG基の存在は、それがタンパク薬物複合体製造方法において必要な薬物対タンパク質比を取得しようとする際に反応効率を向上させるため、最も好ましと判明している。
そのような好ましいリンカー分子には、以下の例が挙げられる：
本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、一般式：
を有する分子を含み、
式中：
XおよびYは、独立して、CHまたはNから選択され；
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1、
R2および／またはR3は、R1と同様の分子群から選択され得る。しかしながら、好ましくは、R2および／またはR3は、水素、もしくはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、-CO2R4、-COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで、R4およびR5は、独立して、水素もしくはC1-10アルキルから選択される；または
R2および／またはR3は、水素、アルキルもしくはフェニルから選択されてもよく、これは特にリンカー分子がピリジン環を含む場合に好ましいが、それは代替の電子求引性基がリンカーの反応性に負の影響を及ぼし得るためである；または
R2およびR3は、一緒になって、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、アジリジンもしくはプリンが挙げられるが、これらに限定されない縮合（ヘテロ）芳香族環置換基を形成する。
R2および／またはR3がアルキル基からなるように選択される場合、メチル基（CH3）またはtert-ブチル（(CH3)3C）が好ましい。リンカー分子上にアルキル基があることが好ましいが、それは、そのような基の存在が、環構造上に存在する窒素の塩基性を増加させ、同等なリンカー分子よりも増加した反応性を有するリンカー構造をもたらすためである。
R2および／またはR3が電子求引性基から選択される場合、CF3が好ましい。CF3の存在は、リンカー分子に存在するビニル基の反応性を増加させ、生理的条件下で安定である。
あるいは、いくつかの実施形態では、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、アジラジンまたはプリンなどの、より拡張された縮合ヘテロ環式芳香族環系を使用することが可能であると考えられる。
上記の式において、
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択されてよく、
Z1は、N3基またはOH基から選択され、
nは0〜10の任意の整数であってよい。いつくかの好ましい実施形態では、nは0〜5の値である。
mは0〜10の任意の整数であってよい。好ましくは、mは0〜5であり、上記の例に示すように、最も好ましくは、mは0〜3である。追加的に、または代替的に、(CH2)m基に続くZ基がO基であり、R1（ならびに同様の分子群から選択される場合のR2および／またはR3）が環構造の2位または6位にあるリンカー分子では、その場合mは好ましくは少なくとも3であり、それは、O基が環構造の窒素から離れている必要があるためである。これは、酸素基がリンカー分子構造の反応性に及ぼすことが見出された還元作用によるものである。酸素基が環構造からさらに離れているとき、この作用は感じられない。この状況は、上述の例示構造に反映される。
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基であってもよい。好ましくは、Rはポリ（アルキレングリコール）であり、最も好ましくはPEGである。当業者により理解されるように、R基がPEGである場合、それは、PEGの付加反応生成物のために、好ましくはNHの形態のZ基により進行され得る。この選択肢は、上記のR1の一般式で詳述されている。通常、ポリ（アルキレングリコール）分子は、上記式に示すように、R1および／またはR2基に直接共有結合している。リンカー基のアームは、異なる長さを有することで、ポリ（アルキレングリコール）分子を、例えば抗体などのタンパク質にさらに近づけるまたは離すことができる。
好ましくは、例えば細胞毒性な薬物が、リンカーR1基に結合している。R2および／またはR3が、上記のようにR1と同様の分子群から選択される場合には、これらの基が細胞毒素などの薬物にも結合し、ADCなどのタンパク薬物複合体を、複数の薬物がその構造中に存在するように提供することが可能である。この種類のいくつかの実施形態は、タンパク薬物複合体における薬物の対称装備と呼ばれ得る。
追加的または代替的に、R1と、任意にR2および／またはR3は、(CH2)n-CH(CO2R)2、または(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2から選択され、すなわち、リンカーアームが分岐している場合、薬物がリンカーアームの各末端基に結合することが可能である。このように複数の薬物がタンパク薬物複合体中に存在するため、薬物の非対称装備として説明され得る。
好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、置換ピリジン環（XおよびYが両方ともCH）であるか、または置換ピリミジン環（XおよびYの一方がCHであり、もう一方がN）である。最も好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環はピリジン環である。
特に好ましい一実施形態では、R1は以下のいずれかである：
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-Rである。
本発明のさらなる実施形態では、上述のリンカー分子内に延長リンカーを含むことが望ましい場合がある。そのような延長リンカーは、官能基化基の溶解性または免疫原性を変化させる必要がある場合がある。特に、そのような延長リンカーは、以下でより詳細に説明される開裂可能型ADCリンカー系で有用であろう。本発明における使用に適したそのような延長リンカーは、当業者に明らかであり、特に好ましい延長リンカーは、特許文献１および特許文献２に記載されている。最も好ましくは、延長リンカーは、細胞内プロテアーゼにより切断され得るアミノ酸の一群を含む酵素切断可能型延長リンカーである。
本発明のさらなる実施形態では、エステル基を含み、タンパク薬物複合体のタンパク質へのリンカーの結合を容易にするよう、リンカーを修飾された形態で提供することが望ましい場合もある。この態様は、さらに以下で説明する。
本発明に係る好ましいリンカーは、以下の式で表されることができ、
または
式中：
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1、
R2は、R1と同様の分子群から選択され得る。しかしながら、好ましくは、R2は、水素、もしくはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、-CO2R4、-COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで、R4およびR5は、独立して、水素またはC1-10アルキルから選択される；または
R2は、水素、アルキルもしくはフェニルから選択されてもよく、これは、代替の電子求引性基がリンカーの反応性に負の影響を及ぼし得るために特に好ましい。
R2がアルキル基からなるように選択される場合、メチル基（CH3）またはtert-ブチル（(CH3)3C）が好ましい。リンカー分子上にアルキル基があることが好ましいが、それは、そのような基の存在が、環構造上に存在する窒素の塩基性を増加させ、同等なリンカー分子よりも増加した反応性を有するリンカー構造をもたらすためである。
R2が電子求引性基から選択される場合、CF3が好ましい。CF3の存在は、リンカー分子に存在するビニル基の反応性を増加させ、生理的条件下で安定である。
上記の式において
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択されてよく、
Z1は、N3基またはOH基から選択され、
nは0〜10の任意の整数であってよい。いつくかの好ましい実施形態では、nは0〜5の値である。
mは0〜10の任意の整数であってよい。好ましくは、mは0〜5であり、上記の例に示すように、最も好ましくは、mは0〜3である。追加的に、または代替的に、(CH2)m基に続くZ基がO基である式（III）のリンカー分子では、その場合mは好ましくは少なくとも3であり、それは、O基が環構造の窒素から離れている必要があるためである。これは、酸素基がリンカー分子構造の反応性に及ぼすことが見出された還元作用によるものである。酸素基が環構造からさらに離れているとき、この作用は感じられない。この状況は、上述の例示構造に反映され、
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基であってもよい。好ましくは、Rはポリ（アルキレングリコール）であり、最も好ましくはPEGである。当業者により理解されるように、R基がPEGである場合、それは、PEGの付加反応生成物のために、好ましくはNHの形態のZ基により進行され得る。この選択肢は、上記のR1の一般式で詳述されている。通常、ポリ（アルキレングリコール）分子は、上記式に示すように、R1および／またはR2基に直接共有結合している。リンカー基のアームは、異なる長さを有することで、ポリ（アルキレングリコール）分子を、例えば抗体などのタンパク質にさらに近づけるまたは離すことができる。
好ましくは、例えば細胞毒性な薬物が、リンカーR1基に結合している。R2が、上記のようにR1と同様の分子群から選択される場合には、これらの基が細胞毒素などの薬物にも結合し、ADCなどのタンパク薬物複合体を、複数の薬物がその構造中に存在するように提供することが可能である。この種類のいくつかの実施形態は、タンパク薬物複合体における薬物の対称装備と呼ばれ得る。
追加的または代替的に、R1と、任意にR2は、(CH2)n-CH(CO2R)2、または(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2から選択され、すなわち、リンカーアームが分岐している場合、薬物がリンカーアームの各末端基に結合することが可能である。このように複数の薬物がタンパク薬物複合体中に存在するため、薬物の非対称装備として説明され得る。
本発明の一実施形態では、リンカーは式（III）で表される。
追加的に、または代替的に、ポリ（アルキレングリコール）基が存在する場合、基本のポリ（アルキレングリコール）構造は、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、アジド、スクシンイミジル、またはチオール基などの1つ以上の反応性官能基を備えることで、ポリ（アルキレングリコール）分子の薬物またはタンパク質との反応を促進し得る。特に好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は、1つ以上のヒドロキシル位において、1〜4個の炭素原子を有するアルキル基などの化学基で置換されたものが挙げられる。本発明に従って使用するのに最も好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は、上記のようにポリエチレングリコール（「PEG」）分子であるが、当業者は、本明細書に開示された技術を、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリ（アルキレングリコール）分子と組み合わせて使用することができるであろう。ポリ（アルキレングリコール）分子は、PEGを含めて、典型的には約200Da〜約80kDaの分子量を有する。好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は、約200Da〜1kDaの分子量を有する。本発明に従って使用され得るポリ（アルキレングリコール）分子は、当技術分野でよく知られており、例えば、Sigma Aldrichなどの市販の供給源から公的に入手可能である。
本発明のさらなる態様では、非切断型および／または切断可能型タンパク薬物複合体（例えばADC）リンカー系が提供される。
タンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、薬物（例えば、細胞毒素）とを含む非切断型タンパク薬物複合体（例えばADC）リンカー系が提供され得る。この種類の系では、抗体上のアミン基の結合は、リンカー上に存在する活性化エステルを介し、その後、細胞毒素にビニル基を介して結合することにより達成される。この非切断型系では、抗体は好ましくはmAbである。加えて、リンカーは、好ましくはポリ（アルキレングリコール）分子を、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含み、細胞毒性はチオールを含有する。理解されるように、上述の系では、抗体はタンパク質の一例として与えられており、アルブミンに代替されてもよく、細胞毒素は薬物の一例として与えられており、治療用ペプチドまたはポリペプチドに代替されてもよい。
この種類の代替系では、抗体上のチオール基の結合は、リンカー上のビニル基を介し、その後、リンカーアームに存在するポリ（アルキレングリコール）基を介して薬物に結合することにより達成される。
代替の実施形態では、タンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、延長リンカーと、薬物（例えば細胞毒素）とを含む切断可能型タンパク薬物複合体（例えばADC）リンカー系が提供される。
切断可能型ADCリンカー系では、天然に存在するか、または抗体に導入された1つ以上のチオール基と反応するのに、リンカー分子のビニル置換基が特に適している（例えば抗体上に存在する1つ以上のシステイン残基のチオール基を使用することにより）。リンカーのサイドアームは、好ましくはポリ（アルキレングリコール）分子を介して、延長リンカーに接続されている；延長リンカーは、本実施形態におけるADCに「切断可能」機能を提供する。細胞毒素は、その後延長リンカーを介してリンカーに結合する。好ましくは、抗体はmAbである。より好ましくは、リンカーは、ポリ（アルキレングリコール）分子を、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。上記でさらに詳述さているように、延長リンカーは、酵素切断可能であることが好ましい。理解されるように、上述の系では、抗体はタンパク質の一例として与えられており、アルブミンに代替されてもよく、細胞毒素は薬物の一例として与えられており、治療用ペプチドまたはポリペプチドに代替されてもよい。
本出願において、用語「切断可能型」は、自己破壊する能力があるか、またはそれらの薬物（例えば細胞毒性）ペイロードを放出するように操作され得るタンパク薬物複合体（例えばADC）を包含するように使用されることが理解されるべきである。その用語の使用は、そのようなタンパク薬物複合体（例えばADC）を、その薬物（例えば細胞毒性）ペイロードを、標的細胞中に存在する場合にのみ放出すると理解されているそれらの「非切断型」タンパク薬物複合体（例えばADC）から識別することを意図している。
本発明のこの態様において使用するためのタンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、薬物（例えば細胞毒素）の好ましい特徴は、第一の態様に関して上述した通りであることが理解されるべきである。特に、リンカー分子の記述およびその好ましい特徴は、前記切断可能型および非切断型の系での使用に特に適している。
本発明で利用されるタンパク質（例えば抗体）が、少なくとも1つ以上のチオール基含有システイン基を含むことが好ましいが、タンパク質（例えば抗体）が1つ以上のリジン基を有していてもよいとも考えられる。この場合には、当業者は、本発明のリンカーを、システイン基の代替としてリジン基に結合させることを好むであろうと考えられる。この状況では、それがリンカーの活性化エステル形態であるように、リンカー分子を修飾することが好ましい。本実施形態では、修飾リンカーのエステル基は、タンパク質（例えば抗体）上に存在するリジンにリンカーアームを介して結合する能力がある。本実施形態では、タンパク質（例えば抗体）は、リジン基を介してエステル修飾リンカーに結合し、次いでこれは、薬物（すなわち細胞毒素）にビニル基を介して結合する。この修飾リンカーは、ポリ（アルキレングリコール）分子、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含んでもよい。
本発明の第三の態様では、リンカーは薬物に結合しており、タンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を提供することが可能であって、好ましくはビニル置換基を含む窒素含有芳香族ヘテロ環式環を含むリンカーにタンパク質を接触させることを含む、タンパク薬物複合体を製造する方法が提供される。別の態様では、タンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を提供することが可能であって、好ましくはビニル置換基を含む窒素含有芳香族ヘテロ環式環を含むリンカーにタンパク質を接触させ、その後リンカーを薬物へ結合させることを含む、タンパク薬物複合体を製造する方法が提供される。
好ましくは、本方法は、少なくとも1つの反応性チオール基を有するタンパク質（例えば抗体）を、タンパク質（例えば抗体）の少なくとも1つのチオール基と反応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試薬を含むリンカーに接触させることを含み、ここで、リンカー官能基化試薬はポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合しているが、これは、リンカー官能基化試薬のビニル置換基が、タンパク質（例えば抗体）のチオール基と反応し、それによりリンカーポリ（アルキレングリコール）分子をタンパク質（例えば抗体）に共有結合させるためである。
加えて、本発明の方法は、官能基化試薬とタンパク質（例えば抗体）とを反応させてそれらを結合させる工程に加えて、1つ以上の工程を含み得る。一例として、本方法は、ビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む前駆官能基化試薬をポリ（アルキレングリコール）分子と反応させ、官能基化試薬を生成する初期工程を含み得る。
タンパク質（例えば抗体）が適切なチオール基を含まないか、またはそのポリペプチド鎖中の所望の位置で適切なチオール基を含まない本発明の実施形態では、本発明は、タンパク質（例えば抗体）を修飾する初期工程を含んでもよく、例えば、化学反応または部位特異的突然変異誘発法により、ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有する変異ポリペプチドを産生させる。好ましくは、これは、タンパク質（例えば抗体）のポリペプチド鎖中の1つ以上のアミノ酸を、システイン残基で置換することにより行われる。
好ましくは、反応性チオール基は、それがタンパク質（例えば抗体）中に天然に存在するものであれ、または導入されたものであれ、システインアミノ酸残基の一部である。
追加的に、または代替的に、本発明は、リンカーと結合したアルブミンを提供し、ここでリンカーは、本発明の第一の実施形態に関して上述した通りである。
理解されるように、本発明での使用を意図されるアルブミンは、肝臓で産生された血漿タンパク質である血清アルブミンである。好ましくは、アルブミンは、ヒトアルブミンである。
好ましくは、リンカーは、ポリ（アルキレングリコール）分子を、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。
追加的に、または代替的に、本発明は、アルブミンと、リンカーと、薬物（例えば細胞毒素）とを含むタンパク薬物複合体を提供し、ここで、リンカーおよび薬物（例えば細胞毒素）は、タンパク薬物複合体および／またはADC発明に関して上述した通りである。特に、リンカーが、薬物（例えば細胞毒素）に結合するポリ（アルキレングリコール）分子を含むことが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。
