KR20190122833A - 링커 유닛 및 이를 포함하는 분자 구조물 - Google Patents

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KR20190122833A
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Abstract

본 개시는 각각 표적화 요소 및 이와 연결된 이펙터 요소를 갖는 다양한 링커 유닛 및 분자 구조물을 제공한다. 이러한 링커 유닛 및 분자 구조물을 사용하여 다양한 질환을 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

링커 유닛 및 이를 포함하는 분자 구조물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2017년 3월 16일 출원된 미국 가출원 제62/472,011호 및 2018년 1월 3일 출원된 제62/613,401호에 관한 것이고 그의 이익을 주장하며; 이들 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 제약 분야; 보다 구체적으로, 다기능성 분자 구조물, 예를 들어 이펙터, 표적화 및 약동학적 개선과 같은 다기능 특성을 갖는 분자 구조물에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
표적화 및 치료 효과를 모두 가지는 약제의 개발은 수요가 많은 연구 분야가 되었다. 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 제WO2016112870 (A1)호에 개시된 바와 같은 멀티-암 링커 유닛 및 이의 관련 응용은 2 이상의 기능성 부분을 갖는 분자의 구성을 위한 주요 화학 물질을 나타낸다. 그러나, WO2016112870 공개에서는 클릭 화학 반응을 위해 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴과 같은 삽입 작용기를 가지는 아미노산을 이용하는데; 이들 아미노산은 고상 펩티드 합성 동안 펩티드 코어에 혼입하는 것이 가능하지 않다. 또한, WO2016112870 공개에 따르면, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴 기를 가지는 커플링 팔은 시스테인 잔기의 티올기와 하나의 말단에 말레이미드기를, 다른 말단에 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기를 포함하는 이종이기능성 링커의 말레이미드기와의 반응을 통해 삽입된다. 티올과 말레이미드 반응의 생성물은 불안정하고, 인접한 티올기 함유 분자와의 가역 반응 또는 교환 반응을 거쳐 저장시 접합 링커의 안정성에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, WO2016112870 공개에 교시된 바와 같이, 펩티드 코어가 시스테인 잔기를 함유하는 경우, 펩티드 코어상의 티올기와 반응할 수 있는 작용기를 가지는 연결 팔의 연속적인 고상 합성 (펩티드의 분기)을 수행하는 것은 불가능하다. 또한, 펩티드 코어의 N-말단에 있는 알파-아민기는 추가적인 차단 단계를 필요로 하여 펩티드 코어 또는 링커 유닛의 수율 및 순도를 감소시킨다.
상기의 관점에서, 관련 업계에서는 전술한 문제점 중 적어도 하나를 해결할 수 있는 신규 멀티-암 링커 유닛에 대한 필요성이 존재한다. 예를 들어, 이러한 신규 멀티-암 링커 유닛은 연속적인 고상 합성으로 합성될 수 있고/있거나 기능성 요소 (예를 들어, 표적화 요소, 이펙터 요소 및/또는 약동학 개선을 위한 요소들)에 보다 바람직한 안정성 및/또는 접합 효능을 나타낼 수 있다.
요약
다음은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 개시의 간략화된 요약을 제공한다. 이 요약은 본 개시의 포괄적인 개요가 아니며, 본 발명의 핵심/주요 요소를 식별하거나 본 발명의 범위를 정확하게 서술하지 않는다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 이후에 제시되는 보다 상세한 설명에 대한 서두로서 간략화된 형태로 제시하는 것이다.
<I> 멀티-암 링커 유닛
제1 측면에서, 본 개시는 기능성 요소와의 접합을 위한 복수의 연결 팔을 갖는 신규 펩티드 코어 기반 멀티-암 링커 유닛에 관한 것이다.
본 개시의 실시양태에 따라, 본 발명의 코어는 복수의 연결 아미노산 잔기, 하나 이상의 스페이서 및 하나 또는 두개의 접합 모이어티를 포함한다. 각각의 연결 아미노산 잔기는 측쇄 아민기 (예를 들어, 라이신 (K) 잔기) 또는 카복실기 (예를 들어, 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E) 잔기)를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 연결 아미노산 잔기 중 임의의 2개는 서로 인접하거나 스페이서 중 하나에 의해 분리된다.
각각의 스페이서는 독립적으로 (1) 하나 이상의 비-K 아미노산 잔기 (즉, K 잔기 이외의 아미노산 잔기), 또는 (2) 2 내지 12개의 반복 에틸렌 글리콜 (EG) 유닛을 갖는 페길화된 아미노산을 포함한다. 일부 예시적인 실시양태에 따라, 스페이서는 하나 이상의 글리신 (G) 및/또는 세린 (S) 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 1 내지 20개의 아미노산 잔기; 바람직하게는 2 내지 5개의 아미노산 잔기로 이루어진다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 스페이서 중 하나는 N-말단으로부터 시작하여 첫 번째 연결 아미노산 잔기의 N-말단에 연결되고, 따라서 N-말단 스페이서를 형성한다. 추가로 또는 대안적으로, 스페이서 중 하나는 N-말단으로부터 시작하여 마지막 연결 아미노산 잔기의 C-말단에 연결되어 C-말단 스페이서를 형성한다.
접합 모이어티는 하나의 말단에 카복실기 (즉, -CO2H기) 또는 아민기 (즉, -NH2기)를, 다른 말단에는 접합기를 갖는다. 예를 들어, 접합기는 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기이다. 구체적으로, 스페이서가 첫 번째 연결 아미노산 잔기의 N-말단에 연결된 경우 (즉, N-말단 스페이서로서), 접합 모이어티는 카복실기를 가지므로 N-말단 스페이서의 알파-아민기와 아미드 결합을 형성함으로써 N-말단 스페이서의 N-말단에 결합된다. 대안적으로, 스페이서가 마지막 연결 아미노산 잔기의 C-말단에 연결된 경우 (즉, C-말단 스페이서로서), 접합 모이어티는 아민기를 가지며 C-말단 스페이서의 카복실기와 아미드 결합을 형성함으로써 C-말단 스페이서의 C-말단에 결합된다. 이와 같이 결합된 접합 부분은 이의 자유 말단 (즉, N-/C-말단 스페이서에 반응하지 않는 말단)에 접합기를 갖는다.
연결 팔은 펩티드 코어에서 연결 아미노산 잔기로부터 연장된다. 본 개시의 실시양태에 따라, 각각의 연결 팔은 이의 하나의 말단에 반응성 기를 갖고 이의 다른 말단에는 작용기를 갖는다. 반응성 기는 숙신이미딜 에스테르 (SE; 예를 들어, 하이드록시숙신이미드-에스테르 또는 N-하이드록시숙신이미딜 (NHS) 에스테르), 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르, 카복실기 또는 하이드록실기 (즉, -OH 기)일 수 있고, 작용기는 아민, 카복실, 하이드록실, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS), NHS, 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 메틸술포닐 벤조티아졸, 요오도, 요오도아세트아미드, 아지드, 알킨, 사이클로옥틴, 테트라진 및 사이클로옥텐기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구조적으로, 각각의 연결 팔은 연결 팔의 반응성 기와 연결 아미노산 잔기의 아민 또는 카복실기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 하나의 연결 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 실시양태에서, 본 코어가 복수의 K 잔기를 포함하는 경우, 각각의 연결 팔은 아민-반응성 기 (예컨대, 숙신이미딜 에스테르, TFP 에스테르 또는 카복실기)를 갖는다. 이 경우, 연결 팔은 K 잔기의 아민기와 아미드 결합을 형성함으로써 K 잔기에 연결될 수 있다. 대안적으로, 본 코어가 복수의 D 및/또는 E 잔기를 포함하는 경우, 각각의 연결 팔은 카복실-반응성 기 (예를 들어, 하이드록실기)을 가지며, 따라서 연결 팔은 D 및/또는 E 잔기의 카복실기와 아미드 결합을 형성함으로써 D 및/또는 E 잔기에 연결될 수 있다. 본 코어에 연결된 후, 각각의 연결 팔은 이의 자유 말단 (즉, 본 코어에 부착되지 않은 말단)에 작용기를 갖는다.
접합기 및 작용기를 선택할 때, 접합 모이어티의 접합기 및 연결 팔의 작용기는 서로 클릭 화학 반응을 겪지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 접합 모이어티의 접합기가 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기인 경우, 연결 팔의 작용기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이고; 대안적으로, 접합 모이어티의 접합기가 테트라진 또는 사이클로옥텐기인 경우, 연결 팔의 작용기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이다. 링커 유닛이 N- 및 C-말단 스페이서에 각각 연결된 2개의 접합 모이어티를 포함하는 조건에도 동일한 설계 방법이 적용될 수 있다; 즉, 연결 팔의 작용기 및 두 접합 모이어티의 접합기는 서로 클릭 화학 반응을 겪을 수 없다. 따라서, 이 경우에, 연결 팔의 작용기는 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 요오도 또는 요오도아세트아미드기일 수 있고; 하나의 접합 모이어티의 접합기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이고; 다른 접합 모이어티의 접합기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이다. 이해할 수 있는 바와 같이, 두 접합 모이어티가 단일 종의 요소와 접합되도록 의도되는 상황에서, 두 접합 모이어티의 접합기는 동일할 수 있거나, 또는 동일한 클릭 화학 반응을 거칠 수 있다.
본 개시의 일부 실시예에 따라, 각각의 연결 팔은 2-12개의 비-K 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 또는 2-24 반복 EG 유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄이다. 하나의 특정 예에서, 각각의 연결 팔은 G, S, E 및 아르기닌 (R) 잔기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5-10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이다. 대안적인 예에서, 각각의 연결 팔은 6-12 반복 EG 유닛을 갖는 PEG 쇄이다.
원하는 목적에 따라, 상이한 기능성 요소 (표적화 또는 이펙터 요소로서 제공)는 각각 연결 팔의 자유-말단 및 본 링커 유닛의 접합기에 연결될 수 있다. 본 개시의 특정 실시양태에 따라, 본 링커 유닛은 복수의 연결 팔 및 하나의 접합 모이어티를 포함하고, 여기서 복수의 제1 요소는 그들 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나, 또는 티올-말레이미드 반응, SN2 반응, 구리 촉매화 아지드-알킨 사이클로부가 (CuAAC) 반응, 변형 촉진 아지드-알킨 클릭 화학 (SPAAC) 반응, 또는 역 전자 요구 딜스-알더 (iEDDA) 반응을 통함으로써 복수의 연결 팔에 연결되고; 제2 요소는 CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 접합기에 연결된다. 대안적으로, 본 링커 유닛은 복수의 연결 팔 및 2개의 접합 모이어티를 포함할 수 있고; 따라서, 다수의 요소가 각각 연결 팔 및 2개의 접합 모이어티에 연결될 수 있다. 구체적으로, 복수의 제1 요소는 그들 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나, 또는 티올-말레이미드 반응 또는 SN2 반응을 통해 연결 팔에 각각 연결되고; 제2 요소는 SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 하나의 접합 모이어티의 접합기에 연결되며; 제3 요소는 CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 다른 접합 모미어티의 접합기에 연결된다. 이해할 수 있는 바와 같이, 상기 제2 및 제3 요소는 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 요소는 연결 팔을 통해 펩티드 코어의 연결 아미노산 잔기 (예를 들어, K 잔기)와 접합되기 때문에, 연결 아미노산 잔기의 수를 변경함으로써 링커 유닛이 보유하는 제1 요소의 수를 조정하는 것이 가능하다. 따라서, 제1 요소 대 제2 요소 (또는 제2 및 제3 요소)의 수의 비는 필요에 따라 변경될 수 있다.
본 개시의 임의적인 실시양태에 따라, 사이클로옥텐기는 노르보넨 또는 트랜스-사이클로옥텐 (TCO) 또는 이의 유도체이다. 사이클로옥틴기의 예시적인 예는 디벤조사이클로옥틴 (DIBO), 이불소화 사이클로옥틴 (DIFO), 비사이클로노닌 (BCN) 및 디벤조아자사이클로옥틴 (DIBAC 또는 DBCO) 및 이들의 유도체를 포함한다. 테트라진기의 예는 1,2,3,4-테트라진, 1,2,3,5-테트라진 및 1,2,4,5-테트라진 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
<II> 2 이상의 링커 유닛 (조인트 링커)을 갖는 분자 구조물
다른 측면에서, 본 개시는 그에서의 각각의 접합기를 통해 서로 커플링하는 적어도 2개의 링커 유닛을 포함하는 분자 구조물에 관한 것이다. 각각의 링커 유닛은 하나 이상의 요소를 보유할 수 있어, 서로 커플링될 때, 얻어진 분자 구조물은 상이한 기능성 (예를 들어, 표적화, 치료 또는 약동학적 기능)을 갖는 요소를 포함할 수 있다. 이 경우, 각각의 링커 유닛의 펩티드 코어의 연결 아미노산 잔기의 수를 변화시킴으로써 상이한 기능성 요소들 사이의 수의 비율을 조정할 수 있다.
본 개시의 특정 실시양태에 따라, 분자 구조물은 제1 및 제2 링커 유닛을 포함한다. 제1 또는 제2 링커 유닛의 기본 구조는 본 개시의 제1 측면과 관련하여 전술한 것과 실질적으로 동일하다. 구체적으로, 제1 링커 유닛은 제1 코어, 및 제1 코어에 각각 연결된 복수의 연결 팔 (이하, 제1 연결 팔)을 포함하고, 여기서 제1 코어는 이의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 모이어티 (이하, 제1 접합 모이어티)를 포함한다; 제2 링커 유닛은 제2 코어, 및 제2 코어에 각각 연결된 복수의 연결 팔 (이하, 제2 연결 팔)을 포함하고, 여기서 제2 코어는 이의 N- 또는 C-말단에 연결된 접합 모이어티 (이하, 제2 접합 모이어티)를 포함한다. 이어서, 제1 및 제2 링커 유닛은 제1 및 제2 접합 모이어티의 접합기 사이에서 일어나는 iEDDA, SPAAC, 또는 CuAAC 반응을 통해 서로 커플링된다.
치료 목적을 위해, 상이한 기능성 요소 (표적화 및 이펙터 요소로서 제공됨)는 그 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나 티올-말레이미드 반응, SN2 반응, CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 제1 및 제2 연결 팔에 각각 연결될 수 있다.
이러한 설계는 복잡한 구조를 갖는 분자 구조물의 손쉬운 합성을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 당업자는 상이한 기능성 요소를 각각 갖는 분자 구조물의 라이브러리를 구축한 다음, 요구 및 또는 의도된 응용에 따라 라이브러리로부터 2개의 분자 구조물 (또는 링커 유닛)을 선택 및 조합하여 원하는 구조물을 형성할 수 있다. 또한, 링커 유닛의 기능성 요소의 수는 코어의 연결 아미노산 잔기의 수를 조정함으로써 제어된다.
<III> 질환 치료에서 본 링커 유닛 또는 분자 구조물의 용도
본 발명의 링커 유닛 및 분자 구조물은 모두 다양한 질환, 예를 들어, 확산성 종양 및 고형 종양을 치료하기 위한 약학 분자의 구성에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시의 다른 측면에 또한 포함되는 대상은 본 링커 유닛 및 분자 구조물을 포함하는 약학 조성물, 본 링커 유닛 및 분자 구조물 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 사용하여 질환을 치료하는 방법, 및 질환 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본 링커 유닛 및 분자 구조물의 용도를 포함한다
확산성 종양을 치료하기에 적합한 약학 분자를 작제하기 위해, 제1 요소는 단일쇄 가변 단편 (scFv), 단일 도메인 항체 (sdAb) 등과 같은 항체 단편일 수 있으며, 이는 제1 세포 표면 단백질에 특이적이고, 제2 요소는 세포 독성 약물, 또는 제2 세포 표면 단백질에 특이적인 항체 단편이다. 확산성 종양을 치료하기 위한 표적화 요소로서 사용하기에 적합한 제1 세포 표면 항원은 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138, 및 CD319를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 한편, 이펙터 요소로서 사용하기에 적합한 제2 세포 표면 항원의 비제한적 예는 CD3 및 CD16a를 포함한다. 대안적으로, 제1 및 제2 세포 표면 항원은 각각 CD79a 및 CD79b이다.
본 링커 유닛 및/또는 분자 구조물에 의해 치료 가능한 확산성 종양의 예는 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 골수종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
고형 종양을 치료하기 위한 분자 구조물을 구축하기 위해, 제1 요소 (즉, 표적화 요소)는 펩티드 호르몬, 성장 인자 및 종양 관련 항원에 특이적인 제1 항체 단편으로부터 선택될 수 있는 반면; 제2 요소 (즉, 이펙터 요소)는 세포 독성 약물, 톨-유사 수용체 (TLR) 작용제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 사이토카인, 또는 제2 성장 인자, 세포 표면 항원, 합텐 또는 사이토카인에 특이적인 제2 항체 단편일 수 있다.
예를 들어, 펩티드 호르몬은 세크레틴, 콜레시스토키닌 (CCK), 소마토스타틴 및 유사체 (예를 들어, 옥트레오티드) 또는 갑상선 자극 호르몬 (TSH)일 수 있다. 제1 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 돌연변이 EGF, 에피레귤린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 (HB-EGF), 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 또는 간세포 성장 인자 (HGF)일 수 있다. 종양-관련 항원의 예시적인 예는 표피 성장 인자 수용체 (HER1), HER2, HER3, HER4, 탄수화물 항원 19-9 (CA 19-9), 탄수화물 항원 125 (CA 125), 암종배아 항원 (CEA), 뮤신 1 (MUC 1), 강글리오사이드 GD2, 흑색종 관련 항원 (MAGE), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 메소텔린, 뮤신 관련 Tn, 시알릴 Tn, Globo H, 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4) 및 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)를 포함한다.
확산성 종양 또는 고형 종양의 치료를 위해 링커 유닛 또는 분자 구조물에 사용하기에 적합한 세포 독성 약물의 예에는 머탄신, 아우리스타틴, 마이탄신, 독소루비신, 칼리케아마이신 및 캄프토테신이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 비제한적인 TLR 작용제는 리포폴리사카라이드 (LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 모톨리모드, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가디퀴모드, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG DON), 리포테이코산, β-글루칸 및 자이모산을 포함한다. 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산 (NOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4-디아세트산 (NODA) 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA)을 포함하고; 방사성 핵종은 111In, 131I, 또는 177Lu이다. 사이토카인은 인터루킨-2 (IL-2), IL-10, IL-12, 인터페론-알파 (IFN-α), IFN-γ, TGF-β 또는 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 제2 항체 단편에 의해 특이적으로 인식되고 결합될 수 있는 제2 성장 인자는 EGF, 돌연변이 EGF, VEGF-A, bFGF 또는 HGF일 수 있다. 제2 항체 단편에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 세포 표면 항원은 CD3, CD16a, CD28, CD134, 세포 독성 T 림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4 또는 CD152), 예정된 세포사 1 (PD-1, 또는 CD279) 및 예정된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1 또는 CD274)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제2 항체 단편에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 사이토카인은 IL-2, IFN-α, IFN-γ 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 이 경우에, 제2 항체 단편은 비중화 항체 단편이다. 합텐은 디니트로페놀 (DNP), 트리니트로페놀 (TNP), 및 아미노산 서열 WADWPGPP (서열 번호 23)를 갖는 짧은 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 링커 유닛 및/또는 분자 구조물에 의해 치료 가능한 예시적인 고형 종양은 흑색종, 식도암종, 위암종, 뇌종양, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 신장암, 간세포 암종, 난소암, 전립선암, 갑상선암, 고환암 및 두경부 편평세포 암종을 포함한다.
첨부 도면과 관련하여 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 본 개시로 수반되는 많은 특징 및 이점이 더 잘 이해될 것이다.
본 설명은 아래에서 간략하게 논의되는 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1A 내지 도 1H는 본 개시의 특정 실시양태에 따른 코어를 도시한 개략도이다.
도 2A 내지 도 2F는 본 개시의 특정 실시양태에 따른 링커 유닛을 도시한 개략도이다.
도 3A 내지 도 3C는 본 개시의 일부 실시양태에 따른 연결된 기능성 요소를 포함하는 링커 유닛을 도시한 개략도이다.
도 4A 내지 도 4C는 본 개시의 일부 실시양태에 따른 상이한 기능성 요소를 포함하는 링커 유닛을 도시한 개략도이다.
도 5A 및 도 5C는 본 개시의 일부 실시양태에 따른 분자 구조물을 예시하는 개략도이다.
도 6은 본 개시의 일부 실시양태에 따른 분자 구조물을 예시하는 개략도이다.
도 7은 본 개시의 다양한 실시양태에 따른 3개의 링커 유닛을 포함하는 분자 구조물을 예시하는 개략도이다.
도 8A 및 8B는 본 개시의 실시예 1에 따른 노르보넨-개질된 펩티드 4의 HPLC 및 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 9A 및 9B는 본 개시의 실시예 2에 따른 아지드-개질된 펩티드 5의 HPLC 및 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 10A 및 10B는 본 개시의 실시예 3에 따른 DBCO-변형된 펩티드 7의 HPLC 및 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 11A 및 11B는 각각 본 개시의 실시예 3에 따른 알킨-변형된 펩티드 9 및 아지도-변형된 펩티드 10의 분석 결과를 나타낸다.
도 12A 및 12B는 각각 본 개시의 실시예 5 및 6에 따른 CCK8 함유 펩티드 및 CC8 함유 연결 팔의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석의 결과를 나타낸다.
도 13A 및 13B는 본 개시의 실시예 8에 따른 특정 코어 및 연결 팔을 포함하는 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 본 개시의 실시예 9에 따른 특정 코어 및 연결 팔을 포함하는 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석의 결과를 나타낸다.
도 15는 본 개시의 실시예 10에 따른 특정 코어 및 연결 팔을 포함하는 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석의 결과를 나타낸다.
도 16은 본 개시의 실시예 12에 따른 말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 알킨 함유 링커 유닛의 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 17은 본 발명의 실시예 12에 따른 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 본 개시의 실시예 14에 따른 5개의 세포 독성 약물을 포함하는 링커 유닛의 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 19는 본 개시의 실시예 15에 따른 5개의 세포 독성 약물을 포함하는 링커 유닛의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
도 20은 본 개시의 실시예 15에 따른 5개의 세포 독성 약물을 포함하는 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 21은 본 개시의 실시예 16에 따른 표적화 요소로서 CCK8을 포함하는 링커 유닛의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
도 22는 본 개시의 실시예 16에 따른 표적화 요소로서 CCK8을 포함하는 링커 유닛의 질량 분석 ESI-TOF 분석의 결과를 나타낸다.
도 23A 내지 도 23C는 본 개시의 실시예 17 내지 19에 따른 특이적 scFv의 순도 및 T 세포에 대한 이의 결합 친화도를 각각 보여준다.
도 24는 본 개시의 실시예 20에 따른 DBCO-접합 항-CD3 scFv의 유세포 분석의 분석 데이터이다.
도 25는 본 개시의 실시예 22에 따른 연결 유닛 및 분자 구조물의 질량 분석법 결과를 나타낸다.
도 26A 및 26B는 본 개시의 실시예 23에 따른 링커 유닛의 질량 분석법 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 27은 본 개시의 실시예 25에 따른 종양 세포에 대한 5개의 세포 독성 약물을 포함하는 링커 유닛의 세포 독성 효과의 결과를 나타낸다.
일반적인 관례에 따라, 다양한 설명된 특징/요소는 비율대로 도시된 것이 아니라 본 발명과 관련된 특정 특징/요소를 가장 잘 설명하기 위해 도시된 것이다. 또한, 다양한 도면에서의 유사한 참조 번호 및 명칭은 유사한 요소/부분을 나타내기 위해 사용된다.
