BRPI0611468A2 - antagonista que inibe atividade de sinalização c-met de um polipeptìdeo c-met hiperestabilizado humano, método de tratamento de um tumor e uso do antagonista - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a usos, métodos e composições para modular a via de sinalização HGF/c-met, em específico pela inibição de uma proteína c-met hiperestabilizada.

Description

"ANTAGONISTA QUE INIBE ATIVIDADE DE SINALIZAÇÃO C-MET DE UMPOLIPEPTÍDEO C-MET HIPERESTABILIZADO HUMANO, MÉTODO DETRATAMENTO DE UM TUMOR E USO DO ANTAGONISTA"

Este é um pedido não provisório depositado com base em 37 CFR1.53(b)(1) reivindicando prioridade sob 35 USC 119(e) para o pedido provisório60/665.482 depositado em 25 de março de 2005, cujos conteúdos sãointegralmente incorporados ao presente como referência.

Campo Da Invenção

A presente invenção relaciona-se geralmente aos campos dabiologia molecular e regulação do fator de crescimento. Mais especificamente,a invenção fornece moduladores da via se sinalização HGF/c-met e usos detais moduladores.

Antecedentes Da Invenção

HGF é um fator pleiotrófico derivado do mesênquima comatividades mitogênicas, motogênicas e morfogênicas em uma série de tiposcelulares diferentes. Os efeitos de HGF são mediados por meio de uma tirosinaquinase específica, c-met, e HGF anormal e expressão de c-met sãofreqüentemente observadas em uma variedade de tumores. Ver, por exemplo,Maulik etal., Cytokine & Growth FactorReviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867. A regulação da viade sinalização HGF/c-Met está envolvida na progressão e metástase de tumor.Ver, por exemplo, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

HGF liga-se ao domínio extracelular do receptor Met tirosinaquinase (RTK) e regula diversos processos biológicos tais como dispersão,proliferação e sobrevivência celular. A sinalização HGF-Met é essencial para odesenvolvimento embrionário normal, especialmente na migração de célulasmusculares progenitoras do fígado e sistema nervoso (Bladt et ai, Nature(1995), 376, 768-771.; Hamanoue etal., Faseb J (2000), 14, 399-406; Maina etal., Cell (1996), 87, 531-542; Schmidt et ai., Nature (1995), 373, 699-702;Uehara et al., Nature (1995), 373, 702-705). Fenótipos desenvolvidos de Met ecamundongos HGF knockout são muito similares, sugerindo que HGF é umligante cognato para o receptor Met (Schmidt et al., 1995, acima, Uehara et al.,1995,acima). HGF-Met também desempenha um papel na regeneração dofígado, angiogênese e cicatrização (Bussolino et al., J Cell Biol (1992), 119,629-641; Matsumoto e Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249; Nusrat et al., J ClinInvest (1994) 93, 2056-2065). O precursor do receptor de Met sofre clivagemproteolítica em uma subunidade β extracelular e subunidade β de transposiçãode membrana ligada por pontes bissulfeto (Tempest et al., BrJ Câncer (1988),58, 3-7). A subunidade β contém o domínio quinase citoplasmático e abriga umsítio de ancoragem multi-substrato na terminação C onde adaptadores deproteínas se ligam e iniciam sinalização (Bardelli et al., Oncogene (1997), 15,3103-3111; Nguyen et al., J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819; Pelicci et al.,Oncogene (1995), 10, 1631-1638; Ponzetto et al., Cell (1994), 77, 261-271;Weidner et al., Nature (1996), 384, 173-176). Por ligação HGF, a ativação deMet leva à fosforilação e sinalização a jusante por meio de Gabl e Grb2/Sosmediados por PI3-kinase e ativação Ras/MAPK respectivamente, queconduzem motilidade e proliferação celular (Furge et al., Oncogene (2000), 19,5582-5589; Hartmann et al., J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939; Ponzettoet al., J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123; Royal e Park, J Bio\ Chem(1995), 270, 27780-27787).

Met mostrou estar transformando uma linhagem celular deosteosarcoma tratado com carcinógeno (Cooper et al., Nature (1984), 311, 29-33; Park et al., Cell (1986), 45, 895-904). A superexpressão ou amplificaçãogênica foi observada em uma variedade de cânceres humanos. Por exemplo,a proteína Met é superexpressada pelo menos 5 vezes mais em câncerescoloretais e relataram ser gene amplificadas em metástases de fígado (DiRenzo et ai, Clin CancerRes (1995), 1, 147-154; Liu et al., Oncogene (1992),7, 181-185). A proteína Met é também relatada ser superexpressada emcarcinoma celular escamoso oral, carcinoma hepatocelular, carcinoma celularrenal, carcinoma de mama e carcinoma de pulmão (Jin et al., Câncer (1997), 79,749-760; Morello et al., J Cell Physiol (2001), 189, 285-290; Natali et al., Int J Câncer(1996), 69, 212-217; Olivero et al., BrJ Câncer (1996), 74, 1862-1868; Suzuki et ai,BrJ Câncer (1996), 74, 1862-1868). Além disso, a superexpressão de mRNA foiobservada em carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico e carcinoma coloretal(Boix et al., Hepatology (1994), 19, 88-91; Kuniyasu et ai, Int J Câncer (1993), 55,72-75; Liu et al., Oncogene (1992), 7,181 -185).

Uma série de mutações no domínio quinase de Met foi encontradaem carcinoma papilar renal que leva à ativação constitutiva do receptor (Oliveroet ai, Int J Câncer (1999), 82, 640-643; Schmidt et al., Nat Genet (1997), 16,68-73; Schmidt et al., Oncogene (1999), 18, 2343-2350). Estas ativações demutações conferem fosforilação constitutiva de tirosina Met e resultam naativação MAPK, formação de foco e tumorgênese (Jeffers et al., Proc Natl AcadSci USA (1997), 94, 11445-11450). Além disso, estas mutações aumentam amotilidade e invasão celular (Giordano et al., Faseb J (2000), 14, 399-406;Lorenzato et ai, Câncer Res (200 2), 62 , 7025-7030). A ativação de Metdependente de HGF em células transformadas media aumento de motilidade,dispersão e migração, que eventualmente leva ao crescimento de tumorinvasivo e metástase (Jeffers et ai, Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125;Meiners et al., Oncogene (1998), 16, 9-20).

