ES2923853T3 - Materiales y métodos relacionados con conectores para su uso en productos conjugados de proteína y fármaco - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a conjugados de proteína y fármaco, métodos de fabricación de los mismos y su uso en terapia. En particular, la presente invención se refiere a conjugados de proteína y fármaco que comprenden una proteína globular, un enlazador mejorado y un fármaco para su uso en aplicaciones de administración de fármacos dirigidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales y métodos relacionados con conectores para su uso en productos conjugados de proteína y fármaco
La presente invención se refiere a productos conjugados de proteína y fármaco, y a métodos para fabricarlos. Más especialmente, la presente invención se refiere a proporcionar una proteína, un conector y un fármaco, por ejemplo, una citotoxina, para producir un producto conjugado de proteína y fármaco. Además, la presente invención proporciona un conector mejorado para su uso en productos conjugados de proteína y fármaco y métodos para introducir dicho conector en dichos productos conjugados de proteína y fármaco. Más específicamente, el producto conjugado de proteína y fármaco puede ser un producto conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC).
Se sabe que los productos conjugados de proteína y fármaco, en particular los productos conjugados de anticuerpo y fármaco, proporcionan un suministro dirigido de fármacos muy potentes a tejidos específicos para su tratamiento. Más específicamente, los ADC, que típicamente consisten en un anticuerpo unido a través de un conector químico con enlaces lábiles, a una carga útil de fármaco o agente citotóxico biológicamente activo, son conocidos por su uso en tratamientos contra el cáncer. El suministro dirigido que ofrecen estos productos conjugados de proteína y fármaco resulta de la capacidad del anticuerpo o similar para discriminar sensiblemente entre tejido sano y enfermo, asegurando así el suministro seguro del fármaco altamente potente.
En cuanto a tales anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales (mAb) son útiles en investigación dirigida, terapéutica, diagnóstica y otros usos biotecnológicos. Más especialmente, los mAb son útiles en el área de tratamientos y medicamentos dirigidos. Los mAb se pueden utilizar a modo de incorporación en un tratamiento por medio de un Producto Conjugado de Anticuerpo y Fármaco (ADC). Como se discutió anteriormente, los ADC son un tipo de medicamento bioactivo que se cree que tiene una utilidad particular en el tratamiento de cánceres, entre otras cosas, y son una tecnología relativamente nueva. Generalmente, un ADC (por ejemplo) para el tratamiento de un cáncer comprenderá un mAb conectado a una carga útil o fármaco citotóxico, que puede proporcionar una acción de eliminación de células. La conexión entre el mAb y el material citotóxico (citotoxina) la proporcionará generalmente una molécula conectora químicamente estable. En la técnica se conocen dos tipos de sistemas conectores de ADC; escindibles y no escindibles. Para los sistemas conectores de ADC escindibles, existe un mecanismo de liberación que es preferiblemente accionado enzimáticamente, aunque se conocen sistemas escindibles alternativos que son químicamente lábiles, como se detalla en Methods in Molecular Biology, Volumen 1045, 2013, publicado por Humana Press. En los sistemas conectores de ADC no escindibles, la ruta de liberación se debe a la degradación de mAb por la maquinaria de la célula cuando el ADC está en uso.
La aprobación comercial en Europa y EE.UU. de los ADC Adcetris® (Seattle Genetics/Takeda Group) y Kadcyla® (Genentech/Roche) ha allanado el camino para una mayor investigación en esta clase de ADC de agentes bioterapéuticos.
Adcetris®, que se muestra a continuación (también conocido como brentuximab vedotin), está dirigido a la proteína CD30, que se expresa en el linfoma de Hodgkin (LH) clásico y el linfoma anaplásico de células grandes sistémico (LACGs). Brentuximab vedotin consiste en el anticuerpo monoclonal quimérico brentuximab (cAC10, que se dirige a la proteína de la membrana celular CD30) conectado a un conector escindible de catepsina (valina-citrulina), espaciador de para-aminobencilcarbamato y el agente antimitótico monometil auristatina E (MMAE).
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Kadcyla®, que se muestra a continuación, es trastuzumab emtansina, un ADC que consiste en el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Trastuzumab) conectado al agente citotóxico mertansina (DM1). Trastuzumab solo detiene el crecimiento de las células cancerosas al unirse al receptor HER2/neu, mientras que la mertansina ingresa a las células y previene la división celular al unirse a la tubulina; en última instancia, esta acción de unión dará como resultado la apoptosis celular. El producto conjugado se abrevia típicamente como T-DM1. Cada molécula de trastuzumab emtansina consiste en una sola molécula de trastuzumab unida a varias moléculas de mertansina, un maitansinoide citotóxico que contiene un grupo sulfhidrilo, a través de un reactivo de entrecruzamiento conocido como SMCC. El SMCC es írans-4-(maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo , un agente de entrecruzamiento bifuncional, que contiene dos grupos funcionales reactivos, un éster de succinimida y una maleimida. El grupo succinimida de SMCC reacciona con el grupo amino libre de un resto de lisina en la molécula de trastuzumab y el radical maleimida de SMCC se conecta al grupo sulfhidrilo libre de la mertansina, formando un enlace covalente entre el anticuerpo y la mertansina.
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Si bien los ADC son bien conocidos en la técnica, otros productos conjugados de proteína y fármaco que comprenden una proteína globular con la capacidad de proporcionar la administración dirigida de una carga útil de fármaco no son tan conocidos. Por ejemplo, la albúmina puede ofrecer una alternativa adecuada a los anticuerpos en tales productos conjugados de proteína y fármaco.
La albúmina consiste en tres dominios estructuralmente homólogos, en gran parte helicoidales (I, II y III), cada uno de los cuales consiste en dos subdominios, A y B. Al igual que otras albúminas de mamíferos, la albúmina humana contiene 17 puentes disulfuro y un tiol libre en Cys34, que proporciona la mayor fracción de tiol libre en suero sanguíneo.
La albúmina es la principal proteína responsable de la presión osmótica coloidal de la sangre y funciona como vehículo de transporte de ácidos grasos de cadena larga, bilirrubina, iones metálicos tales como cobre (II) y níquel (II), calcio y zinc. La albúmina tiene una semivida sérica aproximada de 20 días, atribuible al tamaño de la proteína (aprox. 67 kDa) y también como consecuencia del reciclaje a través de los receptores de Fc neonatales (FcRn). El FcRn recicla la albúmina, así como los anticuerpos (más especialmente las IgG), de una manera no competitiva dependiente del pH, protegiendo a ambos de la degradación de proteínas en el lisosoma. La albúmina circulante es internalizada por las células endoteliales donde se une al FcRn en el ambiente ácido del endosoma temprano (pH 6). Esto permite que la albúmina se recicle a la superficie de la célula y se libere nuevamente a la sangre (pH fisiológico). La albúmina puede conjugarse covalentemente con un fármaco citotóxico o, alternativamente, fusionarse con un agente terapéutico basado en proteínas para aumentar la biodisponibilidad y mejorar la farmacocinética del fármaco.
Los tumores sólidos tienen una vasculatura permeable y también un drenaje linfático deficiente que da como resultado una acumulación y retención de macromoléculas (>40 kDa) dentro del líquido intersticial del tumor. Los estudios han demostrado la retención de albúmina en varios tumores sólidos malignos. También hay pruebas emergentes de la unión específica de la albúmina por varios receptores, algunos de los cuales han demostrado tener una alta expresión en células malignas. De manera similar, se sabe que la albúmina se acumula en las articulaciones inflamadas de los pacientes con artritis reumatoide debido a un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoarticular. Una aplicación conocida de la albúmina en la administración de fármacos es el uso de productos conjugados de albúmina que contienen restos de galactosa, que ingresan a los hepatocitos después de la interacción con el receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R), presente en grandes cantidades y con alta afinidad solo en estas células.
En consecuencia, estas propiedades de direccionamiento, así como su disponibilidad, biodegradabilidad, falta de toxicidad e inmunogenicidad y en línea con su semivida marcadamente larga, hacen de la albúmina un candidato adecuado para la administración de fármacos. Como tal, la albúmina representa una alternativa adecuada a los anticuerpos en los sistemas de productos conjugados de proteína y fármaco.
El suministro exitoso de un fármaco o carga útil citotóxica al tejido diana depende de la capacidad del conector para unirse a la proteína y al fármaco y permanecer unido hasta que el producto conjugado de proteína y fármaco alcance el tejido diana. En consecuencia, existe la necesidad de proporcionar conectores alternativos y/o mejorados para su uso en dichos productos conjugados de proteína y fármaco que proporcionen una administración satisfactoria. MORPHY, J.R. et al, "Towards tumour targeting with copper-radiolabelled macrocycle-antibody conjugates: synthesis, antibody linkage, and complexation behaviour", J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1990, páginas 573-585 describe el uso de moléculas conectoras de vinilpiridina para anclar ligandos macrocíclicos radiomarcados a un anticuerpo a través de una conjugación específica de tiol. Además, el documento WO2010070300 A1 describe un conector que comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente vinilo para funcionalizar polipéptidos con moléculas de poli(alquilenglicol) y grupos glucano.
Además, existe la necesidad de proporcionar productos conjugados de proteína y fármaco nuevos y/o mejorados, tales como los que comprenden albúmina, para la administración segura y eficaz de fármacos citotóxicos o péptidos o polipéptidos terapéuticos.
En una realización, existe la necesidad de proporcionar ADC alternativos y mejorados, que puedan proporcionar eficazmente propiedades de apoptosis celular. Más especialmente, existe la necesidad de proporcionar moléculas conectoras de ADC mejoradas para garantizar una conjugación selectiva y eficaz durante la fabricación de dichos ADC, y proporcionar una carga útil de citotoxina eficaz cuando esté en uso.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un producto conjugado de proteína y fármaco como se reivindica en la reivindicación 1.
La presente divulgación se refiere a un conector para uso en productos conjugados de proteína y fármaco, con utilidad en la unión de proteínas y fármacos, por ejemplo, anticuerpos y citotoxinas para proporcionar moléculas de ADC. El conector proporciona una carga útil dirigida mejorada del fármaco. Además, o alternativamente, el conector proporciona al producto conjugado de proteína y fármaco una mayor estabilidad en comparación con las moléculas conectoras actualmente conocidas para su uso en ADC, proporcionando así productos conjugados de proteína y fármaco con propiedades de seguridad mejoradas y, en consecuencia, perfiles de tolerabilidad mejorados. Más específicamente, el uso de la molécula conectora descrita actualmente en los ADC proporciona una mayor potencia del ADC, cuando está en uso, por encima del anticuerpo no conjugado equivalente.
En el contexto de la presente invención, se debería interpretar que el término "proteína globular" cubre cualquier proteína que tenga capacidades de direccionamiento y, por lo tanto, tenga la capacidad de suministrar una carga útil de fármaco a un tejido diana específico. En consecuencia, las "proteínas globulares" incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, albúmina y transferrina, así como cualquier otra alternativa conocida para su uso en productos conjugados de fármacos. Según las reivindicaciones, la proteína globular es un anticuerpo o un fragmento del mismo.