설명
첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도된 것이며 본 실시예가 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내도록 의도된 것은 아니다. 본 설명은 실시예의 기능과 실시예를 구성하고 동작시키기 위한 단계들의 과정을 설명한다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서가 다른 실시예로 달성될 수도 있다.
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모아놓았다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하고 사용하는 의미를 가질 것이다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 동일한 의미의 복수 형태를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 구체적으로, 본원 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 또한, 본원 및 청구범위에 사용된 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며, 1, 2, 3 또는 그 이상을 포함한다. 유사하게, 용어 "적어도 2"는 2, 3, 4 또는 그 이상을 포함한다. 또한, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 어구 "A, B 및 C 중 적어도 하나", "A, B 또는 C 중 적어도 하나" 및 "A, B 및/또는 C 중 적어도 하나"는 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, B 및 C 함께, A 및 C 함께 뿐만 아니라 A, B 및 C를 함께 포함하도록 의도된다.
본 발명의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 특정 실시양태에서 제시된 수치는 가능한 정확하게 보고되었다. 그러나, 임의의 수치값은 필히 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차에 기인하는 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자에 의해 고려될 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 내를 의미한다. 작동/작업 실시예에서를 제외하고, 또는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 물질의 양, 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 필요에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 각각의 수치 파라미터는 보고된 유효 자릿수의 수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본원에서 범위는 하나의 종점에서 다른 종점까지, 또는 두 종점 사이로 표현될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 모든 범위는 종점을 포함한다.
본 개시는 일반적으로 분자 구조물에 관한 것으로, 각 분자 구조물은 표적화 요소 (T) 및 이펙터 요소 (E)를 포함하고, 이들 분자 구조물은 때때로 "TE-분자", "TE-약제" 또는 "TE-약물"로 지칭되기도 한다.
본원에 사용된 용어 "표적화 요소"는 관심 표적 (예를 들어, 세포 표면상의 수용체 또는 조직 내 단백질)에 직접 또는 간접적으로 결합하여 본 분자 구조물의 관심있는 표적 내로의 수송을 용이하게 하는 분자 구조물의 일부를 지칭한다. 일부 예에서, 표적화 요소는 분자 구조물을 표적 세포에 근접하게 향하도록 할 수 있다. 다른 경우에, 표적화 요소는 표적 세포 표면 상에 존재하는 분자 또는 세포 표면 상에 존재하는 분자에 특이적으로 결합하는 제2 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 표적화 요소는 관심있는 표적에 결합되면 본 분자 구조물과 함께 내재화될 수 있으며, 따라서 표적 세포의 시토졸로 이동된다. 표적화 요소는 세포 표면 수용체에 대한 항체 또는 리간드일 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 리간드에 결합하여 본 분자 구조물을 표적 부위 (예를 들어, 선택된 세포의 표면)에 간접적으로 표적화하는 분자일 수 있다. 질환 부위에서 이펙터 (치료제)의 국소화는 표적화 기능이 없는 치료제와 비교하여 본 분자 구조물로 향상되거나 선호될 것이다. 국소화는 정도 또는 상대적인 비율의 문제이다; 이펙터가 질환 부위에 절대적이거나 완전히 국소화되는 것은 아니라는 것이다.
본 발명에 따라, 용어 "이펙터 요소"는 일단 분자 구조물이 이의 표적 부위로 지정되면 생물학적 활성 (예를 들어, 면역 활성을 유도 또는 억제하거나, 세포 독성 효과를 발휘하거나, 효소를 억제하는 등) 또는 기타 기능적 활성 (예를 들어, 면역 세포 또는 다른 치료 분자 동원)을 유발하는 분자 구조물의 일부를 지칭한다. "효과"는 치료적 또는 진단적일 수 있다. 이펙터 요소는 세포 및/또는 세포 외 면역조절 인자에 결합하는 것을 포함한다. 이펙터 요소는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 글리코펩티드, 약물 모이어티 (소분자 약물 및 생물 제제 둘 다), 화합물, 요소 및 동위 요소, 및 이들의 단편과 같은 작용제를 포함한다.
본원에서 제1, 제2, 제3 등의 용어가 다양한 요소, 구성 요소, 영역 및/또는 섹션을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이들 요소 (및 구성 요소, 영역 및/또는 섹션)는 이들 용어로 제한되지 않는다. 또한, 그러한 서수의 사용은 문맥상 명확하게 표시되지 않는 한 과정이나 순서를 의미하지는 않는다. 오히려, 이 용어들은 단순히 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해 사용된다. 따라서, 이하에서 논의되는 제1 요소는 예시적인 실시예의 교시를 벗어나지 않으면서 제2 구성 요소로 지칭될 수 있다.
여기서, 용어 "링크", "커플링" 및 "접합"은 두 구성 요소 사이의 직접 연결 또는 간접 연결을 통해 두 구성 요소를 연결하는 임의의 수단을 상호호환적으로 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 갖는 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 길이가 2 내지 약 200 잔기; 바람직하게는 2 내지 50 잔기 범위의 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에서 아미노산 서열이 제공되는 경우, 서열의 L-, D- 또는 베타 아미노산 버전이 또한 고려된다. 폴리펩티드는 또한 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 상기 용어는 펩티드 결합 또는 다른 "변형된 결합"에 의해 연결된 아미노산에 적용되며, 예를 들어 여기서 펩티드 결합은 α-에스테르, β-에스테르, 티오아미드, 포스포르아미드, 카보메이트, 하이드록실레이트 등으로 대체된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 서열을 포함하는 아미노산의 보존적 치환이 고려된다. 다양한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 잔기가 치환된다. 용어 "보존적 치환"은 분자의 활성 (예를 들어, 생물학적 또는 기능적 활성 및/또는 특이성)을 실질적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환을 반영하기 위해 사용된다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 특정 보존적 치환은 표준 아미노산이 모 잔기와 최소로 상이한 비표준 (예를 들어, 희귀, 합성 등) 아미노산으로 대체되는 "유사 치환"을 포함한다. 아미노산 유사체는 모체의 구조에 대한 충분한 변화없이 표준 아미노산으로부터 합성적으로 유도되거나, 이성체이거나, 대사물 전구체인 것으로 간주된다. 본 출원에서는 아미노산 잔기로서, (1) 측쇄에 아민기를 함유하는 라이신, (2) 측쇄에 티올기를 함유하는 시스테인, (3) 측쇄에 하이드록실기를 함유하는 세린 및 트레오닌, 및 (4) 측쇄에 카복실기를 함유하는 아스파르트산 및 글루탐산이 4개의 상이한 아미노산기로 간주된다. 이들 4개의 아미노산기는 각각 측쇄에 다양한 화학 성분과의 접합에 적용될 수 있는 특유의 화학기를 함유한다. 측쇄에 동일한 작용기를 함유하는 비천연 아미노산이 유사한 목적으로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 또는 98%의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드가 또한 고려된다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율 (%) 아미노산 서열 동일성"은 필요에 따라 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열 정렬 및 갭 도입 후, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않은 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 폴리펩티드 잔기의 백분율로 정의된다. 백분율 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업자에 의해 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 비교는 NBI (National Center for Biotechnology Information)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp (단백질-단백질 BLAST)에 의해 수행되었다. 주어진 폴리펩티드 서열 A 대 주어진 폴리펩티드 서열 B의 아미노산 서열 동일성 백분율 (선택적으로, 주어진 폴리펩티드 서열 B에 대해 특정% 아미노산 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩티드 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같은 공식으로 계산될 수 있다:
Figure pct00001
식중, X는 프로그램의 A 및 B 정렬에서 서열 정렬 프로그램 BLAST에 의해 동일한 일치로 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 A 또는 B에서 더 짧은 아미노산 잔기의 총 수이다.
본원에 사용된 용어 "페길화된 아미노산"은 하나의 아미노기 및 하나의 카복실기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄를 지칭한다. 일반적으로, 페길화된 아미노산은 NH2-(CH2CH2O)n-CO2H의 화학식을 갖는다. 본 개시에서, n의 값은 1 내지 20의 범위이고; 바람직하게는 2 내지 12의 범위이다.
본원에 사용된 용어 "접합 모이어티"는 화학적으로 반응성이고 다른 화학 유닛에 공유 결합할 수 있는 하나 이상의 작용기를 갖는 분자를 지칭한다. 작용기의 비제한적 예는 하이드록실, 카보닐, 카복실, 티올, 아민, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS), N-하이드록시숙신이미딜 (NHS), 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 메틸술포닐 벤조티아졸, 요오도, 요오도아세트아미드 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴기를 포함한다. 본 개시의 실시양태에 따라, 본 링커 유닛의 접합 모이어티는 2개의 작용기를 가지며, 그 중 하나는 그들 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서의 알파-아민 또는 카복실기와 결합하기 위한 카복실 또는 아민기이고, 따라서 접합 모이어티는 스페이서의 N- 또는 C-말단에 결합되고; 다른 하나는 CuAAC, iEDDA 또는 SPAAC 반응을 통해 요소 또는 다른 링커 유닛과 결합하기 위한 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기이다.
본원에 사용된 폴리펩티드에 대한 용어 "말단"은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서의 아미노산 잔기를 지칭한다. 중합체와 관련하여, 용어 "말단"은 중합체 골격의 말단에 위치된 중합체의 구성 유닛 (예를 들어, 본 개시의 폴리에틸렌 글리콜)를 지칭한다. 본 명세서 및 청구범위에서, 용어 "자유 말단"은 말단 아미노산 잔기 또는 구성 유닛이 임의의 다른 분자에 화학적으로 결합되지 않음을 의미하기 위해 사용된다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 상호호환적으로 사용되며 면역 반응을 유도하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 분비, 체액 및/또는 세포 항원 특이적 반응을 포함할 수 있다. 본 개시에서, 용어 "항원"은 단백질, 폴리펩티드 (돌연변이체 또는 이의 생물학적 활성 단편 포함), 다당류, 당단백질, 당지질, 핵산 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 항원-결합 단편 (Fab/Fab'), F(ab')2 단편 (디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 항원-결합 Fab 부분을 가짐), 가변 단편 (Fv), 단일쇄 가변 단편 (scFv), 이중 특이적 단일쇄 가변 단편 (bi-scFv), 나노바디 (또한 단일 도메인 항체, sdAb라고도 함), 유니바디 및 디아바디와 같은 항원과 결합하는 완전 조립된 항체, 항체 단편을 포함한다. "항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 전형적으로, "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 지칭한다. 잘 알려진 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이는 차례로 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 각각 정의한다. 전형적인 면역글로불린 (항체) 구조 유닛은 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경" 쇄 (약 25 kDa) 및 하나의 "중" 쇄 (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)라는 용어는 이들 경쇄 및 중쇄를 각각 지칭한다. 본 개시의 실시양태에 따라, 항체 단편은 천연 항체를 변형시키거나 또는 재조합 DNA 방법론을 사용한 데노보 합성에 의해 생성될 수 있다. 본 개시의 특정 실시양태에서, 항체 및/또는 항체 단편은 이중 특이적일 수 있고, 다양한 구성으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위 (가변 영역)를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이중 특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 항체 단편을 사용하는 많은 분자 구성에서, 항체 단편은 항체 단편과 동일한 항원 성분에 결합하는 항체 모방체로 대체될 수 있다. 항체 모방체는 안티칼린, DARPin, 아피바디, 필로머, 안키린, 아비머 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 1×106 M, 1×10-7 M, 1×10-8 M, 1×10-9 M, 1×10-10 M, 1×10-11 M, 1×10-12 M 이하의 해리 상수 (Kd)로 항원에 결합하고/거나, 비특이적 항원에 대한 친화력보다 적어도 2배 큰 친화력으로 항원에 결합하는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 방지 (예를 들어, 예방), 치유 또는 완화적 치료를 포함하고; 본원에 사용된 ""은 또한 방지 (예를 들어, 예방), 치유 또는 완화적 치료를 포함한다. 특히, 본원에 사용된 용어 "치료하는 것"은 의학적 상태를 가지거나 의학적 상태와 관련된 증상, 의학적 상태에 이차적인 질환 또는 장애, 또는 의학적 상태에 대한 소인을 가지는 대상체에게 상기 특정 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전히 경감, 개선, 완화, 발병 지연, 진행 억제, 중증도 감소 및/또는 발생률을 감소시킬 목적으로 본 분자 구조물 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 포함하는, 본 분자 구조물 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다. 치료제는 질환, 장애 및/또는 상태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 상태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 병태의 발생 위험을 낮출 목적으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 치료 반응을 산출하기에 충분한 본 분자 구조물의 양을 지칭한다. 유효량의 약제는 질환 또는 상태를 치유하는데 필요하지 않지만, 질환 또는 상태의 발병이 지연, 방해 또는 예방되거나 질환 또는 상태 증상이 개선되도록 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공할 것이다. 유효량은 지정된 기간 동안 1회, 2회 또는 그 이상 투여되도록 적합한 형태로 1, 2 또는 그 이상의 용량으로 분할될 수 있다. 특정 유효량 또는 충분량은 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태 (예를 들어, 환자의 체질량, 연령 또는 성별), 치료되는 대상체의 타입, 치료 기간, 동시 요법의 특성 (존재하는 경우), 사용된 특정 제형 및 화합물 또는 그 유도체의 구조와 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 유효량은 예를 들어 활성 성분의 총 질량 (예를 들어, 그램, 밀리그램 또는 마이크로그램) 또는 활성 성분의 질량 대 체질량의 비율, 예를 들어 킬로그램 당 밀리그램 (mg/kg)으로 표현될 수 있다.
용어 "적용" 및 "투여"는 치료가 필요한 대상체에 대한 본 발명의 분자 구조물 또는 약학 조성물의 적용을 의미하도록 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호호환적으로 사용되며 본 발명의 분자 구조물, 약학 조성물 및/또는 방법에 의해 치료될 수 있는 인간 종을 포함하는 동물을 의미하는 것으로 의도된다. "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 하나의 성별이 구체적으로 지시되지 않는 한 남성 및 여성 성별을 모두 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 개시의 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. "대상체" 또는 "환자"의 예는 인간, 랫트, 마우스, 기니피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 조류 및 가금류를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 실시양태에서, 환자는 인간이다. "포유동물"이라는 용어는 인간, 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 토끼, 돼지, 양 및 소; 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 마우스 및 랫트와 같은 설치류를 포함하는 포유동물류의 모든 구성원들을 지칭한다. "비인간 포유동물"이라는 용어는 인간을 제외한 포유동물류의 모든 구성원들을 지칭한다.
본 개시는 적어도 혈액 순환, 림프계 및 기타 세포, 조직 또는 기관에 비해 증가된 비율로 표적 세포, 표적 조직 또는 기관에 전달될 수 있는 T-E 약제의 구축에 기초한다. 이것이 달성되면, 약제의 치료 효과는 증가하는 반면, 부작용 및 독성의 범위 및 심각성은 감소된다. 치료 이펙터는 표적화 성분이 없는 형태보다 T-E 분자 형태로 더 낮은 투여량으로 투여될 수 있다. 따라서, 치료 이펙터는 부작용 및 독성을 낮추면서 효능을 잃지 않고 더 적은 용량으로 투여될 수 있다.
파트 I 멀티-암 링커의 신규 설계
I-(i) 새로운 형태의 멀티-암 링커
본 개시의 제1 측면은 (1) 복수의 연결 아미노산 잔기를 포함하는 코어 및 (2) 코어의 연결 아미노산 잔기에 각각 연결된 복수의 연결 팔을 포함하는 멀티-암 링커 유닛에 관한 것이다. 본 코어는 1 또는 2개의 접합 모이어티가 이의 N- 또는/및 C-말단에 결합된 것을 특징으로 한다. 본 개시의 실시양태에 따라, 접합 모이어티는 기능성 요소 (예를 들어, 표적화 요소, 치료 이펙터 요소, 또는 약동학을 개선하기 위한 요소)를 코어에 효과적으로 커플링함으로써 본 링커 유닛의 치료 효과를 향상시키는 데 유용하다.
코어는 길이가 3 내지 120개의 아미노산 잔기를 갖고 독립적으로 라이신 (K), 아스파르트산 (D) 및/또는 글루탐산 (E) 잔기인 적어도 2개의 연결 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드이다; 예를 들어, 본 코어는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 K, D 및/또는 E 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 코어는 2 내지 20개의 K 잔기, 또는 2 내지 20개의 D 및/또는 E 잔기를 포함한다. 이해할 수 있는 바와 같이, 연결 아미노산 잔기는 측쇄에 아민 또는 카복실기를 갖는 비천연 아미노산 잔기일 수 있다. 실시양태에 따라, 연결 아미노산 잔기 중 임의의 2개는 서로 인접하거나 스페이서에 의해 분리될 수 있다.
본 개시의 실시양태에 따라, 펩티드 코어는 적어도 하나 (즉, 1, 2, 3 이상)의 스페이서를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나의 스페이서는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 첫 번째 연결 아미노산 잔기의 N-말단에 연결되고; 이하의 설명에서, 이러한 스페이서는 적절한 경우 코어의 N-말단에 배치되기 때문에 N-말단 스페이서로 지정된다. 추가로 또는 대안적으로, 하나의 스페이서는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 마지막 연결 아미노산 잔기의 C-말단에 연결되고; 유사하게, 이러한 스페이서는 코어의 C-말단에 배치되기 때문에 이하에서 때때로 C-말단 스페이서로 지칭되기도 한다.
일반적으로, 상기 언급된 스페이서는 (1) 연결 아미노산 잔기 이외의 단일 아미노산 잔기, (2) 연결 아미노산 잔기 이외에 2-20 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)개의 아미노산 잔기의 펩티드, 또는 (3) EG 유닛이 2 내지 12인 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 EG 유닛을 갖는) 페길화된 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 본 코어가 복수의 K 잔기를 포함하는 경우, 스페이서는 2-12 EG 유닛을 갖는 페길화된 아미노산을 포함하거나, 1-12 비-K 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비-K 아미노산 잔기는 각각 글리신 (G), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 세린 (S), 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 프롤린 (P), 알라닌 (A), 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 및 트립토판 (W) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 각각의 비-K 아미노산 잔기는 각각 G, S, R, H, T, N, Q, P, A, V, I, L, M, F, Y, W 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, 각각의 비-K 아미노산 잔기는 각각 G 및/또는 S 잔기이다. 대안적으로, 본 코어가 복수의 D/E 잔기를 포함하는 경우, 스페이서는 2-12 EG 유닛을 갖는 페길화된 아미노산을 포함하거나, 1-12 비-D/E 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비-D/E 아미노산 잔기는 각각 K, G, S, R, H, T, N, Q, P, A, V, I, L, M, F, Y 및 W 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 각각의 비-D/E 아미노산 잔기는 각각 G, S, R, H, T, N, Q, P, A, V, I, L, M, F, Y 및 W 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, 각각의 비-D/E 아미노산 잔기는 각각 G 및/또는 S 잔기이다.
이해할 수 있는 바와 같이, 본 코어가 복수의 스페이서를 포함하는 경우, 각각의 스페이서는 동일하거나 상이할 수 있고; 즉, 각각의 스페이서는 동일한 상이한 아미노산 서열 및/또는 EG 유닛을 포함할 수 있다. 본 개시의 일 실시양태에 따라, 본 코어는 3개의 스페이서를 포함하고, 여기서 스페이서 중 하나는 8 반복 EG 유닛을 갖는 페길화된 아미노산이고, 다른 2개의 스페이서는 각각 하나의 S 잔기 및 하나의 G 잔기이다. 본 발명의 다른 실시양태에 따라, 본 코어는 5개의 스페이서를 포함하고, 여기서 스페이서 중 하나는 4개의 G 및 2개의 S 잔기로 구성되고, 다른 4개의 스페이서는 각각 1개의 G 및 1개의 S 잔기로 이루어진다. 본 개시의 또 다른 실시양태에 따라, 본 코어는 5개의 스페이서를 포함하고, 이들은 각각 4 반복 EG 유닛을 갖는 페길화된 아미노산이다.
본 링커 유닛의 제조에서, 아민-반응성 기 (예를 들어, 숙신이미딜 에스테르, TFP 에스테르 또는 카복실기) 또는 카복실-반응성 기 (예를 들어, 아민기)를 갖는 펩티드 또는 PEG 쇄는 본 코어의 연결 아미노산 잔기 (즉, K, D 및/또는 E 잔기)에 연결된다. 보다 구체적으로, 하나의 말단에 아민-반응성 기를 갖고 다른 말단에 작용기를 갖는 펩티드 또는 PEG 쇄는 펩티드/PEG 쇄의 아민-반응성 기와 K 잔기의 아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 본 코어의 K 잔기에 연결될 수 있다. 숙신이미딜 에스테르는 NHS 에스테르일 수 있다. 대안적으로, 하나의 말단에 카복실 반응성 기를 갖고 다른 말단에 작용기를 갖는 펩티드 또는 PEG 쇄는 펩티드 또는 PEG 쇄의 아민기와 D 또는 E 잔기의 카복실기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 본 코어의 D 또는 E 잔기의 카복실기에 연결될 수 있다. 본 개시에서, 연결 아미노산 잔기에 연결된 펩티드 또는 PEG 쇄는 그의 자유 말단 (즉, 코어의 연결 아미노산 잔기에 연결되지 않은 말단)에 작용기를 가지는 연결 팔로 지칭된다. 일반적으로, 상기 작용기는 아민, 카복실, 하이드록실, TBDMS, NHS, 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 메틸술포닐 벤조티아졸, 요오도, 요오도아세트아미드, 아지드, 알킨, 사이클로옥틴, 테트라진 및 사이클로옥텐기로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 테트라진기는 1,2,3,4-테트라진, 1,2,3,5-테트라진, 1,2,4,5-테트라진 또는 이의 유도체이고; 사이클로옥텐기는 노르보넨 또는 트랜스-사이클로옥텐 (TCO)기이고; 사이클로옥틴기는 디벤조사이클로옥틴 (DIBO), 이불소화 사이클로옥틴 (DIFO), 비사이클로노닌 (BCN) 및 디벤조아자사이클로옥틴 (DIBAC 또는 DBCO)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 개시의 일 실시양태에 따라, 테트라진기는 6-메틸-테트라진이다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 연결 팔은 연결 아미노산 잔기 외에 2-12 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12) 아미노산 잔기 (각각 천연 또는 비천연 아미노산 잔기일 수 있음)를 포함하는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 본 코어는 복수의 K 잔기를 포함하고, 연결 팔은 2-12개의 비-K 아미노산 잔기 (즉, G, E, D, S, R, H, T, N, Q, P, A, V, I, L, M, F, Y, 및 W 잔기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 잔기)를 포함하는 펩티드이다. 일 실시예에 따라, 본 코어는 복수의 K 잔기를 포함하고, 연결 팔은 G, S, E 및 R 잔기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5-10개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이다. 대안적으로, 연결 팔은 2-24 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24) 반복 EG 유닛; 바람직하게는, 5-15 반복 EG 유닛; 더욱 바람직하게는, 6-12 반복 EG 유닛을 갖는 PEG 쇄일 수 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 연결 팔의 펩티드 또는 PEG 쇄는 거의 동일한 길이의 중합체로 치환될 수 있다. 탄수화물 또는 다른 친수성 빌딩 블록을 포함하는 중합체가 연결 팔로서 사용하기에 적합하다.
본 개시의 실시양태에 따라, 적어도 하나의 접합 모이어티는 N-말단 스페이서의 알파-아민기에 결합되고/되거나, C-말단 스페이서의 카복실기에 결합된다. 아미노산 잔기는 아민 및 카복실레이트기를 둘 다 갖기 때문에 접합 모이어티는 아미노산 잔기일 수 없으며; 두 기는 펩티드 코어와 펩티드 결합을 형성하는데 서로 간섭한다.
