KR20170076651A - 단백질 약물 콘주게이트에서 사용하기 위한 링커와 관련된 물질 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질 약물 콘주게이트, 이를 제조하는 방법, 및 치료법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 타겟화된 약물 전달 적용에서 사용하기 위한 구성 단백질, 개선된 링커 및 약물을 포함하는 단백질 약물 콘주게이트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단백질 약물 콘주게이트(protein drug conjugate), 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 단백질 약물 콘주게이트를 제공하기 위해 단백질, 링커(linker) 및 약물, 예를 들어, 세포 독소(cytotoxin)를 제공하는 것에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 단백질 약물 콘주게이트에서 사용하기 위한 개선된 링커, 및 상기 단백질 약물 콘주게이트에 상기 링커를 도입하는 방법을 제공한다. 더욱 상세하게, 단백질 약물 콘주게이트는 항체 약물 콘주게이트(antibody drug conjugate; ADC), 또는 알부민 및 링커 함유 약물 콘주게이트일 수 있다.
단백질 약물 콘주게이트, 특히, 항체 약물 콘주게이트는 치료를 위한 특정 조직에 매우 강력한 약물의 타겟화된 전달을 제공하는 것으로 알려져 있다. 더욱 상세하게, 통상적으로 불안정한 결합을 갖는 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포 독성 또는 약물 페이로드(drug payload)에 결합된 항체로 이루어진 ADC는 항암 치료에서 사용하기 위한 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질 약물 콘주게이트에 의해 제공된 타겟화된 전달은 건강한 조직과 병이 걸린 조직 사이를 민감하게 구별하는 항체 등의 능력을 형성시키고, 이에 따라, 매우 강력한 약물의 안전한 전달을 보장한다.
이러한 항체로서, 특히, 모노클로날 항체(mAb)가 타겟화된 연구, 치료, 진단 및 다른 생명공학기술 용도에서 유용하다. 보다 상세하게, mAb는 타겟화된 치료 및 약제의 영역에서 유용하다. mAb는 항체 약물 콘주게이트(ADC)를 이용한 치료에 도입에 의해 사용될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, ADC는 다른 것들 중에서, 암의 치료에서 특별히 유용한 것으로 여겨지는 타입의 생체활성 약제로서, 비교적 새로운 기술이다. 일반적으로, 암의 치료를 위한 ADC(예를 들어)는 세포독성 페이로드 또는 약물에 결합된 mAb를 포함할 것이며, 이는 세포 사멸 작용을 제공할 수 있다. mAb와 세포 독성 물질(세포 독소) 간의 연결은 일반적으로, 화학적으로 안정한 링커 분자에 의해 제공될 것이다. 두 가지 타입의 ADC 링커 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다: 즉, 분열 가능한 타입 및 비-분열 가능한 타입. 분열 가능한 ADC 링커 시스템에 대하여, 바람직하게 효소적으로 구동되는 방출 메카니즘이 존재하며, 문헌[Methods in Molecular Biology, Volume 1045, 2013, published by Humana Press]에 기술된 바와 같이, 화학적으로 불안정한 대안적인 분열 가능한 시스템이 알려져 있다. 비-분열 가능한 ADC 링커 시스템에서, 방출 경로는 ADC가 사용 중일 때, 세포의 기구(machinery)에 의한 mAb 분해로 인한 것이다.
ADC Adcetris®(Seattle Genetics/Takeda Group) 및 Kadcyla®(Genentech/Roche)의 유럽 및 미국에서의 시장 승인(market approval)은 증가된 연구를 바이오치료제(biotherapeutics)의 이러한 ADC 부류로의 길을 열였다.
하기에 나타낸 Adcetris®(또한, 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)으로서 공지됨)는 단백질 CD30에 관한 것으로서, 이는 전통적인 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma; HL) 및 전신 역성형 대세포 림프종(systemic anaplastic large cell lymphoma; sALCL)에서 발현되는 것이다. 브렌툭시맙 베도틴은 카텝신 분열 가능한 링커(발린-시트룰린)에 연결된 키메라 모노클로날 항체 브렌툭시맙(cAC10, 이는 세포막 단백질 CD30을 타겟화함), 파라-아미노벤질카바메이트 스페이서 및 세포분열 저지제(antimitotic agent) 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)로 이루어진다.
하기에 나타낸 Kadcyla®는 세포 독성제 메르탄신(DM1)에 결합된 모노클로날 항체 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 이루어진 ADC인 트라스투주맙 엠탄신이다. 트라스투주맙 단독은 HER2/neu 수용체에 대한 결합에 의해 암 세포의 성장을 정지시키는 반면, 메르탄신은 세포로 진입하고, 튜불린에 대한 결합에 의해 세포 분화를 방해하고, 궁극적으로, 이러하 결합 작용은 세포 아폽토시스(apoptosis)를 야기시킬 것이다. 콘주게이트는 통상적으로, T-DM1로 약칭된다. 트라스투주맙 엠탄신의 각 분자는 SMCC로서 알려진 가교 시약을 통해, 설프하이드릴 기를 함유한 세포독성 마이탄시노이드인 수 개의 메르탄신 분자에 결합된 단일 트라스투주맙 분자로 이루어진다. SMCC는 숙신이미드 에스테르 및 말레이미드인 두 개의 반응성 작용기를 함유한 이작용성 가교제인 숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트이다. SMCC의 숙신이미드 기는 트라스투주맙 분자에서 라이신 잔기의 유리 아미노 기와 반응하며, SMCC의 말레이미드 모이어티는 메르탄신의 유리 설프하이드릴 기에 결합하여, 항체와 메르탄신 간에 공유 결합을 형성시킨다.
ADC가 당해 분야에 널리 공지되어 있지만, 약물 페이로드의 타겟화된 전달을 제공하는 능력을 갖는 구상 단백질을 포함하는 다른 단백질 약물 콘주게이트는 널리 공지되어 있지 않다. 예를 들어, 알부민은 이러한 단백질 약물 콘주게이트에서 항체에 대한 적합한 대안을 제공할 수 있다.
알부민은 각각이 두 개의 서브도메인, 즉 A 및 B로 이루어진, 세 개의 구조적으로 동종이고(homologous) 거의 나선형 도메인(I, II 및 III)으로 이루어진다. 다른 포유동물 알부민과 같이, 인간 알부민은 17개의 디설파이드 브릿지 및 Cys34에서 유리 티올을 함유하며, 이는 혈청에서 가장 큰 분율의 유리 티올을 제공한다.
알부민은 혈액의 콜로이드성 삼투압의 원인이 되는 주요 단백질이고, 장쇄 지방산, 빌리루빈, 금속 이온, 예를 들어, 구리(II) 및 니켈(II), 칼슘 및 아연을 위한 수송 비히클(transport vehicle)로서 기능한다. 알부민은 대략 20일의 혈청 반감기를 가져서, 단백질의 크기(대략 67 kDa) 및 또한 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 재순환의 결과에 기여할 수 있다. FcRn은 리소좀에서 단백질 분해로부터 브로쓰(both)를 보호하는 pH-의존적 비-경쟁적 방식으로, 알부민, 뿐만 아니라 항체(보다 상세하게, IgG)를 재순환시킨다. 알부민을 순환시키는 것은 내피 세포에 의해 내부화되며, 여기서, 이는 조기 엔도솜의 산성 환경(pH 6)에서 FcRn에 결합한다. 이는 알부민을 세포의 표면으로 재순화시키고 혈액으로 역으로 방출되게 한다(생리학적 pH). 알부민은 세포 독성 약물에 공유적으로 콘주게이션되거나, 대안적으로 생체이용률을 증가시키고 약물 약동학을 개선시키기 위해 단백질-기반 치료제에 융합될 수 있다.
고형 종양은 투과 가능한 맥관 구조 및 또한 불량한 림프 배출을 가지고, 이는 종양 간질액 내에서 거대 분자(>40 kDa)의 축적 및 체류를 야기시킨다. 다양한 악성 고형 종양에서 알부민의 체류에 대한 연구가 입증되었다. 또한, 다양한 수용체에 의한 알부민의 특이적 결합에 대한 증거가 알려져 있으며, 이들 중 일부는 악성 세포 상에서 상당히 발현되는 것으로 나타났다. 유사하게, 알부민은 혈액-관절 배리어(blood-joint barrier)의 투과성의 증가로 인해 류머티스 관절염 환자의 염증 관절에 축적하는 것으로 알려져 있다. 약물 전달에서 알부민의 공지된 적용은 갈락토오스 잔기를 함유한 알부민 콘주게이트를 사용한 간 타겟화이며, 이는 단지 이러한 세포 상에 대량으로 및 높은 친화력으로 존재하는, 아시알로글리코단백질 수용체(ASGP-R)와의 상호작용 후에 간세포로 진입한다.
이에 따라, 이러한 타겟화 성질, 뿐만 아니라, 이의 이용 가능성, 생분해성, 독성 및 면역원성의 부족, 및 이의 상당히 긴 반감기를 갖도록 조정은 알부민을 약물 전달을 위한 적합한 후보물질로 만든다. 이와 같이, 알부민은 단백질 약물 콘주게이트 시스템에서 항체에 대한 적합한 대안을 나타낸다.
타겟 조직에 약물 또는 세포 독성 페이로드의 성공적인 전달은 단백질 및 약물에 결합하고 단백질 약물 콘주게이트가 타겟 조직에 도달할 때까지 결합을 유지하는 링커의 능력에 의존적이다. 이에 따라, 성공적인 전달을 제공하는 이러한 단백질 약물 콘주게이트에서 사용하기 위한 대안적인 및/또는 개선된 링커를 제공하는 것이 요구된다.
추가적으로, 세포 독성 약물 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드의 안전하고 효과적인 전달을 위한, 신규하고/거나 개선된 단백질 약물 콘주게이트, 예를 들어, 알부민을 포함하는 것을 제공하는 것이 요구된다.
일 구체예에서, 세포 아폽토시스 성질들을 효과적으로 제공할 수 있는, 대안적이고 개선된 ADC를 제공하는 것이 요구된다. 보다 상세하게, 상기 ADC의 제작 동안 선택적이고 효과적인 콘주게이션을 보장하고 사용할 때 효과적인 세포 독소 페이로드를 제공하기 위해 개선된 ADC 링커 분자를 제공하는 것이 요구된다.
이에 따라, 본 발명의 제1 양태에서, 구상 단백질, 링커 및 약물을 포함하는 단백질 약물 콘주게이트가 제공된다. 보다 상세하게, 본 발명은 단백질 상에 존재하는 라이신 또는 시스테인 기를 통한 부위 특이적 콘주게이션을 제공할 수 있는 링커를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트, 바람직하게, 비닐 치환체를 포함하는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 제공한다.
본 발명은 단백질 및 약물, 예를 들어, ADC 분자를 제공하기 위한 항체 및 세포를 연결시키는데 유용성을 갖는 단백질 약물 콘주게이트에서 사용하기 위한 링커를 제공한다. 링커는 약물의 개선된 타겟화된 페이로드를 제공한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 링커는 ADC에서 사용하기 위한 현재 공지된 링커 분자와 비교하여 증가된 안정성을 갖는 단백질 약물 콘주게이트를 제공하며, 이에 따라, 개선된 안전성 성질 및 결과적으로 향상된 내성 프로파일을 갖는 단백질 약물 콘주게이트를 제공한다. 보다 상세하게, ADC에서 현재 기재된 링커 분자의 사용은 균등한 콘주게이션되지 않은 항체 위에, 사용할 때, ADC의 증가된 효능을 제공한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "구상 단백질(globular protein)"은 타겟화 능력을 가지고 이에 따라, 특정 타겟 조직으로 약물 페이로드를 전달하는 능력을 갖는 임의 단백질을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 이에 따라, "구상 단백질"은 항체 및 이의 분절, 알부민 및 트랜스페린, 뿐만 아니라, 약물 콘주게이트에서 사용하기 위해 공지된 임의 다른 대안을 포함한다.
"약물"은 인간 또는 동물에 대한 공지된 생물학적 효과를 갖는 임의 화학 물질을 의미한다. 특히, 약물은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단에서 또는 그밖에 물리적 또는 정신적 웰빙을 향상시키기 위해 사용되는 약제학적 약물일 수 있다. 인식되는 바와 같이, 약물은 필수적인 마케팅 허가(marketing authorisation)를 얻은 공지된 약물, 또는 시험이 아직 이루어지지 않거나 마케팅 허가를 달성하지 못한 신규한 약물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체, 링커 및 세포 독소를 포함하는 항체 약물 콘주게이트가 제공된다.
바람직하게, 항체는 항체, 또는 이의 분절, 및 더욱 바람직하게, 모노클로날 항체(mAb)이다. mAb는 임의 공지된 mAb로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 mAb의 선택에 대한 유일한 제한은 콘주게이션 반응을 일으키기 위해 시스테인 또는 라이신 잔기가 존재해야 한다는 것이다. 본 발명의 링커의 일부 특히 바람직한 구체예가 시스테인 잔기에서 존재하는 티올 기에 대한 증가된 선택성을 나타내기 때문에, mAb가 시스테인 잔기를 함유하는 것이 특히 바람직하다. 그러나, 일반적으로 바람직한 시스테인 잔기를 함유하지 않는 mAb가 동정되는 경우에, mAb에 시스테인을 도입하기 위한 방법이 당업자에게 알려져 있다.
(하기에 추가로 상세히 기술되는 바와 같이) 본 발명의 대안적인 구체예에 따르면, 항체는 알부민에 대해 치환될 수 있다.
항체 함유 ADC 또는 알부민 약물 콘주게이트에 대하여 기술될 수 있거나 기술되지 않을 수 있는 하기에 논의되는 모든 바람직한 구체예는 동일하게 단백질 약물 콘주게이트에 대한 바람직한 구체예, 뿐만 아니라, ADC 구체예 및 알부민 약물 콘주게이트 구체예로서 여겨질 수 있다. 보다 상세하게, 하기의 약물 및 링커의 설명은 단백질 약물 콘주게이트의 다양한 구체예에 동일하게 적용하는 것으로 여겨질 것이다.
