CN110430897A - 接合单元及包含接合单元的分子构建体 - Google Patents

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Abstract

本揭示内容提出多种接合单元与分子构建体，其分别具有与其连接的标的元件与效应元件。亦揭示使用此种接合单元与分子构建体来治疗各种疾病的用途。

Description

接合单元及包含接合单元的分子构建体
相关申请说明
本揭示内容主张2017年3月16日提出的美国临时案No.62/472,011以及2018年1月3日提出的美国临时案No.62/613,401的优先权，此处将上述申请的内容全体引入作为参照。
技术领域
本揭示内容是关于药学领域；更明确地说，是关于多功能的分子构建体，譬如具有效应、标的以及改善药动学特性等多种功能性质的分子构建体。
背景技术
兼具标的与治疗效果的药物的开发已成为相关领域的主流研发方向。举例来说，国际专利申请公开案WO 2016/112870(A1)所述的多臂接合单元以及相关申请案提出了重要的化学实体，其能够用以建构具有二或更多功能性部位的分子。然而，WO 2016/112870公开案使用具有特殊官能基(如四嗪基、环辛烯基与环辛炔基)的氨基酸来进行链接化学反应(click chemistry reaction)；然而，无法在固态肽合成反应中加入此类氨基酸。更有甚者，根据WO 2016/112870公开案，需使用一端带有顺丁烯二酰亚氨基、另一端带有四嗪基、环辛烯基或环辛炔基的异双官能基(heterobifunctional)连接物，以透过半胱氨酸残基(cysteine，C)的硫醇基和上述异双官能基连接物的顺丁烯二酰亚氨基之间的反应，而加入带有四嗪基、环辛烯基或环辛炔基的耦合臂(coupling arm)。已知硫醇与顺丁烯二酰亚氨基反应的产物较不稳定，可能会发生逆向反应(reverse reaction)或和邻近带有硫醇基的分子发生交换反应，进而可能影响耦接的接合单元的储存稳定性。此外，如WO 2016/112870公开案所述，当多肽中心核带有半胱氨酸残基时，若连接臂带有可和多肽核上的硫醇反应的功能基，就无法进行此种连接臂(linking arm)的连续固态合成(多肽分支)。再者，多肽中心核N-端的α-氨基需要额外的阻断步骤，此一步骤会降低多肽中心核或接合单元的产率与纯度。
有鉴于此，相关领域需要一种新颖的多臂接合单元，其能够处理至少一种以上问题。举例来说，此种新颖的多臂接合单元可透过连续固态合成来生产、具有较理想的稳定性、且/或其对于功能性元件(如，标的元件、效应元件及/或用以改善药动学特性的元件)的复合效率较佳。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
<I>多臂接合单元
本揭示内容的第一方面是关于一种新颖的多肽核多臂接合单元，其具有复数个连接臂，用以和功能多个功能性元件复合。
根据本揭示内容的实施方式，此处提出的中心核至少包含复数个连接氨基酸残基、一或多间隔物以及一或二复合部分。每一连接氨基酸残基可以是一个具有侧链氨基(如，赖氨酸(lysine，K)残基)或侧链羧基(如，天冬氨酸(aspartic acid，D)或谷氨酸(glutamic acid，E)残基)的天然(natural)或非天然(non-natural)氨基酸残基。在多种实施方式中，任两个所述连接氨基酸残基彼此相邻或由一间隔物所隔开。
每一间隔物彼此独立地包含：(1)一或多个非赖氨酸(非-K)氨基酸残基(即，K残基以外的氨基酸残基)，或(2)具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)。根据某些例示性地实施方式，所述间隔物可至少包含一或多个甘氨酸(glycine，G)及/或丝氨酸(serine，S)残基。在某些实施例中，间隔物是由1到20个氨基酸残基所组成；较佳为2至五个氨基酸残基。
根据本揭示内容某些实施方式，所述间隔物其中之一连接到N-端起第一个连接氨基酸残基的N-端，亦即形成一N-端间隔物。额外地或替代性地，所述间隔物其中之一连接到N-端起最后一个连接氨基酸残基的C-端，亦即形成一C-端间隔物。
所述复合部分的一端具有羧基(即，-COOH基)或氨基(即，-NH2基)其中一种，而另一端，具有一复合基。举例来说，所述复合基可以是叠氮基(azide)、炔基(alkyne)、四嗪基(tetrazine)、环辛烯基(cyclooctene)或环辛炔(cyclooctyne)基。具体来说，当间隔物连接到第一个连接氨基酸残基的N-端(即，作为N-端间隔物)时，复合部分有一羧基，故可藉由和所述N-端间隔物的α-氨基形成酰胺键而接合到N-端间隔物的N-端。或者是，当间隔物连接到至最后一个连接氨基酸残基的C-端(即，作为C-端间隔物)时，复合部分有一氨基，故可藉由和C-端间隔物的羧基形成酰胺键而接合到C-端间隔物的C-端。透过上述方法接合的复合部分在其自由端(即，未和N-/C-端间隔物反应的该端)带有一复合基。
连接臂可由多肽核的连接氨基酸残基而延伸。根据本揭示内容的实施方式，每一连接臂的一端有一反应基，且另一端有一功能基。所述反应基可以是一种琥珀酰亚胺酯(succinimidyl ester，SE；譬如羟基琥珀酰亚胺酯(hydroxysuccinimide-ester)或N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)酯)、四氟苯基(tetrafluorophenyl，TFP)酯、羧基或羟基(即，-OH基)；且所述功能基选自由以下组成的群组：氨基、羧基、羟基、三级丁基二甲硅基(tert-Butyldimethylsilyl，TBDMS)、NHS、顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基(vinylsulfone)、单砜基(mono-sulfone)、甲磺酰苯并噻唑基(methylsulfonyl benzothiazole)、碘基(iodo)、碘乙酰氨基(iodoacetamide)、叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基与环辛烯基。
在结构上，每一连接臂藉由连接臂的反应基和连接氨基酸的氨基或羧基之间形成的酰胺键而与其连接。于某些实施方式中，当此处提出的中心核至少包含复数个K残基时，每一连接臂有一氨基-反应基(譬如琥珀酰亚胺酯、TFP酯或羧基)。在此类情形中，所述连接臂可透过和K残基的氨基形成酰胺键以连接至K残基。或者是，当此处提出的中心核至少包含复数个D及/或E残基时，每一连接臂有一羧基-反应基(如，羟基)；且因此，所述连接臂可藉由和D及/或E残基的羧基形成酰胺键以连接至D及/或E残基。当连接到此处提出的中心核之后，每一连接臂的自由端(即，未连接至此处提出的中心核的一端)有一功能基。
在选择复合基与功能基时，较理想的状况是复合部分的复合基和连接臂的功能基彼此不会发生链接化学反应。举例来说，当复合部分的复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时，连接臂的功能基为四嗪基或环辛烯基；或者是，当复合部分的复合基为四嗪基或环辛烯基时，连接臂的功能基为叠氮基、炔基或环辛炔基。对于至少包含分别连接到N-端与C-端间隔物的两个复合部分的接合单元，亦可运用相同的设计方法；亦即，连接臂的功能基和两个复合部分的复合基彼此间不能发生链接化学反应。因此，在这类情形中，连接臂的功能基可以是顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、碘基或碘乙酰氨基；一复合部分的复合基可以是叠氮基、炔基或环辛炔基；而另一复合部分的复合基则是四嗪基或环辛烯基。当可理解，当想要将两个复合部分和同一种元件耦接时，两个复合部分的复合基可以相同或可用于进行相同的链接化学反应。
根据本揭示内容的某些实验例，每一连接臂是至少包含2-12个非-K氨基酸残基的多肽，或具有2-2四个EG重复单元的聚乙二醇(PEG)链。在一具体实施例中，每一连接臂为一多肽，其至少包含5-10个独立选自G、S、E与精氨酸(arginine，R)残基的氨基酸残基。在替代性的具体实施例中，每一连接臂为具有6-12个EG重复单元的PEG链。
依所欲的目的不同，可将不同的功能性元件(作为标的或效应元件)分别连接到此处提出的接合单元的连接臂的自由端与复合基的自由端。根据本揭示内容的某些实施方式，此处提出的接合单元至少包含复数个连接臂以及一复合部分，其中复数个第一元件分别透过和该些连接臂形成酰胺键或酯键而与其连接，或分别和连接臂进行硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应、SN2反应、铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应而与其连接。或者是，此处提出的接合单元可包含复数个连接臂以及两个复合部分；如此一来，可将多种/个元件分别连接到所述连接臂与两个复合部分。具体来说，多个第一元件分别透过和该些连接臂形成酰胺键或酯键而与其连接，或分别和连接臂进行硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应或SN2反应而与其连接；一第二元件透过和一复合部分的复合基进行SPAAC反应或iEDDA反应而与其连接；以及一第三元件透过和另一复合部分的复合基进行CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而与其连接。当可理解，所述第二与第三元件可以相同或不同。由于第一元件是透过连接臂而连接到多肽中心核的连接氨基酸残基(如，K残基)，故可藉由改变连接氨基酸残基来调整一接合单元携带的第一元件数目。如此一来，可视需求与必要而调整第一元件相对于第二元件(或相对于第二与第三元件)的数目比。
根据本揭示内容视需要而采用的实施方式，环辛烯基可为降莰烯(norbornene)或反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)、或其衍生物。环辛炔基的例示包括二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DIBO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)与二苯并杂氮环辛炔(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC或DBCO)，及其衍生物。四嗪基的例子包括但不限于：1,2,3,4-四嗪(1,2,3,4-tetrazine)、1,2,3,5-四嗪(1,2,3,5-tetrazine)或1,2,4,5-四嗪基(1,2,4,5-tetrazine)、或其衍生物。
<II>具有二或三个接合单元的分子构建体(联合接合物)
本揭示内容的另一方面是关于一种分子构建体，其至少包含两个接合单元，透过其上个别的复合基而彼此复合。每一接合单元可用以携带一或多种/个元件，故当二或更多种接合单元彼此复合时，所得到的分子构建体可包含具有不同功能(如标的、治疗或药动学特征)的元件。在这种情形中，可藉由改变个别接合单元的多肽中心核的连接氨基酸残基数目，来调整不同功能性元件的数目比。
根据本揭示内容的某些实施方式，所述分子构建体至少包含一第一与一第二接合单元。第一或第二接合单元的基本结构大致上与上文参照本揭示内容第一方面所述者相似。具体来说，第一接合单元至少包含一第一中心核与分别连接至第一中心核的复数个连接臂(下文称为第一连接臂)，其中第一中心核至少包含连接至其N-端或C-端的一复合部分(下文称为第一复合部分)；第二接合单元至少包含一第二中心核与分别连接至第二中心核的复数个连接臂(下文称为第二连接臂)，其中第二中心核至少包含连接至其N-端或C-端的复合部分(下文称为第二复合部分)。第一与第二接合单元透过发生于第一与第二复合部分的复合基之间的iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接。
为了实现治疗的目的，可将不同的功能性元件(作为标的或效应元件)分别透过和第一与第二连接臂形成酰胺键或酯键而与其连接，或分别和第一与第二连接臂进行硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应、SN2反应、CuAAC反应、SPAAC反应、或iEDDA反应而与其连接。
此种设计使得本领域人员能够便捷地合成具有复杂结构的分子构建体。如此一来，本发明所属技术领域中具有通常知识者能够分别建构带有不同功能性元件的分子构建体库，之后再视需要及/或所欲的用途，由分子构建体库中选择并组合两种分子构建体(或接合单元)进而得到所欲的分子构建体。再者，可透过调整中心核的连接氨基酸残基数目来控制一接合单元的功能性元件数目。
<III>接合单元或分子构建体于疾病治疗的用途
可将此处提出的接合单元与分子构建体用于治疗能够治疗多种疾病的药物分子；所述疾病譬如液态肿瘤与固态肿瘤。因此，本揭示内容另一方面所涵盖的标的包括：包含此处所述的接合单元与分子构建体的药学组合物、利用此处所述的接合单元、分子构建体或药学组合物来治疗疾病的方法、以及运用所述接合单元与分子构建体来制备用以治疗疾病的药物的用途。
于建构用以治疗液态肿瘤的药物分子时，第一元件可以是对第一细胞表面蛋白专一的抗体或其片段，譬如单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或与其相似者；而第二元件可以是细胞毒性药物或是对第二细胞表面蛋白专一的抗体或其片段。可作为用以治疗液态肿瘤的标的元件的第一细胞表面抗原包括，但不限于：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。另一方面，适合作为效应元件的第二细胞表面抗原的非限制性实施例包括CD3以及CD16a。或者是，第一与第二细胞表面抗原为分别CD79a与CD79b。
可由此处提出的接合单元及/或分子构建体治疗的液态肿瘤的实施例包括，但不限于：急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenousleukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及骨髓瘤(myeloma)。
在建构用于治疗固态肿瘤的药物分子时，第一元件(即，标的元件)可选自肽类激素、第一生长因子及对肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen)专一的第一抗体或其片段；而第二元件(即，效应元件)可以是细胞毒性药物、类铎受体(toll-like receptor，TLR)促效剂、与一放射性核种复合的螯合剂、细胞介素或对第二生长因子、细胞表面抗原、半抗原(hapten)或该细胞介素专一的一第二抗体或其片段。
举例来说，肽类激素可以是胰泌素、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、体抑素及其衍生物(如体抑素肽(octreotide))或促甲状腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)。至于上述第一生长因子则可以是上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、突变型EGF、表皮调节素(epiregulin)、肝素结合上皮生长因子(heparin-binding epidermalgrowth factor，HB-EGF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)。肿瘤相关抗原的例示性实施例包括人类上皮生长因子受体1(human epidermal growth factor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、糖类抗原125(CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白1(mucin 1，MUC 1)、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺专一膜抗原(prostate-specificmembrane antigen，PSMA)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、间皮素(mesothelin)、粘蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、阶段专一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)以及上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。
在适用于治疗液态肿瘤或固态肿瘤的接合单元或分子构建体中，可使用的细胞毒性药物包括，但不限于：美登素(mertansine)、奥里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)以及喜树碱(camptothecin)。TLR促效剂的非限制性例示包括：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚去氧核苷酸(CpGoligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-葡聚糖(β-glucan)以及酵母聚糖(zymosan)。所述螯合剂可选自以下物质所组成的群组：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraaceticacid，DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetic acid，NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)；而放射性核种可以是111In、131I或177Lu。适当的细胞介素可选自以下群组：介白素-2(interleukin-2，IL-2)、干扰素-α(interferon-α，IFN-α)、IFN-γ以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。可供第二抗体片段专一性地识别并结合的第二生长因子包括：EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。可供第二抗体片段专一性地识别并结合的细胞表面抗原包括：CD3、CD16a、CD28、CD134、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4或CD152)、程序性细胞死亡因子1(programmedcell death 1，PD-1或CD279)或程序性细胞死亡因子1配体1(programmed cell death1ligand 1，PD-L1或CD274)。可供第二抗体片段专一性地识别并结合的细胞介素包括：IL-2、IFN-α、IFN-γ或TNF-α；在这些情形中，第二抗体片段为非中和性抗体片段。上述半抗原是选自以下群组：二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)以及序列为WADWPGPP(序列编号：23)的短肽。
可利用本发明的接合单元及/或分子构建体来治疗的固态肿瘤，包括，但不限于：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌以及头颈部鳞状细胞癌。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1A至图1H为根据本揭示内容某些实施方式的中心核的示意图。
图2A至图2F为根据本揭示内容某些实施方式的接合单元的示意图。
图3A至图3C为根据本揭示内容某些实施方式，其上接有功能性元件的接合单元的示意图。
图4A至图4C根据本揭示内容某些实施方式，包含不同功能性元件的接合单元的示意图。
图5A至图5C为根据本揭示内容某些实施方式的分子构建体的示意图。
图6为根据本揭示内容某些实施方式的分子构建体的示意图。
图7根据本揭示内容多种实施方式，包含三个接合单元的分子构建体的示意图。
图8A与8B为根据本揭示内容实验例1，经降莰烯修饰的多肽4的HPLC与MALDI-TOF质谱分析结果。
图9A与9B为根据本揭示内容实验例2，经叠氮修饰的多肽5的HPLC与MALDI-TOF质谱分析结果。
图10A与10B为根据本揭示内容实验例3，经DBCO修饰的多肽7的HPLC与MALDI-TOF质谱分析结果。
图11A与11B分别为根据本揭示内容的实验例3的经炔基修饰的多肽9与经叠氮基修饰的多肽10的分析结果。
图12A与12B分别为根据本揭示内容实验例5与6，含CCK8多肽与含CCK8的连接臂的MALDI-TOF质谱分析结果。