구체적으로, 본 링커 유닛의 접합 모이어티는 하나의 말단에 아민-반응성 기 (예를 들어, 카복실 또는 카보닐 클로라이드기) 또는 카복실-반응성 기 (예를 들어, 아민 또는 히드라진기)를, 다른 말단에 접합기를 가지며, 여기서 접합기는 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴기로 이루어진 군으로부터 선택된다 (이의 예시적인 예는 상기 참조). 본 개시의 일부 실시양태에 따라, 스페이서 중 하나는 N-말단 스페이서이고; 이들 실시양태에서, 접합 모이어티는 카복실기를 가지며, 따라서 접합 모이어티의 카복실기와 N-말단 스페이서의 알파-아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 N-말단 스페이서의 알파-아민기에 결합될 수 있다. 본 개시의 특정 실시양태에 따라, 스페이서 중 하나는 C-말단 스페이서이고; 이들 실시양태에서, 접합 모이어티는 아민기를 가지므로, 접합 모이어티의 아민기와 C-말단 스페이서의 카복실기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 C-말단 스페이서의 카복실기에 결합될 수 있다. 코어가 N-말단 스페이서 및 C-말단 스페이서를 모두 포함하는 경우에서와 같이, 코어는 또한 2개의 접합 모이어티를 가지며, 여기서 하나의 접합 모이어티는 N-말단 스페이서의 알파-아민기에 결합되는 반면 다른 접합 모이어티는 C-말단 스페이서의 카복실기에 결합된다. 따라서 코어에 결합된 접합 모이어티는 그의 자유-말단 (즉, 코어에 연결되지 않은 말단)에 접합기를 갖는다.
임의로, 접합 모이어티는 카복실 또는 아민기와 접합기 사이에 배치된 2-10 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 반복 EG 유닛을 갖는 PEG 쇄를 추가로 포함하며; 예를 들어, PEG 쇄는 4, 6, 7 또는 8 반복 EG 유닛을 가질 수 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 코어가 그에 결합된 2개의 접합 모이어티를 가지는 경우, 그 접합기는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 2개의 접합기는 상이하다. 바람직한 실시예에 따르면, 하나의 접합기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이고, 다른 접합기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이다.
바람직하게는, 접합 모이어티의 접합기가 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기인 경우, 연결 팔의 작용기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이고; 접합 모이어티의 접합기가 테트라진 또는 사이클로옥텐기인 경우, 연결 팔의 작용기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이다. 링커 유닛이 N- 및 C-말단 스페이서에 각각 연결된 2개의 접합 모이어티를 포함하는 상태에서, 연결 팔의 작용기는 바람직하게는 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 요오도 또는 요오도아세트아미드기이고; 2개의 접합 부분 중 하나의 접합기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이고; 다른 접합 모이어티의 접합기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이다.
이하에서는 각각의 코어 10a, 10b, 10c, 10d 및 10e가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는 도 1A 내지 도 1E를 참조한다. 도 1A 내지 1D에서, 테트라진기, TCO기 및 아지드기 및 알킨기를 각각 갖는 접합 모이어티는 코어 10a, 10b 10c 및 10d의 N-말단 스페이서의 알파-아민기에 결합된다. 도 1E는 보호기로서 작용하는 아세틸기가 펩티드 코어 10e 스페이서의 알파-아민기와 결합되는 반면, (접합기로서) DBCO기를 갖는 접합 모이어티가 코어 10e의 C-말단 스페이서의 카복실기와 결합된 대안적인 예를 제공한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 코어는 2개의 접합기를 포함한다. 도 1F는 테트라진기 및 DBCO기를 각각 갖는 접합 모이어티가 펩티드 코어 10f의 N-말단 스페이서의 알파-아민기 및 C-말단 스페이서의 카복실기에 결합된 이러한 예를 예시한다. 도 1G는 각각 TCO 기 및 DBCO기를 갖는 접합 부분이 펩티드 코어 10g의 N-말단 스페이서의 알파-아민기 및 C-말단 스페이서의 카복실기에 결합된 다른 예를 제공한다. 대안적인 예에서, 펩티드 코어 10h의 N-말단 스페이서의 알파-아민기와 C-말단 스페이서의 카복실기는 각각 알킨기를 갖는 접합 모이어티 및 DBCO기를 갖는 접합 모이어티와 결합된다.
반응식 1 내지 3은 1 또는 2개의 특정 접합 모이어티가 결합된 코어를 합성하는 예를 제공한다.
<<반응식 1: N 말단에 결합된 테트라진 또는 TCO 기를 갖는 코어의 제조>>
Figure pct00002
<<반응식 2: C-말단에 DBCO 기가 결합된 코어의 생성>>
Figure pct00003
<<반응식 3: N- 및 C-말단에 각각 결합된 2개의 접합 모이어티를 갖는 코어의 생성>>
Figure pct00004
스페이서로서 페길화된 아미노산을 사용하는 펩티드 코어의 합성은 G 및 S 잔기와 같은 규칙적인 아미노산이 존재하는 것보다 적은 단계를 포함한다. 또한, 다양한 길이 (즉, 반복된 에틸렌 글리콜 유닛의 수)를 갖는 페길화된 아미노산이 사용될 수 있으며, K 잔기의 인접한 아미노기 사이의 용해성 및 간격에 대한 유연성을 제공한다. 페길화된 아미노산 이외에, 코어는 또한 인공 아미노산, 예컨대 D-형 아미노산, 호모-아미노산, N-메틸 아미노산 등을 포함하도록 구성될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 분자에 함유된 PEG 잔기는 형태적 가요성 및 접합기 사이에 적절한 간격을 제공하고, 수용성을 향상시키며, 일반적으로 약한 면역원성이기 때문에, 다양한 길이의 PEG를 가지는 페길화된 아미노산이 PEG는 코어를 작제하는데 사용된다. 페길화된 아미노산-함유 코어의 합성은 규칙적인 폴리펩티드의 합성 방법과 유사하다.
안정성을 목적으로, 코어의 N-말단이 접합 모이어티와 결합되지 않은 경우, 이는 바람직하게는 아세틸기와 결합된다.
이해할 수 있는 바와 같이, 코어에 연결된 연결 팔의 수는 주로 코어에 포함된 연결 아미노산 잔기 (즉, K, D 및/또는 E 잔기)의 수에 의해 결정된다. 본 코어에는 적어도 2개의 연결 아미노산 잔기가 포함되어 있기 때문에, 본 링커 유닛은 복수의 연결 팔을 포함할 수 있다.
이제 도 2A를 참조한다. 도시된 바와 같이, 링커 유닛 (20A)은 2개의 인접한 K 잔기를 포함하는 코어, 및 첫 번째 K 잔기의 N-말단에 연결된 스페이서 (210) (즉, "N-말단 스페이서")를 포함한다. 카복실기 (230) 및 사이클로옥텐기 (240)를 갖는 접합 모이어티는 접합 모이어티의 카복실기 (230)와 스페이서 (210)의 알파-아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서 (210)의 알파-아민기에 결합된다. 이 예에서, 2개의 연결 팔 (220a, 220b)은 K 잔기에 독립적으로 연결된다. 후술하는 바와 같이, 연결 팔의 자유 말단 (즉, K 잔기에 연결되지 않은 말단)은 기능성 요소와의 접합에 유용하며, 코어의 N-말단에 배치된 사이클로옥텐기 (240)는 추가적인 기능성 요소 또는 다른 링커 유닛과의 접합을 허용한다.
도 2B는 본 링커 유닛의 대안적인 예를 제공한다. 도 2B에서, 링커 유닛 (20B)은 4개의 K 잔기 및 4개의 K 잔기에 각각 연결된 4개의 연결 팔 (220a-220d)을 포함한다. 제1 및 제2 K 잔기는 그들 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 연결되고, 제2, 제3 및 제4 K 잔기는 스페이서 (210b 또는 201c)에 의해 서로 분리된다. 카복실기 (230) 및 아지드 기 (250)를 갖는 접합 모이어티는 접합 모이어티의 카복실기 (230)와 N-말단 스페이서 (210a)의 알파-아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 N-말단 스페이서 (210a)에 결합된다. 전술한 바와 같이, 스페이서 (210a-210c)는 동일하거나 상이한 아미노산 서열 및/또는 EG 유닛을 포함할 수 있다.
도 2C는 스페이서 (210b-210e)에 의해 각각 분리된 5개의 K 잔기 및 5개의 K 잔기에 각각 연결된 5개의 연결 팔 (220a-220e)을 포함하는 링커 유닛 (20C)에 관한 것이다. 또한, N- 및 C-말단 스페이서로서 기능하는 스페이서 (210a, 210f)는 각각 첫 번째 K 잔기의 N-말단 및 마지막 K 잔기의 C-말단에 연결된다. 이 예에서, 카복실기 (230) 및 알킨기 (260)를 갖는 접합 모이어티는 접합 모이어티의 카복실기 (230)와 스페이서 (210a)의 알파-아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서 (210a)에 결합된다.
이제 링커 유닛 (20D)이 접합 모이어티가 코어의 N-말단이 아닌 코어의 C-말단에 결합되는 것을 제외하고는 링커 유닛 (20A-20C)과 유사한 구조를 갖는 도 2D를 참조한다. 도 2D에 도시된 바와 같이, 아민기 (235) 및 사이클로옥틴 (270)을 갖는 접합 모이어티는 접합 모이어티의 아민기 (235)와 C-말단 스페이서 (210c)의 카복실기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 C-말단 스페이서 (210c)에 결합된다.
도 2E는 링커 유닛 (20E)이 4개의 스페이서 (210a-210d)를 포함하는 대안적인 예를 제공한다. 이 예에서, N- 및 C-말단 스페이서로서 제공되는 스페이서 (210a 및 210d)는 각각 첫 번째 K 잔기의 N-말단 및 마지막 K 잔기의 C-말단에 연결되고; 스페이서 (210b)는 제3 및 제4 K 잔기 사이에 배치되고; 스페이서 (210c)는 제5 및 제6 K 잔기 사이에 배치된다. 아민기 (235) 및 테트라진기 (280)를 갖는 접합 모이어티는 접합 모이어티의 아민기 (235)와 스페이서 (210d)의 카복실기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서 (210d)에 결합된다.
도 2F는 본 개시의 다른 실시양태에 따른 2개의 접합 모이어티를 포함하는 링커 유닛 (20F)을 제공한다. 본 코어는 7개의 K 잔기를 포함한다. N- 및 C-말단 스페이서로서 기능하는 2개의 스페이서 (210a, 210f)는 코어의 N-말단 및 C-말단에 각각 배치된다. 사이클로옥틴기 (270)를 갖는 접합 모이어티가 스페이서 (210a)의 알파-아민기에 결합되고, 사이클로옥텐기 (240)를 갖는 접합 모이어티가 스페이서 (210f)의 카복실기에 결합된다. 후술하는 바와 같이, 링커 유닛 (20F)은 연결 팔 (220a-220g), 사이클로옥틴기 (270) 및 사이클로옥텐기 (240)을 통해 각각 세 종류의 작용기와의 연결을 위한 캐리어로서 기능할 수 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 링커 유닛 (20A-20F) 또는 임의의 다른 후속 링커 유닛과 관련하여 위에서 논의된 특정 특징은 본원에 개시된 다른 링커 유닛에 공통적이고, 따라서 특정 실시양태의 내용과 상반되지 않는 한, 이들 특징 중 일부 또는 전부가 다음 실시예에도 적용될 수 있다. 그러나 간결성을 위해 이러한 공통 기능은 아래에서 명시적으로 반복되지 않을 수 있다.
연결 팔의 자유 말단에 존재하는 작용기 (즉, 아민, 카복실, 하이드록실, TBDMS, NHS, 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 메틸 술포닐 벤조티아졸, 요오도, 요오도아세트아미드, 아지드, 알킨, 사이클로옥틴, 테트라진 또는 사이클로옥텐기)에 따라, 기능성 요소가 다음 화학 반응 중 하나를 통해 연결 팔의 자유 말단에 연결될 수 있도록, 상응하는 작용기를 가지는 기능성 요소 (예를 들어, 표적화 요소, 치료 이펙터 요소 또는 약동학적 특성을 개선하기 위한 요소)를 설계하는 것이 가능하다:
(1) 그들 사이에 아미드 결합 형성: 이 경우, 연결 팔은 그의 자유 말단에 아민, 카복실 또는 NHS기를 갖고, 기능성 요소는 아민 또는 카복실기를 갖는다;
(2) 그들 사이에 에스테르 결합 형성: 이 경우, 연결 팔은 그의 자유 말단에 하이드록실 또는 TBDMS기를 갖고, 기능성 요소는 하이드록실-반응성 기 (예를 들어, 토실-O 기)를 갖는다;
(3) 티올-말레이미드 (또는 비닐 술폰) 반응: 이 경우, 연결 팔은 그의 자유 말단에 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰 또는 메틸 술포닐 벤조티아졸기를 갖고, 기능성 요소는 티올기를 갖는다;
(4) SN2 반응: 이 경우, 연결 팔은 그의 자유 말단에 요오도 또는 요오도아세트아미드기를 갖고, 기능성 요소는 티올기를 갖는다;
(5) 구리 (I)-촉매화 알킨-아지드 사이클로부가 반응 (CuAAC 반응): 기능성 요소 및 연결 팔의 자유 말단 중 하나는 아지드 또는 피콜릴 아지드기를 갖는 반면, 다른 하나는 알킨기를 가지며; CuAAC 반응은 반응식 4 및 5에 예시되어 있다;
(6) 역 전자 요구 딜스-알더 (iEDDA) 반응: 기능성 요소 및 연결 팔의 자유 말단 중 하나는 테트라진기를 갖고, 다른 하나는 사이클로옥텐기 (예: TCO 또는 노르보넨기)을 가지며; iEDDA 반응은 반응식 6 및 7에 예시되어 있다; 또는
(7) 변형 촉진된 아지드-알킨 클릭 화학 (SPAAC) 반응: 기능성 요소 및 연결 팔의 자유 말단 중 하나는 아지드기를 갖는 반면, 다른 하나는 사이클로옥틴기를 가지며; SPAAC 반응은 반응식 8에 예시되어 있다.
CuAAC 반응은 1,5 이치환된 1,2,3-트리아졸을 생성한다. 알킨과 아지드 사이의 반응은 매우 선택적이고 천연 생체 분자에는 알킨과 아지드기가 없다. 또한, 반응은 빠르고 pH에 민감하지 않다. 클릭 반응을 촉매화하기 위해 브롬화제1구리 또는 요오드화제1구리와 같은 구리 (I)를 사용하는 대신 반응 혼합물 중 동소에서 구리 (I)를 생성하기 위해 구리 (II)와 아스코르브산나트륨과 같은 환원제를 혼합하여 사용하는 것이 제안된다. 대안적으로, 제2 요소는 구리-무 함유 반응을 통해 본 코어의 N- 또는 C-말단에 연결될 수 있으며, 여기서 펜타메틸사이클로펜타디에닐 루테늄 클로라이드 착물은 아지드-알킨 사이클로부가를 촉매하기 위한 촉매로서 사용된다.
<<반응식 4: CuAAC 반응이 아지드와 알킨기 사이에서 일어남>>
Figure pct00005
<<반응식 5: CuAAC 반응이 피콜릴 아지드와 알킨기 사이에서 일어남>>
Figure pct00006
<<반응식 6: iEDDA 반응이 TCO와 테트라진기 사이에 일어남>>
Figure pct00007
<<반응식 7: iEDDA 반응이 노르보넨과 테트라진기 사이에 일어남>>
Figure pct00008
<<반응식 8: SPAAC 반응이 아지드와 DBCO기 사이에 일어남>>
Figure pct00009
설명을 위해, 연결 팔에 연결된 기능성 요소는 제1 요소로 지칭된다. 이해할 수 있는 바와 같이, 본 링커 유닛에 의해 보유되는 제1 요소의 수는 코어의 연결 아미노산 잔기 (즉, K, D 및/또는 E 잔기)의 수 (따라서, 연결 팔의 수)에 좌우된다. 따라서, 당업자는 예를 들어 원하는 표적화 또는 치료 효과를 달성하기 위해 필요에 따라 링커 유닛의 제1 요소의 수를 조정할 수 있다.
2개의 제1 요소를 갖는 링커 유닛 (30A)의 예가 도 3A에 도시되어 있다. 링커 유닛 (30A)은 2개의 제1 요소 (310a 및 310b)가 각각 연결 팔 (220a 및 220b)을 통해 코어의 K 잔기에 연결되는 것을 제외하고는 도 2A의 링커 유닛 (20A)과 유사한 구조를 갖는다. 도 3B는 링커 유닛 (30B)이 연결 팔 (220a-220e)을 통해 각각 연결된 5개의 제1 요소 (310a-310e)를 갖는 다른 예를 제공한다. 유사하게, 도 3C에서, 연결 팔 (310a-310c)은 3개의 제1 요소 (310a-310c)의 접합을 허용한다.
의도되거나 원하는 효과 (예를 들어, 치료 효과)를 증가시키기 위해, 본 링커 유닛은 제1 요소 외에 제2 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 요소는 표적화 요소 또는 이펙터 요소일 수 있다. 본 개시의 임의적인 실시양태에서, 제1 요소는 이펙터 요소이고, 제2 요소는 다른 이펙터 요소일 수 있으며, 이는 제1 요소와 독립적으로 부가적으로 또는 상승적으로 작용한다. 여전히 임의적으로, 제1 및 제2 요소는 상이한 특성을 나타내고; 예를 들어 제1 요소는 표적화 요소이고 제2 요소는 이펙터 요소이며 그 반대도 적용된다. 대안적으로, 제1 요소는 이펙터 요소이고, 제2 요소는 용해도, 클리어런스, 반감기 및 생체이용률과 같은 링커 유닛의 약동학적 특성을 개선할 수 있는 요소이다. 특정 제1 요소 및/또는 제2 요소의 선택은 본 링커 유닛 (또는 멀티-암 링커 유닛)이 사용되는 의도된 응용에 좌우된다. 이들 기능성 요소의 예는 본 명세서의 파트 I-(ii)에서 후술된다.
구조적으로, 제2 요소는 코어의 N- 또는 C-말단에 결합된 접합 모이어티의 접합기 (즉, 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기)에 연결된다. 제2 요소는 임의로 짧은 PEG 쇄 (바람직하게는 2-12 반복의 EG 유닛을 가짐)과 접합된 후 접합기에 연결될 수 있다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 코어의 접합기는 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기이고; 따라서, 아지드-반응성 기 (예를 들어, 알킨 또는 DBCO기), 알킨-반응성 기 (예를 들어, 아지드기), 테트라진-반응성 기 (예를 들어, 노르보넨 또는 TCO기), 사이클로옥텐 반응성 기 (예를 들어, 테트라진기) 또는 사이클로옥틴 반응성 기 (예를 들어, 아지드기)를 가지는 제2 요소가 CuAAC 반응, iEDDA 반응 또는 SPAAC 반응과 같이 적합한 클릭 화학 반응을 통해 코어의 접합기에 연결될 수 있다.
이제 도 4A를 참조한다. 이후에 논의된 특징 외에, 도 4A는 도 2A와 매우 유사하다. 먼저, 링커 유닛 (40A)은 연결 팔 (220a 및 220b)에 각각 연결된 2개의 제1 요소 (410a 및 410b)를 갖는다. 둘째, 코어의 N-말단에 사이클로옥텐기 (240)가 존재하므로, 사이클로옥텐 반응성 기 (예를 들어, 테트라진기 (280))를 갖는 제2 요소는 iEDDA 반응을 통해 사이클로옥텐기 (240)에 연결될 수 있다.
도 4B는 테트라진기 (280)가 아닌 아지드기 (250)가 코어의 C-말단에 존재하는 것을 제외하고는 링커 유닛 (40)이 도 2E의 링커 유닛 (20E)과 유사한 구조를 갖는 대안적인 예를 제공한다. 또한, 6개의 제1 요소 (410a-410f)는 각각 연결 팔 (220a-220f)에 연결되고, 알킨기 (260)를 갖는 제2 요소는 CuAAC 반응을 통해 아지드기 (250)에 연결된다.
대안적으로, 링커 유닛은 이의 N- 및 C-말단에 각각 존재하는 2개의 접합기를 가질 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 제1 접합기가 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기인 경우, 제2 접합기는 바람직하게는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이다. 따라서, SPAAC 및 iEDDA 반응, 또는 CuAAC 및 iEDDA 반응을 통해 2개의 기능성 요소가 각각 코어에 연결될 수 있다. 예를 들어, 사이클로옥틴 반응성 기 (예를 들어, 아지드기)를 갖는 제2 요소는 SPAAC 반응을 통해 제1 커플링기에 연결될 수 있고; 그에 반해 알킨-반응성 기 (예를 들어, 아지드 기), 테트라진-반응성 기 (예를 들어, 노르보넨 또는 TCO 기), 또는 사이클로옥텐-반응성 기 (예를 들어, 테트라진 기)를 갖는 제3 요소는 CuAAC 또는 iEDDA 반응을 통해 제2 커플링기에 연결될 수 있다. 대안적으로, 테트라진-반응성 기 (예를 들어, 노르보넨 또는 TCO 기) 또는 사이클로옥텐-반응성 기 (예를 들어, 테트라진 기)를 갖는 제2 요소는 iEDDA 반응을 통해 제1 커플링기에 연결될 수 있고; 아지드-반응성 기 (예를 들어, 알킨 또는 DBCO기), 알킨-반응성 (예를 들어, 아지드기) 또는 사이클로옥틴-반응성 기 (예를 들어, 아지드기)를 갖는 제3 요소는 CuAAC 또는 SPAAC 반응을 통해 제2 커플링기에 연결될 수 있다.
도 4C는 제2 및 제3 요소에 각각 결합된 2개의 접합기를 포함하는 본 발명의 링커 유닛 (40C)의 예를 제공한다. 링커 유닛 (40C)은 제1 요소 (410a-410g)가 각각 연결 팔 (220a-220g)에 연결되고, 아지드기 (250)를 갖는 제2 요소 (420)가 SPAAC 반응을 통해 사이클로옥틴 (270)에 연결되고, 테트라진 (280)을 갖는 제3 요소 (430)가 iEDDA 반응을 통해 사이클로옥텐 (240)에 연결된 것을 제외하고는 도 2F의 링커 유닛 (20F)과 유사한 구조를 갖는다.
표적 부위에서 이펙터 요소의 방출이 요구되는 경우, 절단 가능한 결합이 연결 팔에 배치될 수 있다. 이러한 결합은 산/알칼리성 가수 분해, 환원/산화 또는 효소에 의해 절단된다. 커플링 팔을 형성하는데 사용될 수 있는 절단 가능한 PEG 쇄 부류의 한가지 실시양태는 NHS-PEG2-20-S-S-말레이미드 (또는 비닐 술폰)이며, 여기서 S-S는 느리게 환원될 수 있는 디설파이드 결합인 반면, NHS 기는 코어의 아민기와 접합하여 PEG 쇄에서의 코어를 연결하는데 사용된다. 연결 팔의 자유 말단에서 말레이미드 (또는 비닐 술폰) 기는 아지드, 알킨, 테트라진 또는 변형된 알킨기로 치환될 수 있다. 본 개시의 일부 실시양태에 따라, 연결 팔은 자유 말단 (즉, 코어와 연결되지 않은 말단)에서 디설파이드 연결을 갖는 2 내지 20 반복 EG 유닛을 갖는 PEG 쇄이다.
반응식 9는 설프하이드릴-함유 분자와의 접합이 가능한 설프하이드릴-반응성 화학기 (예를 들어, 말레이미드, 비닐 술폰 및 할로아세틸)의 예를 제공한다.
