MX2007011652A - Metodos y composiciones para modular c-met hiperestabilizado. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones para modular la trayectoria de senalizacion de HGF/c-met, en particular al inhibir una proteina de c-met hiperestabilizada.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR C-MET HIPERESTABILIZADO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una solicitud no provisional presentada bajo 37 CFR 1.53 (b) (1), que reivindica la prioridad bajo 35 USC 119 (e) para la solicitud provisional número 60/665,482 presentada el 25 de Marzo de 2005, los contenidos de la cual se incorporan en la presente mediante la referencia. CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y regulación del factor de crecimiento. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la trayectoria de señalización de HGF/c-met, y usos de dichos moduladores . ANTECEDENTES HGF es un factor pleiotrófico derivado del mesénquima con actividades morfogénicas, motogénicas y mitogénicas sobre una cantidad de diferentes tipos celulares.

Los efectos de HGF se median a través de una tirosina cinasa específica, c-met, y HGF aberrante y la expresión de c-met se observa frecuentemente en una variedad de tumores. Ver, por ejemplo, Maulik et al . , Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin.

Invest. (2002), 109 (7 ): 863-867. La regulación de la trayectoria de señalización de HGF/c-Met se encuentra implicada en la progresión de tumores y metástasis. Ver, por ejemplo, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300) . HGF se une al dominio extracelular de la tirosina cinasa receptora (RTK) de Met y regula diversos procesos biológicos tales como dispersión, proliferación y supervivencia celular. La señalización de HGF-Met es esencial para el desarrollo embriónico normal especialmente en la migración de células progenitoras musculares y el desarrollo del hígado y sistema nervioso (Bladt et al . , Nature (1995), 376, 768-771.; Hamanoue et al . , Faseb J (2000), 14, 399-406; Maina et al . , Cell (1996), 81, 531-542; Schmidt et al . , Nature (1995), 373, 699-702; Uehara et al . , Nature (1995), 373, 702-705). Los fenotipos en desarrollo de Met y HGF de ratones con genes desactivados son muy similares sugiriendo que HGF es el ligando cognado para el receptor Met (Schmidt et al . , 1995, supra; Uehara et al . , 1995, supra). HGF-Met también juega un papel en la regeneración del hígado, angiogénesis, y cicatrización de heridas (Bussolino et al . , J Cell Biol (1992), 119, 629-641; Matsumoto and Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249; Nusrat et al . , J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065). El receptor Met precursor experimenta desdoblamiento proteolítico en una subunidad a extracelular y subunidad ß de expansión de membrana enlazada por enlaces de disulfuro (Tempest et al . , Br J Cáncer (1988), 58, 3-7). La subunidad ß contiene el dominio de cinasa citoplásmica y aloja un sitio de acoplamiento de múltiples substratos en la C-terminal en donde las proteínas adaptadoras enlazan e inician la señalización (Bardelli et al . , Oncogene (1997), 15, 3103-3111; Nguyen et al . , J Biol Chera (1997), 272, 20811-20819; Pelicci et al . , Oncogene (1995), 10, 1631-1638; Ponzetto et al . , Cell (1994), 77, 261-271; Weidner et al . , Nature (1996), 384 , 173-176). En la unión de HGF, la activación de Met conduce a fosforilación de tirosina y la señalización corriente abajo a través de P13-cinasa mediada por Gabl y Grb2/Sos y las activación de Ras/MAPK respectivamente, que activa la proliferación y motilidad celular (Furge et al . , Oncogene (2000), 19, 5582-5589; Hartmann et al . , J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939; Ponzetto et al . , J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123; Royal and Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787). Se demostró que Met se transforma en una línea celular de osteosarcoma tratada con carcinógeno (Cooper et al . , Nature (1984), 311 , 29-33; Park et al . , Cell (1986), 45, 895-904). La sobreexpresión de Met o amplificación del gen se ha observado en una variedad de cánceres de humano. Por ejemplo, la proteína Met se sobreexpresa al menos 5 veces en cánceres colorectales y se reporta que se amplifica genéticamente en metástasis de hígado (Di Renzo et al . , Clin Cáncer Res (1995), 1 , 147-154; Liu et al . , Oncogene (1992), 7, 181-185) . También se reporta que la proteína Met se sobreexpresa en carcinoma celular escamoso oral, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula renal, carcinoma de mama y carcinoma de pulmón (Jin et al., Cáncer (1997), 19, 749-760; Morello et al., J Cell Physiol (2001), 189, 285-290; Natali et al., Int J Cáncer (1996), 69, 212-217; Olivero et al., Br J Cáncer (1996), 74, 1862-1868; Suzuki et al., Br J Cáncer (1996), 74, 1862-1868). Además, la sobreexpresión de ARNm se ha observado en carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico, y carcinoma colorectal (Boix et al., Hepatology (1994), 19, 88-91; Kuniyasu et al., Int J Cáncer (1993), 55, 72-75; Liu et al., Oncogene (1992), 7, 181-185). Se ha encontrado una cantidad de mutaciones en el dominio cinasa de Met en carcinoma papilar renal que conduce a la activación constitutiva del receptor (Olivero et al., Int J Cáncer (1999), 82, 640-643; Schmidt et al., Nat Genet (1997), 16, 68-73; Schmidt et al., Oncogene (1999), 18, 2343-2350). Estas mutaciones de activación confieren fosforilación de tirosina Met constitutiva y dan como resultado la activación de MAPK, formación de foco, y tumorigénesis (Jeffers et al., Proc Nati Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450). Además, estas mutaciones aumentan la invasión y motilidad celular (Giordano et al., Faseb J (2000), 14, 399-406; Lorenzato et al., Cáncer Res (2002), 62, 7025-7030). La activación Met dependiente de HGF en células transformadas media la motilidad, dispersión, y migración incrementads, lo que eventualmente conduce a crecimiento del tumor invasivo y metástasis (Jeffers et al . , Mol Cell Biol (1996), 1 6, 1115-1125; Meiners et al . , Oncogene (1998), 1 6, 9-20) . Se ha demostrado que Met interactúa con otras proteínas que conducen la activación, transformación e invasión del receptor. En células neoplásticas, se reporta que Met interactúa con integrina a6ß4, un receptor para componentes de matriz extracelular (ECM) tales como lamininas, para promover el crecimiento invasivo dependiente de HGF (Trusolino et al . , Cell (2001), 107, 643-654). Además, Se ha demostrado que el dominio extracelular de Met interactúa con un miembro de la familia de semaforina, plexina Bl, y aumenta el crecimiento invasivo (Giordano et al . , Nat Cell Biol (2002), 4 , 720-724). Además, CD44v6, que se ha implicado en tumorigénesis y metástasis, también se reporta que forma un complejo con Met y HGF y da como resultado la activación del receptor Met (Orian-Rousseau et al . , Genes Dev (2002), 1 6, 3074-3086). Met es un miembro de la subfamilia de tirosinas cinasas receptoras (RTKs) que incluyen Ron y Sea (Maulik et al . , Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59). La predicción de la estructura del dominio extracelular de Met sugiere homología compartida con las semaforinas y plexinas.

La N-terminal de Met contiene un dominio Sema de aproximadamente 500 aminoácidos que se conserva en todas las semaforinas y plexinas. Las semaforinas y plexinas pertenecen a una gran familia de proteínas unidas a la membrana y secretadas descritas primero por su papel en el desarrollo neural (Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999), 19, R201-204). Sin embargo, más recientemente, la sobreexpresión de semaforina se ha correlacionado con la invasión de tumor y metástasis. Un dominio PSI rico en cisteína (también referido como un dominio de Secuencia Relacionada con Met) encontrado en plexinas, semaforinas, e integrinas se encuentra adyacente al dominio Sema seguido por cuatro repeticiones IPT que son regiones similares a inmunoglobulina encontradas en plexinas y factores de transcripción. Un estudio reciente sugiere que el dominio Sema de Met es suficiente para unión de HGF y heparina (Gherardi et al . , Proc Nati Acad Sci U S A (2003), 100(21): 12039-44). Como se observa arriba, la tirosina cinasa receptora Met se activa por su ligando cognado HGF y la fosforilación del receptor activa trayectorias corriente abajo de MAPK, PI-3 cinasa y PLC-? ( 1 , 2) . La fosforilación de Y1234/Y1235 dentro del dominio cinasa es crítica para la activación de cinasa Met mientras Y1349 y Y1356 en el sitio de acoplamiento de múltiples substratos son importantes para la unión de homología src-2 (SH2), unión de fosfotirosina (PTB), y proteínas ( 3-5) de dominio de unión Met (MBD) , para mediar la activación de las trayectorias de señalización corriente abajo. Un sitio de fosforilación de yuxtamembrana adicional, Y1003, se ha caracterizado bien por su unión al dominio de unión de tirosina cinasa (TKB) de la Cbl E3-ligasa ( 6 , 7) . Se reporta que la unión de Cbl conduce la endocitosis del receptor mediada por endofilina, la ubiquitinación, y la subsiguiente degradación del receptor ( 8) . Este mecanismo de subregulación del receptor se ha descrito previamente en la familia EGFR que también aloja un sitio de unión Cbl similar ( 9-11 ) . Se ha reportado la desregulación de Met y HGF en una variedad de tumores. La activación de Met conducida por ligando se ha observado en varios cánceres. Se observa suero elevado y HGF intra-tumoral en pulmón, cáncer de mama, y mieloma múltiple ( 12-15) . La sobreexpresión de Met y/o HGF, amplificación de Met o mutación, se ha reportado en varios cánceres tales como cáncer colorectal, de pulmón, gástrico, y de riñon y se cree que conduce la activación del receptor independiente del ligando (2, 16) . Adicionalmente, la sobreexpresión inducible de Met en un hígado del modelo de ratón da origen a carcinoma hepatocelular que demuestra que la sobreexpresión del receptor conduce la tumorigénesis independiente del ligando (27). La evidencia más convincente que implica Met en cáncer, se reporta en pacientes con carcinoma papilar renal esporádico (RPC) y familiar. Las mutaciones en el dominio cinasa de Met que conducen a activación constitutiva del receptor se identifican como línea germinal y mutaciones somáticas en RPC ( 18) . La introducción de estas mutaciones en modelos de ratón transgénicos conduce a tumorigénesis y metástasis. ( 19) . Aunque el papel del dominio cinasa de Met se ha investigado en detalle, y se ha hecho la teoría que los niveles de expresión incrementados de HGF/c-met probablemente son la base del desarrollo de algunos cánceres, ha faltado evidencia directa de un papel biológico para dominios no cinasa de c-met. Sin embargo, a pesar de implicarse en la etiología de una variedad de condiciones oncológicas, la trayectoria de HGF/-c-met ha sido una trayectoria difícil de tener como objetivo terapéuticamente. Se han impedido los esfuerzos en este aspecto en gran parte por una falta de entendimiento, considerando los mecanismos de acción mediante los cuales la desregulación de HGF/c-met causa tumorigénesis. Por lo tanto, es claro que es grande la necesidad de un mayor entendimiento de mecanismos de acción oncogénicos relacionados con c-met. La invención proporcionada en la presente satisface esta necesidad y proporciona otros beneficios . Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan mediante la referencia en su totalidad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa al menos en parte en el nuevo descubrimiento que ciertos tumores humanos expresan una proteína de c-met mutada que exhibe tasas disminuidas de subregulación intracelularmente, y aún son capaces de señalización celular. Se encuentra que estas proteínas de c-met "hiperestabilizadas" tienen actividad oncogénica incrementada en comparación con c-met tipo silvestre. Como se muestra en la presente, estos tumores pueden inhibirse por inhibidores anti-c-met. La inhibición de la actividad de c-met hiperestabilizado proporciona numerosas ventajas terapéuticas. Por ejemplo, ya que estos mutantes de c-met son particularmente oncogénicos, se esperaría que su inhibición objetivo disminuya la tumorigénesis conducida por estos mutantes. Además, ya que c-met se encuentra en muchos tipos de células, que incluyen células normales, la capacidad para de manera específica tener como objetivo mutantes de c-met específicos de tumor sería particularmente benéfica, por ejemplo para reducir los efectos secundarios de la terapia de inhibición del c-met. La invención proporciona métodos y composiciones en base a los descubrimientos descritos en la presente, y son útiles para tener como objetivo y/o tratar tumores que tienen c-met hiperestabilizado. En un aspecto, la invención proporciona una sustancia capaz de unirse específicamente al c-met hiperestabilizado . En una modalidad, la sustancia comprende una actividad inhibidora contra la actividad biológica asociada con el c-met hiperestabilizado . En otra modalidad, la sustancia es capaz de unión específica al c-met hiperestabilizado. En una modalidad, la sustancia se une al c-met hiperestabilizado e inhibe la actividad del c-met. En una modalidad, la sustancia se une al c-met hiperestabilizado sin inhibir substancialmente la actividad del c-met. Estas substancias encuentran una variedad de usos, por ejemplo como moléculas para tener como objetivo agentes terapéuticos para una célula que expresa c-met hiperestabilizado. Los agentes terapéuticos incluyen cualquiera de los agentes descritos en la presente, por epemplo, toxinas. Las substancias pueden estar en cualquier forma adecuada, incluyendo en la forma de conjugaciones de anticuerpo-fármaco y polipéptidos de fusión. En un aspecto, la invención proporciona antagonistas de c-met que interrumpen la señalización de HGF/c-met asociada con una proteína de c-met hiperestabilizado . En una modalidad, la invención proporciona un antagonista que inhibe la actividad de señalización de c-met de un polipéptido de c-met hiperestabilizado de humano, en donde el polipéptido de c-met hiperestabilizado comprende una eliminación de al menos una porción de exón 14 de manera que su tasa de degradación en una célula se disminuye en comparación con c-met tipo silvestre, y en donde el polipéptido de c-met hiperestabilizado tiene actividad de señalización del c-met. Un antagonista de la invención puede ser de cualquier forma capaz de inhibir específicamente la actividad de una molécula de c-met hiperestabilizado como se describe en la presente. En una modalidad, un antagonista de la invención comprende un anticuerpo. En una modalidad, un anticuerpo de la invención específicamente se une a un epítope formado por el empalme en estructura del exón 13 y el exón 15 de c-met. En una modalidad, al menos una porción del exón 14 se elimina como un resultado de dicha unión en estructura. En otro aspecto, un antagonista de la invención comprende un aptámero. En una modalidad, un aptámero de la invención específicamente se une a un epítope formado por unión en estructura del exón 13 y el exón 15 de c-met. En una modalidad, al menos una porción del exón 14 se elimina como un resultado de dicha unión en estructura. En un aspecto, un antagonista de la invención comprende un ARN inhibidor que inhibe preferentemente/selectivamente la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de empalme de c-met en donde el exón 13 se empalma al exón 15. En una modalidad, el ácido nucleico codifica un c-met hiperestabilizado en el cual al menos una porción del exón 14 se elimina como un resultado de la unión de la variante. En un aspecto, la invención proporciona un antagonista que comprende un oligonucleótido antisentido que inhibe preferentemente/selectivamente una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de empalme de c-met en donde el exón 13 se empalma al exón 15. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica un c-met hiperestabilizado en el cual al menos una porción del exón 14 se elimina como un resultado de la unión de la variante. La inhibición de la actividad de c-met puede efectuarse en cualquiera de un número de maneras conocidas en la materia, siempre que la actividad biológica de c-met hiperestabilizado se disminuya en una célula. Por ejemplo, en una modalidad, la inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención comprende el aumento de la degradación celular de la proteína de c-met hiperestabilizado. En otra modalidad, la inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención comprende la inhibición de fosforilación de la proteína de c-met hiperestabilizado. En todavía otra modalidad, la inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención comprende la inhibición de fosforilación de un miembro de la trayectoria de señalización de HGF/c-met por el c-met hiperestabilizado. La inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención también puede efectuarse por reducción de niveles de polipéptido de c-met hiperestabilizado en una célula. De esta manera, por ejemplo, en una modalidad, la inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención comprende la inhibición de la expresión de la proteína de c-met hiperestabilizado, por ejemplo transcripción y/o traducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido de c-met hiperestabilizado. En otra modalidad, la inhibición de la actividad de c-met por un antagonista de la invención comprende la muerte celular asociada con una citotoxina enlazada a una molécula (por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco) que específicamente se une a un c-met hiperestabilizado en una célula. En una modalidad, un antagonista de la invención es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, anticuerpo multi-específico o anticuerpo de cadena única. Los antagonistas empleados en los métodos de la invención pueden opcionalmente conjugarse con un agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, que incluye, por ejemplo, un maitansinoide o caliqueamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica, o lo similar. En algunas modalidades de los métodos de la invención, un agente quimioterapéutico también se administra al sujeto. En general, los antagonistas de c-met efectivos incluyen inhibidores de c-met que interfieren con la unión de un ligando tal como HGF al c-met hiperestabilizado. Por ejemplo, un inhibidor de c-met puede unirse al c-met hiperestabilizado de manera que se inhibe la unión de HGF al c-met. En una modalidad, un anticuerpo antagonista es un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión de antígeno de un donador no humano injertado a una secuencia humanizada, humana o no humana heteróloga (por ejemplo, secuencias de dominio constante y/o estructura) . En una modalidad, el donador no humano es un ratón. En una modalidad, una secuencia de unión a antígeno es sintética, por ejemplo obtenida por mutagénesis (por ejemplo, selección de despliegue de fago, etc.). En una modalidad, un anticuerpo quimérico de la invención tiene regiones V de murino y región C de humano. En una modalidad, la región V de cadena ligera de murino se fusiona a una cadena ligera kappa de humano. En una modalidad, la región V de cadena pesada de murino se fusiona a una región C de IgGl de humano. En una modalidad, las secuencias de unión de antígeno comprenden al menos uno, al menos dos o todos los tres CDRs de una cadena ligera y/o pesada. En una modalidad, las secuencias de unión de antígeno comprenden una CDR3 de cadena pesada. En una modalidad, las secuencias de unión de antígeno comprenden parte o toda la CDR y/o secuencias de dominio variable del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En una modalidad, las secuencias de unión de antígeno comprenden al menos CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 1A3.3.13 o 5D5.11.6. Anticuerpos humanizados de la invención incluyen aquellos que tienen substituciones de aminoácido en la FR y variantes de maduración de afinidad con cambios en los CDRs injertados. Los aminoácidos substituidos en la CDR o FR no se limitan a aquellos presentes en el donador o anticuerpo receptor. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden además cambios en residuos de aminoácido en la región Fc que conducen a función de efecto mejorada que incluye función de CDC y/o ADCC mejorada y muerte de la célula B. Otros anticuerpos de la invención incluyen aquellos que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Los anticuerpos de la invención también incluyen variantes deficientes de fucosa que tienen función de ADCC mejorada in vivo . En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión a antígeno que comprende una cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste de SYWLH (SEQ ID NO:l), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO : 2 ) y YGSYVSPLDY (SEQ ID NO : 3 ) . En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-Hl de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos SYWLH. En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-H2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos MIDPSNSDTRFNPNFKD. En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-H3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos YGSYVSPLDY. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión a antígeno que comprende una cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres de las secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID NO:5) y QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 6). En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-Ll de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos KSSQSLLYTSSQKNYLA. En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-L2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos WASTRES. En una modalidad, el brazo de unión a antígeno comprende CDR-L3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos QQYYAYPWT. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión a antígeno que comprende una cadena pesada que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres de las secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de SYWLH (SEQ ID NO:l), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO : 2 ) y YGSYVSPLDY (SEQ ID NO:3) y una cadena ligera que comprende al menos una, al menos dos o todas las tres de las secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID N0:5) y QQYYAYPWT (SEQ ID NO:6). La invención proporciona un anticuerpo antagonista humanizado que une c-met hiperestabilizado de humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es efectivo para inhibir la actividad de HGF/c-met hiperestabilizado de humano in vivo, el anticuerpo comprendiendo en la región Variable de cadena H (VH) al menos una secuencia CDR3 del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6) y substancialmente una secuencia consenso de humano (por ejemplo, substancialmente los residuos de estructura (FR) consenso de humano del subgrupo III de cadena pesada de humano (VHIII)). En una modalidad, el anticuerpo comprende además la secuencia CDRl de cadena H y/o secuencia CDR2 del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En otra modalidad, el anticuerpo precedente comprende la secuencia CDRl de cadena L, secuencia CDR2 y/o secuencia CDR3 del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibpdoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibpdoma 5D5.11.6) con substancialmente los residuos de estructura (FR) consenso de humano del subgrupo I de cadena ligera de humano (V?l) . En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia : QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFN PNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:7) En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia : DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:8) Todavía en otros casos, puede ser ventajoso tener un antagonista de c-met que no interfiere con la unión de un ligando (tal como HGF) al c-met. De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades, un antagonista de la invención no une un sitio de unión a ligando (tal como HGF) en c-met. En otra modalidad, un antagonista de la invención no inhibe substancialmente la unión de ligando (por ejemplo, HGF) al c-met. En una modalidad, un antagonista de la invención no compite substancialmente con un ligando (por ejemplo, HGF) para la unión al c-met. En un ejemplo, un antagonista de la invención puede utilizarse junto con uno o más antagonistas, en donde los antagonistas son los objetivos en diferentes procesos y/o funciones dentro del eje HGF/c-met. De esta manera, en una modalidad, un antagonista de c-met de la invención se une a un epítope en c-met distinto de un epítope al cual se une otro antagonista del c-met, tal como el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En otra modalidad, un antagonista de c-met de la invención es distinto de (es decir, no es) un fragmento Fab del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) O HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En una modalidad, un antagonista de c-met de la invención no comprende una secuencia de unión de c-met de un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En una modalidad, un antagonista de la invención inhibe la actividad de c-met pero no se une a un dominio de yuxtamembrana tipo silvestre de c-met. En una modalidad de un antagonista de c-met de la invención, la unión del antagonista al c-met inhibe la activación de c-met por HGF. En una modalidad de un antagonista de c-met de la invención, la unión del antagonista al c-met en una célula inhibe la proliferación, difusión, morfogénesis y/o motilidad de la célula. En una modalidad, un antagonista de c-met de la invención se une al c-met hiperestabilizado en una célula, resultando en la muerte celular. Por ejemplo, en una modalidad, el antagonista se enlaza a una toxina como se describe en la presente . En algunas modalidades, un antagonista de c-met de la invención es o comprende un péptido (por ejemplo, un oligopeptido) , anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero, oligonucleótido (por ejemplo, oligonucleótido antisentido) , ARN inhibidor o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, un antagonista de c-met de la invención se obtiene por un método de identificación o selección de la invención como se describe en la presente. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para seleccionar o identificar un antagonista del c-met. En un ejemplo, dichos métodos comprenden contactar una sustancia candidata con una molécula objetivo que comprende al menos una porción de c-met hiperestabilizado, mediante lo cual una sustancia que une específicamente dicha molécula objetivo se selecciona (como un antagonista del c-met). En una modalidad, los métodos comprenden además determinar que una sustancia candidata seleccionada específicamente se une a una región mutada de c-met hiperestabilizado. Por ejemplo, si la molécula objetivo comprende un polipéptido, una sustancia candidata seleccionada debe unirse específicamente a un epítope que comprende una posición mutada (o región) de c-met hiperestabilizado. En otro ejemplo, si la molécula objetivo comprende un ácido nucleico que codifica al menos una porción de c-met hiperestabilizado, una sustancia candidata seleccionada debe inhibir específicamente la expresión de la proteína de c-met hiperestabilizado de un ácido nucleico que codifica c-met hiperestabilizado. En algunas modalidades, los métodos de selección de la invención comprenden además contactar una sustancia seleccionada con una célula que expresa c-met hiperestabilizado, en donde la inhibición de la actividad de c-met en la célula se valora (por ejemplo, en donde la extensión de señalización de c-met corriente abajo (por ejemplo, fosforilación MAPK) se detecta o cuantifica). La inhibición de la actividad de señalización de c-met puede ensayarse en una variedad de maneras conocidas en la materia, y en base a cualquiera de una variedad de criterios conocidos en la materia, algunos de los cuales se describen en mayor detalle en la presente. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de señalización de c-met puede indicarse por una disminución en cantidad de activación del c-met, lo cual puede a su vez indicarse por, por ejemplo, la cantidad de señalización de célula asociada al c-met dentro de una célula. La señalización de célula puede valorarse por una variedad de métodos y basarse en una variedad de criterios, que se conocen en la materia, algunos de los cuales se describen en la presente. Por ejemplo, la ocurrencia de señalización de célula en la trayectoria de HGF/c-met puede manifestarse biológicamente en la forma de cambio en fosforilación de moléculas objetivo en la trayectoria de señalización. De esta manera, por ejemplo, la cantidad de fosforilación de proteína asociada con uno o más objetivos de fosforilación conocidos en la trayectoria de HGF/c-met podría medirse. Ejemplos de tales objetivos de fosforilación incluyen c-met por sí mismo y cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) . En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden uno o más antagonistas de la invención y un vehículo. En una modalidad, el vehículo es farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un antagonista de c-met de la invención. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica un antagonista de c-met que es o comprende un polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido) . En una modalidad, un ácido nucleico de la invención codifica un antagonista de c-met que es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención es un aptámero. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención es un oligonucleótido antisentido. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención es un ARN inhibidor (por ejemplo, ARN de interferencia pequeño). En un aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico o un vector de la invención. Un vector puede ser de cualquier tipo, por ejemplo un vector recombinante tal como un vector de expresión. Cualquiera de una variedad de células huésped puede utilizarse. En una modalidad, una célula huésped es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli . En una modalidad, una célula huésped es una célula eucariótica, por ejemplo una célula mamífera tal como célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para hacer un antagonista de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un método para hacer un antagonista de c-met que es o comprende un anticuerpo (o fragmento del mismo) , dicho método comprendiendo expresar en una célula huésped adecuada un vector recombinante de la invención que codifica dicho anticuerpo (o fragmento del mismo) , y recuperar dicho anticuerpo. En otro ejemplo, la invención proporciona un método para hacer un antagonista de c-met que es o comprende un polipéptido (tal como un oligopéptido), dicho método comprendiendo expresar en una célula huésped adecuada un vector recombinante de la invención que codifica dicho polipéptido (tal como un oligopéptido) , y recuperar dicho polipéptido (tal como un oligopéptido) . En un aspecto, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende uno o más antagonistas de c-met de la invención. En una modalidad, la composición comprende un ácido nucleico de la invención. En una modalidad, una composición que comprende antagonista comprende además un vehículo, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un artículo de fabricación de la invención comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el antagonista) a un sujeto. En un aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un primer recipiente que comprende una composición que comprende uno o más antagonistas de c-met de la invención; y un segundo recipiente que comprende un regulador. En una modalidad, el regulador es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una composición que comprende antagonista comprende además un vehículo, que en algunas modalidades es farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, un equipo comprende además instrucciones para administrar la composición (por ejemplo, el antagonista) a un sujeto. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un antagonista de c-met de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis. El antagonista de c-met puede ser de cualquier forma descrita en la presente, que incluye anticuerpo, fragmento de anticuerpo, polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido) , ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido, tal como un oligonucleótido antisentido, ARN inhibidor), un aptámero, o combinación de los mismos. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de fabricación de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un equipo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un desorden proliferativo celular, un desorden inmune (tal como autoinmune) y/o un desorden relacionado con angiogénesis. La invención proporciona métodos y composiciones útiles para modular estados de enfermedad asociados con la desregulación del eje de señalización de HGF/c-met asociada con sub-regulación de c-met retrasada. La trayectoria de señalización de HGF/c-met se incluye en múltiples funciones fisiológicas y biológicas, que incluyen, por ejemplo, proliferación celular y angiogénesis. De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un método que comprende administrar a un sujeto un antagonista que tiene como objetivo c-met hiperestabilizado, mediante el cual la señalización de HGF/c-met se modula. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un tumor en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar un antagonista de la invención a un sujeto, mediante el cual se trata el tumor. En una modalidad, se determina que el tumor comprende c-met hiperestabilizado. En una modalidad, se determina que el tumor comprende c-met mutante que comprende eliminación de al menos una porción del exón 14. En una modalidad de los métodos de la invención, un inhibidor de c-met de la invención se administra junto con un agente que induce y/o mejora la degradación de proteína receptora . En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la proliferación celular activada por c-met, dicho método comprendiendo contactar una célula o tejido con una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, mediante el cual se inhibe la proliferación celular asociada con activación del c-met. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición patológica asociada con la desregulación de activación de c-met en un sujeto, dicho método comprendiendo administrar al sujeto una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, mediante el cual dicha condición se trata. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprendiendo contactar dicha célula con un antagonista de c-met de la invención causando así una inhibición del crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula se contacta por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa c-met o factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprendiendo administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, tratando así de manera efectiva a dicho mamífero. En una modalidad, la célula se contacta por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir un desorden proliferativo celular asociado con actividad o expresión incrementada de c-met o crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprendiendo administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, tratando así de manera efectiva o prevenir dicho desorden proliferativo celular. En una modalidad, dicho desorden proliferativo es cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de dicha célula es al menos en parte dependiente de un efecto que potencia el crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprendiendo contactar dicha célula con una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, inhibiendo así el crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula se contacta por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es al menos en parte dependiente de un efecto que potencia el crecimiento de c-met o factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprendiendo contactar dicha célula con una cantidad efectiva de un antagonista de c-met de la invención, tratando así de manera efectiva dicho tumor. En una modalidad, la célula se contacta por HGF expresado por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino) . Los métodos de la invención pueden utilizarse para afectar cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con desregulación de la trayectoria de señalización de HGF/c-met. En una modalidad, una célula que se tiene como objetivo en un método de la invención es una célula cancerígena. Por ejemplo, una célula cancerígena puede ser una seleccionada del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de carcinoma papilar (por ejemplo, de la glándula tiroidea) , una célula de cáncer de colón, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer ovárico, una célula de cáncer cervical, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de próstata, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamosa de cabeza y cuello, una célula linfoma, una célula de melanoma y una célula de leucemia. En una modalidad, una célula que se tiene como objetivo en un método de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplástica. En una modalidad, una célula que se tiene como objetivo en un método de la invención es una célula diplástica. En todavía otra modalidad, una célula que se tiene como objetivo en un método de la invención es una célula metaestática . Métodos de la invención pueden comprender además etapas de tratamiento adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, un método comprende además una etapa en donde una célula y/o tejido objetivo (por ejemplo, una célula cancerígena) se expone a tratamiento por radiación y/o un agente quimioterapéutico. Como se describe en la presente, la activación de c-met es un proceso biológico importante, desregulación del cual conduce a numerosas condiciones patológicas. De acuerdo con lo anterior, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula que se tiene como objetivo (por ejemplo, una célula cancerígena) en una en la cual la activación de c-met se aumenta en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. En una modalidad, un método de la invención causa la muerte de una célula objetivo. Por ejemplo, el contacto con un antagonista de la invención puede resultar en una incapacidad de la célula para señalar a través de la trayectoria del c-met, lo que da como resultado la muerte celular o inhibición del crecimiento celular. En otro ejemplo, un antagonista de la invención tiene como objetivo una toxina enlazada a una célula que expresa c-met hiperestabilizado . La desregulacion de activación de c-met (and de esta manera señalización) puede resultar de un número de cambios celulares, incluyendo, por ejemplo, la sobreexpresión de HGF (ligando cognado del c-met) y/o c-met por sí mismos (debido a subregulacion/degradación retrasada, niveles de expresión incrementados, etc.). De acuerdo con lo anterior, en algunas modalidades, un método de la invención comprende tener como objetivo una célula en donde c-met o factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, se expresa de manera más abundante por dicha célula (por ejemplo, una célula cancerígena) en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. Una célula que expresa el c-met puede regularse por HGF de una variedad de fuentes, es decir, en una manera paracrina o autocrina. Por ejemplo, en una modalidad de los métodos de la invención, una célula objetivo se contacta/une por el factor de crecimiento de hepatocito expresado en/por una célula diferente (por ejemplo, a través de un efecto paracrino) . Dicha célula diferente del mismo o de un origen de tejido diferente relativo a una célula objetivo. En una modalidad, una célula objetivo se contacta/une por HGF expresado por la célula objetivo por sí misma (por ejemplo, a través de un efecto/ciclo autocrino) . La activación de c-met y/o señalización también puede ocurrir independiente del ligando. Por lo tanto, en una modalidad de los métodos de la invención, la activación de c-met en una célula objetivo ocurre independiente del ligando. En una modalidad de los métodos de la invención, los métodos comprenden además una etapa para determinar si una célula de tumor comprende c-met hiperestabilizado (por ejemplo, al detectar una mutación de polipéptido o polinucleótido, como se describe en la presente) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1 representa el exón de flanqueo 14 de mutaciones intrónicas ilustrativas de Met. Una representación esquemática del exón 14 de Met que muestra las eliminaciones y/o mutaciones puntuales del ácido nucleico correspondiente (NM_000245) (texto en gris claro) con respecto a la estructura de intrón/exón. (A) H596, línea celular de cáncer de pulmón. (B) pac. 14, espécimen del tumor de pulmón del paciente 14. (C) pac. 16, espécimen del tumor de pulmón del paciente 16. Para referencia, en el tumor H596, existe una mutación puntual de G a T en la posición marcada +1 en (A) . En tumor del Pac 14, existe una eliminación de la secuencia de posición marcada -27 a -6 en (B) . En el tumor del Pac 16, existe una eliminación de la secuencia de posición marcada 3195 a +7 en (C) . FIG.2A a 2F. Subregulación retrasada de c-met hiperestabilizado se asocia con la activación de Met y MAPK. (A) 293 células co-transfectadas construcciones Met y marcador Cbl se inmunoprecipitan (IP) con anticuerpos Cbl o V5 seguido por inmunoblotting (IB) con anticuerpos V5, marcador o P-Tyr. Los lisatos se sondean con anticuerpos Cbl o marcador. (B) 293 células se transfectan con construcciones Met seguido por IP de Cbl endógeno. El inmunoblotting con anticuerpo V5 muestra que Met WT, pero no Met?Exl4 co-IPs con Cbl endógeno. La membrana se separa y vuelve a sondear con anticuerpos fosfoespecíficos Y1003, YY1234/1235, Y1349, o Y1365. (C) Lisatos de transfección transitoria de 293 células se inmunoprecipitan con anticuerpo V5 y se someten a inmunoblotting con anticuerpo de ubiquitina para detectar Met ubiquitinado. La membrana se separa y vuelve a sondear con anticuerpo V5 para detectar la presencia de Met. Los lisatos se sondean con anticuerpos de lactina y marcadores para detectar el marcador Cbl o activa para expresión equivalente. (D) 293 células se transfectan con las construcciones indicadas y se tratan con 10 µg/ml de cicloheximida . Los lisatos se sondean con Anticuerpo V5 o actina. (E) Estirpes celulares de cáncer de pulmón privadas de suero se estimulan por 10 minutos con 50 ng/ml de rhuHGF, después se enjuagan y se regresan a medio libre de suero. Los lisatos se recolectan en los tiempos indicados y se someten a inmunoblotting por P-Met ( Y1230/Y1234/Y1235) , Met, P-MAPK, MAPK, P-Akt, o Akt. (F) Clones estables de Rata ÍA se privan de suero y se tratan por 10 minutos con un anticuerpo monoclonal de Met agonístico 3D6 (5 µg/ml), enjuagan con PBS, y se regresan a medio libre de suero. En los tiempos indicados, los lisatos se obtienen y se someten a inmunoblotting para P-MAPK, MAPK, P-Akt, o Akt. FIG.3A y 3B. Potencial proliferativo dependiente del ligando aumentado en estirpes celulares que alojan la eliminación de yuxtamembrana Met (A) Crecimiento estimulado por HGF en un panel de estirpes celulares NSCLC, se determina después de un cultivo de 72 horas en la presencia o ausencia de 50 ng/ml de rhuHGF. Los resultados se representan como un índice de estimulación (SI), como se determina de un mínimo de tres experimentos separados. (B) Curvas de crecimiento de estirpes celulares estables de Rata ÍA subcutáneamente inoculadas que expresan el vector, Met WT, Met ?Exl4, en cada caso en la presencia o ausencia de un anticuerpo agonista de (3D6) en ratón desnudo. FIG. 4A Y 4B. Inhibición de señalización Met dependiente de ligando y crecimiento en células H596 con un anti-Met mAb, OA-5D5. (A) Células H226 o H596 privadas de suero se incuban con OA-5D5 por 30 minutos en las concentraciones indicadas y entonces se estimulan con 100 ng/ml de rhuHGF por 15 minutos. Los lisatos se obtienen y se someten a inmunoblotting por P-Met ( Y1234/Y1235) , Met, P-Akt, Akt, P-MAPK, o MAPK. (B) Células se tratan con OA-5D5 o Ig de control en las concentraciones indicadas en la presencia o ausencia de 50 ng/ml de rhuHGF y la viabilidad celular se determina después de 72 horas. FIG. 5. Cuantificacion de proporciones de fosfo-cinasa a cinasa en estirpes celulares de Met estables de Rata ÍA. La proporción de P-MAPK:MAPK (izquierda) y P-Akt: Akt (derecha) se cuantifica utilizando explorador infrarrojo Odyssey que detecta anticuerpos secundarios conjugados AlexaFluor680 e IR Dye800. FIG. 6. Cuantificacion de proporciones de fosfo-cinasa a cmasa en células H596 y H226 tratadas con OA-5D5. La proporción de P-Met :Met, P-Akt: kt, o P-MAPK:MAPK para cada linea celular se cuantifica utilizando el explorador infrarrojo Odyssey que detecta los anticuerpos secundarios conjugados AlexaFluor680 e IR Dye800. FIG. 7 representa elementos de unión que actúan en cis ilustrativos para regular la unión de exon 14 de c-met humano. Se espera que una mutación en una o más posiciones dentro de estos elementos tendría un impacto negativo en unión tipo silvestre del exon 14. Se espera que una mutación en una o más posiciones dentro de estos elementos tendría un impacto negativo en unión tipo silvestre del exón 1 . FIG. 8 representa la secuencia de proteína de c-met de humano tipo silvestre en base a RefSeq. NM_000245. FIG. 9 representa secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera para el anticuerpo OA-5D5 referido en los Ejemplos. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de fabricación para identificar inhibidores de la trayectoria de señalización de HGF/c-met (en particular, inhibidores de c-met hiperestabilizado) , y métodos para utilizar tales inhibidores. Los detalles de estos métodos, composiciones, equipos y artículos de fabricación se proporcionan en la presente . Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, al menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que están dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al . , 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al . , eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al . , ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V. , 1988) . Definiciones El término "c-met hiperestabilizado", y variaciones del mismo, como se utiliza en la presente, se refiere a un c-met de humano mutante que ocurre de manera natural que se degrada/subregula a una velocidad que es detectablemente más lenta que aquella de un c-met tipo silvestre. Los métodos para comparar las velocidades de degradación/subregulación entre c-met tipo silvestre y un c-met hiperestabilizado serían evidentes para un experto en la materia, incluyendo, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos abajo. En un caso, degradación retrasada/subregulación se valora en base a la cuantificación de los niveles de proteína del receptor en una célula. En otro caso, la degradación retrasada/subregulación se determina en base a la detección de una mutación en un sitio de c-met que se asocia con Cbl uniéndose a c-met. En un caso, la mutación es un sitio de c-met que se asocia con ubiquitinación de c-met (por ejemplo, en exón 14 de c-met) y la degradación/subregulación de proteína receptora. Estas mutaciones pueden originarse en cualquier forma que da como resultado expresión de una proteína de c-met mutada que se degrada/subregula a una velocidad más lenta que c-met tipo silvestre, en donde la proteína de c-met mutada es capaz de actividad asociada con c-met tipo silvestre (por ejemplo, fosforilación de moléculas corriente abajo tales como MAPK, estimulación de la proliferación celular y/o inducción de eventos tumorigénicos). Por ejemplo, estas mutaciones incluyen aquellas que se asocian con la expresión de una variante de empalme de c-met en estructura, funcional que carece al menos de una porción del exón 14 que se asocia con la degradación/subregulación de la proteína receptora. Ejemplos ilustrativos de mutaciones incluyen aquellas encontradas en un elemento de unión como se representa en las Figuras 1 y 7. En una modalidad, la presencia de una proteína de c-met hiperestabilizado de la invención en una célula se asocia con fosforilación prolongada y/o incrementada de moléculas corriente abajo en la trayectoria de HGF/c-met en comparación con una cantidad similar de proteína de c-met tipo silvestre en una célula. El término "vector," como se utiliza en la presente, se propone referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un ciclo de ADN de doble filamento circular en el cual segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector fago. Otro tipo d? vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de réplica autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de réplica y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden integrase en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores se refieren en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinantes con frecuencia están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" puede utilizarse de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. "Polinucleótido," o "ácido nucleico," como se utiliza de manera intercambiable en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser deoxiribonucleótidos , ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o cualquier substrato que puede incorporarse en un polímero por Polimerasa de ADN o ARN, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede impartirse antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótido. Un polinucleótido puede modificarse además después de la síntesis, tal como por conjugación con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "tapas", substitución de uno o más de los nucleótidos que ocurren de manera natural con un análogo, modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces sin cargar (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen porciones colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos anomericos alfa, etc.), así como también formas no modificadas del(los) polmucleotido (s ) . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes de manera ordinaria en los azúcares puede reemplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores estándar, o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos o semi-solidos . OH terminal 5'y 3' puede fosforilarse o substituirse con aminas o porciones de grupo de cobertura orgánicas de desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse en grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de deoxiribosa o ribosa que generalmente se conocen en la materia, incluyendo, por ejemplo, 2'-0-met?l-, 2'-0-al?l, 2' -fluoro- o 2'-az?do-pbosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricas, azúcares epiméricas tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásico tal como pbosita de metilo. Uno o más enlaces de fosfodiéster también pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en donde fosfato se reemplaza por P (0) S ("tioato") , P(S)S ("ditioato") , "(0)NR.sub.2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO o CH.sub.2 ("formacetal") , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo substituido o no substituido (1-20 C.) opcionalmente conteniendo un enlace de éter (-0-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o araldil. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos referidos en la presente, incluyendo ARN y ADN. "Oligonucleótido," como se utiliza en la presente, generalmente se refiere a polinucleótidos generalmente sintéticos, generalmente de filamento único, cortos que son generalmente, pero no necesariamente, de menos de aproximadamente 200 nucleótidos en longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción de arriba para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos. El término "factor de crecimiento de hepatocito" o "HGF", como se utiliza en la presente, se refiere, al menos que se indique de otra manera, a cualquier polipéptido HGF variante o nativo (ya sea nativo o sintético) que es capaz de activar la trayectoria de señalización de HGF/c-met bajo condiciones que permiten que tal proceso ocurra. El término "HGF tipo silvestre" generalmente se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína de HGF que ocurre de manera natural. El término "secuencia de HGF tipo silvestre" generalmente se refiere a una secuencia de aminoácidos encontrada en un HGF que ocurre de manera natural. C-met (o Met) es un receptor conocido para HGF a través del cual la señalización intracelular de HGF se efectúa de manera biológica. Una secuencia de proteínas de c-met de humano tipo silvestre en base a RefSeq NM_000245 se representa en la Fig. 8. Los términos "sitio de unión", "empalme", "punto de ramificación", "tracto de polipirimidina", como se utiliza en la presente, se refieren al significado conocido en la materia en el contexto de unión de ARN de mamífero, en particular humano. Ver, por ejemplo, Pagani & Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5:389-396, y referencias citadas en la misma. Para referencia conveniente, una modalidad de secuencias para elementos de unión de ARN de c-met se establece de manera ilustrativa en la Figura 7. El término "célula huésped" (o "célula huésped recombinante"), como se utiliza en la presente, se propone referirse a una célula que se ha alterado genéticamente, o es capaz de alterarse genéticamente por la introducción de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido recombinante o vector. Debe entenderse que tales términos se proponen referirse no solamente a la célula sujeto particular sino que a la progenie de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesoras debido a ya sea mutación o influencias ambientales, tal progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula de origen, pero aún se incluyen dentro del alcance del término "célula huésped" como se utiliza en la presente. "Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpo que generalmente carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a bajos niveles por el sistema linf y a niveles incrementados por mielomas. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan de manera intercambiable en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que muestren la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mayor detalle en la presente) . Un anticuerpo puede ser quimérico, humano, humanizado y/o madurado por afinidad.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción preferentemente retiene al menos una, preferentemente la mayoría o todas, de las funciones normalmente asociadas con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y de esta manera retiene la capacidad de unirse al antígeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fc, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión FcRn, modulación de la vida media del anticuerpo, función ADCC y unión complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo substancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal un fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión a antígeno enlazado a secuencia Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento. El término "región hipervariable", "HVR", o "HV", cuando se utiliza en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman ciclos estructuralmente definidos. Las letras "HC" y "LC" que preceden el término "HVR" o "HV" se refieren, respectivamente, a HVR o HV de una cadena pesada y cadena ligera. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2, L3) . Un número de delineaciones de región hipervariable están en uso y se comprenden en la presente. Las Regiones que Determinan la Complementaridad Kabat (CDRs) están en base a la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al , Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en cambio a la ubicación de los ciclos estructurales (Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDRs Kabat y ciclos estructurales Chothia, y se utilizan por software de modelo del anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristal complejas, disponibles. Los residuos de cada una de estas regiones hipervariables se observan abajo. Ciclo Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración Kabat; Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración Clothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente. La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminal de cadena ligera o pesada del anticuerpo. Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que ocurren naturalmente que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un antígeno único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales en la presente específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, sí como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. No. 4,816,567; y Morrison et al , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 81:6851-6855 (1984) ) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad deseada, afinidad, y capacidad. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominio variables, en los cuales todos o substancialmente todos de los ciclos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas de las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá también al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver Jones et al , Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann et al , Na ture 332:323-329 (1988); y Presta, Curr . Op . Struct . Bíol . 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann . Allergy, As thma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op . Biotech . 5:428-433 (1994). Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho utilizando cualquiera de una de las técnicas para hacer anticuerpos humanos como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humano . Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDRs/HVRs del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no posee aquella(s) alteración (es ) . Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades aún picomolares o nanomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Marks et al . Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por revoltura del dominio VH y VL . La mutagénesis aleatoria de CDR/HVR y/o residuos de estructura se describe por: Barbas et al . Proc Na t . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al .

J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al , J. Immunol . 154 (7) :3310-9 (1995); y Hawkins et al , J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992) . El término "región Fc" se utiliza para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse por digestión de papaina de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG de humano se define usualmente para estirar de un residuo aminoácido en aproximadamente la posición Cys226, o de aproximadamente la posición Pro230, al carboxilo-término de la región Fc . La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Por "cadena de región Fc" en la presente se entiende una de las dos cadenas de polipéptido de una región Fc . El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ej • ,e--„m-.p-,l ? D32 , P e --isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol; colquicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el topotecan análogo sintético (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocaraptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracil; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; los antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed . Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como también cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionada) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma de HCl de doxorubicina (DOXIL®) y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxiflupdina, enocitabma, floxuridma; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; relleno de acido folleo tal como acido frolmico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; eniluracil; amsacpna; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamma; demecolcma; diaziquona; elfornitma; acetato de eliptimo; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentman; lonidamma; maitansmoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerma; pentostatina; fenamet; pirarubicma; losoxantrona; 2-et?lh?draz?da; procarbazina; complejo de polisacapdo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2, 2 ' , 2"-tpclorotr?et?lam?na; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurma A, roridma A y anguidma) ; uretano; vmdesma (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazma; manomustma; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosma; arabmosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclltaxel (TAXOL®) , formulación de nanoparticula ingeniada por albúmina de paclltaxel (ABRAXANE™) , y doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-t?oguan?na; mercaptopupna; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatma y carboplatma; vmblastina (VELB AN®) ; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinóico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores tal como CHOP, una abreviación para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviación para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear, o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y con frecuencia están en la forma de tratamiento sistémico, o de cuerpo completo. Pueden ser hormonas por si mismas. Los ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs), incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo NOLVADEX® tamoxifen) , raloxifeno (EVISTA®) , droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (FARESTON®); anti-progesteronas; subreguladores del receptor de estrógeno (ERDs); antagonistas del receptor de estrógeno tal como fulvestrant (FASLODEX®); agentes que funcionan para suprimir o extirpar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona que libera la hormona leutinizante (LHRH) tales como acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa de enzima, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®) , exemestano (AROMASIN®) , formestania, fadrozola, vorozola (RTVISOR®) , letrozola (FEMARA®), y anastrozola (ARJMDDEX®) . Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®), o risedronato (ACTONEL®) ; así como también troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1, 3-dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las trayectorias de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELEX®) ; ditiosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de cinasa de tirosina dual ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016) ; inhibidores COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®; 4- (5- (4-metilfenil) -3- (trifluorometil) -lH-pirazol-1-il) bencenosulfonamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Tal bloqueo puede ocurrir por cualquier medio, por ejemplo, al interferir con interacción de proteína-proteína tal como unión de ligando a un receptor. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas substancialmente o completamente inhiben la actividad biológica del antígeno. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular/proliferación no regulada. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin), blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer del hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colón, cáncer colorectal, carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica indirecta o directa de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la velocidad de progresión de enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión o prognosis mejoradas. En algunas modalidades, las moléculas moduladoras y métodos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o desorden. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto dañino o tóxico del agente terapéutico pesa más por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, ya que se utilice una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa temprana de enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva . Composiciones y Métodos de la Invención A. Anticuerpos de antagonista de c-met En una modalidad, la invención proporciona anticuerpos de antagonista de c-met que pueden encontrar uso en la presente como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Anticuerpos ejemplificativos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugado. Los aspectos para generar, identificar, caracterizar, modificar y producir anticuerpos se establecen bien en la materia, por ejemplo, como se describe en Sol. de Pat. de EE.UU. Pub. No. 2005/0042216 de los párrafos 522 a 563, 604 a 608, y 617 a 688. Los anticuerpos de antagonista de c-met descritos en la presente pueden formularse en cualquier forma adecuada para suministro a una célula/tejido objetivo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agentes tensoactivos que es útil para el suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se ordenan comúnmente en una formación bicapa, similar al orden de lípido de membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Pats. de EE.UU. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicada el 23 de Octubre de, 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de EE.UU. No. 5, 013, 556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) .

Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al . , J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico se contiene opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al . , J. National Cáncer Inst. 81 (19) :1484 (1989) . B . Polipéptidos de antagonista del C-met En un aspecto, un antagonista de c-met de la invención comprende un polipéptido. En una modalidad, el polipéptido de antagonista se une a y/o antagoniza la proteína de c-met hiperestabilizado en una célula. En una modalidad, los polipéptidos se unen, preferentemente de manera específica, al c-met hiperestabilizado. Los polipéptidos pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de péptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante. En una modalidad, un polipéptido de antagonista de c-met es al menos de aproximadamente 5 aminoácidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, .73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos en longitud o más, en donde tales polipéptidos son capaces de inhibir la actividad de c-met hiperestabilizado. Estos polipéptidos pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se observa que las técnicas para seleccionar bibliotecas de oligopéptido para oligopéptidos que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Nos. de Publicación de PCT. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al . , en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al . , J. Immunol . Meth. 102:259-274 (1987); Schoofs et al . , J . Immunol . , 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 87:6378; Lowman, H.B. et al . (1991) Biochemistry. 30:10832; Clackson, T. et al . (1991) Nature. 352: 624; Marks, J. D. et al . (1991), J. Mol. Biol. 222:581; Kang, A.S. et al . (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

El desligue de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite a uno seleccionar grandes bibliotecas de oligopéptido para identificar miembro (s) de aquellas librerías que son capaces de unirse específicamente a un polipéptido objetivo. El despliegue de fago es una técnica por la cual los polipéptidos variantes se despliegan como proteínas de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386) . La utilidad del despliegue de fago es el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteína selectivamente aleatorizadas (o cADNs aleatoriamente clonados) pueden clasificarse rápida y eficientemente por aquellas secuencias que se enlazan a una molécula objetivo con alta afinidad. El despliegue de bibliotecas de péptido (Cwirla, S. E. et al . (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al . (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al . (1991) Nature. 352: 624; Marks, J. D. et al . (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al . (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88:8363) en fago se ha utilizado para la selección de millones de polipéptidos u oligopéptidos de unos con propiedades de unión específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2:668). La clasificación de bibliotecas de fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación por afinidad utilizando el receptor objetivo, y un medio para evaluar los resultados del enriquecimiento de unión. Patentes de EE.UU. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143. Aunque la mayoría de los métodos de despliegue de fago han utilizado fago filamentoso, también se conocen sistemas de despliegue de fago lambdoide (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de despliegue de fago T4 (Ren et al . , Gene. 215: 439 (1998); Zhu et al . Cáncer Research. 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al . , Infect on & Immumty. 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al . , Gene, 195 (2 ): 303-311 (1997); Ren, Protein Sci . , 5: 1833 (1996); Efimov et al . , Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de despliegue de fago T7 (Smith and Scott, Methods ín Enzymology. 217: 228-257 (1993); U.S. 5, 766, 905) . Muchas otras mejoras y variaciones del concepto de despliegue de fago básico se han desarrollado ahora. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de despliegue para seleccionar bibliotecas de peptido para unión a moléculas objetivo seleccionadas y desplegar las proteínas funcionales de despliegue con el potencial para seleccionar estas proteínas para propiedades deseadas. Los dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de despliegue de fago se han desarrollado (WO 98/14277) y bibliotecas de despliegue de fago se han utilizado para analizar y controlar las interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales obligados (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue de fago se contacta con una solución en la cual el ligando se unirá a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se unirá a la molécula objetivo, para aislar selectivamente los ligandos de unión. WO 97/46251 describe un método para bioencuadrar una biblioteca de despliegue de fago aleatorio con un anticuerpo purificado por afinidad y después aislar el fago de unión, seguido por un proceso de microencuadramiento utilizando cavidades de microplaca para aislar el fago de unión con alta afinidad. El uso de proteína A de Staphylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li et al . (1998) Mol Biotech., 9: 187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de substracción de substrato para distinguir las especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatorial que puede ser una biblioteca de despliegue de fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para utilizar en detergentes utilizando despliegue de fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de unión específicas se describen en Patente de EE.UU. Nos. 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833.

Los métodos para generar bibliotecas de peptido y seleccionar estas bibliotecas también se describen en las Patentes de EE.UU. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, ,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763, 192, y 5,723,323. Los métodos para generar, identificar, caracterizar, modificar y producir polipeptidos de antagonistas se establecen bien en la materia, por ejemplo, como se describe en Sol. de Pat. de EE.UU. Pub. No. 2005/0042216 de los párrafos 606 a 608, 614 a 688. En una modalidad, los polipeptidos para antagonizar la actividad de c-met hiperestabilizado puede diseñarse en base a la estructura de la proteína de c-met hiperestabilizado, por ejemplo al seleccionar en base a un antigeno objetivo que comprende una secuencia de yuxtamembrana de c-met mutante que comprende la eliminación de al menos una porción del exon 14 como se describe en la presente. Por ejemplo, un antigeno objetivo puede comprender un polipeptido que comprende una secuencia que resulta de el empalme en estructura del exon 13 y 15 de c-met. C . Inmunoconjugados En otro aspecto, la invención proporciona ímmunoconjugados, o conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), que comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico tal como un agente quimioterapeutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para el suministro local de agentes citoestáticos o citotóxicos, es decir, fármacos para matar o inhibir células de tumor en el tratamiento de cáncer (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; Patente de EE.UU. 4,975,278) permite el suministro objetivo de la porción de fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes de fármaco no conjugados puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad a células normales así como también las células de tumor pensadas para eliminarse (Baldwin et al . , (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986) : 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carrier Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al . (ed.s), pp. 475-506). La eficacia máxima con toxicidad mínima se piensa por la presente. Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales se han reportado como útiles en estas estrategias (Rowland et al . , (1986) Cáncer Immunol . Immunother., 21:183-87). Los fármacos utilizados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicma, metotrexato, y vindesina (Rowland et al . , (1986) supra). Las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacteriales tal como toxina de difteria, toxinas vegetales tal como nema, toxinas de molécula pequeña tal como geldanamicina (Mandler et al (2000) Tour. of the Nat. Cáncer Inst. 92 ( 19) : 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansmoides (EP 1391213; Liu et al . , (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y caliqueamic a (Lode et al (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citoestaticos y citotóxicos por mecanismos incluyendo unión de tubulina, unión de ADN, o inhibición de topoisomerasa . Algunos fármacos citotoxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos del receptor de protema. ZEVALIN® (íbritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa de IgGl de murino dirigido contra el antigeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B malignos y normales y radioisótopo ?nIn o 90Y unido por un enlazador de tiourea-quelador (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucí. Med. 27 (7 ): 766-77 ; Wiseman et al (2002) Blood 99(12) :4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10) :2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) : 3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra el Linfoma no Hodgkín (NHL) de célula B, la administración da como resultado citopenias prolongadas y severas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals ) , un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto de un anticuerpo CD33 hu enlazado a caliqueamicina, se aprueba en el 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda por inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7) :686; Patentes de EE.UU. Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo huC242 enlazado a través del enlazador de disulfuro SPP a la porción de fármaco de maitansinoide, DM1, se prueba para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colón, pancreático, gástrico, y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal del antígeno de membrana especifico anti-próstata (PSMA) enlazado a la porción de fármaco maitansmoide, DM1, se prueba por el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos de auristatma, auristatina E (AE) y monometilauristatma (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, se conjugan con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específicos para CD30 en enfermedades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7 ): 778-784 ) y se encuentran bajo desarrollo terapéutico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en la presente (arriba) . Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de auleuritos fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. Una variedad de radionuclidos está disponible para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento a proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCl de adipimidato de dimetil), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidil) , aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de fluorina bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al . , Science, 238: 1098 (1987). El ácido de 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente de quelación ejemplificativo para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Ver WO94/11026. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolostatinas, aurostatinas, un tricoteceno, y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente. Maitansina y maitansinoides En algunas modalidades, el immunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas maitansinoides. Maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan al inhibir la polimerización de tubulina. La maitansina se aisla primero del arbusto de África del Este Maytenus serrataa (Patente de EE.UU. No. 3,896,111). Subsiguientemente, se descubre que ciertos microbios también producen maitansinoides, tal como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (Patente de EE.UU. No. 4,151,042). Maitansinol sintético y derivados y análogos de los mismos se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 4, 137,230; 4,248, 870 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307, 016 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371, 533. Las porciones de fármaco maitansinoide son porciones de fármaco atractivas en conjugados de anticuerpo-fármaco debido a que son: (i) relativamente accesibles de preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) fáciles de derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación a través de los enlazadores no disulfuro a anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) efectivos contra una variedad de estirpes de célula de tumor. Las modalidades ejemplificativas de porciones de fármaco maitansinoide incluyen: DM1; DM3; y DM4. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, métodos para hacer los mismos, y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en Patentes de EE.UU. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y Patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente por la presente para referencia. Liu et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) irnmunoconjugados descritos que comprenden un maitansinoide designado DMl enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal de humano. Se encuentra que el conjugado sea altamente citotóxico hacia células de cáncer de colón cultivadas, y mostró actividad antitumor en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo . Chari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe immunoconjugados en los cuales un maitansinoide se conjuga a través de un enlazador de disulfuro al anticuerpo A7 de murino que se une a un antígeno en las estirpes celulares de cáncer de colón humano, o a otro anticuerpo monoclonal de murino TA.l que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1-maitansonoide se prueba in vi tro en la línea celular de cáncer de mama de humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco logró un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría incrementarse al incrementar el número de moléculas maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide pueden prepararse al enlazar químicamente un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir de manera significativa la actividad biológica de ya sea el anticuerpo o la molécula maitansinoide. Ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,208,020 (la descripción de la cual se incorpora de manera expresa para referencia) . Un promedio de 3-4 moléculas maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para aumentar la citotoxicidad de células objetivo sin afectar de manera negativa la función o solubilidad del anticuerpo, aunque aún una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría para aumentar la citotoxicidad bajo el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides se conocen bien en la materia y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5,208,020 y en las otras patentes y publicaciones de no patente referidas arriba. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios esteres de maitansinol. Existen muchos grupos de enlace conocidos en la materia para hacer conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente de EE.UU. No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 Bl, Chari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992), y Solicitud de Patente de EE.UU. No. 10/960,602, presentada el 8 de Octubre de 2004, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente por la presente para referencia. Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC pueden prepararse como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 10/960,602, presentada el 8 de Octubre de 2004. Los grupos enlazadores incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupo fotolábiles, grupos lábiles peptidasa, o grupos lábiles esterasa, como se describen en las patentes arriba identificadas, prefiriéndose los grupos tioéter y disulfuro. Los grupos de enlace adicionales se describen y ejemplifican en la presente. Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxylato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionales (tal como HCl de adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de fluorina bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al . , Biochem. J. 173:723-737 (1978)) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro . El enlazador puede unirse a la molécula maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo del enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse por reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol. Auristatinas y dolostatinas En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de EE.UU. Nos. 5635483; 5780588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con las dinámicas del microtúbulo, hidrólisis de GTP, y división celular y nuclear (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 ( 12 ): 3580-3584 ) y tienen actividad anticáncer (US 5663149) y actividad antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La porción de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del término N (amino) o el término C (carboxilo) de la porción de fármaco peptídica (WO 02/088172) . Las modalidades de auristatina ejemplificativas incluyen las porciones de fármaco de monometilauristatina enlazadas a N-terminal DE y DF, descritas en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre de 2004, la descripción de la cual se incorpora expresamente para referencia en su totalidad. Modalidades de auristatina ejemplificativas son MMAE y MMAF. Las modalidades ejemplificativas adicionales que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores (descritos en la presente además) Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE y Ab-MC-MMAF. Típicamente, las porciones de fármaco en base a péptido pueden prepararse al formar una unión de péptido entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales uniones de péptido pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo al método de síntesis de fase líquida (ver E. Schróder and K. Lübke, "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que se conoce bien en el campo de química de péptido. Las porciones de fármaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo a los métodos de: US 5635483; US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al . Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. Ver también Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7 ): 778-784 ; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre de 2004, incorporada por la presente para referencia en su totalidad (describiendo, por ejemplo, enlazadores y métodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados con enlazadores) . Caliqueamicina En otras modalidades, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de antibióticos es capaz de producir ADN de doble filamento que se rompe en las concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, ver Patentes de EE.UU. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, ,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas para American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ?i1, a21, a3x, N-acetil-?x1, PSAG y ?1! (Hinman et al . , Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al . , Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE.UU arriba mencionadas para American Cyanamid) . Otro fármaco anti-tumor con el que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es un antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la toma celular de estos agentes a través de la ternalizacion mediada por anticuerpo aumenta grandemente sus efectos citotoxicos. Otros agentes citotoxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, v cristma y 5-fluorouracil, la familia de agentes colectivamente conocidos como complejo LL-E33288 descrito en las Patentes de EE.UU. 5,053,394, 5,770,710, asi como también esperamicinas (Patente de EE.UU. 5,877,296). Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena de exotox a A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abpna A, cadena de modecma A, alfa-sarcma, proteínas de Aleuritos fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como deoxiribonucleasa; DNase) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen AT211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu . Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o una etiqueta giratoria para formación de imágenes de resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como formación de imágenes de resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radioetiquetas y otras pueden incorporarse en el conjugado en maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis química de aminoácido utilizando precursores de aminoácido adecuados que incluyen, por ejemplo, fluorina-19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionales (tal como HCl de adipimidato de dimetilo) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato) , y compuestos de fluorina bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al . , Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente de quelación ejemplificativo para conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador desdoblable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de EE.UU. No. 5,208,020) puede utilizarse. Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco En los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) se conjuga con una o más porciones de fármaco (D), por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 porciones de fármaco por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . El ADC de la Fórmula I puede prepararse por varias vías, empleando reacciones químicas orgánicas, condiciones, y reactivos conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con una porción de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una porción de fármaco con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los métodos adicionales para preparar ADC se describen en la presente. Ab-(L-D)p I El enlazador puede componerse de uno o más componentes enlazadores. Los componentes enlazadores ejemplificativos incluyen 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC"), y N-Succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Los componentes enlazadores adicionales se conocen en la materia y algunos se describen en la presente. Ver también "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, presentada el 5 de Noviembre de 2004, los contenidos de la cual se incorporan por la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, el enlazador puede comprender residuos de aminoácido. Los componentes enlazadores de aminoácido ejemplificativos incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Los dipéptidos ejemplificativos incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe) . Los tripéptidos ejemplificativos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly) . Los residuos de aminoácido que comprenden un componente de enlazador de aminoácido incluyen aquellos que ocurren de manera natural, así como también aminoácidos menores y análogos de aminoácido que no ocurren de manera natural, tal como citrulina. Los componentes de enlazador de aminoácido pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para desdoblamiento enzimático por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina. Las estructuras del componente enlazador ejemplificativas se muestran abajo (en donde la línea ondeada indica sitios de unión covalente a otros componentes del ADC) : Componentes enlazadores ejemplificativos adicionales y abreviaciones incluyen (en donde el anticuerpo (Ab) y enlazador se representan, y p es 1 a aproximadamente 8) : H Val -cit O 1 NH? > ¡\ • ' v -n A. » Ni ? M \ U ? - L" U J (' \. A A N A >=»/ ?< V i\s ] ^ N / H r ) •• hN O* XX y y , t| , n. ¡ Los grupos nucleofílicos o anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en donde el anticuerpo se glicosila. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y son capaces de reaccionar para formar uniones covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos, y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (111) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo, y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros de intercadena reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para conjugación con reactivos enlazadores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente de cisteína de esta manera formara, de manera teórica, dos nucleófilos de tiol reactivos. Grupos nucleofílicos adicionales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de sinas con 2-?mmot?olano (reactivo de Traut) que da como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) al introducir uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisterna (por ejemplo, preparar anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos aminoácido de cisterna no nativos). Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir porciones electrofílicas, que pueden reaccionar con substituyentes nucleofílicos en el reactivo enlazador o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glicosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos cetona o aldehido que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos enlazadores o porciones de fármaco. Los grupos base Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con ya sea oxidasa de glactosa o meta-periodato de sodio puede producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas que contienen serina N-terminal o residuos de treonina pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, lo que da como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Tal aldehido puede reaccionarse con una porción de fármaco o nucleófilo enlazador. Del mismo modo, los grupos nucleofílicos en una porción de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, y grupos arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en porciones enlazadoras y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos, y haluros ácidos; (ii) haluros de bencilo y alquilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo, y maleimida . Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotoxico puede hacerse, por ejemplo, por técnicas recombmantes o síntesis de péptido. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidma) para utilización en pre-objetivo de tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por el retiro de un conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de despeje y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidita) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, radionucleótido) . El anticuerpo (Ab)-MC-MMAE puede prepararse por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con MC-MMAE como sigue. El anticuerpo, disuelto en 500mM de borato de sodio y 500 mM de cloruro de sodio a pH 8.0 se trata con un exceso de lOOmM de ditiotreitol (DTT) . Después de la incubación a 37°C por aproximadamente 30 minutos, el regulador se intercambia por elución sobre resma Sephadex G25 y se eluye con PBS con lmM DTPA. El valor tiol/Ab se verifica al determinar la concentración de anticuerpo reducida de la absorbencia a 280 nm de la solución y la concentración de tiol por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) y la determinación de la absorbencia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfría en hielo. El reactivo enlazador de fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE) , es decir MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se agrega al anticuerpo reducido enfriado 2H9 en PBS. Después de aproximadamente una hora, un exceso de maleimida se agrega para templar la reacción y cubrir cualquier grupo tiol de anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentra por ultrafiltración centrífuga y 2H9-MC-MMAE se purifica y desala por elución a través de resina G25 en PBS, filtra a través de filtros de 0.2 µm bajo condiciones estériles, y congela para almacenamiento . Anticuerpo-MC-MMAF puede prepararse por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con MC-MMAF siguiendo el procedimiento proporcionado para la preparación de Ab-MC-MMAE. Anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAE se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con MC-val-cit-PAB-MMAE siguiendo el procedimiento proporcionado para la preparación de Ab-MC- MMAE. Anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAF se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con MC-val-cit-PAB-MMAF siguiendo el procedimiento proporcionado para la preparación de Ab-MC-MMAE. Anticuerpo-SMCC-DMl se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con SMCC-DM1 como sigue. El anticuerpo purificado se deriva con (Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Ine) para introducir el enlazador SMCC. Específicamente, el anticuerpo se trata a 20 mg/mL en 50mM de fosfato de potasio/50 mM de cloruro de sodio/2 mM de EDTA, pH 6.5 con 7.5 equivalentes molares de SMCC (20 mM en DMSO, 6.7 mg/mL). Después de agitar por 2 horas bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra a través de una columna Sephadex G25 equilibrada con 50mM de fosfato de potasio/50 mM de cloruro de sodio/2 mM de EDTA, pH 6.5. Las fracciones que contienen el anticuerpo se agrupan y ensayan. Anticuerpo-SMCC preparado de esta manera se diluye con 50mM de fosfato de potasio/50 mM de cloruro de sodio/2 mM de EDTA, pH 6.5, a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml, y se reacciona con una solución de 10 mM de DMl en dimetilacetamida. La reacción se agita a temperatura ambiente bajo argón 16.5 horas. La mezcla de reacción de conjugación se filtra a través de una columna de filtración de gel Sephadex G25 (1.5 x 4.9 cm) con 1 x PBS a pH 6.5. La relación del fármaco DMl a anticuerpo (p) puede ser aproximadamente 2 a 5, como se mide por la absorbencia a 252 nm y a 280 nm. Ab-SPP-DMl se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con SPP-DM1 como sigue. El anticuerpo purificado se deriva con N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato para introducir grupos ditiopiridilo. El anticuerpo (376.0 mg, 8 mg/mL) en 44.7 mL de 50 mM de regulador de fosfato de potasio (pH 6.5) que contiene NaCl (50 mM) y EDTA (1 mM) se trata con SPP (5.3 equivalentes molares en 2.3 mL de etanol). Después de la incubación por 90 minutos bajo argón a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtra por gel a través de una columna ephadex G25 equilibrada con 35 mM de citrato de sodio, 154 mM de NaCl, 2 mM de EDTA. Las fracciones que contienen anticuerpo se agrupan y ensayan. El grado de modificación del anticuerpo se determina como se describe arriba . Anticuerpo-SPP-Py (aproximadamente de 10 µmoles de grupos 2-tiopiridina liberables) se diluye con 35 mM de regulador de citrato de sodio, anterior, pH 6.5, a una concentración final de aproximadamente 2.5 mg/mL. DMl (1.7 equivalentes, 17 µmoles) en 3.0 mM de dimetilacetamida (DMA, 3% v/v en la mezcla de reacción final) se agrega entonces a la solución de anticuerpo. La reacción procede a temperatura ambiente bajo argón por aproximadamente 20 horas. La reacción se carga en una columna de filtración de gel Sephacryl S300 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) equilibrada con 35 mM de citrato de sodio, 154 mM de NaCl, pH 6.5. La velocidad de flujo puede ser aproximadamente 5.0 mL/min y 65 fracciones (20.0 mL cada una) se recolectan. El número de moléculas de fármaco DMl enlazadas por molécula de anticuerpo (p1) se determina al medir la absorbencia a 252 nm y 280 nm, y puede ser aproximadamente 2 a 4 porciones de fármaco DMl por anticuerpo 2H9. Anticuerpo-BMPEO-DMl se prepara por conjugación de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en la presente con BMPEO-DM1 como sigue. El anticuerpo se modifica por el reactivo bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), que conduce a un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto puede realizarse al disolver BM(PE0)4 en una mezcla de etanol/agua al 50% a una concentración de 10 mM y agregar un exceso molar de diez veces a una solución que contiene anticuerpo en salina regulada por fosfato a una concentración de aproximadamente 1.6 mg/ml (10 micromolar) y le permite reaccionar por 1 hora para formar el compuesto intermediario de anticuerpo-enlazador, 2H9-BMPEO. El exceso de BM(PE0)4 se remueve por filtración de gel (columna HiTrap, Pharmacia) en 30 mM de citrato, pH 6 con 150 mM de regulador de NaCl. Un aproximado de 10 veces el exceso molar de DMl se disuelve en acetamida de dimetilo (DMA) y se agrega al compuesto intermediario 2H9-BMPE0. Formamida de dimetilo (DMF) también puede emplearse para disolver el reactivo de porción de fármaco. La mezcla de reacción se deja reaccionar durante la noche antes de la filtración de gel o diálisis en PBS para remover DMl sin reaccionar. La filtración de gel en columnas S200 en PBS se utiliza para remover agregados de alto peso molecular y proporcionar 2H9-BMPEO-DM1 purificado. D. Antagonistas de c-met que Comprenden Ácidos Nucleicos En un aspecto, un antagonista de c-met de la invención comprende una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede comprender un oligonucleótido antisentido, un ARN inhibidor/de interferencia (por ejemplo, un ARN inhibidor/de interferencia pequeño (siARN)), o un aptámero. Los métodos de selección para, identificar y hacer estos moduladores de ácido nucleico se conocen en la materia. Por ejemplo, siARNs han probado ser capaces de modular la expresión genética donde los antagonistas tradicionales tales como moléculas pequeñas o anticuerpos han fallado. (Shi Y., Trends in Genetics 19(1): 9-12 (2003)). Los ARNs de doble filamento, sintetizados in vitro que son más pocos que 30 nucleótidos en longitud (por ejemplo, aproximadamente 15 a 25, 17 a 20, 18 a 20, 19 a 20, o 21 a 23 nucleotidos) pueden actuar como ARNs de interferencia (íARNs) y pueden inhibir específicamente la expresión genética (ver, por ejemplo, Fire A., Trends ín Genetics (1999), 391; 806-810; Sois, de Pat. de EE.UU. 09/821832, 09/215257; Pat. de EE.UU. No. 6,506,559; PCT/US01/10188 ; Sol. Europea No. de Ser. 00126325) . Estos íARNs se cree que actúan al menos en parte al mediar la degradación de sus ARNs objetivo. Sin embargo, ya que están ba o 30 nucleótidos en longitud, no activan un mecanismo de defensa antiviral celular. Tales mecanismos incluyen producción de mterferón, y un cierre general de la síntesis de proteina de célula huésped. Prácticamente, los siARNs pueden sintetizarse y después clonarse en vectores de ADN. Tales vectores pueden transfectarse y se hacen para expresar el siARN a altos niveles. El alto nivel de expresión de siARN se utiliza para "noquear" o reducir significativamente la cantidad de proteína producida en una célula, y de esta manera es útil en establecimientos celulares donde la sobreexpresión de una proteína se cree que se enlaza a un desorden patológico. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que son capaces de unirse a una molécula objetivo, tal como una proteína de c-met hiperestabil zado. La generación y uso terapéutico de aptámeros se establecen bien en la materia.

Ver, por ejemplo, Pat. de EE.UU. No. 5,475,096, y la eficacia terapéutica de Macugen® (Eyetech, New York) para tratar la degeneración macular relacionada con la edad. La tecnología anti-sentido se establece bien en la materia. Los detalles adicionales que consideran esta tecnología se proporcionan abajo. E . Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los antagonistas de c-met utilizados de acuerdo con la invención se preparan para almacenamiento al mezclar el antagonista de c-met que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores tales como acetato, Tris, fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol de bencilo o butilo; parabenos de alquilo tales como parabeno de propilo o metilo; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menores a aproximadamente 10 residuos); proteínas; tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agente tensoactivo tal como polisorbato; contraiones que forman sal tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o glicol de polietileno (PEG) . Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, además de un antagonista del C-met, puede ser deseable incluir en una formulación, un modulador adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo que se une a un epítope diferente en la proteína de c-met hiperestabilizado, o un anticuerpo a algún otro objetivo. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento, agente anti-hormonal, y/o cardioprotector. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Las preparaciones de liberación prolongada pueden prepararse. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctides (Pat. de EE.UU. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones a utilizarse para la administración in vivo pueden ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través, de las membranas de filtración estériles. F. Tratamiento con un antagonista de c-met de la invención Los antagonistas de c-met de la invención tienen varias aplicaciones no terapéuticas. Los antagonistas pueden ser útiles para clasificar o detectar enfermedades que expresan c-met hiperestabilizado (por ejemplo, en radioformación de imágenes). Los anticuerpos, oligopéptidos y aptámeros también pueden ser útiles para la purificación o inmunoprecipitación de c-met hiperestabilizado de células, para la detección y cuantificación de c-met hiperestabilizado in ví tro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot, y para modular los eventos celulares en una población de células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento de cáncer incluye una o una combinación de las sigientes terapias: cirugía para remover el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. La terapia que comprende antagonistas de c-met puede ser especialmente deseable en pacientes de edad avanzada quienes no toleran bien la toxicidad y efectos secundarios de la quimioterapia y en enfermedad metastático donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada. Para aplicaciones terapéuticas, los antagonistas de c-met pueden utilizarse solos, o en una terapia de combinación con, por ejemplo, hormonas, antiangiogenes, o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapia, y/o radioterapia. Los antagonistas de c-met pueden administrarse junto con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre- o post-convencional . Los fármacos quimioterapéuticos tales como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se utilizan para tratar cáncer, en particular, en pacientes en riesgo. Los antagonistas de c-met generalmente se administrarían con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, un antagonista de c-met se administra junto con quimioterapia para reducir los efectos secundarios que resultan del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. La Referencia de Escritorio de los Médicos (PDR) describe las dosificaciones de estos agentes que se han utilizado en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos arriba mencionados que son terapéuticamente efectivos dependerá del cáncer particular que se trata, el grado de la enfermedad y otros factores familiares para el médico de experiencia en la materia y pueden determinarse por el médico. Los antagonistas de c-met se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tal como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo, oligopéptido o molécula pequeña orgánica se prefiere en una modalidad de la invención. Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del antagonista del C-met. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un periodo de tiempo mientras ambos (o todos los) agentes activos ejercen de manera simultánea sus actividades biológicas. Preferentemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergístico y/o reducción de efectos secundarios no deseados. También puede ser deseable combinar la administración del antagonista del C-met, con la administración de un agente terapéutico dirigido contra otro antígeno asociado con la condición patológica particular.

En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéuticos de la presente invención incluyen la administración combinada de una molécula de antagonista de c-met y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la co-administración de cocktails de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracil, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y horarios de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes o como se determina de manera empírica por el practicante experto. La preparación y horarios de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El antagonista de c-met puede combinarse con un compuesto anti-hormonal; por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; una anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812); o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Donde el cáncer a tratarse es cáncer independiente de andrógeno, los pacientes previamente pueden haberse sometido a terapia anti-andrógeno y, después de que el cáncer se vuelve independiente de androgeno, el antagonista de c-met puede administrarse al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico co-admmistrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfuncion miocardial asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos de arriba, el paciente puede someterse a retiro quirúrgico de células cancerígenas y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente con, o después de la terapia con antagonista del C-met. Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes co-admmistrados arriba se utilizan actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y antagonista del C-met. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación y modo de administración se elegirá por el médico de acuerdo con los criterios conocidos. La dosificación apropiada del antagonista de c-met dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, como se define arriba, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea el antagonista de c-met se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista del C-met, y la discreción del médico que atiende. El antagonista de c-met se administra de manera adecuada al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. En una modalidad, el antagonista de c-met se administra por infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1-15mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continúa. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis de mantenimiento semanalmente de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo de antagonista del C-met. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. Para las administraciones repetidas durante varios días o más largas, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia puede monitorearse fácilmente por métodos convencionales y ensayos y basarse en los criterios conocidos por el médico u otra persona de experiencia en la materia . Además de la administración de un modulador de polipéptido (por ejemplo, polipéptido, anticuerpo, etc) al paciente, la invención contempla la administración de un modulador por terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que comprende/codifica el antagonista de c-met se comprende por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del c-met". Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de Marzo de 1996 que concierne al uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos planteamientos principales para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo . Para suministro in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde el antagonista de c-met se requiere. Para tratamiento ex vivo, las células del paciente se remueven, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vi tro, o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral. En una modalidad, las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus I simple de Herpes, o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lípido (lípidos útiles para transferencia mediada por lípido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para la revisión del marcado del gen actualmente conocido y procedimientos de terapia genética ver Anderson et al . , Science 256:808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma. Los anticuerpos de antagonista de c-met de la invención pueden estar en diferentes formas comprendidas por la definición de "anticuerpo" en la presente. De esta manera, los anticuerpos incluyen anticuerpo intacto o de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia nativo o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, y fragmentos funcionales de los mismos. La invención proporciona una composición que comprende un antagonista del C-met, y un vehículo. En una modalidad adicional, una composición puede comprender un antagonista de c-met en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes inhibidores del crecimiento o citotóxicos, incluyendo agentes quimioterapéuticos. La invención también proporciona formulaciones que comprenden un antagonista del C-met, y un vehículo. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. G. Artículos de Fabricación y Equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de fabricación que contiene los materiales útiles para el tratamiento de un desorden utilizando un antagonista del C-met. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o inserción de paquete en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente conserva una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un detenedor perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un antagonista de c-met de la invención. La etiqueta o inserción de paquete indica que la composición se utiliza para tratar un desorden particular. La etiqueta o inserción de paquete comprenderá además instrucciones para administrar la composición al paciente. Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacterioestática para inyección (BWFI), salina regulada por fosfato, solución del Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista del usuario y comercial, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. También se proporcionan los equipos que son útiles para diversos propósitos. Pueden proporcionarse los equipos que contienen antagonistas de c-met de la invención para la detección y cuantificación de c-met hiperestabilizado in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot. Como con el artículo de fabricación, el equipo comprende un recipiente y una etiqueta o inserción de paquete en o asociada con el recipiente. El recipiente conserva una composición que comprende al menos un antagonista de c-met de la invención. Pueden incluirse los recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y reguladores, anticuerpos de control. La etiqueta o inserción de paquete puede proporcionar una descripción de la composición así como también instrucciones para el uso de detección o in vitro deseado.

H . Antagonistas de c-met que comprenden polipéptidos, ácido nucleicos y anticuerpos Formas especificas y aplicaciones En una modalidad, los ácido nucleicos de la invención incluyen oligonucleótidos/polinucleótidos antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de filamento único (ya sea ARN o ADN) capaz de unirse a ácidos nucleicos que codifican c-met hiperestabilizado endógeno. Los oligonucleótidos antisentido, de acuerdo a la presente invención, comprenden al menos un fragmento de la región de codificación de ADN de c-met hiperestabilizado. Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido, en base a una secuencia de cADN que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein and Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) and van der Krol et al . (BioTechniques 6:958, 1988). La unión de oligonucleótidos antisentido a secuencias de ácidos nucleicos objetivo da como resultado la formación de dúplex que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia objetivo por uno o varios medios, incluyendo la degradación mejorada de los dúplex, terminación prematura de transcripción o traducción, o por otros medios. Tales métodos se comprenden por la presente invención. Los oligonucleótidos antisentido de esta manera pueden utilizarse para bloquear la expresión de una proteína de c-met hiperestabilizado en células. Oligonucleótidos antisentido comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras de azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos objetivo. Los sitios intragénicos preferidos para unión antisentido incluyen la región que incorpora el codón de inicio/comienzo de traducción (5 ' -AUG/5 ' -ATG) o codón de terminación/fin (5' -UAA, 5' -UAG y 5-UGA/5 ' -TAA, 5 ' -TAG y 5'-TGA) del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del ARNm o gen que comprende de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') de un codón de inicio o terminación de la traducción. Otras regiones ejemplificativas para unión antisentido incluyen: intrones; exones; uniones de intrón-exón; el marco de lectura abierto (ORF) o "región de codificación", que es la región entre el codón de inicio de traducción y el codón de terminación de la traducción, el extremo 5' de un ARNm que comprende un residuo de guanosina metilado por N7 unido al residuo más 5' del ARNm a través de un enlace de trifosfato 5'-5'e la estructura de extremo 5' por sí misma así como también los primeros 50 nucleótidos adyacentes al extremo; la región sin traducir 5' (5' UTR), la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de inicio de traducción, y de esta manera incluyendo nucleótidos entre el sitio de extremo 5' y el codón de inicio de traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen; y la región 3' sin traducir (3' UTR), la porción de un ARNm en la dirección 3' del codón de terminación de la traducción, y de esta manera incluyendo los nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen. Ejemplos específicos de compuestos antisentido útiles para inhibir la expresión de polipéptido de c-met hiperestabilizado incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras modificadas o enlaces de internucleósido no naturales. Los oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los propósitos de esta especificación, y como se hace referencia algunas veces en la materia, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura de internucleósido también pueden considerarse por ser oligonucleósidos. Las estructuras de oligonucleótido modificadas e emplificativas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, metil y otros fosfonatos de alquilo que incluyen fosfonatos de 3 ' -alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3 ' -amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y borano-fosfatos que tienen enlaces 3 '-5' normales, análogos enlazados 2 '-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces de internucleótido es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Oligonucleótidos ejemplificativos que tienen polaridad invertida comprenden un enlace único 3' a 3' en el enlace internucleótido más 3' es decir, un residuo de nucleósido invertido que puede ser abásico (la nucleobase falta o tiene un grupo hidroxilo en lugar del mismo) . Varias sales, sales mezcladas y formas acidas libres también se incluyen. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de enlaces que contienen fósforo, incluyen, pero no se limitan a, Pat. de EE.UU. Nos.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; ,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Ejemplos de estructuras de oligonucleótidos modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras que se forman por alquilo de cadena corta o enlaces de internucleósido de cicloalquilo, heteroátomo mezclado y enlaces de internucleósido de cicloalquilo o alquilo, o uno o más enlaces de internucleósido heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras de siloxano; sulfuro, sulfóxido y estructuras de sulfona; estructuras de formacetil y tioformacetil; estructuras de tioformacetil y formacetil etileno; estructuras de riboacetil; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y metilenohidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen partes mezcladas de los componentes N, 0, S y CH2. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, Pats. de EE.UU. Nos.: 5,034,506; ,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. En otros ejemplos de oligonucleótidos antisentido, tanto el azúcar como el enlace de internucleósido, es decir, la estructura, de las unidades de nucleótido se reemplazan con nuevos grupos. Las unidades base se mantienen para hibridización con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Tal compuesto oligomérico, una imitación de oligonucleótido que Se ha demostrado que tienen excelentes propiedades de hibridización, se refiere como un ácido nucleico de péptido (PNA). En compuestos PNA, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina . Las nucleobases se retienen y se enlazan directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la estructura. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los compuestos de PAN incluyen pero no se limitan a, Pats . de EE.UU. Nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia.