图13A与13B根据本揭示内容实验例8，包含所述中心核与连接臂的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图14为根据本揭示内容实验例9，包含所述中心核与连接臂的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图15为根据本揭示内容实验例10，包含所述中心核与连接臂的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图16为根据本揭示内容实验例12，带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的含炔基接合单元的反相HPLC分析结果。
图17为根据本揭示内容实验例12的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图18为根据本揭示内容实验例14，至少包含五个细胞毒性药物的接合单元的反相HPLC分析结果。
图19为根据本揭示内容实验例15，至少包含五个细胞毒性药物的接合单元的反相HPLC分析结果。
图20为根据本揭示内容实验例15，至少包含五个细胞毒性药物的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图21为根据本揭示内容实验例16，以CCK8作为标的元件的接合单元的反相HPLC分析结果。
图22为根据本揭示内容实验例16，以CCK8作为标的元件的接合单元的ESI-TOF质谱分析结果。
图23A至图23C分别为根据本揭示内容实验例17-19，特定scFv的纯度及其对T细胞的结合亲和力。
图24为根据本揭示内容实验例20，与DBCO复合的抗-CD3 scFv的流式细胞分析资料。
图25为根据本揭示内容实验例22，连接单元与分子构建体的质谱分析结果。
图26A与26B为根据本揭示内容实验例23的接合单元的MALDI-TOF质谱分析结果。
图27为根据本揭示内容实验例25的至少包含五个细胞毒性药物的接合单元对于肿瘤细胞的毒杀效果。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与元件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与元件。此外，在不同图式间，以相同或相似的元件符号来指称相似的元件/部件。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随权利要求中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与权利要求中，「至少一」与「一或更多」等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。相似地，「至少二」一词则代表包含了二、三、四或更多。更有甚者，在本说明书与权利要求中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，「约」通常指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考量而定。当可理解，除了实验例之外，或除非另有明确的说明，此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本揭示内容一般关于多种分子构建体，其中每一分子构建体包含一标的元件(T)与一效应元件(E)，在本说明书中有时将这些分子构建体称为「T-E分子」、「T-E药物」或「T-E药品」。
在此处，「标的元件(targeting element)」一词指分子构建体能够直接或间接结合到一目标标的(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到目标标的。在某些例子中，标的元件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，标的元件可专一地结合到目标细胞表面上的分子；或标的元件可和第二分子专一地结合，而此一第二分子能够专一地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦标的元件与目标对象接合之后，标的元件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。标的元件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体标的到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有标的功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应元件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应元件在疾病部位绝对或完全的局部化。
根据本发明，「效应元件(effector element)」一词指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发或压抑免疫活性、发挥细胞毒性、抑制酵素活性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募免疫细胞或其他治疗用分子)的部分。「效应」可指治疗性或诊断性的效果。效应元件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的元件。上述效应元件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
虽然在此处利用「第一」、「第二、「第三」等词汇来描述多种元件、部件、区域和/或区段，这些元件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各元件。因此，亦可将下文所述的第一元件命名为第二元件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。
在此处，「连接(link)」、「耦接(couple)」以及「复合(conjugate)」等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个元件连接在一起。
「多肽(polypeptide)」一词在此指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。
于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，「保守性置换(conservative substitution)」一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或专一性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括「类似物置换」，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。于本揭示内容中，认为以下氨基酸残基分属四种独特的氨基酸类别：(1)赖氨酸，其侧链带有氨基；(2)半胱氨酸，其侧链带有硫醇基；(3)丝氨酸与苏氨酸(threonine)，其侧链带有羟基；以及(4)天冬氨酸与谷氨酸，其侧链带有羧基。这四大类氨基酸的侧链各自带有独特的官能基，可以用来和不同的化学成分复合。也可使用带有此类官能基的非天然氨基酸，以达到类似目的。
于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
此处针对多肽序列所述的「氨基酸序列相似度百分比(Percentage(％)aminoacid sequence identity)」指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软体如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技资讯中心(Nation Center forBiotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析资料库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
其中X是利用BLAST序列并排程式对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
「聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)」一词在此指带有一个氨基(aminogroup)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示内容中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
「复合部分(conjugating moiety)」一词带有有一或多个功能基的分子，所述功能基具有化学反应性，且能够和其他化学单元共价连接。所述功能基的非限制性实施例包括：羧基、羰基、羟基、硫醇基、氨基、三级丁基二甲硅基(tert-Butyldimethylsilyl，TBDMS)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基(vinylsulfone)、单砜基(mono-sulfone)、甲磺酰苯并噻唑基(methylsulfonyl benzothiazole)、碘基(iodo)、碘乙酰氨基(iodoacetamide)、叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。根据本揭示内容的实施方式，此处提出的接合单元的复合部分具有两个功能基，其中一个是羧基或氨基，此一功能基用以和间隔物的α-氨基或羧基形成酰胺键，而使复合部分接合到间隔物的N-端或C-端；而另一个则是叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基，其可透过CuAAC、iEDDA或SPAAC反应而和一元件或另一接合单元相接。
在此处一多肽的「端」指位于该多肽N-端或C-端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时，「端」则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与权利要求中，「自由端」一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。
「抗原(antigen或Ag)」一词指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性(secretory)、荷尔蒙性(humoral)和/或细胞级(cellular)的抗原专一反应。在本揭示内容中，「抗原」一词指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多糖、糖蛋白、糖脂质、核酸或上述的组合。
在本说明书与权利要求中，「抗体(antibody)」一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个Fab部分)、可变片段(variable fragment，Fv)、单链可变片段(scFv)、双单一性单链可变片段(bi-scFv)、纳米抗体(nanobodies；亦称为单域抗体(single-domain antibodies，sdAb))、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。「抗体片段」包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。在典型的例子中，「抗体」指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(α)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)与μ(mu)等恒定区基因(constant region gene)、以及无数的免疫球蛋白可变区基因(variable region genes)。轻链通常归类为κ(kappa)或λ(lambda)。重链通常归类为γ(gamma)、μ(mu)、α(α)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物(tetramer)。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一「轻」链(约25kDa)与一「重」链(约50-70kDa)。每一链的N-端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(variable light chain，VL)与可变重链(variableheavy chain，VH)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本揭示内容的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组DNA方式重新合成上述抗体片段。于本揭示内容一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双专一性，且可有多种不同的构形。举例来说，双专一性抗体可包含二个不同的抗原结合部位(可变区域)。于多种实施方式中，可利用融合瘤技术或重组DNA技术来制备双专一性抗体。于一些实施方式中，双专一性抗体对至少两种不同的表位(epitope)有结合专一性。在许多运用抗体片段的分子构型中，可使用拟抗体(antibodymimetics)来取代片段，此种拟抗体可结合至与抗体片段相同的抗原成分。拟抗体包含模拟抗体(anticalins)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPins)、亲和体(affibodies)、filomers、锚蛋白(ankyrins)、高亲和力多聚体(avimers)及其他类似物。
「专一地结合(specifically bind)」一词在此处指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(dissociation constant，Kd)小于约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M；或者是或额外地，相较于其对于非专一性抗原的结合亲和力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲和力为两倍以上。
「治疗(treatment)」一词指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。
在此处，「有效量(effective amount)」一词指本发明分子构建体的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重若干毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」与「投予(administration)」等词在此可交替使用，其指将本发明的分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。
「个体(subject)」或「患者(patient)」等词在此可交互使用，且是指可接受本揭示内容的分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，「个体」或「患者」一般包含雄性与雌性。「个体」或「患者」包含任何可因本揭示内容的处置而获益的哺乳类动物。所述「个体」或「患者」的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。「非人类哺乳动物」一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
本揭示内容至少部分是基于建构出了T–E药物，此种T-E药物可被递送至目标细胞、目标组织或器官，且其在这些部位的比例相对高于在血液循环、淋巴系统以及其他细胞、组织和器官中的比例。当实现上述情境时，即可提升T-E药物的疗效，且其副作用与毒性的数目和严重性都会降低。相较于不含标的元件的药物，以T-E分子的形式来投递药物时，发挥疗效的效应物所用的浓度可能较低。因此，可在较低的剂量下施用治疗用的效应物而不会减损其有效性，但却能同时降低其副作用与毒性。
第I部份新颖多臂接合物设计
I-(i)新型多臂接合物
本揭示内容的第一种方面是关于多臂接合单元，其包含：(1)一中心核，其至少包含复数个连接氨基酸残基；以及(2)复数个连接臂，分别连接到。此处提出的中心核特征在于具有连接到其N-及/或C-端的一或二个复合部分。根据本揭示内容的实施方式，复合部分用以有效地将功能性元件(如，标的元件，治疗性的效应元件或用以改善药动学特性的元件)耦接到中心核，以便提升此处提出的接合单元的疗效。
中心核是长度为3-120个氨基酸残基的多肽，且至少包含两个连接氨基酸残基，所述连接氨基酸残基可以独立地为赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)及/或谷氨酸(E)残基；举例来说，此处提出的中心核可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个K、D及/或E残基。在较佳的情形中，此处提出的中心核至少包含2至20个K残基，或2至20个D及/或E残基。当可理解，连接氨基酸残基可以是非天然氨基酸残基，且其侧链带有一氨基或羧基。根据某些实施方式，任两个连接氨基酸残基可彼此相邻或由一间隔物所隔开。
根据本揭示内容的实施方式，多肽中心核至少包含至少一(即，1、2、3或更多)个间隔物。在某些实施方式中，在多肽链N-端起算第一个连接氨基酸残基的N-端上连接有一间隔物；在下文说明中，于适当的情形下，将此种间隔物称为N-端间隔物，因为其位于中心核的N-端。此外，或可替代的，在多肽链N-端起算最后一个连接氨基酸残基的C-端上连接有一间隔物；相似地，下文有时将此种间隔物称为C-端间隔物，因为其位于中心核的C-端。
一般来说，上述间隔物可以是，(1)连接氨基酸残基以外的单一个氨基酸残基，(2)由2-20个(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)连接氨基酸残基以外的氨基酸残基所组成的多肽，或(3)具有2-12个(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)EG单元的聚乙二醇化氨基酸。具体来说，当此处提出的中心核至少包含复数个K残基时，间隔物可包含具有2-12个EG单元的聚乙二醇化氨基酸、或可包含1-12个非-K氨基酸残基，其中每一个非-K氨基酸残基分别且独立地选自以下组成的群组：甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、天冬酰氨(N)、谷胺酰胺(Q)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)与色氨酸(W)残基；在较佳的情形中，每一个非-K氨基酸残基分别且独立地选自选自以下所组成的群组：G、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y与W残基；在更佳的情形中，每一个非-K氨基酸残基分别为G及/或S残基。或者是，当此处提出的中心核至少包含复数个D/E残基时，间隔物可包含具有2-12个EG单元的聚乙二醇化氨基酸、或可包含1-12个非-D/E氨基酸残基，其中每一个非-D/E氨基酸残基分别且独立地选自以下组成的群组：K、G、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y及W残基；在较佳的情形中，每一个非-D/E氨基酸残基分别且独立地选自以下所组成的群组：G、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y及W残基；在更佳的情形中，每一个非-D/E氨基酸残基分别为G及/或S残基。
当可理解，当此处提出的中心核至少包含超过一个间隔物，每一个间隔物可以相同或不同；亦即，每一个间隔物可包含相同或不同的氨基酸序列及/或EG单元。根据本揭示内容一实施方式，此处提出的中心核至少包含三个间隔物，其中一个间隔物是具有8个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，而另外两个间隔物分别有一个S残基与一个G残基。根据本揭示内容另一实施方式，此处提出的中心核至少包含五个间隔物，其中一个间隔物是由四个G残基与两个S残基所组成，而另外四个间隔物分别有一个G与一个S残基。根据本揭示内容又一实施方式，此处提出的中心核至少包含五个间隔物，每一个分别是带有四个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。