<<반응식 9: 티올-특이적 접합>>
Figure pct00010
말레이미드기는 반응 혼합물의 pH가 pH 6.5 내지 7.5일 때 설프하이드릴기와 특정적으로 반응한다. 티오-숙신이미드 부가물은 약간 가역적이고, 생리학적 조건 하에서 말레이미드 제거가 서서히 발생한다. 이러한 레트로-티올-마이클 반응을 피하기 위해, 티오-숙신이미드 부가물 개환은 온화한 조건 (>pH 9.0) 하에서 염기 촉매화에 의해 수행되며, 생성된 생성물은 화학적으로 안정하다.
비닐 술폰기는 자유 티올기와 선택적으로 반응할 수 있다. 비닐 술폰기의 마이클-타입 부가 반응은 온화한 조건 (pH 7-8) 하에서 의도된 분자의 설프하이드릴기의 선택적 변형에 적합하다.
요오도 아세틸기와 설프하이드릴기의 직접적인 SN2 반응은 안정한 티오에테르 연결을 제공한다. R기는 설프히드릴기를 함유하는 scFv, 펩티드, 소분자 약물 또는 펩티드 코어 (멀티-암 링커 유닛용)를 나타낸다.
반응식 10은 단백질 요소를 하이드록실기를 갖는 코어에 접합시키는 방법을 제공한다. PEG 링커 (3)의 형성은 촉매량의 NaI와 화학량론적 양의 NaH의 조건하에서 토실레이트 연결 팔 (2)로 하이드록실-함유 코어 (1)의 직접 에테르화에 의해 달성될 수 있다. scFv (4)를 갖는 원하는 에테르화 코어는 scFv를 사용하여 중간체 (3)를 추가로 1,4-부가함으로써 수득될 수 있다. Y기는 말레이미드 또는 비닐 술폰기이며, Y'기와 반응한다. Y'는 단백질 요소의 SH 기 또는 펩티드의 SH 기 또는 NH2 기이다.
<<반응식 10: 하이드록실기를 갖는 코어에 단백질 요소의 접합 방법>>
Figure pct00011
반응식 11은 소분자 화합물을 하이드록실기를 갖는 코어에 접합하기 위한 일례를 제공한다. 연결 팔 (5) 및 Y'-변형 소분자 약물을 출발 성분으로 사용하여 약물 (6)을 가지는 토실레이트 연결 팔을 형성하는데 다양한 교차 커플링 반응이 이용될 수 있다. 화학량론적 양의 NaH와 촉매량의 NaI의 조건하에서 약물 (7)을 갖는 바람직한 에테르화 코어는 약물 (6)을 가지는 토실레이트 연결 팔에 의한 하이드록시-함유 코어 (1)의 에테르화로부터 얻을 수 있다. Y는 TBDMS, 하이드록실, 말레이미드, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 팔의 말단 작용기이다. Y'는 카복실산, 설프히드릴, 아민, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 소분자 약물의 말단 작용기이다. X는 커플링 반응 후 2개의 말단 작용기 Y와 Y'사이의 교차 연결을 나타낸다.
<<반응식 11: 하이드록실기를 갖는 코어에 소분자 요소의 접합 방법>>
Figure pct00012
Figure pct00013
반응식 12는 반응식 11에 사용된 연결 팔 TsO-PEG6-OTBDMS의 제조예를 제공한다. 헥사에틸렌 글리콜 (HO-PEG6-OH)은 상업적으로 입수 가능하다. 헥사에틸렌 글리콜의 TsCl/NaOH-매개 모노술포네이트 형성은 토실레이트 연결 팔 8 (TsO-PEG6-OH)을 생성할 수 있다. 토실레이트 연결 팔 (8)의 추가의 TBDMSCl/이미다졸-매개 실릴에테르화는 토실 및 OTBDMS 보호기 (9) (TsO-PEG6-OTBDMS)를 가지는 원하는 연결 팔을 전달할 수 있다.
<<반응식 12: 하이드록실기와의 커플링을 위한 링커 팔의 제조>>
Figure pct00014
반응식 13은 반응식 11에 사용된 연결 팔 Cl-PEG6-OTBDMS의 대안적인 제조 예를 제공한다. 헥사에틸렌 글리콜의 SOCl2 매개 모노염소화는 에타닐 클로라이드 (10) (Cl-PEG6-OH)를 제공할 수 있다. 에타닐 클로라이드 (10)의 추가의 TBDMS-Cl/이미다졸-매개 실릴에테르화는 원하는 연결 팔 (11) (Cl-PEG6-OTBDMS)을 전달할 수 있다. 약어: TBAF, 테트라부틸암모늄 플루오라이드; DCC, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드; Et3N, 트리에틸아민; TBDMS, tert-부틸디메틸실릴; NHS, N-하이드록시숙신이미드; Ts, p-톨루엔술포닐; DMF, 디메틸포름아미드.
<<반응식 13: 코어의 하이드록실기와의 커플링을 위한 대안적인 링커 팔의 제조>>
Figure pct00015
반응식 14는 카복실산기를 갖는 코어에 단백질 요소를 접합시키는 방법을 제공한다. 전형적인 DCC/NHS/Et3N 조건하에서 OH 기 (13)를 갖는 연결 팔로 CO2H 함유 코어 (12)의 직접적인 에스테르화는 상응하는 에스테르화된 코어 (14)를 전달할 수 있다. 다음으로, scFv로의 에스테르-변형된 코어 (14)의 술파 또는 아자-마이클 부가가 scFV (15)를 갖는 원하는 에스테르화된 코어를 전달할 수 있다. 연결 팔의 다른 말단은 Y기를 가지고 있는데, 이것은 Y'그룹과 반응하는 말레이미드 또는 비닐 술폰기이다. Y'는 단백질 요소의 SH 기 또는 펩티드의 SH 기 또는 NH2 기이다.
<<반응식 14: 카복실산기를 갖는 코어에 단백질 요소의 접합 방법>>
Figure pct00016
반응식 15는 카복실산 (CO2H)기를 갖는 코어에 소분자 요소를 접합하는 예를 제공한다. 전형적인 DCC/NHS/Et3N 조건하에서 OH 기 (16)를 가지는 연결 팔로 CO2H 함유 코어 (12)의 직접적인 에스테르화는 상응하는 에스테르-변형된 코어 (17)를 전달할 수 있다. 다음으로, 적합한 조건하에서 변형된 소분자 약물과 에스테르 변형된 코어 (17)의 접합은 약물 (18)을 가지는 원하는 에스테르 변형된 코어를 전달할 수 있다. Y는 OTBDMS, 하이드록실, 말레이미드, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 팔의 말단 작용기이다. Y'는 카복실산, 설프하이드릴, 아민, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 소분자 약물의 말단 작용기이다. X는 커플링 반응 후 2개의 말단 작용기 Y 및 Y' 사이의 연결을 나타낸다.
<<반응식 15: 카복실산기를 갖는 코어에 소분자 요소의 접합 방법>>
Figure pct00017
Figure pct00018
반응식 16은 반응식 15에 사용된 연결 팔 TsO-PEG6-OH의 제조예를 제공한다.이 예에서, 헥사에틸렌 글리콜 (HO-PEG6-OH)의 TsCl/NaOH-매개 모노술포네이트 형성은 토실레이트 연결-암 (8) (TsO-PEG6-OH)을 제공할 수 있다. 연결 팔 Cl-PEG6-OTBDMS의 제조에 대한 대안적인 예가 반응식 17에 도시되어 있다. 이 예에서, 헥사에틸렌 글리콜 (HO-PEG6-OH)의 SOCl2 매개 모노염소화는 에타닐 클로라이드 (10) (Cl-PEG6-OH)를 제공할 수 있다. 약어: TBAF, 테트라부틸암모늄 플루오라이드; DCC, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드; Et3N, 트리에틸아민; NHS, N-하이드록시숙신이미드; Ts, p-톨루엔술포닐; DMF, 디메틸포름아미드.
<<반응식 16: 카복실산기와의 커플링을 위한 연결 팔의 제조>>
Figure pct00019
<<반응식 17: 카복실산기와의 커플링을 위한 대안적인 연결 팔의 제조>>
Figure pct00020
반응식 18은 링커 팔의 제조 및 펩티드 코어에서 세린 잔기의 OH기에 대한 그의 접합을 예시한다. HO-PEG12-Cl (19)의 제조 방법은 반응식 17에 기재된 것과 유사하다. HO-PEG12-비닐 술폰 (20)의 형성은 HO-PEG12-Cl (19)를 나트륨 비닐 술피네이트와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. HO-PEG12-비닐 술폰 (20)의 TsCl/Et3N-매개 모노술포네이트 형성은 토실레이트 연결 팔 (21) (TsO-PEG12-비닐 술폰)을 생성할 수 있다. 별도의 반응에서, 클릭 반응으로의 커플링을 위한 DBCO의 도입을 위해 펩티드 코어 Ac-ZSZSZSC를 짧은 링커 말레이미드-PEG3-DBCO와 반응시킨다. 이어서, 변형된 펩티드 코어 (22)를 화학량론적 양의 NaH와 촉매량의 NaI의 조건하에서 토실레이트 연결 팔 (21) (TsO-PEG12-비닐 술폰)과 반응시켜 PEG 링커-변형된 펩티드 코어를 생성한다 (23). 다음으로, SH 함유 scFv와의 PEG 링커-변형된 펩티드 코어 (23)의 술파-마이클 부가로 scFv (24)를 갖는 원하는 PEG 링커-변형된 펩티드 코어를 전달할 수 있다.
<<반응식 18: 세린 잔기를 갖는 펩티드 코어에 연결 팔의 접합 방법>>
Figure pct00021
반응식 19는 세린 잔기를 갖는 펩티드 코어에 소분자 요소를 접합시키는 방법을 예시한다. 이 방법은 반응식 17에 기재된 것과 유사하다. 이 경우에, 소약물 분자는 연결 팔이 펩티드 코어의 하이드록시기에 접합되기 전에 연결 팔에 접합된다. 토실레이트 연결 팔 (5)을 Y'-변형된 소분자 약물과 반응시킴으로써 약물 (6)을 가지는 토실레이트 연결 팔을 형성시키는 데 다양한 교차 커플링 반응이 이용될 수 있다. 화학량론적 양의 NaH와 촉매량의 NaI의 조건하에서 약물 (6)을 갖는 토실레이트 연결 팔과 세린-함유 펩티드 코어 (22)의 에테르화로부터 약물 (28)을 갖는 바람직한 이펙터 링커 유닛을 얻을 수 있다. Y는 OTBDMS, 하이드록실, 말레이미드, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 연결 팔의 말단 작용기이다. Y'는 카복실산, 설프하이드릴, 아민, NHS, 비닐 술폰, 아지드, 알킨, TCO, BCN, DBCO 및 테트라진기로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 소분자 약물의 말단 작용기이다. X는 커플링 반응 후 2개의 말단 작용기 Y와 Y'사이의 연결을 나타낸다.
<<반응식 19: 세린 잔기를 갖는 펩티드 코어의 링커 유닛에 소분자 요소의 접합 방법>>
Figure pct00022
Figure pct00023
I-(ii) 멀티-암 링커에 사용하기에 적합한 기능성 요소
링커 유닛 (또는 멀티-암 링커)이 제1 요소만을 포함하고 제2 및/또는 제3 요소(들)를 포함하지 않는 경우, 제1 요소는 대상체에서 치료 효과를 일으킬 수 있는 이펙터 요소이다. 다른 한편, 본 링커 유닛이 제1 요소(들) 외의 요소들을 포함하는 경우, 요소 중 적어도 하나는 이펙터 요소이고, 다른 것은 또 다른 이펙터 요소, 표적화 요소 또는 링커 유닛의 하나 이상의 약동학적 특성 (예를 들어, 용해성, 클리어런스, 반감기 및 생체이용률)을 향상시키는 것이 가능한 요소일 수 있다. 예를 들어, 링커 유닛은 두 상이한 종류의 이펙터 요소, 하나의 이펙터 요소 및 하나의 표적화 요소 또는 하나의 약동학적 특성-향상 요소, 두 상이한 종류의 표적화 요소 및 1종의 이펙터 요소, 두 상이한 종류의 이펙터 요소 및 1종의 표적화 요소, 또는 1종의 표적화 요소, 1종의 이펙터 요소 및 링커 유닛의 약동학적 특성을 개선할 수 있는 하나의 요소를 가질 수 있다.
확산성 종양의 치료를 위해, 본 링커 유닛의 제1 및 제2 요소 중 하나는 세포 표면 항원에 특이적인 항체 단편 (예를 들어, scFv)이며, 이는 확산성 종양과 관련되고/되거나 과발현되며; 본 발명의 링커 유닛의 제1 및 제2 요소 중 다른 하나는 세포 표면 항원 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 또는 세포 독성 약물이다. 바람직하게는, 본 링커 유닛의 제1 요소는 종양 관련 항원에 특이적인 항체 단편이고, 본 링커 유닛의 제2 요소는 세포 표면 항원 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 또는 세포 독성 약물이다. 본 개시의 실시양태에 따라, 확산성 종양과 관련되고/되거나 과발현된 세포 표면 항원은 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138, 또는 CD319이다. 임의로, 세포 독성 약물은 머탄신, 아우리스타틴, 마이탄신, 독소루비신, 칼리케아마이신 및 캄프토테신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 링커 유닛에 의해 치료 가능한 확산성 종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 또는 골수종일 수 있다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 링커 유닛은 B-림프구-유래 림프종 또는 백혈병을 치료하는데 사용되며, 여기서 제1 요소는 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a, 또는 CD79b에 특이적인 항체 단편 (예를 들어, scFv)이고; 제2 요소는 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 (예를 들어, scFv) 또는 세포 독성 약물이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 링커 유닛은 B-림프구-유래 림프종 또는 백혈병의 치료에 사용되며, 여기서 제1 요소는 CD79a에 특이적인 항체 단편이고, 제2 요소는 CD79b에 특이적인 항체 단편이거나, 또는 그 반대이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 링커 유닛에 의해 치료되는 질환은 형질 세포종 또는 다발성 골수종이며, 여기서 제1 요소는 CD38, CD78, CD138 또는 CD319에 특이적인 항체 단편이고; 제2 요소는 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 또는 세포 독성 약물이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 링커 유닛은 T-세포 유래 림프종 또는 백혈병에 대한 효과를 가지며, 여기서 제1 요소는 CD5, CD30 또는 CD43에 특이적인 항체 단편이고; 제2 요소는 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 또는 세포 독성 약물이다.
바람직한 일 실시양태에서, 본 링커 유닛은 골수성 백혈병을 치료하는데 사용되며, 여기서 제1 요소는 CD33 또는 CD34에 특이적인 항체 단편이고; 제2 요소는 CD3 또는 CD16a에 특이적인 항체 단편 또는 세포 독성 약물이다.
고형 종양의 치료와 관련하여, 본 링커 유닛의 제1 요소는 펩티드 호르몬, 성장 인자 또는 종양 관련 항원에 특이적인 항체 단편이고; 제2 요소는 세포 독성 약물, 톨-유사 수용체 작용제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 사이토카인, 또는 성장 인자, 세포 표면 항원, 합텐 또는 사이토카인에 특이적인 항체 단편이다.
종양 관련 항원은 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER1), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3), 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER4), 탄수화물 항원 19-9 (CA 19-9), 탄수화물 항원 125 (CA 125), 뮤신 1 (MUC 1), 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, 강글리오사이드 GM2, 푸코실 GM1, Neu5GcGM3, 흑색종 관련 항원 (MAGE), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 메소텔린, 뮤신-관련 Tn, 시알릴 Tn, LewisY, 시알릴 LewisY, LewisA, Lewisx, 헤파린 결합 표피 성장 인자 (HB-EGF), Globo H, 및 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
펩티드 호르몬은 세크레틴, 가스트린, 콜레시스토키닌 (CCK), 가스트린-방출 폴리펩티드, 글루카곤-유사 폴리펩티드 1 (GLP-1), 뉴로메딘, 옥트레오티드, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 부신피질 자극 호르몬 (ACTH), 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 및 소마토스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 돌연변이 EGF, 에피레귤린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 (HB-EGF), 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 제1 표적화 요소는 EGF, 돌연변이 EGF, HB-EGF, VEGF-A, bFGF 또는 HGF이다. 다른 실시예에서, 제1 이펙터 요소는 EGF, 돌연변이 EGF, VEGF-A, bFGF 또는 HGF에 특이적인 항체 단편이다.
세포 표면 항원은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD16a, CD28, 또는 CD134이다.
합텐은 디니트로페놀 (DNP), 트리니트로페놀 (TNP), 단실, 페니실린, p-아미노벤조산 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 짧은 펩티드이다.
사이토카인은 IL-2, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, TGF-β 또는 TNF-α이다. 바람직하게는, 제2 요소는 IL-2, IFN-α, IFN-γ 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인에 특이적인 비중화 항체 단편이다.
이해할 수 있는 바와 같이, 종양 세포에 대해 세포 독성 효과를 나타내는 세포 독성 약물은 항-에스트로겐 (예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜 및 메게스트롤), LHRH 작용제 (예를 들어, 고스크르클린 및 류프롤리드), 항안드로겐 (예를 들어, 플루타미드 및 비칼루타미드), 광역학 치료제 (예를 들어, 베르토포르핀, 프탈로시아닌, 감광제 Pc4 및 데메톡시-하이포크렐린 A), 질소 머스타드 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 트로포스파미드, 클로람부실, 에스트라무스틴 및 멜팔란), 니트로소우레아 (예를 들어, 카르무스틴 및 로무스틴), 알킬술포네이트 (예를 들어, 부술판 및 트레오술판), 트리아젠 (예를 들어, 다카르바진, 테모졸로미드), 백금 함유 화합물 (예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁실 및 탁솔), 에피포도필린 (예를 들어, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 토포테칸, 9-아미노캄프토테신, 캄프토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스나톨, 미토마이신 C), 항-대사물질, DHFR 억제제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 디클로로메토트렉세이트, 트리메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 탈수소효소 억제제 (예를 들어, 마이코페놀산, 티아조푸린, 리바비린 및 EICAR), 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제 (예를 들어, 하이드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체 (예를 들어, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록수리딘, 독시플루리딘, 라티트렉시드, 테가푸르-우라실, 카페시타빈), 시토신 유사체 (예를 들어, 시타라빈 (ara C), 시토신 아라비노시드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체 (예를 들어, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 비타민 D3 유사체 (예를 들어, EB 1089, CB 1093 및 KH 1060), 이소프레닐화 억제제 (예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경 독소 (예를 들어, 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온), 세포주기 억제제 (예를 들어, 스타우로스포린), 액티노마이신 (예를 들어, 액티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오 마이신 (예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 페플로마이신), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 피라루비신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 억제제 (예를 들어, 베라파밀), Ca2+ ATPase 억제제 (예를 들어, 탑시카르긴), 이마티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 악시티닙, 보수티닙, 세디라닙, 다사티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 레스타우르티닙, 네라티닙, 닐로티닙, 세막사닙, 수니티닙, 토세라닙, 반데타닙, 바탈라닙, 리툭시맙, 닐로티닙, 소라페닙, 에버롤리무스, 템시롤리무스, 프로테아좀 억제제 (예를 들어, 보르테조밉), mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신, 템시롤리무스, 에버롤리무스 및 리다포롤리무스), 오블리메르센, 겜시타빈, 카미노마이신, 류코보린, 페메트렉시드, 사이클로포스파미드, 다카바진, 프로카바진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캄파테신, 플리카마이신, 아스파라기나제, 아미노프테린, 메토프테린, 포르피로마이신, 멜팔란, 류로시딘, 류로신, 클로람부실, 트라벡테딘, 프로카바진, 디스코더몰리드, 카미노마이신, 아미노프테린 또는 헥사메틸 멜라민일 수 있다. 본 개시의 하나의 특정 실시양태에 따라, 세포 독성 약물은 머탄신, 아우리스타틴, 마이탄신, 독소루비신, 칼리케아마이신 또는 캄프토테신이다.
톨-유사 수용체 작용제는 리포테이코산, 글루칸, 모톨리모드, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 가디퀴모드, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG DON), 리포폴리사카라이드 (LPS), 모노포스포릴 리피드 A 또는 자이모산이다.
본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 고형 종양은 흑색종, 식도암종, 위암종, 뇌종양, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 방광암, 유방암, 췌장암, 결장암, 직장암, 결장 직장암, 신장암, 간세포 암종, 난소암, 전립선암, 갑상선암, 고환암 또는 두경부 편평 세포 암종일 수 있다.
I-(iii) 멀티-암 링커의 용도
본 개시는 또한 본 개시의 적합한 링커 유닛을 사용하여 다양한 질환 (예를 들어, 확산성 종양 및 고형 종양)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 본 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 실시양태에 따른 링커 유닛을 투여하는 단계를 포함한다.
이전에 알려진 치료 구조물과 비교하여, 파트 I에서 논의된 본 링커 유닛은 몇 가지 점에서 유리하다:
(1) 기능성 요소의 수가 필요 및/또는 응용에 따라 조정될 수 있다. 본 링커 유닛은 의도된 적용의 요구 사항 (예를 들어, 치료할 질환, 본 링커 유닛의 투여 경로, 및 본 링커 유닛에 의해 보유되는 항체의 결합력 및/또는 친화력)에 따라 두 요소 (즉, 제1 및 제2 요소) 또는 세 요소 (즉, 제1, 제2 및 제3 요소)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커 유닛이 조직/기관으로 직접 전달되도록 의도된 경우, 이펙터 요소로서 작용하는 하나의 요소이면 충분할 수 있고, 따라서 표적화 요소로서 작용하는 제2 요소가 필요하지 않을 것이다. 그러나, 링커 유닛이 말초적으로 (예를 들어, 경구, 장, 비강, 국소, 경점막, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내 주사) 전달되도록 의도된 경우, 링커 유닛이 본 링커 유닛을 병변 부위 (예를 들어, 종양 또는 암성 세포/조직)로 특이적으로 표적화하는 표적화 요소; 및 병변 부위에 치료 효과를 나타내는 이펙터 요소를 동시에 포함하는 것이 필요할 수 있다. 본 링커 유닛의 표적화 또는 치료 효능을 증가시키거나 안정성을 증가시키기 위해, 제3 요소 (예를 들어, 제2 표적화 요소, 제2 이펙터 요소 또는 PEG 쇄)가 본 링커 유닛에 추가로 포함될 수 있다.
(2) 제1 요소는 번들 형태로 제공된다. 전술한 바와 같이, 제1 요소의 수는 코어에 포함된 연결 아미노산 잔기의 수에 따라 변한다. 코어에서 연결 아미노산 잔기의 수는 2 내지 20의 범위이므로, 적어도 2개의 제1 요소가 각각의 링커 유닛에 포함될 수 있다. 따라서, 전통적인 치료 구조물 또는 방법이 제공할 수 있는 하나의 단일 분자 (예를 들어, 세포 독성 약물 및 항체)를 제공하는 대신에, 본 링커 유닛은 한 번에 더 많은 기능성 요소 (표적화 요소 또는 이펙터 요소)를 제공할 수 있으며, 따라서 치료 효과를 크게 향상시킨다.
(3) 링커 유닛은 그에 결합된 접합기를 통해 기능성 요소 또는 다른 분자 구조물 (아래의 파트 II 참조)에 효율적으로 연결될 수 있다. 본 코어는 상업적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 본 코어는 반응식 4 내지 9에 제공된 절차에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 여기서 합성 폴리펩티드의 α-아민기를 보호하기 위한 보호기로서 제공되는 N-말단 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc)이 접합기 (즉, 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 또는 사이클로옥틴기)로 대체된다. 추가로 또는 대안적으로, 접합기는 폴리펩티드의 카복실기와 반응함으로써 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 이와 같이 생성된 코어는 기능성 요소 (예를 들어, 본 제2 및/또는 제3 요소)와 코어를 연결하기 위한 연결기로서 기능하는 1 또는 2개의 접합기를 포함한다.