Enseñanza adicional de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen et al . , Science, 1991, 254, 1497-1500. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido incorporan estructuras de fosforotioato y/o estructuras de heteroátomo, y en particular -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3) -0-CH2- [conocida como estructura de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-0-N(CH3)-CH2-, -CH2- N(CH3) -N (CH3) -CH2- y -O-N (CH3) -CH2-CH2- [en donde la estructura de fosfodiéster nativa se representa como -O-P-O-CH2-] descrita en la Pat. de EE.UU. No. 5,489,677 arriba referenciada, y las estructuras de amida de la Pat. de EE.UU. No. 5,602,240 arriba referenciada. Los ejemplos adicionales son oligonucleótidos antisentido que tienen estructuras de morfolino de la Pat. de EE.UU. No. 5,034,506 arriba referenciada. Los oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar substituidas. Los oligonucleótidos ejemplificativos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; O-alquil, S-alquil, o N-alquil; O-alquenil, S-alqueinil, o N-alquenil; O-alquinil, S-alquinil o N-alquinil; u O-alquil-0-alquil, en donde el alquil, alquenil y alquinil pueden ser alquil de Ci a Cío o alquinil o alquenil de C2 a C?0 substituido o no substituido. Se prefieren particularmente O [ (CH2) nO]mCH3, 0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y O (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] 2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos antisentido ejemplificativos comprenden uno de los siguientes en la posición 2 ' : alquil inferior Ci a C?0, alquil inferior substituido, alquenil, alquinil, alcaril, aralquil, O-alcaril o O-aralquil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquil, heterocicloalcaril, aminoalquilamino, polialquilamino, silil substituido, un grupo de desdoblamiento de ARN, un grupo reportador, un intercalador, o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros substituyentes que tienen propiedades similares. Una posible modificación incluye 2 ' -metoxietoxi (2 ' -O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2 ' -0- (2-metoxietil) o 2'-M0E) (Martin et al . , Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación preferida adicional incluye 2 ' -dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2, también conocido como 2'-DMA0E, y 2 ' -dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la materia como 2 ' -0-dimetilaminoetoxietil o 2'-DMAE0E), es decir, 2 ' -0-CH2-0-CH2-N(CH2) . Una modificación adicional incluye Ácidos Nucleicos Cerrados (LNAs) en los cuales el grupo 2' -hidroxil se enlaza al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando así una porción de azúcar bicíclica. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-)n que une el átomo de oxígeno 2 ' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. LNAs y la preparación de los mismos se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones incluyen 2 ' -metoxi (2'-0-CH3), 2'-amino?ropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2 NH2) , 2 '-alil (2 ' -CH2-CH=CH2) , 2'-0-alil (2'-0-CH2-CH=CH2) y 2 '-fluoro (2'-F). La 2'-modificación puede estar en la posición arabino (hacia arriba) o posición ribo (hacia abajo). Una 2' -modificación arabino es 2'-F. Las modificaciones similares también pueden hacerse en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en oligonucleótidos 2' -5' enlazados y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener imitaciones de azúcar tales como porciones de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosil . Las Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, Pats. de EE.UU. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Los oligonucleotidos también pueden incluir substituciones o modificaciones de nucleobase (con frecuencia referida en la materia simplemente como "base"). Como se utiliza en la presente, nucleobases "sin modificar" o "naturales" incluyen las bases de pupna adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pipmidma timina (T) , citosina (C) y uracil (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases naturales o sintéticas tales como 5-met?lc?tosma (5-me-C), 5-h?drox?met?l citosina, xantina, hipoxant a, 2-ammoadenma, 6-met?l y otros derivados de alquil de adenina y guanina, 2-prop?l y otros derivados de alquil de adenina y guanina, 2-t?ourac?l, 2-t?ot?m?na y 2-t?oc?tosma, 5-halouracil y citosina, 5-propm?l (-C=C-CH3 o -CH-C=CH) uracil y citosma y otros derivados de alquiml de bases de pirimidma, 6-azo uracil, citosma y timma, 5-urac?l (pseudouracil) , 4-t?ourac?l, 8-halo, 8-ammo, 8-t?ol, 8-tioalquil, 8-h?drox?l y otras adeninas 8-subst?tu?das y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-tr?fluorometil y otros uracilos 5-subst?tu?dos y citosmas, 7-met?lguanma y 7-met?ladenma, 2-F-adenma, 2-ammo-adenma, 8-azaguanma y 8-azaadenma, 7-deazaguanma y 7-deazaadenma y 3-deazaguanina y 3-deazaadenma . Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pipmidmas tricíclicas tales como fenoxaz a citidma (lH-pirimido [5, 4-b] [1, 4 ]benzoxaz?n-2 ( 3H) -ona), citidma de fenotiaz a (lH-pirimido [5, 4- b] [1, 4 ] benzot?azm-2 ( 3H) -ona) , sujeción G tal como una citidma de fenoxazma substituida (por ejemplo 9- (2-ammoetoxi )-H-p?pm?do[5,4-b] [l,4]benzoxazm-2(3H)-ona) , citidina de carbazol (2H-p?r?m?do [4 , 5-b] mdol-2-ona) , citidma de piridoindol (H-pirido [3 ' , 2 ' : 4 , 5] pirrólo [2 , 3-d] p?pm?d?n-2-ona) . Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las cuales la base de pipmidma o purina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenma, 7-deazaguanos?na, 2-ammop?r?d?na y 2-pipdona. Las nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en Pat. de EE.UU. No. 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Eng eermg, paginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y aquellas descritas por Englisch et al . , Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen las pirimidmas 5-subst?tu?das, 6-azap?r?m?dmas y pupnas N-2, N-6 y 0-6 substituidas, incluyendo 2-ammoprop?ladenma, 5-propmiluracil y 5-propm?lc?tos?na . Se ha demostrado que las substituciones de 5-met?lc?tos?na incrementan la estabilidad dúplex de ácido nucleico por 0.6-1.2. grados C. (Sanghvi et al , Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp . 276-278) y son substituciones base ejemplificativas, por ejemplo, cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2 ' -O-metoxietil . Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a: Pat. de EE.UU. No. 3,687,808, así como también Pats. de EE.UU. Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Otra modificación de oligonucleótidos antisentido comprende enlazar de manera química al oligonucleótido una o más porciones o conjugados que aumentan la actividad, distribución celular o toma celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladotes, moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, glicoles de polietileno, poliéteres, grupos que aumentan las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que aumentan las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, lípidos de catión, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceinas, rodaminas, coumarinas, y tintes. Grupos que aumentan las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la toma de oligómero, aumentan la resistencia de oligómero a degradación, y/o refuerzan la hibridización específica de la secuencia con ARN. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la toma de oligómero, distribución, metabolismo o excreción. Las porciones de conjugado incluyen pero no se limitan a porciones de lípido tal como una porción de colesterol (Letsinger et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al . , Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), u tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al . , Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al . , Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al . , Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecil (Saison-Behmoaras et al . , EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al . , FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al . , Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecyl-rac-glicerol o trietil-amonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al . , Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al . , Nucí.

Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamma o una cadena de glicol de polietileno (Manoharan et al . , Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido acético de adamantano (Manoharan et al . , Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción de palmitilo (Mishra et al . , Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una porción de hexilammo-carbonil-oxicolesterol o octadecilamma . Los oligonucleotidos de la invención también pueden conjugarse para activar las substancias de fármaco, por ejemplo, aspirina, warfar a, fenilbutazona, íbuprofen, suprofen, fenbufen, quetoprofen, (S) - (+) -pranoprofen, carprofen, dansilsarcosma, ácido 2, 3, 5-tr?yodobenzó?co, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepma, mdometicma, un barbiturato, una cefalospor a, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacterial o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. No. Ser. 09/334,130 (presentada el 15 de Junio de 1999) y las patentes de Estados Unidos Nos.: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; ,541,313 5,545, 730; 5,552,538 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731 5,591,584; 5,109,124 5,118,802 5,138,045; 5,414,077 5,486, 603; 5,512,439 5,578,718 5, 608,046; 4,587,044 4, 605,735; 4,667,025 4,762,779 4,789,737; 4,824,941 4,835,263; 4,876,335 4, 904,582 4,958,013; ,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia . No es necesario para todas las posiciones en un compuesto dado que se modifiquen, y de hecho más de una de las modificaciones arriba mencionadas puede incorporarse en un compuesto único o aún en un nucleósido único dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región en donde el oligonucleótido se modifica para conferir en el oligonucleótido resistencia incrementada a la degradación de nucleasa, toma celular incrementada, y/o afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un substrato para enzimas capaces de desdoblar híbridos de ARN:ADN o ARN : ARN . A manera de ejemplo, RNase H es una endonucleasa celular que desdobla el filamento de ARN de un dúplex ARN: ADN. La activación de RNase H, por lo tanto, da como resultado el desdoblamiento del ARN objetivo, aumentado así grandemente la eficiencia de inhibición de oligonucleótido de la expresión genética. Consecuentemente, los resultados comparables con frecuencia pueden obtenerse con oligonucleótidos más cortos cuando los oligonucleótidos quiméricos se utilizan, en comparación con deoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan a la misma región objetivo. Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o imitaciones de oligonucleótido como se describe arriba. Los oligonucleótidos de antisentido quiméricos ejemplificativos incorporan al menos una azúcar 2' modificada (preferentemente 2 ' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la 3' terminal para conferir resistencia de nucleasa y una región con al menos u 2'-H azúcares contiguas para conferir actividad de RNase H. Tales compuestos también se han referido en la materia como híbridos y espaciomeros . Los espaciomeros ejemplificativos tienen una región de azúcares 2' modificadas (preferentemente 2 ' -O- (CH2) 2-0-CH3) en la 3'- terminal y en la 5' terminal separadas por al menos una región que tiene al menos 4 azúcares 2'-H contiguos y pueden incorporar enlaces de estructura de fosforotioato. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, Pats. de EE.UU. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los compuestos antisentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden hacerse de manera conveniente o rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. El equipo de tales síntesis se vende por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para tales síntesis conocidas en la materia puede emplearse adicional o alternativamente. Se sabe bien utilizar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o de otra manera asociarse con otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas objetivo del receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la toma, distribución y/o absorción. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales formulaciones que ayudan en la toma, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, Pats. de EE.UU. Nos. 5,108,921; 5,354,844; ,416,016; 5, 459, 127; 5,521,291 5,543,158; 5,547,932; 5,583, 020; 5,591,721; 4,426,330 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213, 804; 5,227, 170 5,264,221; 5,356,633; 5,395, 619; 5,416,016; 5, 417, 978 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527, 52í 5,534,259, 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Otros ejemplos de los oligonucleótidos antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos que se enlazan covalentemente a las porciones orgánicas, tales como aquellas descritas en WO 90/10048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli- (L-lisina) . Aún, los agentes de intercalado, tal como elipticina, y agentes de alquilación o complejos de metal pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido sentido o antisentido para la secuencia de nucleótidos objetivo. Los oligonucleótidos antisentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos objetivo por cualquier método de transferencia de gen, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaP04, electroporación, o al utilizar los vectores de transferencia de gen tal como virus Epstein-Barr. En un procedimiento ejemplificativo, un oligonucleótido sentido o antisentido se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo se contacta con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo . Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados del retrovirus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copia dobles designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Oligonucleótidos antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo por formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, como se describe en WO 91/04753. Tales moléculas de unión a ligando, incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se enlazan a receptores de superficie celular. En general, la conjugación de la molécula de unión a ligando preferentemente no interfiere subtancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o bloquear la entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos objetivo por la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido antisentido-lípido se disocia preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena. Las moléculas de ADN o ARN antisentido son generalmente al menos aproximadamente 5 nucleótidos en longitud, alternativamente al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, o 1000 nucleótidos en longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos referenciada más o menos 10% de esa longitud referenciada . Los ADNs y ARNs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes m vivo . Ya Se ha demostrado que los oligonucleotidos antisentido cortos pueden importarse en células donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones tracelulares causadas por su toma restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para aumentar su toma, por ejemplo, al sustituir sus grupos fosfodiester cargados de manera negativa por grupos no cargados. Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el acido nucleico se transfiere en células cultivadas in vi tro, o m vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de acido nucleico en células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de gen -in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por liposoma de proteína (Dzau et al . . Trends ín Biotechnology 11, 205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que tiene como objetivo las células objetivo, tales como anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Donde los liposomas se emplean, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden utilizarse para tener como objetivo y/o facilitar la toma, por ejemplo, proteínas de cápsido o fragmentos de las mismas trípicas para un tipo celular particular, los anticuerpos para proteínas que experimentan la internalización en ciclado, las proteínas que tienen como objetivo localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al . , J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990) . Para revisión de procedimientos de terapia genética y marcador de gen ver Anderson et al . , Science 256, 808-813 (1992). Los polipéptidos de antagonista de c-met y moléculas de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse a manera de diagnóstico para tipificación del tejido, en donde los polipéptidos de c-met hiperestabilizados pueden expresarse de manera diferencial en un tejido en comparación con otro, preferentemente en un tejido enfermo en comparación con un tejido normal del mismo tipo de tejido. La invención comprende métodos para seleccionar compuestos para identificar aquellos que modulan c-met hiperestabilizado. Los ensayos de selección para candidatos de fármaco de antagonista se diseñan para identificar compuestos que se enlazan o componen con el polipéptido de c-met hiperestabilizado, o de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos de c-met hiperestabilizados con otras proteínas celulares, incluyendo por ejemplo, inhibición de la expresión de polipéptido de c-met hiperestabilizado de células. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de proteína-proteína, ensayos de selección bioquímica, inmunoensayos, y ensayos a base de célula, que se caracterizan bien en la materia. Todos los ensayos para antagonistas son comunes en que se llaman para contactar el candidato de fármaco con un polipéptido de c-met hiperestabilizado bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen . En ensayos de unión, la interacción en la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido de c-met hiperestabilizado o el candidato de fármaco se inmoviliza en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microconcentración, por uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se realiza al revestir la superficie sólida con una solución del polipéptido de c-met hiperestabilizado y secar. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido de c-met hiperestabilizado a inmovilizarse puede utilizarse para sujetarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza al agregar el componente no inmovilizado, que puede marcarse por una etiqueta detectable, al componente inmvolizado, por ejemplo, la superficie revestida que contiene el componente sujeto. Cuando la reacción se completa, los componentes no reaccionados se remueve, por ejemplo, al enjuagar, y los complejos sujetos en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada en la superficie indica que ocurrió la formación del complejo. Donde el componente originalmente no inmovilizado no lleva una etiqueta, la formación del complejo puede detectarse, por ejemplo, al utilizar un anticuerpo etiquetado que une de manera específica el complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con pero no se une a un polipéptido de c-met hiperestabilizado, su interacción con c-met hiperestabilizado puede ensayarse por métodos bien conocidos para detectar interacciones de proteína-proteína. Tales ensayos incluyen planteamientos tradicionales, tales como, por ejemplo, degradación, co- inmunoprecipitación, y co-purificación a través de los gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones de proteína-proteína pueden monitorearse al utilizar un sistema genético a base de levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) . 340:245-246 (1989); Chien et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray and Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores de transcripción, tal como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios moduladores físicamente discretos, uno actuando como el dominio de unión a ADN, el otro funcionando como el dominio de activación de transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio de unión de ADN de GAL4, y otro, en el cual las proteínas de activación candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen reportero GALl-lacZ bajo control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de actividad de GAL4 a través de la interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos de interacción se detectan con un substrato cromogénico para ß-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos está comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse para trazar los dominios de proteína incluidos en interacciones de proteína específicas así como también a residuos de aminoácido de punta que son cruciales para estas interacciones . Los compuestos que interfieren con la interacción de c-met hiperestabilizado y otros componentes intra- o extracelulares pueden probarse como sigue: usualmente una mezcla de reacción se prepara conteniendo c-met hiperestabilizado y el componente intra- o extracelular bajo condiciones y por un tiempo suficiente que permiten la interacción y unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se corre en la ausencia y en la presencia del compuesto prueba. Además, un placebo puede agregarse a una tercer mezcla de reacción para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitorea como se describe en la presente arriba. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto prueba indica que el compuesto prueba interfiere con la interacción del compuesto prueba y su compañero de reacción.