于制备此处提出的接合单元时，可将带有氨基-反应基(如，琥珀酰亚胺(succinimidyl)酯、TFP酯或羧基)或羧基-反应基(如，氨基)的多肽或PEG链连接到中心核的连接氨基酸残基(即，K、D及/或E残基)。更具体而言，可使多肽/PEG链的氨基-反应基和K残基的氨基间形成酰胺键，而将一端带有氨基-反应基且另一端带有功能基的多肽或PEG链连接到所述中心核的K残基。琥珀酰亚胺酯可以是NHS酯。或者是，可使多肽/PEG链的氨基和中心核的D或E残基的羧基间形成酰胺键，而将一端带有羧基-反应基且另一端带有功能基的多肽或PEG链连接到所述中心核的D或E残基。于本揭示内容中，连接至连接氨基酸残基的多肽或PEG链称为连接臂，其自由端(即，未连接至中心核的连接氨基酸残基的该端)有一功能基。一般而言，所述功能基选自以下所组成的群组：氨基、羧基、羟基、TBDMS、NHS、顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰苯并噻唑基、碘基、碘乙酰氨基、叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基与环辛烯基，其中四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪、1,2,4,5-四嗪或其衍生物；环辛烯基为降莰烯(norbornene)或反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基；且环辛炔基选自以下所组成的群组：二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DIBO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并杂氮环辛炔(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC或DBCO)。根据本揭示内容一实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。
根据本揭示内容某些实施方式，连接臂为一多肽，其至少包含2-12(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)个除了连接氨基酸残基以外的氨基酸残基(其中每一者可以是天然或非天然氨基酸残基)。在某些实施方式中，此处提出的中心核至少包含复数个K残基，且连接臂为至少包含2-12个非-K氨基酸残基(即，独立选自以下群组的氨基酸残基：G、E、D、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y及W残基)的多肽。根据一实验例，此处提出的中心核至少包含复数个K残基，且连接臂为一多肽，其至少包含5-10个独立选自G、S、E与R残基的氨基酸残基。或者是，连接臂可以是带有2-24(即、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)个EG重复单元的PEG链；在较佳的情形中，为5-15个EG重复单元；在更佳的情形中，为6-12个EG重复单元。当可理解，可利用具有大致上相同长度的聚合物来取代此处所述的连接臂多肽或PEG链。可以使用如碳水化合物或其他亲水性结构单元等聚合物来作为连接臂。
根据本揭示内容的实施方式，至少一复合部分结合于N-端间隔物的α-氨基，及/或结合于C-端间隔物的羧基。复合部分不得为氨基酸残基，因为氨基酸残基同时具有氨基与羧基；上述两种官能基会彼此干扰而使复合部分无法有效地和多肽中心核形成肽键结。
具体来说，此处提出的接合单元的复合部分的一端有一氨基-反应基(如，羧基或氯化羰基)或一羧基-反应基(如，氨基或联氨基)，而另一端则有一复合基，其中所述复合基选自由以下所组成的群组：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基(其例示如上文所述)。根据本揭示内容某些实施方式，所述间隔物其中之一为N-端间隔物；在这些实施方式中，复合部分有一羧基，且相对应地，可以透过复合部分的羧基以及N-端间隔物的α-氨基间形成的酰胺键而结合到N-端间隔物的α-氨基。根据本揭示内容的某些实施方式，上述间隔物其中之一为C-端间隔物；在这些实施方式中，复合部分带有氨基，且因此可透过在复合部分的氨基与C-端间隔物的羧基间形成酰胺键而键结到C-端间隔物的羧基。在某些例子中，中心核至少包含N-端间隔物与C-端间隔物两者，此时中心核亦带有两个复合部分，其中一个复合部分结合到N-端间隔物的α-氨基，而另一个复合部分则是结合到C-端间隔物的羧基。如此一来，结合到中心核的复合部分在其自由端(即，未连接到中心核的一端)带有复合基。
在视需要而实施的情形中，复合部分的羧基或氨基和复合基之间至少更包含带有2-10(即，2，3，4，5，6，7，8，9或10)个EG重复单元的PEG链；举例来说，PEG链可带有4、6、7或8个EG重复单元。
当可想见，当中心核有两个复合部分与其结合时，这些复合部分所带的复合基可以相同或不同。在较佳的情形中，两个复合基是不同的。根据较佳实施例，一个复合基是叠氮基、炔基或环辛炔基，而另一个复合基则是四嗪基或环辛烯基。
在较佳的情形中，当复合部分的复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时，连接臂的功能基可以是四嗪基或环辛烯基；又或者是，当复合部分的复合基为四嗪基或环辛烯基时，连接臂的功能基为叠氮基、炔基或环辛炔基。在接合单元至少包含分别连接到N-端与C-端间隔物的两个复合部分时，连接臂的功能基较佳为顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、碘基或碘乙酰氨基；两个复合部分其中之一的复合基是叠氮基、炔基或环辛炔基；而另一个复合部分的复合基则是四嗪基或环辛烯基。
参照图1A-1E，其中每一个中心核10a、10b、10c、10d与10e上连接有一复合部分。在图1A至1D中，各自带有一四嗪基、TCO基、叠氮基与炔基的复合部分连接到中心核10a、10b、10c与10d的N-端间隔物的α-氨基。图1E是另一种替代性的实施例，其中作为保护基团的乙酰(acetyl)基和多肽中心核10e的间隔物的α-氨基键结，而带有DBCO基(作为复合基)的复合部分则和中心核10e的C-端间隔物的羧基键结。
于本揭示内容中某些实施方式，中心核至少包含两个复合基。图1F绘示了其中一例，其中分别带有四嗪基与DBCO基的复合部分结合到多肽中心核10f的N-端间隔物的α-氨基以及C-端间隔物的羧基。图1G为另外一例，其中分别带有TCO基与DBCO基的复合部分结合到多肽中心核10g的N-端间隔物的α-氨基与C-端间隔物的羧基。在替代性的具体实施例中，多肽中心核10h的N-端间隔物的α-氨基与C-端间隔物的羧基分别与带有炔基的复合部分以及带有DBCO基的复合部分结合。
反应式1-3例示了带有一或两个所述复合部分与其连接的中心核的合成方式。
相较于使用常规氨基酸(譬如G与S残基)做间隔物，使用聚乙二醇化氨基酸作为间隔物来合成多肽中心核所涉及的步骤较少。此外，聚乙二醇化氨基酸可具有不同的长度(即，不同数目的EG重复单元)，对于中心核中相邻的K残基提供了较为理想的弹性与可溶性。除了聚乙二醇化氨基酸之外，亦可建构中心核使其带有人工氨基酸，譬如D-型氨基酸、高氨基酸(homo-amino acid)、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，使用带有不同PEG长度的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为氨基酸分子中的PEG部分提供了构型上的弹性且可使复合基之间有适当的间隔、提升水溶性，此外，PEG分子的免疫原性通常较弱。含聚乙二醇化氨基酸的中心核的合成方式与常规多肽合成相似。
基于稳定性的目的，当中心核的N-端并未与复合部分结合时，该N-端较佳与一乙酰基键结。
当可理解，连接至中心核的连接臂数目主要是由中心核中所含连接氨基酸残基(即，K、D及/或E残基)的数目来决定。由于此处提出的中心核至少包含两个连接氨基酸残基，所述接合单元可包含复数个连接臂。
<<反应式1N-端带有四嗪基或TCO基的中心核的制备>>
<<反应式2C-端带有DBCO基的中心核的制备>>
参照图2A。如图所示，接合单元20A至少包含一中心核，其带有两个相邻K残基与一个连接至第一个K残基N-端的间隔物210(即，N-端间隔物)。带有一个羧基230与一个环辛烯基240的复合部分透过其羧基230和间隔物210的α-氨基两者间形成的酰胺键而连接到间隔物210的α-氨基。于本实施例中，两个连接臂220a与220b分别连接到K残基。如下文所述，连接臂的自由端(即，并未连接到K残基的一端)可用于和功能性元件复合，而位于中心核N-端的环辛烯基240则可用于和额外的功能性元件或另一个接合单元复合。
<<反应式3N-端与C-端分别带有复合部分的中心核的制备>>
图2B是此处提出的接合单元的另一种替代性实实施例。在图2B中，接合单元20B至少包含四个K残基还有四个连接臂220a-220d分别连接到所述的四个K残基。第一与第二个K残基彼此间形成酰胺键而连接，而第二与第三以及第三与第四个K残基之间分别以间隔物210b与201c彼此间隔。带有一个羧基230与一个叠氮基250的复合部分是以复合部分的羧基230与N-端间隔物的α-氨基210a间形成的酰胺键而连接到N-端间隔物210a。如上所述，间隔物210a-210c可包含相同或不同的氨基酸序列及/或EG单元。
图2C是关于一种接合单元20C，其至少包含五个K残基，彼此分别以间隔物210b-210e隔开；以及五个连接臂220a-220e，分别连接至上述五个K残基。此外，作为N-端与C-端间隔物的间隔物210a与210f则分别连接至第一个K残基的N-端与最后一个K残基的C端。于本实施例中，带有一羧基230与一炔基260的复合部分透过其羧基230与间隔物210a的α-氨基间形成的酰胺键而接合至间隔物210a。
接着参照图2D，其中接合单元20D的结构与接合单元20A-20C相似，不同之处在于复合部分接合至中心核的C-端而非中心核的N-端。如图2D所示，带有一氨基235与一环辛炔基270的复合部分透过其氨基235与C-端间隔物210c的羧基间所形成的酰胺键而接合到C-端间隔物210c。
图2E提出了一种替代性的实施例，其中接合单元20E至少包含四个间隔物210a-210d。于本实施例中，作为N-端与C-端间隔物的间隔物210a与210d分别连接到第一个K残基的N-端以及最后一个K残基的C端；间隔物210b设于第三与第四个K残基之间；而间隔物210c则设于第五与第六个K残基之间。带有一氨基235与一四嗪基280的复合部分透过其氨基235与间隔物210d的羧基间形成的酰胺键而接合到间隔物210d。
图2F提出了根据本揭示内容另一实施方式，至少包含两个复合部分的接合单元20F。此处提出的中心核至少包含7个K残基。作为N-端与C-端间隔物的两个间隔物210a、210f分别设于中心核的N-端与C-端。带有一环辛炔基270的复合部分接合到间隔物210a的α-氨基，而带有一环辛烯基240的复合部分则接合到间隔物210f的羧基。如下文所述，接合单元20F可作为一载体进而分别透过连接臂220a-220g、环辛炔基270与环辛烯基240与三种不同的连接功能性基团连接。
当可理解，上文针对接合单元20A-20F或任何下述接合单元的特征描述亦适用于此处揭露的其他接合单元，且因此，这些特征的部分或全部亦适用于下文的实施例，除非其与该特定实施方式的上下文相冲突。然而，为求简洁，下文可能不会明文重复部分共通特征。
随着此处提出的连接臂在自由端的官能基(如，氨基、羧基、羟基、TBDMS、NHS、顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰苯并噻唑基、碘基、碘乙酰氨基、叠氮基、炔基、环辛炔、四嗪基或环辛烯基)不同，能够设计带有相应官能基的功能性元件(譬如，标的元件、治疗效应元件或能够提升药动学特性的元件)，而使得功能性元件可以透过以下任一种化学反应而连接到连接臂的自由端：
(1)于其间形成酰胺键：在此种情形中，连接臂的自由端带有氨基、羧基或NHS基，而功能性元件则带有氨基或羧基；
(2)于其间形成酯键：在此种情形中，连接臂的自由端带有羟基或TBDMS基，而功能性元件则带有羟基-反应基(如，甲苯磺酰-O基)；
(3)硫醇–顺丁烯二酰亚氨基(或乙烯砜)反应：在此种情形中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基或甲磺酰苯并噻唑基，而功能性元件则带有硫醇基；
(4)SN2反应：在此种情形中，连接臂的自由端带有碘基或碘乙酰氨基，而功能性元件则带有硫醇基；
(5)铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(Copper(I)-catalyzed alkyne-azidecycloaddition；CuAAC)反应：连接臂自由端与功能性元件其中之一带有叠氮基或吡啶甲基叠氮(picolyl azide)基，而另一个则带有炔基；例示性的CuAAC反应如反应式4、5；
(6)逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应：连接臂自由端与功能性元件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有环辛烯基(如，TCO或降莰烯(norbornene)基)；例示性的iEDDA反应如反应式6、7；或
(7)应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne clickchemistry，SPAAC)：连接臂自由端与功能性元件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基；例示性的SPAAC反应如反应式8。
CuAAC反应会产生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted1,2,3-triazole)。炔基和叠氮基之间的反应选择性极高，且天然生物分子不含炔基和叠氮基。再者，上述反应快速且对pH值不敏感。已知除了利用一价铜(如溴化铜(I)或碘化铜(I))来催化链接反应之外，较佳可使用二价铜和还原剂(如抗坏血酸钠)的混合物以在反应系统中原位(in situ)产生一价铜。或者是，可利用不含铜的反应，将第二元件连接到中心核的N-端或C-端，此反应可利用环戊烷基环戊二烯基氯化钌复合物(pentamethylcyclopentadienyl rutheniumchloride complex)作为催化剂，以催化叠氮基-炔环加成反应。
为了便于说明，下文将连接至连接臂的功能性元件称为第一元件。当可理解，此处提出的接合单元可携带的第一元件数目取决于中心核的连接氨基酸残基(即，K、D及/或E残基)数目，也因而取决于连接臂的数目。因此，本发明所属技术领域中具有通常知识者可视需要而调整接合单元的第一元件数目，譬如为了达到所欲的标的或效应效果而进行调整。
<<反应式4叠氮基与炔基间的CuAAC反应>>
<<反应式5吡啶甲基叠氮基与炔基间的CuAAC反应>>
<<反应式6TCO与四嗪基间的iEDDA反应>>
<<反应式7降莰烯与四嗪基间的iEDDA反应>>
<<反应式8叠氮基与DBCO基之间的SPAAC反应>>
图3A绘示了依据本揭示内容一实施方式的接合单元30A，其具有两个第一元件。所述接合单元30A的结构与图2A的接合单元20A类似，不同之处在于两个第一元件310a与310b分别透过连接臂220a与220b而连接到至中心核的K残基。图3B揭示了另一种实施方式，其中接合单元30B带有五个第一元件310a-310eM，其分别透过连接臂220a-220e而连接。相似地，在图3C中，连接臂310a-310c可用以耦接三个第一元件310a-310c。
为了加强所欲的效果(如，治疗效果)，此处提出的接合单元除了第一元件之外还可以包含第二元件。举例来说，第二元件可以是标的元件或效应元件。于本揭示内容中视需要而采用的实施方式中，第一元件为效应元件，而第二元件可以是另一种效应元件，其可和第一元件迭加地(additively)、加乘地(synergistically)或独立地(independently)作用。同样可任选地，第一与第二元件可展现不同的性质；举例来说，第一元件可以是标的元件，而第二元件为效应元件，反之亦然。或者是，第一元件为效应元件，而第二元件是能够提升接合单元药动学特性(譬如水溶性、清除作用、半衰期与生物可用率)的元件。对特定第一元件及/或第二元件的选用取决于其中此处提出的接合单元(或多臂接合单元)的应用领域。本揭示内容第I-(ii)部分讨论了某些功能性元件的实施例。
在结构上，第二元件连接到复合部分的复合基(即，叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)，所述复合部分连接到中心核的N-端或C-端。可任选地，第二元件可与短PEG链(较佳为2-12个EG重复单元)耦接，再连接到复合基。
根据本揭示内容某些实施方式，中心核的复合基是叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基；且相对应地，可将带有叠氮基-反应基(如，炔基或DBCO基)、炔-反应基(如，叠氮基)、四嗪基-反应基(如，降莰烯基或TCO基)、环辛烯基-反应基(如，四嗪基)或环辛炔基-反应基(如，叠氮基)的第二元件透过适当的链接化学反应(如CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应)而连接到中心核的复合基。
接着参照图4A。除了下文所述的特征之外，图4A与图2A大致相同。首先，接合单元40A带有分别连接到连接臂220a与220b的两个第一元件410a与410b。其次，中心核的N-端有一个环辛烯基240，且因此带有环辛烯基-反应基(如，四嗪基280)的第二元件可透过iEDDA反应而连接到环辛烯基240。
图4B提出了一种替代性的实施例，其中接合单元40B的结构与图2E的接合单元20E相近，不同之处在于中心核的C-端为叠氮基250而非四嗪基280。此外，有六个第一元件410a-410f分别连接到连接臂220a-220f，而一个带有炔基260的第二元件则透过CuAAC反应而连接至叠氮基250。
或者是，所述接合单元的N-端与C-端可分别带有复合基。如上文所述，当第一复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时，第二复合基较佳为四嗪基或环辛烯基。因此，两个功能性元件可分别透过SPAAC与iEDDA反应、或透过CuAAC与iEDDA反应而连接至中心核。举例来说，带有环辛炔基-反应基(如，叠氮基)的第二元件可透过SPAAC反应而连接到第一复合基；而带有炔基-反应基(如，叠氮基)、四嗪基-反应基(如，降莰烯基或TCO基)或环辛烯基-反应基(如，四嗪基)的第三元件则可以透过CuAAC或iEDDA反应而连接到第二复合基。或者是，带有四嗪基-反应基(如，降莰烯基或TCO基)或环辛烯基-反应基(如，四嗪基)的第二元件可透过iEDDA反应连接至第一复合基；而带有叠氮基-反应基(如，炔基或DBCO基)、炔基-反应基(如，叠氮基)或环辛炔基-反应基(如，叠氮基)的第三元则可透过CuAAC或SPAAC反应而连接至第二复合基。
图4C为根据本揭示内容实施例的接合单元40C，其至少包含分别与第二、第三元件连接的两个复合基。接合单元40C的结构和图2F的接合单元20F相似，不同之处在于第一元件410a-410g分别连接至连接臂220a-220g、带有叠氮基250的第二元件420透过SPAAC反应连接至环辛炔基270且带有四嗪基280的第三元件430透过iEDDA反应而连接至环辛烯基240。
当需要在标的部位释放效应元件时，可在连接臂中加入可裂解的键结。此种键结可在酸性/碱性水解、还原/氧化或酵素的作用下发生裂解。NHS-PEG2-20-S-S-顺丁烯二酰亚氨基(或乙烯砜)是一种可用来形成连接臂的可裂解PEG链，其中S-S是会被缓慢还原的双硫键，而NHS基则用来和中心核的氨基复合，藉以将PEG链连接到中心核上。可使用叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基来取代位于连接臂自由端的顺丁烯二酰亚氨基(或乙烯砜)基。根据本揭示内容某些实施方式，连接臂为具有2-20个EG重复单元的PEG链，且其自由端(即，未与中心核连接的一端)有一双硫键。
反应式9提供了可用于和含硫氢基分子反应的硫氢基-反应性化学基(如，顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜与卤素乙酰基)的实施例。
当反应混合物的pH值介于pH 6.5与7.5之间时，顺丁烯二酰亚氨基可专一地与硫氢基反应。硫-丁二酰亚胺加成物(thio-succinimide adduct)有些微的可逆性，在生理条件下会慢慢地发生顺丁烯二酰亚氨基清除反应(maleimide elimination)。为了避免这种逆-硫醇-迈克尔(retro-thiol-Michael)反应，可在较温和(>pH 9.0)的反应条件下进行碱催化以将硫-丁二酰亚胺加成物开环，所得产物的化学性质较为稳定。
