JP2012232979A - 過剰に安定化したc−metを調節するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトの過剰に安定化したc-metポリペプチドのc-metシグナル伝達活性を阻害するアンタゴニストであって、過剰に安定化したc-metポリペプチドがエキソン14の少なくとも一部を欠失しているために野生型のc-metに比べてその分解が減少しており、過剰に安定化したc-metポリペプチドがc-metシグナル伝達活性を有するものである、アンタゴニスト。
【選択図】なし
Description
この出願は、米国特許法規則1.53(b)(1)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法119(e)に基づき、2005年3月25日に出願の仮出願第60/665,482号の優先権を主張し、出典明記によりここにその内容全体を援用するものである。
本発明は、一般に、分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。より具体的には、本発明は、HGF/c-metシグナル伝達経路の修飾因子と該修飾因子の使用に関する。
HGFは、多くの異なる種類の細胞に対して分裂促進活性、細胞運動促進活性及び形態形成活性を有する肝葉由来の多能性因子である。HGF作用は特定のチロシンキナーゼであるc-metに媒介されており、異常なHGF及びc-metの発現は様々な腫瘍において観察されることが多い。例としてMaulik ら, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59、 Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867を参照。HGF/c-Metシグナル伝達経路の調節機能は腫瘍発達及び転移に関係する。例としてTrusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照。
特許出願及び刊行物を含む、本明細書中で引用したすべての文献は、出典明記によってそれらの全体を援用する。
本発明は、特定のヒトの腫瘍が細胞内の下方制御の速度を低減するが細胞シグナル伝達できる変異したc-metタンパク質を発現するという新規の発見に少なくとも一部が基づいている。これらの「過剰に安定化した」c-metタンパク質は野生型c-metに比べて発癌活性が増加していることが明らかとなった。本明細書中で示されるように、これらの腫瘍は抗c-met阻害剤により阻害されうる。過剰に安定化したc-met活性の阻害により多くの治療的有用性が生じる。例えば、これらc-met変異体は特に発癌性があるので、その阻害を標的とすることにより、それら変異体により生じる腫瘍形成を減少することが期待される。さらに、c-metは正常細胞を含め多くの細胞種類にみられるので、腫瘍特異的c-met変異体を特異的に標的とする能力は、例えばc-met阻害治療の副作用を低減する際に特に有用である。本発明は、本明細書中に記載の発見に基づく方法及び組成物を提供し、過剰に安定化したc-metを有する腫瘍のターゲティング及び/又は治療に有用である。
一態様では、本発明は、過剰に安定化したc-metタンパク質と関係しているHGF/c-metシグナル伝達を崩壊させるc-metアンタゴニストを提供する。一実施態様では、本発明は、ヒトの過剰に安定化したc-metポリペプチドのc-metシグナル伝達活性を阻害するアンタゴニストであって、過剰に安定化したc-metポリペプチドがエキソン14の少なくとも一部を欠失しているために、野生型のc-metに比べて細胞における分解の速度が減少しており、過剰に安定化したc-metポリペプチドがc-metシグナル伝達活性を有するものであるアンタゴニストを提供する。
一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、多重特異的抗体又は単鎖抗体である。本発明の方法に用いるアンタゴニストは、場合によっては、増殖阻害剤又は細胞障害性剤、例えば毒素、例としてメイタンシノイドないしカリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素などにコンジュゲートしていてもよい。本発明の方法のいくつかの実施態様では、化学療法剤もまた、被検体に投与される。
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS (配列番号:7)
一実施態様では、本発明の抗体断片は、以下の配列を有する軽鎖可変ドメインを含有してなる抗原結合アームを含んでなる:
DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (配列番号:8)
いくつかの実施態様では、本発明のc-metアンタゴニストは、ペプチド(例えばオリゴペプチド)、抗体、抗体断片、アプタマー、オリゴヌクレオチド(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)、抑制性RNA、又はこれらの組合せであるか、又はこれらを含んでなる。
いくつかの実施態様では、本発明のc-metアンタゴニストは、本明細書中に記載の本発明のスクリーニング又は同定方法によって得られる。
一態様では、本発明は、本発明のc-metアンタゴニストをコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又はポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を含んでなるc-metアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体ないしその断片であるか又は抗体ないしその断片を含んでなるc-metアンタゴニストをコードする。一実施態様では、本発明の核酸はアプタマーである。一実施態様では、本発明の核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施態様では、本発明の核酸は抑制性RNA(例えば小干渉RNA)である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、例えば発現ベクターなどの組み換えベクターなど、任意の種類のものでよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類の細胞である。