本発明は、アルブミンと、リンカーと、治療用ペプチドまたはポリペプチドを含むタンパク薬物複合体も提供する。リンカーおよび治療用ペプチドまたはポリペプチドは、上述した通りであり、リンカーが、治療用ペプチドまたはポリペプチドに結合するポリ（アルキレングリコール）分子を含むことが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。
追加的に、または代替的に、上述のように、基本のポリ（アルキレングリコール）構造は、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、アジド、スクシンイミジル、またはチオール基などの1つ以上の反応性官能基を備えることで、ポリ（アルキレングリコール）分子の、薬物すなわち細胞毒性または治療用ペプチドもしくはポリペプチドとの反応を促進し得る。
さらに、リンカーポリ（アルキレングリコール）構造は、第二のリンカーと、リンカーアームを介して反応し、ホモ二官能性リンカーを提供してもよく、これは、1つのリンカーのビニル基が、薬物すなわち細胞毒性または治療用ペプチドもしくはポリペプチドのチオール基と反応することができ、もう一方のリンカーのビニル基が、タンパク質、例えばアルブミンのチオール基に結合することができるようにするためである。この実施形態では、タンパク薬物複合体、例えば、アルブミン薬物複合体は、アルブミンの、チオール含有細胞毒素、治療用ペプチドまたは治療用ポリペプチドへの結合を容易にする2つのリンカー分子を含むことになる。
本発明のさらなる実施形態において、アルブミンを、アルブミンの遊離チオール基と反応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試薬を含むリンカーに接触させることを含む方法が提供され、ここで、リンカー官能基化試薬はポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合しているが、これは、リンカー官能基化試薬のビニル置換基が、アルブミンのチオール基と反応し、それによりリンカーポリ（アルキレングリコール）分子をアルブミンに共有結合させるためである。
このさらなる方法は、アルブミンを修飾する初期工程を含んでもよく、例えば、化学反応または部位特異的突然変異誘発法により、ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有する変異体を産生させる、例えば、溶媒露出システイン残基を導入する。好ましくは、これは、アルブミンのポリペプチド鎖中の1つ以上のアミノ酸を、システイン残基で置換することにより行われる。
さらなる態様では、本発明は、治療に使用するための上記で定義したタンパク薬物複合体を提供する。
一実施形態では、治療に使用するための上記で定義したADCが提供される。好ましくは、ADCは、抗がん治療に使用することが意図されている。
さらなる実施形態では、本発明は、治療に使用するための上記で定義したアルブミン薬物複合体を提供する。好ましくは、アルブミン薬物複合体は、抗がん、抗侵害受容、抗糖尿病、抗腫瘍または抗ウイルス療法で使用するためのものである。
本発明の実施形態を、添付の図面を参照しながら、限定ではなく例として説明する。
本発明による例示的リンカーとグルタチオンの反応の相対速度を示す図である。 PL13遊離酸のN-アセチルシステイン（NAC）との、24時間後の3つの異なるpH（7.0、7.5および8.0）での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。 PL-13-NAC付加物のpH 7.0での形成を実証するMSデータを示す図である。 PL-13-NAC付加物のpH 8.0での形成を実証するMSデータを示す図である。 PL13遊離酸のNACとの、pH8.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。 PL13遊離酸のアミノ酸混合物（Tyr/Lys/His/NAC）との、pH7.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。 アミノ酸混合物とのpH 7.0での反応におけるPL13-NACの形成を実証するMSデータを示す図である。 PL13遊離酸の10当量のリジンとのpH7.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。 PL13遊離酸の10当量のアスパラギン酸との反応性のRP-HPLC分析を示す図である。 PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの構造を示す図である。 PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのMS分析を示す図である。 反応の1時間後のトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHICおよび紫外可視プロファイルを示す図である。 チオールに対して1.25モル過剰の薬物-リンカーとの1、8、および16時間でのインキュベーションでの、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHICおよび紫外可視プロファイルを示す図である。 チオールに対して5モル過剰の薬物-リンカーとの16時間でのインキュベーションでの、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHICプロファイルを示す図である。 10モル過剰のPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの結合を介して、16時間のインキュベーション後に得られたトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHICプロファイルを示す図である。 10モル過剰のPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの16時間のインキュベーション後に結合したトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPプロファイルを示す図である。 二重脱塩したトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPプロファイルを示す図である。 NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHIC分析を示す図である。 NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のPLRPプロファイルを示す図である。 NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHIC分析を示す図である。 トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）複合体のSECクロマトグラフィーによる分析を示す図である。 トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの非還元SDS-PAGE分析を示す図である。 PL13-NH-PEG4-OSuリンカーの構造を示す図である。 PL13-NH-PEG4-COOHリンカー中間体のESI-MS分析を示す図である。 SMCCまたはPL13-NH-PEG4-OSuリンカーを介するトラスツズマブ架橋の、還元SDS-PAGEによる分析を示す図である。 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーの構造を示す図である。 トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のHICプロファイルを示す図である。 トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のPLRPプロファイルを示す図である。 図２８のPLRP溶出プロファイルに基づく、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEおよびトラスツズマブ-mal-val-cit-MMAEについてのDAR計算を示す図である トラスツズマブ-mal-val-cit-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE（B）のSEC分析を示す図である。 1mgスケールでのプロセス最適化後に得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの代表的なHIC（A）およびPLRP（B）プロファイルを示す図である。 150mgスケールで得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のHICプロファイルを示す図である。 150mgスケールで得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（B）のSECプロファイルを示す図である。 チオmab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEのpH 7.0（実線）およびpH 7.5（破線）でのHICプロファイルを示す図である。 トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの脱薬を実証するPLRPプロファイルを示す図である。 DARが3.8であるトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの脱薬を実証するPLRPプロファイルを示す図である。 ADCのin vitro安定性：トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、MAL-ADC（A）対トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、PL13-ADC（B）を示す図である。 ADCのin vivo安定性：PL13-ADC対Mal-ADCを示す図である。 SKBR3細胞株（A）、BT474細胞株（B）、およびJIMT-1細胞株（C）についての細胞死滅データを示す図である。 ADCの毒性を実証する複数用量の異種移植片データを示す図である。 腫瘍増殖に対するADCの効果を示す複数用量の異種移植片データを示す図である。 腫瘍成熟組織病理学データを示す図である。 20kDaのPEG-PL12とPEG-PL13対20kDaのPEG-マレイミドの、還元型アルブミンへのpH 7.4での結合の比較データを示す図である。 アルブミンへのPL11（A）、PL12（B）、およびPL13（C）結合の最適化を示す図である。 アルブミンへのPL11（A）、PL12（B）およびPL13（C）結合のESI-MSによる分析を示す図である。 ESI-MSにより実証される、1mMのGSH存在下でのアルブミン-PL-12複合体の安定性を示す図である。 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシンリンカーの構造を示す図である。 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシンリンカーの、アルブミン、チオアルブミン（単一変異体）およびチオアルブミン（二重変異体）への結合の比較データを示す図である。 アルブミン-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシン複合体の非還元SDS-PAGE分析を示す図である。（1）チオアルブミン-二重変異体-DOX；（2）チオアルブミン-単一変異体-DOX；（3）アルブミン-DOX；（M）-タンパク質マーカー。 アルブミン-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシン複合体のSEC分析を示す図である：アルブミン（A）およびアルブミン-DOX複合体（B）；チオアルブミン（単一変異体）（C）およびチオアルブミン-DOX（単一変異体）（D）；チオアルブミン（二重変異体）（E）およびチオアルブミン-DOX（二重変異体）（F）。
本発明の方法は、本発明に従ってリンカーに結合した抗体またはアルブミンを含み、そしてそれが細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドなどの薬物に結合しているADCまたはアルブミン薬物複合体などのタンパク薬物複合体を提供することができる。
本発明において、抗体への言及は、免疫グロブリンを、天然または部分的にもしくは完全に合成的に生産されたかどうかに関わらず含む。この用語は、抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。Fab、scFv、Fv、dAb、Fdフラグメント、ダイアボディ、トリアボディまたはナノボディを含む抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントも考えられる。モノクローナル抗体および他の抗体を採取し、組換えDNA技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生することが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（CDR）をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、特許文献３、特許文献４、または特許文献５を参照。抗体を多くの方法で修飾することができ、その用語は、必要な特異性を有する抗体抗原結合ドメインを有する任意の特異的結合成員または物質を含むと解釈されるべきである。したがって、この用語は、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体を、天然または完全にもしくは部分的に合成されているかどうかに関わらず包含する。したがって、免疫グロブリン結合ドメインを含む、または別のポリペプチドに同等な、融合したキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、特許文献６および特許文献７に記載されている。
従来技術では、全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を果たすことができると示されてきた。結合フラグメントの例は、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；（iii）単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；（iv）VHドメインからなるdAbフラグメント（非特許文献２）；（v）単離CDR領域；（vi）F(ab')2フラグメント、2つの連結したFabフラグメントを含む二価フラグメント（vii）VHドメインとVLドメインとが、2つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーにより連結されている一本鎖Fv分子（scFv）（非特許文献３；非特許文献４）；（viii）二重特異性一本鎖Fvダイマー（特許文献８）および（ix）「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築された多価または多特異的フラグメント（特許文献９；非特許文献５）である。Fv、scFvまたはダイアボディ分子は、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る（非特許文献６）。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニボディも作製され得る（非特許文献７）。したがって、そのような結合フラグメントは、本発明により企図される。
好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法は、抗体などのタンパク質を、リンカーを介して、細胞毒素などの薬物に結合させるのによく適している試薬と条件とを用いる。特に、本発明の方法で使用される反応条件は、様々な特性を有する異なる生成物の混合物を生成する傾向があるマレイミドなどの先行技術の試薬を使用する場合に発生しやすい問題を回避するのに役立つ。特に、以下の実験データから分かるように、本発明によるリンカーを使用するADCなどのタンパク薬物複合体を製造する方法は、マレイミド架橋に関連する問題を回避する。
上記のように、タンパク薬物複合体（例えばADC）組成物用の目的とするタンパク質（例えば抗体）を、既存のチオール基を使用して、または、本方法の最初の工程でチオール基を導入することにより、例えば、タンパク質（例えば抗体）の1つ以上の官能基を反応させ、チオール基を生成することにより、または、チオール基もしくはその前駆体を、タンパク質（例えば抗体）へ導入することにより、リンカーに結合させてもよい。一例として、システイン残基をタンパク質（この例では抗体）に、リンカーがタンパク質（例えば抗体）に結合することが所望される部位で導入する工程を含み得る。これは、本発明による反応にとって都合のいいシステイン残基が、出発または野生型ポリペプチド／タンパク質中に存在しない状況において有用であり得る。都合よく、これは、抗体ポリペプチドなどのタンパク質の部位特異的突然変異誘発を用いて達成することができ、その使用は、当技術分野において確立されている。
代替的に、または追加的に、タンパク質が商用グレードのアルブミンである場合、初期の還元工程が必要になることがあるが、これは、以下にさらに詳細に説明するように、存在するシステインチオールの大部分がキャップ化されているためである。
（実験データおよび考察）
PL13として識別され、および本明細書でそのように称されるリンカー分子を、以下に示すようなその遊離酸またはNH-ペグ化型で利用して、以下の実験データを主に作り出した。
または
１．PL11、PL12およびPL13リンカーのグルタチオンとの反応性の実証。
グルタチオンは、結合にすぐ利用できるチオール基を含み、良いタンパク質モデルを提供し、本発明で使用するリンカーの、ADCなどのタンパク薬物複合体における有用性についての適合性を評価することができる。図１は、本発明による3つのリンカー基の例を示し、グルタチオン中に存在するチオール基と結合するそれらの能力を実証する。図１の例は、PL11、PL12およびPL13であり、それらの構造を以下に示す。
２．PL13遊離酸選択性の測定
以下に示されるデータは、本発明によるリンカーが、システイン基に対する特異性を示すことを実証する。PL13遊離酸は以下として識別される；
（PL13遊離酸の、N-アセチルシステインとのpH 7.0、7.5および8.0での反応性）
PL13遊離酸を、2モル当量のN-アセチルシステイン（NAC）と、3つの異なるpH：7.0、7.5および8.0で反応させた。反応を、適切なpHに緩衝したメタノール／リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中（9:1の比率）で、室温（RT）で行った。RP-HPLC分析を、15分間にわたる1%〜50%のB（0.1%のTFAを含むアセトニトリル）のグラジエントと、254nmでの検出により実施し、遊離チオールのPL13のビニル基への付加を経時的に観測した。
方法：
メタノール210μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、緩衝液22μL中の50mMのNACと混合し、最終濃度が2.37mMのPL13遊離酸と4.74mMのNACとを得た。
結果：
PL13-NAC付加物を、5.1分の保持時間で、全てのpHで24時間後に溶出した（図２を参照）。生成物（PL13-NAC付加物）の量は、pH 7.0および8.0で同様であった。PL13遊離酸のpH7.5での反応性が遅かった。加えて、未同定のピークを4分で溶出した。
ESI-MS分析は、PL13-NAC付加物の存在を、分析した全てのpHで確認した。MSトレースデータが本明細書に含まれており、この分析をpH 7.0（図３）およびpH 8.0（図４）で実施したとして示す。
（PL13遊離酸のN-アセチルシステインとのpH 8.0での反応性）