乙烯砜基可选择性地与自由硫醇基反应。此种乙烯砜基的迈克尔加成反应适合在温和(pH 7-8)的条件下选择性地修饰标的分子的硫氢基。碘乙酰基和硫氢基的直接SN2反应会得到稳定的硫醚(thioether)键结。反应式9的R基可以是scFv、多肽、小分子药物或多臂连接单元的多肽中心核，其带有硫氢基。<<反应式9硫醇-专一接合>>
反应式10提出将蛋白成分复合至带有羟基的中心核的方法。使含羟基的中心核(1)和甲苯磺酸酯(tosylate)连接臂(2)在含有化学计量理想配比的NaH以及催化适量的NaI的环境下，进行直接醚化作用，以形成PEG连接物(3)。使上述中间产物(3)和scFv进一步进行1,4-加成反应，以得到带有所欲scFv的醚化中心核(4)。Y基为顺丁烯二酰亚氨基或乙烯砜基，其可和Y’基反应。Y’基为蛋白成分的SH基或多肽的SH基或NH2基。
<<反应式10将蛋白成分复合至带有羟基的中心核的方法>>
反应式11提出将小分子化合物复合至带有羟基的中心核的方法。使用连接臂(5)与Y’-修饰的小分子药作为起始材料，以使用各种交互连接(cross-coupling)反应来制得带有药物的甲苯磺酸酯连接臂(6)。使含羟基的中心核(1)和带有药物的甲苯磺酸酯连接臂(6)在含有化学计量理想配比的NaH以及催化适量的NaI的环境下，进行直接醚化作用，以得到带有所欲药物的醚化中心核(7)。Y为连接臂一端的功能基，选自于以下的群组：TBDMS、羟基、顺丁烯二酰亚氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。Y’为经修饰小分子药一端的功能基，选自于：羧酸、硫氢基、氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。X表示Y与Y'两个端功能基在复合反应后的交互键结。
<<反应式11将小分子成分复合至带有羟基的中心核的方法>>
反应式12揭示了制备用于反应式11的TsO-PEG6–OTBDMS连接臂的制备方法。自商业管道购得六聚乙二醇(HO-PEG6–OH)。加入TsCl/NaOH使六聚乙二醇进行单磺酸盐(monosulfonate)形成，以制得甲苯磺酸酯连接臂(8)(TsO-PEG6–OH)。接着，加入TBDMSCl/咪唑使甲苯磺酸酯连接臂(8)硅醚化(silyletherification)，以得到带有甲苯磺酰基与OTBDMS保护基的所欲连接臂(9)(TsO-PEG6–OTBDMS)。
<<反应式12用于和中心核的羟基复合的连接臂的制备>>
反应式13揭示了制备用于反应式11的另一种Cl-PEG6–OTBDMS连接臂的制备方法。加入SOCl2使六聚乙二醇进行单氯化反应(monochlorination)以得到氯化乙酰(10)(Cl-PEG6–OH)。接着，加入TBDMS-Cl/咪唑使氯化乙酰(10)硅醚化，以得到所欲的连接臂(11)(Cl-PEG6–OTBDMS)。缩写：TBAF，氟化四丁铵(tetrabutylammonium fluoride)；DCC，N,N'二环己碳二亚胺(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide)；Et3N，三乙胺(triethylamine)；TBDMS，三级丁基二甲硅基(tert-Butyldimethylsilyl)；NHS，N-羟基琥珀酰亚氨基(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)；Ts，对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)；DMF，二甲基甲酰胺(dimethylformamide)。
<<反应式13用于和中心核的羟基复合的替代性连接臂的制备>>
反应式14揭示将蛋白成分与中心核的羧酸复合的方法。在一般DCC/NHS/Et3N条件下使含CO2H的中心核(12)与带有OH基的连接臂(13)进行直接酯化反应，以得到相对应的酯化中心核(14)。接着，以scFv对酯化中心核(14)进行硫-或氮杂-迈克尔加成反应，以得到带有所欲scFv的酯化中心核(15)。连接臂的另一端带有Y基，Y可以是顺丁烯二酰亚氨基或乙烯砜基，其会和Y’基反应。Y’为蛋白成分的SH基或多肽的SH基或NH2基。
<<反应式14将蛋白成分复合至带有元件羧酸基的中心核的方法>>
反应式15揭示将小分子药物与中心核的羧酸复合的方法。在一般DCC/NHS/Et3N条件下使含CO2H的中心核(12)与带有OH基的连接臂(16)进行直接酯化反应，以得到相对应的酯化中心核(17)。接着，在适当的条件下使小分子药物和酯化中心核(17)复合，以得到带有所欲小分子药物的酯化中心核(18)。Y为连接臂一端的功能基，选自于以下的群组：TBDMS、羟基、顺丁烯二酰亚氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。Y’为经修饰小分子药一端的功能基，选自于：羧酸、硫氢基、氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。X表示Y与Y'两个端功能基在复合反应后的交互键结。
<<反应式15将小分子成分复合至带有元件羧酸基的中心核的方法>>
Y＝ Y’＝ X＝
OTBDMS 羧酸 酯键
羟基 羧酸 酯键
乙烯砜基 硫氢基 磺酰硫醚键
顺丁烯二酰亚氨基 硫氢基 磺酰硫醚键
NHS 氨基 酰胺键
叠氮基 炔基 1,2,3-三唑键
叠氮基 DBCO 三唑键
叠氮基 BCN 三唑键
TCO 四嗪 二氢吡口井键
反应式16揭示制备反应式15中所用的TsO-PEG6–OH连接臂的实施例。于本实施例中，加入TsCl/NaOH使六聚乙二醇(HO-PEG6–OH)进行单磺酸盐形成，以制得甲苯磺酸酯连接臂(8)(TsO-PEG6–OH)。接着，加入TBDMSCl/咪唑使甲苯磺酸酯连接臂(8)硅醚化(silyletherification)，以得到带有甲苯磺酰基与OTBDMS保护基的所欲连接臂(9)(TsO-PEG6–OTBDMS)。
<<反应式16与羧酸基复合的连接臂的制备>>
反应式17揭示制备Cl-PEG6–OTBDMS连接臂的替代性实施例。于本实施例中，加入SOCl2使使六聚乙二醇(HO-PEG6–OH)进行单氯化反应，以得到氯化乙酰(10)(Cl-PEG6–OH)。缩写：TBAF，氟化四丁铵(tetrabutylammonium fluoride)；DCC，N,N'二环己碳二亚胺(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide)；Et3N，三乙胺(triethylamine)；NHS，N-羟基琥珀酰亚氨基(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)；Ts，对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)；DMF，二甲基甲酰胺(dimethylformamide)。
<<反应式17与羧酸基复合的替代性连接臂的制备>>
反应式18揭示连接臂的制备及将其复合至多肽中心核的丝氨酸残基的OH基的方法。HO-PEG12-Cl(19)的制备方式与反应式17所述者相近。将HO-PEG12-Cl(19)和乙烯基磺酸钠反应，以制得HO-PEG12-乙烯砜(20)。加入TsCl/Et3N使HO-PEG12-乙烯砜(20)进行单磺酸盐形成，以制得甲苯磺酸酯连接臂(21)(TsO-PEG12-vinyl sulfone)。在另一个独立的反应中，将多肽中心核Ac-ZSZSZSC和短的连接物顺丁烯二酰亚氨基-PEG3-DBCO反应，以引入可用于链接反应的DBCO官能基。之后，使经修饰的多肽中心核(22)和甲苯磺酸酯连接臂(21)(TsO-PEG12-vinyl sulfone)反应在含有化学计量理想配比的NaH以及催化适量的NaI的环境下，制得带有PEG连接臂的多肽中心核(23)。接着，使带有PEG连接臂的多肽中心核(23)和含SH官能基的scFv进行硫-迈克尔加成反应，以得到带有所欲scFv与PEG连接臂的多肽中心核(24)。
<<反应式18将连接臂复合到多肽中心核的丝氨酸残基的方法>>
反应式19揭示将小分子药物复合到带有丝氨酸残基的多肽中心核的方法。此一方法与反应式17所述类似。在此处，在将连接臂耦接到多肽中心核的OH基之前，先将小分子药物先和连接臂耦接。使甲苯磺酸酯连接臂(5)与Y’-修饰的小分子药反应，以透过各种交互连接反应来制得带有药物的甲苯磺酸酯连接臂(6)。使含丝氨酸的多肽中心核(22)和带有药物的甲苯磺酸酯连接臂(6)在含有化学计量理想配比的NaH以及催化适量的NaI的环境下反应，以得到带有所欲药物的效应接合单元(28)。Y为连接臂一端的功能基，选自于以下的群组：OTBDMS、羟基、顺丁烯二酰亚氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。Y’为经修饰小分子药一端的功能基，选自于：羧酸、硫氢基、氨基、NHS、乙烯砜基、叠氮基、炔基、TCO、BCN、DBCO与四嗪基。X表示Y与Y'两个端功能基在复合反应后的交互键结。
<<反应式19将小分子药复合至接合单元多肽中心核丝氨酸残基的方法>>
Y＝ Y’＝ X＝
OTBDMS 羧酸 酯键
羟基 羧酸 酯键
乙烯砜基 硫氢基 磺酰硫醚键
顺丁烯二酰亚氨基 硫氢基 磺酰硫醚键
NHS 氨基 酰胺键
叠氮基 炔基 1,2,3-三唑键
叠氮基 DBCO 三唑键
叠氮基 BCN 三唑键
TCO 四嗪 二氢吡口井键
I-(ii)适用于多臂接合物的功能性元件
当接合单元(或多臂接合物)仅包含第一元件而不包含一或多个第二及/或第三元件时，第一元件为可在患者体内发会疗效的效应元件。另一方面，当此处提出的接合单元包含第一元件的外的其他元件时，则其中一种元件可为一效应元件，而另一种元件可以是另一效应元件、一标的元件或能够提升接合单元一或多种药动学特性(譬如水溶性、清除作用、半衰期与生物可用率)的元件。举例来说，所述接合单元可带有两种不同的效应元件，一种效应元件以及一种标的元件或一种改善其药动学特性的元件、两种不同的标的元件以及一种效应元件、两种不同的效应元件以及一种标的元件，或一种标的元件、一种效应元件以及一种可改善接合单元药动学特性的元件。
欲治疗液态肿瘤(diffused tumor)时，此处提出的接合单元的第一与第二元件其中一者为对一细胞表面抗原专一的抗体片段(如，scFv)，所述细胞表面抗原与液态肿瘤相关或在液态肿瘤中有过量表达；而此处提出的接合单元的第一与第二元件的另一者为细胞毒性药物或对细胞表面抗原CD3或CD16a专一的抗体片段。在较佳的情形中，此处提出的接合单元的第一元件对肿瘤相关抗原专一，且第二元件为细胞毒性药物或对细胞表面抗原CD3或CD16a专一的抗体片段。根据本揭示内容某些实施方式，与液态肿瘤相关或在液态肿瘤中有过量表达的细胞表面抗原为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138或CD319。在视需要而采行的实施例中，细胞毒性药物选自以下群组：美登素(mertansine)、奥里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)以及喜树碱(camptothecin)。
此处提出的接合单元可用以治疗以下类型的液态肿瘤：急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia，CLL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)或骨髓瘤(myeloma)。
在较佳的实施方式中，此处提出的接合单元可用以治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一元件为对CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b专一的scFv，而第二元件为细胞毒性药物或对CD3或CD16a专一的抗体片段(如scFv)。
在另一较佳的实施方式中，此处提出的接合单元可用以治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一元件为对CD79a专一的抗体片段，且第二元件为对CD79b专一的抗体片段，反之亦然。
在又一较佳的实施方式中，此处提出的接合单元可用以治疗浆细胞瘤(plasmacytoma)或多发性骨髓瘤(myeloma)，其中第一元件为对CD38、CD78、CD138或CD319专一multiple的抗体片段；且第二元件为细胞毒性药物或对CD3或CD16a专一的抗体片段。
在进一步的较佳实施方式中，此处提出的接合单元可用以治疗T细胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一元件为对CD5、CD30或CD43专一的抗体片段；且第二元件为细胞毒性药物或对CD3或CD16a专一的抗体片段。
在较佳的实施方式中，此处提出的接合单元可用以治疗骨髓性白血病，其中第一元件是对CD33或CD34专一的抗体片段，而第二元件是细胞毒性药物或对CD3或CD16a专一的抗体片段。
于治疗固态肿瘤时，本发明接合单元的第一元件可以是肽类激素、生长因子或对肿瘤相关抗原专一的抗体片段，而第二元件可以是细胞毒性药物、类铎受体(toll-likereceptor，TLR)促效剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞介素、或对生长因子、细胞表面抗原、半抗原或细胞介素专一的抗体片段。
所述肿瘤相关抗原选自以下群组：人类上皮生长因子受体1(human epidermalgrowth factor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、糖类抗原19-9(carbohydrateantigen 19-9，CA 19-9)、糖类抗原125(CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞表面相关粘蛋白1(cell surface-associated mucin 1，MUC 1)、神经节苷脂GD2(ganglioside GD2)、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、岩藻糖GM1神经节苷脂(fucosylGM1)、Neu5GcGM3、黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺专一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺干细胞抗原(prostatestem cell antigen，PSCA)、间皮素(mesothelin)、粘蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、LewisY、唾液酸化LewisY(Sialyl LewisY)、LewisA、Lewisx、肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、Globo H以及阶段专一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)。
所述肽类激素可选自：胰泌素(secretin)、胃泌素(gastrin)、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide)、似升糖素多肽1(glucagon-like polypeptide 1，GLP-1)、神经调节肽(neuromedin)、体抑素肽(octreotide)、促甲状腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)、肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、促性腺素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，GnRH)以及体抑素(somatostatin)。
所述生长因子选自：上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、突变型EGF、表皮调节素(epiregulin)、肝素结合上皮生长因子(heparin-binding epidermal growthfactor，HB-EGF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)。于一实施例中，第一标的元件为EGF、突变型EGF、HB-EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。于另一实施例中，第一效应元件为对EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF专一的抗体片段。
所述细胞表面抗原可以是PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28或CD134。
上述对半抗原专一的抗体片段可以是二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)、丹磺酰(dansyl)、盘尼西林、对胺苯甲酸以及具有序列编号：23所示氨基酸序列的多肽。
所述细胞介素可以是介白素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-10、IL-12、干扰素-α(interferon-α，IFN-α)、IFN-γ、转型生长因子-β(TGF-β)或肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)。在较佳的情形中，第二元件为对选自IL-2、IFN-α、IFN-γ与TNF-α等细胞介素专一的非中和性抗体片段。
当可理解，可对肿瘤细胞发挥细胞毒杀效果的细胞毒性药物可以是：抗雌性素(anti-estrogen，如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黄体释素促效剂(LHRH agonist，如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，如氟他胺(flutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide))、光动力治疗剂(photodynamic therapies，如维替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂Pc4(photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹红菌素(demethoxy-hypocrellin A))、氮芥(nitrogen mustard，如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法仑(melphalan))、亚硝基尿素(nitrosoureas，如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、烷基磺酸(alkylsulphonate，如白消安(busulfan)及苏消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，如达卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含铂化合物(如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid，如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine))、类紫杉醇(taxoid，如紫杉醇(paclitaxel)及欧洲紫杉醇(docetaxeal))、表鬼臼毒素(epipodophyllin，如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜树咸(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及丝裂霉素C(mytomycin C))、抗代谢药物(anti-metabolite)、二氢叶酸还原酶抑制剂(DHFR inhibitor，如胺甲喋呤(methotrexate)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依达曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-单磷酸去氢酶抑制剂(IMP dehydrogenase inhibitor，如霉酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸还原酶抑制剂(ribonuclotide reductase