Met mostrou interagir com outras proteínas que conduzemativação, transformação e invasão do receptor. Em células neoplásicas, Met érelatado interagir com integrina α6β4, um receptor para componentes da matrizextracelular (ECM), tais como lamininas, para promover crescimento invasivodependente de HGF (Trusolino et al., Cell (2001), 107, 643-654). Além disso, odomínio extracelular de Met mostrou interagir com um membro da famíliasemaforina, plexina B1, e aumentar crescimento invasivo (Giordano et ai, Nat CellBiol (2002), 4, 720-724). Além disto, CD44v6, que foi envolvido em tumorgênese étambém relatado formar um complexo com Met e HGF e resultar na ativação doreceptor Met (Orian-Rousseau et ai, Genes Dev (2002), 16, 3074-3086).

Met é um membro da subfamília de receptores tirosina quinase(RTKs) que incluem Ron e Sea (Maulik et ai, Cytokine Growth Factor Rev(2002), 13, 41-59). A previsão da estrutura de domínio extracelular de Metsugere homologia compartilhada com as semaforinas e plexinas. O N-terminalde Met contém um domínio Sema de aproximadamente 500 aminoácidos que éconservado em todas as semaforinas e plexinas. As semaforinas e plexinaspertencem a uma ampla família de proteínas secretadas e de membrana,primeiro descritas para seus papéis no desenvolvimento neural (Van Vactor eLorenz, Curr Bio (1999),I 9, R201-204). No entanto, mais recentemente asuperexpressão de semaforina foi correlacionada com a invasão de tumor emetástase. Um domínio PSI rico em cisteína (também referido como umdomínio de seqüência relacionado a Met) encontrado em plexinas, semaforinase integrinas está situado adjacente ao domínio Sema seguido por quatrorepetições IPT que são regiões similares a imunoglobulina encontradas emplexinas e fatores de transcrição. Um estudo recente sugere que o domínioMet Sema é suficiente para ligação HGF e heparina (Gherardi et ai, Proc NatlAcad Sci U S A (2003), 100(21): 12039-44).

Como apontado acima, o receptor Met tirosina quinase é ativadopelo seu Iigante cognato HGF e a fosforilação do receptor ativa vias a jusantede MAPK, PI-3 kinase e PLC-γ (1, 2). A fosforilação de Y1234/Y1235 nodomínio quinase é crítica para ativação quinase Met enquanto Y1349 e Y1356no sítio de ancoragem multisubstrato são importantes para ligação de srchomologia-2 (SH2), ligação fosfotirosina (PTB), e proteínas (3-5) do domínio deligação Met (MBD), para mediar ativação de vias de sinalização a jusante. Umsítio de fosforilação adicional próximo à membrana, Y1003, foi bemcaracterizado para sua ligação ao domínio tirosina quinase (TKB) da Cbl E3-Iigase (6, 7). Ligação Cbl é relatada por conduzir endocitose do receptormediado por endofilina, ubiquitinação e subsequente degradação do receptor(8). Este mecanismo de desregulação do receptor foi descrito previamente nafamília EGFR que também abriga um sítio de ligação Cbl similar {9-11).

A desregulação de Met e HGF foi relatada em uma variedade detumores. A ativação de Met conduzida por Iigante foi observada em diversoscânceres. HGF elevado no soro e intratumoral é observado em câncer depulmão, de mama e mieloma múltiplo (12-15). A superexpressão de Met e/ouHGF, amplificação ou mutação de Met foi relatada em vários cânceres taiscomo coloretal, de pulmão, gástrico e câncer de rim e acredita-se que conduzaativação do receptor independente do Iigante (2,16). Adicionalmente, asuperexpressão induzível de Met em um modelo de fígado de camundongocausa carcinoma hepatocelular demonstrando que a superexpressão doreceptor conduz a tumorgênese independente de Iigante (17). A evidência maisconvincente envolvendo Met em câncer é relatada em pacientes comcarcinoma papilar renal esporádico e hereditário (RPC). Mutações no domínioquinase de Met que levam à ativação constitutiva do receptor foramidentificadas como linhagem germe e mutações somáticas em RPC (18). Aintrodução dessas mutações em modelos camundongo transgênico leva àtumorgênese e metástase. (19).

Embora o papel do domínio quinase de Met tenha sidoinvestigado em detalhes, e tenha sido teorizado que o aumento dos níveis deexpressão de HGF/c-met provavelmente é base do desenvolvimento de algunscânceres, evidências diretas para um papel biológico para domínios nãoquinase de c-met têm faltado. De fato, apesar de envolvida na etiologia deuma variedade de condições oncológicas, a via HGF/c-met tem sido uma viadifícil de ser atingida terapeuticamente. Esforços nesse sentido foramimpedidos em grande parte pela falta de entendimentos relativos a estesmecanismos de ação pelos quais a desregulação de HGF causa tumorgênese.

Então, está claro que é maior a necessidade para maior entendimento demecanismos de ação oncogênica relacionados a c-met. A invenção fornecidano presente vai de encontro a esta necessidade e fornece outros benefícios.

Todas as referências citadas no presente, incluindo pedidos de patentee publicações, são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Descrição Resumida Da Invenção

A invenção está baseada, pelo menos em parte, na novarevelação de que certos tumores humanos expressam uma proteína c-metmutada que exibe diminuição das taxas de baixa regulação intracelular, mesmoassim são capazes de sinalização celular. Revelou-se que estas proteínas"hiperestabilizadas" possuem atividade oncogênica aumentada comparadascom c-met tipo selvagem. Como mostrado no presente, estes tumores podemser inibidos por inibidores anti-c-met. A inibição da atividade de c-met fornecenumerosas vantagens terapêuticas. Por exemplo, visto que c-met mutantes sãoparticularmente oncogênicos, seria esperado que sua inibição atingida fossediminuir tumorgênese dirigida por estes mutantes. Além disso, visto que c-meté encontrado em muitos tipos celulares, incluindo células normais, a habilidadepara atingir especificamente mutantes c-met específicos de tumores seriaparticularmente benéfico, por exemplo, na redução dos efeitos colaterais daterapia de inibição de c-met. A invenção fornece métodos e composiçõesbaseados nas revelações descritas no presente, e são úteis para atingir e/outratar tumores que possuem c-met hiperestabilizada.

Em um aspecto, a invenção fornece uma substância capaz deespecificamente se ligar a c-met hiperestabilizada. Em uma realização, umasubstância compreende uma atividade inibitória contra atividade biológicaassociada com c-met hiperestabilizada. Em outra realização, a substância écapaz de especificamente se ligar a c-met hiperestabilizada. Em umarealização, a substância se liga a c-met hiperestabilizada e inibe atividade de c-met. Em uma realização, a substância se liga a c-met hiperestabilizada seminibir substancialmente atividade de c-met. Estas substâncias encontram umavariedade de usos, por exemplo, como moléculas para atingir agentesterapêuticos para uma célula que expressa c-met hiperestabilizada. Agentesterapêuticos incluem qualquer um dos agentes descritos no presente, tal comotoxinas. As substâncias podem estar em qualquer forma adequada, incluindo aforma de conjugações anticorpo-droga e fusões de polipeptídeos.