PL13遊離酸を、2モル当量のNACと、pH8.0のメタノール／PBS溶液中（9:1）で反応させた。反応の進行を、RP-HPLCにより、15分間にわたる1%〜50%のBのグラジエントを用い、254nmでの検出で観測した。試料を、0、1、4および72時間の室温でのインキュベートで分析した（図５参照）。
方法：
メタノール100μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、pH 8.0の緩衝液11μL中の50mMのNACと混合し、最終濃度が2.35mMのPL13遊離酸と5mMのNACとを得た。
結果：
PL13遊離酸のNACへの付加は、最初の4時間にわたって遅い。72時間のインキュベーション後、〜70%のPL13遊離酸が、pH8.0で生成物（PL13-NAC付加物）に変換した。
（PL13遊離酸の、10当量のチロシン、ヒスチジン、リジンおよびN-アセチルシステインとの、7.0pHでの反応性）
PL13遊離酸を、10当量の各アミノ酸（チロシン（Tyr）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、およびN-アセチルシステイン（NAC））で、pH 7.0でチャレンジした。反応を、RP-HPLCにより、15分間にわたる1%〜50%のBのグラジエントを用い、254nmに設定した検出で分析した。
方法：
メタノール50μL中の2.61mMのPL13を、緩衝液260μL中の20mMのTyr/His/LysおよびNACと混合し、最終濃度が0.42mMのPL13と、4.2mMのTyr、His、LysおよびNACのそれぞれを得た。
結果：
PL13遊離酸は、Tyr、HisおよびLysの存在下で、NACとpH7.0で選択的に反応した（図６を参照）。図７は、PL13 NAC付加物のみが形成されたことを実証するMSデータを示している。
PL13とNAC間の付加反応は、10モル過剰のアミノ酸で有意に増加した。PL13遊離酸の所望のPL13-NAC付加物への変換は、室温（RT）で4時間後に90%完了し、＜18時間で完全に完了した。
得られた結果は、本発明によるリンカー分子の遊離酸型の、リンカー分子のビニル基を介するシステイン反応性に対する選択性を実証する。
（PL13遊離酸のリジンとの反応性のRP-HPLC分析）
PL13遊離酸を、PBS緩衝液中の10当量のLysで、室温でpH 7.4でチャレンジした。反応を、RP-HPLCにより、30分間にわたる12%〜50%の水中アセトニトリルのグラジエントを用い、270nmに設定した検出で分析した。
方法：
メタノール10μL中の4mMのPL13を、8mMのLys溶液50μLとpH 7.4のPBS緩衝液40μLと混合し、最終濃度が0.4mMのPL13と4.0mMのLysとを得た。反応を、RP-HPLCにより、30分間にわたる12%〜50%の水中アセトニトリルのグラジエントを用い、270nmに設定した検出で分析した。
結果：
RP-HPLC分析では、PL13-Lys付加物に対応するピークは観測されないため、PL13遊離酸は、pH 7.4でLysと反応しなかった（図８を参照）。
得られた結果は、PL13遊離酸のLysとのインキュベーションによる付加物は形成されていないことを示している。このデータは、本発明のリンカーの遊離酸型のシステイン基選択性を支持している。そのようなシステイン特異性はマレイミドにより提示されず、そのため本発明のリンカーは、この点において利点をもたらすことが理解されるべきである。
上記のデータは、本発明のリンカーにより提示されるシステイン特異性を示しているが、リンカーが当技術分野でよく知られている方法により修飾される場合、リジン特異性が代替的にもたらされ得ることが容易に理解される。
（PL13遊離酸のアスパラギン酸との反応性）
PL13遊離酸を、10当量のアスパラギン酸（Asp）で、pH 7.0で室温で処理した。分析を、RP-HPLCにより、15分にわたる1%〜50%のBのグラジエントで、254nmでの検出で実施した。
方法：
メタノール50μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、緩衝液280μL中の50mMのAspと混合し、最終濃度が0.42mMのPL13遊離酸と4.2mMのAspとを得た。
結果：
PL13遊離酸は、Aspの存在下で、pH 7.0で18時間以上室温で安定である（図９を参照）。
MSスペクトルは、PL13遊離酸のAspとのインキュベーションによる付加物は形成されていないことを実証する（データは示さず）。ここでも、このデータは、本発明のリンカーのシステイン基選択性を支持している。そのようなシステイン特異性はマレイミドにより提示されず、そのため本発明のリンカーは、これに関する利点をもたらすことが理解されるべきである。
３．PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAE細胞毒性薬物リンカーの合成
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、当業者によく知られてフラグメントアプローチにより合成した。
方法：
PL13遊離酸を、H-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、典型的な細胞毒素の遊離のアミノ末端に、HOBt活性エステル法により結合させた。
結果：
3.1mgのPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを合成した（図１０を参照）。原料をジメチルアセトアミド（DMA）に溶解させ、薬物リンカー溶液を50mMの濃度で得た。
RP-HPLCは、PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーの純度を確認した（データは示さず）。
ESI-MS分析は、細胞毒性薬物リンカーの同一性を確認した（予想MWは1296.67Daであり、実験結果は1296.5DaのMWを与えた）（図１１を参照）。
４．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの生成
20mgのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体、本発明の典型的なADCと、20mgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体、既知マレイミドリンカーを含むADCとを生産した。
（PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびマレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、トラスツズマブへの結合）
方法：
トラスツズマブを還元し、トラスツズマブ分子あたり3〜4つの薬物の結合を可能にした。トラスツズマブの還元についての詳細な方法は、当業者によく知られているはずであるため、提供されない。
マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、遊離チオールに対して1.25モル過剰のトラスツズマブに、pH7.0で結合させた。反応を1時間室温で行った。結合反応を、過剰のNACによりクエンチした。トラスツズマブ複合体の分析を、東ソーのブチル-NPR（4.6x3.5、2.5μM）カラムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により、および紫外可視分光法により行った。MMAEは、248nmで独特のUV吸収を示す（ε248=1500M-1cm、ε280=15900M-1cm）。
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、遊離チオールに対して1.25、2.5、5および10モル過剰のトラスツズマブに結合させた。反応を16時間pH 7.0で行った。結合反応を、HIC（東ソーのブチル-NPRカラムでの分離）とPLRPクロマトグラフィー（PLRPカラム-2.1mmx5cm、5μmでの分離）の両方で分析した。トラスツズマブ複合体を、紫外可視分光法により調べた。MMAE細胞毒性薬物とPL13リンカーとの両方が、248nmでのUV吸収の一因となる。
結果：
マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブとの反応は、1.25の薬物対遊離チオール比を用いて、1時間以内に完了した（図１２を参照）。図１２中の数字は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。入口は、マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合による248nmでの吸収の増加を表す紫外可視プロファイルである。10mgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体（薬物対抗体比（DAR）2.2）を得て、さらに以下に説明するようにin vitro試験用に取っておいた。
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE反応の速度と効率は、リンカーの低い溶解度のために、マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEよりもはるかに遅い（図１３を参照）。結合を、チオールに対して1.25モル過剰の薬物-リンカーで実施した。入口は、PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの16時間以内のカップリングによる248nmでの吸収の増加を示す紫外可視プロファイルである。PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合の速度の緩増加が、チオール基に対して5モル過剰の薬物-リンカーを適用することにより観測された（図１４を参照）。図１４において、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、非結合薬物を指す。
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合は、10モル過剰および50%プロピレングリコールの存在下で、90%の収率を4時間以内に得た（図１５および図１６を参照）。図１５において、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、非結合薬物を指す。図１６では、数字は、抗体の軽（L）または重（H）鎖に結合した薬物の量を指す。7.2mgのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体（DAR 3.03）を得て、さらに以下に説明するようにin vitro試験用に取っておいた。
（トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの薬物抗体比（DAR）の測定）
HICおよびPLRPクロマトグラフィーは、システイン結合ADCの平均薬物負荷および薬物負荷分散の特性評価をするためによく適用される。ADCの効力および薬物動態に影響を与えるため、平均薬物負荷および薬物負荷分散の測定は重要な属性である。
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、2.2のDAR計算を1.8%非結合トラスツズマブと共に与えた（図１２を参照）。図２７に関して以下で議論されるように、HICプロファイルからのDAR計算は、当該分野においてよく知られている方法により決定される。
トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC分析は、DAR測定を支持するのに十分には分離しなかったピークを生じた（図１５を参照）。しかし、このデータは、完全を期すためにここに含まれている。HICを使用し、〜8.4%と計算されるDAR 0でトラスツズマブの量を計算した。
ジチオスレイトール（DTT）の分離は、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを還元させ、PLRPカラムを介して、非結合または薬物結合した抗体軽鎖および重鎖に対応する十分に分離されたピーク（図１６）を与えた。3.0のDARを、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（図１７を参照）について計算した。図１７の表は、非結合または薬物を装備した軽鎖および重鎖の割合の面積に基づく、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEについてのDAR計算を示している。
５．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの安定性試験
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体についての薬物-リンカーの安定性を、NAC存在下でPBS緩衝液中で評価した。
方法：
各ADCを（1〜2mg/mLの濃度で）、1mMのNACと、PBS緩衝液中、24時間37℃でインキュベートした。
結果：
トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、緩衝液中のNACの存在による影響を受けなかった（図１８および１９を参照）。トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、NACの存在下で安定性の減少を示した（図２０を参照）。図１８において、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、非結合薬物を指す。
図１９は、特に、遊離チオールからのチャレンジに起因する、ADCを含むPL13についてのプロファイルの変更はないことを実証し、構造の安定性を示している。
６．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのSDS-PAGEおよびSEC分析
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、SECクロマトグラフィーおよび非還元SDS-PAGEにより評価した。
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、99.5%モノマーとして存在する（図２１（A）を参照）。トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、93.5%モノマーとして存在する（図２１（B）を参照）。
非還元条件下でのSDS-PAGE分析は、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE試料の両方で複数のバンドの存在を示したが、これは、リンカー-薬物部分でのシステイン残基のアルキル化の間の、抗体の鎖間ジスルフィド結合の破壊による（図２２を参照）。図２２において、レーン1は、1.8mg/mLの濃度でゲルに入れた5μLのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの試料の分析を表し、レーン2は、5mg/mLの濃度でゲルに入れた5μLのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの試料の分析を表す。SEC分析により確認された重鎖および軽鎖間の強力な非共有結合性相互作用により、完全長抗体の完全性は依然として保たれる。
７．PL13-NH-PEG4-OSuヘテロ二官能性リンカーの合成
親水性PEG（PEG4）を、リンカー分子のリンカーアーム部分に導入し、PL13-NH-PEG4-OSuを供給し、上記セクション1の下で与えられた例に関するリンカー溶解性を向上させた（図２３を参照）。
方法：
PL13遊離酸（上記の通り）を、1-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-酸に結合させた。カルボキシル基の所望のスクシンイミジルエステルへの活性化を、無水ジクロロメタン（DCM）中でのN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）2.5eq./HOSuカップリングを用いて実施した。未反応のDCCおよびジイソプロピル尿素副生成物を、濾過により冷DCMから除去した。
結果：
PL13-NH-PEG4-COOHのESI-MS（図２４を参照）は、リンカーの同一性を確認した。
（PL13-NH-PEG4-OSuおよびSMCCリンカーの交差反応性の比較）
スクシンイミジルトランス-4-（マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、既知リンカー、およびPL13-NH-PEG4-OSuを介するトラスツズマブ架橋の程度を、SDS-PAGEを還元することにより評価した。
方法：
最終濃度2mg/mLのトラスツズマブを、10倍過剰のSMCCまたはPL13-NH-PEG4-OSuでインキュベートした。試料を室温でインキュベートした。
結果：
PL13-NH-PEG4-OSuは、SMCCリンカーよりも少ない高分子量バンドを示すことが、SDS-PAGEから明らかである（図２５、レーン5〜9を参照）。PL13-NH-PEG4-OSuのSDS-PAGEではいくつかのより高い分子量のバンドがあるが、これらは出発トラスツズマブのレーンにもある程度存在している（図２５、レーン5を参照）。
本発明のリンカーとは対照的に、SMCCリンカーはトラスツズマブ架橋を誘導するが、これは、特にリジン残基のアミン側鎖へのマレイミド基の非特異的反応性によるものである。
８．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの合成
前もって合成したPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE細胞毒性薬物リンカーの溶解性をさらに改善するために、短い親水性PEGユニットを分子に導入した（図２６を参照）。PEGユニットはまた、「スペーサー」をADCのリンカーアームに取り込み、PL13を介したMMAE細胞毒性ペイロードと抗体の結合点との分離を、いくつかの39原子により増加させる（対して、事前にPL13-vcMMAEでは22原子）。この「スペーサー」は、遊離チオールのマイケル付加の反応速度に影響を及ぼし得るPL13ユニットの回転柔軟性を増大させるはずであると考えられている。
方法：
40mgのクルードFmoc-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを精製した。N-Fmoc基を、その後アミノ分解により除去して、アミン官能化細胞毒性化合物を精製し、24mgの原料を得た。これを使用して、PL13-NH-PEG4-COOHを、標準HOBt活性エステル化学によりカップリングした。
結果：
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを合成した。この分子は、本発明による切断型ADC系の一例を表している。
９．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびマレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合
方法：
トラスツズマブを、室温で1時間かけ、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の存在下で、2.4倍過剰トリス（2-カルボキシチル）ホスフィン（TCEP）で還元した。抗体をPBSに再緩衝化した。トラスツズマブを、20mg/mLの濃度で、5%v/vのDMAの存在下で、室温で16時間かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに結合させた。加えて、マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーを、室温で1時間かけ、6モル過剰のトラスツズマブ（20mg/mL）に結合させた。得られたADCを、HIC、PLRPおよびSECクロマトグラフィーにより分析した。
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、4.29のDAR計算を与えた（図２７Aを参照）。