inhibitor，如羟基尿素(hydroxyurea)及去铁胺(deferoxamine))、尿嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶类似物(如阿糖胞苷(cytarabine，又称ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及氟达拉滨(fludarabine))、嘌呤类似物(如硫氢基嘌呤(mercaptopurine)及硫鸟嘌呤(Thioguanine))、维生素D3类似物(如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、异戊二烯抑制剂(isoprenylation inhibitor，如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(dopaminergic neurotoxin，如1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、细胞周期抑制剂(如星形孢菌素(staurosporine))、放线菌素(actinomycin，如放线菌素D)、博莱霉素(bleomycin，如博莱霉素A2、博莱霉素B2及培洛霉素(peplomycin))、蒽环类药物(anthracycline，如柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗药性抑制剂(MDR inhibitor，如维拉帕米(verapamil))、钙离子三磷酸腺苷酶抑制剂(Ca2+ATPase inhibitor，如毒胡萝卜素(thapsigargin))、伊马替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitor，如阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cediranib)、达沙替尼(dasatinib)、厄罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、司马沙尼(semaxanib)、舒尼替尼(sunitinib)、托赛拉尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、利妥昔单抗(rituximab)、索拉非尼(sorafenib)、依维莫司(everolimus)、西罗莫司(temsirolimus)、蛋白酶抑制剂(如硼替佐米(bortezomib))、哺乳类斥消灵标的蛋白抑制剂(mTOR inhibitor，例如雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、及雷帕霉素衍生物(ridaforolimus))、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨(gemcitabine)、洋红霉素(carminomycin)、亚叶酸钙(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜树碱(campathecin)、普卡霉素(plicamycin)、天门冬酰胺酶(asparaginase)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤(methopterin)、紫菜霉素(porfiromycin)、美法仑(melphalan)、异长春碱(leurosidine)、环氧长春碱(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲贝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素(carminomycin)、氨基蝶呤(aminopterin)或六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。根据本揭示内容一具体实施方式，细胞毒性药物为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。
所述类铎受体(TLR)促效剂可以是脂磷壁酸、葡聚糖、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚去氧核苷酸、脂多糖、单磷酰脂A或酵母聚糖。
本发明提出的接合单元可用以治疗以下的固态肿瘤：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
I-(iii)多臂接合物的用途
本揭示内容亦揭示了利用适当的接合单元来治疗各种疾病(如，液态肿瘤与固态肿瘤)的方法。一般而言，所述方法至少包含对需要治疗的个体投予有效量的本发明接合单元。
相较于既有的治疗性构建体，第I部分所述的接合单元至少有以下的优点：
(1)可以视需求和/或用途来调整功能性元件的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含二种元件(即，第一与第二元件)或三种元件(即，第一、第二与第三元件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲和力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/器官时，可以只使用一种元件作为效应元件，而不需加入标的元件。然而，当透过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或粘膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，所述接合单元就需要同时包含能够将接合单元专一地标的到病灶部位(如肿瘤或癌细胞/组织)的标的元件、以及可在病灶部位发挥治疗效果的效应元件。为了要提高接合单元的标的或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二种标的元件、第二种效应元件或PEG链。
(2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一元件的数目取决于中心核所包含的连接氨基酸残基的数目。由于中心核中连接氨基酸残基的数目是2到20，故每一接合单元可带有至少两个第一元件。因此，相较于传统治疗性构建体或方法仅能携带单一个分子(譬如单一个细胞毒性药物或抗体分子)，此处提出的接合单元可同时提供更多的功能性元件(不论是标的元件或效应元件)，进而可大幅提升疗效。
(3)可透过所述接合单元上的复合基将其和一功能性元件或另一分子构建体连接(如下文第II部分所述)。可利用商业方法合成此处提出的中心核。或者是，可利用反应式4-9提出的反应是来制备此处提出的中心核，其中以复合基(即，叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)取代了作为保护性基团以保护合成多肽的α-氨基的N-端9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc)。额外地或替代性地，上述复合基也可和多肽的羧基反应而与多肽连接。所制得的中心核至少包含一或两个复合基，此复合基可用于将功能性元件(如，此处提出的第二及/或第三元件)连接到中心核。
第II部分联合接合物构型分子构建体及其用途
本揭示内容的另一方面是关于包含二或更多个接合单元的分子构建体及其用途，这些接合单元透过彼此的复合部分而连接到一起。根据本揭示内容一实施方式，所述分子构建体至少包含一第一接合单元与一第二接合单元。一般而言，第一或第二接合单元的结构分别与本揭示内容上述方面与实施方式所述相同。具体来说，第一接合单元至少包含一第一中心核以及连接到第一中心核的二或更多个连接臂(下文称为第一连接臂)；第二接合单元至少包含一第二中心核以及连接到第二中心核的二或更多个连接臂(下文称为第二连接臂)。如上文第I部分所述，此处提出的中心核的特征在于其N-端或C-端上接有至少一复合部分。根据本揭示内容的某些实施方式，每一个第一与第二中心核各有一复合部分与其连接；为了便于说明，下文将连接到第一中心核的复合部分称为第一部分，而连接到第二中心核的复合部分则称为第二部分。第一元件耦接于第一连接臂，且第二元件耦接于第二连接臂。第一与第二接合单元透过发生于第一与第二复合部分间的iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接。第一与第二元件具有不同的功能，且可以分别微小分子药物或多肽、蛋白。举例来说，第一与第二元件可以是分别对两种不同抗原专一的抗体片段，譬如svFv、sdAb、Fab、或F(ab)’2或拟抗体。
更具体来说，第一与第二复合部分分别至少包含位于一端的复合基以及位于另一端的一氨基或羧基，其中上述复合基选自由以下所组成的群组：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。相对应地，可透过羧基将复合部分连接到N-端间隔物的α-氨基。或者是，可透过氨基将复合部分连接到C-端间隔物的羧基。利用此种方法连接到中心核的复合部分在其自由端带有所述的复合基。
可任选的，上述复合部分在其复合基与连接基之间至少更包含长度为2-10个EG重复单元的一PEG链。举例来说，PEG链可以是4、6、7或8个EG重复单元。
同样可任选地，第一与第二接合单元其中之一可更包含一个第三复合部分。第三复合部分可用以与第三元件或第三接合单元复合，上述第三元件可以是例如抗体片段或长链PEG。在此种情形中，第一与第二接合单元可透过链接反应而耦接。其后，已互相连接的第一与第二接合单元的第三复合部分可利用不同的链接反应而与第三元件或第三接合单元复合。
II-(i)联合接合物构型的分子构建体的结构
根据本揭示内容某些实施方式，所述分子构建体至少包含两个接合单元，且所述接合单元透过CuAAC、SPAAC或iEDDA反应而彼此连接。于某些实施方式中，其中一接合单元接有作为标的元件的复数个第一元件，而另一个接合单元则接有作为效应元件的复数个第二元件。
首先参照图5A-5C，这些图式分别绘示了两个接合单元之间的连接方式。
图5A所示的分子构建体至少包含两个接合单元50A与55A，彼此透过CuAAC反应而连接。第一接合单元50A至少包含第一中心核510、连接至第一中心核510的连接臂520(即，第一连接臂)以及连接至连接臂520的功能性元件530(即，第一元件)，其中第一中心核510的N-端或C-端间隔物接有带有叠氮基515的复合部分。相似地，第二接合单元55A至少包含第二中心核550、连接至第二中心核550的连接臂560(即，第二连接臂)以及连接至连接臂560的功能性元件570(即，第二元件)，其中第二中心核550的N-端或C-端间隔物接有带有炔基516的复合部分。因此，接合单元50A与55A可透过发生于叠氮基515与炔基516之间的CuAAC反应而彼此复合。图5A的元件符号541表示CuAAC反应形成的化学键结。
图5B是此处提出的分子构建体的另一实施例，其中第一中心核511的N-端或C-端间隔物接有带有环辛炔基517的复合部分，且第二中心核551的N-端或C-端间隔物接有带有叠氮基515的复合部分。其后，接合单元50B与55B彼此透过发生于环辛炔基517与叠氮基515之间的SPAAC反应而连接。图5B的元件符号542表示SPAAC反应形成的化学键结。
或者是，第一与第二接合单元可以透过iEDDA反应而彼此耦接。接着参照图5C。接合单元50C与55C的结构分别于接合单元50A/50B与55A/55B类似，不同之处在于中心核512与552分别接有带有四嗪基518的复合部分以及带有环辛烯基514的复合部分。接合单元50C与55C可透过发生在四嗪基518与环辛烯基514间的iEDDA反应而彼此耦接。图5C的元件符号543表示iEDDA反应形成的化学键结。
在较佳的情形中，当第一与第二连接臂其中至少一种透过CuAAC或SPAAC反应而与功能性元件连接时，则第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应而连接。或者是，当第一与第二连接臂其中至少一种透过iEDDA反应而与功能性元件连接时，则第一与第二接合单元彼此透过CuAAC或SPAAC反应而连接。
与其他治疗性构建体相较之下，本发明分子构建体至少有以下三种优点：
(1)可独立制备带有特定数目和/或类型的标的/效应元件的接合单元，之后再透过适当的链接化学反应(如CuAAC、iEDDA或SPAAC反应)将这些接合单元彼此连接在一起；
(2)可基于特定应用的需求(譬如欲治疗的疾病、以及标的和/或效应元件的结合亲和力和/或亲和力等)，来调整标的和/或效应元件的数目与种类。可根据具体的需求与应用来调整标的与效应元件的组合。可随着各种因素，譬如欲治疗的症状、患者的生理状况和/或欲治疗的疾病种类等，来改变本发明标的与效应元件。本发明所述技术领域中具有通常知识者，能够结合最适当的标的元件与最适当的效应元件，以便达到最理想的治疗效果。根据本揭示内容的实施方式，标的元件可以是生长因子、肽类激素、细胞介素或抗体片段；而效应元件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞介素、可溶性受体或抗体片段；以及
(3)在接合任两个接合单元时，此处提出的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应的接合效率优于其他接合反应。
接着参照图6，可单独制备图中绘示的六个构建体库。在本实施方式中，构建体库1-6分别包含复数个接合单元60A、60B、60C、65A、65B与65C，而每一种接合单元连接有功能性元件。接合单元60A、60B与60C的结构类似；其中接合单元60A、60B与60C分别包含一个中心核610以及特定数目的连接臂620，其中中心核的N-端或C-端610接有带有叠氮基615的复合部分。举例来说，所述接合单元60A至少包含三个连接臂620，且因此有三个标的元件630a分别连接到这三个连接臂620。相似地，接合单元60B与60C上分别接有四个标的元件630b与五个标的元件630c。标的元件630a、630b与630c可以相同或不同。至于接合单元65A、65B与65C，其分别包含一个中心核650与特定数目的连接臂660，其中中心核的N-端或C-端650接有带有环辛炔基617的复合部分。如图所示，接合单元65A，65B与65C上分别接有两个效应元件670a、三个效应元件670b以及六个效应元件670c。效应元件670a、670b与670c可以相同或不同。可分别制备构建体库1-6。本发明所属技术领域具有通常知识者可以从构建体库1、2与3中选择第一接合单元，并从构建体库4、5与6中选择第二接合单元，接着再透过发生叠氮基615与环辛炔基617之间的iEDDA反应，而将第一与第二接合单元连接在一起，因此，所得到的分子构建体即具有指定数目的标的与效应元件。
当可想见，所述分子构建体亦可包含三个接合单元，其中第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应而耦接，第三接合单元则透过CuAAC反应与第一或第二接合单元耦接。或者是，第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应而耦接，第三接合单元则透过SPAAC反应与第一或第二接合单元耦接。于某些实施方式中，第一、第二与第三接合单元分别携载复数个第一、第二与第三元件，其中第一、第二与第三元件可以相同或不同。
接着参照图7，其中接合单元70A、70B与70C透过iEDDA与SPAAC反应而耦接。在结构方面，接合单元70A、70B、70C分别包含中心核(710a、710b、710c)、连接至中心核(710a、710b、710c)的连接臂(720a、720b、720c)以及连接至连接臂(720a、720b、720c)的功能性元件(730a、730b、730c)。为了进行耦接，接合单元70A的N-端或C-端接有含四嗪基的复合部分；接合单元70B的N-端与C-端分别接有含环辛烯基的复合部分以及含叠氮基的复合部分；而接合单元70C的N-端或C-端则接有含环辛炔基的复合部分。如此一来，接合单元70A与70B可透过发生于四嗪基与环辛烯基间的iEDDA反应而耦接，图7的元件符号750代表iEDDA反应所形成的化学键结。另一方面，接合单元70B与70C则透过发生于叠氮基与环辛炔基之间的SPAAC反应而耦接，图7的元件符号760代表SPAAC反应所形成的化学键结。
当可想见，随着所欲的应用不同，分别连接至接合单元70A、70B与70C的功能性元件730a、730b、730c的数目可以相同或不同。采用图6所示的构建体库概念，可分别制备带有不同数目及/或种类功能性元件的接合单元，以得到不同的构建体库，而本发明所属技术领域中具有通常知识者能够基于分子构建体的用途来选择与组合来自构建体库的所欲接合单元。
在可选的实施方式中，本发明分子构建体可更包含相对较长的PEG链，此一长PEG链和第一或第二中心核连接，而使得在施用至一个体后，本发明分子构建体可远离网状内皮细胞(reticuloendothelial)系统而能有较长的半衰期。在利用PEG链修饰蛋白质以改善其药动学特性和/或降低免疫原性的时候，较佳可使用分子量最高为20,000-50,000道耳顿的PEG。因此，在本发明较佳的实施方式中，会使用相对较短的PEG链作为连接标的与效应元件所用的连接臂，而要提升分子构建体在活体内的半衰期时，则会将分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链连接到任一接合单元。
于某些实施方式中，可使用多个抗体片段作为标的及/或效应元件，以建构此处提出的分子构建体。对于以含有抗体片段的分子构建体为基础的标的元件/效应元件药物，其所含的抗体片段的活体内半衰期应该比个别的抗体片段来得长。在某些临床应用中，药物的半衰期越长越好，因此就不需要经常施用这些药物；对于用于上述适应症的分子构建体，可利用分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链作为连接臂，以连接作为标的或效应元件的抗体片段。可利用上述长度的PEG来修饰多种治疗性蛋白，以延长其半衰期。
使用多肽作为中心核使得本发明分子构建体具有更大的设计弹性，因为可在单一构建体中携带多份或多种标的/效应元件；因此能够提升药物递送的专一性以及其在预定标的部位的功效。可利用包含多个接合单元的分子构建体而得到多种不同的构形。举例来说：第一接合单元可携带三个scFv标的元件，而第二接合单元可携带五个治疗性药物分子；第一接合单元可携带三个scFv标的元件，而第二接合单元可携带三个scFv效应元件；第一接合单元可携带两个scFv以作为第一组标的元件、第二接合单元可携带两个scFv以作为第二组标的元件，而第三接合单元可携带五个细胞治疗性药物分子；第一接合单元可携带两个双专一性scFv作为标的元件，而第二接合单元可携带两个scFv作为效应元件；或第一接合单元可携带三个scFv作为标的元件、第二接合单元可携带两个scFv作为效应元件，并透过连接臂而连接分子量为20,000-50,000道耳顿的长PEG以提升其药动学特性。
在本发明的某些实施方式中，可利用双功PEG作为连接臂，以将作为标的或效应元件的抗体或其抗原结合片段连接到位于多肽核中的氨基。每一条PEG的一端可带有NHS基，另一端则带有顺丁烯二酰亚氨基及/或乙烯砜基。NHS基可和多肽核中的氨基耦接，而顺丁烯二酰亚氨基或乙烯砜基则可和抗体片段(如scFv、双专一性scFv或Fab片段)的半胱氨酸残基的硫氢基耦接。可设计scFv与双专一性scFv使其C-端带有一多肽接合链且最末端为半胱氨酸残基。可利用胃蛋白酶(pepsin)裂解完整IgG以得到Fab片段，且可利用温和的还原反应将链间的双硫键反应产生自由硫氢基。
当标的与效应元件都是scFv，且使用600道耳顿(12个EG单元)的PEG链作为连接臂时，此种分子构建体共有六个scFv，且其总分子量约为170,000道耳顿。带有七个scFv的分子构建体的分子量约为200,000道耳顿，而带有八个scFv的分子构建体的分子量为230,000道耳顿。根据本揭示内容所制备的大多数分子构建体的分子量小于200,000道耳顿，有一小部分的分子构建体的分子量介于200,000-250,000道耳顿之间。
当想要建构带有四组不同的scFv的分子构建体时，较佳可使一个接合单元带有接合的单链双专一性scFv(bi-scFv)，譬如scFv1-scFv2(如抗HER2与HER3)，而另外两个接合单元则分别带有一种scFv(即，分别带有scFv3与scFv4)。有两种方法能够建构上述双专一性的scFv1-scFv2。在「串联(tandem)」构形中，抗体片段的排列方式为VL1-VH1-VL2-VH2或VH1-VL1-VH2-VL2；在「双抗体(diabody)」构形中，抗体片段则是排列成VL2-VL1-VH1-VH2或VH2-VH1-VL1-VL2。可在免疫球蛋白区域间加入多肽接合链，如GGGGS(序列编号：24)重复或其他序列。
由发明人的经验推知，在经过长时间储存后，带有顺丁烯二酰亚胺与叠氮基的多肽或PEG接合链可能会因为顺丁烯二酰亚胺与叠氮基间自发的接合反应而形成聚合物。因此，在较佳的情形中，最好分别制备新鲜的各种接合单元，接着再即时将标的或效应元件连接到所述接合单元上，并透过链接反应将这些接合单元连接到一起。另一种较佳的实施方式是将标的元件和效应元件都接合到带有炔基的接合单元上，而后再将其中一种接合单元的炔基转变为叠氮基，譬如可利用一条两端都带有叠氮基的短同型双功接合物。之后就可将分别带有炔基与叠氮基的两种接合单元透过链接反应而耦接。在另一种实施方式中，连接臂自由端带有乙烯砜基，其在常规生理pH状态下，可和硫氢基反应而形成稳定的共价键结。