약물은 세포 독성 페이로드 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 특히, 단백질이 항체 또는 이의 분절이며 단백질 약물 콘주게이트가 ADC인 경우에, 약물은 바람직하게, 세포 독소이다. 대안적으로, 단백질이 알부민인 경우에, 약물은 세포 독소 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
바람직하게, 세포 독소는 생물학적 활성 세포 독성 물질이다. 가장 바람직하게, 세포 독소는 항암 약물이다. 세포 독소는 아우리스타틴, 마이탄신, 칼리케아미신, 안트라시클린 및 피롤로벤조디아제펜을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 상세하게, 세포 독소는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 독소루비신 또는 메르탄신(DM1)일 수 있다. MMAE가 또한, (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드로서 공지된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
그러나, 추가적으로 또는 대안적으로, 세포 독소는 또한, 리신 서브유닛 및 다른 펩티드 기반 세포 독성 물질을 포함하는 다른 공지된 세포 독소들로부터 선택될 수 있으며, 이러한 물질들은 당해 분야에서 덜 통상적으로 사용된다.
약물이 치료 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에, 펩티드 또는 폴리펩티드는 치료 성질, 예를 들어, 통각억제, 항당뇨병, 항종양 또는 항바이러스 활성을 갖는 임의 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 약물은 바람직하게, 아민 기, 티올 기, 또는 카복실산 기를 포함하는데, 이러한 타입의 기들은 본 발명의 링커와 약물의 콘주게이션을 위한 이상적인 부위를 제공하기 때문이다.
바람직하게, 링커(또한, 본원에서 링커 분자 또는 링커 기로서 지칭됨)는 단백질, 예를 들어, 항체 상에 존재하는 라이신 또는 시스테인 기를 통한 부위 특이적 콘주게이션을 제공한다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 링커는 비닐 치환체를 포함하는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함한다.
매우 일반적인 용어에서, 링커는 세 가지 부분, 즉 비닐 기, 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리, 및 링커 암으로 이루어진 것으로 여겨질 수 있다. 링커 암은 링커에 결합시키기 위해 약물 또는 단백질 중 어느 하나, 예를 들어 ADC의 항체에 대한 반응 부위를 제공하기 위해 상이한 말단 기를 야기시키기 위해 변경될 수 있다.
바람직하게, 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리는 피리딘, 피리미딘, 이미다졸 또는 아지리딘 고리이다. 더욱 바람직하게, 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리는 피리딘 고리 또는 피리미딘 고리이며, 가장 바람직하게, 이는 피리딘 고리이다. 피리딘 또는 피리미딘 고리가 사용될 때, 바람직하게, 비닐 기는 질소 헤테로원자에 대해 2번 위치 또는 4번 위치에 존재한다. 4-비닐피리딘은 이러한 것이 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 특정 환경에서 상업적으로 허용되는 반응 속도를 제공하는 것으로 발견되었기 때문에 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 바람직한 링커의 예는 하기를 포함한다:
상기에 나타낸 예들 중에서, 4-비닐피리딘 구조는 특히 바람직하며, [13]으로 나타낸 구조가 가장 특히 바람직하다. 4-비닐피리딘 구조가 바람직하며, 특정 조건에서와 같이, 이러한 것은 균등한 2-비닐피리딘 구조에 비해 증가된 반응성을 나타낸다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 상기에 예시된 구조들 각각에는 주로 링커 암 상에 말단 카복실산 기가 제공된다. 그러나, 이러한 구조는 바람직하게, 치환된 형태로 제공될 수 있으며, 이에 따라, 바람직한 비닐피리딘 구조가 바람직한 폴리-(알킬렌 글리콜) 기, 가장 바람직하게 PEG 분자를 포함한다. 링커 분자 암 상에 PEG 기의 존재는, 단백질 약물 콘주게이트 제조 방법에서 요망되는 약물 대 단백질 비를 얻기 위해 연구할 때 반응 효능을 향상시키기 때문에 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
이러한 바람직한 링커 분자는 하기 예를 포함한다:
본 발명의 바람직한 구체예에서, 링커는 하기 일반식을 갖는 분자를 포함한다:
상기 식에서,
- X 및 Y는 독립적으로 CH 또는 N으로부터 선택되며,
- R1은 하기 기로부터 선택되며:
■ (CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-R, 또는
■ (CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)n-CH(CO2R2)2, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2, 또는
■ (CH2)n-Z1,
- R2 및/또는 R3은 R1과 동일한 기의 분자들로부터 선택될 수 있다. 그러나, 바람직하게, R2 및/또는 R3은 수소 또는 전자 끄는 기, 예를 들어, 할로겐(F, Cl, 또는 Br), -NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, -CN, -CF3, -SO2NR4R5로부터 선택되며, 여기서, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬로부터 선택되거나;
- R2 및/또는 R3은 수소, 알킬 또는 페닐로부터 선택될 수 있으며, 이는 링커 분자가 피리딘 고리를 포함할 때 특히 바람직한데, 왜냐하면, 대안적인 전자 끄는 기가 링커의 반응성에 대해 악영향을 미칠 수 있기 때문이거나;
- R2 및 R3은 함께, 인돌, 인다졸, 벤즈이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 아지리딘 또는 푸린을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 융합된 (헤테로) 방향족 고리 치환체를 형성한다.
R2 및/또는 R3이 알킬 기로부터 선택될 때, 메틸 기(CH3), 또는 3차-부틸((CH3)3C)이 바람직하다. 링커 분자 상의 알킬 기의 존재는, 이러한 기의 존재가 고리 구조에 존재하는 질소의 염기성을 증가시키고 균등한 링커 분자에 비해 증가된 반응성을 갖는 링커 구조를 야기시키기 때문에, 바람직하다.
R2 및/또는 R3이 전자 끄는 기로부터 선택될 때, CF3이 바람직하다. CF3의 존재는 링커 분자에 존재하는 비닐 기의 반응성을 증가시키고, 생리학적 조건 하에서 안정적이다.
대안적으로, 일부 구체예에서, 인돌, 인다졸, 벤즈이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 아지라딘 또는 푸린과 같은 더욱 연장된 융합된 헤테로시클릭 방향족 고리 시스템을 사용하는 것이 가능하다는 것이 고려된다.
상기에 제공된 화학식에서,
- Z는 독립적으로 NH, O, 또는 S로부터 선택될 수 있으며,
- Z1은 N3 기 또는 OH 기이며,
- n은 0 내지 10의 임의 정수일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, n은 0 내지 5의 수치이다.
- m은 0 내지 10의 임의 정수일 수 있다. 바람직하게, 상기 제공된 예에 나타낸 바와 같이, m은 0 내지 5이며, 가장 바람직하게, m은 0 내지 3이다. 추가적으로 또는 대안적으로, (CH2)m 기 이후 Z 기가 O 기이고 R1(동일한 기의 분자들로부터 선택되는 경우 R2 및/또는 R3)이 고리 구조 상의 2번 또는 6번 위치에 있는 링커 분자에서, O 기가 고리 구조의 질소와 이격되기 때문에, m은 바람직하게, 적어도 3이다. 이는 산소 기가 링커 분자 구조의 반응성을 지닌다는 것으로 밝혀진 감소 효과로 인한 것이다. 이러한 효과는 산소 기가 고리 구조와 더욱 이격될 때 나타나지 않는다. 이러한 상황은 상기 예시된 구조들에서 반영된다.
- R은 수소(H), 하이드록사이드(OH), 아민 또는 폴리-(알킬렌 글리콜) 기일 수 있다. 바람직하게, R은 폴리-(알킬렌 글리콜)이며, 가장 바람직하게, 이는 PEG이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, R 기가 PEG일 때, 이는 바람직하게, PEG의 첨가의 반응 산물로 인해, NH 형태의 Z 기에 의해 진행될 수 있다. 이러한 옵션(option)은 상기 제공된 R1의 일반식에서 상세히 열거된다. 일반적으로, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 상기 화학식에 나타낸 바와 같이 R1 및/또는 R2 기에 직접적으로 공유 결합된다. 링커 기 암(arm)은 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자를 단백질, 예를 들어, 항체와 더욱 가깝게 또는 멀리 떨어지게 유지하기 위해 상이한 길이를 가질 수 있다.
바람직하게, 약물, 예를 들어, 세포 독성 약물은 링커 R1 기에 결합된다. R2 및/또는 R3이 상술된 바와 같이, R1과 동일한 기의 분자들로부터 선택되는 경우에, 이의 구조에 다수의 약물이 존재하는, ADC와 같은 단백질 약물 콘주게이트를 제공하기 위해, 이러한 기들이 또한 약물, 세포 독소에 결합하는 것이 가능하다. 이러한 타입의 일부 구체예는 단백질 약물 콘주게이트에서 약물의 대칭 로딩(symmetrical loading)으로서 지칭될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, R1, 및 임의적으로 R2 및/또는 R3이 (CH2)n-CH(CO2R)2, 또는 (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2로부터 선택된 경우, 즉, 링커 암이 분지된 경우에, 약물이 링커 암의 각 말단 기에 결합하는 것이 가능하다. 이와 같이, 다수의 약물이 단백질 약물 콘주게이트에 존재하고, 약물의 비대칭 로딩(asymmetrical loading)으로서 기술될 수 있다.
바람직하게, 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리는 치환된 피리딘 고리(X 및 Y 둘 모두는 CH임) 또는 치환된 피리미딘 고리(X 및 Y 중 하나는 CH이며, 나머지는 N임)이다. 가장 바람직하게, 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리는 피리딘 고리이다.
하나의 특히 바람직한 구체예에서, R1은 하기 기술된 것들 중 어느 하나이다:
(CH2)n-C(O)-R, 또는
(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R, 또는
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R.
본 발명의 다른 구체예에서, 상술된 링커 분자 내에 연장 링커를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 연장 링커는 작용화 기의 용해도 또는 면역원성 성질을 변경시키기 위해 필수적일 수 있다. 더욱 특히, 이러한 연장 링커는 분열 가능한 ADC 링커 시스템에서 유용할 것인데, 이는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 연장 링커는 당업자에게 명백할 것이며, 특히 바람직한 연장 링커는 미국특허번호 제7,659,241호 및 미국특허번호 제5,609,105호에 기술되어 있다. 가장 바람직하게, 연장 링커는 세포내 프로테아제(intracellular protease)에 의해 분열될 수 있는 아미노산의 콜렉션(collection)을 포함하는 효소 분열 가능한 연장 링커이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 단백질 약물 콘주게이트의 단백질에 대한 링커의 결합을 촉진시키기 위해 에스테르 기를 포함하도록, 개질된 형태의 링커를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 양태는 하기에 추가로 기술될 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 링커는 하기 화학식에 의해 표현될 수 있다:
상기 식에서,
R1은 하기 기로부터 선택되며:
■ (CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-R, 또는
■ (CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)n-CH(CO2R2)2, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2, 또는
■ (CH2)n-Z1;
- R2는 R1과 동일한 기의 분자, 전자 끄는 기, 알킬 또는 페닐 기로부터 선택될 수 있다. 그러나, 바람직하게, R2는 수소 또는 전자 끄는 기, 예를 들어, 할로겐(F, Cl, 또는 Br), -NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, -CN, -CF3, -SO2NR4R5로부터 선택되며, 여기서, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬로부터 선택되거나,
- R2는 수소, 알킬 또는 페닐로부터 선택될 수 있으며, 이는 대안적인 전자 끄는 기가 링커의 반응성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 특히 바람직하다.
R2가 알킬 기로부터 선택될 때, 메틸 기(CH3), 또는 3차-부틸((CH3)3C)이 바람직하다. 링커 분자 상에 알킬 기의 존재는 이러한 기의 존재가 고리 구조에 존재하는 질소의 염기도를 증가시키고 균등한 링커 분자에 비해 증가된 반응성을 갖는 링커 구조를 야기시키기 때문에 바람직하다.
R2가 전자 끄는 기로부터 선택될 때, CF3이 바람직하다. CF3의 존재는 링커 분자에 존재하는 비닐 기의 반응성을 증가시키고, 생리학적 조건 하에서 안정하다.
상기 제공된 화학식에서,
- Z는 독립적으로 NH, O, 또는 S로부터 선택될 수 있으며,
- Z1은 독립적으로 N3 또는 OH로부터 선택되며,
- n은 0 내지 10의 임의 정수일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, n은 0 내지 5의 수치이다.
- m은 0 내지 10의 임의 정수일 수 있다. 상기 제공된 예에 나타낸 바와 같이, 바람직하게, m은 0 내지 5이며, 가장 바람직하게, m은 0 내지 3이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, (CH2)m 기 이후 Z 기가 O 기인 화학식 (III)의 링커 분자에서, O 기가 고리 구조의 질소로부터 이격되어야 하기 때문에, m은 바람직하게, 적어도 3이다. 이는 링커 분자 구조의 반응성에 대해 산소 기가 갖는다는 것으로 확인된 환원 효과(reducing effect)에 기인한 것이다. 이러한 효과는 산소 기가 고리 구조로부터 더욱 멀리 이격될 때 나타나지 않는다. 이러한 상황(situation)은 상기 예시된 구조에서 반영된다.
- R은 수소(H), 하이드록사이드(OH), 아민 또는 폴리-(알킬렌 글리콜) 기이다. 바람직하게, R은 폴리-(알킬렌 글리콜)이며, 가장 바람직하게, 이는 PEG이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, R 기가 PEG일 때, 이는 바람직하게, PEG의 첨가의 반응 산물로 인하여, NH 형태의 Z 기에 의해 진행될 수 있다. 이러한 옵션은 상기 제공된 R1의 일반식에서 상세히 나타낸다. 일반적으로, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 상기 화학식에 나타낸 바와 같이 R1 및/또는 R2 기에 직접적으로 공유 결합된다. 링커 기 암은 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자를 단백질, 예를 들어, 항체와 더욱 가깝게 또는 더욱 멀게 유지시키기 위해 상이한 길이를 가질 수 있다.