一態様では、本発明は、容器と、容器内に具備される組成物を含んでなる製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数のc-metアンタゴニストを含有するものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有してなる。一実施態様では、アンタゴニストを含有してなる組成物は担体を更に含み、いくつかの実施態様では、その担体は薬学的に受容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト)を投与することについての指示書を更に具備する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び/又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び/又は予防的処置のための医薬の製造における本発明のc-metアンタゴニストの使用を提供する。c-metアンタゴニストは、抗体、抗体断片、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)、核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNAなどのオリゴヌクレオチド)、アプタマー、又はこれらの組合せを含む本明細書中に記載の何れかの形態であってもよい。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び/又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び/又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び/又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び/又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び/又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び/又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び/又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び/又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
一態様では、本発明は被検体の腫瘍の治療方法であって、本発明のアンタゴニストを被検体に投与することを含み、それによって腫瘍が治療される方法を提供する。一実施態様では、腫瘍は過剰に安定化したc-metを含むことが決定される。一実施態様では、腫瘍は、エキソン14の少なくとも一部を欠失している変異c-metを含むことが決定される。
本発明の方法の一実施態様では、本発明のc-metインヒビターは、レセプタータンパク質分解を誘導及び/又は促進する薬剤と組み合わせて投与される。
一態様では、本発明は、被検体のc-met活性化の調節不全に伴う病理的な症状の治療方法であって、有効量の本発明のc-metアンタゴニストが被検体に投与されることを含み、これによって該症状が治療される方法を提供する。
一態様では、本発明は、c-met又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞と本発明のc-metアンタゴニストを接触させることを含み、これによって該細胞の増殖が抑制される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるHGFと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、c-met又は肝細胞増殖因子又はその両方の発現ないし活性の増加に関連する細胞増殖性疾患の治療又は予防方法であって、有効量の本発明のc-metアンタゴニストが該哺乳動物に投与されることを含み、これによって該細胞増殖性疾患が有効に治療又は予防される方法を提供する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞の増殖がc-met又は肝細胞増殖因子又はその両方の増殖促進作用に少なくとも一部が依存しているものであって、有効量の本発明のc-metアンタゴニストと該細胞を接触させることを含み、これによって該細胞の増殖が抑制される方法を提供する。一実施態様では、細胞は、異なる細胞により発現されるHGFと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
本発明の方法は、任意の適切な病理学的状態、例えばHGF/c-metシグナル伝達経路の調節不全を伴う細胞及び/又は組織に作用するために用いてもよい。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞(例えば、甲状腺のもの)、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞及び白血病細胞からなる群から選択されるものであってもよい。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は、過剰増殖性細胞及び/又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法でターゲティングされる細胞は転移性細胞である。
本明細書において記述されるように、c-met活性化は、その調節不全により多くの病理学的な症状が生じる重大な生物学的過程である。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とする細胞(例えば癌細胞)は、c-metの活性化が同じ組織起源の正常細胞と比較して亢進されているものである。一実施態様では、本発明の方法によって標的とする細胞の細胞死が生じる。例えば、本発明のアンタゴニストと接触することによってc-met経路によるシグナル伝達が細胞で不可能となり、その結果、細胞死又は細胞増殖の抑制が生じる。他の例では、本発明のアンタゴニストは過剰に安定化したc-metを発現する細胞に結合した毒素を仕向ける。
本発明の方法の一実施態様では、本方法は、(本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド突然変異又はポリペプチド突然変異を検出することによって)腫瘍細胞が過剰に安定化したc-metを含むかどうかを決定する工程を更に含む。
本発明は、HGF/c-metシグナル伝達経路の抑制因子(特に、過剰に安定化したc-metの抑制因子)を同定するための方法、組成物、キット及び製造品と、この抑制因子の使用方法を提供する。
これらの方法、組成物、キット及び製造品の詳細は、本明細書において、提供される。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第2版(Sambrookら, 1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984);「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel等, 編., 1987, 及び定期的に更新されたもの);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994);「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)。