Por "fármaco" se entiende cualquier sustancia química que tenga un efecto biológico conocido en seres humanos o animales. En particular, el fármaco puede ser un fármaco que se utiliza en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de enfermedades o para mejorar de otro modo el bienestar físico o mental. Como se apreciará, el fármaco puede ser un fármaco conocido que haya obtenido la autorización de comercialización necesaria o un fármaco novedoso que aún no se haya sometido a pruebas ni obtenido la autorización de comercialización.
En una realización de la presente invención, se proporciona un producto conjugado de anticuerpo y fármaco.
Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo, o un fragmento del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo monoclonal (mAb). El mAb se puede seleccionar entre cualquier mAb conocido. La única limitación en la selección del mAb para su uso en la presente invención es que debe tener presente un resto de cisteína para permitir que tenga lugar la reacción de conjugación. Se prefiere particularmente que el mAb contenga un resto de cisteína, ya que algunas realizaciones especialmente preferidas del conector de la presente invención muestran un aumento de selectividad hacia el grupo tiol presente en el resto de cisteína.
Sin embargo, en el caso de que se identifique un mAb que normalmente no contenga el resto de cisteína preferido, los expertos en la técnica conocen métodos para introducir cisteína en los mAb.
Según una realización alternativa divulgada en el presente documento (como se detalla más adelante), el anticuerpo puede sustituirse por albúmina. Esta realización no forma parte de la presente invención.
Se debe considerar que la descripción del fármaco y el conector a continuación se aplica por igual a las diversas realizaciones de los productos conjugados de proteína y fármaco.
El fármaco puede ser una carga útil citotóxica o un péptido o polipéptido terapéuticos. En particular, cuando la proteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo y el producto conjugado de proteína y fármaco es un ADC, el fármaco es preferiblemente una citotoxina. Alternativamente, cuando la proteína es albúmina, el fármaco puede ser una citotoxina o un péptido o polipéptido terapéutico. La realización en la que la proteína es albúmina no forma parte de la invención reivindicada.
Preferiblemente, la citotoxina es un material citotóxico biológicamente activo. Lo más preferiblemente, la citotoxina es un fármaco contra el cáncer. La citotoxina puede seleccionarse del grupo que comprende auristatinas, maitansinas, caliqueamicina, antraciclina y los pirrolobenzodiazepenos. Más especialmente, la citotoxina puede ser monometil auristatina E (MMAE), doxorrubicina o mertansina (DM1). Debería ser evidente para el experto en la técnica que la MMAE también se conoce como (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1 R,2R)-3-(((1 S,2fí)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida.
Sin embargo, adicional o alternativamente, la citotoxina también podría seleccionarse entre otras citotoxinas conocidas, incluidas las subunidades de ricina y otros materiales citotóxicos basados en péptidos, aunque tales materiales se utilizan con menos frecuencia en el campo de la técnica. Cuando el fármaco es un péptido o polipéptido terapéutico, el péptido o polipéptido pueden ser cualquier péptido o polipéptido que tenga propiedades terapéuticas, por ejemplo, actividad antinociceptiva, antidiabética, antitumoral o antiviral.
Además, o alternativamente, el fármaco comprende preferiblemente un grupo amina, un grupo tiol o un grupo ácido carboxílico, ya que estos tipos de grupos proporcionan sitios ideales para la conjugación del fármaco con el conector de la presente invención.
Preferiblemente, el conector (también denominado en el presente documento molécula conectora o grupo conector) proporciona una conjugación específica del sitio a través del grupo cisteína presente en la proteína, tal como un anticuerpo.
El conector de la presente invención comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que comprende un sustituyente vinilo.
En términos muy generales, se puede considerar que el conector consiste en tres partes; un grupo vinilo, un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno y un brazo conector. El brazo conector se puede variar para proporcionar como resultado diferentes grupos terminales para proporcionar sitios de reacción para que el fármaco o la proteína, por ejemplo, el anticuerpo de un ADC, se unan al conector.
Se ha encontrado que las 4-vinilpiridinas proporcionan velocidades de reacción comercialmente aceptables en ciertas circunstancias, como se comenta adicionalmente más adelante.
Los ejemplos de conectores incluyen:
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
De los ejemplos mostrados anteriormente, los conectores [1 ]-[10] y [15] no forman parte de la presente invención pero ayudan a ilustrar la invención. Se prefieren las estructuras de 4-vinilpiridina de la presente invención, ya que en ciertas condiciones muestran un aumento de reactividad por encima de las estructuras de 2-vinilpiridina equivalentes. Como apreciará el experto en la técnica, cada una de las estructuras ilustradas anteriormente está provista predominantemente de un grupo ácido carboxílico terminal en el brazo conector. Sin embargo, estas estructuras pueden proporcionarse preferiblemente en forma sustituida, de modo que la estructura de vinilpiridina preferida comprenda un grupo poli-(alquilenglicol) preferido, lo más preferiblemente una molécula de PEG. Se ha descubierto que la presencia de un grupo PEG en el brazo de la molécula conectora es lo más preferible ya que mejora la eficacia de la reacción cuando se busca obtener la razón requerida de fármaco a proteína en los métodos de fabricación del producto conjugado de proteína y fármaco.
Tales moléculas conectoras incluyen los siguientes ejemplos:
Figure imgf000007_0001
En una realización adicional de la presente invención, podría ser deseable incluir un conector extensor dentro de la molécula conectora descrita en el presente documento. Tal conector extensor puede ser necesario para alterar la solubilidad o las propiedades inmunogénicas del grupo funcionalizante. Más especialmente, un conector extensor de este tipo será útil en un sistema conector de ADC escindible, que se describirá con más detalle a continuación. Los conectores extensores adecuados para su uso en la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica, y los conectores extensores particularmente preferidos se describen en la Patente de Estados Unidos Núm.
7.659.241 y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.609.105. Lo más preferiblemente, el conector extensor es un conector extensor escindible por enzima que comprende una colección de aminoácidos que pueden ser escindidos por una proteasa intracelular.
Podría ser deseable proporcionar el conector en una forma modificada, de modo que comprenda un grupo éster para facilitar la unión del conector a la proteína del producto conjugado de proteína y fármaco. Este aspecto se describirá más adelante.
Los conectores de acuerdo con la presente invención están representados por la siguiente fórmula,
Figure imgf000008_0001
en donde:
Ri se selecciona entre;
■ (CH2)n-C(O)-R, o
■ (CH2)m-S-(CH2)n-C(O)-R, o
■ (CH2)n-CH(CO2R)2 , o
■ (CH2)m-S-(CH2)2CH(CO2R)2,
-R2 se selecciona del mismo grupo de moléculas que R1, hidrógeno o un grupo alquilo.
Cuando R2 se selecciona entre un grupo alquilo, es preferible un grupo metilo (CH3), o terc-butilo ((CH3)3C). Se prefiere la presencia de un grupo alquilo en la molécula conectora ya que la presencia de dicho grupo aumenta la alcalinidad del nitrógeno presente en la estructura del anillo y da como resultado que la estructura conectora tenga un aumento de reactividad por encima de las moléculas conectoras equivalentes.
En la fórmula proporcionada más arriba,
- n puede ser cualquier número entero de 0 a 10. En algunas realizaciones preferidas, n es un valor entre 0 y 5,
- m puede ser cualquier número entero entre 0 y 10. Preferiblemente m es entre 0 y 5, y lo más preferiblemente m es entre 0 y 3, como se muestra en los ejemplos proporcionados anteriormente.
- R es un grupo hidróxido (OH), amina o poli-(alquilenglicol). Preferiblemente, R es un poli-(alquilenglicol), y lo más preferiblemente es un PEG. En general, la molécula de poli-(alquilenglicol) está directamente unida covalentemente a los grupos R1 y/o R2 como se muestra en la fórmula anterior. El brazo del grupo conector puede tener diferentes longitudes para mantener la molécula de poli-(alquilenglicol) más cerca o más lejos del anticuerpo.
Preferiblemente, el fármaco, por ejemplo un agente citotóxico, se une al grupo R1 conector. En los casos en que R2 se selecciona del mismo grupo de moléculas que R1, como se describió anteriormente, es posible que estos grupos también se unan a fármacos, p. ej. citotoxinas, para proporcionar productos conjugados de proteína y fármaco, p. ej. ADC, con múltiples fármacos presentes en sus estructuras. Algunas realizaciones de este tipo pueden denominarse carga simétrica del fármaco en el producto conjugado de proteína y fármaco.
Además, o alternativamente, cuando R1, y opcionalmente R2 , se seleccionan entre (CH2)n-CH(CO2R)2 , o (CH2)m-S-(CH2)2CH(CO2R)2 , es decir, cuando el brazo conector está ramificado, es posible que los fármacos se unan a cada grupo terminal del brazo conector. Como tales, múltiples fármacos están presentes en el producto conjugado de proteína y fármaco y pueden describirse como una carga asimétrica del fármaco.
Además, o alternativamente, cuando está presente un grupo poli(alquilenglicol), la estructura básica de poli-(alquilenglicol) puede estar provista de uno o más grupos funcionales reactivos tales como grupos hidroxi, amina, ácido carboxílico, haluro de alquilo, azida, succinimidilo, o tiol para facilitar la reacción de la molécula de poli-(alquilenglicol) con el fármaco o la proteína. Las moléculas de poli-(alquilenglicol) particularmente preferidas incluyen aquellas sustituidas en una o más posiciones hidroxilo con un grupo químico, tal como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro átomos de carbono. Las moléculas de poli(alquilenglicol) más preferidas para su uso de acuerdo con la presente invención son las moléculas de polietilenglicol ("PEG"), como se mencionó anteriormente, aunque el experto en la técnica podría utilizar los mecanismos descritos en el presente documento junto con otras moléculas de poli-(alquilenglicol), tales como polipropilenglicol o copolímeros de polietilen-polipropilenglicol. Las moléculas de poli-(alquilenglicol), incluidos los PEG, normalmente tienen pesos moleculares entre aproximadamente 200 Da y aproximadamente 80 kDa. Las moléculas de poli-(alquilenglicol) preferidas tienen pesos moleculares entre aproximadamente 200 Da y 1 kDa. Las moléculas de poli-(alquilenglicol) que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención son bien conocidas en la técnica y están disponibles públicamente, por ejemplo, de fuentes comercialmente disponibles tales como Sigma Aldrich.
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan sistemas conectores de productos conjugados de proteína y fármaco (p. ej., ADC) no escindibles y/o escindibles.
Se puede proporcionar un sistema conector de producto conjugado de proteína y fármaco (p. ej., ADC) no escindible, que comprende una proteína (p. ej., un anticuerpo), un conector y un fármaco (p. ej., una citotoxina). En un sistema de este tipo, la conjugación de un grupo amino en el anticuerpo se logra a través de un éster activado presente en el conector, que después se une a la citotoxina a través del grupo vinilo. En este sistema no escindible, el anticuerpo es preferiblemente un mAb. Además, el conector preferiblemente comprende una molécula de poli-(alquilenglicol), lo más preferiblemente una molécula de polietilenglicol (PEG) y el agente citotóxico contiene un tiol. Como se apreciará, en el sistema descrito anteriormente, el anticuerpo se proporciona como ejemplo de proteína y se puede sustituir por albúmina y la citotoxina se proporciona como ejemplo de fármaco y puede sustituirse por un péptido o polipéptido terapéuticos.