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、3.15のDAR計算を与えた（図２7Bを参照）。
図２7Aおよび図２7Bにおいて、数字は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。表は、HIC溶出プロファイルからの各ピーク面積の相対的割合を表す。平均DARを、百分率ピーク面積に対応する薬物負荷を掛けることで算出し、重み付けのピーク面積を得る。重み付けしたピーク面積を加算して100で割り、最終DAR値を得る。
DTT還元トラスツズマブ-マレイミド-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPによるDAR分析は、平均薬物負荷が4.3であることを確認した（図２８Aおよび図２９を参照）。
DTT還元トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPによる分析は、平均薬物負荷が3.8であることを確認した（図２８Bおよび図２９を参照）。
図２８Aおよび２８Bにおいて、数字は、抗体の軽（L）または重（H）鎖に結合した薬物の量を指す。
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（HER-MAL-MMEA）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（HER-PL-13-MMEA）の両方のSECクロマトグラフィーでの分析は、両方の試料がモノマー種として表わされることを示した（図３０AおよびBを参照）。図３０Aおよび３０Bの下にある表は、高分子量種（HMW）、モノマーおよび低分子量種（LMW）の計算を示している。
１０．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの結合の最適化条件
方法：
トラスツズマブ（23.5mg/mL）を、室温で2時間かけて2.4当量のTCEPで還元し、平均4.5の遊離チオールを得た。還元トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、30℃で18時間かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEに結合させた。複合体を、HICおよびPLRPクロマトグラフィーにより分析した（図３１AおよびBを参照）。
結果：
HICおよびPLRPデータは、結合効率の大幅な改善を示している。高いレベルの結合効率はまた、「奇数」レベルのDAR種の有意な減少と、非結合抗体のレベルの減少とをもたらした。
１１．トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（B）の150mgスケールでの結合、プロセスのスケーラビリティの実証
方法：
トラスツズマブ（24.53mg/mL）を、室温で2時間かけて2.1当量のTCEPで還元した。還元トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、30℃で18時間かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEに結合させた。
25.68mg/mlの濃度のトラスツズマブを、室温で2時間かけて1.95当量のTCEPで還元した。還元トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、室温で1時間かけ、6倍過剰のマレイミド-val-cit-MMAEに結合させた。
複合体を、HICおよびSECクロマトグラフィーにより分析した（図３２および３３を参照）。
結果：
HICプロファイルは、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（図３２A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（図３２B）について、同様の結合効率を示した。SEC（図３３Aおよび３３B）は、両複合体が、少量でのみ存在する高分子量種（1.4〜2.4%）を有するモノマーであることを確認した。これは、本発明のリンカーを用いて開発された結合プロセスのスケーラビリティを実証している。
１２．PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEのチオMabへの結合、改変トラスツズマブ（チオMab）への正常な結合の実証
方法：
抗体軽鎖に導入されたシステイン変異（V205C）を含むトラスツズマブを、10mg/mlの濃度で、10%DMAの存在下で、pH 7.4の緩衝液中において、40倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEに結合させた。結合反応液を、35℃で48時間インキュベートした。
結果：
トラスツズマブ（V2015C）-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEのHICプロファイルは、PL13が、両方のpHで、改変Cys残基を有する抗体に正常に結合することができることを実証している（図３４）。結合反応の速度および程度は、チオール微小環境に影響されるようである。
１３．ADCなどの本発明によるADCの有用性
ADC複合生成物を、セクション8で説明したように、さらにin vivoおよびin vitro試験にかけ、それらの商用ADCとしての有用性を実証した。
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのNAC存在下でのin vitro安定性）
方法：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体についての薬物-リンカー安定性を、NAC存在下で、PBS緩衝液中において評価した。
結果：
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、緩衝液中のNACの存在に影響を受けなかった（図３６）。トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、NAC存在下での安定性の減少を示した（図３５を参照）。図３６は、特に、遊離チオールからのチャレンジに起因する、ADCを含むPL13についてのプロファイルの変更はないことを実証し、構造の安定性を示している。
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、マウス血漿中におけるin vitro安定性）
ADCトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEのin vitro血清安定性を、マウス血漿中で比較した。
方法：
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEを、濾過した無胸腺ヌードマウスの血漿中に、0.2mg/mLの濃度になるよう別々にスパイクした。溶液を混合し、50μLの3倍アリコートを採取し、液体窒素中で急速凍結した（時点-0時間）。ADCの血漿溶液を、37℃で7日間インキュベートした。50μLのアリコートを、各時点：1、2、3、4、5、6、および7日間について3倍に引き上げ、分析まで-80℃で保存。
結果：
ADC安定性を、LC-ESI/MS分析により観測した。血漿試料を、MS分析の前に、予備精製およびトリプシン／CNBr消化した。4つの非結合ペプチド（重鎖から2つと軽鎖から2つ）および2つの結合ペプチド（重鎖から1つと軽鎖から1つ）を選択し、ADC安定性を観測した。非結合ペプチドからの平均データは、マウス血漿における抗体成分（全体-Ab）の安定性と調和し、結合ペプチドからのデータは、ADC複合体（LC結合、HC結合ペプチド）の安定性を示す。
このin vitroデータは、抗体成分は安定である一方で、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEは、軽鎖および重鎖の両方で脱薬を起こすことを明らかにした（図３７A）。重鎖ペプチドからの薬物損失は、軽鎖ペプチドと比較した場合、より迅速であり、薬物消失速度が結合部位に影響されることを示している。
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、7日間のインキュベーション期間を通してMMAE薬物を保持し、PL13が両方の結合部位に安定性を付与することを示す（図３７B）。両方の複合体について観測されたばらつきは、試料分析に適用したESI-MS法での試料回収の効率によるものである。
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、マウスにおけるin vivo安定性）
方法：
in vivo安定性を、5mg/kgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体を注射したマウスで評価した。血漿試料を、LC-MS分析前に、予備精製およびトリプシン／CNBr消化した。2つの結合ペプチド（重鎖から1つと軽鎖から1つ）を選択し、ADCの安定性を観測した。
結果：
複合ペプチドの安定性は、2つの事象の結果である：1）ADCの異化劣化、および2）リンカーの不安定性に起因する薬物消失。トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE由来の結合ペプチドは、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE由来のペプチドよりも優れた安定性を、マウス血漿中1日目で示す。観測された差は、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE由来の結合ペプチドからの薬物消失が、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEからよりも速いことに起因する可能性が高く、これはin vitroでのマウス血漿データと一致しており、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEについて、インキュベーションの最初の4日以内の急速な脱薬を示している（図３８）；軽鎖に結合した薬物の約70%、重鎖については薬物の90%が、最初の2日以内に消失した。対照的に、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、より長期間にわたるリンカーの安定性により、より多くの薬物を保持している。
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、種々の細胞株におけるin vitro安定性）
図３９A〜３９Cにおいて、SKBR3、BT747およびJIMT-1の細胞死滅データを、上述のADCについて示す。SKBR3、BT747およびJIMT-1細胞株をこの試験で選択したが、それは、それらがHER2受容体を発現することが知られているためである。さらに、JIMT-1細胞株は、トラスツズマブに耐性であることが知られている。図３９A〜３９Cにおいて、「ADC mal」は、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに関し、「ADC-PL13」は、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに関する。試験した複合体の3つの細胞株に対する相対的in vitro活性は、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEが、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに匹敵するというデータを示している。したがって、このデータは、本発明のADCは活性を有し、そのためPL13の存在が細胞死滅に対して負の影響を与えないことを示している。
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブPL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、乳がん細胞腫瘍を示すマウスにおけるin vivo安定性）
異種移植片データを、図４０、４１および４２に、乳がん細胞腫瘍を示すマウスに対するADCの効果に関連して示す。利用した乳がん細胞株は、BT474であった（トラスツズマブに対して高い感受性を有するHer2発現体）。
マウスの体重を使用して（図４０に示すように）、ADCのin vivoでの毒性を測定した。トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-mal）（図４０A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）（図４０B）は、治療期間にわたって、マウス体重にほとんど影響しないことが、得られたデータから見ることができる。これは、本発明のADCの、商業的に使用するのに適した毒性レベルであるという指標である。
図４１は、3つの用量（0.1、5および10mg/kgで）で試験したADCの、21日の治療期間にわたる腫瘍成長に対する有効性を示している。腫瘍成長を、腫瘍体積の変化により測定した。両化合物で0.1mg/kgで処理したマウスは、未処理群に比べて遅い腫瘍成長を経験した。対照的に、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-mal）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）を、5および10mg/kgで投与された全動物は、治療期間にわたって完全な反応を示した。
図４２は、3つの用量（0.1、5および10mg/kg）で試験したADCの、10日間の治療期間にわたる腫瘍成熟組織学的表現型に対する有効性を示している。腫瘍組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色後に顕微鏡で検査し、次のように等級付けした：
0：異種移植片の塊なし；時折、皮下組織または脂肪組織にて分離された腫瘍細胞
1：小断片化した塊；不完全な上皮発生過程
2：顕著な細胞消失を示す異種移植片
3：成熟腫瘍の領域での帯状のセル損失
4：完全な上皮発生過程および関連病状を示す無傷の異種移植片の塊
腫瘍成熟の減少は、0.1mg/kgで投与されたトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）またはトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-mal）のどちらについても観測されず、2つのADC間で有意差は観測されなかった。しかし、5および10mg/kgで投与されたトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、3日目から腫瘍成熟の有意な減少を示した（それぞれグレード3およびグレード3/2）。この効果は、10日目に腫瘍塊を示さないいくつかの試料（5mg/kgについてグレード1、10mg/kgについてグレード1/0）でより顕著であった。5および10mg/kgで投与されたトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、3日目から腫瘍成熟を減少させたが（それぞれグレード4/3とグレード4/3/2）、その効果は、対応用量でトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを投与された動物と比較して3日目にはあまりはっきりしなかった。さらに、5および10mg/kg用量での10日目の腫瘍の不均一性は、ADC-malについての方が、ADC-PL13で観測されるよりも著しく大きかった。
１４．PL11-PEG20kDa、PL12-PEG20kDaおよびPL13-PEG20kDaリンカーの、アルブミンとの反応性の実証
上述したように、市販グレードのアルブミンに存在するシステインチオールの大部分がキャップされており、そのため、還元工程が、リンカー分子との結合の前に必要である。
方法：
アルブミン（221μM）を、ジチオスレイトール（DTT）（1mM）で、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（1mM）を含有するpH 7.0のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、室温（RT）で1時間かけて還元し、その後Nap-5カラムで脱塩し、UV測定により定量した。20kDaのPEG-PL-12（10モル過剰）または20kDaのPEG-PL-13（10モル過剰）の還元アルブミン（20μM）への結合を、pH 7.4、1mMのEDTA、PBS中で室温で1日かけて行った。同様に、20kDaのPEG-マレイミド（1.1モル過剰）の還元アルブミン（20μM）への結合を、pH 7.4、1mMのEDTAを含有するPBS中で室温で1日かけて行った。反応をSDS-PAGEゲルで分析し、定量を、SDS-PAGEゲル上のタンパク質バンド密度をImageLabソフトウェア（BioRad）を用いて分析することにより行った。
結果：
中等度の結合収率のみを、還元した商用グレードのアルブミンで1日後に観測した。PL12は同じ期間にわたって若干低い収率をもたらしたのに対し、PL13の結合は、マレイミド対照に匹敵する収率で進行した。これは、図４３に示されている。
１５．アルブミンへのPL11、PL12およびPL13結合の最適化
リンカーのアルブミンへの結合を、PL-11についてpH 5.5で、PL-12とPL-13についてpH 5.5、6.5、7.5、8.0および8.5で測定した。
方法：
PL-11（10モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、37℃で24時間かけ、pH 5.5の酢酸ナトリウム50mM中で行った。PL-12およびPL-13（10モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、以下の緩衝液中で行った：50mMの酢酸ナトリウム、pH 5.5；1mMのEDTAのPBS、pH 6.5；1mMのEDTAのPBS、pH 7.5；100mMのリン酸塩；1mMのEDTA、pH 8.0；および100mMの炭酸ナトリウム、1mMのEDTA、pH 8.5；37℃で24時間。
完了時に、全アルブミン試料を、Nap-5カラムで、PBS緩衝液（pH 7.4）中に脱塩した。結合効率を、エルマンアッセイにより定量した。エルマンアッセイは、5,5'-ジチオ-ビス-（2-ニトロ安息香酸）を遊離チオール基で反応させることにより、遊離システイン残基を検出および定量化する。アルブミンの34Cysの遊離チオール基へのリンカー分子の結合は、非結合アルブミン対照と比較して、エルマン試薬によるこれらの基の検出を阻害する。検出可能な遊離チオールの濃度の減少を利用し、アルブミンに結合したリンカー分子の量を定量した。
結果：
PL-11のアルブミンへのpH5.5での結合は、82%の収率で進行した。PL-12（91%）およびPL-13（94%）の結合についての最適pHは、7.5であると測定された。これらの結果を、図４４に示す。
１６．リンカー-アルブミン複合体の安定性のESI-MSによる実証
加えて、アルブミン-PL11、アルブミン-PL12およびアルブミン-PL13複合体を、ESI-MSにより分析した。
方法：
PL-11（20モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、EDTA（1mM）を含有するpH 6.5のPBS中で37℃で24時間かけて行った。PL-12およびPL-13（10モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、EDTA（1mM）を含有するpH7.5のPBS中で37℃で24時間かけて行った。アルブミン-リンカー複合体を、ESI-MSにより分析した。
結果：
図４５は、アルブミン-PL-11結合（A）、アルブミン-PL-12結合（B）およびアルブミンPL-13結合（C）について得られたESI-MSの結果を示している。
以下のアルブミン種を、MS信号強度に基づいて検出および定量した（MWは、分子量を表すことに注意）：