파트 II 조인트-링커 분자 구조물 및 이의 용도
다른 측면에서, 본 개시는 그의 접합 모이어티를 통해 서로 커플링하는 2개 이상의 링커 유닛을 포함하는 분자 구조물; 및 이러한 분자 구조물의 유용성에 관한 것이다. 본 개시의 일 실시양태에 따라, 분자 구조물은 제1 링커 유닛 및 제2 링커 유닛을 포함한다. 일반적으로, 제1 또는 제2 링커 유닛은 각각 본 개시의 다른 측면(들) 및 실시양태(들)와 관련하여 상술된 구조를 갖는다. 구체적으로, 제1 링커 유닛은 제1 코어, 및 제1 코어에 연결된 2개 이상의 연결 팔 (이하, 제1 연결 팔이라 함)을 포함하고; 제2 링커 유닛은 제2 코어, 및 제2 코어에 연결된 2개 이상의 연결 팔 (이하, 제2 연결 팔이라 함)을 포함한다. 본 개시의 파트 I에 기술된 바와 같이, 본 코어는 그의 N- 및/또는 C-말단에 직접 결합된 적어도 하나의 접합 모이어티를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 개시의 특정 실시양태에 따라, 제1 및 제2 코어는 각각 그와 결합된 접합 모이어티를 가지며; 설명 상, 제1 코어에 결합된 접합 모이어티는 제1 모이어티라 하고, 제2 코어에 결합된 접합 모이어티는 제2 모이어티라 한다. 제1 요소는 제1 연결 팔에 접합되고, 제2 요소는 제2 연결 팔에 접합된다. 이어, 제1 및 제2 링커 유닛은 제1 및 제2 접합 모이어티 사이에서 일어난 iEDDA, SPAAC 또는 CuAAC 반응을 통해 서로 커플링된다. 제1 및 제2 요소는 상이한 기능을 가지며 소분자 또는 펩티드 및 단백질일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 요소는 svFv, sdAb, Fab 또는 F(ab)'2와 같은 항체 단편 또는 2개의 상이한 항원에 특이적인 항체 모방체일 수 있다.
보다 구체적으로, 제1 및 제2 접합 모이어티는 각각 그의 하나의 말단에서 접합기 및 다른 말단에서 아민 또는 카복실기를 포함하고, 여기서 접합기는 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 접합 모이어티는 카복실기를 통해 N-말단 스페이서의 알파-아민기에 결합될 수 있다. 대안적으로, 접합 모이어티는 아민기를 통해 C-말단 스페이서의 카복실기에 결합될 수 있다. 따라서 코어에 결합된 접합 모이어티는 그의 자유-말단에 접합기를 갖는다.
임의로, 접합 모이어티는 접합기와 연결기 사이에 배치된 2-10 반복 EG 유닛을 갖는 PEG 쇄를 추가로 포함한다. 예를 들어, PEG 쇄는 4, 6, 7, 또는 8 반복의 EG 유닛을 가질 수 있다.
또한 임의로, 제1 및 제2 링커 유닛 중 하나는 제3 접합 모이어티를 추가로 함유할 수 있다. 제3 접합 모이어티는 제3 요소 (예컨대 항체 단편 또는 장쇄 PEG) 또는 제3 링커 유닛과 커플링하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 제1 및 제2 링커 유닛은 클릭 반응에 의해 커플링된다. 이어서, 조인트 제1 및 제2 링커 유닛의 제3 접합 모이어티가 상이한 클릭 반응에 의해 제3 요소 또는 링커 유닛과 결합된다.
II-(i) 조인트-링커 분자 구조물의 구조
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 분자 구조물은 2개의 링커 유닛을 포함하고, 링커 유닛은 CuAAC, SPAAC 또는 iEDDA 반응을 통해 서로 커플링된다. 일부 실시양태에서, 링커 유닛 중 하나는 표적화 요소로서 작용하는 복수의 제1 요소와 연결되고, 다른 링커 유닛은 이펙터 요소로서 작용하는 복수의 제2 요소와 연결된다.
이제 두개의 링커 유닛 사이의 연결을 각각 나타내는 도 5A 내지 도 5C를 참조한다.
도 5A는 CuAAC 반응을 통해 서로 커플링된 2개의 링커 유닛 (50A 및 55A)을 포함하는 분자 구조물를 도시한다. 제1 링커 유닛 (50A)은 제1 코어 (510), 제1 코어 (510)에 연결된 연결 팔 (520) (즉, 제1 연결 팔) 및 연결 팔 (520)에 연결된 기능성 요소 (530) (즉, 제1 요소)를 포함하며, 여기서 제1 코어 (510)의 N- 또는 C-말단 스페이서는 아지드기 (515)가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는다. 유사하게, 제2 링커 유닛 (55A)은 제2 코어 (550), 제2 코어 (550)에 연결된 연결 팔 (560) (즉, 제2 연결 팔) 및 연결 팔 (560)에 연결된 기능성 요소 (570) (즉, 제2 요소)를 포함하고, 여기서 제2 코어 (550)의 N- 또는 C-말단 스페이서는 알킨기 (516)가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는다. 따라서, 링커 유닛 (50A 및 55A)은 아지드 기 (515)와 알킨기 (516) 사이에서 일어난 CuAAC 반응을 통해 함께 커플링될 수 있다. 도 5A에 도시된 기호 (541)는 CuAAC 반응에 의해 형성된 화학 결합을 나타낸다.
도 5B는 제1 코어 (511)의 N- 또는 C-말단 스페이서가 사이클로옥틴기 (517)가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖고, 제2 코어 (551)의 N- 또는 C-말단 스페이서가 아지드기 (515)가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는 본 분자 구조물의 다른 예를 제공한다. 이어, 링커 유닛 (50B 및 55B)이 사이클로옥틴기 (517)와 아지드기 (515) 사이에서 일어난 SPAAC 반응을 통해 서로 커플링될 수 있다. 도 5B에 도시된 기호 (542)는 SPAAC 반응에 의해 형성된 화학 결합을 나타낸다.
대안적으로, 제1 및 제2 링커 유닛은 iEDDA 반응을 통해 함께 커플링될 수 있다. 이제 도 5C를 참조한다. 코어 (512 및 552)가 각각 테트라진기 (518)를 가지는 접합 모이어티 및 사이클로옥텐기 (514)가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는다는 점을 제외하고, 링커 유닛 (50C 및 55C)은 각각 링커 유닛 (50A/50B 및 55A/55B)과 유사한 구조를 갖는다. 링커 유닛 (50C 및 55C)은 테트라진기 (518)와 사이클로옥텐기 (514) 사이에서 일어난 iEDDA 반응을 통해 서로 커플링될 수 있다. 도 5C에 도시된 기호 (543)는 iEDDA 반응에 의해 형성된 화학 결합을 나타낸다.
바람직하게는, 제1 및 제2 연결 팔 중 적어도 하나가 CuAAC 또는 SPAAC 반응을 통해 기능성 요소에 연결되는 경우, 제1 및 제2 링커 유닛은 iEDDA 반응을 통해 서로 커플링된다. 대안적으로, 제1 및 제2 연결 팔 중 적어도 하나가 iEDDA 반응을 통해 기능성 요소에 연결되는 경우, 제1 및 제2 링커 유닛은 CuAAC 또는 SPAAC 반응을 통해 서로 커플링된다.
다른 치료 구조물과 비교하여, 본 분자 구조물은 적어도 다음 3 가지 측면에서 유리하다:
(1) 특정 수 및/또는 유형의 표적화/이펙터 요소를 포함하는 링커 유닛이 독립적으로 제조될 수 있고, 이어서 적합한 클릭 화학 반응 (예를 들어, iEDDA, CuAAC 또는 SPAAC 반응)을 통해 함께 커플링되도록 진행될 수 있다;
(2) 표적화 및/또는 이펙터 요소의 수 및 유형은 의도된 적용 요건 (예를 들어, 치료되는 질환, 및 표적화 및/또는 이펙터 요소의 결합력 및/또는 친화력)에 따라 달라질 수 있다. 표적화 및 이펙터 요소의 조합은 특정 요구 및/또는 응용에 따라 조정될 수 있다. 본 표적화 및 이펙터 요소는 각각 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태 및/또는 치료되는 질환의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 최상의 치료 효과를 달성하기 위해 가장 적합한 표적화 요소 및 가장 적합한 이펙터 요소를 조합할 수 있다. 본 개시의 실시양태에 따라, 표적화 요소는 성장 인자, 펩티드 호르몬, 사이토카인 또는 항체 단편일 수 있고; 이펙터 요소는 면역조절제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 세포 독성 약물, 사이토카인, 가용성 수용체 또는 항체일 수 있다;
(3) 다른 커플링 반응과 비교하여, iEDDA 반응 또는 SPAAC 반응은 임의의 두 링커 유닛을 커플링하는 면에서 더 효율적이다.
이제 독립적으로 제조될 수 있는 6개의 링커 유닛 라이브러리를 예시하는 도 6을 참조한다. 본 실시양태에서, 라이브러리 1 내지 6은 각각 기능성 요소와 연결된 복수의 링커 유닛 (60A, 60B, 60C, 65A, 65B, 65C)을 포함한다. 각각의 링커 유닛 (60A, 60B 및 60C)은 구조가 유사하다; 여기서 각각의 링커 유닛 (60A, 60B 및 60C)은 하나의 코어 (610) 및 특정 수의 연결 팔 (620)을 포함하고, 여기서 코어 (610)의 N- 또는 C-말단은 아지드기 (615)를 갖는 접합 모이어티와 결합된다. 예를 들어, 링커 유닛 (60A)은 3개의 연결 팔 (620)을 포함하고, 따라서 3개의 표적화 요소 (630a)가 3개의 연결 팔 (620)에 각각 연결될 수 있다. 유사하게, 4개의 표적화 요소 (630b) 및 5개의 표적화 요소 (630c)는 각각 링커 유닛 (60B 및 60C)에 연결될 수 있다. 표적화 요소 (630a, 630b 및 630c)는 동일하거나 상이할 수 있다. 링커 유닛 (65A, 65B 및 65C)과 관련하여, 이들 링커 유닛 각각은 하나의 코어 (650) 및 특정 수의 연결 팔 (660)을 포함하고, 여기서 코어 (650)의 N- 또는 C-말단은 사이클로옥틴기 (617)를 가지는 접합기와 결합된다. 도시된 바와 같이, 2개의 이펙터 요소 (670a), 3개의 이펙터 요소 (670b) 및 6개의 이펙터 요소 (670c)는 각각 링커 유닛 (65A, 65B 및 65C)에 연결될 수 있다. 이펙터 요소 (670a, 670b, 670c)는 동일하거나 상이할 수 있다. 라이브러리 1 내지 6은 독립적으로 제조될 수 있다. 당업자는 라이브러리 1, 2 및 3에서 제1 링커 유닛을 선택하고 라이브러리 4, 5 및 6에서 제2 링커 유닛을 선택한 다음, 아지드기 (615)와 사이클로옥틴기 (617) 사이에서 일어난 iEDDA 반응을 통해 제1 및 제2 링커 유닛의 커플링을 진행함으로써 특정된 수의 표적화 및 이펙터 요소를 갖는 분자 구조물을 생성할 수 있다.
이해할 수 있는 바와 같이, 분자 구조물은 3개의 링커 유닛을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 링커 유닛은 iEDDA 반응을 통해 서로 커플링되고, 이어서 제3 링커 유닛이 CuAAC 반응을 통해 제1 또는 제2 링커 유닛에 커플링된다. 대안적으로, 제1 및 제2 링커 유닛은 iEDDA 반응을 통해 서로 커플링되고, 제3 링커 유닛은 SPAAC 반응을 통해 제1 또는 제2 링커 유닛에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 링커 유닛은 각각 복수의 제1, 제2 및 제3 요소를 보유하며, 여기서 제1, 제2 및 제3 요소는 동일하거나 상이할 수 있다.
이제 링커 유닛 (70A, 70B 및 70C)이 iEDDA 및 SPAAC 반응을 통해 함께 커플링된 도 7을 참조한다. 구조적으로, 각각의 링커 유닛 (70A, 70B, 70C)은 코어 (710a, 710b, 710c), 코어 (710a, 710b, 710c)에 연결된 연결 팔 (720a, 720b, 720c) 및 연결 팔 (720a, 720b, 720c)에 연결된 기능성 요소 (730a, 730b, 730c)를 포함한다. 커플링을 위해, 링커 유닛 (70A)의 N-말단 또는 C-말단은 테트라진기가 이에 결합된 접합 모이어티를 가지며; 링커 유닛 (70B)의 N- 및 C-말단은 각각 사이클로옥텐을 가지는 접합 모이어티 및 아지드기가 결합된 접합 모이어티를 가지며; 링커 유닛 (70C)의 N-말단 또는 C-말단은 사이클로옥틴기가 이에 결합된 접합 모이어티를 갖는다. 따라서, 링커 유닛 (70A 및 70B)은 테트라진과 사이클로옥텐기 사이에서 일어난 iEDDA 반응을 통해 커플링되며, 여기서 도 7에 도시된 기호 (750)는 iEDDA 반응에 의해 형성된 화학 결합을 나타낸다. 다른 한편, 링커 유닛 (70B 및 70C)은 아지드와 사이클로옥틴기 사이에서 일어난 SPAAC 반응을 통해 커플링되며, 여기서 도 7에 도시된 기호 (760)는 SPAAC 반응에 의해 형성된 화학 결합을 나타낸다.
이해할 수 있는 바와 같이, 링커 유닛 (70A, 70B 및 70C)에 각각 연결된 각각의 기능성 요소 (730a, 730b, 730c)의 수는 의도된 용도에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 도 6에 도시된 라이브러리 개념으로, 상이한 수 및/또는 유형의 기능성 요소를 각각 갖는 링커 유닛은 상이한 라이브러리로서 독립적으로 제조될 수 있고, 당업자는 분자 구조물의 의도된 적용에 비추어 라이브러리로부터 원하는 링커 유닛을 선택하고 조합할 수 있다.
임의로, 본 분자 구조물은 제1 또는 제2 코어에 연결된 비교적 긴 PEG 쇄를 포함할 수 있어, 본 분자 구조물은 세망내피 시스템으로부터 더 멀리 분리될 수 있고 대상체에 투여 후 더 긴 반감기를 달성할 수 있다. 단백질이 이의 약동학적 특성을 개선시키고/시키거나 면역원성을 감소시키기 위해 PEG 쇄에 의해 변형되는 경우, PEG의 길이는 20,000 내지 50,000 달톤이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시양태에서, 본 분자 구조물의 생체 내 반감기 증가를 목적으로 비교적 짧은 길이의 연결 팔은 표적화 및 이펙터 요소를 연결하는데 사용되는 반면, 20,000 내지 50,000 달톤의 PEG 쇄가 임의의 링커 유닛에 연결된다.
일부 실시양태에서, 다수의 항체 단편이 본 분자 구조물을 작제하기 위한 표적화 및/또는 이펙터 요소로서 사용된다. 항체 단편을 포함하는 분자 구조물에 기초한 표적화 요소/이펙터 요소 약제는 개별 항체 단편보다 생체 내 반감기가 더 길어야 한다. 일부 임상 적용의 경우, 약물의 빈번한 투여의 필요성을 제거하기 위해, 약물의 반감기가 훨씬 연장되는 것이 요구되고; 이 경우에, 중량 기준으로 20,000 내지 50,000 달톤인 PEG 쇄가 표적화 또는 이펙터 요소로서 작용하는 항체 단편을 연결하기 위한 연결 팔로서 사용될 수 있다. 이들 길이의 PEG가 그들의 반감기를 증가시키기 위해 다수의 치료 단백질을 변형시키는데 사용되어 왔다.
코어로서 폴리펩티드를 채택하는 것은 본 분자 구조물에 다목적성을 제공하는데, 여기서 다수의 카피 또는 유형의 표적화/이펙터 요소가 하나의 구조물에 존재할 수 있으며, 따라서 의도된 표적 부위에서의 약물 전달의 특이성 및 효능 향상이 달성된다. 다수의 링커 유닛을 포함하는 분자 구조물을 사용함으로써 다수의 구성이 이루어질 수 있다. 몇몇 비제한적인 예는 표적화 요소로서 3개의 scFv를 보유하는 제1 링커 유닛 및 5개의 치료 약물 분자를 보유하는 제2 링커 유닛; 표적화 요소로서 3개의 scFv를 보유하는 제1 링커 유닛 및 3개의 scFv 이펙터 요소를 보유하는 제2 링커 유닛; 2개의 제1 scFv (제1 표적화 요소로서 제공)를 보유하는 제1 링커 유닛, 2개의 제2 scFv (제2 표적화 요소로서 제공)를 보유하는 제2 링커 유닛, 및 5개의 치료 약물 분자를 보유하는 제3 링커 유닛; 표적화 요소로서 2개의 bi-scFv를 보유하는 제1 링커 유닛 및 이펙터 요소로서 2개의 scFv를 보유하는 제2 링커 유닛; 또는 약동학적 특성을 증가시킬 목적으로 20,000 내지 50,000 달톤의 긴 PEG가 부착된 하나의 연결 팔과 함께 표적화 요소로서 3개의 scFv를 보유하는 제1 링커 유닛 및 이펙터 요소로서 2개의 scFv를 보유하는 제2 링커 유닛이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 연결 팔로서 작용하는 이기능성 PEG는 항체의 항원-결합 단편 (표적 또는 이펙터 요소로서 제공)을 폴리펩티드 코어에 위치한 아민기에 연결하는데 사용된다. 각각의 PEG는 하나의 말단에 NHS기를, 다른 말단에 말레이미드 및/또는 비닐 술폰기를 가질 수 있다. NHS기는 폴리펩티드 코어에서 아민기와 커플링될 수 있는 반면, 말레이미드 또는 비닐 술폰기는 항체의 scFv, bi-scFv 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편의 C 잔기의 설프하이드릴기와 커플링될 수 있다. scFv 및 bi-scFv는 C-말단에 말단 C 잔기를 갖는 폴리펩티드 링커를 갖도록 조작된다. Fab는 펩신 절단에 의해 전체 IgG로부터 유래될 수 있고, 자유 술프하이드릴기는 온화한 환원 반응에 의해 쇄간 디설파이드 결합으로부터 유래된다.
표적화 및 이펙터 요소가 각각 scFv이고, 600 달톤 (12 EG 유닛)의 연결 팔이 사용되는 경우, 총 6개의 scFv를 갖는 분자 구조물은 약 170,000 달톤의 분자량을 가질 것이다. 7개의 scFv를 갖는 분자 구조물은 약 200,000 달톤의 분자량을 가질 것이고, 8개의 scFv를 갖는 분자 구조물은 약 230,000 달톤의 분자량을 가질 것이다. 본 발명의 대부분의 분자 구조물은 각각 200,000 달톤 미만의 분자량을 가지며, 몇몇 분자 구조물은 200,000 내지 250,000 달톤의 분자량 범위를 갖는다.
4개의 상이한 scFv 세트가 하나의 분자 구조물에 보유되도록 존재하는 경우, scFv1-scFv2 (예를 들어, HER2 및 HER3에 특이적)와 같은 조인된 단일쇄 이중 특이성 scFv (bi-scFv)를 보유하는 하나의 링커 유닛 및 각각 하나의 scFv (즉, 각각 scFv3 및 scFv4)를 보유하는 다른 2개의 링커 유닛을 갖는 것이 바람직하다. 이중 특이성 scFv1-scFv2를 작제하는 두 가지 방법이 있다. "탠덤 (tandem)" 구성에서, VL1-VH1-VL2-VH2 또는 VH1-VL1-VH2-VL2가 배열되고; "디아바디" 구성에서, VL2-VL1-VH1-VH2 또는 VH2-VH1-VL1-VL2가 배열된다. GGGGS (서열 번호 24) 반복 또는 다른 서열을 갖는 적절한 링커가 면역글로불린 도메인 사이에 위치한다.
본 발명자들의 경험에서, 말레이미드 및 아지드기를 함유하는 펩티드 또는 PEG 링커는 장기간 저장시 말레이미드와 아지드 기 사이의 자동 커플링 반응으로 인해 중합될 수 있다. 따라서, 각각의 링커 유닛이 새로이 독립적으로 제조된 후, 표적화 또는 이펙터 요소를 링커 유닛에 연결하고, 지연없이 클릭 반응을 통해 링커 유닛의 커플링을 진행하는 것이 바람직하다. 대안적인 바람직한 실시양태는 표적화 요소 및 이펙터 요소가 모두 알킨기를 갖는 링커 유닛에 접합되고, 이어서 링커 유닛 중 하나의 알킨기가 양 말단에 아지드를 갖는 짧은 동종 이기능성 링커를 사용하여 아지드로 전환되는 것이다. 이어서 하나가 알킨을 갖고 다른 하나가 아지드를 갖는 링커 유닛이 클릭 반응을 통해 커플링된다. 또 다른 실시양태에서, 연결 팔의 자유 말단에 있는 작용기는 비닐 술폰이며, 이는 설프하이드릴 기와 반응하여 보통의 생리학적 pH에서 안정한 공유 결합을 형성한다.
본 발명에 바람직한 연결 팔은 PEG이다. 연결 팔의 길이는 몇 가지 고려 사항에 중요하다. 연결된 scFv 또는 다른 유형의 기능성 요소의 유연성이 입체적 제약없이 표적 세포 표면 상의 표적화된 항원 부위에 도달할 수 있을 정도로 길어야 하지만; 연결 팔 및 그의 연결된 scFv 단편 또는 기능성 요소의 분자 내 및 분자 간 엉킴을 유발하거나 조직 침투를 방해할 정도로 전체 분자 구조의 크기를 불필요하게 증가시키기에 충분히 길지 않아야 한다. 아폽토시스 또는 다른 세포 효과를 위한 신호 변환 과정을 개시하기 위해 클러스터가 필요한 경우, 너무 긴 연결 팔은 또한 항원 분자를 끌어당겨 압축된 클러스터를 형성하지 못할 수 있다. 표적 항원 및 이들 결합제의 상이한 유형의 조합에 대한 연결 팔의 최적의 길이는 과도한 실험없이 관련 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. NHS-(PEG)12-말레이미드 (또는 비닐 술폰) (약 500 달톤)의 연결 팔이 본 발명의 다수의 분자 구조물에서 바람직하다. 완전히 신장된 (PEG)12의 길이는 40 내지 50Å이다.
적용 가능한 연결 팔 및 커플링 팔은 PEG 쇄로 제한되지 않는다. 글리신, 세린 및 다른 아미노산 친수성 잔기, 및 다당류, 및 NHS 및 말레이미드 (또는 비닐 술폰)기를 함유하도록 변형된 다른 생체적합성 선형 중합체를 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다.
특정 치료적 적용을 위해, 본 개시의 분자 구조물에서의 이펙터 요소가 연결 팔로부터 방출되어, 이들이 표적화 요소에 의해 결합된 세포 또는 주변 세포를 포함하여 표적화된 부위에서의 세포로 들어가 약리학적 효과를 일으킬 수 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 절단 가능한 결합이 연결 팔에서 조작된다. 가수 분해, 산 노출, 환원 및 효소에 의해 절단되기 쉬운 절단 가능한 결합이 개발되었다. 예를 들어, 염증 조직에 존재하는 매트릭스 금속단백분해효소에 민감한 펩티드 분절이 치료용 구조물을 작제하는데 사용되어 왔다. 다양한 세포의 엔도좀 또는 리포좀에 존재하는 카텝신 B 또는 C에 민감한 펩티드 분절도 항체 약물 접합체의 링커에서 조작되어 왔다. 본 발명의 일 실시양태는 말레이미드 또는 비닐 술폰기 NHS-PEG2-12-S-S-말레이미드 (또는 비닐 술폰)에 인접한 S-S 결합을 갖는 PEG 링커를 사용하는 것이며, 여기서 S-S는 천천히 환원될 수 있는 디설파이드 결합이다.