Em um aspecto, a invenção fornece antagonistas de c-met queinterrompem a sinalização HGF/c-met associada com uma proteína c-methiperestabilizada. Em uma realização, a invenção fornece um antagonista queinibe atividade de sinalização c-met de um polipeptídeo c-met hiperestabilizadohumano, em que o polipeptídeo c-met hiperestabilizado compreende umadeleção de pelo menos uma porção do exon 14 tal que sua taxa de degradaçãoem uma célula seja diminuída comparada ao c-met tipo selvagem, e em que opolipetídeo c-met hiperestabilizado possui atividade de sinalização c-met.

Um antagonista da invenção pode ser qualquer forma capaz deespecificamente inibir uma molécula c-met hiperestabilizada como descrito nopresente. Em uma realização, um antagonista da invenção compreende umanticorpo. Em uma realização, um anticorpo da invenção especificamente seliga a um epitopo formado por uma junção na estrutura do exon 13 e exon 15de c-met. Em uma realização, pelo menos uma porção do exon 14 é deletadacomo um resultado de dita junção na estrutura. Em outra realização, umantagonista da invenção compreende um aptâmero. Em uma realização, umaptâmero da invenção especificamente se liga a um epitopo formado por umajunção na estrutura do exon 13 e exon 15 de c-met. Em uma realização, pelomenos uma porção do exon 14 é deletada como um resultado de dita junção naestrutura. Em um aspecto, um antagonista da invenção compreende um RNAinibidor que preferencialmente/seletivamente inibe expressão de uma moléculade ácido nucléico que codifica uma variante de junção de c-met, em que o exon13 é ligado ao exon 15. Em uma realização, o ácido nucléico codifica um c-methiperestabilizado em que pelo menos uma porção do exon 14 é deletada comoum resultado da variante de junção. Em um aspecto, um antagonista dainvenção compreende um RNA inibidor que preferencialmente/seletivamenteinibe expressão de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma variantede junção de c-met, em que o exon 13 é ligado ao exon 15. Em umarealização, a molécula de ácido nucléico codifica um c-met hiperestabilizadoem que pelo menos uma porção do exon 14 é deletada como um resultado davariante de junção.

A inibição da atividade de c-met pode ser efetuada de qualquermaneira conhecida na técnica, contanto que a atividade de c-methiperestabilizado seja diminuída em uma célula. Por exemplo, em umarealização, a inibição da atividade de c-met por um antagonista da invençãocompreende um aumento da degradação celular da proteína c-methiperestabilizada. Em uma realização, a inibição da atividade de c-met por umantagonista da invenção compreende uma inibição da fosforilação da proteínac-met hiperestabilizada. Em ainda outra realização, a inibição da atividade de c-met por um antagonista da invenção compreende inibição da fosforilação deum membro da via de sinalização HGF/c-met por c-met hiperestabilizado. Ainibição da atividade de c-met por um antagonista da invenção pode tambémser efetuada pela redução dos níveis do polipeptídeo c-met hiperestabilizadona célula. Dessa forma, por exemplo, em uma realização, a inibição daatividade de c-met por um antagonista da invenção compreende inibição daexpressão da proteína c-met hiperestabilizada, por exemplo, transcrição e/outradução de um polinücleotídeo que codifica um polipeptídeo c-methiperestabilizado. Em outra realização, a inibição da atividade de c-met por umantagonista da invenção compreende morte celular associada com umacitotoxina ligada a uma molécula (por exemplo, um conjugado anticorpo-droga)que especificamente se liga a c-met hiperestabilizado em uma célula.

Em uma realização, um antagonista da invenção é um anticorpomonoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado, anticorpo humano, anticorpo multi-específico ou anticorpo decadeia única. Antagonistas empregados nos métodos da invenção podemopcionalmente ser conjugados a um agente inibitório de crescimento ou agentecitotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolíticaou similares. Em algumas realizações dos métodos da invenção, um agentequimioterápico é também administrado ao sujeito.

Em geral, antagonistas de c-met efetivos incluem inibidores de c-met que interferem na ligação de um Iigante tal como HGF para c-methiperestabilizado. Por exemplo, um inibidor de c-met pode se ligar ao c-methiperestabilizado tal que a ligação de HGF a c-met seja inibida. Em umarealização, um anticorpo antagonista é um anticorpo quimérico, por exemplo,um anticorpo que compreende seqüências de ligação de antígeno a partir deum doador não humano enxertado com uma seqüência heteróloga nãohumana, humana ou humanizada (tal como, estruturas e/ou seqüências dedomínio constante). Em uma realização, o doador não humano é umcamundongo. Em uma realização, uma seqüência de ligação de antígeno ésintética, por exemplo, obtida por mutagênese (tal como, seleção de exibiçãopor fago, etc.). Em uma realização, um anticorpo quimérico da invenção possuiregiões V de murino e regiões C humanas. Em uma realização, a região V decadeia leve murino é ligada à cadeia leve kappa humana. Em uma realização,a região V de cadeia leve murino é ligada à região C de IgGI humana. Emuma realização, as seqüências de ligação de antígeno compreendem pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três CDRs de uma cadeia leve e/oupesada. Em uma realização, as seqüências de ligação de antígenocompreendem uma CDR3 de cadeia pesada. Em uma realização, asseqüências de ligação de antígeno compreendem toda ou parte da CDR ouseqüências de domínio variável do anticorpo monoclonal produzido pelalinhagem celular de hibridoma depositada com base na Coleção Americana deTipos de Cultura Acesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ouHB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). Em uma realização, as seqüências de ligaçãode antígeno compreendem pelo menos CDR3 da cadeia pesada do anticorpomonoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma 1A3.3.13 ou5D5.11.6. Anticorpos humanizados da invenção incluem aqueles que possuemsubstituições de aminoácido na FR e variantes de maturação de afinidade comtrocas nas CDRs enxertadas. Os aminoácidos substituídos na CDR ou FR nãoestão limitados àqueles presentes no anticorpo doador ou receptor. Em outrasrealizações, os anticorpos da invenção também compreendem trocas nosresíduos de aminoácidos na região Fc que leva à função efetora melhoradaincluindo aumento das funções CDC e/ou ADCC e morte de célula B. Outrosanticorpos da invenção incluem aqueles que possuem trocas específicas quemelhoram a estabilidade. Anticorpos da invenção também incluem variantesdeficientes em fucose que possuem função ADCC melhorada in vivo.