本明細書中で用いる「過剰に安定化したc-met」なる用語及びその変形語は、野生型のc-metのものよりも検出可能な程度のゆっくりとした速度で分解/下方制御される天然に生じる変異形のヒトc-metを指す。野生型c-metと過剰に安定化したc-metとの間の分解/下方制御速度を比較する方法は、例えば、下記の実施例にて説明したような当分野の技術者に明らかなものが挙げられるがこれに限定されるものではない。一例を挙げると、遅発性分解/下方制御は、細胞のレセプタータンパク質レベルを数量化することに基づいて評価される。他の例では、遅発性分解/下方制御は、c-metへのCbl結合と関係しているc-met部位の突然変異の検出量に基づいて決定される。一例を挙げると、突然変異は、(例えば、c-metエキソン14の)c-metユビキチン結合及びレセプタータンパク質分解/下方制御と関係しているc-met部位にある。これらの突然変異は、野生型c-metよりもゆっくりな速度で分解/下方制御される変異したc-metタンパク質の発現が生じる任意の形態で生じ、変異したc-metタンパク質は野生型c-met関連の活性(例えば、MAPKなどの下流分子のリン酸化、細胞増殖の刺激及び/又は腫瘍形成性の現象の誘導)が可能であるものである。例えば、これらの突然変異には、レセプタータンパク質分解/下方制御を伴うエキソン14の少なくとも一部を欠失している機能的なインフレームのc-metスプライス変異体の発現と関連しているものが含まれる。突然変異の例示的な例には、図1及び図7に示すスプライシング成分に見られるものが含まれる。一実施態様では、細胞における本発明の過剰に安定化したc-metタンパク質の存在は、同じくらいの量の細胞内の野生型c-metタンパク質と比較して、HGF/c-met経路内の下流分子のリン酸化の延長及び/又は増加と関係している。
本明細書中で用いる「スプライス部位」、「スプライス接合部位」、「枝分かれ部位」、「ポリピリミジン域」なる用語は、哺乳類、特にヒトのRNAスプライシングとの関係において、当分野で公知の意味を指す。例として、Pagani 及び Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5:389-396及びその中の引例を参照のこと。参考として、c-met RNAスプライシング成分のための配列の一実施態様を図7に例として記載する。
「抗体」(Ab)と「免疫グロブリン」(Ig)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンには、抗体と一般的に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は完全なモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び(本明細書で詳細に記載される)特定の抗体断片が含まれる。抗体はキメラ、ヒト、ヒト化及び/又は親和性成熟したものであり得る。
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、通常、抗体の最も可変的な部位であって、抗原結合部位を含有する。
本明細書中のモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片が含まれる(米国特許第4,816,567号;及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のCDR/HVRに一又は複数の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させたものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDR/HVRおよび/またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994);Schier他、Gene, 169:147-155 (1995);Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995);Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995);およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を称する。この用語は放射性アイソトープ(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位元素)、化学療法剤、及び細菌性、真菌性、植物性又は動物性起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素等の毒素又はその断片を含むことが意図されている。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に制御不能な細胞成長/増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的症状を指す又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、上皮癌、リンパ腫(例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例は、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝上皮癌及び様々なタイプの頭頸部癌を含む。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。治療剤の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は治療剤の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
A.c-metアンタゴニスト抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療剤及び/又は診断剤としての使用が見出されているc-metアンタゴニスト抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。抗体の産出、同定、特徴付け、修飾及び生成についての態様は、当該分野で十分に確立されており、例えば米国特許出願公開2005/0042216のパラグラフ522〜563、604〜608及び617〜688に記載されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のFab'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