본 개시의 일부 실시양태에 따라, 상기 언급된 실시양태에 기재된 표적화 요소는 성장 인자, 펩티드 호르몬, 사이토카인 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 이펙터 요소는 면역조절제, 예컨대 톨-유사 수용체 작용제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 치료 약물, 사이토카인, 가용성 수용체 또는 항체 또는 항체 단편이다.
일부 임의적인 실시양태에서, 항체 단편은 항원-결합 단편 (Fab), 가변 단편 (Fv), 단일쇄 가변 단편 (scFv), 단일 도메인 항체 (sdAb), 또는 이중 특이적 단일쇄 가변 단편 (bi-scFv) 형태이다. 일 실시양태에 따라, bi-scFv는 이중 특이적 탠덤 scFv 또는 이중 특이적 디아바디 scFv이다.
분자 구조물의 확산 능력을 유지하기 위해, 250,000 달톤보다 작은 분자 크기가 바람직하다. 따라서, 대부분의 실시양태에 대해 scFv가 바람직하다. DNA 수준에서, 유전자는 VL 및 VH가 글리신 및 세린이 주요 잔기인 10-25 아미노산 잔기의 펩티드 링커에 의해 양 순서 (VL-VH 또는 VH-VL)로 단일 폴리펩티드로서 연결되도록 구성된다. C-말단에서, 글리신 및 세린 잔기와 말단 잔기 C를 갖는 짧은 펩티드 연장이 조작된다. 펩티드 연장은 또한 다른 친수성 및 하전 아미노산 잔기, 예를 들어 H, K, R, N 및 Q 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 C 잔기의 SH기가 멀티-암 링커 유닛의 연결 팔과의 접합을 위해 자유롭게 접근 가능하도록 신장된 구성으로 펩티드 연장 및 말단 C 잔기를 제공하도록 도와줄 수 있다. 재조합 scFv 및 bi-scFv는 대장균 및 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)와 같은 박테리아, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 효모 또는 CHO 및 HEK293 세포주와 같은 포유동물 세포에서 생산될 수 있다.
본 발명자들은 시험관 내 시스템 및 동물 모델에서의 실험을 위해 HEK293 및 CHO 세포주에서 다수의 IgG 항체, Fab, scFv 및 다양한 항체 단편, Fc 기반 단백질 및 기타 재조합 항체를 생산하였다. 또한, 인간 임상 시험용 항체를 생산하기 위한 세포주를 개발하였다. HEK293 일시 발현 시스템이 연구 실험실에서 여러 1 내지 2 리터 플라스크를 사용하여 최대 1 그램의 IgG 또는 항체 단편을 생성하는데 편리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 분자 구조물에 사용되는 항체 단편은 일반적으로 탄수화물 변형을 갖지 않으며, 탄수화물 변형은 scFv의 그의 항원 표적에 대한 결합 활성에 필요하지 않다. 또한, 단 하나의 디설파이드 결합 및 하나의 말단 C만이 항체 단편에 존재한다. 따라서, scFv를 생산하기 위한 제조 대안으로서 소규모 박테리아 발현 시스템이 개발되었다. 대장균을 이용하여, 세포 내 봉입체, 주변 세포질 및/또는 분비된 형태로 scFv를 회수하기 위한 발현 시스템이 또한 사용되었다. scFv는 대부분의 경우 대부분의 κ 경쇄의 VH와 상호 작용하는 단백질 L과의 친화성 컬럼으로, 또는 다른 경우에는 이온 교환 컬럼으로 정제될 수 있다.
조인트-링커 플랫폼에 기반한 본 발명의 실시예는 표적화 및/또는 이펙터 요소로서 주로 scFv 및 Fab를 사용한다. 그러나, sdAb 또는 다른 항체 단편에 기초한 결합 분자의 대형 라이브러리로부터 특이적 결합 분자를 스크리닝할 수도 있다. 면역글로불린 도메인을 기반으로 하지 않지만 선택된 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 항체와 유사한 결합 분자의 라이브러리는 (1) 표적 분자에의 결합을 위해 선택된 올리고뉴클레오티드 또는 짧은 펩티드인 앱타머, (2) 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질인 파이노머, (3) 시스테인의 시스테인 단백질 억제제 패밀리로부터 유래된 결합 단백질인 아피머, 및 (4) 천연 안키린 단백질로부터 유래되고 이들 단백질의 3, 4 또는 5개의 반복 모티프로 이루어진 구조를 갖는 유전자 조작된 단백질인 DARPin (설계된 안키린 반복 단백질)을 포함한다. 이들 항체 모방체는 약 10K 내지 20K 달톤의 분자량을 갖는다.
II-(ii) 조인트-링커 분자 구조물과 함께 사용하기에 적합한 기능성 요소
상술한 바와 같이, 본 조인트 링커는 적어도 2개의 링커 유닛을 포함하고, 여기서 제1 링커 유닛은 하나 이상의 표적화 요소를 보유하고, 제2 링커 유닛은 하나 이상의 이펙터 요소 또는 약동학적 특성 향상 요소를 보유하고, 그 반대도 가능하다. 당업자는 목적하는 효과를 산출하기 위해 본 명세서의 파트 I-(ii)에서 선택된 제1 및 제2 요소에 따라 표적화 요소, 이펙터 요소 및/또는 약동학적 특성 향상 요소로서 적합한 기능성 요소를 선택할 수 있다.
II-(iii) 조인트-링커 분자 구조물의 용도
본 개시는 또한 적합한 조인트-링커 분자 구조물을 사용하여 다양한 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 본 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 실시양태에 따른 조인트-링커 분자 구조물을 투여하는 단계를 포함한다.
이해할 수 있는 바와 같이, 본 개시의 다른 측면(들) 또는 실시양태(들)와 관련하여 상기 기술된 기능성 요소의 예들이 본 분자 구조물에 적용 가능한데, 간결성을 위해 이들 예는 여기에서 반복되지 않는다.
하지만, 예시를 목적으로, 다양한 유형의 폐암 치료에 본 분자 구조물을 사용하는 것이 여기에서 논의된다. 다양한 유형의 폐암 환자를 치료하기 위해, 투여될 분자 구조물 또는 본 링커 유닛의 이펙터 요소는 다음과 같다:
1. 세포 독성 약물 - 머탄신, 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 피롤로벤조다이제핀 (PBD), 레날리도미드, 포말리도미드, 에리불린, 튜블리신 A, 튜블리신 B, 독소루비신, 칼리케아마이신 및 캄프토테신;
2. 면역자극제 - 톨-유사 수용체 작용제, 모노포스포릴 리피드 A; 또는
3. 면역 체크포인트 억제제: CTLA-4, PD-1 및 PD-L1에 특이적인 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체.
하기 실험 실시예는 본 발명의 특정 측면을 설명하고 당업자가 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 추가의 설명없이, 당업자는 본 명세서의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
실험예
실시예 1: 펩티드 코어로서의 펩티드 1 내지 4의 직접 합성
멀티-암 링커 유닛을 작제하는데 중심 코어로서 사용될 수 있는 접합기를 함유하는 4개의 펩티드가 설계되었다. 각각의 접합기 함유 펩티드 1 내지 4 (중국 상하이 소재 ChinaPeptide Co., Ltd.에서 주문 제조)를 표준 고상법으로 직접 합성한 후, Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D HPLC 시스템을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 95% 이상의 순도로 정제하였다. 역상 HPLC는 Kromasil 100-5C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5 μm)을 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 15 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 5% - 20% 아세토니트릴로 선형 구배하여 사용하였다.
펩티드 1 (순도: 95.52%)은 N- 및 C-말단이 화학적으로 변형된 서열 번호 1 (GGSGGSGGSKGSGSKGSK)의 펩티드 서열을 가졌다. 특히, 서열 번호 1의 N-말단은 4-펜티노산으로 아미드화함으로써 변형된 반면, C-말단은 메틸 알콜로 에스테르화되었다. 펩티드 2 (순도: 97.05%)는 N 및 C-말단이 2-아지도아세트산 및 메틸 알콜로 각각 변형된 서열 번호 2 (GGSGGSKGSKGSKGSKGSK)의 펩티드 서열을 가졌다. 펩티드 3 (순도: 98.71%)을 제조하기 위해, 서열 번호 3 (GSSGSSKGSGKGSGKGSGKGSGK)의 펩티드를 3-부티노산으로 N-말단 아미드화화고 아미드 수지를 사용하여 C-말단에 일차 아미드를 형성하였다. 유사하게, 펩티드 4 (순도: 95.95%)에 대해, 서열 번호 4 (GSSGSSGSSGSKGSGSKGSGSK)의 펩티드를 말단에서 엑소-5-노르보넨카복실산으로 아미드화하고, 이의 C-말단도 아미드화로 변형시켰다.
이렇게 합성된 펩티드를 각각 전기분무 이온화 질량 분석법 (ESI-MS) (API 150 EX Applied Biosystems)으로 확인하였다.
하기 예시된 본 발명의 펩티드 1 (서열 번호 1)은 1532.58 달톤의 분자량 (m.w.)을 가졌다.
Figure pct00024
하기 예시된 본 발명의 펩티드 2 (서열 번호 2)는 1734.84 달톤의 분자량 (m.w.)을 가졌다.
Figure pct00025
하기 예시된 본 발명의 펩티드 3 (서열 번호 3)은 2004.977 달톤의 분자량 (m.w.)을 가졌다.
Figure pct00026
하기 예시된 본 발명의 펩티드 4 (서열 번호 4)는 1935.98 달톤의 분자량 (m.w.)을 가졌다.
Figure pct00027
노르보넨-함유 펩티드 4의 정제된 샘플을 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 30 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 0% - 100% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Supelco C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5 μm)에서 역상 분석 HPLC를 사용하여 분석하고, 210 nm에서의 자외선 (UV) 흡광도 (OD210)를 측정하였다. 도 8A는 본 노르보넨 함유 펩티드 4의 역상 분석 HPLC 프로파일로서, 14.17 분의 체류 시간으로 노르보넨 함유 펩티드 4의 피크를 나타냈다 (화살촉 #2; 화살촉 #1은 용출된 용매의 피크임). 도 8B는 펩티드 4의 질량 분석법 MALDI-TOF 결과를 나타낸다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 질량 분석은 대만 타이페이 소재 Academia Sinica의 Mass Core Facility of Institute of Molecular Biology (IMB)에 의해 수행되었고; 측정은 Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF 질량 분석기 (독일 브레멘에 소재하는 Bruker Daltonics)에서 수행하였다.
실시예 2: 펩티드 코어로서 페길화된 펩티드 5의 직접 합성
하기에 예시된 바와 같이, 펩티드 5 (중국 상하이 소재의 Shanghai WuXi AppTech Co., Ltd., Ltd.에 의해 주문 제조됨)도 표준 고체상 방법을 사용하여 직접 합성하였으며, 여기서 서열 번호 5 (-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K)의 서열을 갖는 페길화된 펩티드가 N-말단에서 아지도아세트산에 의해, C-말단에서 메틸 알콜로 변형되었다. 본 발명자들은 펩티드를 설계하고 2개의 펩티드의 제조를 Shanghai WuXi AppTech Co., Ltd. (중국 상하이)에 위탁했다.
아지드-함유 페길화 펩티드 5를 Agilent Nexera-i 1200 HPLC-BE 시스템을 사용하여 역상 HPLC에 의해 97.58% 순도로 정제하였다. 역상 HPLC는 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 20 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 10% - 40% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Gemini-NX C18 컬럼 (150 mm × 4.6 mm; 5 μm)을 사용하였다. 도 9A는 아지드 함유 페길화 펩티드 5의 역상 분석 HPLC 프로파일로서, 아지드 함유 페길화 펩티드 5의 피크가 7.941 분의 체류 시간을 가짐을 나타낸다.
Figure pct00028
코어로서 아지드-함유 페길화 펩티드 5의 확인을 ESI-MS에 의해 수행하였다. 도 9B는 본 발명의 페길화된 펩티드 5가 아지드기를 가지는 하나의 커플링 팔을 보유하는 펩티드 코어임을 보여준다. ESI-MS의 결과는 본 분자 구조물의 m.w.가 996.6 달톤임을 나타낸다.
실시예 3: 펩티드 코어로서 펩티드 6 내지 10의 직접 합성
멀티-암 링커 유닛을 작제하는데 중심 코어로서 사용될 수 있는 접합기를 함유하는 5개의 펩티드가 설계되었다. 각각의 펩티드 6 내지 10을 표준 고상법으로 직접 합성하였다 (펩티드 6 및 10은 ChinaPeptide Co., Ltd.에서 주문 제조하고; 펩티드 7 내지 9는 중국 닝보에 소재한 NingBo KareBay Co., Ltd.에서 주문 제조하였다).
펩티드 6 (하기 예시) 또한 서열 번호 2 (GGSGGSKGSKGSKGSKGSK)의 아미노산 서열을 가졌지만, 이의 N-말단은 아지도-Xaa5-산으로 변형되었고, C-말단은 C-말단 아미드화로 변형되었다. 중심 코어로서, 펩티드 6은 GS 서열을 갖는 스페이서에 의해 분리된 5개의 K 잔기를 갖고, N-말단에서의 아지도기는 상응하는 반응성 기를 갖는 요소 또는 다른 링커 유닛과 클릭 반응될 수 있다.
Figure pct00029
펩티드 6의 정제된 샘플을 35 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 12 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 15% - 30% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Kromasil 100-5 C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5μm)에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다.
이렇게 합성된 펩티드 6을 ESI-MS를 사용하여 조사하였다. ESI-MS의 결과는 본 분자 구조물의 분자량이 1954.15 달톤임을 나타내었다.
아래에 예시된 바와 같이, GGSGGSGGSKGSGSKGSK (서열 번호 1)의 서열을 갖는 펩티드 7은 N-말단에서 디벤조사이클로옥틴산 (DBCO-산)으로 변형되고 C-말단에서 아미드 수지를 사용하여 아미드화되었다. 펩티드 7은 중심 코어로서 작용하며, 그의 N-말단에 요소 또는 링커 유닛과의 클릭 반응을 위한 하나의 DBCO기를 갖는다.
Figure pct00030
DBCO-함유 펩티드 7의 정제된 샘플을 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 30 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 0% - 73% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Supelco C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5μm)에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하고; UV 흡광도를 300 nm에서 측정하였다. 도 10A는 DBCO-함유 펩티드 7의 역상 분석 HPLC 프로파일로서, 19.166 분의 체류 시간으로 피크를 가짐을 보여준다.
이렇게 합성된 DBCO-함유 펩티드 7을 MALDI-TOF를 사용하여 조사하였다. 도 10B는 DBCO-함유 펩티드 7의 분자량이 1734.73 달톤임을 보여준다.
하기에 나타낸 바와 같이, SKSKSK (서열 번호 6)을 갖는 펩티드 8은 N-말단에서 아지도-Xaa6-산에 의해 변형되고 C-말단에서 아미드 수지에 의해 아미드화되었다. 펩티드 8 (아래 예시됨)은 동일한 스페이서 서열 (즉, 단일 S 잔기)로 분리된 3개의 K 잔기를 포함한다. 이 아지드 함유 펩티드 8의 m.w.는 1024.17 달톤이었다.
Figure pct00031
하기에 예시된 바와 같이, 펩티드 9는 KKK의 서열 (즉, K 잔기 사이에 스페이서가 없음)을 가지며, 여기서 N-말단은 프로파길-Xaa6 산에 의해 변형되고, 이의 C-말단은 C-말단 일차 아미드화로 변형되었다. 도 11A에서의 데이터는 알킨-펩티드 9의 m.w.가 732.454 달톤임을 나타낸다.
Figure pct00032
하기에 나타낸 바와 같이, 펩티드 10의 N-말단 (KSKGK; 서열 번호 7)을 아세트산으로 변형시키고, 이의 C-말단을 아민-Xaa8-아지드로 변형시켰다. 중심 코어로서, 펩티드 10은 요소 또는 링커 유닛과의 클릭 반응을 위해 C-말단에 하나의 아지도기와 N-말단에서 아미노기를 차단하기 위한 하나의 아세틸기를 갖는다. 펩티드 10은 3개의 K 잔기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 K 잔기 사이의 스페이서는 S이고, 제2 및 제3 K 잔기 사이의 스페이서는 G이다. 도 11B는 펩티드 10의 분자량이 1009 달톤임을 나타낸다.
Figure pct00033
실시예 4: 멀티-암 링커 유닛을 작제하기 위한 펩티드 코어로서 이중 접합기 함유 펩티드 11 (서열 번호 8)의 직접 합성
하기 예시된 바와 같이, 펩티드 11은 GGSGGSKGSSGKGGSGGS (서열 번호 8)의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 N-말단은 엑소-5-노르보넨카복실산에 의해 변형되고, C-말단은 3-아지도프로필아민으로 변형되었다. 중심 링커 유닛을 작제하는데 중심 코어로서 작용하는 펩티드 11 (아래에 예시됨)은 클릭 반응을 통해 하나의 요소 또는 링커 유닛을 커플링하기 위해 N-말단에 엑소-5-노르보닐기를 갖고, 클릭 반응을 통해 다른 요소 또는 링커 유닛을 커플링하기 위해 C-말단에 아지도기를 가진다. 이중 접합기 함유 펩티드 11은 ChinaPeptide Co., Ltd.에서 주문 합성하였다.
Figure pct00034
실시예 5: 콜레시스토키닌 옥타펩티드 (CCK8) 분절 (서열 번호 9)의 합성
CCK8-함유 펩티드는 CGGGGSDYMGWMDF (서열 번호 9)의 서열을 갖고, N-말단에서 아세트산에 의해 변형되고, 이의 C-말단에서 아미드 수지에 의해 아미드화되었다. CCK8-함유 펩티드는 이의 N-말단이 시스테인 잔기로서 6개 아미노산 잔기 (CGGGGS; 서열 번호 10)의 연속적인 N-말단 연장을 갖는 CCK의 8-아미노산 잔기로 구성되도록 설계되었다. N-말단 시스테인 잔기는 본 개시에 따른 링커 유닛의 PEG-말레이미드 연결 팔과의 접합을 위한 SH기를 제공한다. 이 펩티드는 ChinaPeptide Co., Ltd.에서 주문 합성하였다.
이렇게 합성된 CCK8 함유 펩티드를 ESI-MS를 사용하여 조사하였다. 생성물을 질량 분석법 ESI (도 12A)에 의해 분석하였고, 데이터는 (ESI-TOF) m/z: [M+H]+ - C65H86N16O21S3에 대한 계산치가 1523.67이고; 실측치가 1523.5418임을 나타내었다. 또한 MS 스펙트럼에서는 1524.5448, 1525.5458 1526.5458, 및 1527.5458에서 4개의 동위원소 피크를 볼 수 있으며 이는 각각 [M+H+1]+, [M+H+2]+, [M+H+3]+ 및 [M+H+4]+에 해당한다.
실시예 6: Mal-PEG 6 -NHS와 CCK8-함유 펩티드의 접합
CCK8-함유 펩티드의 티올기를 이종이기능성 가교제인 Mal-PEG6-NHS와 반응시켰다. 펩티드는 10 mM의 최종 농도에서 100% DMSO에 용해되는 반면, 이종이기능성 가교제인 Mal-PEG6-NHS는 250 mm의 최종 농도에서 100% DMSO에 용해되었다. Mal-PEG6-NHS 가교제를 10 mM 최종 농도 (10 mM 펩티드 용액에 대해 1배 몰 과량)로 용해된 펩티드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
CCK8-PEG6-NHS를 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 30 분에 걸쳐 3.0 ml/분의 유속으로 30% - 100% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Supelco C18 컬럼 (250 mm × 10 mm; 5μm)에서 역상 분석 HPLC에 의해 정제하였다. 254 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 DM1-PEG6-NHS의 역상 HPLC의 용출 프로파일을 모니터링하였다.
이렇게 합성된 CCK8-PEG6-NHS (하기 예시됨)를 질량 분석 ESI를 이용하여 분석하였다 (도 12B). 데이터는 (ESI-TOF) m/z: [M+2H]2+ - C91H125N19O34S3에 대한 계산치가 2125.28이고; 실측치가 2123.79임을 나타내었다. 또한 MS 스펙트럼에서는 1063.398, 1063.8978, 1064.4003, 1064.9022 및 1065.4061에서 6개의 동위원소 피크를 볼 수 있으며 이는 각각 [M+2H+1]2+, [M+2H+2]2+, [M+2H+3]2+, [M+2H+4]2+ 및 [M+2H+5]2+에 해당한다.
실시예 7: Mal-PEG 6 -CO 2 H와 머탄신 (DM1)의 접합
DM1을 중국 홍콩의 ALB Technology Inc.에서 구입하였다. 이종이기능성 가교제에 대한 SH 기를 가지는 DM1의 접합 및 생성물의 정제는 이전 실시예에 기재된 것과 유사하였다.
간략하게, DM1 분자의 티올기를 이종이기능성 가교제인 Mal-PEG6-CO2H와 반응시켰다. DM1은 10 mM의 최종 농도에서 100% DMSO에 용해된 반면, Mal-PEG6-CO2H는 250 mM의 최종 농도에서 100% DMSO에 용해되었다. Mal-PEG6-CO2H 가교제를 10 mM의 최종 농도 (10 mM DM1 용액에 대한 1배 몰 과량)로 용해된 DM1 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
Figure pct00035
DM1-PEG6-CO2H를 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 30 분에 걸쳐 3.0 ml/분의 유속으로 30% - 100% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Supelco C18 컬럼 (250 mm × 10 mm; 5μm)에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다. DM1-PEG6-CO2H의 역상 HPLC의 용출 프로파일은 DM1-PEG6-CO2H의 용출 피크가 11.5 분의 체류 시간을 가짐을 나타내었고, 이는 254 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 모니터링되었다. 이렇게 합성된 DM1-PEG6-CO2H의 질량 분광 분석 결과 (상기 예시), 이 분자 구조물의 m.w는 1242.429 달톤인 것으로 나타났다.
실시예 8: 펩티드 코어로서 펩티드 7 및 연결 팔로서 TFP-PEG 12 -Mal 또는 NHS-PEG 6 -Mal을 갖는 DBCO-함유 링커 유닛의 합성
본 실시예에서, PEG12-말레이미드의 3개의 연결 팔을 펩티드 코어 DBCO-펩티드 7에 접합시켰다. 가교제, TFP-PEG12-말레이미드 [알파-말레인이미도-오메가-(2.3.5.6-테트라플루오로페닐-프로피온아미도)-도데카에틸렌글리콜]에스테르는 QuantaBiodesign Inc (Plain City, USA)에서 구입하였다. 접합 과정을 제조사의 지시에 따라 수행하였다; K 잔기를 갖는 펩티드를 10 mM의 최종 농도로 100% DMSO에 용해시켰다. TFP-PEG12-말레이미드 가교제를 60 mM의 최종 농도 (10 mM 펩티드 용액에 대해 6배 몰 과량)로 용해된 펩티드에 첨가하였다. 촉매, 유기 염기 DABCO (1,4-디아자비사이클로[2.2.2]옥탄) (5 당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 18 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
하기에 예시된 바와 같이, 이렇게 합성된 말레이미드-PEG12-접합 DBCO-펩티드 7은 DBCO기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 말레이미드기를 갖는 3개의 PEG 연결 팔을 보유하였다; 도 13A는 질량 분석법 MALDI-TOF의 결과를 도시하며, 이는 본 분자 구조물의 m.w.가 3978 달톤임을 나타내었다.