Em uma realização, um fragmento de anticorpo da invençãocompreende um braço de ligação de antígeno que compreende uma cadeiapesada que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as trêsseqüências CDR selecionadas do grupo que consiste de SYWLH (SEQ IDNO:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2) e YGSYVSPLDY (SEQ IDN0:3). Em uma realização, o braço de ligação de antígeno compreende umaCDR-H1 de cadeia pesada que possui a seqüência de aminoácido SYWLH.Em uma realização, o braço de ligação de antígeno compreende uma CDR-H2de cadeia pesada que possui a seqüência de aminoácidoMIDPSNSDTRFNPNFKD. Em uma realização, o braço de ligação de antígenocompreende uma CDR-H3 de cadeia pesada que possui a seqüência deaminoácido YGSYVSPLDY. Em uma realização, um fragmento de anticorpo dainvenção compreende um braço de ligação de antígeno que compreende umacadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas astrês seqüências de CDR selecionadas do grupo que consiste deKSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID NO:5) eQQYYAYPWT (SEQ ID NO:6). Em uma realização, o braço de ligação deantígeno compreende uma CDR-L1 de cadeia pesada que possui a seqüênciade aminoácido KSSQSLLYTSSQKNYLA. Em uma realização, o braço deligação de antígeno compreende uma CDR-L2 de cadeia pesada que possui aseqüência de aminoácido WASTRES. Em uma realização, o braço de ligaçãode antígeno compreende uma CDR-L3 de cadeia pesada que possui aseqüência de aminoácido QQYYAYPWT. Em uma realização, um fragmentode anticorpo da invenção compreende um braço de ligação de antígeno quecompreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma, pelomenos duas ou todas as três seqüências de CDR selecionadas do grupo queconsiste de SYWLH (SEQ ID NO:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2)e YGSYVSPLDY (SEQ ID NO:3) e uma cadeia leve que compreende pelomenos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências de CDRselecionadas do grupo que consiste de KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ IDNO:4), WASTRES (SEQ ID NO:5) e QQYYAYPWT (SEQ ID NO:6).

A invenção fornece um anticorpo antagonista humanizado que seliga a c-met humano hiperestabilizado, ou um fragmento de ligação de antígenodeste, em que o anticorpo é efetivo para inibir a atividade de HGF/c-methiperestabilizado humano in vivo, o anticorpo que compreende na regiãovariável da cadeia H (Vh) pelo menos uma seqüência CDR3 do anticorpomonoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada sobColeção Americana de Tipos de Cultura Número de Acesso ATCC HB-11894(hibridoma 1A3.3.13) ou HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6) e substancialmenteuma seqüência consenso humana (tal como, substancialmente os resíduos deestrutura consenso humana (FR) do subgrupo Ill de cadeia pesada (VHIII)). Emuma realização, o anticorpo também compreende a seqüência CDR1 e/ouseqüência CDR2 da cadeia H do anticorpo monoclonal produzido pelalinhagem celular de hibridoma depositada com base na Coleção Americana deTipos de Cultura Acesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ouHB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). Em outra realização, o anticorpo anteriorcompreende a seqüência CDR1 da cadeia L, a seqüência CDR2 e/ouseqüência CDR3 do anticorpo monoclonal produzido por linhagem celular dehibridoma depositada com base na Coleção Americana de Tipos de CulturaAcesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ou HB-11895(hibridoma 5D5.11.6) com substancialmente resíduos de estrutura de consensohumana (FR) do subgrupo I de cadeia leve κ humana (VkI).

Em uma realização, um fragmento de anticorpo da invençãocompreende um braço de ligação de antígeno que compreende um domíniovariável de cadeia pesada que possui a seqüência:

QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSWSPLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:7)

Em uma realização, um fragmento de anticorpo da invençãocompreende um braço de ligação de antígeno que compreende um domíniovariável de cadeia leve que possui a seqüência:DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:8)

Em ainda outros casos, pode ser vantajoso ter um antagonista dec-met que não interfira na ligação de um Iigante (tal como HGF) para c-met.

Consequentemente, em algumas realizações, um antagonista da invenção nãose liga a um sítio de ligação do Iigante (tal como HGF) em c-met. Em umarealização, um antagonista da invenção não inibe substancialmente a ligaçãodo Iigante (tal como, HGF) a c-met. Em uma realização, um antagonista dainvenção não compete substancialmente com um Iigante (tal como, HGF) paraligação com c-met. Em um exemplo, um antagonista da invenção pode serusado junto com um ou mais outros antagonistas, em que os antagonistas sãoatingidos em diferentes processos e/ou funções no eixo HGF/c-met. Dessaforma, em uma realização, um antagonista de c-met da invenção se liga a umepitopo no c-met diferente do epitopo ao qual outro antagonista de c-met seliga, tal como o fragmento Fab do anticorpo monoclonal produzido pelalinhagem celular de hibridoma depositada com base na Coleção Americana deTipo de Cultura Acesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ou HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). Em outra realização, um antagonista de c-metda invenção é diferente de (isto é, não é) um fragmento Fab do anticorpomonoclonal produzido pela linhagem celular de hibridoma depositada combase na Coleção Americana de Tipo de Cultura Acesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ou HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). Em umarealização, um antagonista de c-met da invenção não compreende umaseqüência de ligação de c-met de um anticorpo produzido pela linhagemcelular de hibridoma depositada com base na Coleção Americana de Tipo deCultura Acesso Número ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) ou HB-11895(hibridoma 5D5.11.6). Em uma realização, um antagonista da invenção inibeatividade de c-met, mas não se liga a um domínio próximo à membrana de c-met tipo selvagem.

Em uma realização de um antagonista da invenção, a ligaçãodo antagonista de c-met inibe ativação de c-met por HGF. Em umarealização de um antagonista de c-met da invenção, a ligação doantagonista de c-met inibe uma proliferação celular, dispersão, morfogênesee/ou motilidade da célula. Em uma realização, um antagonista de c-met dainvenção se liga a c-met hiperestabilizado em uma célula, resultando emmorte celular. Por exemplo, em uma realização, o antagonista é ligado auma toxina como descrito no presente.

Em algumas realizações, um antagonista de c-met da invenção éou compreende um peptídeo (tal como, um oligopeptídeo), anticorpo,fragmento de anticorpo, aptâmero, oligonucleotídeo (tal como, oligonucleotídeoantisense), RNA inibidor ou uma combinação destes.