바람직하게, 약물, 예를 들어, 세포독성 약물은 링커 R1 기에 결합된다. R2가 상술한 바와 같이 R1과 동일한 기의 분자로부터 선택되는 경우에,이러한 기들이 이의 구조에 존재하는 다수의 약물과 단백질 약물 콘주게이트, 예를 들어, ADC를 제공하기 위해 약물, 예를 들어, 세포 독소에 또한 결합하는 것이 가능하다. 이러한 타입의 일부 구체예는 단백질 약물 콘주게이트에서 약물의 대칭 로딩(symmetrical loading)으로서 지칭될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, R1 및 임의적으로 R2가 (CH2)n-CH(CO2R)2, 또는 (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2인 경우에, 즉, 링커 암이 분지된 경우에, 약물이 링커 암의 각 말단 기에 결합하는 것이 가능하다. 이와 같이, 다수의 약물은 단백질 약물 콘주게이트에 존재하고, 약물의 비대칭 로딩(asymmetrical loading으로서 기술될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 링커는 화학식 (III)에 의해 표현된다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 폴리(알킬렌 글리콜) 기가 존재하는 경우에, 폴리-(알킬렌 글리콜 )분자와 약물 또는 단백질의 반응을 촉진시키기 위해 염기성 폴리-(알킬렌 글리콜) 구조에 하나 이상의 반응성 작용기, 예를 들어, 하이드록시, 아민, 카복실산, 알킬 할라이드, 아지드, 숙신이미딜, 또는 티올 기가 제공될 수 있다. 특히 바람직한 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기와 같은 화학적 기를 갖는 하나 이상의 하이드록실 위치에서 치환된 것들을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 가장 바람직한 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자에는 상기에 언급된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 분자가 있으며, 당업자는 다른 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 코폴리머와 함께 본원에 기술된 기술들을 사용할 수 있을 것이다. PEG를 포함하는 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 통상적으로, 약 200 Da 내지 약 80 kDa의 분자량을 갖는다. 바람직한 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 약 200 Da 내지 1 kDa의 분자량을 갖는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자는 당해 분야에 널리 알려져 있고, 예를 들어, Sigma Aldrich와 같은 상업적으로 이용 가능한 공급처로부터 공공연하게 입수 가능하다.
본 발명의 다른 양태에서, 비-분열 가능한 및/또는 분열 가능한 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC) 링커 시스템이 제공된다.
비-분열 가능한 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC) 링커 시스템이 제공될 수 있는데, 이는 단백질(예를 들어, 항체), 링커, 및 약물(예를 들어, 세포 독소)를 포함한다. 이러한 타입의 하나의 시스템에서, 항체 상에 아민 기의 콘주게이션은 링커 상에 존재하는 활성화된 에스테르를 통해 달성되고, 이후에, 또한 비닐 기를 통해 세포 독소에 결합한다. 이러한 비-분열 가능한 시스템에서, 항체는 바람직하게, mAb이다. 추가적으로, 링커는 바람직하게, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함하며, 세포독성 약물은 티올을 함유한다. 인식되는 바와 같이, 상술된 시스템에서, 항체는 단백질의 일 예로서 제공되고, 알부민에 대해 치환될 수 있으며, 세포 독소는 약물의 일 예로서 제공되고, 치료 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 치환될 수 있다.
이러한 타입의 대안적인 시스템에서, 항체 상에 티올 기의 콘주게이션은 링커의 비닐 기를 통해 달성되고, 이는 또한, 링커 암 상에 존재하는 폴리(알킬렌 글리콜) 기를 통해 약물에 결합한다.
대안적인 구체예에서, 분열 가능한 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC) 링커 시스템이 제공되는데, 이는 단백질(예를 들어, 항체), 링커, 연장 링커 및 약물(예를 들어, 세포 독소)을 포함한다.
분열 가능한 ADC 링커 시스템에서, 링커 분자의 비닐 치환체는 자연적으로 존재하거나 (예를 들어, 항체 상에 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기의 티올 기를 이용함으로써) 항체에 도입된 하나 이상의 티올 기와 반응하는데 특히 적합하다. 링커 측면-암(side-arm)은 이후에 바람직하게, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자를 통해 연장 링커에 연결되며, 연장 링커(extender linker)는 이러한 구체예에서, ADC에 대한 "분열 가능한" 기능을 제공한다. 세포 독소는 이후에 연장 링커를 통해 링커에 결합된다. 바람직하게, 항체는 mAb이다. 더욱 바람직하게, 링커는 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자를 포함한다. 연장 링커가 상기에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 효소 분열 가능한 것이 바람직하다. 인식되는 바와 같이, 상기 기술된 시스템에서, 항체는 단백질의 일 예로서 제공되고, 알부민에 대해 치환될 수 있으며, 세포 독소는 약물의 일 예로서 제공되고, 치료 펩티드 또는 폴리펩티드에 대해 치환될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "분열 가능한"이 자기 희생이 가능하거나 이의 약물(예를 들어, 세포독성) 페이로드(payload)를 방출시키도록 조작될 수 있는 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC)를 포함하기 위해 사용되는 것으로 이해될 것이다. 이러한 용어의 사용은 타겟 세포에 존재 시에 단지 이의 약물(예를 들어, 세포독성) 페이로드를 배출시키는 것으로 이해되는 그러한 "비-분열 가능한" 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC)와 이러한 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC)를 구별하기 위해 의도된다.
본 발명의 이러한 양태에서 사용하기 위한 단백질(예를 들어, 항체), 링커 및 약물(예를 들어, 세포 독소)의 바람직한 특징들이 제1 양태에 관하여 상술된 바와 같은 것으로 이해될 것이다. 보다 특히, 링커 분자 및 이의 바람직한 특징들의 설명은 상기 분열 가능한 및 비-분열 가능한 시스템에서 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명에서 사용되는 단백질(예를 들어, 항체)이 적어도 하나 이상의 티올 함유 시스테인 기를 포함하는 것이 바람직하지만, 또한, 단백질(예를 들어, 항체)이 하나 이상의 라이신 기를 함유할 수 있는 것이 고려된다. 이러한 것이 그러한 경우일 때, 당업자가 시스테인 기에 대한 대안예로서 라이신 기에 본 발명의 링커를 부착시키는 것을 선호할 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 상황에서, 활성화된 에스테르 형태의 링커이도록, 링커 분자를 개질시키는 것이 바람직하다. 이러한 구체예에서, 개질된 링커의 에스테르 기는 링커 암을 통해 단백질(예를 들어, 항체) 상에 존재하는 라이신에 결합할 수 있다. 이러한 구체예에서, 단백질(예를 들어, 항체)은 라이신 기를 통해 에스테르 개질된 링커에 결합할 것이고, 또한, 이는 비닐 기를 통해 약물(즉, 세포 독소)에 결합할 것이다. 이러한 개질된 링커는 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 양태에서, 바람직하게, 비닐 치환체를 포함하는 질소 함유 방향족 헤테로시클릭 고리를 포함하는, 단백질 상에 존재하는 라이신 또는 시스테인 기를 통해 부위 특이적 콘주게이션을 제공할 수 있는 링커와 단백질을 접촉시키는 것을 포함하는 단백질 약물 콘주게이트를 제조하는 방법으로서, 링커가 약물에 결합되는 방법이 제공된다. 대안적인 양태에서, 바람직하게, 비닐 치환체를 포함하는 질소 함유 방향족 헤테로시클릭 고리를 포함하는, 단백질 상에 존재하는 라이신 또는 시스테인 기를 통해 부위 특이적 콘주게이션을 제공할 수 있는 링커와 단백질을 접촉시키고, 후속하여 링커를 약물에 결합시키는 것을 포함하는, 단백질 약물 콘주게이트를 제조하는 방법이 제공된다.
바람직하게, 본 방법은 적어도 하나의 반응성 티올 기를 갖는 단백질(예를 들어, 항체)을 단백질(예를 들어, 항체)의 적어도 하나의 티올 기와 반응할 수 있는 비닐 치환체를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는, 작용화 시약을 포함하는 링커와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 링커 작용화 시약은 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자에 공유 결합되며, 이에 따라, 링커 작용화 시약의 비닐 치환체는 단백질(예를 들어, 항체)의 티올 기와 반응하여, 단백질(예를 들어, 항체)에 링커 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자를 공유 결합시키도록 한다.
또한, 본 발명의 방법은 작용화 시약 및 단백질(예를 들어, 항체)을 반응시켜 이러한 것들을 함께 결합시키는 단계 이외에, 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 일 예로서, 본 방법은 비닐 치환체를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는 전구체 작용화 시약을 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자와 반응시켜 작용화 시약을 제조하는 초기 단계를 포함할 수 있다.
단백질(예를 들어, 항체)이 적합한 티올 기를 포함하지 않거나 이의 폴리펩티드 사슬에서 요망되는 위치에 적합한 티올 기를 포함하지 않는 본 발명의 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 화학적 반응 또는 부위 지향적 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 단백질(예를 들어, 항체)을 변형시켜 폴리펩티드의 하나 이상의 요망되는 위치에서 티올 기를 갖는 변종 폴리펩티드를 제조하는 초기 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이는 단백질(예를 들어, 항체)의 폴리펩티드 사슬에서의 아미노산들 중 하나 이상을 시스테인 잔기로 대체시킴으로써 이루어진다.
바람직하게, 반응성 티올 기는, 단백질(예를 들어, 항체)에 자연적으로 존재하거나 도입되었는 지 간에, 시스테인 아미노산 잔기의 일부이다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명은 링커와 조합된 알부민을 제공하며, 여기서, 링커는 본 발명의 제1 구체예에 관해 상술된 바와 같다.
인식되는 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위해 의도된 알부민은 혈청 알부민으로서, 이는 간에서 형성되는 혈장 단백질이다. 바람직하게, 알부민은 인간 알부민이다.
바람직하게, 링커는 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함한다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명은 알부민, 링커 및 약물(예를 들어, 세포 독소)을 포함하는 단백질 약물 콘주게이트를 제공하며, 여기서, 링커 및 약물(예를 들어, 세포 독소)은 단백질 약물 콘주게이트 및/또는 ADC 발명에 대해 상술된 바와 같다. 특히, 링커가 약물(예를 들어, 세포 독소)에 결합하는, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 알부민, 링커 및 치료 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트를 제공한다. 링커 및 치료 펩티드 또는 폴리펩티드는 상기에 기술된 바와 같으며, 링커가 치료 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합하는, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함하는 것이 바람직하다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 상술된 바와 같이, 염기성 폴리-(알킬렌 글리콜) 구조에는, 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자와 약물, 즉, 세포독성 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드의 반응을 촉진시키기 위해 하나 이상의 반응성 작용기, 예를 들어, 하이드록시, 아민, 카복실산, 알킬 할라이드, 아지드, 숙신이미딜, 또는 티올 기가 제공될 수 있다.
추가적으로, 링커 폴리-(알킬렌 글리콜) 구조는 또한, 동종이작용성 링커(homobifunctional linker)를 제공하기 위해 링커 암을 통해 제2 링커와 반응될 수 있으며, 이에 따라, 하나의 링커의 비닐 기가 약물, 즉 세포독성 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드의 티올 기와 반응될 수 있으며, 다른 링커의 비닐 기가 단백질, 예를 들어, 알부민의 티올 기에 콘주게이션될 수 있게 한다. 이러한 구체예에서, 단백질 약물 콘주게이트, 예를 들어, 알부민 약물 콘주게이트는 두 개의 링커 분자들을 포함하는데, 이는 티올 함유 세포 독소, 치료 펩티드 또는 치료 폴리펩티드에 대한 알부민의 연결을 촉진시킬 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 알부민의 유리 티올 기와 반응할 수 있는 비닐 치환체를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는, 작용화 시약을 포함하는 링커와 알부민을 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서, 링커 작용화 시약은 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자에 공유 결합되며, 이에 따라, 링커 작용화 시약의 비닐 치환체가 알부민의 티올 기와 반응하여 알부민에 링커 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자를 공유 결합시키도록 한다.
이러한 추가 방법은 예를 들어, 화학적 반응 또는 부위 지향적 돌연변이유발에 의해 알부민을 개질시켜 폴리펩티드의 하나 이상의 요망되는 위치에 티올 기를 갖는 변형체를 형성시키고, 예를 들어, 용매 노출된 시스테인 잔기를 도입하는 초기 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이는 알부민의 폴리펩티드 사슬에서의 아미노산들 중 하나 이상을 시스테인 잔기로 대체시킴으로써 이루어진다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 상기에 규정된 바와 같은 단백질 약물 콘주게이트를 제공한다.
일 구체예에서, 치료법에서 사용하기 위한 상기에 규정된 바와 같은 ADC가 제공된다. 바람직하게, ADC는 항암 치료법에서 사용하기 위해 의도된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 치료법에서 사용하기 위한 상기에 규정된 바와 같은 알부민 약물 콘주게이트를 제공한다. 바람직하게, 알부민 약물 콘주게이트는 항암, 항통각, 항당뇨병, 항종양, 또는 항바이러스 치료법에서 사용하기 위해 의도된다.
본 발명의 구체예들은 일 예로 기술되는 것으로서, 첨부된 도면을 참조로 하여 제한되지 않는다.
도 1은 예를 들어, 본 발명에 따른 링커 및 글루타티온의 상대 반응 속도를 도시한 것이다.