一態様では、本発明のc-metアンタゴニストはポリペプチドを含んでなる。一実施態様では、アンタゴニストポリペプチドは細胞内の過剰に安定化したc-metタンパク質に結合及び/又は拮抗する。一実施態様では、ポリペプチドは過剰に安定化したc-metに結合する、好ましくは特異的に結合する。ポリペプチドは、既知のペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び生成することができる。一実施態様では、c-metアンタゴニストポリペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約6、7、8、9、10、11、1−73、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100のアミノ酸長以上であり、このようなポリペプチドは過剰に安定化したc-met活性を阻害することができる。これらのポリペプチドは、公知の技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する(例えば、米国特許第5556762号、同第5750373号、同第4708871号、同第4833092号、同第5223409号、同第5403484号、同第5571689号、同第5663143号;PCT国際公開公報84/03506、及び国際公開公報84/03564;Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984);Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985);Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986);Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987);Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378;Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832;Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624;Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581;Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照)。
ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり(国際公開公報98/14277)及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用(国際公開公報98/20169;国際公開公報98/20159)及び拘束性へリックスペプチドの特性(国際公開公報98/20036)を分析及び制御するために使用されている。国際公開公報97/35196は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。国際公開公報97/46251は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌(Staphlylococcus aureus)タンパク質Aの親和性タグとしての使用も報告されている(Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187)。国際公開公報97/47314は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法は国際公開公報97/09446に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第5498538号、同第5432018号、及び国際公開公報98/15833に記載されている。
アンタゴニストポリペプチドを作製し、同定し、特徴付け、修飾し及び生成する方法は、当該分野において十分に確立されており、例えば米国特許出願公開2005/0042216のパラグラフ606〜608、614〜688に記載されている。
一実施態様では、過剰に安定化したc-met活性をアンタゴナイズするためのポリペプチドは、例えば本明細書中に記載のエキソン14の少なくとも一部を欠失した変異c-met膜近傍配列を含んでなる標的抗原に基づいたスクリーニングによるなどして、過剰に安定化したc-metタンパク質構造に基づいて設定することができる。例えば、標的抗原は、c-metのエキソン13及びエキソン15のインフレームスプライシングによって生じる配列を含有するポリペプチドを含みうる。
他の態様では、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、イムノコンジュゲート、又は抗体-薬剤コンジュゲート(ADC)を提供する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213;Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、DNA結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分SMCCを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
例示的なアウリスタチンの実施態様はMMAE及びMMAFである。更なる例示的な実施態様では、MMAE又はMMAFと様々なリンカー成分であるAb-MC-vc-PAB-MMAF、Ab-MC-vc-PAB-MMAE、Ab-MC-MMAE及びAb-MC-MMAF(本明細書中にさらに記載される)を含んでなる。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開93/21232を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1) 共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ab−(L−D)p I
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「SIAB」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAEは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAEと本明細書において提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAFは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAFと本明細書において提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製される。