Em algumas realizações, um antagonista de c-met da invenção éobtido por um método de seleção e/ou identificação da invenção como descritono presente.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para selecionar ouidentificar um antagonista de c-met. Em um exemplo, ditos métodoscompreendem contatar uma substância candidata com uma molécula alvo quecompreende pelo menos uma porção de c-met hiperestabilizado, através dosquais uma substância que especificamente se liga a dita molécula alvo éselecionada (como um antagonista de c-met). Em uma realização, os métodostambém compreendem determinar se uma substância candidata selecionadaespecificamente se liga a uma região mutada de c-met hiperestabilizado. Porexemplo, se a molécula alvo compreende um polipeptídeo, uma substânciacandidata selecionada deveria especificamente se ligar a um epitopo quecompreende uma posição (ou região) mutada de c-met hiperestabilizado. Emoutro exemplo, se a molécula alvo compreende um ácido nucléico que codificapelo menos uma porção de c-met hiperestabilizado, uma substância candidataselecionada deveria especificamente inibir a expressão da proteína c-methiperestabilizada de um ácido nucléico que codifica c-met hiperestabilizado.

Em algumas realizações, métodos de seleção da invenção tambémcompreendem contatar uma substância selecionada com uma célula queexpressa c-met hiperestabilizado, em que a inibição da atividade de c-met nacélula é avaliada (por exemplo, em que a extensão da sinalização c-met ajusante (por exemplo, fosforilação MAPK) é detectada ou marcada). A inibiçãoda atividade de sinalização c-met pode ser avaliada de diversas maneirasconhecidas na técnica, e baseadas em qualquer critério conhecido na técnica,alguns dos quais estão descritos em maiores detalhes no presente. Porexemplo, a inibição da atividade de sinalização de c-met pode ser indicada poruma diminuição na quantidade da ativação de c-met, que pode ser indicadauma por uma pela, por exemplo, quantidade de sinalização celular associada ac-met dentro de uma célula. A sinalização celular pode ser avaliada por umavariedade de métodos e baseada em uma variedade de critérios que sãoconhecidos na técnica, alguns dos quais estão descritos no presente. Porexemplo, a ocorrência de sinalização celular na via HGF/c-met pode semanifestar biologicamente na forma de trocas na fosforilação das moléculasalvo na via de sinalização. Dessa forma, a quantia de fosforilação de proteínaassociada com um ou mais alvos de fosforilação conhecidos na via HGF/c-metpoderia ser medida. Exemplos de tais alvos de fosforilação incluem a própria c-met e proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK).

Em um aspecto, a invenção fornece composições quecompreendem um ou mais antagonistas da invenção e um veículo. Em umarealização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos quecodificam um antagonista de c-met da invenção. Em uma realização, um ácidonucléico da invenção codifica um antagonista de c-met que é ou compreendeum polipeptídeo (tal como, um oligopeptídeo). Em uma realização, um ácidonucléico da invenção codifica um antagonista de c-met que é ou compreendeum anticorpo ou fragmento deste. Em uma realização, um ácido nucléico dainvenção é um aptâmero. Em uma realização, um ácido nucléico da invenção éum oligonucleotídeo antisense. Em uma realização, um ácido nucléico dainvenção é um RNA inibidor (tal como, RNA de interferência pequena).

Em um aspecto, a invenção fornece vetores que compreendemum ácido nucléico da invenção.

Em um aspecto, a invenção fornece células hospedeiras quecompreendem um ácido nucléico ou um vetor da invenção. Um vetor pode serde qualquer tipo, por exemplo, um vetor recombinante tal como um vetor deexpressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode serusada. Em uma realização, uma célula hospedeira é uma célula procarionte,por exemplo, E.coli. Em uma realização, a célula hospedeira é uma célulaeucarionte, por exemplo, uma célula de mamífero tal como célula Ovariana deHamster Chinês (CHO).

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para fazer umantagonista da invenção. Por exemplo, a invenção fornece um método parafazer um antagonista de c-met que é ou compreende um anticorpo (oufragmento deste), dito método que compreende expressão de um vetorrecombinante da invenção em uma célula hospedeira adequada que codificadito anticorpo (ou fragmento deste), e recupera dito anticorpo. Em outroexemplo, a invenção fornece um método para fazer um antagonista de c-metque é ou compreende um polipeptídeo (tal como um oligopeptídeo), ditométodo compreende a expressão de um vetor recombinante da invenção emuma célula hospedeira adequada que codifica dito polipeptídeo (tal como umoligopeptídeo), e recupera dito polipeptídeo (tal como um oligopeptídeo).

Em um aspecto, a invenção fornece um artigo de fabricação quecompreende um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, emque a composição compreende um ou mais antagonistas de c-met dainvenção. Em uma realização, a composição compreende um ácido nucléico dainvenção. Em uma realização, uma composição que compreende umantagonista, além disso, compreende um veículo, que em algumas realizaçõesé farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um artigo de fabricação dainvenção, além disso, compreende instruções para administrar a composição(por exemplo, o antagonista) para um sujeito.

Em um aspecto, a invenção fornece um kit que compreende umprimeiro recipiente que compreende uma composição que compreende um oumais antagonista de c-met da invenção; e um segundo recipiente quecompreende um tampão. Em uma realização, o tampão é farmaceuticamenteaceitável. Em uma realização, uma composição que compreende umantagonista, além disso, compreende um veículo, que em algumas realizaçõesé farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um kit, além disso,compreende instruções para administrar a composição (por exemplo, umantagonista) para um sujeito.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um antagonista dec-met da invenção na preparação de um medicamento para o tratamentoterapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor,uma disfunção proliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune)e/ou uma disfunção relacionada à angiogênese. O antagonista de c-met podeser qualquer forma descrita no presente, incluindo anticorpo, fragmento deanticorpo, polipeptídeo (tal como, um oligopeptídeo), ácido nucléico (tal como,um oligonucleotídeo antisense, RNA inibidor), um aptâmero ou umacombinação destes.Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um ácido nucléicoda invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêuticoe/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, uma disfunçãoproliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune) e/ou umadisfunção relacionada à angiogênese.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um vetor deexpressão da invenção na preparação de um medicamento para o tratamentoterapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor,uma disfunção proliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune)e/ou uma disfunção relacionada à angiogênese.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de uma célulahospedeira da invenção na preparação de um medicamento para o tratamentoterapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor,uma disfunção proliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune)e/ou uma disfunção relacionada à angiogênese.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um artigo defabricação da invenção na preparação de um medicamento para o tratamentoterapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor,uma disfunção proliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune)e/ou uma disfunção relacionada à angiogênese.

Em um aspecto, a invenção fornece o uso de um kit da invençãona preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ouprofilático de uma doença, tal como um câncer, um tumor, uma disfunçãoproliferativa celular, uma doença imune (tal como auto-imune) e/ou umadisfunção relacionada à angiogênese.