En un sistema alternativo de este tipo, la conjugación de un grupo tiol en el anticuerpo se logra a través del grupo vinilo del conector, que a su vez se une a un fármaco a través de un grupo poli(alquilenglicol) presente en el brazo conector.
En una realización alternativa, se proporciona un sistema conector de producto conjugado de proteína y fármaco (p. ej., ADC) escindible, que comprende una proteína (p. ej., un anticuerpo), conector, conector extensor y un fármaco (p. ej., una citotoxina).
En un sistema conector de ADC escindible, el sustituyente vinilo de la molécula conectora es especialmente adecuado para reaccionar con uno o más grupos tiol que están naturalmente presentes o se han introducido en el anticuerpo (por ejemplo, empleando un grupo tiol de uno o más restos de cisteína presentes en el anticuerpo). A continuación, el brazo lateral del conector se conecta al conector extensor, preferiblemente a través de la molécula de poli-(alquilenglicol); el conector extensor proporciona la función "escindible" al ADC en esta realización. A continuación, la citotoxina se une al conector a través del conector extensor. Preferiblemente, el anticuerpo es un mAb. Más preferiblemente, el conector comprende una molécula de poli-(alquilenglicol), lo más preferiblemente una molécula de polietilenglicol (PEG). Se prefiere que el conector extensor sea escindible por enzimas, como se describe con mayor detalle anteriormente. Como se apreciará, en el sistema descrito anteriormente, el anticuerpo se proporciona como ejemplo de proteína y puede sustituirse por albúmina y la citotoxina se proporciona como ejemplo de fármaco y puede sustituirse por un péptido o polipéptido terapéuticos.
Debe entenderse que en la presente solicitud el término "escindible" se utiliza para abarcar productos conjugados de proteína y fármaco (p. ej., ADC) que pueden autoinmolarse o pueden manipularse para liberar su carga útil de fármaco (p. ej., citotóxico). Se pretende que el uso del término pretende distinga tales productos conjugados de proteína y fármaco (por ejemplo, ADC) de aquellos productos conjugados de proteína y fármaco (p. ej., ADC) "no escindibles" que se entiende que solo liberan su carga útil de fármaco (p. ej., agente citotóxico) una vez presente en una célula diana.
Debe entenderse que las características preferibles de la proteína (es decir, el anticuerpo), el conector y el fármaco (p. ej., citotoxina) para utilizar en este aspecto de la invención son las descritas anteriormente con relación al primer aspecto. Más especialmente, la descripción de la molécula conectora y sus características preferibles son particularmente adecuadas para su uso en dichos sistemas escindibles y no escindibles.
Aunque se prefiere que la proteína (es decir, el anticuerpo) utilizada en la presente invención comprenda al menos uno o más grupos cisteína que contienen tiol, también se contempla que la proteína (p. ej., el anticuerpo) pueda contener uno o más grupos lisina. Cuando este es el caso, se contempla que el experto en la técnica puede preferir anclar el conector de la presente invención a un grupo lisina como alternativa a un grupo cisteína. En esta situación, se prefiere modificar la molécula conectora de modo que sea una forma de éster activado del conector. En esta realización, el grupo éster del conector modificado puede unirse a la lisina presente en la proteína (p. ej., anticuerpo) a través del brazo conector. En esta realización, la proteína (p. ej., el anticuerpo) se unirá a través de un grupo lisina al conector modificado con éster y, a su vez, este se unirá al fármaco (es decir, la citotoxina) a través del grupo vinilo. Este conector modificado puede comprender una molécula de poli-(alquilenglicol), lo más preferiblemente una molécula de polietilenglicol (PEG). La realización de unión del conector a un grupo lisina como alternativa a un grupo cisteína no forma parte de la invención reivindicada.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir un producto conjugado de proteína y fármaco como se reivindica en la reivindicación 9, que comprende poner en contacto una proteína con un conector capaz de proporcionar una conjugación específica del sitio a través de un grupo cisteína presente en la proteína, que comprende un anillo heterocíclico aromático que contiene nitrógeno que comprende un sustituyente vinilo, en donde el conector está unido a un fármaco. En un aspecto alternativo, se proporciona un método para producir un producto conjugado de proteína y fármaco que comprende poner en contacto una proteína con un conector capaz de proporcionar una conjugación específica del sitio a través de un grupo cisteína presente en la proteína, que comprende un anillo heterocíclico aromático que contiene nitrógeno que comprende un sustituyente vinilo, y posteriormente unir el conector a un fármaco.
Preferiblemente, el método comprende poner en contacto la proteína (es decir, el anticuerpo) que tiene al menos un grupo tiol reactivo con el conector que comprende un reactivo de funcionalización, que comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente vinilo capaz de reaccionar con al menos un grupo tiol de la proteína (p. ej., el anticuerpo), en el que el reactivo de funcionalización del conector está unido covalentemente a una molécula de poli(alquilenglicol), de modo que el sustituyente vinilo del reactivo de funcionalización del conector reacciona con el grupo tiol de la proteína (p. ej., el anticuerpo), para unir de ese modo covalentemente la molécula de poli-(alquilenglicol) conectora a la proteína (p. ej., el anticuerpo).
Además, los métodos de la presente invención pueden implicar una o más etapas además de la etapa de hacer reaccionar el reactivo de funcionalización y la proteína (es decir, el anticuerpo) para conectarlos entre sí. A modo de ejemplo, los métodos pueden incluir una etapa inicial de hacer reaccionar un reactivo de funcionalización precursor que comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente de vinilo con la molécula de poli-(alquilenglicol) para producir el reactivo de funcionalización.
En realizaciones de la presente invención en las que el anticuerpo no incluye un grupo tiol adecuado, o no incluye un grupo tiol adecuado en una posición deseada en su cadena polipeptídica, la presente invención puede comprender la etapa inicial de modificar el anticuerpo, p. ej. por reacción química o mutagénesis dirigida al sitio, para producir un polipéptido variante que tiene un grupo tiol en una o más posiciones deseadas del polipéptido. Preferiblemente, esto se hace reemplazando uno o más de los aminoácidos en la cadena polipeptídica de la proteína (p. ej., el anticuerpo) por un resto de cisteína.
Preferiblemente, el grupo tiol reactivo, tanto si está presente de forma natural en la proteína (es decir, el anticuerpo) como si se ha introducido, forma parte de un resto de aminoácido de cisteína.
Preferiblemente, el conector comprende una molécula de poli-(alquilenglicol), lo más preferiblemente una molécula de polietilenglicol (PEG).
Además, o alternativamente, como se describió anteriormente, la estructura básica de poli-(alquilenglicol) puede estar provista de uno o más grupos funcionales reactivos tales como grupos hidroxi, amina, ácido carboxílico, haluro de alquilo, azida, succinimidilo o tiol para facilitar la reacción de la molécula de poli-(alquilenglicol) con el fármaco, es decir, el péptido o polipéptido citotóxicos o terapéuticos.
Además, la estructura de poli-(alquilenglicol) del conector también se puede hacer reaccionar con un segundo conector a través del brazo conector para proporcionar un conector homobifuncional, de modo que el grupo vinilo de un conector pueda reaccionar con el grupo tiol del fármaco, es decir, el péptido o polipéptido citotóxicos o terapéuticos, y el grupo vinilo del otro conector puede conjugarse con un grupo tiol de una proteína, por ejemplo, albúmina. En esta realización, el producto conjugado de proteína y fármaco, p. ej., el producto conjugado de albúmina y fármaco comprenderá dos moléculas conectoras, que facilitarán la unión de la albúmina a citotoxinas, péptidos terapéuticos o polipéptidos terapéuticos que contienen tiol. Esta realización no forma parte de la invención reivindicada.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un producto conjugado de proteína y fármaco como se define anteriormente para su uso en terapia.
En una realización, se proporciona un ADC como se define anteriormente para uso en terapia. Preferiblemente, el ADC está destinado a su uso en la terapia contra el cáncer.
Ahora se describirán realizaciones de la presente invención a modo de ejemplo y no de limitación con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Velocidades relativas de reacción para ejemplos de conectores de acuerdo con la presente invención y glutatión.
Figura 2. Análisis RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con W-acetilcisteína (NAC) después de 24 horas a tres pH diferentes (7,0, 7,5 y 8,0).
Figura 3. Datos de MS para demostrar la formación del Aducto PL-13-NAC a pH 7,0.
Figura 4. Datos de MS para demostrar la formación del Aducto PL-13-NAC a pH 8,0.
Figura 5. Análisis de RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con NAC a pH 8,0.
Figura 6. Análisis de RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con una mezcla de aminoácidos (Tyr/Lys/His/NAC) a pH 7,0.
Figura 7. Datos de MS para demostrar la formación de PL13-NAC en reactividad con una mezcla de aminoácidos a pH 7,0.
Figura 8. Análisis de RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con 10 equivalentes de Lisina a pH 7,0. Figura 9. Análisis de RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con 10 equivalentes de ácido aspártico. Figura 10. Estructura de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE.
Figura 11. Análisis MS de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE.
Figura 12. Perfiles HIC y UV-Vis de Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE tras 1 hora de reacción.
Figura 13. Perfiles HIC y UV-Vis del producto conjugado Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a las 1,8 y 16 horas de incubación con un exceso molar de 1,25 de fármaco-conector sobre tiol.
Figura 14. Perfil HIC del producto conjugado Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a las 16 horas de incubación con exceso 5 molar de fármaco-conector sobre tiol.
Figura 15. Perfil HIC de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE obtenido mediante la conjugación de un exceso 10 molar de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE después de 16 horas de incubación.
Figura 16. Perfil PLRP de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE conjugado con un exceso 10 molar de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE después de 16 horas de incubación.
Figura 17. Perfil PLRP de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE doblemente desalinizado.
Figura 18. Análisis HIC del producto conjugado Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en presencia de NAC a las 0, 24 y 48 horas.
Figura 19. Perfil PLRP del producto conjugado Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en presencia de NAC a las 0, 24 y 48 horas.
Figura 20. Análisis HIC del producto conjugado Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en presencia de NAC a las 0, 24 y 48 horas.
Figura 21. Análisis de los productos conjugados Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (A) y Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (B) mediante cromatografía SEC.
Figura 22. Análisis SDS-PAGE no reductora de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumabmaleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE.
Figura 23. Estructura del conector PL13-NH-PEG4-OSu.
Figura 24. Análisis ESI-MS del intermedio conector PL13-NH-PEG4-COOH.
Figura 25. Análisis del entrecruzamiento de Trastuzumab vía conector SMCC o PL13-NH-PEG4-OSu por SDS-PAGE reductora.
Figura 26. Estructura del conector PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE.
Figura 27. Perfil HIC de Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (A) y Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (B).