도 2는 상이한 pH(7.0, 7.5 및 8.0)에서 24시간 동안 N-아세틸 시스테인(NAC)과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 3은 pH 7.0에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 4는 pH 8.0에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 5는 pH 8.0에서 NAC와의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 6은 pH 7.0에서 아미노산(Tyr/Lys/His/NAC)의 혼합물과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 7은 pH 7.0에서 아미노산 혼합물과의 반응성에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 8은 pH 7.0에서 10 당량의 라이신과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 9는 10 당량의 아스파르트산과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 10은 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 구조를 도시한 것이다.
도 11은 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 MS 분석을 도시한 것이다.
도 12는 1시간의 반응 후 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 및 UV-Vis 프로파일을 도시한 것이다.
도 13은 티올에 비해 1.25 몰 과량의 약물-링커와 함께 1, 8 및 16시간 인큐베이션에서 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 및 UV-Vis 프로파일을 도시한 것이다.
도 14는 티올에 비해 5 몰 과량의 약물-링커와 함께 16시간의 인큐베이션에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 15는 16시간의 인큐베이션 후 10 몰 과량의 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 콘주게이션을 통해 얻어진 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 16은 16시간의 인큐베이션 후 10 몰 과량의 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에서 콘주게이션된 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 17은 이중 탈염화된 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 18은 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 분석을 도시한 것이다.
도 19는 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 20은 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 분석을 도시한 것이다.
도 21은 SEC 크로마토그래피에 의한 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B) 콘주게이트의 분석을 도시한 것이다.
도 22는 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.
도 23은 PL13-NH-PEG4-OSu 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 24는 PL13-NH-PEG4-COOH 링커 중간체의 ESI-MS 분석을 도시한 것이다.
도 25는 환원 SDS-PAGE에 의한 SMCC 또는 PL13-NH-PEG4-OSu 링커를 통한 트라스투주맙 가교의 분석을 도시한 것이다.
도 26은 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 27은 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 28은 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 29는 도 28의 PLRP 용리 프로파일을 기초로 한 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE 및 트라스투주맙-mal-val-cit-MMAE의 DAR 계산을 도시한 것이다.
도 30은 트라스투주맙-mal-val-cit-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE (B)의 SEC 분석을 도시한 것이다.
도 31은 1 mg 스케일에서 공정 최적화 후에 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 예시적인 HIC (A) 및 PLRP (B) 프로파일을 도시한 것이다.
도 32는 150 mg 스케일에서 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 33은 150 mg 스케일에서 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE (B)의 SEC 프로파일을 도시한 것이다.
도 34는 pH 7.0(실선) 및 pH 7.5(점선)에서 티오맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 35는 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 위한 탈-약물화(de-drugging)를 나타내기 위한 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 36은 3.8의 DAR을 갖는 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 탈-약물화를 나타내기 위한 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 37은 ADC의 시험관내 안정성을 도시한 것이다: 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE, Mal-ADC (A) vs 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE, PL13-ADC (B)
도 38은 ADC의 생체내 안정성을 도시한 것이다: PL13-ADC vs Mal-ADC
도 39는 SKBR3 세포주 (A), BT474 세포주 (B) 및 JIMT-1 세포주 (C)에 대한 세포 사멸 데이타를 도시한 것이다.
도 40은 ADC 독성을 나타내기 위한 다중-용량 이종이식 데이타를 도시한 것이다.
도 41은 종양 성장에 대한 ADC 효과를 나타내기 위한 다중-용량 이종이식 데이타를 도시한 것이다.
도 42는 종양 성숙 조직병리학 데이타를 도시한 것이다.
도 43은 pH 7.4에서 환원된 알부민에 대한 20 KDa PEG-PL12 및 PEG-PL13 대 20 KDa PEG-말레이미드의 콘주게이션에 대한 비교 데이타를 도시한 것이다.
도 44는 알부민에 대한 PL11 (A), PL12 (B) 및 PL13 (C) 콘주게이션의 최적화를 도시한 것이다.
도 45는 ESI-MS에 의한 알부민에 대한 PL11 (A), PL12 (B) 및 PL13 (C) 콘주게이션의 분석을 도시한 것이다.
도 46은 ESI-MS에 의해 나타낸 1 mM GSH의 존재 하에 알부민-PL-12 콘주게이트의 안정성을 도시한 것이다.
도 47은 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 48은 알부민, 티오알부민(단일 돌연변이체) 및 티오알부민(이중 돌연변이체)에 대한 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 링커의 콘주게이션에 대한 비교 데이타를 도시한 것이다.
도 49는 알부민-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 콘주게이트의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. (1) 티오알부민-이중 돌연변이체-DOX; (2) 티오알부민-단일 돌연변이체-DOX; (3) 알부민-DOX; (M)-단백질 마커.
도 50은 알부민-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 콘주게이트의 SEC 분석을 도시한 것이다: 알부민 (A) 및 알부민-DOX 콘주게이트 (B); 티오알부민(단일 돌연변이체) (C) 및 티오알부민-DOX(단일 돌연변이체) (D); 티오알부민(이중 돌연변이체) (E) 및 티오알부민-DOX(이중 돌연변이체) (F).
도 2는 상이한 pH(7.0, 7.5 및 8.0)에서 24시간 동안 N-아세틸 시스테인(NAC)과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 3은 pH 7.0에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 4는 pH 8.0에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 5는 pH 8.0에서 NAC와의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 6은 pH 7.0에서 아미노산(Tyr/Lys/His/NAC)의 혼합물과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 7은 pH 7.0에서 아미노산 혼합물과의 반응성에서 PL-13-NAC 부가물의 형성을 나타내기 위한 MS 데이타이다.
도 8은 pH 7.0에서 10 당량의 라이신과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 9는 10 당량의 아스파르트산과의 PL13 유리산 반응성의 RP-HPLC 분석을 도시한 것이다.
도 10은 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 구조를 도시한 것이다.
도 11은 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 MS 분석을 도시한 것이다.
도 12는 1시간의 반응 후 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 및 UV-Vis 프로파일을 도시한 것이다.
도 13은 티올에 비해 1.25 몰 과량의 약물-링커와 함께 1, 8 및 16시간 인큐베이션에서 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 및 UV-Vis 프로파일을 도시한 것이다.
도 14는 티올에 비해 5 몰 과량의 약물-링커와 함께 16시간의 인큐베이션에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 15는 16시간의 인큐베이션 후 10 몰 과량의 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 콘주게이션을 통해 얻어진 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 16은 16시간의 인큐베이션 후 10 몰 과량의 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에서 콘주게이션된 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 17은 이중 탈염화된 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 18은 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 분석을 도시한 것이다.
도 19는 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 20은 0, 24 및 48시간에 NAC의 존재 하에 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트의 HIC 분석을 도시한 것이다.
도 21은 SEC 크로마토그래피에 의한 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B) 콘주게이트의 분석을 도시한 것이다.
도 22는 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.
도 23은 PL13-NH-PEG4-OSu 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 24는 PL13-NH-PEG4-COOH 링커 중간체의 ESI-MS 분석을 도시한 것이다.
도 25는 환원 SDS-PAGE에 의한 SMCC 또는 PL13-NH-PEG4-OSu 링커를 통한 트라스투주맙 가교의 분석을 도시한 것이다.
도 26은 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 27은 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 28은 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 29는 도 28의 PLRP 용리 프로파일을 기초로 한 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE 및 트라스투주맙-mal-val-cit-MMAE의 DAR 계산을 도시한 것이다.
도 30은 트라스투주맙-mal-val-cit-MMAE (A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE (B)의 SEC 분석을 도시한 것이다.
도 31은 1 mg 스케일에서 공정 최적화 후에 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 예시적인 HIC (A) 및 PLRP (B) 프로파일을 도시한 것이다.
도 32는 150 mg 스케일에서 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE (B)의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 33은 150 mg 스케일에서 달성된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE (B)의 SEC 프로파일을 도시한 것이다.
도 34는 pH 7.0(실선) 및 pH 7.5(점선)에서 티오맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE의 HIC 프로파일을 도시한 것이다.
도 35는 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 위한 탈-약물화(de-drugging)를 나타내기 위한 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 36은 3.8의 DAR을 갖는 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 탈-약물화를 나타내기 위한 PLRP 프로파일을 도시한 것이다.
도 37은 ADC의 시험관내 안정성을 도시한 것이다: 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE, Mal-ADC (A) vs 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE, PL13-ADC (B)
도 38은 ADC의 생체내 안정성을 도시한 것이다: PL13-ADC vs Mal-ADC
도 39는 SKBR3 세포주 (A), BT474 세포주 (B) 및 JIMT-1 세포주 (C)에 대한 세포 사멸 데이타를 도시한 것이다.
도 40은 ADC 독성을 나타내기 위한 다중-용량 이종이식 데이타를 도시한 것이다.
도 41은 종양 성장에 대한 ADC 효과를 나타내기 위한 다중-용량 이종이식 데이타를 도시한 것이다.
도 42는 종양 성숙 조직병리학 데이타를 도시한 것이다.
도 43은 pH 7.4에서 환원된 알부민에 대한 20 KDa PEG-PL12 및 PEG-PL13 대 20 KDa PEG-말레이미드의 콘주게이션에 대한 비교 데이타를 도시한 것이다.
도 44는 알부민에 대한 PL11 (A), PL12 (B) 및 PL13 (C) 콘주게이션의 최적화를 도시한 것이다.
도 45는 ESI-MS에 의한 알부민에 대한 PL11 (A), PL12 (B) 및 PL13 (C) 콘주게이션의 분석을 도시한 것이다.
도 46은 ESI-MS에 의해 나타낸 1 mM GSH의 존재 하에 알부민-PL-12 콘주게이트의 안정성을 도시한 것이다.
도 47은 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 링커의 구조를 도시한 것이다.
도 48은 알부민, 티오알부민(단일 돌연변이체) 및 티오알부민(이중 돌연변이체)에 대한 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 링커의 콘주게이션에 대한 비교 데이타를 도시한 것이다.
도 49는 알부민-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 콘주게이트의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. (1) 티오알부민-이중 돌연변이체-DOX; (2) 티오알부민-단일 돌연변이체-DOX; (3) 알부민-DOX; (M)-단백질 마커.
도 50은 알부민-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 콘주게이트의 SEC 분석을 도시한 것이다: 알부민 (A) 및 알부민-DOX 콘주게이트 (B); 티오알부민(단일 돌연변이체) (C) 및 티오알부민-DOX(단일 돌연변이체) (D); 티오알부민(이중 돌연변이체) (E) 및 티오알부민-DOX(이중 돌연변이체) (F).
본 발명의 방법은 링커에 결합되고 또한 약물, 예를 들어, 세포 독소 또는 치료 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합된 항체 또는 알부민을 포함하는 본 발명에 따른, 단백질 약물 콘주게이트, 예를 들어, ADC 또는 알부민 약물 콘주게이트를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 항체에 대한 언급은 자연적이거나 일부 또는 전부 합성적으로 형성된 면역글로불린을 포함한다. 이러한 용어는 또한, 항원 결합 도메인을 포함하는 임의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 분절, 이중체, 삼중체 또는 나노체(nanobody)를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 분절이 또한 고려된다. 모노클로날 및 다른 항체를 획득하고, 본래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 형성시키기 위해 재조합 DNA 기술의 기술들을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 기술들은 항체의 면역글로불린 가변 영역, 또는 상보적 결정 영역(CDR)을 엔코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 플러스(plus) 프레임워크 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다[예를 들어,EP 0 184 187 A, GB 2,188,638 A 또는 EP 0 239 400 A 참조]. 항체는 여러 방식으로 변형될 수 있으며, 이러한 용어는 요망되는 특이성을 갖는 항체 항원-결합 도메인을 갖는 임의 특이적 결합 일원(member) 또는 물질을 포함하는 것으로서 해석될 것이다. 이에 따라, 이러한 용어는 자연적이거나 전부 또는 일부 합성된, 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의 폴리펩티드를 포함하는, 항체 분절 및 유도체를 포함한다. 이에 따라, 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인, 또는 균등물을 포함하는 키메라 분자들이 포함된다. 키메라 항체의 클로닝(cloning) 및 발현은 EP 0 120 694 A 및 EP 0 125 023 A호에 기술되어 있다.
종래 기술에서는, 전 항체의 분절들이 항원들을 결합시키는 기능을 수행할 수 있음을 나타내고 있다. 결합 분절의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 분절; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 분절; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 분절; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 분절(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 분절, 두 개의 연결된 Fab 분절을 포함하는 이가 분절; (vii) 단일 사슬 Fv 분자(scFv), 여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 항원 결합 부위를 형성시키기 위해 두 개의 도메인들을 회합시킬 수 있는 펩티드 링커에 의해 연결됨(Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988); (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 다이머(PCT/US92/09965) 및 (ix) "이중체," 유전자 융합에 의해 작제화된 다가 또는 다중특이적 분절(WO 94/13804; Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993)이다. Fv, scFv 또는 이중체 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 디설파이드 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다[Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996]. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(minibody)가 또한 제조될 수 있다[Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996]. 이에 따라, 이러한 결합 분절이 본 발명에 의해 고려된다.
바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 방법들은 세포 독소와 같은 약물에 링커를 통해 항체와 같은 단백질을 결합시키기 위해 잘 구성된 시약들 및 조건들을 사용한다. 특히, 본 방법에서 사용되는 반응 조건들은 소정 범위의 상이한 성질들을 갖는 상이한 생성물들의 혼합물을 형성시키는 경향을 갖는, 말레이미드와 같은 종래 기술 시약들을 사용할 때 일어나는 경향이 있는 문제점을 회피하는데 도움을 준다. 보다 특히, 하기의 실험 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 링커를 사용하는, ADC와 같은 단백질 약물 콘주게이트를 제조하는 방법은 말레이미드 가교와 관련된 문제점을 회피한다.