A invenção fornece métodos e composições úteis para modularestados da doença associados com descontrole do eixo da sinalização doHGF/c-met associados baixa regulação atrasada de c-met. A via de sinalizaçãoHGF/c-met está envolvida em múltiplas funções biológicas e fisiológicas,incluindo por exemplo, proliferação celular e angiogênese. Dessa forma, em umaspecto, a invenção fornece um método que compreende administrar a umsujeito um antagonista que atinge c-met hiperestabilizado, através do qual asinalização HGF/c-met é modulada.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento deum tumor em um sujeito, dito método que compreende administrar umantagonista da invenção para o sujeito, através do qual o tumor é tratado. Emuma realização, o tumor é determinado para compreender c-methiperestabilizado. Em uma realização, o tumor é determinado paracompreender c-met mutante que compreende deleção de pelo menos umaporção do exon 14.

Em uma realização dos métodos da invenção, um inibidor de c-met da invenção é administrado junto com um agente que induz e/ou aumentaa degradação da proteína do receptor.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibição daproliferação celular ativada por c-met, dito método que compreende contatocom uma célula ou tecido com uma quantidade efetiva de um antagonista de c-met da invenção, através do qual a proliferação celular associada com ativaçãode c-met é inibida.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento deuma condição patológica associada com desregulação da ativação de c-metem um sujeito, dito método que compreende administrar ao sujeito umaquantidade efetiva de uma molécula antagonista de c-met da invenção, atravésda qual dita condição é tratada.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de inibição docrescimento de uma célula que expressa c-met ou fator de crescimento dohepatócito, ou ambos, dito método que compreende o contato de dita célulacom um antagonista de c-met da invenção através disso causando umainibição do crescimento de dita célula. Em uma realização, a célula écontatada pelo HGF expressado por uma célula diferente (por exemplo, atravésde um efeito parácrino).

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratarterapeuticamente um mamífero que possui um tumor canceroso quecompreende uma célula que expressa c-met ou fator de crescimento dohepatócito, ou ambos, dito método que compreende administrar para ditomamífero de uma quantidade efetiva de um antagonista de c-met da invenção,através disso tratando efetivamente dito mamífero. Em uma realização, acélula é contatada pelo HGF expressado por uma célula diferente (porexemplo, através de um efeito parácrino).

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar ouprevenir uma disfunção proliferativa celular associada com aumento daexpressão ou atividade de c-met ou crescimento do hepatócito, ou ambos, ditométodo que compreende administrar a um sujeito uma quantidade efetiva deum antagonista de c-met da invenção, através disso tratar efetivamente ouprevenir dita disfunção proliferativa celular. Em uma realização, a disfunçãoproliferativa celular é câncer.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para inibir ocrescimento de uma célula, em que o crescimento de dita célula é pelo menosem parte dependente de um efeito de crescimento potencializado pelo c-met oufator de crescimento do hepatócito, ou ambos, dito método que compreende ocontatar de dita célula com uma quantidade efetiva de um antagonista de c-metda invenção, através disso inibindo o crescimento de dita célula. Em umarealização, a célula é contatada pelo HGF expressado por uma célula diferente(por exemplo, através de um efeito parácrino).

Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratarterapeuticamente um tumor em um mamífero, em que o crescimento dedito tumor é pelo menos em parte dependente de um efeito de crescimentopotencializado pelo c-met ou fator de crescimento do hepatócito, ou ambos,dito método que compreende o contato de dita célula com uma quantidadeefetiva de um antagonista de c-met da invenção, através disso tratandoefetivamente dito tumor. Em uma realização, a célula é contatada peloHGF expressado por uma célula diferente (por exemplo, através de umefeito parácrino).

Os métodos da invenção podem ser usados para afetarqualquer estado patológico adequado, por exemplo, células ou tecidosassociados com a desregulação da via de sinalização HGF/c-met. Emuma realização, uma célula que é atingida em um método da invenção éuma célula de câncer. Por exemplo, uma célula cancerosa pode seraquela selecionada de um grupo que consiste de uma célula de câncer demama, uma célula de câncer coloretal, uma célula de câncer de pulmão,uma célula de carcinoma papilar (por exemplo, da glândula tireóide), umacélula de câncer de cólon, uma célula de câncer pancreático, uma célulade câncer de ovário, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncerdo sistema nervoso, uma célula de sarcoma osteogêncio, uma célula decâncer renal, uma célula de carcinoma hepatocelular, uma célula decâncer de bexiga, uma célula de câncer de próstata, uma célula decarcinoma gástrico, uma célula de carcinoma escamoso de cabeça epescoço, uma célula de melanoma e uma célula de leucemia. Em umarealização, uma célula que é atingida em um método da invenção é umacélula hiperproliferativa e/ou hiperplástica. Em uma realização, uma célulaque é atingida em um método da invenção é uma célula displástica. Emainda outra realização, uma célula que é atingida em um método dainvenção é uma célula metastática.Os métodos da invenção podem, além disso, compreender etapasadicionais de tratamento. Por exemplo, em uma realização, um método, alémdisso, compreende uma etapa em que uma célula e/ou tecido atingido (porexemplo, uma célula cancerosa) é exposta ao tratamento de radiação ou a umagente quimioterápico.

Como descrito no presente, a ativação de c-met é um processobiológico importante de desregulação que leva a numerosas condiçõespatológicas. Consequentemente, em uma realização dos métodos da invenção,uma célula que é atingida (por exemplo, uma célula cancerosa) é aquela emque a ativação de c-met é aumentada quando comparada a uma célula normaldo mesmo tecido de origem. Em uma realização, um método da invençãocausa a morte celular de uma célula atingida. Por exemplo, o contato com umantagonista da invenção pode resultar em uma inabilidade da célula emsinalizar através da via c-met, o qual resulta na morte celular ou inibição damorte celular. Em outro exemplo, um antagonista da invenção atinge umatoxina ligada a uma célula que expressa c-met hiperestabilizado.

A desregulação da ativação de c-met (e dessa forma, sinalização)pode resultar em um número de mudanças celulares, incluindo, por exemplo,superexpressão de HGF (ligante cognato de c-met) e/ou o próprio c-met(devido ao atraso na baixa regulação/degradação, aumento dos níveis deexpressão, etc.). Consequentemente, em algumas realizações, um método dainvenção compreende atingir uma célula em que c-met ou fator de crescimentodo hepatócito, ou ambos, é mais abundantemente expressado por dita célula(por exemplo, uma célula cancerosa) quando comparado a uma célula normaldo mesmo tecido de origem. Uma célula que expressa c-met pode serregulada pelo HGF de uma variedade de fontes, isto é, em uma maneiraautócrina ou parácrina. Por exemplo, em uma realização dos métodos dainvenção, uma célula atingida é contactada/ligada pelo fator de crescimento dohepatócito expressado na ou por uma célula diferente (por exemplo, via umefeito parácrino). Dita célula diferente pode ser da mesma ou de uma origemde tecido diferente relativo à célula atingida. Em uma realização, uma célulaatingida é contactada/ligada pelo HGF expressado pela própria célula atingida(por exemplo, via um efeito autócrinolloop). A ativação e/ou sinalização de c-met pode também ocorrer independente do ligante. Portanto, em umarealização dos métodos da invenção, a ativação de c-met em uma célulaatingida ocorre independente do ligante.