アルブミン-PL11
・非結合アルブミン - 6%
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW = 66445Da）
・アルブミン-PL11複合体 - 90%
アルブミン-PL11の予想MW - 66649Da（検出MW = 66650Da）
・2つのPL11に結合したアルブミン〜4%
アルブミン-2-PL11の予想MW - 66858Da（検出MW = 66858Da）

アルブミン-PL12
・非結合アルブミン - 1%
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW= 66441Da）
・アルブミン-PL12 - 92%
アルブミン-PL12の予想MW - 66663Da（検出MW = 66664Da）
・2つのPL12に結合したアルブミン - 7%
アルブミン-2-PL12の予想MW - 66886Da（検出MW = 66886Da）

アルブミン-PL13
・非結合アルブミン - 5%
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW = 66441Da）
・アルブミン-PL13 - 94%
アルブミン-PL13の予想MW - 66631Da（検出MW = 66632Da）
・2つのPL13に結合したアルブミン - 1%
アルブミン-2-PL13のMW予想 - 66822Da（検出MW = 66822Da）
具体的には、図４５を参照して、ピーク（4501）、（4504）および（4507）は未反応で酸化されたアルブミンに対応しており、ピーク（4502）、（4505）および（4508）は単一結合アルブミンに対応しており、ピーク（4503）、（4506）および（4509）は二重結合アルブミンに対応している。
１７．アルブミン-リンカー複合体のグルタチオンにおける安定性の実証
アルブミン-リンカー分子複合体の安定性を、過剰のグルタチオンの存在下で測定し、ESI-MSにより7日間にわたって分析した。
方法：
アルブミン-PL-12複合体の試料（0.5mg/ml）を、還元グルタチオン（1mM）と共に、PBS（pH 7.4）中、37℃で7日間インキュベートした。試料を、ESI-MSで分析した。
結果：
図４６は、代表的な例としてのアルブミン-PL-12複合体について得られた結果を示している。同様の傾向が、アルブミン-PL-11およびアルブミン-PL-13複合体について観測された。
図４６は、0、1、4および7日目のESI-MSの結果を示している。図４６において、ピーク（4601）、（4603）、（4605）および（4608）はアルブミンに対応しており、ピーク（4602）、（4604）、（4606）および（4609）はアルブミン-PL12複合体に対応しており、ピーク（4607）および（4610）はGSH-アルブミンに対応している。したがって、以下が示される：