상술된 바와 같이, 단백질 약물 콘주게이트(예를 들어, ADC) 조성물을 위해 고려되는 단백질(예를 들어, 항체)은 존재하는 티올 기를 사용하거나 본 방법의 초기 단계에서 티올 기를 도입함으로써, 예를 들어, 티올 기를 형성시키기 위해 단백질(예를 들어, 항체)의 하나 이상의 작용기를 반응시킴으로써, 또는 단백질(예를 들어, 항체)에 티올 기 또는 이의 전구체를 도입함으로써 링커에 결합될 수 있다. 일 예로서, 이는 단백질(예를 들어, 항체)에 링커를 결합시키는 것이 요망되는 부위에 단백질(그러한 예에서, 항체)에 시스테인 잔기를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 반응을 위한 통상적인 시스테인 잔기가 출발 또는 야생형 폴리펩티드/단백질에 존재하지 않는 상황에서 유용할 수 있다. 통상적으로, 이는 항체 폴리펩티드와 같은 단백질의 부위 지향된 돌연변이유발을 이용하여 달성될 수 있으며, 이의 사용은 당해 분야에서 널리 확립된 것이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 초기 환원 단계가 요구될 수 있으며, 여기서, 하기에 추가로 상세히 논의되는 바와 같이, 존재하는 대부분의 시스테인 티올이 캡핑되어 있기 때문에, 단백질은 상업적 등급의 알부민이다.
실험
데이타
및 논의
하기 실험 데이타는 주로 하기에 나타낸 바와 같은 이의 유리산 또는 NH-페그화된 형태의 PL13으로서 식별화되거나 이러한 것으로 지칭되는 링커 분자를 사용하여 주로 생산되었다.
1. 글루타티온과의 PL11, PL12 및 PL13 링커 반응성의 확인
글루타티온은 콘주게이션을 위해 용이하게 이용 가능한 티올 기를 함유하고, ADC와 같은 단백질 약물 콘주게이트에서 사용하기 위한 본 발명에서 사용하기 위한 링커의 적합성을 평가하기 위해 단백질에 대한 양호한 모델을 제공할 수 있다. 도 1은 본 발명에 따른 3 가지 링커 기 예를 나타낸 것으로서, 이는 글루타티온에 존재하는 티올 기에 대한 콘주게이트에 대한 이의 능력을 입증한 것이다. 도 1에서의 예는 PL11, PL12 및 PL13이며, 이의 구조는 하기에 나타낸 바와 같다.
2. PL13 유리산 선택성의 결정
하기에 제공된 데이타는 본 발명에 따른 링커가 시스테인 기에 대한 특이성을 나타냄을 입증하는 것이다. PL13 유리산은 하기와 같이 식별된다:
pH 7.0, 7.5 및 8.0에서 PL13 유리산과 N-아세틸 시스테인의 반응성
PL13 유리산을 세 가지의 별도의 pH 7.0, 7.5 및 8.0에서 2 몰 당량의 N-아세틸 시스테인(NAC)과 반응하였다. 반응을 실온(RT)에서 적절한 pH로 완충된, 메탄올/포스페이트 완충된 염수(PBS) 용액(9:1의 비)에서 수행하였다. 15분에 걸친 1%에서 50% B(0.1% TFA를 함유한 아세토니트릴)까지의 구배 및 254 nm에서의 검출과 함께 RP-HPLC 분석을 시간에 따른 PL13의 비닐 기에 대한 유리 티올의 첨가를 모니터링하기 위해 수행하였다.
방법:
메탄올 중 210 ㎕의 2.61 mM PL13 유리산을 완충액 중에서 22 ㎕의 50 mM NAC와 혼합하여 최종 농도의 2.37 mM PL13 유리산 및 4.74 mM NAC를 수득하였다.
결과:
PL13-NAC 부가물을 24시간 후에 모든 pH에서 5.1분의 체류 시간에 용리하였다(도 2 참조). 생성물(PL13-NAC 부가물)의 양은 pH 7.0 및 8.0에서 유사하였다. pH 7.5에서 PL13 유리산의 반응성은 더욱 느렸다. 또한, 식별되지 않은 피크가 4분에 용리되었다.
ESI-MS 분석은 모든 분석된 pH에서 PL13-NAC 부가물의 존재를 확인하였다. MS 트레이스 데이타는 pH 7.0(도 3), 및 pH 8.0(도 4)에서 수행된 바와 같이 이러한 분석을 나타내기 위해 이와 함께 포함된다.
pH 8.0에서 PL13 유리산과 N-아세틸 시스테인의 반응성
PL13 유리산을 메탄올/PBS 용액(9:1), pH 8.0 중 2 몰 당량의 NAC와 반응시켰다. 반응의 진행을 254 nm에서의 검출과 함께, 15분에 걸쳐 1%에서 50% B까지의 구배를 이용하여 RP-HPLC에 의해 모니터링하였다. 샘플을 RT에서 0, 1, 4 및 72시간의 인큐베이션에 분석하였다(도 5 참조).
방법:
메탄올 중 100 ㎕의 2.61 mM PL13 유리산을 pH 8.0에서 완충제 중 11 ㎕의 50 mM NAC와 혼합하여 최종 농도의 2.35 mM PL13 유리산 및 5 mM NAC를 수득하였다.
결과:
NAC에 PL13 유리산의 첨가는 최초 4시간에 걸쳐 느렸다. 72시간의 인큐베이션 후에, ~70%의 PL13 유리산은 pH 8.0에서 생성물(PL13-NAC 부가물)로 전환되었다.
pH 7.0에서 PL13 유리산과 10
당량의
티로신, 히스티딘,
라이신
및 N-아세틸 시스테인의 반응성
PL13 유리산을 pH 7.0에서 10 당량의 각 아미노산(티로신(Tyr), 히스티딘(His), 라이신(Lys) 및 N-아세틸 시스테인(NAC))으로 접종하였다. 반응을 254 nm에서 셋팅된 검출과 함께 15분에 걸쳐 1 내지 50% B의 구배를 이용하여 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
방법:
메탄올 중 50 ㎕의 2.61 mM PL13을 완충제 중 260 ㎕의 20 mM Tyr/His/Lys 및 NAC와 혼합하여, 최종 농도의 0.42 mM PL13 및 4.2 mM의 각 Tyr, His, Lys 및 NAC를 수득하였다.
결과:
PL13 유리산은 pH 7.0에서 Tyr, His 및 Lys의 존재 하에 NAC와 선택적으로 반응하였다(도 6 참조). 도 7은 단지 PL13 NAC 부가물이 형성되었음을 입증하기 위한 MS 데이타를 도시한 것이다.
PL13과 NAC 간의 첨가 반응은 10 몰 과량의 아미노산에서 현저하게 증가하였다. PL13 유리산의 요망되는 PL13-NAC 부가물로의 전환은 실온(RT)에서 4시간 후에 90% 완료되었고, 18시간 미만에 완전히 완료되었다.
얻어진 결과는 링커 분자의 비닐 기를 통한 시스테인 반응성에 대한 본 발명에 따른 링커 분자의 유리산 형태의 선택성을 입증한다.
라이신과의
PL13 유리산 반응성의 RP-
HPLC
분석
PL13 유리산을 RT에서 PBS 완충제, pH 7.4에서 10 당량의 Lys로 접종하였다. 반응을 270 nm에서 셋팅된 검출과 함께 30분에 걸쳐 수중 12 내지 50% 아세토니트릴의 구배를 이용하여 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
방법:
메탄올 중 10 ㎕의 4 mM PL13을 50 ㎕의 8 mM Lys 용액 및 40 ㎕의 PBS 완충제 pH 7.4와 혼합하여 최종 농도의 0.4 mM PL13 및 4.0 mM Lys를 수득하였다. 반응을 270 nm에서 셋팅된 검출과 함께 30분에 걸쳐 수중 12 내지 50% 아세토니트릴의 구배를 이용하여 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
결과:
피크가 PL13-Lys 부가물에 해당하는 RP-HPLC 분석에서 관찰되지 않았기 때문에 PL13 유리산은 pH 7.4에서 Lys와 반응하지 않았다(도 8 참조).
얻어진 결과는 부가물이 Lys와 함께 PL13 유리산의 인큐베이션에 의해 형성되지 않음을 입증하였다. 이러한 데이타는 본 발명의 링커의 유리산 형태의 시스테인 기 선택성을 지지한다. 이러한 시스테인 특이성이 말레이미드에 의해 나타나지 않고, 이와 같이, 본 발명의 링커가 이와 관련하여 잇점을 나타내는 것으로 인식될 것이다.
상기 데이타가 본 발명의 링커에 의해 나타낸 시스테인 특이성을 나타내지만, 링커가 당해 분야에 널리 공지된 방법들에 의해 개질되는 경우에 라이신 특이성이 대안적으로 달성될 수 있다는 것으로 용이하게 인식된다.
아스파르트산과 PL13 유리산의 반응성
PL13 유리산을 pH 7.0에서 그리고 RT에서 10 당량의 아스파르트산(Asp)으로 처리하였다. 분석을 254 nm에서의 검출과 함께 15분에 걸쳐 1% 내지 50% B의 구배에서 RP-HPLC에 의해 수행하였다.
방법:
메탄올 중 50 ㎕의 2.61 mM PL13 유리산을 완충제 중 280 ㎕의 50 mM Asp와 혼합하여 최종 농도의 0.42 mM PL13 유리산 및 4.2 mM Asp를 수득하였다.
결과:
PL13 유리산은 RT에서 18시간에 걸쳐 pH 7.0에서 Asp의 존재 하에 안정하다(도 9 참조).
MS 스펙트럼은 부가물이 Asp와 함께 PL13 유리산의 인큐베이션에 의해 형성되지 않음을 입증한다(데이타가 도시되지 않음). 또한, 이러한 데이타는 본 발명의 링커의 시스테인 기 선택성을 지지한다. 이러한 시스테인 특이성이 말레이미드에 의해 나타내지 않으며, 이와 같이, 본 발명의 링커가 이에 대한 잇점을 제시하는 것으로 인식될 것이다.
3. PL13-Val-
Cit
-4-
아미노벤조일
-
MMAE
세포 독성 약물 링커의 합성
PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 분절 방법에 의해 합성하였는데, 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려진 것이다.
방법:
PL13 유리산을 HOBt 활성 에스테르 방법을 통해 예시적인 세포 독소인 H-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 유리 아모니 말단에 커플링하였다.
결과:
3.1 mg의 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(도 10 참조)를 합성하였다. 물질을 디메틸-아세트아미드(DMA)에 용해시켜 50 mM의 농도에서 약물 링커 용액을 제공하였다.
RP-HPLC는 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 링커의 순도를 확인하였다(데이타 미도시됨).
ESI-MS 분석은 세포 독성 약물 링커의 확인을 입증하였다(예측된 MW는 1296.67 Da이고, 실험 결과는 1296.5 Da의 MW를 제공하였다)(도 11 참조).
4. 트라스투주맙-PL13-Val-
Cit
-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 발생
20 mg의 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트, 본 발명의 예시적인 ADC, 및 20 mg의 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트, 공지된 말레이미드 링커를 포함한 ADC를 제조하였다.
트라스투주맙에 PL13-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및
말레이미드
-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의
콘주게이션
방법:
트라스투주맙을 트라스투주맙 분자 당 3 내지 4개의 약물의 콘주게이션을 가능하게 하기 위해 환원시켰다. 트라스투주맙의 환원을 위한 상세한 방법은 이러한 것이 당업자에 의해 널리 공지되어 있기 때문에 제공되지 않는다.
말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 pH 7.0에서 유리 티올에 비해 1.25 몰 과량의에서 트라스투주맙에 콘주게이션하였다. 반응을 RT에서 1시간 동안 수행하였다. 콘주게이션 반응을 과량의 NAC에 의해 켄칭하였다. 트라스투주맙 콘주게이트의 분석을 Tosoh 부틸-NPR(4.6×3.5, 2.5 ㎛) 컬럼을 이용하고 UV-VIS 분광법에 의해 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 달성하였다. MMAE는 248 nm에서 별개의 UV 흡광도를 갖는다(ε248= 1500 M-1cm, ε280= 15900 M-1cm).
PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 유리 티올에 비해 1.25, 2.5, 5 및 10 몰 과량에서 트라스투주맙에 커플링하였다. 반응을 pH 7.0에서 16시간 동안 수행하였다. 콘주게이션 반응을 HIC(Tosoh 부틸-NPR 컬럼 상에서 분리) 및 PLRP 크로마토그래피(PLRP 컬럼-2.1 mm×5 cm, 5 ㎛) 둘 모두에 의해 분석하였다. 트라스투주맙 콘주게이트를 UV-VIS 분광법에 의해 시험하였다. MMAE 세포 독성 약물 및 PL13 링커 둘 모두는 248 nm에서 UV 흡광도에 기여한다.
결과:
말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE와 트라스투주맙의 반응을 유리 티올에 대한 1.25 약물의 비율을 이용하여 1시간 내에 완료하였다(도 12 참조). 도 12에서의 숫자는 전장 항체에 콘주게이션된 약물의 양을 명시하는 것이다. 삽입도(inlet)는 트라스투주맙에 말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 콘주게이션으로 인해 248 nm에서 흡광도의 증가를 나타내는 UV-Vis 프로파일이다. 10 mg의 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트(항체에 대한 약물의 비율(DAR) 2.2)를 수득하고, 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 시험관내 연구를 위해 취하였다.
PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 반응의 속도 및 효율은 링커의 낮은 용해도로 인해 말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 비해 훨씬 더 느리다(도 13 참조). 콘주게이션은 티올에 비해 1.25 몰 과량의 약물-링커에서 수행되었다. 삽입도는 16시간 내에 트라스투주맙에 대한 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 커플링에 기인하여 248 nm에서 흡광도의 증가를 도시한 UV-Vis 프로파일이다. 트라스투주맙에 대한 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이션의 속도의 느린 증가는 티올 기에 비해 5 몰 과량의 약물-링커를 적용함으로써 관찰되었다(도 14 참조). 도 14에서, 숫자는 전장 항체에 콘주게이션된 약물의 양을 명시하는 것이다. DL은 콘주게이션되지 않은 약물을 지시하는 것이다.