Em uma realização dos métodos da invenção, os métodostambém compreendem uma etapa que determina se uma célula tumoralcompreende c-met hiperestabilizado (por exemplo, pela detecção de umpolinucleotídeo ou mutação de um polipeptídeo, como descrito no presente).

Breve Descrição Das Figuras

FIG. 1 descreve mutações intrônicas ilustrativas ao redor do exon14 de Met. Uma representação esquemática do exon 14 de Met mostrandodeleções e/ou pontos de mutação (texto cinza claro) do ácido nucléicocorrespondente (NM_000245) com relação à estrutura íntron/exon. (A) H596,linhagem celular de câncer de pulmão. (B) pac. 14, espécime de tumor dopaciente 14. (b) pac. 16, espécime de tumor do paciente 16. Para referência,para tumor H596, existe um ponto de mutação de G até T na posição marcada+1 em (A). Para tumor Pac 14, existe uma deleção da seqüência da posiçãomarcada -27 até -6 em (B). Para tumor Pac 16, existe uma deleção daseqüência da posição marcada 3195 até + 7 em (C).

FIG. 2. Atraso na regulação para baixo de c-met hiperestabilizadoassociado com ativação de Met e MAPK. (A) Células 293 co-transfectadascom construção de Met e Cbl-flag foram imunoprecipitadas (IP) com anticorposV5 ou Cbl seguido por immunoblotting (IP) com V5, flag ou anticorpos P-Tyr.Lisados foram sondados com anticorpos flag ou Cbl. (B) células 293 foramtransfectadas com construções de Met seguido por IP de Cbl endógeno.Immunoblotting com anticorpo V5 mostra que Met WT1 mas não MetAEx14 co-Ips com Cbl endógeno. A membrana foi retirada e resondada com anticorposfosfo-específicos Y1003, YY1234/1235, Y1349 ou Y1365. (C) Usados detransfecção temporária de células 293 foram imunoprecipitados com anticorpoV5 e imunoblotados com anticorpo ubiquitina para detectar Met ubiquitinado.

A membrana foi retirada e resondada com anticorpo V5 para detectar apresença de Met. Lisados foram sondados com anticorpos flag ou actina paradetectar Cbl-flag ou actina para expressão equivalente. (D) Células 293 foramtransfectadas com a construção indicada e tratadas com 10 pg/ml decicloheximida. Lisados foram sondados com anticorpo V5 ou actina. (E)Linhagens celulares de câncer de pulmão privadas de soro foram estimuladaspor 10 minutos com 50 ng/ml de rhuHGF, então lavadas e devolvidas ao meiolivre de soro. Lisados foram coletados nos tempos indicados e imunoblotadospara P-Met (Υ1230ΛΊ234ΛΊ235), Met, P-MAPK, MAPK, P-Akt, ou Akt. (F)Clones estáveis de RAT 1A foram privados de soro e tratados por 10 minutoscom um anticorpo monoclonal de Met agonístico 3D6 (5 pg/ml), lavados comPBS e devolvidos para o meio livre de soro. Nos tempos indicados, Iisadosforam obtidos e imunoblotados para P-MAPK, MAPK, P-Akt, ou Akt.

FIG.3. Aumento do potencial proliferativo dependente deIigante em linhagens celulares que abrigam a deleção de Met próximo àmembrana (A) Crescimento estimulado por HGF em um painel de linhagemcelular NSCLC foi determinado após 72 horas de cultura na presença ouausência de 50 ng/ml de rhuHGF. Os resultados estão descritos como umíndice de estimulação (SI), como determinado a partir de um mínimo detrês experimentos separados. (B) Curvas de crescimento de linhagenscelulares estáveis de Rat 1A inoculados subcutaneamente que expressamvetor, Met WT, Met ΔΕχ14, em cada caso na presença ou ausência de umanticorpo agonista de HGF (3D6) em camundongos nus.

FIG.4. Inibição de sinalização de Met dependente de Iigante ecrescimento em células H596 com um anti-Met mAb, OA-5D5. (A) CélulasH226 ou H596 privadas de soro foram incubadas com OA-5D5 por 30 minutosnas concentrações indicadas e então estimuladas com 100 ng/ml de rhuHGFpor 15 minutos. Lisados foram obtidos e imunoblotados para P-Met(Y1230/Y1234/Y1235), Met1 P-Akt1 P-MAPK ou MAPK. (B) Células foramtratadas com OA-5D5 ou um controle Ig nas concentrações indicadas napresença ou ausência de 50 ng/ml de rhuHGF e a viabilidade celular foideterminada após 72 horas.

FIG. 5. Quantificação de fosfoquinase para razões de quinaseem linhagens celulares estáveis Rat 1A. A razão de P-MAPK:MAPK(esquerda) e P-Akt:Akt (direita) foi quantificada usando-se scannerinfravermelho Odyssey que detecta anticorpos secundários conjugadosAlexaFluor680 e IR Dye800.

FIG. 6. Quantificação de fosfoquinase para razões de quinase emcélulas H596 e H226 tratadas com AO-5D5. A razão de P-Met:Met, P-Akt.Aktou P-MAPK:MAPK para cada linhagem celular foi quantificada usando-sescanner infravermelho Odyssey que detecta anticorpos secundáriosconjugados AlexaFluor680 e IR Dye800.

FIG. 7 descreve elementos ilustrativos de junção que atuam emeis que se espera que regulem a junção do exon 14 de c-met humano. Espera-se que uma mutação em uma ou mais posições nestes elementos tenham umimpacto negativo na junção do exon 14 tipo selvagem.

FIG. 8 descreve a seqüência da proteína c-met humana tiposelvagem baseada na RefSeq. NM_000245.

FIG. 9 descreve seqüências de domínio variável de cadeiapesada e leve para o anticorpo AO-5D5 referido nos Exemplos.Modos Para Realizar A Invenção

A invenção fornece métodos, composições, kits e artigos defabricação para identificar inibidores da via de sinalização HGF/c-met (em particular,inibidores de c-met hiperestabilizado), e métodos para uso de tais inibidores.

Detalhes destes métodos, composições, kits e artigos defabricação são fornecidos no presente.