・存在する主要な種は、アルブミン-PL12複合体（MW = 〜66664Da）である。
・1mMのグルタチオンとのインキュベーションに際して、アルブミン-GSH信号（〜8%、MW = 66752 Da）の非常に遅い増加が、グルタチオンとのインキュベーションの4日目からあり、インキュベーションの7日目に〜13%に達する。
本発明のアルブミン-リンカー複合体は、競争環境で良好な安定性を示すと結論付けることができる。
１８．本発明によるリンカーを用いた、アルブミン-ドキソルビシン複合体の生成
方法：
アルブミンと、チオアルブミン（単一システイン変異体）と、チオアルブミン（二重システイン変異体）とを、14、20および30倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシンリンカー（図４７）に、それぞれ結合させた。反応を、147mMのリン酸ナトリウム中、pH 7.5で、10%v/vのDMAおよび0.6mMのEDTAの存在下で、37℃で2日間暗所で行った。この時間の後、反応液を、pH7.4のPBS緩衝液で平衡化したPD-10カラムで脱塩した。
結合効果を、紫外可視分光法により、ドキソルビシンの495nm（ε=8030M-1、cm-1）での吸光度と吸光係数、およびアルブミンの280（ε=34445M-1、cm-1）でのそれを用い、以下の式により280nmでのドキソルビシン吸光度を補正して、測定した：
アルブミン-ドキソルビシン複合体の凝集の程度を、非還元SDS-PAGEおよびSECクロマトグラフィーでの分析により測定した。
SDS-PAGEローディング緩衝液中の、10μlの各アルブミン-ドキソルビシン複合体を、NuPAGE 4〜12% Bis-Trisゲルに入れ、200Vで45分間実行した。ドキソルビシンの天然の蛍光特性を利用して、タンパク質種用のクマシー色素でのゲルの染色の前に、アルブミン-ドキソルビシン複合体を可視化した。
5μlの各複合体を、pH 7.0の150mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したSEC HPLCカラムに入れ、1mL/分の流速で溶出し、280nmで検出した。
結果：
野生型アルブミンとアルブミン変異体へのドキソルビシンの結合は、アルブミンでは収率55%、チオアルブミン-単一変異体では32%、チオアルブミン-二重変異体では14%という結果になった（図４８を参照）。
SDS-PAGE分析は、全てのアルブミン-ドキソルビシン試料中で、少量の高分子量種（HMWS）の存在を明らかにした（図４９を参照）。このデータは、SEC分析により観測されたものと一致している（図５０を参照）。加えて、SDS-PAGE分析は、紫外可視分光法により観測されたドキソルビシンのアルブミンへの結合を確認した（図４９を参照、DOX蛍光）
アルブミン-ドキソルビシンおよびチオアルブミン-ドキソルビシン複合体を、非結合アルブミンおよび非結合チオアルブミン対照と共に、SECクロマトグラフィーにより分析した。ドキソルビシン複合体の分析は、モノマー含量が、アルブミン-DOXでは約97.6%であり、アルブミン-DOX（単一変異体）では86.8%であり、アルブミン-DOX（二重変異体）では88.2%であることを示した（図５０B、DおよびFを参照）。非結合アルブミンとチオアルブミン対照（図５０A、CおよびEを参照）は、ドキソルビシン結合種と同様のモノマーおよび高分子量種含量を示した。具体的には、図５０は、HMWSの存在に対応する（5001）、（5003）、（5005）、（5007）、（5009）および（5011）でのピークと、モノマー含量に対応する（5002）、（5004）、（5006）、（5008）、（5010）および（5012）でのピークとを示している。
両チオアルブミン変異体は、野生型アルブミンよりも高い凝集傾向を示している：天然アルブミンでは2.4〜2.6%であるのと比べて、チオアルブミン（単一変異体）では13.2〜14.5%であり、チオアルブミン（二重変異体）では11.8〜16.6%である。これらの試料の分析は、PL13-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイルを介したドキソルビシンの結合が十分に忍容され、追加的な凝集を生じなかったことを確認した（図５０A、CおよびFを参照）。
したがって、本発明のタンパク薬物複合体は、既知タンパク薬物複合体の適切な代替物を提供することが示された。また、本発明のタンパク薬物複合体に組み込まれたリンカーは、薬物をタンパク質に正常に結合させ、薬物を標的組織に到達するまで保持することにより、安全で効果的な薬物送達を可能にする。