10 몰 과량에서 그리고 50% 프로필렌 글리콜의 존재 하에 트라스투주맙에 대한 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 콘주게이션은 4시간 내에 90% 수율을 야기시켰다(도 15 및 도 16 참조). 도 15에서, 숫자는 전장 항체에 콘주게이션된 약물의 양을 지정하는 것이다. DL은 콘주게이션되지 않은 약물을 지시한 것이다. 도 16에서, 숫자는 항체의 경(L)쇄 또는 중(H)쇄에 콘주게이션된 약물의 양을 지정하는 것이다. 7.2 mg의 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트(DAR 3.03)를 수득하였고, 하기에 추가로 논의된 바와 같이 시험관내 연구를 위해 취하였다.
트라스투주맙-PL13-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 약물 항체 비율(DAR)의 결정
HIC 및 PLRP 크로마토그래피를 종종 시스테인-연결된 ADC에 대한 평균 약물-로드 및 약물-로드 분포를 특징분석하기 위해 적용하였다. 평균 약물-로드 및 약물-로드 분포의 결정은 이러한 것이 ADC의 효능 및 약동력학을 가져오기 때문에 결정적인 속성이다.
결과:
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 특징분석은1.8% 콘주게이션되지 않은 트라스투주맙의 경우 2.2의 DAR 계산치를 야기시켰다(도 12 참조). HIC 프로파일로부터의 DAR 계산치는 도 27과 관련하여 하기에 논의되는 바와 같이, 당해 분야의 널리 공지된 방법에 의해 결정된다.
트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 분석은 DAR 결정을 지지하기 위해 충분히 해결되지 않는 피크를 야기시켰다(도 15 참조). 그러나, 이러한 데이타는 여기에서, 완전성을 위해 포함된다. HIC는 트라스투주맙의 양을 걔산하기 위해 사용되었으며, 계산된 DAR 0은 ~8.4%이었다.
PLRP 컬럼을 통한 디티오트레이톨(DTT) 환원된 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 분리는 콘주게이션되지 않거나 약물 콘주게이션된 항체 경쇄 및 중쇄에 해당하는 잘 분리된 피크를 제공하였다(도 16). 3.0의 DAR은 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대해 계산되었다(도 17 참조). 도 17에서의 표는 콘주게이션되지 않은 그리고 약물 로딩된 경쇄 및 중쇄의 구역 백분율을 기초로 하여 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 DAR 계산을 도시한 것이다.
5. 트라스투주맙-PL13-Val-
Cit
-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-
말레이미드
-Val-Cit-4-아미노벤조일-MMAE의 안정성 연구
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트에 대한 약물-링커의 안정성을 PBS 완충제에서 NAC의 존재 하에 평가하였다.
방법:
각 ADC(1 내지 2 mg/mL의 농도에서)를 37℃에서 24시간 동안 PBS 완충제 중 1 mM NAC와 함께 인큐베이션하였다.
결과:
트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트는 완충제 중 NAC의 존재에 의해 영향을 받지 않았다(도 18 및 도 19 참조). 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 NAC의 존재 하에 감소된 안정성을 나타내었다(도 20 참조). 도 18에서, 숫자는 전장 항체에 콘주게이션된 약물의 양을 지정한다. DL은 콘주게이션되지 않은 약물을 지시하는 것이다.
도 19는 특히, 유리 티올로부터의 접종(challenge)으로 형성된 PL13 함유 ADC를 위한 프로파일 변화가 존재하지 않음을 나타내는 것으로서, 이는 작제물의 안정성을 명시하는 것이다.
6. 트라스투주맙-PL13-Val-
Cit
-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-
말레이미드
-Val-Cit-4-아미노벤조일-MMAE의 SDS-PAGE 및 SEC 분석
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 SEC 크로마토그래피 및 비-환원 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
결과:
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 99.5% 모노머로서 존재한다(도 21(a) 참조). 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 93.5% 모노머로서 존재한다(도 21(b) 참조).
비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석은 링커-약물 모이어티로의 시스테인 잔기의 알킬화 동안 항체에서 사슬간 디설파이드 결합의 파괴로 인해 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 샘플 둘 모두에서 다수의 밴드의 존재를 나타내었다(도 22 참조). 도 22에서, 레인 1은 1.8 mg/mL의 농도에서 겔 상에 로딩된 5 ㎕의 트라스투주맙-PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 샘플의 분석을 나타내며, 레인 2는 5 mg/mL의 농도에서 겔 상에 로딩된 5 ㎕의 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 샘플의 분석을 나타낸다. 전장 항체의 보존성(integrity)은 SEC 분석에 의해 확인된 중쇄와 경쇄 간의 강력한 비-공유 상호작용으로 인해 여전히 유지된다.
7. PL13-NH-
PEG4
-
OSu
이종이작용성
링커의 합성
상기 섹션 1 하에서 제공된 예에 비해 링커 용해도를 개선시키기 위해 친수성 PEG(PEG4)를 링커 분자 링커 암 부분에 도입하여 PL13-NH-PEG4-OSu를 제공하였다(도 23 참조).
방법:
PL13 유리산(상기에 기술된 바와 같음)을 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오산에 커플링하였다. 요망되는 숙신이미딜 에스테르에 대한 카복실 기의 활성화를 무수 디클로로메탄(DCM) 중 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 2.5 eq./HOSu 커플링을 이용하여 수행하였다. 미반응된 DCC 및 디이소프로필우레아 부산물을 냉각된 DCM으로부터의 여과를 통해 제거하였다.
결과:
PL13-NH-PEG4-COOH의 ESI-MS(도 24 참조)는 링커 신원(identity)을 확인하였다.
PL13-NH-
PEG4
-
OSu
및
SMCC
링커의 교차-반응성의 비교
숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 공지된 링커, 및 PL13-NH-PEG4-OSu를 통한 트라스투주맙 가교의 크기를 환원 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
방법:
2 mg/mL의 최종 농도에서의 트라스투주맙을 10배 과량의 SMCC 또는 PL13-NH-PEG4-OSu와 인큐베이션하였다. 샘플을 RT에서 인큐베이션하였다.
결과:
PL13-NH-PEG4-OSu가 SMCC 링커 보다 덜 높은 분자량 밴드를 나타낸다는 것이 SDS-PAGE로부터 입증된다(도 25, 레인 5 내지 레인 9 참조). PL13-NH-PEG4-OSu SDS-PAGE 상에서 약간 보다 높은 분자량 밴드가 존재하지만, 이러한 것들은 또한, 출발 트라스투주맙 레인에서 어느 정도의 크기로 존재한다(도 25, 레인 5 참조).
본 발명의 링커와는 상반되게, SMCC 링커는 특히 라이신 잔기의 아민 측쇄에 대한 말레이미드 기의 비-특이적 반응성으로 인하여 트라스투주맙 가교를 유도한다.
8. PL13-NH-
PEG4
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE의
합성
이미 합성된 PL13-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 세포 독성 약물 링커의 용해도를 추가로 개선시키기 위하여, 짧은 친수성 PEG 단위를 분자에 도입하였다(도 26 참조). PEG 단위는 또한, ADC 링커 암에 '스페이서'를 도입하여, MMAE 세포독성 페이로드의 분리 및 일부 39개의 원자(대 PL13-vcMMAE에서 이미 22개의 원자)에 의한 PL13을 통한 항체 부착점을 증가시킨다. 이러한 "스페이서"가 PL13 단위의 회전 가요성(rotational flexibility)을 증가시킬 것이며, 이는 유리 티올에 대한 마이클 첨가의 동력학에 영향을 미칠 수 있다.
방법:
40 mg의 미정제 Fmoc-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 정제하였다. 이후에, N-Fmoc 기를 아미노분해에 의해 제거하며, 아민 작용화된 세포 독성 화합물을 정제하여 24 mg의 물질을 수득하였다. 이를 표준 HOBt 활성 에스테르 화학을 통해 PL13-NH-PEG4-COOH를 커플링하기 위해 사용하였다.
결과:
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE를 합성하였다. 이러한 분자는 본 발명에 따른 분열 가능한 ADC 시스템의 일 예를 나타낸다.
9. 트라스투주맙에 대한 PL13-NH-
PEG4
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및
말레이미드
-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의
콘주게이션
방법:
트라스투주맙을 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)의 존재 하에 RT에서 1시간 동안 2.4배 과량의 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로 환원시켰다. 항체를 PBS에 재-완충시켰다. 20 mg/mL의 농도의 트라스투주맙을 RT에서 16시간 동안 5% v/v DMA의 존재 하에 20배 과량의 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 콘주게이션하였다. 추가적으로, 말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 링커를 RT에서 1시간 동안 6 몰 과량으로 트라스투주맙(20 mg/mL)에 커플링하였다. 수득된 ADC를 HIC, PLRP 및 SEC 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
결과:
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 특징분석은 4.29의 DAR 계산치를 야기시켰다(도 27a 참조).
트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 HIC 특징분석은 3.15의 DAR 계산치를 야기시켰다(도 27b 참조).
도 27a 및 도 27b에서, 숫자는 전장 항체에 콘주게이션된 약물의 양을 지정하는 것이다. 표는 HIC 용리 프로파일로부터의 각 피크 면적의 상대 백분율을 나타낸다. 가중된 피크 면적을 수득하기 위해 피크 면적 백분율을 상응하는 약물 로드와 곱함으로써 평균 DAR을 계산하였다. 가중된 피크 면적들을 합하고, 100으로 나누어서 최종 DAR 수치를 제공하였다.
PLRP에 의한 DTT 환원된 트라스투주맙-말레이미드-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 DAR 분석은 평균 약물 로드가 4.3임을 확인하였다(도 28a 및 도 29 참조).
PLRP에 의한 DTT 환원된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 분석은 평균 약물 로드가 3.8임을 확인하였다(도 28b 및 도 29 참조).
도 28a 및 도 28b에서, 숫자는 항체의 경(L) 또는 중(H)쇄에 콘주게이션된 약물의 양을 지정한 것이다.
SEC 크로마토그래피 상에서의 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(HER-MAL-MMEA) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(HER-PL-13-MMEA) 둘 모두의 분석은, 두 샘플 모두가 모노머 종으로서 표시된다는 것을 나타낸다(도 30a 및 도 30b 참조). 하기 표 도 30a 및 도 30b는 고분자량 종(HMW), 모노머 및 저분자량 종(LMW)의 계산치를 나타낸 것이다.
10. PL13-NH-
PEG4
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE의
콘주게이션을
위한 최적화된 조건
방법:
트라스투주맙(23.5 mg/mL)을 RT에서 2시간 동안 2.4 당량의 TCEP로 환원시켜 평균 4.5 유리 티올을 수득하였다. 환원된 트라스투주맙을 30℃에서 18시간 동안 10% v/v DMA의 존재 하에 20배 과량의 PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE에 콘주게이션하였다. 콘주게이트를 HIC 및 PLRP 크로마토그래피에 의해 분석하였다(도 31a 및 도 31b 참조).
결과:
HIC 및 PLRP 데이타는 콘주게이션 효능의 실질적인 개선을 나타낸다. 보다 높은 수준의 콘주게이션 효능은 또한, '홀수(odd)' DAR 종의 수준의 유의미한 감소 및 콘주게이션되지 않은 항체의 수준의 감소를 야기시켰다.
11. 공정의 확장성(
scalability
)을 나타낸,
150 mg
스케일에서 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE (A) 및 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-아미노벤조일-MMAE (B)의 콘주게이션
방법:
트라스투주맙(24.53 mg/mL)을 RT에서 2시간 동안 2.1 당량의 TCEP로 환원시켰다. 환원된 트라스투주맙을 30℃에서 18시간 동안 10% v/v DMA의 존재 하에 20배 과량의 PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE에 콘주게이션하였다.
25.68 mg/ml의 농도의 트라스투주맙을 RT에서 2시간 동안 1.95 당량의 TCEP로 환원시켰다. 환원된 트라스투주맙을 RT에서 1시간 동안 10% v/v DMA의 존재 하에 6배 과량의 말레이미드-val-cit-MMAE에 콘주게이션하였다.
콘주게이트를 HIC 및 SEC 크로마토그래피에 의해 분석하였다(도 32 및 도 33 참조).
결과:
HIC 프로파일은 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE(도 32a) 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE(도 32b)에 대한 유사한 콘주게이션 효능을 나타내었다. SEC(도 33a 및 도 33b)에서는 두 개의 콘주게이트 모두가 단지 소량의 고분자량 종이 존재하는(1.4 내지 2.4%) 모노머임을 확인하였다. 이는 콘주게이션 공정의 확정성이 본 발명의 링커를 이용하여 개발되었음을 나타낸다.
12.
공학처리된
트라스투주맙(
티오맙
)에 대한 성공적인
콘주게이션을
나타내는, 티오맙에 대한 PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE의 콘주게이션
방법:
항체 경쇄에 도입된 시스테인 돌연변이(V205C)를 갖는 트라스투주맙을 완충제 pH 7.4에서 10% DMA의 존재 하에 40배 과량의 PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE에 10 mg/ml의 농도에서 콘주게이션하였다. 콘주게이션 반응을 35℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
결과:
트라스투주맙(V2015C)-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE의 HIC 프로파일은, PL13이 두 pH 모두에서 공학처리된 Cys 잔기를 갖는 항체에 성공적으로 콘주게이션될 수 있음을 나타낸다(도 34). 콘주게이션 반응의 속도 및 크기는 티올 미세환경에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다.
13.
ADC로서
본 발명에 따른
ADC의
유용성
섹션 8에서 상술된 바와 같은, ADC 콘주게이션 생성물을 상업적 ADC로서의 이의 유용성을 입증하기 위해 생체내 및 시험관내 시험으로 추가로 처리하였다.