Figure pct00036
PEG6-말레이미드의 3개의 연결 팔을 펩티드 코어 DBCO-펩티드 7에 접합시켰다. 가교제, NHS-PEG6-말레이미드 (숙신이미딜-[(N-말레이미도-프로피온아미도)-헥사에틸렌글리콜])에스테르는 Conju-probe Inc.로부터 구입하였다. 접합 과정을 제조사의 지시에 따라 수행하였다; K 잔기를 갖는 펩티드를 10 mM의 최종 농도로 100% DMSO에 용해시켰다. NHS-PEG6-말레이미드 가교제를 60 mM의 최종 농도 (10 mM 펩티드 용액에 대해 6배 몰 과량)로 용해된 펩티드에 첨가하였다. 촉매, 유기 염기 DABCO (5 당량)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 18 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
이렇게 합성된 말레이미드-PEG6-접합 아지드-펩티드 7은 DBCO기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 말레이미드기를 갖는 3개의 PEG 연결 팔을 보유하였다. 결과는 분자량이 3186.687 달톤임을 나타내었다 (도 13B).
실시예 9: 아지드-함유 펩티드 8의 NH 2 기에 NHS-PEG 6 -Mal을 접합시키는 것에 의한 멀티-암 링커 유닛의 합성
가교제의 접합을 상기 실시예에 기재된 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이렇게 합성된 PEG6-말레이미드-접합 아지드-펩티드 8을 MALDI-TOF를 사용하여 조사하였다.
하기에 예시된 바와 같이, 이렇게 합성된 말레이미드-PEG6-접합 아지드-펩티드 8은 아지드기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 말레이미드기를 갖는 3개의 PEG 연결 팔을 보유하였다; 도 14는 질량 분석법 MALDI-TOF의 결과를 도시하며, 이는 본 분자 구조물의 m.w.가 1024.627 달톤임을 나타내었다.
Figure pct00037
실시예 10: 알킨-함유 펩티드 9의 NH 2 기에 NHS-PEG 6 -Mal을 접합시키는 것에 의한 멀티-암 링커 유닛의 합성
가교제의 접합을 상기 실시예에 기재된 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 이렇게 합성된 PEG6-말레이미드-접합 알킨-펩티드 9를 MALDI-TOF를 사용하여 조사하였다.
하기에 예시된 바와 같이, 이렇게 합성된 말레이미드-PEG6-접합 알킨-펩티드 9는 알킨기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 말레이미드를 갖는 3개의 PEG 연결 팔을 보유하였다; 도 15는 질량 분석법 MALDI-TOF의 결과를 도시하며, 이는 본 분자 구조물의 m.w.가 2194.13 달톤임을 나타내었다.
Figure pct00038
실시예 11: 펩티드 코어로서 펩티드 12 (서열 번호 11) 및 연결 팔로서 RSGSSG (서열 번호 12)를 갖는 노르보넨 함유 링커 유닛의 직접 합성
펩티드 코어로서 펩티드 12 및 연결 팔로서 펩티드 RSGSSG (서열 번호 12)를 갖는 노르보넨 함유 링커 유닛을 표준 Fmoc 화학을 사용하여 수동 합성에 의해 직접 합성하였다. 하기 예시된 바와 같이, 연결 팔의 N-말단은 페닐말레이미드기에 의해 변형되었다. 본 발명자들은 링커 유닛을 설계하고, 페닐말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 노르보넨-함유 링커 유닛의 생산을 ONTORES Co., Ltd. (중국 항저우)에 위탁했다.
Figure pct00039
페닐말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 노르보넨-함유 링커 유닛의 정제된 샘플을 30 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 20 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 27% - 47% 아세토니트릴로 선형 구배하여 C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5 μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다.
페닐말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 노르보넨-함유 링커 유닛의 확인을 질량 분석법 ESI-MS에 의해 수행하였다.
페닐말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 본 노르보넨-함유 링커 유닛은 노르보넨기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 이의 자유-말단에 페닐말레이미드 변형을 각각 갖는 3개의 연결 팔을 보유하는 펩티드 코어 기반 링커 유닛이었다. 이렇게 합성된 링커 유닛의 질량 분석 결과, [M+3H]3+에 해당하는 966에서 강한 분자 이온을 나타내었고, 링커 유닛의 실제 분자량은 2895 달톤인 것으로 나타났다.
실시예 12: 펩티드 코어로서 펩티드 13 (서열 번호 1) 및 연결 팔로서 RSGSSG (서열 번호 12)를 갖는 알킨-함유 링커 유닛의 직접 합성
펩티드 코어로서 펩티드 13 및 연결 팔로서 RSGSSG (서열 번호 12)를 갖는 알킨-함유 링커 유닛을 표준 Fmoc 화학을 사용하여 수동 합성에 의해 직접 합성하였다. 하기에 예시된 바와 같이, 펩티드 13의 N- 및 C-말단은 각각 4-펜티노산에 의해 아미드화되고 메틸 알콜에 의해 에스테르화되었으며; 연결 팔의 N-말단은 3-말레이미도프로피온산에 의해 변형되었다. 본 발명자들은 링커 유닛을 설계하고 말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 알킨-함유 링커 유닛의 생산을 Shanghai ChinaPeptide Co., Ltd. (중국 상하이)에 위탁했다.
말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 알킨-함유 링커 유닛의 정제된 샘플을 35 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 15 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 5% - 48% 아세토니트릴로 선형 구배하여 kromasil 100-5 C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5 μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다. 도 16은 말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 알킨-함유 링커 유닛의 역상 HPLC 프로파일이며, 여기서 피크는 화살촉으로 표시된다.
말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 알킨-함유 링커 유닛의 확인을 질량 분석법 MALDI-TOF에 의해 수행하였다.
말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 본 알킨-함유 링커 유닛은 알킨기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 이의 자유-말단에 말레이미드 변형을 각각 갖는 3개의 연결 팔을 보유하는 펩티드 코어 기반 링커 유닛이었다. 도 17은 질량 분석법 MALDI-TOF의 결과를 도시하며, 이는 본 분자 구조물의 m.w.가 3583.701 달톤임을 나타내었다.
Figure pct00040
실시예 13: 펩티드 코어로서 펩티드 14 (서열 번호 13) 및 연결 팔로서 SGSSGSSG (서열 번호 14)를 갖는 메틸테트라진 함유 링커 유닛의 직접 합성
펩티드 코어로서 펩티드 14 및 연결 팔로서 SGSSGSSG (서열 번호 14)를 갖는 메틸테트라진 함유 링커 유닛을 표준 Fmoc 화학을 사용하여 수동 합성에 의해 직접 합성하였다. 아래에 예시된 바와 같이, 연결 팔의 N-말단은 3-말레이미도프로피온산에 의해 변형되었다. 본 발명자들은 링커 유닛을 설계하고 말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 메틸테트라진-함유 링커 유닛의 생산을 Shanghai WuXi AppTech Co., Ltd.에 위탁하였다.
말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 메틸테트라진 함유 링커 유닛의 정제된 샘플을 30 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 20 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 10% - 40% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Gemini-NX 5u C18 컬럼 (150 mm × 4.6 mm; 4 μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다.
Figure pct00041
말레이미드-변형된 연결 팔을 가지는 메틸테트라진 함유 링커 유닛의 확인을 질량 분석법 MALDI-TOF에 의해 수행하였다.
말레이미드-변형된 연결 팔을 갖는 본 발명의 메틸테트라진 함유 링커 유닛은 메틸테트라진기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 이의 자유-말단에 말레이미드 변형을 갖는 3개의 연결 팔을 각각 갖는 펩티드 코어 기반 링커 유닛이었다. 질량 분석법 MALDI-TOF의 결과 본 분자 구조물의 m.w.는 1038 달톤이었다.
실시예 14: DBCO-함유 펩티드 7의 NH 2 기에 NHS-PEG 6 -CCK8의 접합
이 실시예는 3개의 PEG6-CCK8이 펩티드 코어 DBCO-함유 펩티드 7에 접합되었음을 보여 주었다. NHS-PEG6-CCK8은 이전 실시예에서 제조되었다.
접합 과정을 제조사의 지시에 따라 수행하였다; K 잔기를 갖는 펩티드를 1 mM의 최종 농도로 100% DMSO에 용해시켰다. 상기 실시예에서 제조된 NHS-PEG6-CCK8을 6 mM의 최종 농도 (1 mM 펩티드 용액에 대해 6배 몰 과량)로 용해된 펩티드에 첨가하였다. 촉매, 유기 염기 DABCO (50 당량)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 18 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. CCK8-PEG6-접합 DBCO-펩티드 7을 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 28 분에 걸쳐 27.0 ml/분의 유속으로 0% - 73% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Princeton SPHER-300 C18 컬럼 (250 mm × 30 mm; 300Å; 5μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다.
하기에 예시된 바와 같이, 이렇게 합성된 CCK8-PEG6-접합 DBCO-펩티드 7은 DBCO기를 갖는 하나의 커플링 팔 및 CCK8 펩티드를 갖는 3개의 PEG 연결 팔을 보유하였다. 데이터는 (ESI-TOF) m/z: [M+H]+ - C334H470N77O119S9에 대한 계산치가 7751.0574이고; 실측치가 7751.0533임을 나타내었다. 또한 MS 스펙트럼에서는 7752.0714, 7753.0759, 7754.0818, 7755.0820, 7756.0849, 7757.0353, 7758.0647, 7759.0844 및 7760.0636에서 9개의 동위원소 피크를 볼 수 있으며 이는 각각 [M+H+1]+, [M+H+2]+, [M+H+3]+, [M+H+4]+, [M+H+5]+, [M+H+6]+, [M+H+7]+, [M+H+8]+ 및 [M+H+9]+에 해당한다 (도 18).
Figure pct00042
실시예 15: 아지드-함유 펩티드 2의 NH 2 기에 CO 2 H-PEG 6 -DM1의 접합
합성된 아지드-함유 펩티드 2 (중국 상하이 소재 Chinapeptide Inc.)를 10% M의 최종 농도로 100% DMSO에 용해시켰다. CO2H-PEG6-DM1은 이전 실시예에서 제조되었다.
아지드-함유 펩티드 2 및 유기 염기 DMAP를 100% CH2Cl2에서 1/15 몰비로 혼합하였다. CO2H-PEG6-DM1을 아지드-함유 펩티드 2에 접합시키기 전에, 에틸(디메틸아미노프로필)카보디이미드 (EDC)를 100% CH2Cl2에서 1/2 (CO2H-PEG6-DM1:EDC)의 몰비로 CO2H-PEG6-DM1 용액에 첨가한 다음, CO2H-PEG6-DM1 분자의 CO2H기를 활성화시키기 위해 인큐베이션하였다. 이어서, EDC-활성화된 CO2H-PEG6-DM1을 100% CH2Cl2에서 1/6의 최종 몰비 (아지드-함유 펩티드 2:CO2H-PEG6-DM1)로 아지드-함유 펩티드 2 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
아지드-함유 펩티드 2를 25 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 30 분에 걸쳐 3.0 ml/분의 유속으로 0% - 100% 아세토니트릴로 선형 구배하여 Supelco C18 컬럼 (250 mm × 10 mm; 5μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다.
도 19는 다섯 DM1 분자와 접합된 아지드-함유 펩티드 2의 역상 HPLC 용출 프로파일을 나타내며, 17.8 분의 체류 시간으로 피크를 가졌다. 도 20은 다섯 DM1 분자와 접합된 합성된 아지드-함유 펩티드 2의 질량 분광 분석을 나타내며 (이하 참조), 이 분자 구조물의 m.w.가 7856.2 달톤임을 나타내었다.
Figure pct00043
실시예 16: CCK8 펩티드로 펩티드 코어로서 아지드-함유 펩티드 15 (서열 번호 15) 및 표적화 요소-연결 팔로서 EGGGGSDYMGWMDF (서열 번호 16)를 갖는 CCK8-함유 표적 번들의 직접 합성
본 실시예에서, CCK8-함유 표적 번들을 합성하였다. 약물 번들 (하기 예시됨)은 아지드-함유 펩티드 15 (펩티드 코어로서) 및 EGGGGSDYMGWMDF (서열 번호 16)의 서열을 갖는 4개의 분지형 팔을 함유하였다. 상기 분지형 팔은 이의 자유 말단에 일차 아미드 변형을 갖는 연결 팔 서열 (EGGGGS; 서열 번호 17) 및 CCK 옥타펩티드 (DYMGWMDF; 서열 번호 18)로 이루어진다. CCK8-함유 표적 번들은 표준 Fmoc 화학을 사용하여 수동 합성에 의해 합성되었다. 본 발명자들은 CCK8-표적화 번들을 설계하고 팩킹된 링커 유닛의 생산을 Shanghai ChinaPeptide Co., Ltd. (중국 상하이)에 위탁하였다.
Figure pct00044
이 CCK8-함유 표적 번들의 정제된 샘플을 35 ℃의 컬럼 온도에서 이동상으로 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산을 15 분에 걸쳐 1.0 ml/분의 유속으로 35% - 84% 아세토니트릴로 선형 구배하여 kromasil 100-5 C18 컬럼 (250 mm × 4.6 mm; 5 μm) 상에서 역상 분석 HPLC에 의해 분석하였다. 도 21의 역상 HPLC 프로파일은 CCK8-표적 번들의 용출 피크가 체류 시간이 8.988 분임을 나타내었고; 254 nm에서 UV 흡광도 측정을 수행하였다. CCK8-함유 표적 번들의 순도는 95.25%였다.
이 CCK8-함유 표적 번들의 확인을 질량 분석법 ESI-TOF에 의해 수행하였다. 도 22는 질량 분광 분석법 ESI-TOF의 결과를 도시하며, 이는 본 분자 구조물의 m.w.가 1608.6944 달톤 (ESI-TOF) m/z (z=5): [M + 5H]5+임을 나타내었다.
실시예 17: Expi293F 과발현 시스템에 의한 인간 CD3에 특이적인 scFv의 생산
돌연변이화 테플리주맙의 scFv를 생성하기 위해, 추가 코돈 최적화없이 인간화 항체의 VH 및 VL DNA 서열을 사용하였다. VH-GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열 번호 19)-VL-(GGGGS)2 (서열 번호 20)-C를 암호화하는 DNA 서열을 합성하였다. 돌연변이화 테플리주맙 항체 분자는 VH의 CDR3에 시스테인 잔기를 함유하며, 이는 상기 설명된 바와 같이 SH-말레이미드 접합을 방해한다. 따라서 본 발명자들은 시스테인 잔기를 세린 잔기로 대체함으로써 돌연변이화 테플리주맙을 제조하였다. 본 발명의 실험을 위해 제조된 인간 CD3에 특이적인 scFv의 아미노산 서열은 서열 번호 21에 제시되어 있다.
포유동물 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 제조하기 위해, 본 발명자들은 Expi293F™ 세포주에 기초한 과발현 시스템을 사용하였다. 시스템은 Expi293F™ 세포주, 양이온성 지질 기반 ExpiFectamine™ 293 시약 및 ExpiFectamine™ 293 형질감염 증강인자 1 및 2로 이루어진 ExpiFectamine™ 293 형질감염 키트 (Life Technologies, USA, Carlsbad, USA) 및 발현 시스템의 일부인 배지 (Gibco, New York, USA)를 사용하였다.
유전자-암호화 서열을 pcDNA3 발현 카세트에 도입하였다. Expi293F 세포를 Expi293F 발현 배지에 2.0 × 106 생존 세포/ml의 밀도로 시딩하고 형질감염 전에 세포가 형질감염 시점에서 활발하게 분열되도록 하기 위해 18 내지 24 시간 동안 유지시켰다. 형질감염시, 2-리터 엘렌마이어 진탕 플라스크 내 255-ml 배지 중의 7.5 × 108 세포를 ExpiFectamine™ 293 형질감염 시약으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 궤도식 진탕기 (125 rpm)에서 형질감염 후 16 내지 18 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고, 진탕 플라스크에서 세포에 ExpiFectamine™ 293 형질감염 증강인자 1 및 증강인자 2를 첨가하고, 5 내지 6 일 동안 인큐베이션하였다. 배양 상등액을 수거하고 배지에서 발현된 scFv 재조합 단백질을 단백질 L 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
MALDI-TOF 질량 분석 결과 scFv의 m.w.는 27643 달톤인 것으로 나타났다. CD3에 특이적인 돌연변이화 테플리주맙 scFv의 순도를 12% SDS-PAGE의 쿠마시 염색을 통해 확인하였다. 도 23A는 돌연변이화 테플리주맙의 정제된 scFv의 SDS-PAGE 분석을 보여준다.
실시예 18: 주르카트 (Jurkat) T 세포주 상의 인간 CD3에 대한 돌연변이화 테플리주맙 scFv의 결합을 조사하기 위한 염색 분석
돌연변이화 테플리주맙이 CD3를 발현하는 인간 T 림프구에 결합하는 능력을 주르카트 T 세포주로 연구하였다. 돌연변이화 테플리주맙을 주르카트 T 세포주에서 인간 CD3 분자에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. 주르카트 세포는 세포 표면에서 T 세포 수용체 (TcR)/CD3 복합체를 발현하는 인간 T 림프구 세포의 불멸화주이다.
2 × 106 주르카트 T 세포를 얼음상에서 1% FBS 및 0.1% 소듐 아지드를 함유하는 PBS 중 0.1 및 1 μg/ml의 scFv와 함께 30 분 동안 인큐베이션하여 검정을 수행하였다. 세포를 세척하고 PBS/FBS에서 1:200으로 희석된 FITC-접합 단백질 L (ACROBiosystems Inc., Newark, USA)과 함께 4 ℃에서 30 분 동안 암소에서 인큐베이션하였다. 단백질 L-FITC 및 FITC-접합된 토끼 항-마우스 IgG.Fc (AbD Serotec)를 이차 항체로 사용하였다. 이차 항체 단독의 염색이 음성 대조군이었다. 인간 CD3에 특이적인 마우스 모노클로날 항체인 OKT3을 양성 대조군으로 사용하였다. 세포 염색을 FACS (FACSCanto II; BD Biosciences)에 의해 분석하였다. 히스토그램의 x 축은 형광 강도이다. 도 23B는 돌연변이화 테플리주맙이 T 세포에 결합하였음을 보여준다.
실시예 19: CD3에 특이적인 DBCO-scFv의 제조
서열 번호 12를 암호화하는 DNA 서열을 상기 실시예에서와 같이 합성하고 발현시켰다. CD3에 특이적인 scFv의 VH 및 VL의 서열은 돌연변이화 테플리주맙의 VH 및 VL의 서열이었다. Mal-PEG5-DBCO (Conju-probe, Inc.)와의 접합을 위해, 돌연변이화 테플리주맙의 정제된 scFv의 C-말단에 있는 시스테인 잔기를 완만히 진탕하면서 실온에서 3 시간 동안 1:1 ([TCEP]:[scFv])의 몰비로 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)으로 환원시켰다. 환원된 항-CD3 scFv의 완충액을 4 ℃에서 NAP-10 세파덱스 G-25 컬럼을 사용하여 HEPES 완충액 (100 mM HEPES, pH7.0, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 5 mM EDTA)으로 교환하였다. 환원 반응 및 완충액 교환 후, 1:1의 반응 몰비 ([Mal-PEG5-DBCO:[scFv]])로 실온에서 1 시간 동안 접합을 수행하였다. 과량의 가교제를 탈염 칼럼으로 제거하고, DBCO-접합된 scFv 산물을 분석하였다.
질량 분석법 MALDI-TOF 분석의 결과 CD3에 특이적인 DBCO-접합된 scFv의 샘플의 m.w.가 28148 달톤인 것으로 나타났다. CD3에 특이적인 DBCO-접합된 scFv의 순도를 12% SDS-PAGE의 쿠마시 염색을 통해 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 도 23C는 CD3 및 항-CD3 scFv 에 특이적인 DBCO-접합된 scFv의 유세포 분석 결과를 나타낸다(양성 대조군). 결과는 비접합된 scFv와 마찬가지로, CD3에 특이적인 본 DBCO-접합된 scFv도 또한 T 세포에 결합됨을 입증하였다.
실시예 20: CCK-타입 B 수용체-발현 종양 세포주에 대한 CCK8 펩티드 분자의 결합을 보여주는 염색 분석
CCK8 펩티드 분자를 Panc-1 종양 세포주에서 인간 CCK8-타입 B 수용체 분자에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. Panc-1은 췌장 암종으로부터 확립되었으며, 이는 56세 백인 개인으로부터의 췌십이지장 절제술 표본을 통해 추출되었다. 이 세포주의 악성 종양은 시험관 내 및 생체 내 분석을 통해 확인되었다.
염색하기 전에, Cys-함유 CCK8 펩티드를 말레이미드-FITC와 접합시켜 FITC를 가지는 검출 CCK8 분자로서 FITC-표지된 CCK8 펩티드를 생성하였다. 이어서, 2 × 106 Panc-1 세포를 암소에서 30 분 동안 얼음상에서 1% FBS 및 1% 소듐아지드와 PBS 중 CCK8-FITC 분자의 반응 혼합물 150 μg/ml와 함께 인큐베이션하여 검정을 수행하였다. 말레이미드-FITC 단독 염색이 음성 대조군으로 사용되었다. 세포의 염색을 FACS (FACSCanto II; BD Biosciences)에 의해 분석하였다. 히스토그램의 x 축은 형광 강도이다. 도 24에서, 어두운 영역은 Panc-1 세포의 형광 분포 배경을 나타내고, 점선은 말레이미드-FITC로 염색된 Panc-1 세포의 형광 분포이고, 어두운 선은 CCK8-FITC로 염색된 Panc-1 세포의 형광 분포이다. 염색 분석의 결과 FITC-표지된 CCK8 펩티드 분자가 Panc-1 세포에 결합한 것으로 나타났다.
실시예 21: 이펙터 요소로서 CD3에 특이적인 1개의 scFv 및 4개의 팔 CCK8 함유 표적 번들을 갖는 분자 구조물의 제조
본 실시예에서는, 전술한 실시예의 CCK8-함유 표적화 링커 유닛 및 CD3에 특이적인 DBCO-scFv의 이펙터 요소를 SPAAC 반응을 통해 커플링하였다. 전술한 바와 같이, 표적화 링커 유닛은 서열 번호 16의 서열 및 하나의 자유 아지드기를 갖는 분지형 팔을 가졌다.
SPAAC 반응을 위한 공정은 제조사의 설명서 (Conju-Probe Inc.)에 따라 수행하였다. 요약하면, 표적화 링커 유닛 (12.4 mg/ml) 113 ㎕를 1:1 ([아지드]:[DBCO])의 몰비로 이펙터 요소를 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다.
아래에 예시된 바와 같이, 생성물은 이펙터 요소로서 CD3에 특이적인 하나의 scFv 및 CCK8을 함유하는 4개의 팔을 갖는 단일 링커 유닛 분자 구조물이었다. 접합 후 반응 혼합물의 SDS-PAGE 분석 결과, 본 분자 구조물의 크기가 예상된 크기와 일치하는 것으로 나타났다.
Figure pct00045
실시예 22: 3개의 CCK8 펩티드 분자를 갖는 표적 링커 유닛 및 5개의 DM1 분자를 갖는 이펙터 링커 유닛으로 구성된 조인트-링커 분자 구조물의 제조
SPAAC 반응을 수행하는 공정은 이전 실시예에 기술된 바와 같이 수행되었다.