抗体-SMCC-DM1は、以下のSMCC-DM1と本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。精製された抗体は、(スクシンイミジル4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、SMCCリンカーを導入する。具体的には、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5中で、7.5モル等量のSMCC(DMSO中に20mM、6.7mg/mL)にて20mg/mLの抗体を処理した。室温のアルゴン下で2時間撹拌した後に、反応混合物を、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。
Ab-SPP-DM1は、本明細書中で提供される何れかの抗体と以下のSPP-DM1とのコンジュゲートにより調製される。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエートによって、誘導体化される。NaCl(50mM)及びEDTA(1mM)を含有する44.7mLの50mM リン酸カリウムバッファ(pH6.5)中の抗体(376.0mg、8mg/mL)を、SPP(2.3mL エタノール中に5.3のモル等量)にて処理した。室温、アルゴン下にて90分間インキュベートした後、抗応混合物を、35mMのクエン酸ナトリウム、154mM NaCl、2mM EDTAにて平衡化したSephadex G25カラムにゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体の修飾の程度は、上記の通りに決定される。
抗体-BMPEO-DM1は、本明細書中に示される何れかの抗体と以下のBMPEO-DM1とのコンジュゲートにより調製される。抗体を、ビスマレイミド試薬BM(PEO)4(Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、BM(PEO)4を50%のエタノール/水混合液に10mMの濃度になるまで溶解して、およそ1.6mg/ml(10マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に10倍のモル過剰量を加え、1時間反応させて、抗体-リンカー中間生成物である2H9-BMPEOを形成させることにより達成される。150mMのNaClバッファと0mMのクエン酸塩、pH6のゲル濾過(HiTrap column, Pharmacia)によって、過剰なBM(PEO)4を取り除く。およそ10倍のモル過剰DM1を、ジメチルアセトアミド(DMA)に溶解して、2H9-BMPEO中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(DMF)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、PBSでゲル濾過ないし透析を行って反応していないDM1を取り除く。PBS中のS200カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された2H9-BMPEO-DM1に供給する。
一態様では、本発明のc-metアンタゴニストは核酸分子を含む。例えば、核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性/干渉性RNA(例えば低分子抑制性/干渉性RNA(siRNA))、又はアプタマーを含んでいてもよい。これらの核酸修飾因子をスクリーニングし、同定し、作製するための方法は当該分野で知られている。
アンチセンス技術は、当該分野で十分に確立されている。この技術に関するさらなる詳細は、以下に提供する。
本発明に従って使用されるc-metアンタゴニストの治療用製剤は、所望の純度を有するc-metアンタゴニストを、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンズエトニウムクロリド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;トレハロース及び塩化ナトリウム等の等張化剤(tonicifiers);スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類;ポリソルバート等の界面活性剤;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
本発明のc-metアンタゴニストは、様々な非治療的用途を有している。該アンタゴニストは、過剰に安定化したc-met発現疾病の病期分類又は検出(例えば放射性イメージング)に有用でありうる。抗体、オリゴヌクレオチド及びアプタマーもまた、例えばELISA又はウエスタンブロットにおいて、細胞集団における細胞性イベントを調節する過剰に安定化したc-metのインビトロでの検出及び定量のために、細胞からの過剰に安定化したc-metの精製及び免疫沈降に有用である。
他の治療計画を、c-metアンタゴニストの投与と併用してもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬用製剤を使用する同時投与、及び何れかの順序での連続投与を含み、好ましくは、両方の(又は全ての)活性剤が同時に生物学的活性を示す期間があるものである。好ましくは、そのような併用治療により、相乗的治療効果及び/又は所望しない副作用の低減に至る。
特定の病的状態に関連する他の抗原に対する治療剤の投与と、c-metアンタゴニストの投与を組合せることもまた望ましい。
本発明のc-metアンタゴニスト抗体は、ここでの「抗体」の定義に包含される異なった形態でありうる。例えば、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、及びその機能的断片が含まれる。
本発明は、c-metアンタゴニストと担体を含有する組成物を提供する。さらなる実施態様では、組成物は、化学療法剤を含む細胞障害剤又は成長阻害剤等の他の治療剤と組合せて、c-metアンタゴニストを含有可能である。また本発明は、c-metアンタゴニスト及び担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の実施態様は、c-metアンタゴニストを使用する疾患の治療に有用な物質を含む製造品にある。製造品は容器と該容器上又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器は、病状の治療に有用な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のc-metアンタゴニストである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療のために使用されることを示している。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に組成物を投与するための使用説明書をさらに含むであろう。加えて、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第2の容器をさらに具備していてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