适用于本发明的连接臂较佳为PEG链。连接臂的长度取决于多种因素。连接臂的长度应足以对所连接的scFv或其他类型的功能性元件提供适当的弹性，使其能够在不受到立体结构限制的情形下，接近目标细胞表面上的标的抗原位置；但连接臂的长度又不应过长，以免造成连接臂和其上连接的scFv片段或功能性元件发生分子间与分子内缠结，或使得分子构建体的分子量过大而无法轻易穿透组织。过长的连接臂可能无法拉动抗原分子以形成较密实的团簇，但在某些细胞凋亡或其他细胞层次的效应中可能会需要此种团簇以启动讯息传导过程。本发明所属技术领域具有通常知识者可在不需过度实验的前提下，针对标的抗原和其结合剂的不同组合类型，决定理想的连接臂长度。在根据本揭示内容的多种分子构建体中，较佳的连接臂是NHS-(PEG)12-顺丁烯二酰亚胺(或乙烯砜)(约500道耳顿)。完全伸展后的(PEG)12链长度约为
适用于本发明的连接臂与耦合臂不限于PEG链。举例来说，可使用包含甘氨酸、丝氨酸以及其他亲水性氨基酸残基的多肽、多糖与其他生物可相容的线性聚合物，并修饰上述高分子使其带有NHS基与顺丁烯二酰亚氨基。
在某些治疗应用中，可能需要将分子构建体的效应元件从连接臂释放出来，而使得效应元件能够进入标的位置的细胞(包括与标的元件结合的细胞或其周围的细胞)，以引发药学效应。在这些情形中，可在连接臂中加入可裂解键。目前已开发出多种可裂解键，这些可裂解键会因为水解、酸解、还原裂解或酵素裂解等作用而被切开。举例来说，在发炎组织中会出现基质金属蛋白酶，已设计出会受此种酵素作用而裂解的多肽片段，并将其用于建构治疗用构建体。在多种细胞的胞内体或脂质体会出现细胞自溶酶(cathepsin)B或C，亦可在抗体药物复合体的连接臂中加入对此种细胞自溶酶敏感的多肽片段。本发明的一实施方式中使用的PEG接合物为NHS-PEG2-12-S-S-顺丁烯二酰亚胺(或乙烯砜)，在邻近顺丁烯二酰亚氨基或乙烯砜基处设有会被缓慢还原而裂解的S-S双硫键。
根据本揭示内容某些实施方式，上文实施方式中所述的标的元件可选自以下物质所组成的群组：生长因子、肽类激素、细胞介素与抗体或其片段；而效应元件可以是免疫调节剂(譬如类铎受体促效剂)、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞介素、可溶性受体或抗体或其片段。
在一些实施方式中，所述抗体片段可采用以下任一种形式：抗原结合片段(Fab)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或双专一性单链可变片段(双专一性scFv)。根据一实施方式，双专一性scFv是双专一性串联scFv或双专一性双抗体scFv。
为了保持分子构建体的扩散能力，其分子量以小于250,000道耳顿为宜。因此，在大多数的实施方式中较佳应采用scFv片段。在DNA层级，可建构基因序列以将VL与VH连接成单一多肽链，其顺序为VL-VH或VH-VL，且两者间以一多肽连接链连接，上述多肽延伸物以甘氨酸与丝氨酸为主要残基，且其长度为10-25个氨基酸。此外，在上述多肽链的C-端加入一段短的多肽延伸物，其亦可包括其他亲水性与带电氨基酸残基(譬如H、K、R、N与Q残基)，以利多肽延伸物与其C端残基保持在延伸的状态，而使C残基的SH基能够自由地用于和多臂接合单元的连接臂复合。可用以生产上述重组scFv与双专一性scFv的宿主细胞包括：细菌，如大肠杆菌(E.coli)与恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母菌，如毕氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)；与哺乳动物细胞，如CHO与HEK293细胞系
本案发明人已利用HEK293与CHO细胞产制出大量的IgG抗体、Fab、scFv与各种抗体片段、Fc构型蛋白与其他重组抗体，以供活体外系统与动物模型试验用。本案发明人亦已开发出多种细胞系，以产制用于人类临床试验的抗体。在实验室研究阶段，只要使用几个1-2升的烧瓶，即可轻易地制备HEK293暂时表达系统，进而生产1克左右的IgG或抗体片段。一般来说，适用于本发明所述分子构建体的scFv片段通常不带有糖类修饰，而且糖类修饰也不是scFv与其抗原标的结合所必须的。更有甚者，所述的scFv片段中只有一个双硫键以及一个位在末端的半胱氨酸残基。因此，也可利用小规模的细菌表达系统来制备scFv。使用大肠杆菌时，可选用能从细胞内包涵体(intracellular inclusion bodies)或胞外质(periplasm)中收取scFv或可收取分泌性scFv的表达系统。在大多数的情形中，可利用蛋白L(Protein L)以亲和管柱法来纯化scFv，上述蛋白L可和大多数κ轻链的VH互动；而在其他情形中则可使用离子交换管柱。
根据本发明多个实施例，所述的联合接合物平台主要运用scFv与Fab作为标的和/或效应元件。然而，亦可从sdAb或其他抗体片段所组成的大型抗体库中筛选出特定的结合分子，此类结合分子并不是以免疫球蛋白区域为基础，但其针对所选的标的分子有专一结合亲和力，因而有和抗体类似的功能，这些结合分子包括以下类型：(1)适配体(aptamer)，包含可和目标分子结合的寡核苷酸或短肽；(2)Fyn激酶衍生物(fynomer)，包含衍生自人类Fyn激酶SH3区域的小的结合蛋白；(3)黏合素(affimer)，包含衍生自半胱氨酸蛋白抑制剂(cystatin)家族的结合蛋白；以及(4)经设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrinrepeat protein，DARPin)，此类蛋白是利用遗传工程设计，设计出包含三、四或五个由天然锚蛋白衍生的结构的重复区段。上述这些抗体拟似物的分子量约约为10K至20K道耳顿。
II-(ii)适用于联合接合物分子构建体的功能性元件
如上文所述，此处提出的联合接合物包含至少两个接合单元，其中第一接合单元携载一或多标的元件或可促进药动学特性的元件，而第二接合单元携载一或多效应元件，反之亦然。为了实现所欲的效果，本发明所属技术领域具有通常知识者可根据上文I-(ii)部分所记载的第一与第二元件，来选择适当的功能性元件作为标的元件、效应元件及/或提升药动学特性的元件。
II-(iii)联合接合物分子构建体的用途
本揭示内容亦揭示了利用适当的联合接合物分子构建体来治疗各种疾病的方法。一般而言，所述方法至少包含对需要治疗的个体投予有效量的所述联合接合物分子构建体。
当可理解，针对本揭示内容其他方面与实施方式所述的功能性元件的例示亦适用于此处提出的分子构建体，为求简洁，此处不再赘述。
然而，为了进一步说明，此处讨论了利用本案的分子构建体来治疗各种类型的肺癌。对罹患不同类型肺癌的患者，可施用带有以下效应元件的接合单元或分子构建体：
(1)细胞毒性药物：美登素、单甲基奥里斯他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)，吡咯二氮平(pyrrolobenzodizepine，PBD)、来那度胺、泊马度胺(pomalidomide)、艾瑞布林(erybulin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)A、微管蛋白裂解素B、阿霉素、卡奇霉素与喜树碱；
(2)免疫刺激剂：类铎受体促效剂、单磷酰脂A；或
(3)免疫检查点抑制剂：对CTLA-4、PD-1与PD-L1专一的抗体、抗体片段或拟抗体。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明。这些实验例仅为例示，且不应将其视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。
实验例
实验例1：作为多肽中心核的多肽1至4的直接合成
设计了四种可作为多臂接合单元的中心核的含复合基多肽。利用标准固态合成方法直接合成含复合基多肽1至4(由ChinaPeptid公司客制化生产；上海；中国)，之后再利用Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D HPLC系统进行反相高效能液态层析(high-performanceliquid chromatography，HPLC)，以得到至少95％纯度。反相HPLC使用Kromasil 100-5C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为5％至20％、15分钟，流速为1.0mL/min、管柱温度25℃。
多肽1(纯度：95.52％)的序列如SEQ ID NO:1(GGSGGSGGSKGSGSKGSK)所示，其N-端与C-端皆经化学修饰。具体来说，SEQ ID NO:1的N-端经4-戊炔酸的酰胺化修饰，而C-端则经甲醇酯化。多肽2(纯度：97.05％)的序列如SEQ ID NO:2(GGSGGSKGSKGSKGSKGSK)所示，其N-端与C-端分别经2-叠氮乙酸与甲醇修饰。于制备多肽3(纯度：98.71％)时，将如SEQ IDNO:3(GSSGSSKGSGKGSGKGSGKGSGK)所示的多肽序列以3-丁炔酸进行N-端酰胺化，并以酰胺树脂在C-端进行一集酰胺形成。相似地，对于多肽4(纯度：95.95％)，将如SEQ ID NO:4(GSSGSSGSSGSKGSGSKGSGSK)所示的多肽以外-5-降莰烯羧酸将其N端酰胺化，且同样将其C-端酰胺化。
分别以API 150EX Applied Biosystem电洒游离质谱分析仪(electrosprayionization mass spectrometry，ESI-MS)来分析所合成的多肽。
多肽1(SEQ ID NO:1)的结构如下图所示，其分子量(m.w.)为约1532.58道耳顿。
多肽2(SEQ ID NO:2)的结构如下图所示，其分子量为约1734.84道耳顿。
多肽3(SEQ ID NO:3)的结构如下图所示，其分子量为约2004.977道耳顿。
多肽4(SEQ ID NO:4)的结构如下图所示，其分子量为约1,935.98道耳顿。
利用反相分析级HPLC来分析纯化的含降莰烯的多肽4样本，使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度25℃，测量210nm下的紫外线(UV)吸收度(OD210)。图8A为含降莰烯的多肽4的反相分析级HPLC图谱，在滞留时间约14.17分钟(箭头#2；箭头#1为析出溶剂的波峰)出现含降莰烯的多肽4的波峰。图8B为多肽4的MALDI-TOF质谱分析结果。U除非另有指明，此处的质谱分析都是由中央研究院分子生物学研究中心质谱核心设施(台北)进行分析，所用的设备为Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker Daltonics，Bremen，德国)。
实验例2：作为多肽中心核的聚乙二醇化多肽5的直接合成
同样利用标准固态合成方法直接合成多肽5(由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd客制化生产；上海；中国)，其结构如下图所示，其中聚乙二醇化多肽的序列如SEQ ID NO:5(-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K-Xaa4-K)所示，其N-端经叠氮乙酸修饰，而C-端经甲醇修饰。发明人设计了多肽结构并交由Shanghai WuXi AppTech Co.，Ltd.(上海，中国)制备。
使用Agilent Nexera-i 1200HPLC-BE系统进行反相HPLC以将含叠氮的聚乙二醇化多肽5纯化到97.58％的纯度。反相HPLC使用Gemini-NX C18管柱(150mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为10％至40％、20分钟，流速为1.0mL/min、管柱温度25℃。图9A为含叠氮的聚乙二醇化多肽5的反相分析级HPLC图谱，在滞留时间7.941分钟可观察到含叠氮的聚乙二醇化多肽5的波峰。
使用ESI-MS来鉴别做为中心核的含叠氮的聚乙二醇化多肽5。图9B显示此处提出的聚乙二醇化多肽5多肽中心核携带一个有叠氮基的耦合臂。ESI-MS分析结果显示此一分子构建体的分子量为约996.6道耳顿。
实验例3：作为多肽中心核的多肽6至10的直接合成
设计了五种可作为多臂接合单元的中心核的含复合基多肽。利用标准固态合成方法直接合成含复合基多肽6至10(多肽6、10由ChinaPeptid公司客制化生产；上海；中国；多肽7至9由NingBo KareBay Co.,Ltd客制化生产；宁波；中国)。
多肽6(如下图所示)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(GGSGGSKGSKGSKGSKGSK)所示，然其N-端经叠氮-Xaa5-酸修饰，而C-端则经过C-端酰胺化。多肽6中心核具有五个K残基，彼此间以含GS的间隔物隔开，且其N-端的叠氮基可以用来和带有相应反应基的元件或另一个接合单元进行链接反应。
利用反相分析级HPLC以Kromasil 100-5 C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)来分析纯化的多肽6样本，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为15％至30％、12分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度35℃。
以ESI-MS分析所得到的多肽6。ESI-MS分析结果显示此一分子构建体的分子量为约1954.15道耳顿。
多肽7(如下图所示)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(GGSGGSGGSKGSGSKGSK)所示，然其N-端经DBCO-酸修饰，而C-端则利用酰胺树脂进行C-端酰胺化。多肽7中心核N-端的DBCO可以用来和一元件或另一个接合单元进行链接反应。
利用反相分析级HPLC以Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)来分析纯化的多肽7样本，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至73％、30分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度25℃；测量300nm下的UV吸收度。图10A为含DBCO的多肽7的反相分析级HPLC图谱，在滞留时间19.166分钟可观察到其波峰。
利用MALDI-TOF分析此处制得的含DBCO多肽7。图10B显示含DBCO多肽7的分子量为约1,734.73道耳顿。
如下图所示，多肽8的序列为SKSKSK(SEQ ID NO:6)，其N-端经叠氮-Xaa6-酸修饰，且C-端经酰胺树脂酰胺化。多肽8(如下图所示)至少包含三个K残基，彼此间以相同的间隔物序列(即，单一S残基)隔开。此一含叠氮多肽8的分子量为约1024.17道耳顿。
如下图所示，多肽9的序列为KKK(亦即，K残基间没有间隔物)，其中N-端经炔丙基-Xaa6-酸修饰，而C-端经C-端一级酰胺化修饰。图11A的资料显示炔基多肽9的分子量为约732.454道耳顿。
如下图所示，多肽10(KSKGK；SEQ ID NO:7)的N-端经乙酸修饰，且C-端经氨基-Xaa8-叠氮修饰。多肽10中心核具有一个乙酰基可以保护N-端的氨基，并有一C-端的叠氮基可供和一元件或接合单元进行链接反应。多肽10至少包含三个K残基，第一与第二K残基间的间隔物序列为S，且第二与第三K残基间的间隔物序列为G。图11B显示多肽10的分子量为约1,009道耳顿。
实验例4：含有双重复合基的多肽11(SEQ ID NO:8)的直接合成，其可作为用以建构多臂接合单元的多肽中心核
如下图所示，多肽11的氨基酸序列如SEQ ID NO:8(GGSGGSKGSSGKGGSGGS)所示，其中N-端经外-5-降莰烯羧酸修饰，且C-端经3-叠氮丙胺修饰。可利用多肽11(如下图所示)作为建构中心接合单元的中心核，其N-端的外-5-降莰烯基可用于和一元件或接合单元进行链接反应，而C-端的叠氮基则可和另一元件或接合单元进行链接反应。含有双重复合基的多肽11是由ChinaPeptid公司客制化生产。
实验例5：胆囊收缩素八肽(CCK8)片段(SEQ ID NO:9)的合成
含CCK8多肽的序列为CGGGGSDYMGWMDF(SEQ ID NO:9)，其N-端经乙酸修饰，且C-端经酰胺树脂酰胺化。含CCK8多肽由CCK的8个氨基酸残基在N-端加上连续的6个氨基酸残基(CGGGGS；SEQ ID NO:10)所组成，如此一来，其N-端带有半胱氨酸残基。N-端的半胱氨酸残基有SH基，可供和此处提出的接合单元的PEG-顺丁烯二酰亚氨基连接臂耦接。此一多肽亦由ChinaPeptid公司客制化生产。
利用ESI-MS来分析所合成的含CCK8多肽。以ESI质谱分析产物的结果如图12A所示，质谱分析结果为：(ESI-TOF)m/z:[M+H]+-calculated for C65H86N16O21S3 1523.67；found 1523.5418。MS质谱可在以下四点观察到同位素波峰：1524.5448、1525.5458、1526.5458与1527.5458，分别对应于[M+H+1]+、[M+H+2]+、[M+H+3]+与[M+H+4]+。
实验例6：含CCK8多肽与Mal-PEG6-NHS的耦接
使含CCK8多肽的硫醇基和异型双功接合物Mal-PEG6-NHS反应。将多肽溶于100％DMSO，最终浓度10mM，并将异型双功接合物Mal-PEG6-NHS溶于100％DMSO，最终浓度250mM。将Mal-PEG6-NHS接合物加入溶解的多肽溶液中，使接合物最终浓度为10mM(即，相对于10mM多肽溶液为1倍摩尔过剩)。在室温下将反应混合物培育一晚。
以反相HPLC利用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)纯化CCK8-PEG6-NHS，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为30％至100％、30分钟，流速为3.0mL/min、管柱温度25℃。测量在254nm的UV吸收度以得到DM1-PEG6-NHS的反相HPLC冲提图谱。
利用质谱ESI分析所得到的CCK8-PEG6-NHS(图12B)。质谱分析结果为：(ESI-TOF)m/z:[M+2H]2+-calculated for C91H125N19O34S3 2125.28；found2123.79。MS质谱可在以下位置观察到同位素波峰：1063.398、1063.8978、1064.4003、1064.9022与1065.4061，分别对应于[M+2H+1]2+、[M+2H+2]2+、[M+2H+3]2+、[M+2H+4]2+与[M+2H+5]2+。
实验例7：美登素(DM1)与Mal-PEG6-CO2H的耦接
DM1购自ALB Technology Inc.(香港，中国)。将带有SH基的DM1和异型双功接合物耦接以及纯化的方法与上文所述实验例相似。
简言之，将DM1分子的硫醇基和异型双功接合物Mal-PEG6-CO2H反应。将DM1溶于100％DMSO，最终浓度为10mM，并且将Mal-PEG6-CO2H溶于100％DMSO，最终浓度为250mM。将Mal-PEG6-CO2H连接物加入溶解的多肽溶液中，使接合物最终浓度为10mM(即，相对于10mM多肽溶液为1倍摩尔过剩)。在室温下将反应混合物培育一晚。
以反相HPLC利用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)纯化DM1-PEG6-CO2H，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为30％至100％、30分钟，流速为3.0mL/min、管柱温度25℃。测量在254nm的UV吸收度以得到DM1-PEG6-CO2H的反相HPLC冲提图谱，结果显示在滞留时间约11.5分钟可观察到DM1-PEG6-CO2H的冲提波峰。对所合成的DM1-PEG6-CO2H(如上图所示)进行质谱分析，结果显示此分子构建体的分子量为约1,242.429道耳顿。
实验例8：以多肽7作为多肽中心核并以TFP-PEG12-Mal或NHS-PEG6-Mal作为连接臂的含DBCO接合单元的合成
于本实施例中，将三个PEG12-顺丁烯二酰亚氨基连接臂耦接到作为多肽中心核的DBCO-多肽7。自QuantaBiodesign Inc(Plain City,USA)购得TFP-PEG12-顺丁烯二酰亚胺酯([α-顺丁烯二酰亚氨基-ω-(2.3.5.6-四氟苯基丙酰氨基)-十二聚乙二醇]酯([alpha-maleinimido-omega-(2.3.5.6-tetrafluorophenyl-propionamido)-dodecaethyleneglycol]ester))连接物。依制造商的指示进行耦接；将带有K残基的多肽溶于100％DMSO，最终浓度10mM。将TFP-PEG12-顺丁烯二酰亚氨基连接物加入溶解的多肽中，连接物最终浓度60mM(相对于10mM多肽溶液为6倍摩尔过剩)。将催化剂有机碱1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane；DABCO)(5当量)加入至反应混合物。在室温下将反应混合物培育18小时。