Figura 28. Perfil PLRP de T rastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (A) y T rastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (B).
Figura 29. Cálculo de DAR para Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE y Trastuzumab-mal-val-cit-MMAE basándose en el perfil de elución PLRP de la Figura 28.
Figura 30. Análisis SEC de Trastuzumab-mal-val-cit-MMAE (A) y Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE (B).
Figura 31. Perfiles representativos de HIC (A) y PLRP (B) de Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE logrados después de la optimización del procedimiento a una escala de 1 mg.
Figura 32. Perfiles HIC de Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (A) y Trastuzumab-maleimidaval-cit-4-aminobenzoil-MMAE (B) logrados a una escala de 150 mg.
Figura 33. Perfiles SEC de Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE (A) y Trastuzumab-maleimidaval-cit-aminobenzoil-MMAE (B) logrados a una escala de 150 mg.
Figura 34. Perfil HIC de Thiomab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE a pH 7,0 (línea continua) y pH 7,5 (línea discontinua).
Figura 35. Perfil PLRP para demostrar la eliminación de fármacos para trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil MMAE.
Figura 36. Perfil PLRP para demostrar la eliminación de fármacos para trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con una DAR de 3,8.
Figura 37. Estabilidad in vitro de los ADC: trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, Mal-ADC (A) frente a trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, PL13-ADC (B)
Figura 38. Estabilidad in vivo de ADC: PL13-ADC vs Mal-ADC
Figura 39. Datos de muerte celular para la línea celular SKBR3 (A), la línea celular BT474 (B) y la línea celular JIMT-1 (C).
Figura 40. Datos de xenoinjertos de dosis múltiples para demostrar la toxicidad de ADC.
Figura 41. Datos de xenoinjertos de dosis múltiples para mostrar el efecto de ADC sobre el crecimiento tumoral.
Figura 42. Datos histopatológicos de madurez tumoral
Figura 43. Datos comparativos para la conjugación de PEG-PL12 y PEG-PL13 de 20 KDa frente a PEG-maleimida de 20 KDa con albúmina reducida a pH 7,4
Figura 44. Optimización de la conjugación de PL11 (A), PL12 (B) y PL13 (C) con albúmina.
Figura 45. Análisis de conjugación de PL11 (A), PL12 (B) y PL13 (C) con albúmina por ESI-MS.
Figura 46. Estabilidad del producto conjugado de albúmina-PL-12 en presencia de GSH 1 mM demostrada por ESI-MS.
Figura 47. Estructura del conector PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-doxorrubicina.
Figura 48. Datos comparativos para la conjugación del conector PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-doxorrubicina con albúmina, tioalbúmina (mutante sencillo) y tioalbúmina (doble mutante).
Figura 49. Análisis SDS-PAGE no reductora de productos conjugados de albúmina-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-doxorrubicina. (1) doble mutante de tioalbúmina-DOX; (2) mutante sencillo de tioalbúmina-DOX; (3) Albúmina-DOX; marcador de proteína (M).
Figura 50. Análisis SEC de productos conjugados de albúmina-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-doxorrubicina: albúmina (A) y producto conjugado de albúmina-DOX (B); Tioalbúmina (mutante sencillo) (C) y Tioalbúmina-DOX (mutante sencillo) (D); Tioalbúmina (doble mutante) (E) y Tioalbúmina-DOX (doble mutante) (F).
Los métodos de la presente invención son capaces de proporcionar productos conjugados de proteína y fármaco, tales como ADC o productos conjugados de albúmina y fármaco, de acuerdo con la presente invención que comprenden un anticuerpo o albúmina unidos a un conector, que a su vez está unido a un fármaco, tal como una citotoxina o un péptido o polipéptido terapéuticos. Los productos conjugados de fármacos con albúmina no forman parte de la invención reivindicada.
En la presente invención, las referencias a anticuerpos incluyen inmunoglobulinas ya sean naturales o parcial o totalmente sintéticas. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprendan un dominio de unión a antígeno. También se contemplan fragmentos de anticuerpos que comprenden dominios de unión a antígeno que incluyen fragmentos Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, diacuerpos, triacuerpos o nanocuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y utilizar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conservan la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones flanqueantes, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0184187 A, GB 2.188.638 A o EP 0 239 400 A. Los anticuerpos se pueden modificar de varias maneras y se debe interpretar que el término cubre cualquier miembro de unión específica o sustancia que tenga un dominio de unión al antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluido cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por lo tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado con otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP 0120694 A y EP 0125023 A.
En la técnica anterior se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo sencillo; (iv) el fragmento dAb (Ward, ES et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab conectados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están conectados por un conector peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et al., Science, 242; 423-426, 1988; Houston et al., PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv monocatenarios biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (documento WO 94/13804; Holliger et al., P.N.A.S. Estados Unidos, 90: 6444-6448, 1993). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que conectan los dominios VH y VL (Reiter et al., Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996). También se pueden fabricar minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al., Cancer Res., 56: 3055-3061,1996). Por consiguiente, tales fragmentos de unión están contemplados por la presente invención.
En realizaciones preferidas, los métodos divulgados en el presente documento emplean reactivos y condiciones que están bien adaptados para unirse a una proteína, tal como un anticuerpo, a través de un conector a un fármaco, tal como una citotoxina. En particular, las condiciones de reacción que se utilizan en el presente método ayudan a evitar los problemas que tienden a ocurrir cuando se utilizan reactivos de la técnica anterior tales como maleimida, que tienden a producir una mezcla de diferentes productos con una variedad de propiedades diferentes. Más especialmente, como se puede observar a partir de los datos experimentales siguientes, los métodos para producir productos conjugados de proteína y fármaco, tales como los ADC, que utilizan conectores según la presente invención, evitan los problemas asociados con el entrecruzamiento de maleimida.
Como se mencionó anteriormente, la proteína de interés (es decir, el anticuerpo) para la composición del producto conjugado de proteína y fármaco (p. ej., ADC) puede unirse al conector utilizando grupos tiol existentes o introduciendo grupos tiol en una etapa inicial del método, por ejemplo, haciendo reaccionar uno o más grupos funcionales de la proteína (p. ej., anticuerpo) para producir un grupo tiol, o introduciendo un grupo tiol o un precursor del mismo en el anticuerpo. A modo de ejemplo, esto puede implicar la etapa de introducir un resto de cisteína en la proteína (en el ejemplo, un anticuerpo) en un sitio donde se desea unir el conector a la proteína (p. ej., anticuerpo). Esto puede ser útil en situaciones en las que no está presente un resto de cisteína conveniente para la reacción según la presente invención en un polipéptido/proteína de partida o de tipo salvaje. Convenientemente, esto se puede lograr utilizando mutagénesis dirigida al sitio de la proteína, tal como un polipéptido anticuerpo, cuyo uso está bien establecido en la técnica.
Alternativamente o adicionalmente, puede ser necesario una etapa de reducción inicial cuando la proteína es albúmina de grado comercial, ya que la mayoría de los tioles de cisteína presentes están protegidos, como se comenta con más detalles a continuación.
Datos experimentales y discusión
Los siguientes datos experimentales se produjeron principalmente utilizando la molécula conectora identificada como PL13, en su forma de ácido libre o pegilada con NH, como se muestra a continuación.
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1. Demostración de la reactividad del conector PL11, PL12 y PL13 con glutatión.
El glutatión contiene un grupo tiol que está fácilmente disponible para la conjugación y puede proporcionar un buen modelo para proteínas para evaluar la idoneidad de los conectores para su uso en la presente invención para su utilidad en productos conjugados de proteína y fármaco, tales como los ADC. La Figura 1 muestra tres ejemplos de grupos conectores según la presente invención y demuestra su capacidad para conjugarse con los grupos tiol presentes en el glutatión. Los ejemplos de la Figura 1 son PL11, PL12 y PL13, y sus estructuras se muestran a continuación.
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2. Determinación de la selectividad del ácido libre de PL13
Los datos proporcionados a continuación demuestran que los conectores de acuerdo con la presente invención muestran especificidad por los grupos de cisteína. El ácido libre de PL13 se identifica como;
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Reactividad del ácido libre de PL13 con N-acetilcisteína a pH 7,0, 7,5 y 8,0
El ácido libre de PL13 se hizo reaccionar con 2 equivalentes molares de N-acetilcisteína (NAC) a tres pH diferentes: 7.0, 7,5 y 8,0. Las reacciones se llevaron a cabo en una solución salina tamponada con metanol/fosfato (PBS) (razón de 9:1), tamponada al pH apropiado a temperatura ambiente (RT). Se realizó un análisis de RP-HPLC con un gradiente de B de 1 % a 50 % (Acetonitrilo con TFA al 0,1 %) durante 15 minutos y detección a 254 nm para controlar la adición de tiol libre al grupo vinilo de PL13 a lo largo del tiempo.
Método:
Se mezclaron 210 pl de ácido libre de PL132,61 mM en metanol con 22 pl de NAC 50 mM en tampón para proporcionar una concentración final de ácido libre de PL132,37 mM y NAC 4,74 mM.
Resultados:
El aducto PL13-NAC se eluyó con un tiempo de retención de 5,1 minutos a todos los pH después de 24 horas (véase la Figura 2). La cantidad de producto (aducto PL13-NAC) fue similar a pH 7,0 y 8,0. La reactividad del ácido libre de PL13 a pH 7,5 fue más lenta. Además, se eluyó un pico no identificado a los 4 minutos.
El análisis ESI-MS confirmó la presencia del aducto PL13-NAC a todos los pH analizados. Los datos de trazas de MS se incluyen aquí para mostrar este análisis realizado a pH 7,0 (Figura 3) y pH 8,0 (Figura 4).
Reactividad del ácido libre de PL13 con N-acetilcisteína a pH 8,0
El ácido libre de PL13 se hizo reaccionar con 2 equivalentes molares de NAC en solución de metanol/PBS (9:1), pH 8.0. El progreso de la reacción se controló mediante RP-HPLC utilizando un gradiente de B de 1 % a 50 % durante 15 minutos con detección a 254 nm. Las muestras se analizaron a las 0, 1, 4 y 72 horas de incubación a temperatura ambiente (véase la Figura 5).
Método:
Se mezclaron 100 pl de ácido libre de PL132,61 mM en metanol con 11 pl de NAC 50 mM en tampón a pH 8,0 para proporcionar una concentración final de ácido libre de PL132,35 mM y nAc 5 mM.
Resultados:
La adición de ácido libre de PL13 a NAC es lenta durante las primeras 4 horas. Después de 72 horas de incubación, -70 % del ácido libre de PL13 se convirtió en producto (aducto PL13-NAC) a pH 8,0.
Reactividad del ácido libre de PL13 con 10 equivalentes de Tirosina, Histidina, Lisina y N-Acetilcisteína a pH 7,0 El ácido libre de PL13 se expuso a 10 equivalentes de cada aminoácido (tirosina (Tyr), histidina (His), Lisina (Lys) y N-acetilcisteína (NAC)) a pH 7,0. La reacción se analizó mediante RP-HPLC utilizando un gradiente de B de 1 a 50 % durante 15 minutos con detección establecida a 254 nm.