一実施態様では、本発明の核酸は、内因性の過剰に安定化したc-metコード核酸に結合可能な一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド/ポリヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、過剰に安定化したc-metDNAのコード化領域の断片を少なくとも含む。そのような断片は、一般には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第90/10448号に記載されるように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入されうる。アンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
この発明は、過剰に安定化したc-metを調節するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬候補のスクリーニングアッセイは、過剰に安定化したc-metポリペプチドと結合又は複合体形成するか、又は例えば細胞からの過剰に安定化したc-metポリペプチドの発現の阻害を含む、過剰に安定化したc-metポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用に干渉する化合物を同定するために設定される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬を過剰に安定化したc-metポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な時間及び条件下で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなるものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介してトリプルヘリックス形成を促進するように設定され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上にプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のPCT公報、国際公開第97/33551号を参照。
これらの小分子は、上で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた任意の他のスクリーニング技術により同定することができる。
(a) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4又は5の高頻度可変領域(HVR)配列
(i) KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号1)である配列A1-A17を含有してなるHVR-L1
(ii) WASTRES (配列番号2)である配列B1-B7を含有してなるHVR-L2
(iii) QQYYAYPWT (配列番号3)である配列C1-C9を含有してなるHVR-L3
(iv) GYTFTSYWLH (配列番号4)である配列D1-D10を含有してなるHVR-H1
(v) GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号5)である配列E1-E18を含有してなるHVR-H2
(vi) XYGSYVSPLDY (配列番号6) であり、XがRでない配列F1-F11を含有してなるHVR-H3;
(b) 変異体HVRが配列番号1、2、3、4、5又は6に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体HVR
を含んでなる抗c-met抗体などがある。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-L1は、配列番号1の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-L2は、配列番号2の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-L3は、配列番号3の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-H1は、配列番号4の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-H2は、配列番号5の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のHVR-H3は、配列番号6の配列を含んでなる。一実施態様では、HVR-H3は、TYGSYVSPLDY(配列番号7)を含んでなる。一実施態様では、HVR-H3は、SYGSYVSPLDY(配列番号8)を含んでなる。一実施態様では、これらの配列を含有する本発明の抗体は、ヒト化又はヒトである(共に本願明細書において記述される)。
細胞培養
細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)、癌治療及び診断のNCI部(NCI Division of Cancer Treatment and Diagnosis)腫瘍保存機関又はヒューマンサイエンス振興財団から入手した。293細胞及びラット1A細胞を除くすべての細胞株は、10%FBS(Sigma)、ペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO)及び2mM L-グルタミンを補充したRPMI1640で維持した。293細胞及びラット1A細胞は、上記のように補充した高グルコースDMEM中で維持した。
完全長Met WT-V5/Hisは既に記載されている(Kong-Beltran 等, 2004)。Met WT-V5/Hisを鋳型として用いて、製造業者の指示書に従って、QuikChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene)により、既に記載(Peschard 等, 2001)のあるプライマーを用いてY1003F点突然変異を生成した。QuikChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene)により、Metエキソン14に隣接して新たにNheI制限酵素部位(aa963−1011)を生成する2つのプライマー対を用いてエキソン14を欠失し、次いでNheIで消化した後にプラスミドを再びライゲーションした。DNA塩基配列決定によって突然変異を確認した。ラット1A細胞にMet安定発現株を生成するために、pRK5TKneo、Met WT-V5/His、Met Y1003F-V5/His、又はMet ΔEx14−V5/His DNAそれぞれ10μgをKpnIで消化して、精製した(Qiagen)。製造者の指示書に従って、リポフェクタミン2000(Invitrogen)により6ウェルプレート中で各々4μgのDNAをラット1A細胞に形質移入した。翌日、細胞をトリプシン処理して、10cmのプレート中に播いた。24時間後、500μg/mlのG418(Sigma)を加えた。選別はおよそ2週間続け、3D6抗体を用いたFACS(米国特許第6,099,841号を参照)とPE染色によって、Metポジティブクローンを選別した。1ウェル当たり1細胞とした。広がったクローンを溶解して、V5抗体(Invitrogen)を用いたイムノブロットによってMetについて試験した。