如下图所示，所合成的顺丁烯二酰亚氨基-PEG12-DBCO-多肽7耦接物带有一个含DBCO的耦合臂以及三个含顺丁烯二酰亚氨基的PEG连接臂；图13A的MALDI-TOF质谱分析结果显示此一分子构建体的分子量为约3,978道耳顿。
将三个PEG6-顺丁烯二酰亚氨基连接臂耦接到DBCO-多肽7中心核。NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚胺酯((succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-hexaethyleneglycol])ester)连接物购自Conju-probe Inc.。依制造商的建议进行耦接；将带有K残基的多肽溶于100％DMSO，最终浓度10mM。将NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚氨基连接物加入溶解的多肽中，最终浓度60mM(相对于10mM多肽溶液为6倍摩尔过剩)。将催化剂有机碱DABCO(5当量)加入至反应混合物。在室温下将反应混合物培育18小时。
所合成的顺丁烯二酰亚氨基-PEG6-叠氮-多肽7带有一个含DBCO的耦合臂以及三个含顺丁烯二酰亚氨基的PEG连接臂，分析结果显示其分子量为约3,186.687道耳顿(图13B)。
实验例9：将NHS-PEG6-Mal复合至含叠氮多肽8的NH2基以合成多臂接合单元
利用上文实验例所述的流程来耦接接合物。以MALDI-TOF分析所得到的PEG6-顺丁烯二酰亚氨基-叠氮-多肽8。
如下图所示，所合成的顺丁烯二酰亚氨基-PEG6-叠氮-多肽8带有一个含叠氮基的耦合臂以及三个含顺丁烯二酰亚氨基的PEG连接臂；图14的MALDI-TOF质谱分析结果显示此一分子构建体的分子量为约1,024.627道耳顿。
实验例10：将NHS-PEG6-Mal复合至含炔基多肽9的NH2基以合成多臂接合单元
利用上文实验例所述的流程来耦接接合物。以MALDI-TOF分析所得到的PEG6-顺丁烯二酰亚氨基-炔基-多肽9。
如下图所示，所合成的顺丁烯二酰亚氨基-PEG6-炔基-多肽9带有一个含炔基的耦合臂以及三个含顺丁烯二酰亚氨基的PEG连接臂；图15的MALDI-TOF质谱分析结果显示此一分子构建体的分子量为约2,194.13道耳顿。
实验例11：以多肽12(SEQ ID NO:11)做为多肽中心核并以RSGSSG(SEQ ID NO:12)做为连接臂的含降莰烯基接合单元的直接合成
利用标准芴甲氧羰基化学法(standard Fmoc chemistry)人工合成含降莰烯基的接合单元，其以多肽12做为多肽中心核并以多肽RSGSSG(SEQ ID NO:12)做为连接臂。如下图所示，连接臂的N-端经苯基顺丁烯二酰亚氨基修饰。含降莰烯基且带有经苯基顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元由本案发明人设计并委由ONTORES Co.,Ltd.(杭州，中国)生产。
以反相分析级HPLC分析含降莰烯基且带有经苯基顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元的纯化样本，所用管柱为C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为27％至47％、20分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度30℃。
利用质谱ESI-MS来分析所合成的含降莰烯基且带有经苯基顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元。
此处提出的含降莰烯基且带有经苯基顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元是一种以多肽中心核为基础的接合单元，其带有一个含降莰烯基的耦合臂以及三个自由端带有苯基顺丁烯二酰亚氨基的连接臂。所合成的接合单元的质谱分析结果显示在966处有一个强分子离子讯号，对应于[M+3H]3+，这代表本接合单元的实际分子量约为2,895道耳顿。
实验例12：以多肽13(SEQ ID NO:1)做为多肽中心核并以RSGSSG(SEQ ID NO:12)做为连接臂的含炔基接合单元的直接合成
利用标准Fmoc化学法人工合成含炔基的接合单元，其以多肽13做为多肽中心核并以多肽RSGSSG(SEQ ID NO:12)做为连接臂。如下图所示，多肽13的N-端与C-端分别经4-戊炔酸酰胺化以及经甲醇酯化；连接臂的N-端经3-顺丁烯二酰亚胺丙酸修饰。含炔基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元由本案发明人设计并委由ShanghaiChinaPeptide Co.,Ltd.(上海，中国)生产。
以反相分析级HPLC分析含炔基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元的纯化样本，所用管柱为kromasil 100-5 C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为5％至48％、15分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度35℃。图16为含炔基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元的反相HPLC图谱，其波峰以箭头指示。
利用MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的含炔基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元。
此处提出的含炔基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元是一种以多肽中心核为基础的接合单元，其带有一个含炔基的耦合臂以及三个自由端带有顺丁烯二酰亚氨基的连接臂。图17的MALDI-TOF质谱分析结果显示此一分子构建体的分子量为约3,583.701道耳顿。
实验例13：以多肽14(SEQ ID NO:13)做为多肽中心核并以SGSSGSSG(SEQ ID NO:14)做为连接臂的含甲基四嗪基接合单元的直接合成
利用标准Fmoc化学法人工合成含甲基四嗪基的接合单元，其以多肽14做为多肽中心核并以SGSSGSSG(SEQ ID NO:14)做为连接臂。如下图所示，连接臂的N-端经3-顺丁烯二酰亚胺丙酸修饰。含甲基四嗪基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元由本案发明人设计并委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.生产。
以反相分析级HPLC分析含甲基四嗪基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元的纯化样本，所用管柱为Gemini-NX 5u C18管柱管柱(150mm X 4.6mm；4μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为10％至40％、20分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度30℃。
利用MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的含甲基四嗪基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元。
此处提出的含甲基四嗪基且带有经顺丁烯二酰亚氨基修饰的连接臂的接合单元是一种以多肽中心核为基础的接合单元，其带有一个含甲基四嗪基的耦合臂以及三个自由端带有顺丁烯二酰亚氨基的连接臂。MALDI-TOF质谱分析结果显示此分子构建体的分子量为约1,038道耳顿。
实验例14：将NHS-PEG6-CCK8复合至含DBCO多肽7的NH2基
本实验例将三个PEG6-CCK8耦接到含DBCO多肽7的多肽中心核。依上文实验例制备NHS-PEG6-CCK8。
依制造商的建议进行耦接；将带有K残基的多肽溶于100％DMSO，最终浓度1mM。将所制得的NHS-PEG6-CCK8加入溶解的多肽中，最终浓度6mM(相对于1mM多肽溶液为6倍摩尔过剩)。将催化剂有机碱DABCO(50当量)加入至反应混合物。在室温下将反应混合物培育18小时。以反相HPLC纯化CCK8-PEG6-conjugated DBCO-多肽7，所用管柱为Princeton SPHER-300C18管柱(250mm X 30mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至73％、28分钟，流速为27.0ml/min、管柱温度25℃。
如下图所示，所合成的CCK8-PEG6-DBCO-多肽7带有一个含DBCO基的耦合臂以及三个含CCK8多肽的PEG连接臂。质谱分析结果为：(ESI-TOF)m/z:[M+H]+-calculated forC334H470N77O119S9 7751.0574；found 7751.0533。可在MS质谱观察到以下九个同位素波峰：7752.0714、7753.0759、7754.0818、7755.0820、7756.0849、7757.0353、7758.0647、7759.0844与7760.0636，分
别对应于[M+H+1]+、[M+H+2]+、[M+H+3]+、[M+H+4]+、[M+H+5]+、[M+H+6]+、[M+H+7]+、[M+H+8]+and[M+H+9]+(图18)。
实验例15：将CO2H-PEG6-DM1复合至含叠氮多肽2的NH2基
将所合成的含叠氮的多肽2(ChinaPeptide Inc.，上海，中国)溶于100％DMSO，最终浓度10mM。采用上文实验例的方法制备CO2H-PEG6-DM1。
在100％CH2Cl2中将含叠氮的多肽2与有机碱DMAP以1/15的摩尔比混合。在将CO2H-PEG6-DM1耦接到含叠氮的多肽2之前，将乙基(二甲基三胺丙)碳二亚胺(ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)加入至CO2H-PEG6-DM1的100％CH2Cl2溶液中，CO2H-PEG6-DM1与EDC的混合摩尔比为1：2，并培育一段时间以活化CO2H-PEG6-DM1分子的CO2H基。接着，将经EDC活化的CO2H-PEG6-DM1加入至含叠氮多肽2的100％CH2Cl2溶液中，使含叠氮的多肽2与CO2H-PEG6-DM1的最终摩尔比为1：6。再将反应混合物于室温下培育一晚。
以反相HPLC来纯化含叠氮的多肽2，所用管柱为Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为3.0ml/min、管柱温度25℃。
图20为耦接了五个DM1分子的含叠氮的多肽2(如下图所示)的反相HPLC冲提图谱，其在滞留时间约17.8分钟有一波峰。图20为所合成的耦接了五个DM1分子的含叠氮的多肽2的质谱分析结果，由图中可以看出本分子构建体的分子量为约7,856.2道耳顿。
实验例16：含CCK8的标的束的直接合成，其以含叠氮的多肽15(SEQ ID NO:15)为多肽中心核并以EGGGGSDYMGWMDF(SEQ ID NO:16)做为连接有CCK8多肽的标的元件连接臂
于本实验例中，合成含CCK8的标的束。此一标的束(如下图所示)带有含叠氮的多肽15(做为多肽中心核)与四个分支臂；上述分支臂的序列为EGGGGSDYMGWMDF(SEQ ID NO:16)，其由一连接臂(序列为EGGGGS；SEQ ID NO:17)以及一CCK八肽(序列为DYMGWMDF；SEQID NO:18)所组成，且其自由端有一级酰胺修饰。利用标准Fmoc化学法人工合成此一含CCK8的标的束。CCK8-标的束由本案发明人设计并委由Shanghai ChinaPeptide Co.,Ltd.(上海，中国)生产。
以反相分析级HPLC分析含CCK8的标的束的纯化样本，所用管柱为kromasil 100-5C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为35％至84％、15分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度35℃。图21的反相HPLC图谱显示在滞留时间约8.988分钟可观察到CCK8-标的束的冲提波峰；本分析测量在254nm下的UV吸收度。含CCK8的标的束的纯度为95.25％。
利用质谱ESI-TOF来鉴别此一含CCK8的标的束。图22的质谱ESI-TOF分析结果显示此一分子构建体的分子量为约1,608.6944道耳顿(ESI-TOF)m/z(z＝5):[M+5H]5+。
实验例17：以Expi293F过度表达系统生产对人类CD3专一的scFv
于制备突变替利珠单抗(teplizumab)的scFv时，使用人源化抗体的VH与VL的DNA序列，而未进一步进行密码子优化。合成编码以下序列的的DNA序列：VH-GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:19)-VL-(GGGGS)2(SEQ ID NO:20)-C。替利珠单抗抗体分子VH的CDR3中带有半胱氨酸残基，这会干扰上文所述的SH-顺丁烯二酰亚胺复合。故本实验例制备了突变的替利珠单抗，将半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基。对于人类CD3专一的scFv的氨基酸序列如SEQID NO:21所示。
于利用哺乳类动物表达系统来制备重组蛋白时，采用以Expi293FTM细胞为基础的过度表达系统。所用系统使用ExpiFectamineTM293转染套组(Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM细胞株、阳离子脂质是ExpiFectamineTM293试剂、ExpiFectamineTM293转染强化剂1与2、以及培养基(Gibco,New York,USA)。
将编码基因的序列置于pcDNA3表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255ml培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲和力层析法纯化培养基中的scFv重组蛋白。
MALDI-TOF质谱分析显示所制得的scFv分子量为约27,643道耳顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯(Coomassie)染色来分析突变替利珠单抗以及抗CD3scFv的纯度。图23A为突变替利珠单抗的纯化scFv的SDS-PAGE分析结果。
实验例18：利用染色分析检视突变替利珠单抗scFv对Jurkat T细胞株上人类CD3的结合能力
利用Jurkat T细胞株来探究突变替利珠单抗是否会与表达CD3的人类T淋巴细胞结合。Jurkat细胞为人类T淋巴细胞的不死化细胞株，细胞表面会表达T细胞受体(TcR)/CD3复合物。
将2x106个Jurkat T细胞和PBS(带有1％FBS与0.1％叠氮化钠)中的0.1或1μg/ml的scFv在冰上培育30分钟。冲洗细胞后，将其与FITC-复合的蛋白L(ACROBiosystems Inc.,Newark,USA)(以1：200的倍率稀释于PBS/FBS中)在4℃下于黑暗中培育30分钟。以蛋白L-FITC与FITC-复合的兔抗小鼠IgG.Fc(AbD Serotec)做为二次抗体。负对照组仅使用二次抗体染色。使用对人类CD3专一的小鼠单株抗体OKT3做为阳性对照组。使用FACS(FACSCantoII；BD Biosciences)分析细胞染色结果。长条图的X轴表示萤光强度。图23B显示突变替利珠单抗可结合至T细胞。
实验例19：DBCO-对CD3专一的scFv的制备
利用上文实验例所述的方式合成与表达编码SEQ ID NO:12的DNA序列。对CD63专一的VH与VL序列为突变替利珠单抗的VH与VL序列。于和Mal-PEG5-DBCO(Conju-probe,Inc.)复合时，利用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称TCEP)使纯化的突变替利珠单抗scFv的C-端的半胱氨酸残基还原，[TCEP]:[scFv]的摩尔比为1：1，在室温、温和摇晃下反应3小时。使用NAP-10Sephadex G-25管柱在4℃下将经还原的抗-CD3 scFv缓冲液置换为HEPES缓冲液(100mM HEPES，pH7.0，含100mM NaCl、10％丙三醇与5mM EDTA)。于还原反应以及缓冲液置换后，加入摩尔比1：1的Mal-PEG5-DBCO与scFv，在室温下使复合反应进行1小时。使用去盐管柱移除过量的连接物，并分析与DBCO复合的scFv产物。
MALDI-TOF质谱分析的结果显示与DBCO复合的对CD3专一scFv产物的分子量为约28,148道耳顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯(Coomassie)染色来分析与DBCO复合的对CD3专一scFv的纯度(资料未显示)。图23C为与DBCO复合的对CD3专一scFv与抗-CD3 scFv(阳性对照)的流式细胞分析结果。分析结果显示，此处提出的与DBCO复合的对CD3专一scFv和未复合的scFv一样会和T细胞结合。
实验例20：利用染色分析检视CCK8多肽对表达CCK类B受体的肿瘤细胞株的结合能力
分析CCK8多肽是否会结合到表达人类CCK类B受体的Panc-1肿瘤细胞株。Panc-1来自56岁高加索裔个体经胰脏-十二指肠胰脏切除后取下的胰脏癌细胞。透过活体外与活体内分析来确认本细胞株的恶性程度。
于染色前，将含Cys的CCK8多肽和顺丁烯二酰亚氨基-FITC复合，以得到经FITC标记的CCK8多肽，以利透过FITC侦测CCK8分子。之后将2x106个Panc-1细胞和150μg/ml的CCK8-FITC反应混合物(于PBS中，含1％FBS与1％叠氮化钠)在冰上于黑暗中培育30分钟。单独使用顺丁烯二酰亚氨基-FITC染色做为负对照组。使用FACS(FACSCanto II；BDBiosciences)分析细胞染色结果。长条图的X轴表示萤光强度。于图24中，黑色区域表示Panc-1细胞萤光强度分布的背景，虚线表示经顺丁烯二酰亚氨基-FITC染色的Panc-1细胞的萤光强度分布，而实线表示经CCK8-FITC染色的Panc-1细胞的萤光强度分布。染色分析的结果显示经FITC标记的CCK8多肽分子可结合到Panc-1细胞。
实验例21：由含CCK8的四臂标的束以及做为效应元件的对CD3专一scFv组成的分子构建体的制备
于本实施例中，透过SPAAC反应来耦接上文实验例所制备的含CCK8的标的接合单元以及做为效应元件的DBCO-对CD3专一scFv。如上文所述，标的接合单元的分枝臂序列如SEQ ID NO:16所示，且带有一自由叠氮基。
依制造商(Conju-Probe Inc.)的指示进行SPAAC反应。简言之。以1：1([叠氮]:[DBCO])的摩尔比将113μl的标的接合单元(12.4mg/ml)加入至含有效应元件的溶液中。将反应混合物在室温下培育3小时。
产物的结构如下图所示，所得产物是一个单一接合单元分子构建体，其带有四个连接臂分别与CCK8连接，以及一个做为效应元件的对CD3专一的scFv。经过复合反应的反应混合物的SDS-PAGE分析结果显示，此处提出的分子构建体的分子量与预期分子量相符。
实验例22：由带有三个CCK8多肽分子做为标的接合单元以及带有5个DM1分子的效应接合单元组成的联合接合物构型的分子构建体的制备
使用如上文实验例所述的方式进行SPAAC反应。
于本实施例中，利用上文实验例所述的方式使带有三个CCK多肽分子和一个自由DBCO基的标的接合单元和带有五个DM1分子以及一个自由叠氮基的效应接合单元(载药束)透过SPAAC反应而耦接。如下图所示，所得到的联合接合物构型的分子构建体有三个CCK8多肽以及一个带有五个DM1分子的载药束。质谱分析结果为：(ESI-TOF)m/z:[M+H]+-calculated for C686H993N129O246S14Cl5Na1 15632.07；found 15630.6186。在MS质谱可在以下位置观察到六个同位素波峰：15631.6699、15632.6877、15633.5712、15634.4507、15635.5302与15637.6933，分别对应于[M+H+1]+、[M+H+2]+、[M+H+3]+、[M+H+4]+、[M+H+5]+以及[M+H+6]+(图25)。