NAC의
존재 하에
트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 시험관내 안정성
방법:
트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트에 대한 약물-링커의 안정성을 PBS 완충제에서 NAC의 존재 하에 평가하였다.
결과:
트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트는 완충제에서 NAC의 존재에 의해 영향을 받지 않았다(도 36). 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 NAC의 존재 하에 감소된 안정성을 나타내었다(도 35 참조). 도 36은 특히, 유리 티올로부터의 접종으로부터 야기되는 PL13 함유 ADC에 대한 프로파일 변화가 존재함을 나타내는데, 이는 작제물의 안정성을 지시하는 것이다.
마우스 혈장에서의 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의
시험관내
안정성
ADC 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE의 시험관내 혈청 안정성을 마우스 혈장에서 비교하였다.
방법:
트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE를 0.2 mg/mL의 농도로 가슴샘없는 누드 마우스 혈장에 별도로 주사하였다. 용액들을 혼합하고, 삼중 분취액 50 ㎕를 취하고, 액체 질소에서 냉동시켰다(시점-0시간). ADC의 혈장 용액을 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 분취액을 각 시점, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7일 동안 세 배로 뽑고, 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
결과:
ADC 안정성을 LC-ESI/MS 분석에 의해 모니터링하였다. 혈장 샘플을 사전-정제하고, 트립신/CNBr을 MS 분석 전에 소화시켰다. 4개의 콘주게이션되지 않은 펩티드(두 개는 중쇄이고 두 개는 경쇄임) 및 두 개의 콘주게이션된 펩티드(하나는 중쇄이며 하나는 경쇄임)를 ADC의 안정성을 모니터링하기 위해 선택하였다. 콘주게이션된 펩티드로부터의 평균 데이타는 마우스 혈장(전체-Ab) 중의 항체 성분의 안정성과 일치하며, 콘주게이션된 펩티드로부터의 데이타는 ADC 콘주게이트의 안정성을 나타낸다(LC 콘주게이션된, HC 콘주게이션된 펩티드).
이러한 시험관내 데이타는, 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-아미노벤조일-MMAE가 경쇄 및 중쇄 둘 모두에서 탈-약물화를 수행하는 반면, 항체 성분이 안정적임을 나타내었다(도 37a). 중쇄 펩티드로부터의 약물의 손실은 경쇄 펩티드와 비교할 때, 더욱 빠르며, 이는 약물 손실 속도가 콘주게이션 사이트에 의해 영향을 받음을 지시한다.
트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트는 7일 인큐베이션 기간 전반에 걸쳐 MMAE 약물을 보유하였는데, 이는 PL13이 두 콘주게이션 사이트 모두에 대한 안정성을 부여함을 나타낸다(도 37b). 두 콘주게이션 모두에 대한 관찰된 변동성(variability)은 샘플 분석을 위해 적용된 ESI-MS 방법에 대한 샘플 회수의 효능에 기인한 것이다.
마우스에서 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의 생체내 안정성
방법:
생체내 안정성을 5 mg/kg의 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 콘주게이트가 주사된 마우스에서 평가하였다. 혈장 샘플을 사전-정제하였고, LC-MS 분석 전에 트립신/CNBr을 소화하였다. 두 개의 콘주게이션된 펩티드(하나는 중쇄이며, 하나는 경쇄임)를 ADC의 안정성을 모니터링하기 위해 선택하였다.
결과:
콘주게이션된 펩티드의 안정성은 두 가지 이벤트(event)의 결과이다: 1) ADC의 이화작용 분해 및 2) 링커 불안정성으로 인한 약물의 손실. 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE로부터 유도된 콘주게이션된 펩티드는 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE로부터 유도된 펩티드 보다 마우스 혈장에서 1일에 더욱 양호한 안정성을 나타낸다. 관찰된 차이는 시험관내 마우스 혈장 데이타와 일치하는 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 보다 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE로부터 유도된 콘주게이션된 펩티드로부터의 더욱 빠른 약물 손실로 기인한 것이며, 이는 첫 4일 인큐베이션 내에 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 빠른 탈-약물화를 나타내며(도 38), 경쇄에 부착된 약물의 대략 70% 및 중쇄 상의 약물의 90%는 첫 2일내에 손실되었다. 상반되게, 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 보다 긴 시간에 걸친 링커 안정성으로 인해 보다 많은 약물을 보유한다.
다양한 세포주에서 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE
및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE의
시험관내
안정성
도 39a 내지 도 39c에서, SKBR3, BT747 및 JIMT-1 세포 사멸 데이타는 상술된 ADC에 대해 나타낸 것이다. SKBR3, BT747 및 JIMT-1 세포주가 Her2 수용체를 발현시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 세포주들을 본 시험에서 선택하였다. 추가적으로, JIMT-1 세포주는 트라스투주맙에 대해 내성적인 것으로 알려져 있다. 도 39a 내지 도 39c에서, "ADC mal"은 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 관한 것이며, "ADC-PL13"은 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 관한 것이다. 세 가지 세포주에 대한 시험된 콘주게이트의 상대적 시험관내 활성은 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE에 대한 데이타가 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE와 유사함을 지시한다. 이에 따라, 이러한 데이타는, 본 발명의 ADC가 활성적이고, 이에 따라, PL13의 존재가 세포 사멸에 대해 악영향을 지니지 않음을 나타낸다.
유방암 세포 종양을 나타내는 마우스에서 트라스투주맙-
말레이미드
-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE 및 트라스투주맙-PL13-NH-
PEG4
-val-cit-4-
아미노벤조일
-
MMAE의
생체내 안정성
유방암 세포 종양을 나타내는 마우스 상에서 ADC의 효과에 대한 이종이식 데이타는 도 40, 도 41, 및 도 42에 나타나 있다. 사용된 유방암 세포주는 BT474(Her2 발현체(expresser), 트라스투주맙에 대한 높은 민감성을 지님)이다.
생체내 ADC의 독성을 측정하기 위해 마우스 체중을 이용하였다(도 40에 나타낸 바와 같음). 얻어진 데이타로부터, 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-mal)(도 40A) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-PL13)(도 40B)가 치료 기간의 과정에 걸쳐 마우스 체중에 대한 무시할 정도의 효과를 갖는다는 것을 알 수 있었다. 이는 본 발명의 ADC가 상업적으로 사용하기 위한 적합한 독성 수준을 지님을 나타내는 것이다.
도 41은 21일 치료 기간에 걸쳐 종양 성장에 대한 세 용량(0.1, 5 및 10 mg/kg)에서의 시험된 ADC의 효과를 도시한 것이다. 종양 성장은 종양 용적의 변화에 의해 결정되었다. 0.1 mg/kg에서 두 가지 화합물 모두로 처리된 마우스는 미처리군에 비해 종양 성장 지연을 나타내었다. 상반되게, 5 및 10 mg/kg에서 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-mal) 및 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-PL13)가 투여된 모든 동물들은 치료 기간에 걸쳐 완전한 반응을 나타내었다.
도 42는 10일 치료 기간에 걸친 종양 성숙 조직학적 표현형에 대한 세 용량(0.1, 5 및 10 mg/kg)에서의 시험된 ADC의 효과를 도시한 것이다. 해마톡실린 및 에오신 염색 후에 종양 조직을 현미경으로 검사하였고, 하기와 같이 등급화하였다:
0: 이종이식 물질이 존재하지 않음; 가끔, 피하 조직 또는 지방 조직에 단리된 종양 세포가 존재함
1: 작은 분절화된 물질; 불완전한 상피 발달 순서
2: 뚜렷한 세포 손실을 나타내는 이종이식
3: 성숙 종양의 구역을 갖는 구역 세포(zonal cell) 손실
4: 완전 상피 발달 순서 및 관련된 병리학을 나타내는 온전한 이종이식 물질
종양 성숙의 감소는 0.1 mg/kg에서 투여된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-PL13) 또는 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE(ADC-mal) 중 어느 하나에 대래 관찰되지 않았으며, 두 개의 ADC 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 5 및 10 mg/kg에서 투여된 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 3일에 출발하여 유의미하게 감소된 종양 성숙을 나타내었다(각각 등급 3 및 등급 3/2). 이러한 효과는 10일에 더욱 확연하였으며(5 mg/kg의 경우 등급 1 및 10 mg/kg의 경우 등급 1/0), 일부 샘플들에서는 종양 물질을 나타내지 않았다. 5 및 10 mg/kg에서 투여된 트라스투주맙-말레이미드-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE는 3일에 출발하여 종양 성숙을 감소시켰지만(각각, 등급 4/3 및 등급 4/3/2), 이러한 효과는 3일에 동일한 용량의 트라스투주맙-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-MMAE가 투여된 동물과 비교하여 덜 뚜렷하였다. 또한, 10일에 5 및 10 mg/kg 용량에 대하 ADC-PL13에서 관찰된 것 보다 현저하게 큰 종양 이질성이 존재하였다.
14. 알부민과의 PL11-
PEG
20KDa
, PL12-
PEG
20KDa
및 PL13-
PEG
20KDa
링커 반응성의 입증
상기에 명시된 바와 같이, 상업적 등급의 알부민에 존재하는 대부분의 시스테인 티올을 캡핑하였으며, 이에 따라, 링커 분자와의 콘주게이션 이전에 환원 단계가 요구된다.
방법:
알부민(221 μM)을 실온(RT)에서 1시간 동안 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(1 mM)을 함유한 포스페이트-완충된 염수(PBS) pH 7.0 중에서 디티오트레이톨(DTT)(1 mM)로 환원시키고, 이후에, Nap-5 컬럼 상에서 탈염화시키고, UV 측정으로 정량화하였다. 환원된 알부민(20 μM)에 20 KDa PEG-PL-12(10 몰 과량) 또는 20 KDa PEG-PL-13(10 몰 과량)의 콘주게이션을 RT에서 1일 동안 PBS, pH 7.4, 1 mM EDTA에서 수행하였다. 유사하게, 환원된 알부민(20 μM)에 20 KDa PEG-말레이미드(1.1 몰 과량)의 콘주게이션을 RT에서 1일 동안 1 mM EDTA를 함유한 PBS, pH 7.4에서 수행하였다. 반응을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였고, ImageLab 소프트웨어(Biorad)를 이용하여 SDS-PAGE 겔 상의 단백질 밴드 밀도의 분석에 의해 정량화를 수행하였다.
결과:
단지 중간 정도의 콘주게이션 수율이 관찰되었으며, 1일 후에 알부민의 상업적 등급이 감소되었다. PL13의 콘주게이션은 말레이미드 대조군에 대해 유사한 수율로 진행되었으며, PL12는 동일한 시간에 걸쳐 보다 약간 낮은 수율을 제공하였다. 이는 도 43에 도시되어 있다.
15. 알부민에 대한 PL11, PL12 및 PL13
콘주게이션의
최적화
알부민에 대한 링커의 콘주게이션은 PL-11의 경우 pH 5.5에서, 그리고 PL-12 및 PL-13의 경우 pH 5.5, 6.5, 7.5, 8.0 및 8.5에서 결정되었다.
방법:
알부민(50 μM)에 대한 PL-11(10 몰 과량)의 콘주게이션을 37℃에서 24시간 동안 50 mM 아세테이트-Na pH 5.5에서 수행하였다. 알부민(50 μM)에 대한 PL-12 및 PL-13(10 몰 과량)의 콘주게이션을 37℃에서 24시간 동안 하기 완충제에서 수행하였다: 50 mM 아세테이트-Na pH 5.5; PBS 1 mM EDTA pH 6.5; PBS 1 mM EDTA pH 7.5; 100 mM 포스페이트; 1 mM EDTA pH 8.0; 및 100 mM 카보네이트-Na, 1 mM EDTA pH 8.5.
완료 시에, 모든 알부민 샘플을 Nap-5 컬럼 상에서 PBS 완충제(pH 7.4)로 탈염화시켰다. 콘주게이션 효능을 Ellman의 검정에 의해 정량화하였다. Ellman 검정은 5,5'-디티오-비스-(2-니트로벤조산)을 유리 티올 기와 반응시킴으로써 유리 시스테인 잔기를 검출하고 정량화한다. 알부민 중 34Cys의 유리 티올 기에 대한 링커 분자의 콘주게이션은 콘주게이션되지 않은 알부민 대조군과 비교하여 Ellman 시약에 의한 이러한 기의 검출을 방해한다. 검출 가능한 유리 티올의 농도의 감소를 이용하여 알부민에 콘주게이션된 링커 분자의 양을 정량화하였다.
결과:
pH 5.5에서 알부민에 대한 PL-11의 콘주게이션은 82% 수율로 진행되었다. PL-12(91 %) 및 PL-13(94 %)의 콘주게이션을 위한 최적의 pH는 pH 7.5인 것으로 결정되었다. 이러한 결과는 도 44에 도시되어 있다.
16.
ESI
-MS에 의한 링커-알부민
콘주게이트
안정성의 결정
또한, 알부민-PL11, 알부민-PL12 및 알부민-PL13 콘주게이트를 ESI-MS에 의해 분석하였다.
방법:
알부민(50 μM)에 대한 PL-11(20 몰 과량)의 콘주게이션을 37℃에서 24시간 동안 pH 6.5에서 EDTA(1 mM)를 함유한 PBS에서 수행하였다. 알부민(50 μM)에 대한 PL-12 및 PL-13(10 몰 과량)의 콘주게이션을 37℃에서 24시간 동안 pH 7.5에서 EDTA(1 mM)를 함유한 PBS에서 수행하였다. 알부민-링커 콘주게이트를 ESI-MS에 의해 분석하였다.
결과:
도 45는 알부민-PL-11 콘주게이션 (A), 알부민-PL-12 콘주게이션 (B) 및 알부민-PL-13 콘주게이션 (C)에 대해 얻어진 ESI-MS 결과를 도시한 것이다.