凍結組織試料においてタンパク質発現を分析するために、組織(〜100mg)を、プロテアーゼインヒビター反応混液(Sigma)、ホスファターゼ阻害剤反応混液I及びII(Sigma)、50mM フッ化ナトリウム及び2mM バナジン酸ナトリウムを含有する200μlの細胞溶解バッファ(Cell Signaling)中で、Polytron(登録商標)ホモジナイザー(Kinematica)を用いてホモジナイズした。4℃で1時間ゆっくり振とうすることによって試料を更に溶解して、プロテインAセファロースFast Flow(Amersham)とプロテインGセファロース4Fast Flow(Amersham)の混合物にて前清掃した。タンパク質濃度はブラッドフォード試薬(BioRad)を用いて測定した。その後、SDS-PAGEによって、タンパク質(20μg)を分離して、ニトロセルロースメンブレンへ移し、Met(DL-21, Upstate)又はβ-アクチン(I-19, Santa Cruz)抗体にてイムノブロットした。タンパク質は、増強させた化学発光(ECL Plus, Amersham)によって視覚化した。Met及びCblの形質移入を伴う免疫共沈降研究のために、3μgの各々のMetコンストラクトと3μgのCbl-flagをFuGENE6(Roche)を用いて293細胞内に形質移入した。翌日、細胞を100ng/mlのrhuHGFにて30分間刺激して、完全なプロテアーゼ阻害剤反応混液錠剤(Roche)及びホスファターゼ阻害剤反応混液IIを含有する1%NP40溶解バッファ[50mM トリス(pH7.45)、150mM NaCl及び1%ノニデット40]を用いて回収した。細胞片を遠心分離して、1mgの溶解物を、1.5μlのV5抗体(Invitrogen)又は2μgのCbl抗体(C-15, Santa Cruz)によって4℃で回転させながら終夜免疫沈降し、プロテインG又はAビーズとともに2時間インキュベートした。20mM DTT(Sigma)を含有する2×試料バッファ(Invitrogen)を添加し、試料を5分間沸騰させた。試料を4−12%のトリス-グリシンゲル(Invitrogen)に流し、0.45μmのニトロセルロースメンブレン(Invitrogen)へ移した。メンブレンは5%の脱脂乳にて1時間ブロックした後、V5抗体、flagポリクローナル抗体(Sigma)又はP-Tyr抗体(4G10, Upstate)にてイムノブロットした。内在性Cblを含む結合研究のために、293細胞に、FuGENE6を用いて10cmのプレートにつき6μgの各々のDNAコンストラクトを形質移入した。翌日、細胞を100ng/mlのrhuHGFにて30分間刺激して、回収した。試料を2μgのCbl抗体又は1.5μgのV5抗体にて免疫沈降して、V5抗体又はCbl抗体にてイムノブロットを行った。V5免疫沈降したブロットを、リストアウェスタンブロットストリッピングバッファ(Pierce)を用いて除去し、P-Met Y1003(Biosource)、P-Met Y1234/Y12345 (Cell Signaling)、P-Met Y1349 (Cell Signaling)又はP-Met1365(Biosource)にて再プローブした。分解を調べるために、6ウェルプレート中でFuGENE6を用いて、293細胞に、0.25μgのpRK5TKneo、Met WT-V5/His、Met Y1003F-V5/His又はMet ΔEx14-V5/His変異体を形質移入した。翌日、示された時間の間、細胞を10μg/mlのシクロヘキシミド(Sigma)で処理した。溶解物をSDS-PAGEによって分析し、メンブレンをV5抗体又はアクチン抗体にてイムノブロットした。
FuGENE6を用いて、試料当たり全DNA量が6μgとなるように、293細胞に3μgのMetコンストラクト、2μgのCbl-flag、1μgのHA-ユビキチンと、pRK5TKneo又はpFlag5aの空ベクターを形質移入した。翌日、細胞を、25μMのMG-132(Calbiochem)で4時間処理した後に回収した。阻害剤、25μM MG-132及び10mM N‐エチルマレイミドを含有する1%NP-40溶解バッファ中で細胞を溶解した。溶解物(1mg)を、1.5μgのV5抗体にて免疫沈降して、ユビキチン(P4D1, Santa Cruz)抗体にてイムノブロットして、次いではがして、V5抗体にて再プローブした。
H226、H596、H358又はラット1A-Met安定発現クローンにおけるシグナル伝達の延長を調べるために、細胞をPBSですすぎ、次いで0.5%BSA、2mM グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有するDMEM培地又はRPMI培地中で1時間、血清枯渇状態にした。rhuHGF又はアゴニスト抗Metモノクローナル抗体である3D6(Genentech)を無血清培地に加えて10分置いた。次いで、単層の細胞をPBSですすぎ、示された時間の抽出まで無血清培地中でインキュベートした。次いで、細胞を一度PBSですすぎ、1×DTT(Invitrogen)を含有する1×SDS試料バッファにて溶解して、短時間超音波処理し、5分間沸騰させた。Metレセプター阻害を分析するために、血清枯渇状態の細胞を含む無血清培地に、示された濃度の抗Met5D5抗体を30分間添加した。次いで、細胞を100ng/mlのrhuHGFにて15分間(Met活性化分析のため)又は30分間(Akt及びMAPK分析のため)刺激し、DTTを含有する1×SDS試料バッファにて溶解した。沸騰させた試料は、P-Met(Y1230/Y1234/Y1235、BioSource)、P-Met(Y1234/Y1235)、Met(DL-21)、P-MAPK(E10、Cell Signaling)、P-MAPK(Cell Signaling)、P-Akt(587F11、Cell Signaling)、又はAkt(Cell Signaling)によるSDS-PAGE及びイムノブロットにて分析した。二次抗体には、抗ウサギ-AlexaFluor680コンジュゲート(Molecular Probes)又は抗マウス-IRDye800コンジュゲート(Rockland Immunochemicals)を用いた。ニトロセルロースメンブレン上に転写したタンパク質は、製造業者の指示したウェスタンブロット使用法に従ってOdyssey (LiCor)を用いた赤外線スキャンの後に定量化して検出した。細胞生存率測定のために、0.5%FBSを含有するRPMI(アッセイ培地)中に96ウェルプレートの1ウェル当たり1×104個以下の細胞を3通り播いて終夜置き、50ng/mlのrhuHGFを含有するアッセイ培地にて刺激した。rhuHGFを含まないアッセイ培地を刺激しなかったウェルに添加した。72時間後、細胞生存度を、Celltiter-Glo発光細胞生存アッセイ(Promega)を用いて測定した。刺激インデックスは、HGF刺激培養物の平均細胞生存単位を未刺激培養物の平均細胞生存単位で割って決定した。平均刺激インデックスは最低3回の異なる実験により決定した。増殖阻害アッセイは、HGF刺激時にOA-5D5又はコントロールIgを添加して、同様の方法で行った。