Método:
Se mezclaron 50 pl de PL132,61 mM en metanol con 260 pl de Tyr/His/Lys 20 mM y NAC en tampón para proporcionar una concentración final de PL130,42 mM y 4,2 mM de Tyr, His, Lys y NAC.
Resultados:
El ácido libre de PL13 reaccionó selectivamente con NAC en presencia de Tyr, His y Lys a pH 7,0 (véase la Figura 6). La Figura 7 muestra los datos de MS para demostrar que solo se formó el aducto de PL13 y NAC.
La reacción de adición entre PL13 y NAC aumentó significativamente con un exceso 10 molar de aminoácido. La conversión del ácido libre de PL13 en el aducto PL13-NAC deseado se completa en 90 % después de 4 horas a temperatura ambiente (RT) y se completa totalmente en <18 horas.
Los resultados obtenidos demuestran la selectividad de la forma de ácido libre de la molécula conectora de acuerdo con la presente invención para la reactividad de la cisteína a través del grupo vinilo de la molécula conectora.
Análisis RP-HPLC de la reactividad del ácido libre de PL13 con lisina.
El ácido libre de PL13 se expuso a 10 equivalentes de Lys en tampón PBS, pH 7,4 a RT. La reacción se analizó mediante RP-HPLC utilizando un gradiente de 12 a 50 % de acetonitrilo en agua durante 30 minutos con detección establecida a 270 nm.
Método:
Se mezclaron 10 |ul de PL134 mM en metanol con 50 |ul de solución de Lys 8 mM y 40 |ul de tampón PBS de pH 7,4 para proporcionar una concentración final de PL130,4 mM y Lys 4,0 mM. La reacción se analizó mediante RP-HPLC utilizando un gradiente de 12 a 50 % de acetonitrilo en agua durante 30 minutos con detección establecida a 270 nm.
Resultados:
El ácido libre de PL13 no reaccionó con Lys a pH 7,4 ya que no se observa ningún pico en el análisis de RP-HPLC correspondiente a un aducto PL13-Lys (véase la Figura 8).
Los resultados obtenidos demuestran que no se forma aducto mediante la incubación del ácido libre de PL13 con Lys. Estos datos respaldan la selectividad del grupo cisteína de la forma de ácido libre de los conectores de la presente invención. Debe apreciarse que la maleimida no exhibe tal especificidad de cisteína y, como tales, los conectores de la presente invención presentan un beneficio a este respecto.
Si bien los datos anteriores muestran la especificidad de cisteína exhibida por los conectores de la presente invención, se aprecia fácilmente que puede lograrse alternativamente la especificidad de lisina si el conector se modifica mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Reactividad del ácido libre de PL13 con ácido aspártico
El ácido libre de PL13 se trató con 10 equivalentes de ácido aspártico (Asp) a pH 7,0 ya temperatura ambiente. El análisis se realizó mediante RP-HPLC con un gradiente de B de 1 % a 50 % durante 15 minutos con detección a 254 nm.
Método:
Se mezclaron 50 |ul de ácido libre de PL132,61 mM en metanol con 280 |ul de Asp 50 mM en tampón para proporcionar una concentración final de ácido libre de PL130,42 mM y Asp 4,2 mM.
Resultados:
El ácido libre de PL13 es estable en presencia de Asp a pH 7,0 durante 18 horas a temperatura ambiente (véase la Figura 9).
Los espectros de MS corroboran que no se forma aducto por la incubación de ácido libre de PL13 con Asp (datos no mostrados). Nuevamente, estos datos respaldan la selectividad del grupo cisteína de los conectores de la presente invención. Debe apreciarse que la maleimida no exhibe tal especificidad de cisteína y, como tales, los conectores de la presente invención presentan un beneficio sobre esto.
3. Síntesis del conector de fármacos citotóxicos PL13-Val-C¡t-4-aminobenzo¡l-MMAE
PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE se sintetizó mediante un enfoque de fragmentos, que será familiar para el experto en la técnica.
Método:
El ácido libre de PL13 se acopló al extremo amino libre de H-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, una citotoxina ilustrativa, a través de un método de éster activo de HOBt.
Resultados:
Se sintetizaron 3,1 mg de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (véase la Figura 10). La sustancia se solubilizó en dimetilacetamida (DMA) para proporcionar una solución conectora de fármacos a una concentración de 50 mM.
La RP-HPLC confirmó la pureza del conector PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (datos no mostrados).
El análisis ESI-MS confirmó la identidad del conector del fármaco citotóxico (el MW esperado es de 1296,67 Da, el resultado experimental dio un MW de 1296,5 Da) (véase la Figura 11).
4. Generación de Trastuzumab-PL13-Val-C¡t-4-aminobenzo¡l-MMAE y Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE
Se produjeron 20 mg de producto conjugado de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, un ADC ilustrativo de la presente invención, y 20 mg de producto conjugado de Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, un ADC que comprende un conector de maleimida conocido.
Conjugación de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con trastuzumab
Método:
Trastuzumab se redujo para permitir la conjugación de 3-4 fármacos por molécula de trastuzumab. No se proporciona un método detallado para la reducción de trastuzumab, ya que el experto en la técnica debería conocerlo bien.
Se conjugó maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con Trastuzumab en un exceso molar de 1,25 sobre el tiol libre a pH 7,0. La reacción se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción de conjugación se detuvo por un exceso de NAC. El análisis del producto conjugado de Trastuzumab se realizó mediante Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) utilizando una columna Tosoh butil-NPR (4,6x3,5, 2,5 gm) y mediante espectroscopia UV-VIS. MMAE tiene una absorbancia UV distintiva a 248 nm (£248= 1500 M-1cm, £280= 15900 M-1cm).
Se acopló PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a trastuzumab a un exceso molar de 1,25, 2,5, 5 y 10 sobre el tiol libre. Las reacciones se llevaron a cabo durante 16 horas a pH 7,0. Las reacciones de conjugación se analizaron mediante HIC (separación en una columna Tosoh butil-NPR) y cromatografía PLRP (separación en una columna PLRP-2,1 mm x 5 cm, 5 gm). Los productos conjugados de trastuzumab se examinaron mediante espectroscopia UV-VIS. Tanto el fármaco citotóxico MMAE como el conector PL13 contribuyen a la absorbancia UV a 248 nm.
Resultados:
La reacción de maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con Trastuzumab se completó en 1 hora utilizando una razón de 1,25 de fármaco sobre el tiol libre (véase la Figura 12). Los números de la Figura 12 designan la cantidad de fármaco conjugado con un anticuerpo completo. La entrada es el perfil UV-Vis que representa un aumento de la absorbancia a 248 nm debido a la conjugación de maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con Trastuzumab. Se obtuvieron 10 mg del producto conjugado trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (razón fármaco/anticuerpo (DAR) 2,2) y se reservaron para estudios in vitro, como se comenta más adelante.
La velocidad y la eficiencia de la reacción de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE es mucho más lenta que la de maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE debido a la baja solubilidad del conector (véase la Figura 13). La conjugación se realizó con un exceso 1,25 molar de conector de fármaco sobre el tiol. La entrada es el perfil UV-Vis que representa un aumento de absorbancia a 248 nm debido al acoplamiento de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a Trastuzumab en 16 horas. Se observó un lento aumento en la tasa de conjugación de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con trastuzumab al aplicar un exceso 5 molar del conector de fármaco sobre el grupo tiol (véase la Figura 14). En la Figura 14, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con un anticuerpo completo. DL indica fármaco no conjugado.
La conjugación de PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con trastuzumab en un exceso 10 molar y en presencia de propilenglicol al 50 % dio como resultado un rendimiento de 90 % en 4 horas (véanse la Figura 15 y la Figura 16). En la Figura 15, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con un anticuerpo completo. DL indica fármaco no conjugado. En la Figura 16, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con la cadena ligera (L) o pesada (H) del anticuerpo. Se obtuvieron 7,2 mg de producto conjugado Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (DAR 3,03) y se reservaron para estudios in vitro, como se comenta más adelante.
Determinación de la razón fármaco-anticuerpo (DAR) para Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE.
La cromatografía HIC y PLRP se aplican a menudo para caracterizar la carga promedio de fármaco y la distribución de la carga de fármaco para ADC conectados a cisteína. La determinación de la carga promedio de fármaco y la distribución de la carga de fármaco es un atributo crucial, ya que afecta a la potencia y la farmacocinética del ADC.
Resultados:
La caracterización mediante HIC de Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE dio como resultado un cálculo de DAR de 2,2 con 1,8 % de Trastuzumab no conjugado (véase la Figura 12). El cálculo de DAR a partir del perfil HIC se determina mediante métodos bien conocidos en la técnica, como se comenta a continuación con relación a la Figura 27.
El análisis mediante HIC de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE dio como resultado picos que no se resolvieron lo suficientemente bien como para respaldar la determinación de DAR (véase la Figura 15). Sin embargo, estos datos se incluyen aquí para completar. Se utilizó HIC para calcular que la cantidad de Trastuzumab con DAR 0 calculada era de -8,4%.
La separación de Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE reducido con ditiotreitol (DTT) a través de una columna PLRP proporcionó picos bien resueltos (Figura 16) correspondientes a cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos no conjugados o conjugados con fármacos. Se calculó una DAR de 3,0 para T rastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (véase la Figura 17). La tabla de la Figura 17 muestra el cálculo de DAR para Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en función del porcentaje de área de cadenas ligeras y pesadas no conjugadas y cargadas con fármaco.
5. Estudios de estabilidad de Trastuzumab-PL13-Val-Cit-4-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumab-maleimida-Val-Cit-4-aminobenzoil-MMAE
La estabilidad del conector de fármacos para los productos conjugados trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE se evaluó en presencia de NAC en tampón PBS.
Método:
Cada ADC (a una concentración de 1 -2 mg/ml) se incubó con NAC 1 mM en tampón PBS durante 24 horas a 37°C.
Resultados:
El producto conjugado trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE no se vio afectado por la presencia de NAC en el tampón (véanse las Figuras 18 y 19). Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE mostró una menor estabilidad en presencia de NAC (véase la Figura 20). En la Figura 18, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con un anticuerpo completo. DL indica fármaco no conjugado.
La Figura 19 en particular demuestra que no hay cambio de perfil para el ADC que contiene PL13 como resultado de la exposición del tiol libre, lo que indica la estabilidad de la construcción.
6. Análisis SDS-PAGE y SEC de Trastuzumab-PL13-Val-Cit-4-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumab-maleimida-Val-Cit-4-aminobenzoil-MMAE
Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE se evaluaron mediante cromatografía SEC y SDS-PAGE no reductora.
Resultados:
Trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE está presente como monómero al 99,5 % (véase la Figura 21 (A) ). Trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE está presente como monómero al 93,5 % (véase la Figura 21 (B) ).
El análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras mostró la presencia de múltiples bandas en las muestras de trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE debido a la rotura de enlaces disulfuro entre cadenas en el anticuerpo durante la alquilación de restos de cisteína con restos de fármaco conector (véase la Figura 22). En la Figura 22, la calle 1 representa el análisis de 5 |uL de muestra de trastuzumab-PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE cargado en el gel a una concentración de 1,8 mg/mL y la calle 2 representa el análisis de 5 |uL de muestra de trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE cargado en el gel a una concentración de 5 mg/mL. La integridad del anticuerpo completo aún se mantiene debido a las fuertes interacciones no covalentes entre las cadenas pesada y ligera, lo que se confirmó mediante análisis SEC.
7. Síntesis del conector heterobifuncional PL13-NH-PEG4-OSu
El PEG (PEG4) hidrófilo se introdujo en la porción del brazo conector de la molécula conectora, para proporcionar PL13-NH-PEG4-OSu, para mejorar la solubilidad del conector con respecto al ejemplo proporcionado en la sección 1 anterior (véase la Figura 23).
Método:
El ácido libre de PL13 (como se describe anteriormente) se acopló al ácido 1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15oico. La activación del grupo carboxilo al éster de succinimidilo deseado se llevó a cabo utilizando acoplamiento de N,N- diciclohexilcarbodiimida (DCC) 2,5 eq./HOSu en diclorometano anhidro (DCM). El DCC que no había reaccionado y un subproducto de diisopropilurea se eliminaron mediante filtración en DCM frío.
Resultados:
La ESI-MS de PL13-NH-PEG4-COOH (véase la Figura 24), confirmó la identidad del conector.
Comparación de la reactividad cruzada de los conectores PL13-NH-PEG4-OSu y SMCC
El grado de entrecruzamiento de Trastuzumab a través de trans-4-(maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), un conector conocido, y PL13-NH-PEG4-OSu se evaluó mediante SDS-PAGE reductora. Método:
Se incubó trastuzumab a una concentración final de 2 mg/ml con un exceso de 10 veces de SMCC o PL13-NH-PEG4-OSu. Las muestras se incubaron a RT.
Resultados:
Resulta evidente a partir de la SDS-PAGE que PL13-NH-PEG4-OSu muestra menos bandas de alto peso molecular que el conector SMCC (véase la Figura 25, calles 5-9). Hay algunas bandas de mayor peso molecular en la SDS-PAGE de PL13-NH-PEG4-OSu, pero también están presentes en cierta medida en la calle inicial de Trastuzumab (véase la Figura 25, calle 5).
A diferencia de los conectores de la presente invención, el conector SMCC induce el entrecruzamiento de trastuzumab debido a la reactividad no específica del grupo maleimida, particularmente hacia las cadenas laterales de amina de los restos de lisina.
8. Síntesis de PL13-NH-PEG4-val-c¡t-4-aminobenzo¡l-MMAE
Para mejorar adicionalmente la solubilidad del conector de fármacos citotóxicos PL13-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE sintetizado previamente, se introdujo en la molécula una unidad de PEG hidrófila corta (véase la Figura 26). La unidad PEG también introduce un 'espaciador' en el brazo conector de ADC, lo que aumenta la separación de la carga útil citotóxica de MMAE y el punto de anclaje del anticuerpo a través de PL13 en unos 39 átomos (frente a los 22 átomos anteriores en PL13-vcMMAE). Se cree que este "espaciador" debería aumentar la flexibilidad de rotación de la unidad PL13, lo que puede influir en la cinética de la adición de Michael al tiol libre.
Método:
Se purificaron 40 mg de Fmoc-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE bruto. A continuación, el grupo N-Fmoc se eliminó mediante aminólisis y el compuesto citotóxico funcionalizado con amina se purificó para proporcionar 24 mg de material. Esto se usó para acoplar PL13-NH-PEG4-COOH a través de la química de éster activo con HOBt convencional.
Resultados:
Se sintetizó PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE. Esta molécula representa un ejemplo de un sistema ADC escindible de acuerdo con la presente invención.
9. Conjugación de PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y Maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE con Trastuzumab.
Método:
El T rastuzumab se redujo con un exceso de 2,4 veces de tris(2-carboxitil)fosfina (TCEP) durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El anticuerpo se volvió a tamponar en PBS. El Trastuzumab, a una concentración de 20 mg/ml, se conjugó con un exceso de 20 veces de PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en presencia de DMA al 5 % v/v a temperatura ambiente durante 16 horas. Además, el conector maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE se acopló a trastuzumab (20 mg/ml) en exceso 6 molar a temperatura ambiente durante 1 hora. Los ADC obtenidos se analizaron mediante cromatografía HIC, PLRP y SEC.
Resultados:
La caracterización por HIC de trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE dio como resultado un cálculo de DAR de 4,29 (véase la Figura 27 A).
La caracterización por HIC de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE dio como resultado un cálculo de DAR de 3,15 (véase la Figura 27 B).
En las Figuras 27A y 27B, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con un anticuerpo completo. La tabla representa el porcentaje relativo de cada área de pico del perfil de elución de HIC. La DAR promedio se calcula multiplicando el área del pico porcentual por la carga de fármaco correspondiente para obtener un área del pico ponderada. Las áreas de los picos ponderadas se suman y se dividen por 100 para proporcionar un valor de DAR final.
El análisis DAR de trastuzumab-maleimida-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE reducido por DTT mediante PLRP confirmó que la carga media de fármaco era de 4,3 (véase la Figura 28 A y la Figura 29).
El análisis de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE reducido por DTT mediante PLRP confirmó una carga de fármaco promedio de 3,8 (véase la Figura 28 B y la Figura 29).
En las Figuras 28A y 28B, los números designan la cantidad de fármaco conjugado con la cadena ligera (L) o pesada (H) del anticuerpo.
El análisis tanto de trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (HER-MAL-MMEA) como de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (HER-PL-13-MMEA) en la cromatografía SEC mostró que ambas muestras están representadas como especies monoméricas (véase la Figura 30 A y B). La tabla debajo de las Figuras 30A y 30B muestra el cálculo de especies de alto peso molecular (HMW), especies monoméricas y de bajo peso molecular (LMW).
10. Condiciones optimizadas para la conjugación de PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE
Método:
El Trastuzumab (23,5 mg/mL) se redujo con 2,4 equivalentes de TCEP durante 2 horas a temperatura ambiente para producir un promedio de 4,5 tioles libres. El Trastuzumab reducido se conjugó con un exceso de 20 veces de PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE en presencia de DMA al 10% v/v a 30°C durante 18 horas. El producto conjugado se analizó mediante cromatografía HIC y PLRP (véase la Figura 31 A y B).
Resultados:
Los datos de HIC y PLRP muestran una mejora sustancial en la eficacia de la conjugación. El mayor nivel de eficacia de la conjugación también da como resultado una reducción significativa a nivel de especies de DAR 'raras' y una reducción en el nivel de anticuerpo no conjugado.
11. Conjugación de Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE (A) y Trastuzumab-maleimidaval-cit-aminobenzoil-MMAE (B) a una escala de 150 mg, lo que demuestra la capacidad de ampliación del procedimiento
Método:
El Trastuzumab (24,53 mg/ml) se redujo con 2,1 equivalentes de TCEP durante 2 horas a RT. El Trastuzumab reducido se conjugó con un exceso de 20 veces de PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE en presencia de DMA al 10% v/v a 30°C durante 18 horas.
El T rastuzumab a una concentración de 25,68 mg/ml se redujo con 1,95 equivalentes de TCEP durante 2 horas a RT. El Trastuzumab reducido se conjugó con un exceso de 6 veces de maleimida-val-cit-MMAE en presencia de DMA al 10% v/v a RT durante 1 hora.
Los productos conjugados se analizaron mediante cromatografía HIC y SEC (véanse las Figuras 32 y 33).
Resultados:
Los perfiles HIC mostraron una eficiencia de conjugación similar para Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-citaminobenzoil-MMAE (Figura 32A) y Trastuzumab-maleimida-val-cit-aminobenzoil-MMAE (Figura 32B). La SEC (Figuras 33A y 33B) confirmó que ambos productos conjugados son monómeros con solo una pequeña cantidad de especies de alto peso molecular presentes (1,4 - 2,4 %). Esto demuestra la capacidad de ampliación del procedimiento de conjugación desarrollado utilizando los conectores de la presente invención.
12. Conjugación de PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE con Thiomab, lo que demuestra una conjugación exitosa con Trastuzumab modificado mediante ingeniería genética (Thiomab)
Método:
El Trastuzumab con una mutación de cisteína (V205C) introducida en la cadena ligera del anticuerpo se conjugó a una concentración de 10 mg/ml con un exceso de 40 veces de PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE en presencia de DMA al 10% en tampón de pH 7,4. Las reacciones de conjugación se incubaron a 35°C durante 48 horas.
Resultados:
El perfil HIC de Trastuzumab (V2015C)-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE demuestra que PL13 se puede conjugar con éxito con anticuerpos con restos de Cys modificados mediante ingeniería genética a ambos pH (Figura 34). La velocidad y el alcance de la reacción de conjugación parecen estar influenciados por el microambiente del tiol.
13. Utilidad de los ADC según la presente invención como ADC.
Los productos de conjugación de ADC, como se describe anteriormente en la sección 8, se sometieron adicionalmente a pruebas in vivo e in vitro para demostrar su utilidad como ADC comerciales.
Estabilidad in vitro de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en presencia de NAC
Método:
La estabilidad del conector de fármacos para los productos conjugados trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE se evaluó en presencia de NAC en tampón PBS.
Resultados:
El producto conjugado de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE no se vio afectado por la presencia de NAC en el tampón (Figura 36). Trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE mostró una menor estabilidad en presencia de NAC (véase la Figura 35). La Figura 36 en particular demuestra que no hay cambio de perfil para el ADC que contiene PL13 como resultado de la exposición al tiol libre, lo que indica la estabilidad de la construcción.
Estabilidad in vitro de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en plasma de ratón
Se comparó la estabilidad sérica in vitro de los ADC Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumab-maleimida-val-cit-aminobenzoil-MMAE en plasma de ratón.
Método:
Se añadieron por separado Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE y Trastuzumab-maleimida-valcit-aminobenzoil-MMAE a plasma de ratón carente de sistema inmunitario atímico filtrado a una concentración de 0,2 mg/ml. Las soluciones se mezclaron y se tomaron alícuotas por triplicado de 50 pL y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido (punto de tiempo - 0 h). Las soluciones de plasma de los ADC se incubaron a 37°C durante 7 días. Se extrajeron alícuotas de 50 pL por triplicado para cada punto de tiempo: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 días, y se almacenaron a -80°C hasta el análisis.
Resultados:
La estabilidad del ADC se controló mediante análisis LC-ESI/MS. Las muestras de plasma se purificaron previamente y se digirieron con tripsina/CNBr antes del análisis de MS. Se seleccionaron cuatro péptidos no conjugados (dos de la cadena pesada y dos de la cadena ligera) y dos péptidos conjugados (uno de la cadena pesada y uno de la cadena ligera) para controlar la estabilidad de los ADC. Los datos promediados de los péptidos no conjugados corresponden a la estabilidad del componente anticuerpo en plasma de ratón (Ab Total) y los datos de los péptidos conjugados muestran la estabilidad del producto conjugado ADC (péptido conjugado con LC, conjugado con HC).