Para ensayar los antagonistas, el compuesto a seleccionarse para una actividad particular puede agregarse a una célula que expresa el c-met hiperestabilizado, y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés indica que el compuesto es un antagonista para el polipeptido de c-met hiperestabilizado . El polipéptido de c-met hiperestabilizado puede etiquetarse, tal como por radioactividad, de manera que el número de moléculas de polipéptido de c-met hiperestabilizado presentes en la célula pueden utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. Un antagonista de c-met hiperestabilizado potencial es una construcción de ADN o ARN antisentido preparada utilizando tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm al hibpdar a ARNm objetivo y prevenir la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión genética a través de ARN o ADN antisentido o la formación de triple hélice, ambos de tales métodos se basan en la unión de un pol ucleotido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de c-met hiperestabilizado maduro puede utilizarse para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares bases en longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementaria a una región del gen incluido en la transcripción (triple hélice-ver Lee et al . , Nucí . Acids Res . , 6:3073 (1979); Cooney et al . , Science, 241: 456 (1988); Dervan et al . , Science . 251:1360 (1991)), previniendo así la transcripción y la producción del polipéptido de c-met hiperestabilizado. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibridiza al ARNm ín vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido de c-met hiperestabilizado (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos arriba también pueden suministrarse a células de manera que el ADN o ARN antisentido pueden expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido de c-met hiperestabilizado. Cuando el ADN antisentido se utiliza, se prefieren los oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo, entre aproximadamente posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos de gen objetivo. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar el desdoblamiento específico de ARN. Ribozimas actúan por hibridización específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por desdoblamiento endonucleolítico. Los sitios de desdoblamiento de ribozima específicos dentro de un ARN potencial objetivo pueden identificarse por técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de filamento único y componerse de deoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de triple hélice a través de reglas de formación de pares base Hoogsteen, que generalmente requiere estiramientos dimensionables de purinas o pirimidinas en un filamento de un dúplex. Para detalles adicionales, ver, por ejemplo, publicación PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden identificarse por cualquiera de uno o más ensayos de selección tratados arriba en la presente y/o por cualquier otra técnica bien conocida por aquellos expertos en la materia. En una modalidad, se prefieren los anticuerpos de internalización. Los anticuerpos pueden poseer ciertas características, o modificarse para poseer tales características, para aumentar el suministro de anticuerpos en las células. Las técnicas para lograr esto se conocen en la materia. En todavía otra modalidad, un anticuerpo puede expresarse en una célula objetivo al introducir un ácido nucleico capaz de expresar el anticuerpo en una célula objetivo. Ver, por ejemplo, Pats. de EE.UU. Nos. 6,703,019; 6,329,173; y Pub. PCT No. 2003/077945. Las lipofecciones o liposomas también pueden utilizarse para suministrar el anticuerpo en las células. Donde los fragmentos de anticuerpo se utilizan, el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo es generalmente ventajoso. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse las moléculas de péptido que retienen la capacidad para unir la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse de manera química y/o producirse por tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al, Proc, Nati. Acad. Sci. USA. 90: 7889-7893 (1993). La entrada de polipéptidos moduladores en células objetivo puede aumentarse por métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, ciertas secuencias, tales como aquellas derivadas de VIH Tat o la proteína Antennapedia homeodomain son capaces de dirigir la toma eficiente de proteínas heterólogas a través de membranas celulares. Ver, por ejemplo, Chen et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329. Los anticuerpos de antagonista de c-met de la invención pueden ser cualquier anticuerpo que es capaz de interferir con la actividad del c-met. Algunos ejemplos específicos incluyen un anticuerpo anti-c-met que comprende: (a) al menos una, dos, tres, cuatro o cinco secuencias de región hipervariable (HVR) seleccionadas del grupo que consiste de: (i) HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A17, en donde A1-A17 es KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO: 1) (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, en donde B1-B7 es WASTRES (SEQ ID NO:2) (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, en donde C1-C9 es QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 3) (iv) HVR-Hl que comprende la secuencia D1-D10, en donde D1-D10 es GYTFTSYWLH (SEQ ID NO: 4) (v) HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, en donde E1-E18 es GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 5) y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia Fl-Fll, en donde Fl-Fll es XYGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 6) y X no es R; y (b) al menos una HVR variante, en donde la secuencia de HVR variante comprende modificación de al menos un residuo de la secuencia representada en SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4, 5 o 6. En una modalidad, HVR-L1 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, HVR-L2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2. En una modalidad, HVR-L3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3. En una modalidad, HVR-Hl de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4. En una modalidad, HVR-H2 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. En una modalidad, HVR-H3 de un anticuerpo de la invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6. En una modalidad, HVR-H3 comprende TYGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 7) . En una modalidad, HVR-H3 comprende SYGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 8) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención que comprende estas secuencias (en combinación como se describe en la presente) es humanizado o de humano. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs, en donde cada HVR comprende, consiste o consiste esencialmente de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8, y en donde SEQ ID NO:l corresponde a una HVR-Ll, SEQ ID NO: 2 corresponde a una HVR-L2, SEQ ID NO: 3 corresponde a una HVR-L3, SEQ ID NO: 4 corresponde a una HVR-Hl, SEQ ID NO: 5 corresponde a una HVR-H2, y SEQ ID NOs: 6, 7 o 8 corresponden a una HVR-H3. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2, y HVR-H3, en donde cada uno, en orden, comprende SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 7. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR- Hl, HVR-H2, y HVR-H3, en donde cada uno, en orden, comprende SEQ ID NO:l, 2, 3, 4, 5 y 8. HVRs variantes en un anticuerpo de la invención pueden tener modificaciones de uno o más residuos dentro de la HVR. En una modalidad, una variante de HVR-L2 comprende 1-5 substituciones (1, 2, 3, 4 o 5) en cualquier combinación de las siguientes posiciones: Bl (M o L) , B2 (P, T, G o S), B3 (N, G, R o T), B4 (I, N o F) , B5 (P, I, L o G) , B6 (A, D, T o V) y B7 (R, I, M o G) . En una modalidad, una variante de HVR-Hl comprende 1-5 substituciones (1, 2, 3, 4 o 5) en cualquier combinación de las siguientes posiciones: D3 (N, P, L, S, A, I), D5 (I, S o Y), D6 (G, D, T, K, R) , D7 (F, H, R, S, T o V) y D9 (M o V) . En una modalidad, una variante de HVR-H2 comprende 1-4 substituciones (1, 2, 3 o 4) en cualquier combinación de las siguientes posiciones: E7 (Y), E9 (I), ElO (T), E14 (T o Q) , E15 (D, K, S, T o V), E16 (L) , E17 (E, H, N o D) y Eld (Y, E o H) . En una modalidad, una variante de HVR-H3 comprende 1-5 substituciones (1, 2, 3, 4 o ) en cualquier combinación de las siguientes posiciones: Fl (T, S), F3 (R, S, H, T, A, K) , F4 (G) , F6 (R, F, M, T, E, K, A, L, W) , F7 (L, I, T, R, K, V), F8 (S, A), FIO (Y, N) y Fll (Q, S, H, F) . La letra (s) en paréntesis después de cada posición indica un aminoácido de substitución ilustrativo (es decir, reemplazo) ; como sería evidente para un experto en la materia, la estabilidad de otros aminoácidos como aminoácidos de substitución en el contexto descrito en la presente pueden valorarse de manera rutinaria utilizando técnicas bien conocidas en la materia y/o descritas en la presente. En una modalidad, una HVR-Ll comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, Fl en una HVR-H3 variante es T. En una modalidad, Fl en una HVR-H3 variante es S. En una modalidad, F3 en una HVR-H3 variante es R. En una modalidad, F3 en una HVR-H3 variante es S. En una modalidad, F7 en una HVR-H3 variante es T. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es T o S, F3 es R o S, y F7 es T. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es T, F3 es R y F7 es T. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es S. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es T, y F3 es R. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es S, F3 es R y F7 es T. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es T, F3 es S, F7 es T, y F8 es S. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H3 variante en donde Fl es T, F3 es S, F7 es T, y F8 es A. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-H3 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl y HVR-H2 en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 y 5. En algunas modalidades, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura de cadena pesada del subgrupo III de humano. En una modalidad de estos anticuerpos, la secuencia consenso de estructura comprende la substitución en la posición 71, 73 y/o 78. En algunas modalidades de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una modalidad de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura de cadena ligera ?l de humano . En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-L2 variante en donde B6 es V. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-L2 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5 y 6. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-L2 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5 y 7. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-L2 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 y HVR-H3, en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 5 y 8. En algunas modalidades, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura de cadena pesada del subgrupo III de humano. En una modalidad de estos anticuerpos, la secuencia consenso de estructura comprende la substitución en la posición 71, 73 y/o 78. En algunas modalidades de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una modalidad de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura de cadena ligera ?l de humano. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H2 variante en donde E14 es T, E15 es K y E17 es E. En una modalidad, un anticuerpo de la invención comprende una HVR-H2 variante en donde E17 es E. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-H3 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, y HVR-H3 en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 y 6. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-H2 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, y HVR-H3, en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, y 7. En algunas modalidades, dicho anticuerpo de HVR-H2 variante comprende además HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, y HVR-H3, en donde cada una comprende, en orden, la secuencia representada en SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, y 8. En algunas modalidades, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura de cadena pesada del subgrupo III de humano. En una modalidad de estos anticuerpos, la secuencia consenso de estructura comprende la substitución en la posición 71, 73 y/o 78. En algunas modalidades de estos anticuerpos, la posición 71 es A, 73 es T y/o 78 es A. En una modalidad de estos anticuerpos, estos anticuerpos comprenden además una secuencia consenso de estructura ligera ?l de humano. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que aumenta su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los siguientes son ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que varias otras modalidades pueden practicarse, dada la descripción general proporcionada arriba. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención en ninguna manera . EJEMPLOS Materiales y Métodos Cul tivo Celular Estirpes celulares se obtienen de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) , NCl División of Cáncer Treatment and Diagnosis tumor repository, o Japanese Health Sciences Foundation. Todas las estirpes celulares con la excepción de 293 y Rata ÍA se mantienen en RPMI 1640 complementado con 10% FBS (Sigma) , penicilina/estreptomicina (GIBCO) , y 2 mM de L-glutamina. Las células 293 y Rata ÍA se mantienen en DMEM rica en glucosa y complementada como se describe . Plásmidos y es tirpes cel ulares estables Met WT-V5/His de longitud completa se describe previamente (Kong-Beltran et al, 2004). Met WT-V5/HÍS sirvió como un templado para producir una mutación puntual Y1003F utilizando cebadores descritos previamente (Peschard et al, 2001) a través de Mutagénesis dirigida por Sitio QuikChange (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Exón 14 se elimina al utilizar dos conjuntos de cebadores creando nuevos sitios de restricción Nhel que flanquean el Met exón 14 (aa 963-1011) a través de Mutagénesis Dirigida por Sitio QuikChange y después se digiere con Nhel seguido por religación del plásmido. Las mutaciones se verifican por secuenciación de ADN. Para generar estirpes celulares estables Met en células de Rata ÍA, 10 µg of cada pRK5TKneo, Met WT-V5/HÍS, Met Y1003F -V5/His, o Met ?Exl4-V5/His ADN se digiere con Kpnl y se purifica (Qiagen) . Las células de Rata ÍA se transfectan con 4 µg de cada ADN en una placa de 6 cavidades a través de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El siguiente día las células se tripsinizan y siembran en placas de 10 cm. Veinticuatro horas después 500 µg/ml G418 (Sigma) se agrega. La selección continúo por aproximadamente dos semanas antes de seleccionar los clones positivos Met por FACS utilizando anticuerpo 3D6 (ver Pat. de EE.UU. No. 6,099,841) y coloración PE. Una célula se coloca por cavidad. Los clones expandidos se lisan y prueban para Met a través de inmunoblotting con anticuerpo V5 (Invitrogen). Inmunoprecipitación y análisis Western blot Para análisis de expresión de proteína en especímenes de tejido congelados, el tejido (~100 mg) se homogeniza en 200 µl de regulador de lisis celular (Señalización Celular), que contiene cocktail de inhibidor de proteasa (Sigma) , cocktails I y II del inhibidor de fosfatasa (Sigma), 50 mM de fluoruro de sodio, y 2 mM de ortovanadato de sodio utilizando un homogeneizador Polytron® (Kinematica) . Las muestras se lisan además por agitación gentil por 1 hora a 4°C, antes del predespeje con una mezcla de Flujo Rápido de Sefarosa de Proteina A (Amersham) y Flujo Rápido de Sefarosa 4 de Proteína G (Amersham) . Las concentraciones de proteína se determinan utilizando reactivo Bradford (BioRad) . Las proteínas (20 µg) se resuelven de manera subsiguiente por SDS-PAGE, transfectan a membrana de nitrocelulosa, y se someten a inmunoblotting con anticuerpos Met (DL-21, Upstate) o ß-actina (1-19, Santa Cruz). Las proteínas se visualizan por qumiluminescencia aumentada (ECL Plus, Amersham) . Para estudios de coimunoprecipitación incluyendo Met y Cbl transfectados, 3 µg de cada construcción Met y 3 µg de señal Cbl se transfectan en 293 células utilizando FuGENEd (Roche). El siguiente día las células se estimulan con 100 ng/ml de rhuHGF por 30 minutos antes de recolectar utilizando 1% regulador de lisis NP40 [50 mM de Tris (pH 7.45), 150 mM de NaCl, y 1% Nonidet 40] que contiene la tableta de cocktail de inhibidor de proteasa completa (Roche) y cocktail II de inhibidor de fosfatasa. Los residuos celulares se centrifugan y 1 mg de lisatos se inmunoprecipitan con ya sea 1.5 µl de anticuerpos V5 (Invitrogen) o 2 µg de Cbl (C-15, Santa Cruz) a 4°C con rotación durante la noche seguido por incubación con la Proteína G o perlas A por 2 hrs. El regulador 2X muestra (Invitrogen) que contiene 20 mM de DTT (Sigma) se agrega y las muestras se hierven por 5 minutos. Las muestras se cargan en 4-12% de geles de Tris-glicina (Invitrogen) y se transfieren a 0.45 µm de membranas de nitrocelulosa (Invitrogen). La membrana se bloquea con 5% leche sin gasa por 1 hr seguido por inmunoblotting con anticuerpos V5, marcador policlonal (Sigma), o P-Tyr (4G10, Upstate) . Para estudios de unión que contienen Cbl endógeno, 293 células se transfectan con 6 µg de cada construcción de ADN por placa de 10 cm utilizando FuGENE6. El siguiente día las células se estimulan con 100 ng/ml de rhuHGF por 30 minutos antes de recolectarse. Las muestras se inmunoprecipitan con 2 µg de anticuerpos Cbl o 1.5 µg de V5, seguido por inmunoblotting con anticuerpos V5 o Cbl. La mancha inmunoprecipitada de V5 se separa utilizando regulador de separación western blot Restore (Pierce) y se vuelve a sondear con P-Met Y1003 (Biosource) , P-Met Y1234/Y12345 (Cell Signaling), P-Met Y1349 (Cell Signaling), o P-Met 1365 (Biosource) . Para estudios de degradación, 293 células se transfectan con 0.25 µg de pRK5TKneo, Met WT-V5/His, Met Y1003F-V5/His, o Met ?Exl4-V5/His mutante utilizando FuGENEd en una placa de 6 cavidades . El siguiente día las células se tratan con 10 µg/ml de cicloheximida (Sigma) por los tiempos indicados. Los lisatos se analizan por SDS-PAGE y la membrana se somete a inmunoblotting con anticuerpos V5 o actina . Ensayo de Ubigui tina ción 293 células se transfectan con 3 µg de construcciones Met, 2 µg de Cbl-marcador, 1 µg de HA-ubiquitina, y vectores vacío pRK5TKneo o pFlag5a cuando sea necesario para tener 6 µg de ADN total por muestra utilizando FuGENE6. El siguiente día las células se tratan con 25 µM de MG-132 (Calbiochem) por 4 horas antes de recolectarse. Las células se lisan en 1% regulador de lisis NP-40 que contiene inhibidores, 25 µM de MG-132, y 10 mM de N-etilmaleimida . Los lisatos (1 mg) se inmunoprecipitan con 1.5 µg de anticuerpo V5 y se someten a inmunoblotting con anticuerpo de ubiquitina (P4D1, Santa Cruz) y después se separan y se vuelven a sondear con anticuerpo V5. Estudios de Señalización de Célula e Inhibición Para examinar la señalización prolongada en clones estables H226, H596, H358, o Rata ÍA-Met, las células se enjuagan con PBS después se privan de suero en medio RPMI o DMEM que contiene 0.5% BSA, 2 mM de glutamina, y penicilina/estreptomicina por una hora. rhuHGF o el anticuerpo monoclonal anti-Met agonístico, 3D6 (Genentech) , se agrega al medio libre de suero por 10 minutos. La monocapa de células se enjuaga entonces con PBS e incuban con medio libre de suero hasta su extracción en los tiempos indicados. Las células se enjuagan entonces una vez con PBS, lisan con regulador muestra IX SDS que contiene IX DTT (Invitrogen), sonican brevemente, y hierven por 5 minutos. Para analizar la inhibición del receptor Met, las células privadas de suero tuvieron anticuerpo 5D5 anti-Met 5D5 agregado al medio libre de suero a concentraciones indicadas por 30 minutos. Las células se estimulan entonces por 15 (para análisis de activación Met) o 30 minutos (para análisis Akt y MAPK) con 100 ng/ml de rhuHGF y lisan con regulador de muestra IX SDS que contiene DTT. Las muestras hervidas se analizan por SDS-PAGE y se someten a inmunoblotting con P-Met (Y1230/Y1234/Y1235, BioSource), P-Met ( Y1234/Y1235) , Met (DL-21), P-MAPK (ElO, Cell Signaling), P-MAPK (Cell Signaling), P-Akt (587F11, Cell Signaling), o Akt (Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios utilizados son anti-conejo-AlexaFluor680 conjugado (Molecular Probes) o anti-ratón-IRDyedOO conjugado (Rockland Immunochemicals) . Las proteínas transferidas en membranas de nitrocelulosa se detectan por exploración infrarroja utilizando Odyssey (LiCor) de acuerdo a las instrucciones de western blotting recomendadas por el fabricante seguidas por cuantificación. Para ensayos de viabilidad celular, las células se colocan por triplicado en ~lxl04 células por cavidad en placas de 96 cavidades en RPMI que contiene 0.5% FBS (medio de ensayo) durante la noche, antes de la estimulación con medio de ensayo que contiene 50 ng/ml de rhuHGF. El medio de ensayo sin rhuHGF se agrega a cavidades no estimuladas. Después de 72 hrs, la viabilidad celular se mide utilizando el Ensayo de Viabilidad Celular Luminescente Celltiter-Glo (Promega). Los índices de estimulación se determinan al dividir las unidades de viabilidad celular promedio de cultivos estimulados por HGF por las unidades de viabilidad celular promedio de cultivos no estimulados. Los índices de estimulación promedio se determinan de un mínimo de 3 experimentos separados. Los ensayos de inhibición de crecimiento se llevan a cabo en una manera similar, con ya sea OA-5D5 o un Ig de control agregado al momento de la estimulación de HGF. Modelo de Xenoinjerto m vivo Los ratones desnudos atímicos hembra (Charles River, Hollister) se inoculan subcutáneamente con grupos de estirpes celulares estables de Rata ÍA que expresan Met WT, Met Y1003F, Met ?Exl4, o vector control (5 millones de células/ratón, n=5). 