雌胸腺欠損ヌードマウス(Charles River, Hollister)の皮下に、Met WT、Met Y1003F、Met ΔEx14又はベクターコントロールを発現しているラット1A安定発現株のプールを接種した(5000000細胞/マウス、n=5)。Metレセプター刺激のために、ヒトのMetのみを認識する抗Met3D6アゴニスト抗体の10mg/kgを週に1度、腹膜内投与した。腫瘍はデジタル測径器を用いて週2回測定し、腫瘍体積は以下の方程式を用いて算出した:腫瘍容積(mm3)=(π/6)(A)(B)(B)。A=最長の幅、B=最短の幅。
本発明者等は、原発性腫瘍、腫瘍細胞株及び原発性腫瘍異種移植片モデルを示す肺癌と大腸癌の試料のパネルから、Metのエクソンをコードする全ての配列を決定した。配列決定したところ、本発明者等は、イントロン領域フランキングエキソン14において原発性肺腫瘍試料での体細胞性ヘテロ接合の突然変異を同定した(図1)。これらの突然変異は腫瘍特異性であり、同じ個体の非腫瘍性肺組織にはみられなかった(データは示さない)。非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株であるH596では、3pスプライスドナー部位にホモ接合性の点突然変異を同定した。ジヌクレオチドスプライス部位コンセンサス及びエキソン14の上流のポリピリミジン域内の突然変異の存在と、エキソン13とエキソン15が同相のままであったという所見から、エキソン14を欠失していると思われるMet転写産物が依然として機能的なMetタンパク質を産生することが示唆される。このことを調べるために、本発明者等は、まず、変異体腫瘍及び細胞株からMet RNAのRT-PCR増幅を行った。3つすべてのイントロンの突然変異により、野生型と比べて短い長さの転写物が生じ、これはエキソン14の欠失と一致していた(データは示さない)。また、本発明者等は、RT-PCR産物を配列決定することによってエキソン14の欠如を確認したところ、Metのアミノ酸L964からD1010を除去するインフレーム欠失が示された。興味深いことに、腫瘍試料がエキソン14の欠失についてヘテロ接合体であるにもかかわらず、レセプターの変異した形態が主に発現されていたことから(データは示さない)、変異体の転写産物が優先的に発現されていることが示唆される。これは、ウェスタンブロッティングによって、切断型Metタンパク質の優先的な発現を示すことが更に確認された。これらのイントロンの突然変異を有する試料は、配列決定した関連するエキソンにおいて、K-ras、B-raf、EGFR及びHER2については野生型であった(データは示さない)。まとめると、これらの結果は、これらのMetイントロンの突然変異が優性形質であることを示す。興味深いことに、腫瘍形成に関して機能的な因果関係は不明であるけれども、エキソン14を欠失しているMetのスプライス変異体は正常なマウス組織において、既に報告されている(20、21)。しかしながら、本発明者等は、調べた任意の正常なヒトの肺試料において、このスプライス変異体の発現が検出されなかった(データは示さない)。以前に述べられているように(21)、正常なヒト組織におけるこのスプライス変異体の欠失はさらに立証されている。エキソン14を欠失しているスプライス変異体を含むcDNAは、原発性のヒトのNSCLC試料において報告されている、しかしながら、スプライシング欠損を媒介する際の体細胞性突然変異の役割は評価されなかったし、ある場合でも、発現されうる任意の変異体c-metの機能上の結果でもなかった(22)。スプライス変異体を含む核酸は癌細胞において、まれでないので、報告されたスプライス変異体の機能的な関連は知られていなかった。
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Claims (12)
- ヒトの過剰に安定化したc-metポリペプチドのc-metシグナル伝達活性を阻害するアンタゴニストであって、過剰に安定化したc-metポリペプチドがエキソン14の少なくとも一部を欠失しているために野生型のc-metに比べてその分解が減少しており、過剰に安定化したc-metポリペプチドがc-metシグナル伝達活性を有するものである、アンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、ヒトc-metのエキソン13とエキソン15のインフレームスプライシングにより形成されるエピトープに結合する抗体である、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 過剰に安定化したc-metポリペプチドのエキソン14の少なくとも一部が欠失している、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、エキソン13がエキソン15にスプライスされているc-metのスプライス変異体をコードする核酸分子からの発現を優位に抑制する抑制性RNAである、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストによるc-metシグナル伝達活性の抑制が過剰に安定化したc-metタンパク質の細胞性分解の亢進を含むものである、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが毒素に結合している、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが野生型c-metポリペプチドを特異的に結合しない、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが野生型c-metポリペプチド活性を実質的に阻害しない、請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 被検体の腫瘍の治療方法であって、請求項1ないし8の何れか一に記載のアンタゴニストが被検体に投与されることを含み、これによって腫瘍が治療される方法。
- 前記腫瘍が過剰に安定化したc-metを含むことが決定されている、請求項9に記載の方法。
- 前記腫瘍が、エキソン14の少なくとも一部を欠失している変異形c-metを含むことが決定されている、請求項10に記載の方法。
- レセプタータンパク質分解を誘導する薬剤と組み合わせて前記アンタゴニストが投与されることを含む、請求項9に記載の方法。
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