Estos datos in vitro revelaron que trastuzumab-maleimida-val-cit-aminobenzoil-MMAE experimenta eliminación de fármacos tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada, mientras que el componente de anticuerpo es estable (Figura 37A). La pérdida de fármaco del péptido de cadena pesada fue más rápida en comparación con el péptido de cadena ligera, lo que indica que la tasa de pérdida de fármaco se ve afectada por el sitio de conjugación.
El producto conjugado Trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-aminobenzoil-MMAE retuvo el fármaco MMAE durante el período de incubación de 7 días, lo que demuestra que PL13 confiere estabilidad a ambos sitios de conjugación (Figura 37B). La variabilidad observada para ambos productos conjugados se debe a la eficiencia de la recuperación de muestras para el método ESI-MS aplicado para el análisis de muestras.
Estabilidad in vivo de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en ratones
Método:
La estabilidad in vivo se evaluó en ratones a los que se había inyectado 5 mg/kg de los productos conjugados trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE. Las muestras de plasma se purificaron previamente y se digirieron con tripsina/CNBr antes del análisis mediante LCMS. Se seleccionaron dos péptidos conjugados (uno de cadena pesada y otro de cadena ligera) para controlar la estabilidad de los ADC.
Resultados:
La estabilidad de los péptidos conjugados es el resultado de dos eventos; 1) degradación catabólica de ADC y 2) pérdida de fármaco debido a la inestabilidad del conector. Los péptidos conjugados derivados de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE muestran una mejor estabilidad a 1 día en plasma de ratón que los péptidos derivados de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE. La diferencia observada probablemente se deba a una pérdida de fármaco más rápida de los péptidos conjugados derivados de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE que de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, que es compatible con los datos in vitro de plasma de ratón, que muestran una eliminación rápida de fármaco para trastuzumab-malemidaval-cit-4-aminobenzoil-MMAE en el plazo de los primeros cuatro días de incubación (Figura 38); se perdieron aproximadamente 70% del fármaco anclado a la cadena ligera y 90% del fármaco en la cadena pesada durante los dos primeros días. Por el contrario, trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE retiene más fármaco debido a la estabilidad del conector durante un período de tiempo más largo.
Estabilidad in vitro de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en varias líneas celulares
En las Figuras 39A a 39C se muestran los datos de destrucción de células SKBR3, BT747 y JIMT-1 para los ADC descritos anteriormente. En esta prueba se seleccionaron las líneas celulares SKBR3, BT747 y JIMT-1, ya que se sabe que expresan el receptor Her2. Además, se sabe que la línea celular JIMT-1 es resistente a trastuzumab. En las Figuras 39A a 39C "ADC mal" se refiere a trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE, y "ADC-PL13" se refiere a trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE. Las actividades in vitro relativas de los productos conjugados probados frente a tres líneas celulares indican que los datos de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE son comparables a trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE. Por consiguiente, estos datos muestran que el ADC de la presente invención es activo y, por lo tanto, la presencia de PL13 no tiene un efecto negativo sobre la destrucción de células.
Estabilidad in vivo de trastuzumab-malemida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE en ratones que presentan tumores de células de cáncer de mama
Los datos del xenoinjerto se muestran en las Figuras 40, 41 y 42 con relación al efecto de los ADC en ratones que presentan tumores de células de cáncer de mama. La línea celular de cáncer de mama utilizada fue BT474 (que expresa Her2, con alta susceptibilidad a trastuzumab).
Se utiliza el peso del ratón (como se muestra en la Figura 40) para medir la toxicidad del ADC in vivo. De los datos obtenidos se puede observar que el trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-mal) (Figura 40A) y el trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-PL13) (Figura 40B) tienen un efecto insignificante sobre el peso del ratón durante el transcurso del período de terapia. Esto es indicativo de que los ADC de la presente invención tienen niveles de toxicidad adecuados para su uso comercial.
La Figura 41 muestra la eficacia de los ADC probados a tres dosis (0,1, 5 y 10 mg/kg) sobre el crecimiento tumoral durante un período de terapia de 21 días. El crecimiento tumoral se determinó mediante cambios en los volúmenes tumorales. Los ratones tratados con ambos compuestos a 0,1 mg/kg experimentaron un retraso en el crecimiento del tumor con relación al grupo no tratado. Por el contrario, todos los animales a los que se administraron trastuzumabmaleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-mal) y trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-PL13) a 5 y 10 mg/kg mostraron respuestas completas durante el período de terapia.
La Figura 42 muestra la eficacia de los ADC probados a tres dosis (0,1,5 y 10 mg/kg) sobre el fenotipo histológico de madurez tumoral durante un período de terapia de 10 días. Los tejidos tumorales se examinaron microscópicamente después de la tinción con hematoxilina y eosina y se clasificaron de la siguiente manera:
0: sin masa de xenoinjerto; ocasionalmente, células tumorales aisladas en subcutis o tejido adiposo
1: pequeña masa fragmentada; secuencia de desarrollo epitelial incompleta
2: xenoinjerto que muestra una marcada pérdida de células
3: pérdida de células zonales con áreas de tumor maduro
4: masa de xenoinjerto intacto que muestra la secuencia de desarrollo epitelial completa y la patología asociada
No se observó reducción en la madurez del tumor ni para trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-PL13) ni para trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE (ADC-mal) dosificados a 0,1 mg/kg, sin observarse diferencias significativas entre los dos ADC. Sin embargo, trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a dosis de 5 y 10 mg/kg reveló una madurez tumoral significativamente reducida a partir del día 3 (grado 3 y grado 3/2, respectivamente). Este efecto fue más pronunciado el día 10 (grado 1 para 5 mg/kg y grado 1/0 para 10 mg/kg) no mostrando algunas muestras masa tumoral. El trastuzumab-maleimida-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a dosis de 5 y 10 mg/kg redujo la madurez tumoral (grado 4/3 y grado 4/3/2, respectivamente) a partir de los 3 días, pero los efectos fueron menos pronunciados en comparación con los animales que recibieron las dosis correspondientes de trastuzumab-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-MMAE a los 3 días. Además, hubo una heterogeneidad tumoral marcadamente mayor para ADC-mal que la observada para ADC-PL13 para dosis de 5 y 10 mg/kg a los 10 días.
14. Demostración de reactividad del conector PL11-PEG 20KDa , PL12-PEG 20KDa y PL13-PEG 20KDa con albúmina (Ejemplo de referencia)
Como se indicó anteriormente, la mayoría de los tioles de cisteína presentes en la albúmina de grado comercial están protegidos, por lo que es necesario una etapa de reducción antes de la conjugación con las moléculas conectoras.
Método:
La albúmina (221 pM) se redujo con ditiotreitol (DTT) (1 mM) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,0 que contenía ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (1 mM) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT), seguido de desalinización en una columna Nap-5 y cuantificación mediante medición UV. La conjugación de PEG-PL-12 de 20 KDa (exceso 10 molar) o PEG-PL-13 de 20 KDa (exceso 10 molar) con albúmina reducida (20 pM) se realizó en PBS, pH 7,4, EDTA 1 mM durante 1 día a temperatura ambiente. De forma similar, se realizó la conjugación de PEG-maleimida de 20 KDa (exceso 1,1 molar) con albúmina reducida (20 pM) en PBS, pH 7,4 que contenía EDTA 1 mM durante 1 día a temperatura ambiente. Las reacciones se analizaron en gel SDS-PAGE y la cuantificación se realizó mediante el análisis de la densidad de la banda de proteína en gel SDS-PAGE utilizando el soporte lógico ImageLab (Biorad).
Resultados:
Solo se observaron rendimientos de conjugación moderados con albúmina de calidad comercial reducida después de 1 día. La conjugación de PL13 procedió con un rendimiento comparable al del control de maleimida, mientras que PL12 proporcionó un rendimiento ligeramente inferior durante el mismo período de tiempo. Esto se muestra en la Figura 43.
15. Optimización de la conjugación de PL11, PL12 y PL13 con albúmina (Ejemplo de referencia)
La conjugación del conector con albúmina se determinó a pH 5,5 para PL-11 y a pH 5,5, 6,5, 7,5, 8,0 y 8,5 para PL-12 y PL-13.
Método:
La conjugación de PL-11 (exceso 10 molar) con albúmina (50 pM) se realizó en acetato-Na 50 mM pH 5,5 durante 24 horas a 37°C. La conjugación de PL-12 y PL-13 (exceso 10 molar) con albúmina (50 pM) se realizó en los siguientes tampones: acetato-Na 50 mM, pH 5,5; PBS EDTA 1 mM pH 6,5; Pb S EDTA 1 mM pH 7,5; fosfato 100 mM; EDTA 1 mM pH 8,0; y carbonato de sodio 100 mM, EDTA 1 mM pH 8,5; durante 24 horas a 37°C.
Al finalizar, todas las muestras de albúmina se desalinizaron en una columna Nap-5 en tampón PBS (pH 7,4). La eficacia de la conjugación se cuantificó mediante el ensayo de Ellman. El ensayo de Ellman detecta y cuantifica los restos de cisteína libres al hacer reaccionar ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) con grupos tiol libres. La conjugación de moléculas conectoras al grupo tiol libre de 34Cys en la albúmina bloquea la detección de estos grupos por el reactivo de Ellman en comparación con el control de albúmina no conjugado. Se usó una disminución en la concentración de tioles libres detectables para cuantificar la cantidad de molécula conectora conjugada con la albúmina.
Resultados:
La conjugación de PL-11 con albúmina a pH 5,5 tuvo lugar con un rendimiento de 82%. Se determinó que el pH óptimo para la conjugación de PL-12 (91%) y PL-13 (94%) era pH 7,5. Estos resultados se muestran en la Figura 44.
16. Demostración de la estabilidad del producto conjugado de conector-albúmina mediante ESI-MS (Ejemplo de referencia)
Además, los productos conjugados de albúmina-PL11, albúmina-PL12 y albúmina-PL13 se analizaron mediante ESI-MS.
Método:
La conjugación de PL-11 (exceso 20 molar) con albúmina (50 pM) se realizó en PBS que contenía EDTA (1 mM) a pH 6,5 durante 24 horas a 37°C. La conjugación de PL-12 y PL-13 (exceso 10 molar) con albúmina (50 pM) se realizó en PBS que contenía EDTA (1 mM) a pH 7,5 durante 24 horas a 37°C. Los productos conjugados de albúmina-conector se analizaron mediante ESI-MS.
Resultados:
La Figura 45 muestra los resultados de ESI-MS obtenidos para la conjugación de albúmina-PL-11 (A), la conjugación de albúmina-PL-12 (B) y la conjugación de albúmina-PL-13 (C).