Claims (23)

  1. 球状タンパク質と、リンカーと、薬物とを含むタンパク薬物複合体であって、リンカーが、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む、タンパク薬物複合体。
  2. 前記球状タンパク質がアルブミンである、請求項１に記載のタンパク薬物複合体。
  3. 前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項２に記載のタンパク薬物複合体。
  4. 前記球状タンパク質が、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載のタンパク薬物複合体。
  5. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載のタンパク薬物複合体。
  6. 前記薬物が細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  7. 前記細胞毒素が、生物活性のある細胞毒性物質である、請求項６に記載のタンパク薬物複合体。
  8. 前記細胞毒素が抗がん剤である、請求項６または請求項７に記載のタンパク薬物複合体。
  9. 前記リンカーが、一般式：
    を有する分子を含み、
    式中：
    − XおよびYは、独立して、CHまたはNから選択され；
    − R1は、以下から選択され；
    (CH2)n-C(O)-R、または
    (CH2)m-Z-R、または
    (CH2)m-Z-C(O)-R、または
    (CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
    (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)n-CH(CO2R2)2、または
    (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
    (CH2)n-Z1、
    ここで、
    Zは、独立して、NH、OまたはSから選択され、
    Z1は、独立して、N3またはOHから選択され、
    nは0〜10の任意の整数であり、
    mは0〜10の任意の整数であり、および
    Rは、H、OH、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基であり；
    − R2および／またはR3は、R1と同様の分子群から選択されるか、またはR2および／またはR3は、水素、またはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、-CO2R4、-COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで、R4およびR5は、独立して、水素またはC1-10アルキルから選択される；または
    − R2および／またはR3は、水素、アルキルまたはフェニルから選択される；または
    − R2およびR3は、一緒になって、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、アジリジンまたはプリンが挙げられるが、これらに限定されない縮合（ヘテロ）芳香族環置換基を形成する、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  10. ZがOであり、R1と、任意にR2とR3とが、R1と同様の分子群から選択され、環の2または6位にある場合、mが少なくとも3であるという条件で、前記リンカーが一般式（I）を有する分子を含む、請求項９に記載のタンパク薬物複合体。
  11. 前記リンカーが4-ビニルピリジンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  12. 前記リンカーが、以下の式：
    で表されていてもよく、
    式中：
    R1は、以下から選択され；
    (CH2)n-C(O)-R、または
    (CH2)m-Z-R、または
    (CH2)m-Z-C(O)-R、または
    (CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
    (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
    (CH2)n-CH(CO2R2)2、または
    (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
    (CH2)n-Z1；
    ここで、
    R2は、R1と同様の分子群、水素、電子求引性基、アルキルまたはフェニル基から選択され、
    Zは、独立して、NH、O、またはSから選択され、
    Z1は、独立して、N3またはOHから選択され、
    nは0〜10の任意の整数であり、
    mは0〜10の任意の整数であり、
    Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基である、
    請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  13. ZがOである場合、mが少なくとも3であるという条件で、前記リンカーが一般式（III）を有する分子を含む、請求項１２に記載のタンパク薬物複合体。
  14. 前記リンカーがポリ（アルキレングリコール）基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  15. 前記ポリ（アルキレングリコール）基が、ポリエチレングリコール（PEG）である、請求項１４に記載のタンパク薬物複合体。
  16. 前記ポリ（アルキレングリコール）構造が、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、アジド、スクシンイミジルまたはチオール基を含む1つ以上の反応性官能基を備える、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体ADC。
  17. 延長リンカーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
  18. 前記延長リンカーが、酵素切断可能である、請求項１７に記載のタンパク薬物複合体。
  19. 前記タンパク質を、前記薬物に結合している前記リンカーと接触させることを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体の製造方法。
  20. 少なくとも1つの反応性チオール基を有するタンパク質を、タンパク質の少なくとも1つの遊離チオール基と反応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試薬を含む前記リンカーと接触させることを含み、前記リンカー官能基化試薬がポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合している、請求項１９に記載の方法。
  21. ビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む前駆官能基化試薬を、ポリ（アルキレングリコール）分子と反応させ、官能基化試薬を生成させる初期工程を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. タンパク質を修飾し、変異ポリペプチドを、該ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有するように生成させる初期工程をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 治療における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬物タンパク複合体。
JP2017507012A 2014-10-27 2015-10-27 タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法 Pending JP2018502045A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1419108.4A GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-10-27 Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
GB1419108.4 2014-10-27
GB1503012.5 2015-02-23
GB201503012A GB201503012D0 (en) 2014-10-27 2015-02-23 Materials and methods relating to linkers for use in antibody or albumin drug conjugates
PCT/GB2015/053227 WO2016067021A1 (en) 2014-10-27 2015-10-27 Materials and methods relating to linkers for use in protein drug conjugates