10 mg/kg de anticuerpo de agonista anti-Met 3D6 que reconoce solamente Met de humano se administra para la estimulación del receptor Met, mtra peritonealmente, una vez a la semana. Los tumores se miden dos veces por semana utilizando un calibre digital y los volúmenes del tumor se calculan utilizando la siguiente ecuación: Volumen de Tumor (mm3)= (p/6) (A) (B) (B) . A= ancho más largo; B= ancho más corto. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se colocan en secuencias todos los exones de codificación de Met de un panel de especímenes de tumor de colón y pulmón que representan tumores primarios, estirpes celulares de tumor, y modelos de xenoinjerto de tumor primario. En nuestro esfuerzo por colocar en secuencias, se identificaron mutaciones heterocigosas somáticas en especímenes de tumor de pulmón primario en el exón 14 de flanqueo de regiones mtrónicas (Fig. 1). Estas mutaciones fueron específicas de tumor y no se identifican en tejido de pulmón no neoplástico de los mismos individuos (datos no mostrados) . En H596, una línea celular de cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) , identificamos una mutación puntual homocigosa en el sitio de donador de unión 36p. La presencia de mutaciones dentro del consenso de sitio de unión dinucleotídico y el tracto de polipirimidina aguas arriba del exón 14, combinados con la observación de que el exón 13 y el exón 15 permanecieron en fase, se sugirió que una transcripción de Met potencial que carece del exón 14 aún produciría una proteína Met funcional. Para dirigir esto, se desempeña primero la amplificación RT-PCR de ARN de Met de los tumores mutantes y la estirpe celular. Todas las tres mutaciones introcónicas resultaron en una transcripción de una longitud más corta en comparación con el tipo silvestre, consistente con la eliminación del exón 14 (datos no mostrados). También se confirmo la ausencia del exón 14 al secuenciar los productos RT-PCR y nuestros resultados mostraron una eliminación en estructura que remueve los aminoácidos L964 a D1010 de Met. De manera interesante, la forma mutante del receptor es la forma más predominantemente expresada, a pesar de las muestras de tumor siendo heterocigosas para la eliminación del exón 14 (datos no mostrados), indicando una expresión preferencial de la transcripción variante. Esto se confirma además por Western blotting demostrando la expresión predominante de una proteína Met truncada. Los especímenes que alojan estas mutaciones intronicas son tipo silvestre para K-ras, B-raf, EGFR, y HER2 en exones relevantes en secuencia (datos no mostrados). Tomados juntos, estos resultados indican la naturaleza dominante de estas mutaciones intrónicas de Met. De manera interesante, una variante de empalme Met que carece de exon 14 se ha reportado previamente en tejido de ratón normal, aunque la consecuencia funcional con respecto a tumorigénesis fue nuclear ( 20 , 21 ) . Sin embargo, no se detectó expresión de esta variante de empalme en ninguno de los especímenes de pulmón de humano normales examinados (datos no mostrados) . La falta de esta variante de empalme en tejido de humano normal se ha substanciado normalmente, como se trata previamente ( 21 ) . cADN que comprende una variante de empalme que carece de exón 14 se ha reportado en un espécimen NSCLC de humano primario; sin embargo el papel de mutagénesis somática para mediar los defectos de unión no se valora, ni fue la consecuencia funcional, si la hay, de cualquier c-met mutante que pudieron haberse expresado ( 22) . Ya que los ácidos nucleicos que comprenden variantes de unión no son no comunes en las células cancerígenas, la relevancia funcional de la variante de empalme reportada se desconoce. La eliminación del aminoácido 47 del exón 14 dentro del dominio de yuxtamembrana de Met (L964-D1010) remueve el sitio de fosforilación Y1003 necesario para unión de Cbl y subregulación del receptor activado. Los estudios previos mostraron que una mutación de Y1003F elimina la unión de Cbl y mantiene la activación de Met ( 6) . Se confirma primero la pérdida de unión de Cbl del Met mutante asociado a tumor por estudios de coimunoprecipitación . 293 células se transfectan con Met tipo silvestre (Met WT) , Met Y1003F mutante (Met Y1003F) , y el Met sin exón 14 (Met ?Exl4) por la transfección de estas construcciones de Met con Cbl-marcador en 293 células. Se observa que la unión de Cbl a Met ?Exl4 se disminuye en comparación con WT Met (Fig. 2A) y se confirma la pérdida de unión de Cbl a Met Y1003F ( 6) . La fosforilación de tirosina Cbl por Met WT y mutantes de Met fue equivalente, lo que indica que las mutaciones de Met no alteran toda la foforilación de Cbl. Nuestros datos también indican que MET WT se coinmunoprecipita con Cbl endógeno, pero no con Met ?Exl4 (Fig. 2B) que es consistente con la coexpresión observada de Met y Cbl. Además, examinamos los sitios de fosforilación de tirosina necesarios para la activación del receptor Met. Nuestros datos indican que la fosforilación de Y1234/Y1235, Y1349, y Y1365 se mantiene tanto en Met WT como Met ?Exl4 (Fig. 2B) . Como se espera, una pérdida de fosforilación de Y1003 en Met ?Exl4 se observa en contraste con Met WT (Fig. 2B) . Ya que la actividad de Cbl E3-ligasa se reporta para facilitar la degradación mediada por ubiquitina del receptor ( 6, 8) , los ensayos de ubiquitinación se llevan a cabo en células transfectadas con Met WT, Met Y1003F y Met ?Exl4. Tanto Met ?Exl4 como Met Y1003F muestran ubiquitinación atenuada en comparación con Met WT en la presencia de Cbl (Fig. 2C) . Se confirma que la fosforilación de Y1234/Y1235 se mantiene en todas las construcciones de Met y fosfo-Y1003 se pierde en los mutantes como antes (datos no mostrados). De manera interesante, Met WT menos procesado se detecta con co-expresión de Cbl en comparación con los mutantes o expresión de Met WT solo (Fig. 2C) . Estas observaciones sugieren que Met WT que une Cbl se ubiquitina preferentemente y degrada ( 6, 24 ) en contraste con el Met ?Exl4. Para determinar si la ubiquitinación disminuida de Met ?Exl4 conduce a la subregulación del receptor, las células se transfectan con construcciones de Met y se tratan con cicloheximida para bloquear nuevas síntesis de proteína. Met ?Exl4 mostró la subregulación del receptor retrasada con el tiempo en comparación con Met WT (Fig. 2D) . Met Y1003F mutante mostró resultados similares (datos no mostrados) . De manera significativa, los tumores primarios que alojan la variante de empalme del exón 14 mostraron niveles elevados de proteína Met relativos tanto al tejido de pulmón adyacente normal, acoplado al paciente como los adenocarcinomas de Met tipo silvestre (datos no mostrados), a pesar de expresar los niveles equivalentes de Met al nivel de transcripción. Además, el análisis de inmunoquímica de la expresión de Met en estos tumores del paciente con exón 14 eliminado revela fuerte expresión membranosa en todas las células neoplásticas; en contraste, expresión de Met esporádica se observa en tumores con Met WT y en tejidos adyacentes normales (datos no mostrados) . Para determinar si la subregulación disminuida de Met ?Exl4 afectó la señalización de célula corriente abajo en la estimulación de HGF, los niveles de fosforilación de Met, Akt, y MAPK se examinan en estirpes celulares de tumor NSCLC que alojan la eliminación del exón 14 (H596) o Met WT (H226 y H358). Las células H596 mostraron que tanto los niveles de fosfo-Met como fosfo-MAPK se mantienen hasta 3 horas después de la estimulación de HGF mientras que ambas estirpes celulares H226 y H358, que expresaron el receptor Met WT, mostraron una pérdida fija de fosforilación con el tiempo (Fig. 2E). De manera interesante, los niveles de fosfo-Akt no se sostienen con el tiempo a pesar de la activación inicial en respuesta a HGF. La fosforilación de Stat3 y Stat5 también se examina, pero no mostró activación elevada (datos no mostrados) . Ya que estas estirpes celulares de tumor se derivan de diferentes antecedentes genéticos, se generan estirpes celulares estables en células de Rata ÍA con vector vacío, Met WT, y Met ?Exl4 para comparación. Met ?Exl4 de Rata ÍA demostró la fosforilación MAPK prolongada, pero no la activación de Akt, en comparación con Met WT en la estimulación con el agonista Met 3D6 que activa el receptor de humano recombmante solo ( 25) (Fig. 2F, 5), corroborando los datos obtenidos de las estirpes celulares de tumor NSCLC. Las consecuencias de señalización prolongada de Met y MAPK se examina en la proliferación mediada por HGF de las células H596 que alojan el Met sin exón 14 en el contexto de un panel de 28 estirpes celulares NSCLC adicionales (Fig. 3A) . Células H596 mostraron de manera consistente el potencial proliferativo más alto en la estimulación de HGF en este panel de estirpes celulares NSCLC. Además, para valorar el crecimiento -in vivo de la eliminación de Met, los ratones se inoculan con estirpes celulares Met ?Exl4 de Rata ÍA y se comparan con Met WT de Rata ÍA por la capacidad para formar tumores. La proliferación celular incrementada se observa tanto en ambas células de Rata ÍA, Met ?Exl4 y Met Y1003F en comparación con Met WT (datos no mostrados) . En la estimulación con 3D6, las células Met ?Exl4 de Rata ÍA fueron altamente tumorigénicas y desarrollaron grandes tumores en comparación con aquellos de Met WT de Rata ÍA (Fig. 3B) . Estos resultados fueron consistentes con un papel oncogénico aumentado para el Met sin exón 14. Para determinar si los antagonistas de met podrían inhibir las células de tumor que alojan la eliminación de Met, las células H596 se tratan con un inhibidor anti-c-met conocido (también referido como anti-Met OA-5D5 ( 26) ) . Anti-Met OA-5D5 es un anticuerpo que comprende 3 polipéptidos de inmunoglobulina - una cadena ligera intacta y cadena pesada que comprende secuencias de dominio variable (mostrados en la Fig. 9), y una cadena pesada truncada N-terminalmente que comprende una porción Fc que se dimeriza con la porción Fc de la cadena pesada de longitud completa. La construcción y generación de anti-Met OA-5D5 también se describe en la Sol. de Pat. PCT No. PCT/US2004/042619 (presentada el 17 de Diciembre de 2004) . La fosforilación de Met y MAPK disminuyo con la adición de anti-Met OA-5D5 en una manera dependiente de dosis (Fig. 4A, 6) . Además, el tratamiento de las células H596 con OA-5D5 resultó en la inhibición dependiente de dosis de la proliferación celular en una manera dependiente de ligando (Fig. 4B) . Estos resultados soportan un planteamiento terapéutico que comprende tratar cánceres que expresan c-met que es hiperestabilizado (tal como un c-met mutante que muestra eliminación de la yuxtamembrana) con un antagonista de Met. A pesar de la naturaleza intrínseca de la unión aberrante en células de tumor, es preferentemente inesperado que una variante de empalme asociada a tumor codifique una proteína receptora mutante que es más lenta en degradarse de manera intracelular y que muestra actividad oncogénica incrementada. Nuestros datos sugieren fuertemente que un evento de unión, conducido por ejemplo, por mutagénesis somática, se utiliza por tumores para activar un producto genético oncogénico. En el estudio presente, la identificación de múltiples tipos de mutaciones intrónicas que afectan de manera diferencial el ensamble del empalmeosoma y selectivamente excluyen el exón 14, resalta la relevancia de tal evento mutagénico en Met. De manera interesante, las eliminaciones e inserciones dentro del dominio de yuxtamembrana aparentemente juegan un papel en la activación de ciertas tirosinas cinasa receptoras al alterar la activación y conformación del receptor del dominio cinasa (Hubbard, S Nature Rev Mol Cell Bio, 5:464, 2004). La eliminación de yuxtamembrana de KIT (Hirota et al Science 279:577, 1998) y PDGFR (Heinrich, MC . et al Science 299:708, 2003) se ha identificado en tumores estromales gastrointestinales; las repeticiones aleatorias internas dentro de la yuxtamembrana activan FLT3 en leucemia mieloide aguda (Nakao, M et al Leukemia 10: 1911, 1996). Sin embargo, nuestra identificación de una eliminación de yuxtamembrana en la presente caracteriza un mecanismo completamente diferente de activación de Met que retrasa la subregulación del receptor, resultando de esta manera en proteínas de c-met mutante con estabilidad significativamente aumentada en células cancerígenas. Estos datos sugieren que las mutaciones que conducen la subregulación del receptor pueden conducir a activación oncogenica y conducir el desarrollo del tumor . Lis ta Parcial de Referencias 1. L. Trusolmo, P. M. Comoglio, Na t Rev Cáncer 2 , 289 (Abr, 2002) . 2. C. Birchmeier, W. Birchmeier, E. Gherardi, G. F. Vande Woude, Na t Rev Mol Cell Biol 4, 915 (Die, 2003) . 3. C. Ponzetto et al . , Cell 11 , 261 (Abr 22, 1994). 4. K. M. Weidner et al , Na ture 384, 173 (Nov 14, 1996) . 5. G. Pelicci et al . , Oncogene 10, 1631 (Abr 20, 1995) . 6. P. Peschard et al , Mol Cell 8, 995 (Nov, 2001) . 7. P. Peschard, N. Ishiyama, T. Lin, S. Lipkowitz, M. Park, J Biol Chem 279, 29565 (Jul 9, 2004). 8. A. Petrelli et al, Na ture 416, 187 (Mar 14, 2002). 9. K. Shtiegman, Y. Yarden, Semm Cáncer Biol 13, 29 (Feb, 2003) . 10. M. D. Marmor, Y. Yarden, Oncogene 23, 2057 (Mar 15, 2004). 11. P. Peschard, M. Park, Cáncer Cell 3, 519 (Jun, 2003) . 12. J. M. Siegfned et al , Ann Thorac Surg 66, 1915 (Die, 1998) . 13. P. C. Ma et al , Anticancer Res 23, 49 (Ene-Feb, 2003) . 14. B. E. Elliott, W. L. Hung, A. H. Boag, A. B. Tuck, Can J Physiol Pha rma col 80, 91 (Feb, 2002) . 15. C. Seidel, M. Borset, H. Hjorth-Hansen, A. Sundan, A. Waage, Med Oncol 15, 145 (Sep, 1998) . 16. G. Maulik et al , Cytoguine Growth Fa ctor Rev 13, 41 (Feb, 2002) . 17. R. Wang, L. D. Ferrell, S. Faouzi, J. J. Maher, J. M. Bishop, J Cell Biol 153, 1023 (28 de Mayo de 2001) . 18. L. Schmidt et al , Na t Genet 16, 68 (Mayo, 1997). 19. M. Jeffers et al , Proc Na ti Acad Sci U S A 94, 11445 (Oct 14, 1997) . 20. C. C. Lee, K. M. Yamada, J Biol Chem 269, 19457 (Jul 29, 1994) . 21. C. M. Baek, S. H. Jeon, J. J. Jang, B. S. Lee, J. H. Lee, Exp Mol Med 36, 283 (Ago 31, 2004) . 22. P. C. Ma et al , Cáncer Res 65, 1479 (Feb 15, 2005). 23. P. C. Ma et al , Cáncer Res 63, 6272 (Oct 1, 2003). 24. M. Jeffers, G. A. Taylor, K. M. Weidner, S. Omura, G. F. Vande Woude, Mol Cell Biol 17, 799 (Feb, 1997) . 25. K. Ohashi et al , Na t Med 6, 327 (Mar, 2000). 26. Schwall, R. et al Proc Am Assoc Cáncer Res 44, 1424 (2004) .

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES 1. Un antagonista que inhibe la actividad de señalización de c-met de un polipéptido de c-met hiperestabilizado de humano, en donde el polipéptido de c-met hiperestabilizado comprende una eliminación de al menos una porción del exón 14 de manera que su degradación se disminuye en comparación con c-met tipo silvestre, y en donde el polipéptido de c-met hiperestabilizado tiene actividad de señalización del c-met.
2. 2. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista es un anticuerpo que se une a un epítope formado por el empalme en estructura del exón 13 y el exón 15 de c-met de humano.
3. 3. El antagonista de la reivindicación 1, en donde al menos una porción del exón 14 de polipéptido de c-met hiperestabilizado se elimina.
4. 4. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista es un ARN inhibidor que preferentemente inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de empalme de c-met en donde el exón 13 se empalma al exón 15.
5. 5. El antagonista de la reivindicación 1, en donde la inhibición de la actividad de señalización de c-met mediante el antagonista comprende el aumento de la degradación celular de la proteína de c-met hiperestabí1izado .
6. 6. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista se enlaza a una toxina.
7. 7. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista no se une específicamente al polipéptido de c-met tipo silvestre.
8. 8. El antagonista de la reivindicación 1, en donde el antagonista no inhibe substancialmente la actividad del polipéptido de c-met tipo silvestre.
9. 9. Un método para tratar un tumor en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones precedentes a un sujeto, mediante lo cual se trata el tumor.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde se determina que el tumor comprende c-met hiperestabilizado .
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde se determina que el tumor comprende c-met mutante que comprende la eliminación de al menos una porción del exón 14.
12. 12. El método de la reivindicación 9, en donde el método comprende administrar el antagonista junto con un agente que induce la degradación de la proteína receptora.