Se detectaron y cuantificaron las siguientes especies de albúmina en función de la intensidad de la señal de MS (obsérvese que MW significa peso molecular):
Albúmina-PL11
• Albúmina no conjugada - 6 %
MW esperado de albúmina no conjugada - 66440 (MW detectado = 66445 Da)
• Producto conjugado de albúmina-PL11 - 90 %
MW esperado de albúmina-PL11 - 66649 Da (MW detectado = 66650 Da)
• Albúmina conjugada con dos PL11 ~ 4 %
MW esperado de albúmina-2-PL11 - 66858 Da (MW detectado = 66858 Da) Albúmina-PL12
• Albúmina no conjugada - 1 %
MW esperado de albúmina no conjugada - 66440 (MW detectado = 66441 Da)
• Albúmina-PL12 - 92 %
MW esperado de albúmina-PL12- 66663 Da (MW detectado = 66664 Da)
• Albúmina conjugada con dos PL12 - 7 %
MW esperado de albúmina-2-PL12 - 66886 Da (MW detectado = 66886 Da) Albúmina-PL13
• Albúmina no conjugada - 5 %
MW esperado de albúmina no conjugada - 66440 (MW detectado = 66441 Da)
• Albúmina-PL13 - 94 %
MW esperado de albúmina-PL13 - 66631 Da (MW detectado = 66632Da)
• Albúmina conjugada con dos PL13 - 1%
MW esperado de albúmina-2-PL13 - 66822 Da (MW detectado = D66822a)
En particular, con referencia a la Figura 45, los picos (4501), (4504) y (4507) corresponden a albúmina oxidada y que no ha reaccionado, los picos (4502), (4505) y (4508) corresponden a producto conjugado de albúmina sencillo y los picos (4503), (4506) y (4509) corresponden a producto conjugado de albúmina doble.
17. Demostración de la estabilidad de los productos conjugados de albúmina-conector en glutatión (Ejemplo de referencia)
La estabilidad de los productos conjugados de albúmina-molécula conectora se determinó en presencia de exceso de glutatión y se analizó mediante ESI-MS durante un período de 7 días.
Método:
Las muestras del producto conjugado de albúmina-PL-12 (0,5 mg/ml) se incubaron con glutatión reducido (1 mM) en PBS (pH 7,4) a 37°C durante 7 días. Las muestras se analizaron en ESI-MS.
Resultados:
La Figura 46 muestra los resultados obtenidos para el producto conjugado de albúmina-PL-12 como ejemplo representativo. Se observó una tendencia similar para los productos conjugados de albúmina-PL-11 y albúmina-PL-13.
La Figura 46 muestra los resultados de ESI-MS los días 0, 1,4 y 7. En la Figura 46, los picos (4601), (4603), (4605) y (4608) corresponden a albúmina, los picos (4602), (4604), (4606) y (4609) corresponden al producto conjugado de albúmina-PL12 y los picos (4607) y (4610) corresponden a GSH-albúmina. En consecuencia, se demuestra que: • La principal especie presente es el producto conjugado de albúmina-PL12 (MW = -66664 Da)
• Tras la incubación con glutatión 1 mM, se produce un aumento muy lento de la señal de albúmina-GSH (~8 %, MW = 66752 Da) a partir de los 4 días de incubación con glutatión y alcanzando -13% el 7° día de incubación.
Puede concluirse que los productos conjugados de albúmina-conector de la presente invención demuestran una buena estabilidad en un entorno competitivo.
18. Generación de productos conjugados de albúmina-doxorrubicina utilizando conectores según la presente invención (Ejemplo de referencia)
Método:
Se conjugaron albúmina, tioalbúmina (mutante de cisteína sencillo) y tioalbúmina (mutante de cisteína doble) con un exceso de 14, 20 y 30 veces del conector PL13-NH-PEG4-val-cit-4-aminobenzoil-doxorrubicina (Figura 47), respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo en fosfato de sodio 147 mM de pH 7,5, en presencia de DMA al 10% v/v y EDTA 0,6 mM, a 37°C durante 2 días en la oscuridad. Transcurrido este tiempo, las reacciones se desalinizaron en columnas PD-10 equilibradas en tampón PBS de pH 7,4.
La eficacia de la conjugación se determinó mediante espectroscopia UV-Vis utilizando la absorbancia de doxorrubicina y el coeficiente de extinción a 495 nm (£=8030 M-1, cm-1) y el de la albúmina a 280 (£=34445 M-1, cm-1), con corrección por absorbancia de doxorrubicina a 280 nm según la ecuación:
„Concent .ra .ció .n . ó .e . alb .úm . ina = < --¿-¡-ji-Z--t¡-t-í-n-]-is---(-U--.:-?-;-!-+-j-íA ■—l>s.;í.1...H..T.im —)J
EítfO nm
El grado de agregación del producto conjugado de albúmina-doxorrubicina se determinó mediante análisis en cromatografía SDS-PAGE y SEC no reductora.
Se cargaron 10 gl de cada producto conjugado de albúmina-doxorrubicina en tampón de carga SDS-PAGE en gel Bis-Tris al 4-12% NuPAGE y se hizo migrar durante 45 minutos a 200 V. Las propiedades de fluorescencia nativas de la doxorrubicina se utilizaron para visualizar los productos conjugados de albúmina-doxorrubicina antes de la tinción de un gel con colorante de Coomassie para especies proteicas.
Se cargaron 5 gl de cada producto conjugado en una columna de HPLC SEC equilibrada con tampón de fosfato de sodio 150 mM a pH 7,0 y se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min con detección a 280 nm.
Resultados:
La conjugación de doxorrubicina con albúmina de tipo salvaje y mutantes de albúmina dio como resultado rendimientos del 55% para albúmina, 32% para mutante sencillo de tioalbúmina y 14% para doble mutante de tioalbúmina (véase la Figura 48).
El análisis SDS-PAGE reveló la presencia de una pequeña cantidad de especies de alto peso molecular (HMWS) en todas las muestras de albúmina-doxorrubicina (véase la Figura 49). Estos datos son compatibles con los observados mediante el análisis SEC (véase la Figura 50). Además, el análisis SDS-PAGE confirmó la conjugación de doxorrubicina con albúmina observada mediante espectroscopia UV-Vis (véase la Figura 49, fluorescencia DOX)
Los productos conjugados de albúmina-doxorrubicina y tioalbúmina-doxorrubicina se analizaron junto con los controles de albúmina no conjugada y tioalbúmina no conjugada mediante cromatografía SEC. El análisis de los productos conjugados de doxorrubicina mostró que el contenido de monómero era de aproximadamente 97,6% para albúmina-DOX, 86,8% para albúmina-DOX (mutante sencillo) y 88,2% para albúmina-DOX (doble mutante), (véase la Figura 50 B, D y F). Los controles de albúmina y tioalbúmina no conjugadas (véanse las Figuras 50 A, C y E) mostraron un contenido similar de monómeros y especies de alto peso molecular que las especies conjugadas con doxorrubicina. En particular, la Figura 50 muestra picos a (5001), (5003), (5005), (5007), (5009) y (5011) correspondientes a la presencia del HMWS y picos a (5002), (5004), (5006), (5008), (5010) y (5012) correspondientes al contenido de monómero.
Ambos mutantes de tioalbúmina muestran una mayor tendencia a agregarse que la albúmina de tipo salvaje: 13,2-14,5% para la tioalbúmina (mutante sencillo) y 11,8-16,6% para la tioalbúmina (doble mutante), en comparación con 2,4-2,6% para la albúmina nativa. El análisis de estas muestras confirmó que la conjugación de doxorrubicina a través de PL13-PEG4-val-cit-4-aminobenzoilo se tolera bien y no produce agregación adicional (véase la Figura 50 A, C y F).
Por consiguiente, se ha demostrado que los productos conjugados de proteína y fármaco de la presente invención proporcionan alternativas adecuadas a los productos conjugados de proteína y fármaco conocidos. Por otra parte, el conector incorporado en los productos conjugados de proteína y fármaco de la presente invención permite la administración segura y eficaz del fármaco uniendo con éxito el fármaco a la proteína y reteniendo el fármaco hasta que se alcanza el tejido diana.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un producto conjugado de proteína y fármaco formado por la reacción de una proteína globular, un conector y un fármaco, en donde la proteína globular es un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende al menos un grupo tiol reactivo y en donde el conector comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que comprende un sustituyente vinilo representado por las siguientes fórmulas,
Figure imgf000025_0001
en donde:
R1 se selecciona entre;
■ (CH2)n-C(O)-R, o
■ (CH2)m-S-(CH2)n-C(O)-R, o
■ (CH2)n-CH(CO2 R)2 , o,
■ (CH2)m-S-(CH2)2CH(CO2R)2 , o,
en donde,
- R2 se selecciona del mismo grupo de moléculas que R1, hidrógeno o un grupo alquilo,
- n es cualquier número entero de 0 a 10,
- m es cualquier número entero entre 0 y 10,
- R es un grupo hidróxido (OH), amina o poli-(alquilenglicol),
o en donde R1 es -CH2-CH(C(O)-NH-PEG)2 y R2 es un grupo metilo;
en donde la proteína globular se conjuga con el conector mediante la conjugación del grupo tiol con el sustituyente vinilo; y
en donde el fármaco se conjuga con el conector a través del grupo R1 , o cuando R2 se selecciona del mismo grupo de moléculas que R1, el fármaco se conjuga con el conector a través del grupo R2 , o a través del grupo R1 y el grupo R2 .
2. El producto conjugado de proteína y fármaco según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. El producto conjugado de proteína y fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fármaco es una citotoxina o un péptido o polipéptido terapéuticos.
4. El producto conjugado de proteína y fármaco según la reivindicación 3, en donde la citotoxina es una sustancia citotóxica biológicamente activa.
5. El producto conjugado de proteína y fármaco según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la citotoxina es un fármaco anticanceroso.
6. El producto conjugado de proteína y fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el conector comprende un grupo poli-(alquilenglicol), preferiblemente en donde el grupo poli-(alquilenglicol) es un polietilenglicol (PEG).
7. El producto conjugado de proteína y fármaco según la reivindicación 6, en donde la estructura de poli-(alquilenglicol) se proporciona con uno o más grupos funcionales reactivos que incluyen grupos hidroxi, amina, ácido carboxílico, haluro de alquilo, azida, succinimidilo o tiol.
8. El producto conjugado de proteína y fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un conector extensor, preferiblemente en donde dicho conector extensor es escindible por enzimas.
9. Un método para producir el producto conjugado de proteína y fármaco de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende poner en contacto la proteína con el conector que está unido al fármaco.
10. Un método para producir el producto conjugado de proteína y fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende poner en contacto la proteína con el conector y, posteriormente, poner en contacto el conector con el fármaco.
11. El método según las reivindicaciones 9 o 10, que incluye una etapa inicial de hacer reaccionar un conector precursor que comprende un anillo aromático heterocíclico que contiene nitrógeno que tiene un sustituyente vinilo con una molécula de poli-(alquilenglicol) para producir el conector.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende adicionalmente una etapa inicial de modificación de la proteína para producir un polipéptido variante que tiene un grupo tiol en una o más posiciones deseadas del polipéptido.
13. El producto conjugado de fármaco y proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.
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