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020092494A Division JP7057391B2 (ja) 2014-10-27 2020-05-27 タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2018502045A true JP2018502045A (ja) 2018-01-25

Family

ID=52103473

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017507012A Pending JP2018502045A (ja) 2014-10-27 2015-10-27 タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法
JP2020092494A Active JP7057391B2 (ja) 2014-10-27 2020-05-27 タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020092494A Active JP7057391B2 (ja) 2014-10-27 2020-05-27 タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法

Country Status (19)

Country Link
US (1) US11285220B2 (ja)
EP (1) EP3223853B1 (ja)
JP (2) JP2018502045A (ja)
KR (1) KR102530542B1 (ja)
CN (2) CN116115771A (ja)
AU (1) AU2015340370B2 (ja)
DK (1) DK3223853T3 (ja)
ES (1) ES2923853T3 (ja)
GB (2) GB201419108D0 (ja)
HR (1) HRP20221120T1 (ja)
HU (1) HUE059641T2 (ja)
IL (1) IL250664B (ja)
LT (1) LT3223853T (ja)
PL (1) PL3223853T3 (ja)
PT (1) PT3223853T (ja)
RS (1) RS63552B1 (ja)
RU (1) RU2737553C2 (ja)
SI (1) SI3223853T1 (ja)
WO (1) WO2016067021A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020123275A1 (en) * 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
CN111650267B (zh) * 2020-06-11 2023-02-28 南京师范大学 一种系列共轭芳香分子掺杂蛋白质的制备及调节蛋白质电子传输带隙的方法
GB202300668D0 (en) 2023-01-17 2023-03-01 Univ Bradford Cancer treating compounds

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8603537D0 (en) 1986-02-13 1986-03-19 Parker D Conjugate compound
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988005433A1 (en) 1987-01-15 1988-07-28 Celltech Limited Thiol-reactive cross-linking reagents
JPH0778082B2 (ja) 1989-12-25 1995-08-23 日本ゼオン株式会社 大粒径ラテックスの製造方法
GEP20033082B (en) 1991-03-15 2003-10-27 Amgen Inc Pegylation of Polypeptides
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6309646B1 (en) 1996-05-09 2001-10-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Protein-polysaccharide conjugate vaccines and other immunological reagents prepared using homobifunctional and heterobifunctional vinylsulfones, and processes for preparing the conjugates
AU2001238595A1 (en) 2000-02-22 2001-09-03 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
CA2473526C (en) 2002-01-18 2013-10-22 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
US7659241B2 (en) 2002-07-31 2010-02-09 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
RS20050202A (en) 2002-09-09 2007-08-03 Nektar Therapeuticals Al.Corporation, Water-soluble polymer alkanals
BR122018071808B8 (pt) * 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
NZ561211A (en) * 2005-03-25 2011-03-31 Genentech Inc Methods and compositions for modulating hyperstabilized C-met
ES2579323T3 (es) * 2007-07-16 2016-08-09 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79B e inmunoconjugados y métodos de uso
US8609105B2 (en) 2008-03-18 2013-12-17 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
WO2010009124A2 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
GB0823309D0 (en) 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
FR2968663A1 (fr) 2010-12-09 2012-06-15 Univ Strasbourg Peptides et medicament antiviral
PL2675479T3 (pl) 2011-02-15 2016-09-30 Cytotoksyczne pochodne benzodiazepiny
CN102206267A (zh) 2011-04-18 2011-10-05 中国药科大学 一种肿瘤坏死因子受体1前配体装配域缀合物的结构及用途
MX2015005122A (es) 2012-10-24 2015-10-29 Polytherics Ltd Conjugados de farmaco-proteina novedosos.

Also Published As

Publication number Publication date
HUE059641T2 (hu) 2022-12-28
IL250664B (en) 2022-08-01
AU2015340370A9 (en) 2019-08-01
HRP20221120T1 (hr) 2022-11-25
CN116115771A (zh) 2023-05-16
JP7057391B2 (ja) 2022-04-19
NZ728857A (en) 2023-08-25
PT3223853T (pt) 2022-08-01
EP3223853A1 (en) 2017-10-04
RU2017103462A3 (ja) 2019-04-04
RS63552B1 (sr) 2022-09-30
KR20170076651A (ko) 2017-07-04
LT3223853T (lt) 2022-10-10
US11285220B2 (en) 2022-03-29
JP2020147581A (ja) 2020-09-17
DK3223853T3 (da) 2022-08-22
RU2737553C2 (ru) 2020-12-01
WO2016067021A1 (en) 2016-05-06
RU2017103462A (ru) 2018-11-29
US20170232108A1 (en) 2017-08-17
GB201419108D0 (en) 2014-12-10
CN107073133A (zh) 2017-08-18
WO2016067021A9 (en) 2018-03-15
ES2923853T3 (es) 2022-10-03
GB201503012D0 (en) 2015-04-08
EP3223853B1 (en) 2022-06-22
PL3223853T3 (pl) 2022-10-10
US20180092981A9 (en) 2018-04-05
KR102530542B1 (ko) 2023-05-08
IL250664A0 (en) 2017-06-29
SI3223853T1 (sl) 2022-10-28
AU2015340370B2 (en) 2020-07-02
AU2015340370A1 (en) 2017-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7360377B2 (ja) アントラサイクリン誘導体を含む、結合タンパク質薬物複合体（Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
ES2788864T3 (es) Conjugados de anticuerpo-fármaco e inmunotoxinas
JP7057391B2 (ja) タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーに関連する材料および方法
JP6585600B2 (ja) Ｃ末端軽鎖ポリペプチド伸長を含有する抗体、ならびにその複合体及びその使用方法
US20210061916A1 (en) Anti-prlr antibody-drug conjugates (adc) and uses thereof
CN115175917A (zh) 药物缀合物及其应用
JP2023552290A (ja) Ｇｐｃ３結合剤、そのコンジュゲートおよびその使用方法
JP2020532523A (ja) 抗ｅｇｆｒ抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）及びその使用
US20230158154A1 (en) Conjugates comprising a phosphorus (v) and a camptothecin moiety
NZ728857B2 (en) Materials and methods relating to linkers for use in protein drug conjugates
Sivado New bacterial transglutaminase Q-tag substrate for the development of site-specific Antibody Drug Conjugates
JP2023546293A (ja) 抗ｃｓｐｇ４結合剤、そのコンジュゲートおよびその使用方法
EA040604B1 (ru) Конъюгаты, связывающие белок-лекарственное средство, содержащие производные антрациклина

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180731

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190625

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190925

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200128