본 실시예에서는, 3개의 CCK 펩티드 분자 및 1개의 자유 DBCO기를 갖는 표적화 링커 유닛 및 5개의 DM1 분자 및 1개의 자유 아지드기를 갖는 이펙터 링커 유닛 (약물 번들)을 전술한 실시예에 기재된 바와 같이 SPAAC 반응을 통해 커플링시켰다. 3개의 CCK8 펩티드 및 5개의 DM1 분자를 갖는 하나의 약물 번들을 갖는 생성된 조인트-링커 분자 구조물이 하기에 예시되어 있다. 데이터는 (ESI-TOF) m/z: [M+H]+ - C686H993N129O246S14Cl5Na1에 대한 계산치가 15632.07이고; 실측치가 15630.6186임을 나타내었다. 또한 MS 스펙트럼에서는 15631.6699, 15632.6877, 15633.5712, 15634.4507, 15635.5302 및 15637.6933에서 6개의 동위원소 피크를 볼 수 있으며 이는 각각 [M+H+1]+, [M+H+2]+, [M+H+3]+, [M+H+4]+, [M+H+5]+및 [M+H+6]+ 에 해당한다 (도 25).
Figure pct00046
실시예 23: 글루타티온 존재하에 합성된 DBCO-PEG3-말레이미드 접합 펩티드 16 (서열 번호 22) 및 메틸테트라진-PEG 4 -말레이미드 접합 펩티드 16 (서열 번호 22)의 티올-교환 부가물의 MALTI-TOF 질량 분석법에 의한 분석
말레이미드기는 반응 혼합물의 pH가 6.5 내지 7.5일 때 설프하이드릴-함유 분자와 특이적으로 반응할 수 있다. 말레이미드에 티올의 마이클 부가가 티올-말레이미드 부가물을 형성하기 위해 다양한 생체 접합에 일반적으로 사용되어 왔다. 그러나, 티올-말레이미드 부가물은 생리학적 조건하에서 티올 교환에 의해 파괴적인 절단을 겪을 수 있다. 소위 레트로-티올-마이클 반응은 티올-말레이미드 부가물의 분해를 초래하고 부가물의 안정성을 감소시킬 수 있다.
본 실시예에서는, DBCO-PEG3-말레이미드 접합 펩티드 16뿐만 아니라 메틸테트라진-PEG4-말레이미드 접합 펩티드 16을 수용액에서 티올 함유 글루타티온 분자의 존재하에 커플링기를 가지는 합성된 티올-말레이미드 펩티드 코어의 티올-말레이미드 교환에 대해 MALDI-TOF 분석으로 조사하였다. DBCO-PEG3-말레이미드 접합 펩티드 16을 다음과 같이 제조하였다: 펩티드 16을 표준 고상법에 의해 합성하였다 (본 발명자들은 펩티드 16의 생산을 Shanghai ChinaPeptide Co., Ltd.에 위탁하였다). 펩티드 16 (아세틸-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK; 서열 번호 22)은 95%의 순도를 가지며, 여기서 펩티드 16의 N-말단은 아세틸기로 변형되었다. 이종이기능성 가교제인 DBCO-PEG3-말레이미드는 Conju-probe Inc.로부터 구입하였다. 펩티드 16에 대한 가교제인 DBCO-PEG3-말레이미드의 티올-말레이미드 접합은 이전 실시예에서 기술된 것과 동일하였다. 이렇게 합성된 DBCO-펩티드 16은 m.w.가 2227 달톤이었다 (아래에 예시됨).
Figure pct00047
이어서, 이렇게 합성된 DBCO-PEG3-말레이미드 펩티드 16을 100 mM HEPES 완충액, pH 7.0 및 100 mM NaCl에서 37 ℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 1:10 ([펩티드]:[글루타티온])의 몰비로 글루타티온과 인큐베이션하였다. 생성된 반응 혼합물을 MALDI-TOF를 사용하여 추가로 분석하였고, 그 결과 72 시간의 인큐베이션 후 티올-말레이미드 교환으로부터 생성된 DBCO-PEG3-말레이미드 글루타티온 부가물 (하기 예시)의 분자량이 940.385 달톤인 것으로 나타났다 (도 26A).
Figure pct00048
메틸테트라진-PEG4-말레이미드 접합 펩티드 16을 DBCO-PEG3-말레이미드 접합 펩티드 16의 제조와 동일한 방식으로 제조하고 분석하였다. 이렇게 합성된 메틸테트라진-PEG4-말레이미드 펩티드 16은 m.w.가 2111.2 달톤이었다 (하기 예시).
Figure pct00049
이렇게 합성된 메틸테트라진-PEG4-말레이미드 펩티드 16과 글루타티온의 반응은 글루타티온과 반응한 DBCO-PEG3-말레이미드 펩티드 16의 조건에서 설명한 것과 동일하다. 생성된 반응 혼합물을 MALDI-TOF에 의해 추가로 분석하였다. 질량 분석 결과, 72 시간의 인큐베이션 후 MALDI-TOF에 의해 메틸테트라진-PEG4-말레이미드 글루타티온 부가물 (하기 참조)이 관찰되었고 (도 26B), 부가물의 분자량은 826.397 달톤인 것으로 나타났다.
Figure pct00050
실시예 24: Panc-1 종양 세포주에서 4개의 CCK8 펩티드 분자를 갖는 표적 링커 유닛 및 1개의 항-CD3 scFv 분자를 갖는 이펙터 모이어티로 구성된 분자 구조물의 T 세포-매개 세포 독성 분석
인간 말초 혈액 T 세포를 T 세포의 공급원으로 사용하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) 밀도 구배를 통한 원심 분리에 의해 건강한 공여자 (Taiwan Blood Service Foundation)의 연막으로부터 단리하고, 90% FBS/10% DMSO에서 동결 보존하였다. 인간 Pan T 세포 단리 키트 (Miltenyl Biotech, Auburn, CA, USA)를 사용하여 비-T 세포의 고갈 (음성 선택)에 의해 PBMC로부터 인간 T 세포를 준비하였다. T 세포를 10 μ/ml의 재조합 인간 IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, USA)의 존재하에 배양하였다. 항-DNP AN02 mAb를 이소타입-매칭 대조군으로서 사용하였다.
100 ㎕ 완전 RPMI 배지에서 5,000 Panc-1 표적 세포의 분취액을 4개의 CCK8 펩티드를 갖는 표적화 모이어티 및 1개의 항-CD3 scFv 분자를 갖는 이펙터 모이어티 또는 음성 대조군으로서 4개의 CCK8 펩티드만을 가지는 표적화 모이어티로 구성된 분자 구조물과 함께 5% CO2 분위기하에 37 ℃에서 30 분 동안 배양한 후, 20, 10 또는 5의 상이한 E:T 비에서 인간 T 세포와 결합시켰다. 24 시간 인큐베이션 후, 세포 독성을 제조사의 지시에 따라 aCella-Tox 키트 (Cell Technology, Mountain View, CA)를 사용하여 발광 방법에 의해 분석하였다. 플레이트를 루미노미터 (다중 검출 마이크로플레이트 판독기, DS Pharma, Osaka, Japan)로 판독하였다.
4개의 CCK8 펩티드를 갖는 표적화 모이어티 및 1개의 항-CD3 scFv 분자를 갖는 이펙터 모이어티로 구성된 분자 구조물에 의한 CCK8-타입 B 수용체-발현 종양 세포의 T 세포-매개 세포 분해를 Panc-1 종양 세포를 사용하여 조사하였다. 4개의 CCK8 펩티드를 갖는 표적화 모이어티 및 1개의 항-CD3 scFv 분자를 갖는 이펙터 모이어티로 구성된 분자 구조물은 이전 실시예에서 제조되었다.
세포 독성 효과를 위해, 공여자로부터 단리된 인간 T 림프구를 선택하여 T- 세포 매개 세포 독성을 조사하였다. Panc-1 세포를 4개의 CCK8 펩티드를 갖는 표적화 모이어티 및 1개의 항-CD3 scFv 분자를 갖는 이펙터 모이어티로 구성된 10 μg/mL의 분자 구조물과 함께 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 20, 10 또는 5의 상이한 E:T 비로 인간 T 림프구와 혼합하고 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 4개의 CCK8 펩티드만 (이펙터 모이어티 없음)을 갖는 표적화 모이어티 및 1개의 항-CD3 scFv 만을 갖는 이펙터 모이어티 (표적화 모이어티 없음)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포 분해를 aCella-Tox 키트를 사용하여 분석하였다.
실시예 25: Panc-1 종양 세포주에서 3개의 CCK8 펩티드 분자를 갖는 표적 링커 유닛 및 5개의 DM1 분자를 갖는 이펙터 링커 유닛으로 구성된 조인트-링커 분자 구조물의 세포 독성 분석
3개의 CCK8 펩티드를 갖는 표적화 링커 유닛 및 5개의 DM1 분자를 갖는 이펙터 링커 유닛으로 구성된 조인트-링커 분자 구조물은 이전 실시예에서 제조되었다.
Panc-1 세포 (2 × 104/웰)를 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 18 시간 후, 세포를 3개의 CCK-8 펩티드 (약물 번들없이)를 갖는 링커 유닛, 5개의 DM1 분자 (약물 번들)를 갖는 링커 유닛 및 표적화 모이어티로서 3개의 CCK-8 펩티드 및 이펙터 모이어티로서 5개의 DM1 분자를 갖는 분자 구조물의 상이한 농도 (1 μM로부터 10 배 희석)로 처리하였다. 6 시간 동안 인큐베이션한 후, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하고, 세포를 48 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 생존력을 제조사의 지시에 따라 alamarBlue 세포 생존능 시약 키트 (Invitrogen)로 결정하였다.
도 27은 세 처리군의 Panc-1 세포의 생존성 결과를 나타낸다. 3개의 CCK-8 펩티드의 표적 링커 유닛 및 5개의 DM1 분자의 약물 번들을 갖는 분자 구조물은 Panc-1 세포의 약 35%의 세포 용해를 일으켰다.
상기 실시양태들에 대한 설명은 단지 예로서 주어진 것이고 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시양태의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태가 어느 정도 특정하게, 또는 하나 이상의 개별 실시양태를 참조하여 위에서 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시양태를 상당히 변경시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHANG Tse-Wen CHU Hsing-Mao <120> LINKER UNITS AND MOLECULAR CONSTRUCTS COMPRISING THE SAME <130> P3010-PCT <150> US62613401 <151> 2018-01-03 <150> US62472011 <151> 2017-03-16 <160> 24 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 1 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys Gly 1 5 10 15 Ser Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 3 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys Gly 1 5 10 15 Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 4 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Lys Gly Ser Gly Ser Lys 20 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MOD_RES <222> 1,3,5,7,9 <223> Xaa is PEGylated amino acid with four EG units <220> <223> synthesized <400> 5 Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 6 Ser Lys Ser Lys Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 7 Lys Ser Lys Gly Lys 1 5 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 9 Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 10 Cys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 11 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 12 Arg Ser Gly Ser Ser Gly 1 5 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 13 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Lys 20 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 14 Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly 1 5 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Lys Gly Ser Ser Gly Lys 20 25 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 16 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe 1 5 10 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 17 Glu Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 18 Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe 1 5 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 19 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 115 120 125 Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Gln Ile Thr Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 245 250 255 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 22 Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 23 Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (23)

  1. 복수의 라이신 (K) 잔기, 하나 이상의 스페이서 및 제1 접합 모이어티를 포함하는 코어로서, 여기서
    임의의 두 K 잔기는 서로 인접하거나 하나의 스페이서에 의해 분리되고,
    각각의 스페이서는 독립적으로 (1) 하나 이상의 비-K 아미노산 잔기, 또는 (2) 2 내지 12 반복의 에틸렌 글리콜 (EG) 유닛을 가지는 페길화된 아미노산을 포함하고,
    적어도 하나의 스페이서는 N-말단에서 시작하여 첫 번째 K 잔기의 N-말단 또는 N-말단에서 시작하여 마지막 K 잔기의 C-말단에 연결되고,
    제1 접합 모이어티는 카복실기 또는 아민기와, 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴기로 이루어진 군으로부터 선택된 접합기를 가지며,
    스페이서가 첫 번째 K 잔기의 N-말단에 연결된 경우, 제1 접합 모이어티는 카복실기를 가지며 스페이서의 알파-아민기와 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서에 결합되거나; 또는
    스페이서가 마지막 K 잔기의 C-말단에 연결된 경우, 제1 접합 모이어티는 아민기를 가지며 스페이서의 카복실기와 아미드 결합을 형성함으로써 스페이서에 결합되는,
    코어; 및
    복수의 연결 팔로서, 여기서
    각각의 연결 팔은 이의 한 쪽 말단에 반응성 기를 갖고 이의 다른 쪽 말단에 작용기를 가지며, 연결 팔의 반응성 기와 코어의 K 잔기의 아민기 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 코어의 K 잔기에 연결되고,
    작용기는 아민, 카복실, 하이드록실, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS), N-하이드록시숙신이미딜 (NHS), 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 메틸술포닐 벤조티아졸, 요오도, 요오도아세트아미드, 아지드, 알킨, 사이클로옥틴, 테트라진 및 사이클로옥텐기로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단 접합기가 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이면, 작용기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기이고, 접합기가 테트라진 또는 사이클로옥텐기이면, 작용기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기인 것인 연결 팔;
    을 포함하는 링커 유닛.
  2. 제1항에 있어서, 코어가 2 내지 20개의 K 잔기를 포함하는 링커 유닛.
  3. 제1항에 있어서, 스페이서가 하나 이상의 글리신 (G) 및/또는 세린 (S) 잔기를 포함하는 링커 유닛.
  4. 제1항에 있어서, 반응성 기가 숙신이미딜 에스테르 (SE), 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르 또는 카복실기인 링커 유닛.
  5. 제1항에 있어서, 코어가 첫 번째 K 잔기의 N-말단 및 마지막 K 잔기의 C-말단에 각각 연결된 2개의 스페이서를 포함하는 링커 유닛.
  6. 제5항에 있어서, 코어가 카복실기 또는 아민기와, 아지드, 알킨, 테트라진, 사이클로옥텐 및 사이클로옥틴기로 이루어진 군으로부터 선택된 접합기를 갖는 제2 접합 모이어티를 추가로 포함하고, 여기서
    제1 및 제2 접합 모이어티 중 하나는 첫 번째 K 잔기의 N-말단에 연결된 스페이서의 N-말단에 결합되고,
    제1 및 제2 접합 모이어티 중 다른 하나는 마지막 K 잔기의 C-말단에 연결된 스페이서의 C-말단에 결합된,
    링커 유닛.
  7. 제6항에 있어서,
    작용기가 말레이미드, 비닐 술폰, 모노-술폰, 요오도 또는 요오도아세트아미드기이고;
    제1 및 제2 접합 모이어티 중 하나의 접합기는 아지드, 알킨 또는 사이클로옥틴기이며;
    제1 및 제2 접합 모이어티 중 다른 하나의 접합기는 테트라진 또는 사이클로옥텐기인,
    링커 유닛.
  8. 제1항에 있어서, 각각의 연결 팔이 2-12개의 비-K 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드; 또는 2-24 반복 EG 유닛을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄인, 링커 유닛.
  9. 제8항에 있어서, 연결 팔의 펩티드가 G, S, 글루탐산 (E) 및 아르기닌 (R) 잔기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 링커 유닛.
  10. 제1항에 있어서,
    사이클로옥텐기는 노르보넨 또는 트랜스-사이클로옥텐 (TCO)이거나;
    사이클로옥틴기는 디벤조사이클로옥틴 (DIBO), 이불소화 사이클로옥틴 (DIFO), 비사이클로노닌 (BCN) 또는 디벤조아자사이클로옥틴 (DIBAC)이거나; 또는
    테트라진기는 1,2,3,4-테트라진, 1,2,3,5-테트라진 또는 1,2,4,5-테트라진 또는 이들의 유도체인,
    링커 유닛.
  11. 제1항에 있어서, 코어가 그 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나, 또는 티올-말레이미드 반응, SN2 반응, 구리 촉매화 아지드-알킨 사이클로부가 (CuAAC) 반응, 변형 촉진 아지드-알킨 클릭 화학 (SPAAC) 반응, 또는 역 전자 요구 딜스-알더 (iEDDA) 반응을 통해 복수의 연결 팔에 각각 연결된 복수의 제1 요소를 추가로 포함하는 링커 유닛.
  12. 제11항에 있어서, 코어가 CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 접합기에 연결된 제2 요소를 추가로 포함하는 링커 유닛.
  13. 제12항에 있어서,
    각각의 제1 요소가 제1 세포 표면 항원에 특이적인 제1 항체 단편이고;
    제2 요소는 제2 세포 표면 항원에 특이적인 제2 항체 단편 또는 세포 독성 약물인,
    링커 유닛.
  14. 제13항에 있어서,
    제1 세포 표면 항원이 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138, 및 CD319로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
    제2 세포 표면 항원이 CD3 또는 CD16a인,
    링커 유닛.
  15. 제12항에 있어서,
    각각의 제1 요소가 펩티드 호르몬, 제1 성장 인자 또는 종양 관련 항원에 특이적인 제1 항체 단편이고;
    제2 요소는 세포 독성 약물, 톨-유사 수용체 작용제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 사이토카인, 또는 제2 성장 인자, 세포 표면 항원, 합텐 또는 사이토카인에 특이적인 제2 항체 단편인,
    링커 유닛.
  16. 제15항에 있어서,
    제1 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 돌연변이 EGF, 에피레귤린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 (HB-EGF), 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    제2 성장 인자는 EGF, 돌연변이 EGF, VEGF-A, bFGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    펩티드 호르몬은 세크레틴, 콜레시스토키닌 (CCK), 소마토스타틴, 옥트레오티드 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH)으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    종양-관련 항원은 표피 성장 인자 수용체 (HER1), HER2, HER3, HER4, 탄수화물 항원 19-9 (CA 19-9), CA 125, 암종배아 항원 (CEA), 뮤신 1 (MUC 1), 강글리오사이드 GD2, 흑색종 관련 항원 (MAGE), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 메소텔린, 뮤신 관련 Tn, 시알릴 Tn, Globo H, 단계 특이적 배아 항원-4 (SSEA-4) 및 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    세포 표면 항원은 CD3, CD16a, CD28, CD134, 세포 독성 T 림프구-관련 단백질 4 (CTLA-4), 예정된 세포사 1 (PD-1) 및 예정된 세포사 1 리간드 1 (PD-L1)로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    링커 유닛.
  17. 제7항에 있어서, 코어가 추가로,
    그 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나, 또는 티올-말레이미드 반응 또는 SN2 반응을 통해 복수의 연결 팔에 각각 연결된 복수의 제1 요소; 및
    제1 및 제2 접합 모이어티의 접합기에 각각 연결된 제2 요소 및 제3 요소를 포함하고,
    상기 제2 및 제3 요소 중 하나는 iEDDA 반응을 통해 하나의 접합기에 연결되고, 상기 제2 및 제3 요소 중 다른 하나는 SPAAC 또는 CuAAC 반응을 통해 다른 접합기에 연결된,
    링커 유닛.
  18. 독립적으로 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 제1 링커 유닛 및 제2 링커 유닛을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 링커 유닛은 CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 제1 및 제2 링커 유닛의 접합기 사이에서 일어난 반응에 의해 커플링된, 분자 구조물.
  19. 제18항에 있어서, 그 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하거나, 또는 티올-말레이미드 반응, SN2 반응, CuAAC 반응, SPAAC 반응 또는 iEDDA 반응을 통해 제1 링커 유닛 및 제2 링커 유닛의 복수의 연결 팔에 각각 연결된 복수의 제1 요소 및 복수의 제2 요소를 추가로 포함하는 분자 구조물.
  20. 제19항에 있어서,
    각각의 제1 요소가 제1 세포 표면 항원에 특이적인 제1 항체 단편이고;
    각각의 제2 요소가 제2 세포 표면 항원에 특이적인 제2 항체 단편 또는 세포 독성 약물인,
    분자 구조물.
  21. 제20항에 있어서,
    제1 세포 표면 항원은 CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138, 및 CD319로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
    제2 세포 표면 항원은 CD3 또는 CD16a인,
    분자 구조물.
  22. 제19항에 있어서,
    각각의 제1 요소가 펩티드 호르몬, 제1 성장 인자 또는 종양 관련 항원에 특이적인 제1 항체 단편이고;
    각각의 제2 요소가 세포 독성 약물, 톨-유사 수용체 작용제, 방사성 핵종과 복합화된 킬레이터, 사이토카인, 또는 제2 성장 인자, 세포 표면 항원, 합텐 또는 사이토카인에 특이적인 제2 항체 단편인, 분자 구조물.
  23. 제22항에 있어서,
    제1 성장 인자는 EGF, 돌연변이 EGF, 에피레귤린, HB-EGF, VEGF-A, bFGF, 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    제2 성장 인자는 EGF, 돌연변이 EGF, VEGF-A, bFGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    펩티드 호르몬은 세크레틴, CCK, 소마토스타틴, 옥트레오티드 및 TSH로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    종양-관련 항원은 HER1, HER2, HER3, HER4, CA 19-9, CA 125 CEA, MUC 1, 강글리오사이드 GD2, MAGE, PSMA, PSCA, 메소텔린, 뮤신 관련 Tn, 시알릴 Tn, Globo H, SSEA-4, 및 EpCAM로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    세포 표면 항원은 CD3, CD16a, CD28, CD134, CTLA-4, PD-1, 및 PD-L1로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    분자 구조물.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
CN109485849B (zh) * 2018-10-31 2020-09-22 华南理工大学 一种含砜基聚烯胺类化合物及其制备方法
KR102225650B1 (ko) * 2019-02-12 2021-03-09 부경대학교 산학협력단 클릭 화학을 이용한 주입형 psma 유도체 하이드로겔, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 겔 형성방법
WO2020190725A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
US11203614B2 (en) * 2019-03-25 2021-12-21 Immunwork Inc. Composite polypeptide having a metal binding motif and molecular construct comprising the same
CN110672836B (zh) * 2019-09-30 2023-03-21 香港大德昌龙生物科技有限公司 磁珠包被物及其制备方法和应用、检测试剂盒
GB2594753B (en) * 2020-05-27 2022-05-18 Spirea Ltd Antibody-drug conjugates
WO2022263627A1 (en) * 2021-06-18 2022-12-22 Imescia Polymer derivatives of mertansine and therapeutic uses thereof
EP4108669A1 (en) * 2021-06-24 2022-12-28 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry As CR, V.V.I. Carbohydrate derivatives and kits for cell surface labeling
WO2023047090A1 (en) * 2021-09-21 2023-03-30 Spirea Limited Antibody-drug conjugates

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016112870A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Tse-Wen Chang Molecular constructs with targeting and effector elements
WO2016184426A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Tse-Wen Chang Molecular constructs with targeting and effector elements and their applications

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL178921A0 (en) * 1998-12-24 2007-03-08 Yeda Res & Dev Caspase-8 interacting proteins
AU782856B2 (en) * 1999-09-24 2005-09-01 Large Scale Biology Corporation Creation of variable length and sequence linker regions for dual-domain or multi-domain molecules
ES2790420T3 (es) * 2013-03-14 2020-10-27 Scripps Research Inst Conjugados de anticuerpos y de agentes de focalización usos de los mismos
WO2015031268A1 (en) * 2013-08-26 2015-03-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University High affinity synbodies for influenza
US9840493B2 (en) * 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
WO2017036255A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Tse-Wen Chang Molecular constructs for preventing the formation of blood clot and/or treating thrombosis
WO2017144620A1 (en) * 2016-02-24 2017-08-31 Max Planck Florida Institute for Neuroscience Light-gated signaling modulation
EP3684414A4 (en) * 2017-09-19 2021-06-09 Immunwork Inc. PHARMACEUTICAL CONSTRUCTIONS WITH IMPROVED BINDING AFFINITY WITH ALBUMIN

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016112870A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Tse-Wen Chang Molecular constructs with targeting and effector elements
WO2016184426A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Tse-Wen Chang Molecular constructs with targeting and effector elements and their applications

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