하기 알부민 종들은 MS 신호 세기를 기초로 하여 검출되고 정량화되었다(주석: MW는 분자량을 나타냄):
알부민-PL11
● 콘주게이션되지 않은 알부민 - 6 %
콘주게이션되지 않은 알부민의 예상된 MW - 66440(검출된 MW = 66445 Da)
● 알부민-PL11 콘주게이트 - 90 %
알부민-PL11의 예상된 MW - 66649 Da(검출된 MW = 66650 Da)
● 두 개의 PL11에 콘주게이션된 알부민 ~ 4 %
알부민-2-PL11의 예상된 MW - 66858 Da(검출된 MW = 66858 Da)
알부민-PL12
● 콘주게이션되지 않은 알부민 - 1 %
콘주게이션되지 않은 알부민의 예상된 MW - 66440(검출된 MW = 66441 Da)
● 알부민-PL12 - 92 %
알부민-PL12의 예상된 MW - 66663 Da(검출된 MW = 66664 Da)
● 두 개의 PL12에 콘주게이션된 알부민 - 7 %
알부민-2-PL12의 예상된 MW - 66886 Da(검출된 MW = 66886 Da)
알부민-PL13
● 콘주게이션되지 않은 알부민 - 5 %
콘주게이션되지 않은 알부민의 예상된 MW - 66440(검출된 MW = 66441Da)
● 알부민-PL13 - 94 %
알부민-PL13의 예상된 MW - 66631 Da(검출된 MW = 66632Da)
● 두 개의 PL13에 콘주게이션된 알부민 - 1%
알부민-2-PL13의 예상된 MW - 66822 Da(검출된 MW = D66822a)
특히, 도 45에 관하여, 피크 (4501), (4504) 및 (4507)은 미반응되고 산화된 알부민에 해당하는 것이며, 피크 (4502), (4505) 및 (4508)은 단일 콘주게이트 알부민에 해당하는 것이며, 피크 (4503), (4506) 및 (4509)는 이중 콘주게이트 알부민에 해당하는 것이다.
17. 글루타티온에서 알부민-링커
콘주게이트의
안정성의 결정
알부민-링커 분자 콘주게이트의 안정성을 과량의 글루타티온의 존재 하에 결정하였고, 7일의 기간에 걸쳐 ESI-MS에 의해 분석하였다.
방법:
알부민-PL-12 콘주게이트(0.5 mg/mL)의 샘플을 37℃에서 7일 동안 PBS(pH 7.4) 중에서 환원된 글루타티온(1 mM)과 함께 인큐베이션하였다. 샘플들을 ESI-MS 상에서 분석하였다.
결과:
도 46은 예시적인 예로서 알부민-PL-12 콘주게이트에 대해 얻어진 결과를 도시한 것이다. 유사한 경향(trend)이 알부민-PL-11 및 알부민-PL-13 콘주게이트에 ㄷ대해 관찰되었다.
도 46은 0, 1, 4 및 7일에 ESI-MS 결과를 도시한 것이다. 도 46에서, 피크 (4601), (4603), (4605) 및 (4608)은 알부민에 해당하는 것이며, 피크 (4602), (4604), (4606) 및 (4609)는 알부민-PL12 콘주게이트에 해당하는 것이며, 피크 (4607) 및 (4610)은 GSH-알부민에 해당하는 것이다. 이에 따라, 하기와 같은 것이 나타난다:
● 존재하는 주요 종들은 알부민-PL12 콘주게이트(MW = ~66664 Da)이다.
● 1 mM 글루타티온과 함께 인큐베이션 시에, 글루타티온과 함께 4일의 인큐베이션에서 출발하고 7일째 인큐베이션에서 ~ 13 %에 도달하는, 알부민-GSH 신호의 매우 느린 증가가 존재한다((~8 %, MW = 66752 Da).
본 발명의 알부민-링커 콘주게이트가 경쟁적 환경에서 양호한 안정성을 나타낸다고 결론지어질 수 있다.
18. 본 발명에 따른 링커를 사용한 알부민-
독소루비신
콘주게이트의
발생
방법:
알부민, 티오알부민(단일 시스테인 돌연변이체) 및 티오알부민(이중 시스테인 돌연변이체)을 각각 14, 20 및 30배 과량의 PL13-NH-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일-독소루비신 링커(도 47)에 콘주게이션시켰다. 반응을 어두운 곳에서 37℃에서 2일 동안 10 % v/v DMA 및 0.6 mM EDTA의 존재 하에 147 mM 소듐 포스페이트 pH 7.5에서 수행하였다. 이러한 시간 후에, 반응을 PBS 완충제 pH 7.4에서 평형화된 PD-10 컬럼 상에서 탈염화시켰다.
콘주게이션 효능을 495 nm(ε=8030 M-1, cm- 1)에서 독소루비신 흡광도 및 소광 계수 및 280(ε=34445 M-1, cm- 1)에서 알부민의 흡광도 및 소광 계수를 이용하여 UV-Vis 흡광법에 의해 결정하였으며, 하기 방정식에 따라 280 nm에서 독소루비신 흡광도에 대해 보정하였다:
알부민-독소루비신 콘주게이트 응집의 정도를 비-환원 SDS-PAGE 및 SEC 크로마토그래피에 대한 분석에 의해 결정하였다.
SDS-PAGE 로딩 완충제 중 10 ㎕의 각 알부민-독소루비신 콘주게이트를 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 상에 로딩하고, 200 V에서 45분 동안 진행시켰다. 독소루비신의 고유 형광 성질을 사용하여 단백질 종에 대한 쿠마시(Coomassie) 염료로 겔을 염색하기 전에 알부민-독소루비신 콘주게이트를 시각화하였다.
5 ㎕의 각 콘주게이트를 pH 7.0에서 150 mM 소듐 포스페이트 완충제로 평형화된 SEC HPLC 컬럼 상에 로딩하고, 280 nm에서의 검출과 함께, 1 mL/분의 유량으로 용리시켰다.
결과:
야생형 알부민 및 알부민 돌연변이체에 대한 독소루비신의 콘주게이션은 알부민의 경우 55 %, 티오알부민-단일 돌연변이체의 경우 32 %, 및 티오알부민-이중 돌연변이체의 경우 14 %의 수율을 야기시켰다(도 48 참조).
SDS-PAGE 분석은 모든 알부민-독소루비신 샘플에서 소량의 고분자량 종(HMWS)의 존재를 나타내었다(도 49 참조). 이러한 데이타는 SEC 분석에 의해 관찰된 것과 일치한다(도 50 참조). 또한, SDS-PAGE 분석은 UV-Vis 분광법에 의해 관찰된 알부민에 대한 독소루비신의 콘주게이션을 확인하였다(도 49 참조, DOX 형광).
알부민-독소루비신 및 티오알부민-독소루비신 콘주게이트를 SEC 크로마토그래피에 의해 콘주게이션되지 않은 알부민 및 콘주게이션되지 않은 티오알부민 대조군과 함께 분석하였다. 독소루비신 콘주게이트의 분석은 모노머 함량이 알부민-DOX의 경우 대략 97.6 %, 알부민-DOX(단일 돌연변이체)의 경우 86.8 %, 및 알부민-DOX(이중 돌연변이체)의 경우 88.2 %임을 나타내었다(도 50 B, C 및 F 참조). 콘주게이션되지 않은 알부민 및 티오알부민 대조군(도 50 A, C 및 E 참조)은 독소로비신 콘주게이션된 종에 대한 유사한 모노머 및 고분자량 종 함량을 나타내었다. 특히, 도 50은 HMWS의 존재에 해당하는 (5001), (5003), (5005), (5007), (5009) 및 (5011)에서의 피크, 및 모노머 함유물에 해당하는 (5002), (5004), (5006), (5008), (5010) 및 (5012)에서의 피크를 나타낸다.
두 개의 티오알부민 돌연변이체 모두는 야생형 알부민에 비해 보다 높은 응집 경향을 나타낸다: 고유 알부민의 경우 2.4 내지 2.6 %와 비교하여 티오알부민(단일 돌연변이체)의 경우 13.2 내지 14.5 % 및 티오알부민(이중 돌연변이체)의 경우 11.8 내지 16.6 %. 이러한 샘플들의 분석은, PL13-PEG4-val-cit-4-아미노벤조일를 통한 독소루비신의 콘주게이션이 매우 내성적이고, 추가적인 응집을 형성시키지 않음을 확인하였다(도 50 A, C 및 F 참조).
이에 따라, 본 발명의 단백질 약물 콘주게이트가 공지된 단백질 약물 콘주게이트에 대한 적합한 대안을 제공함을 나타낸다. 또한, 본 발명의 단백질 약물 콘주게이트에 도입된 링커가 성공적으로 단백질에 약물을 결합시키고 타겟 조직에 도달할 때까지 약물을 보유함으로써 안전하고 효과적인 약물 전달을 가능하게 한다.
Claims (23)
- 구상 단백질(globular protein), 링커(linker) 및 약물을 포함하는 단백질 약물 콘주게이트(protein drug conjugate)로서, 링커가 비닐 치환체를 포함하는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항에 있어서, 구상 단백질이 알부민인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제2항에 있어서, 알부민이 인간 알부민인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항에 있어서, 구상 단백질이 항체 또는 이의 분절인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제4항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약물이 세포 독소(cytotoxin) 또는 치료 펩티드(therapeutic peptide) 또는 폴리펩티드인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제6항에 있어서, 세포 독소가 생물학적 활성 세포 독성 물질인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 세포 독소가 항암 약물인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 일반식을 갖는 분자를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트:
상기 식에서,
- X 및 Y는 독립적으로 CH 또는 N으로부터 선택되며,
- R1은 하기 기로부터 선택되며:
■ (CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-R, 또는
■ (CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)n-CH(CO2R2)2, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2, 또는
■ (CH2)n-Z1,
여기서,
● Z는 독립적으로 NH, O 또는 S로부터 선택되며,
● Z1은 독립적으로 N3 또는 OH로부터 선택되며,
● n은 0 내지 10의 임의 정수이며,
● m은 0 내지 10의 임의 정수이며,
● R은 H, OH, 아민 또는 폴리(알킬렌 글리콜) 기이며;
- R2 및/또는 R3은 R1 또는 R2와 동일한 기의 분자들로부터 선택되고/거나 R3은 수소 또는 전자 끄는 기, 예를 들어, 할로겐(F, Cl, 또는 Br), -NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, -CN, -CF3, -SO2NR4R5로부터 선택되며, 여기서, R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-10 알킬로부터 선택되거나;
- R2 및/또는 R3은 수소, 알킬 또는 페닐로부터 선택되거나;
- R2 및 R3은 함께, 인돌, 인다졸, 벤즈이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 아지리딘 또는 푸린을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 융합된 (헤테로) 방향족 고리 치환체를 형성한다. - 제9항에 있어서, 링커가, Z가 O이고 R1 및 임의적으로 R1과 동일한 기의 분자들로부터 선택된 R2 및 R3이 고리 상에서 2번 또는 6번 위치에 있을 때, m이 3 이상인 일반식 (I)을 갖는 분자를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 4-비닐피리딘인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 화학식에 의해 표현될 수 있는 단백질 약물 콘주게이트:
상기 식에서,
R1은 하기 기로부터 선택되며:
■ (CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-R, 또는
■ (CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R, 또는
■ (CH2)n-CH(CO2R2)2, 또는
■ (CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2, 또는
■ (CH2)n-Z1;
여기서,
- R2는 R1과 동일한 기의 분자, 수소, 전자 끄는 기, 알킬 또는 페닐 기로부터 선택되며,
- Z는 독립적으로 NH, O, 또는 S로부터 선택되며,
- Z1은 독립적으로 N3 또는 OH로부터 선택되며,
- n은 0 내지 10의 임의 정수이며,
- m은 0 내지 10의 임의 정수이며,
- R은 수소(H), 하이드록사이드(OH), 아민 또는 폴리-(알킬렌 글리콜) 기이다. - 제12항에 있어서, 링커가 Z가 O일 때, m이 3 이상인 일반식 (III)을 갖는 분자를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 폴리-(알킬렌 글리콜) 기를 포함하는 단백질 약물 콘주게이트.
- 제14항에 있어서, 폴리-(알킬렌 글리콜) 기가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 단백질 약물 콘주게이트.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 폴리-(알킬렌 글리콜) 구조에 하이드록시, 아민, 카복실산, 알킬 할라이드, 아지드, 숙신이미딜 또는 티올 기를 포함하는 하나 이상의 반응성 작용기가 제공되는 단백질 약물 콘주게이트 ADC.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 연장 링커(extender linker)를 추가로 포함하는 단백질 약물 콘주게이트.
- 제17항에 있어서, 상기 연장 링커가 효소 분열 가능한 단백질 약물 콘주게이트.
- 약물에 결합된 링커와 단백질을 접촉시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 단백질 약물 콘주게이트를 제조하는 방법.
- 제19항에 있어서, 하나 이상의 반응성 티올 기를 갖는 단백질을, 단백질의 하나 이상의 유리 티올기(free thiol group)와 반응할 수 있는 비닐 치환체를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는 작용화 시약(funtionalising reagent)을 포함하는 링커와 접촉시키는 것을 포함하며, 링커 작용화 시약이 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자에 공유 결합되는 방법.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 비닐 치환체를 갖는 질소 함유 헤테로시클릭 방향족 고리를 포함하는 전구체 작용화 시약을 폴리-(알킬렌 글리콜) 분자와 반응시켜 작용화 시약을 형성시키는 초기 단계를 포함하는 방법.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질을 개질시켜 폴리펩티드의 하나 이상의 요망되는 위치에서 티올 기를 갖는 변이형 폴리펩티드(variant polypeptide)를 형성시키는 초기 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 치료법(therapy)에서 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 약물 단백질 콘주게이트.
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Citations (1)
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