实验例23：在有谷胱甘肽的情形下对合成的DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16(SEQ ID NO:22)复合物以及甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16(SEQ ID NO:22)复合物的硫醇-交换加合物进行MALTI-TOF质谱分析
当反应混合物的pH介于6.5与7.5之间时，顺丁烯二酰亚氨基可专一地和含硫氢基的分子反应。对于多种生物性复合物会使用硫醇与顺丁烯二酰亚氨基间的迈克尔加成反应，以形成硫醇-顺丁烯二酰亚氨基加合物。然而，在生理条件下，硫醇-顺丁烯二酰亚氨基加合物可能会因为硫醇交换而产生破坏性的裂解。这种所谓的逆硫醇迈克尔反应可能导致硫醇-顺丁烯二酰亚氨基加合物的降解，并会减低产物的安定性。
于本实施例中，利用MALDI-TOF分析来探究在存有含硫醇的谷胱甘肽分子水溶液下，DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物以及甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物中所合成的带有复合基的硫醇-顺丁烯二酰亚氨基多肽中心核的硫醇-顺丁烯二酰亚氨基交换。利用以下方式制备DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物：利用标准固态合成法合成多肽16(多肽16委由Shanghai ChinaPeptide Co.,Ltd.生产)。多肽16(乙酰基-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK；SEQ ID NO:22)的纯度为95％，其中多肽16的N-端经乙酰基修饰。异型双功接合物DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基购自Conju-probe Inc.。利用上文实验例所述的方式将进行硫醇-顺丁烯二酰亚氨基复合反应，以将连接物DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基复合到多肽16。所合成的DBCO-多肽16的分子量为约2,227道耳顿(如下图所示)。
将所合成的DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物和谷胱甘肽以1：10([peptide]:[glutathione])的摩尔比在37℃下于100mM HEPES缓冲液(pH 7.0，含100mMNaCl)中培育24、48与72小时。利用MALDI-TOF进一步分析所得到的反应混合物，结果显示因硫醇-顺丁烯二酰亚氨基交换在培育72小时后所得到的DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基谷胱甘肽加合物(如下图所示)的的分子量为约940.385道耳顿(图26A)。
A利用与上文针对DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物所述的方法来制备与分析甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物。所合成的甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基多肽16的分子量为约2,111.2道耳顿(如下图所示)。
所合成的甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物和谷胱甘肽的反应和上文DBCO-PEG3-顺丁烯二酰亚氨基-多肽16复合物和谷胱甘肽的反应条件相同。以MALDI-TOF进一步分析所得到的反应混合物。质谱分析结果显示，在培育72小时后，MALDI-TOF可观察到甲基四嗪基-PEG4-顺丁烯二酰亚氨基谷胱甘肽加合物(如下图所示)，且该加合物的分子量为约826.397道耳顿(图26B)。
实验例24：由带有四个CCK8多肽的标的接合单元以及带有一个抗-CD3scFv分子的效应部分所组成的分子构建体对Panc-1肿瘤细胞株的T细胞介导的细胞毒性分析
使用人类外周血T细胞为T细胞来源。取得健康捐赠者血液(Taiwan BloodService Foundation)透过离心并以Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)密度梯度自白细胞层(buffy coat)分离得到外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，再于90％FBS/10％DMSO中冷冻保存。利用人类Pan T cell分离套组(MiltenylBiotech,Auburn,CA,USA)透过负面筛选移除非T细胞，进而由PBMC中得到T细胞。在有10μ/ml重组人类IL-2(PeproTech,Rocky Hill,USA)的环境下培育T细胞。以抗-DNP AN02单株抗体做为同型对照(isotype-matched control)。
将5,000个100μl完全RPMI培养基中的Panc-1目标细胞与由带有四个CCK8多肽的标的部分与带有一个抗CD-3 scFv分子的的效应部分组成的分子构建体一起培养，而带有四个CCK8多肽的标的部分则做为负对照组，培养温度37℃、培养时间30分钟、大气环境为5％CO2，之后和人类T细胞以20、10或5的E：T比混合。培育24小时后，利用aCella-Tox套组(Cell Technology.Mountain View,CA)根据制造商的建议以萤光法测定细胞毒性。以光度计(多功能微孔盘分光光谱仪，DS Pharma,Osaka,Japan)读取培养盘。
利用Panc-1肿瘤细胞来探究由带有四个CCK8多肽的标的部分与带有一个抗CD-3scFv分子的效应部分组成的分子构建体对表达CCK8 B型受体的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞裂解。由带有四个CCK8多肽的标的部分与带有一个抗CD-3 scFv分子的的效应部分组成的分子构建体的制备方式如上文述实验例所述。
进行细胞毒性分析时，选择来自捐赠者的人类T淋巴细胞以分析T细胞介导的细胞毒性。将Panc-1细胞和10μg/mL的由带有四个CCK8多肽的标的部分与带有一个抗CD-3 scFv分子的的效应部分组成的分子构建体在37℃下培育1小时，之后和E：T比例为20、10或5的人类T淋巴细胞混合并培育24小时。负对照组使用带有四个CCK-8多肽(不含载药部分)的标的部分或带有一个抗-CD3 scFv的效应部分(不含标的部分)。利用aCella-Tox套组进行细胞溶解分析。
实验例25：由带有三个CCK8多肽的标的接合单元以及带有五个DM1分子的效应接合单元所组成的联合接合物构型分子构建体对Panc-1肿瘤细胞株的T细胞介导的细胞毒性分析
依上文实验例所述方式制备由带有三个CCK8多肽的标的接合单元以及带有五个DM1分子的效应接合单元所组成的联合接合物构型分子构建体。
将DMEM培养基(含10％胎牛血清)中的Panc-1细胞(2x104/well)播于96-孔盘。18小时后，以不同浓度(由1μM进行10倍序列稀释)的以下样本处理细胞：带有三个CCK-8多肽(不含载药束)的接合单元、带有五个DM1分子的接合单元(载药束)以及带有三个CCK-8多肽做为标的部分以及五个DM1分子做为效应部分的分子构建体。在培育6小时后，以新鲜培养基取代既有培养基，并将细胞再度培育48小时。利用alamarBlue细胞存活率试剂套组(Invitrogen)依制造商的指示来测定细胞存活率。
图27显示三种处理组别的Panc-1细胞的存活率。由三个CCK-8多肽的标的接合单元以及五个DM1分子的载药束的组成的分子构建体可使约35％的Panc-1细胞溶解。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求所界定者为准。
序列表
<110> CHANG,TSE-WEN
CHU,HSING-MAO
<120> 接合单元及包含接合单元的分子构建体
<130> 182050 1PCWO
<150> US62613401
<151> 2018-01-03
<150> US62472011
<151> 2017-03-16
<160> 24
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys Gly
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys Gly
1 5 10 15
Ser Gly Lys Gly Ser Gly Lys
20
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Lys Gly Ser Gly Ser Lys
20
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1,3,5,7,9
<223> Xaa is PEGylated amino acid with four EG units
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ser Lys Ser Lys Ser Lys
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Lys Ser Lys Gly Lys
1 5
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Cys Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Arg Ser Gly Ser Ser Gly
1 5
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly
1 5 10 15
Ser Ser Gly Lys
20
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly
1 5
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Ser Gly Lys Gly
1 5 10 15
Ser Ser Gly Lys Gly Ser Ser Gly Lys
20 25
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Glu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1 5 10
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Glu Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe
1 5
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Gln Ile Thr Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro
1 5
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (23)

1.一种接合单元，至少包含一中心核以及复数个连接臂，其中：
该中心核至少包含复数个赖氨酸残基、一或多个间隔物以及一第一复合部分，其中：
任两个所述K残基彼此相邻或由一所述间隔物隔开；
每一所述间隔物彼此独立地包含：(1)一或多个非赖氨酸氨基酸残基，或(2)一聚乙二醇化氨基酸，其具有2至12个乙二醇重复单元；
至少一所述间隔物连接至由N-端起第一个K残基的N-端或最后一个K残基的-C端；以及
该第一复合部分具有一羧基或氨基，且具有选自以下群组的一复合基：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基；其中，当该间隔物连接至该第一个K残基的N-端时，该第一复合部分具有该羧基并藉由与该间隔物的α-氨基形成酰胺键而与其连接，以及当该间隔物连接至该最后一个K残基的C-端时，该第一复合部分具有该氨基并藉由与该间隔物的羧基形成酰胺键而与其连接；以及
每一所述连接臂的一端具有一反应基，另一端具有一功能基，且藉由该连接臂的该反应基与该中心核的该K残基形成一酰胺键而与其连结，其中该功能基选自以下所组成的群组：氨基、羧基、羟基、三级丁基二甲硅基、N-羟基琥珀酰亚胺基、顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰苯并噻唑基、碘基、碘乙酰氨基、叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基与环辛烯基，前提是当该复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时，该功能基为四嗪基或环辛烯基，且当该复合基为四嗪基或环辛烯基时，该功能基为叠氮基、炔基或环辛炔基。
2.如权利要求1所述的接合单元，其中该中心核至少包含2-20个K残基。
3.如权利要求1所述的接合单元，其中该间隔物至少包含一或多个甘氨酸及/或丝氨酸残基。
4.如权利要求1所述的接合单元，其中该反应基为琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯或羧基。
5.如权利要求1所述的接合单元，其中该中心核至少包含二间隔物，分别连接到该第一个K残基的N-端与该最后一个K残基的C-端。
6.如权利要求5所述的接合单元，其中该中心核至少更包含一第二复合部分，其具有一羧基或氨基，且具有选自以下群组的一复合基：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基，其中：
该第一与第二复合部分其中之一连接至连接于该第一个K残基N-端的该间隔物的N-端，以及
该第一与第二复合部分其中另一连接至连接于该最后一个K残基C-端的该间隔物的C-端。
7.如权利要求6所述的接合单元，其中：
该功能基为顺丁烯二酰亚氨基、乙烯砜基、单砜基、碘基或碘乙酰氨基；
该第一与第二复合部分其中之一的复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基；以及
该第一与第二复合部分其中另一的复合基为四嗪基或环辛烯基。
8.如权利要求1所述的接合单元，其中每一所述连接臂为至少包含2-12个非赖氨酸氨基酸残基的一多肽、或为具有2-2四个EG重复单元的一聚乙二醇链。
9.如权利要求8所述的接合单元，其中该连接臂的该多肽至少包含5-10个独立选自以下群组的氨基酸残基：G、S、谷氨酸与精氨酸残基。
10.如权利要求1所述的接合单元，其中：
该环辛烯基为降莰烯或反式-环辛烯；
该环辛炔基为二苯并环辛炔、二氟化环辛炔、二环壬炔或二苯并杂氮环辛炔；或
该四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或其衍生物。
11.如权利要求1所述的接合单元，其中该中心核至少更包含复数个第一元件，分别透过以下方式而连接于该些连接臂：于其间形成一酰胺键或酯键、或透过硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应、SN2反应、铜催化的叠氮化物-炔羟环加成反应、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学反应或逆电子需求狄尔斯-阿德反应。
12.如权利要求11所述的接合单元，其中该中心核至少更包含一第二元件，其透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而连接至该复合基。
13.如权利要求12所述的接合单元，其中：
每一该第一元件为对第一细胞表面抗原专一的一第一抗体片段；以及
该第二元件为一细胞毒性药物或对第二细胞表面抗原专一的一第二抗体片段。
14.如权利要求13所述的接合单元，其中：
该第一细胞表面抗原选自以下物质所组成的群组：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319；或
该第二细胞表面抗原为CD3或CD16a。
15.如权利要求12所述的接合单元，其中：
每一该第一元件为一肽类激素、一第一生长因子或对一肿瘤相关抗原专一的一第一抗体片段；以及
该第二元件为一细胞毒性药物、类铎受体促效剂、与一放射性核种复合的螯合剂、细胞介素或对第二生长因子、细胞表面抗原、半抗原或该细胞介素专一的一第二抗体片段。
16.如权利要求15所述的接合单元，其中：
该第一生长因子选自以下物质所组成的群组：上皮生长因子、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子、血管内皮生长因子A、碱性纤维母细胞生长因子以及肝细胞生长因子；
该第二生长因子选自以下物质所组成的群组：EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF；
该肽类激素选自以下物质所组成的群组：胰泌素、胆囊收缩素、体抑素、体抑素肽以及促甲状腺素；
该肿瘤相关抗原选自以下物质所组成的群组：人类上皮生长因子受体、HER2、HER3、HER4、糖类抗原19-9、糖类抗原125、癌胚抗原、黏蛋白1、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原、前列腺专一膜抗原、前列腺干细胞抗原、粘蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段专一性胚胎抗原以及上皮细胞粘附分子；或
该细胞表面抗原选自以下物质所组成的群组：CD3、CD16a、CD28、CD134、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白、程序性细胞死亡因子1以及程序性细胞死亡因子1配体1。
17.如权利要求7所述的接合单元，其中该中心核还包含：
复数个第一元件，分别透过与该些连接臂形成一酰胺键或酯键、或藉由硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应或SN2反应而与其连接；以及
一第二元件与一第三元件，分别连接至该第一与第二复合部分的该些复合基，其中该第二与第三元件其中之一透过iEDDA反应连接至一复合基，且该第二与第三元件其中另一透过SPAAC或CuAAC反应连接至另一复合基。
18.一种分子构建体，至少包含一第一接合单元与一第二接合单元，其中该第一接合单元与第二接合单元分别如权利要求1至11所述，且该第一与第二接合单元透过发生于该第一与第二接合单元的该些复合基间的CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而耦接。
19.如权利要求18所述的分子构建体，至少更包含复数个第一元件与复数个第二元件，分别透过与该该第一接合单元与第二接合单元的该些连接臂形成一酰胺键或酯键、或藉由硫醇-顺丁烯二酰亚氨基反应、SN2CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而与其连接。
20.如权利要求19所述的分子构建体，其中：
每一所该第一元件为对第一细胞表面抗原专一的一第一抗体片段；以及
每一该第二元件为一细胞毒性药物或对第二细胞表面抗原专一的一第二抗体片段。
21.如权利要求20所述的分子构建体，其中：
该第一细胞表面抗原选自以下物质所组成的群组：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319；或
该第二细胞表面抗原为CD3或CD16a。
22.如权利要求19所述的分子构建体，其中：
每一该第一元件为一肽类激素、一第一生长因子或对一肿瘤相关抗原专一的一第一抗体片段；以及
每一该第二元件为一细胞毒性药物、类铎受体促效剂、与一放射性核种复合的螯合剂、细胞介素或对第二生长因子、细胞表面抗原、半抗原或该细胞介素专一的一第二抗体片段。
23.如权利要求22所述的分子构建体，其中：
该第一生长因子选自以下物质所组成的群组：EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF；
该第二生长因子选自以下物质所组成的群组：EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF；
该肽类激素选自以下物质所组成的群组：胰泌素、CCK、体抑素、体抑素肽以及TSH；
该肿瘤相关抗原选自以下物质所组成的群组：HER1、HER2、HER3、HER4、CA 19-9、CA125、CEA、MUC 1、神经节苷脂GD2、MAGE、PSMA、PSCA、间皮素、粘蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4以及EpCAM；或
该细胞表面抗原选自以下物质所组成的群组：CD3、CD16a、CD28、CD134、CTLA-4、PD-1以及PD-L1。
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