Técnicas Gerais

A prática da presente invenção irá empregar, a menos queindicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular(incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica eimunologia, que estão dentro das técnicas do assunto. Tais técnicas sãototalmente explicadas na literatura, tais como, "Molecular Cloning: A LaboratoryManuaf,segunda edição (Sambrook et ai, 1989); "Oligonucleotide Synthesis"(M. J. Gait, ed„ 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987);"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols inMolecular Biology" (F. M. Ausubel et ai, eds., 1987, e periódicos atuais);"PCR:The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et ai, ed., 1994); "A Practical Guide toMolecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988).

Definições

O termo "c-met hiperestabilizado" e variações deste, como usadono presente, referem-se a um c-met humano mutante de ocorrência natural queé degradado/diminuído a uma taxa que é detectável mais lentamente do queaquela de um c-met tipo selvagem. Métodos de comparação de taxas dedegradação/regulação para baixo entre c-met tipo selvagem e c-methiperestabilizado seria evidente para aquele técnico no assunto, incluindo, porexemplo, como descrito nos Exemplos abaixo. Em um caso, o atraso nadegradação/regulação para baixo é avaliado baseado na quantificação dosníveis de proteína do receptor em uma célula. Em outro caso, a atraso nadegradação/regulação para baixo é determinado baseado na detecção de umamutação em um sítio c-met que está associado com ligação Cbl a c-met. Em umcaso, a mutação é no sítio c-met que está associado com ubiquinação de c-met(tal como, no exon 14 de c-met) e regulação de degradação de proteína doreceptor/regulação para baixo. Estas mutações podem aparecer em qualquerforma que resulte na expressão de uma proteína c-met mutada que édegradada/ diminuída em uma taxa mais lenta do que c-met tipo selvagem, emque a proteína c-met mutada seja capaz de ter atividade associada a c-met tiposelvagem (por exemplo, fosforilação de molécula a jusante tal como MAPK queestimula proliferação e/ou indução de eventos tumorgênicos). Por exemplo,estas mutações incluem aquelas que estão associadas com expressão de umavariante de junção c-met funcional na estrutura que é desprovida de pelo menosuma porção do exon 14 que está associada com degradação de proteína doreceptor/regulação para baixo. Exemplos ilustrativos de mutações incluem aqueles encontrados em um elemento de junção como descrito nas Figuras 1 e7. Em uma realização, a presença de uma proteína c-met hiperestabilizada dainvenção em uma célula está associada com a fosforilação prolongada e/ouaumentada de moléculas a jusante na via HGF/c-met quando comparado comuma quantia similar de proteína c-met tipo selvagem em uma célula.

O termo "vetor", como utilizado no presente, tem a intenção de sereferir a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácidonucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere auma fita dupla circular de DNA Ioop no qual seguimentos de DNA adicionaispodem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor éum vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados nogenoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em umacélula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetoresbacterianos que têm uma origem de replicação bacteriana e vetores episomaisde mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não-episomais demamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira pelaintrodução em uma célula hospedeira, e através disso serem replicados juntocom o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes dedirecionar a expressão de genes para o qual eles são ligados operativamente.

Tais vetores são referidos no presente como "vetores de expressãorecombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Em geral,vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estãofreqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente a medida que oplasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.

"Polinucleotídeo" ou "ácido nucléico", como usado alternadamenteno presente, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento,e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos,ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ouqualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por DNA ouRNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo podecompreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados eseus análogos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podemser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A seqüência denucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Opolinucleotídeo pode ser, além disto, modificado depois da síntese, tal comopela conjugação com uma marca. Outros tipos de modificações incluem, porexemplo, "caps", substituições de um ou mais nucleotídeos de ocorrêncianatural com um análogo, modificações internucleotídeos tais como, porexemplo, aquelas com ligações não carregadas (tais como, fosfonato de metila,fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas(tais como, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles contendo unidadespendentes, tais como, por exemplo, proteínas (tais como, nucleases, toxinas,anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (taiscomo, acridina, psoralen, etc.), aqueles contendo quelatos (tais como, metais,metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aqueles contendoalquiladores, aqueles com ligações modificadas (tais como, ácidos nucléicosalfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas depolinucleotídeo(s). Além disto, qualquer um dos grupos hidroxil geralmentepresentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por gruposfosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ouativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, oupodem ser conjugados a suportes sólidos ou semi-sólidos. As terminação OH5' e 3' podem ser fosforiladas ou substituídas por componentes do grupo aminaou de revestimento orgânico com 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilaspodem também ser derivadas para grupos de proteção padrão.

Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de ribose ou açúcaresdesoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, porexemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluor- ou 2'-azido-ribose, açúcarescarbocíclicos análogos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos taiscomo arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose,sedoheptuloses, acíclicos análogos e nucleosídeos análogos não básicos talcomo metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem sersubstituídas por grupos de ligações alternativas. Estes grupos de ligaçõesalternativas incluem, mas não são limitados a, realizações em que o fosfato ésubstituído por P(O)SCtioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR.sub.2 ("amidato"),P(O)R, P(O)OR', CO ou CH.sub.2 ("formacetol"), no qual cada R ou R1 éindependente de H ou substituído ou não substituído por alquil (1-20 C.)opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-) ligado, aril, alquenil, cicloalquil,cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisamser idênticas. A descrição anterior aplica-se para todos os polinucleotídeosreferidos no presente, incluindo RNA e DNA.

"Oligonucleotídeo", como utilizado no presente, geralmente refere-se à fita curta simples, geralmente polinucleotídeos sintéticos que sãogeralmente, mas não necessariamente, menor que aproximadamente 200nucleotídeos no comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo"não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos éigualmente e completamente aplicável para oligonucleotídeos.

O termo "fator de crescimento do hepatócito" ou "HGF", comousado no presente, refere-se, a menos que indicado de outra forma, a qualquerpolipeptídeo HGF nativo ou variante (se nativo ou sintético) que é capaz deativar a via de sinalização HGF/c-met sob condições que permitam tal processoocorrer. O termo "HGF tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeoque compreende a seqüência de aminoácido de uma proteína HGF deocorrência natural. O termo "seqüência HGF tipo selvagem" geralmente refere-se a uma seqüência de aminoácido encontrada em um HGF de ocorrêncianatural. C-met (ou Met) é um receptor conhecido para HGF por meio do qual asinalização intracelular HGF é biologicamente efetuada. Uma proteína c-methumana tipo selvagem baseada na RefSeq NM_000245 está descrita na Fig.8.

Os termos "sítio de junção", "cruzamento de junção", "ponto deramificação", "trato polipirimidina", como usados no presente, referem-se aosignificado conhecido na técnica no contexto de mamífero, em específicohumano, junção de RNA. Ver, por exemplo, Pagani & Baralle, Nature Reviews:Genetics (2004), 5:389-396, e referências citadas neste. Para convenientereferência, uma realização de seqüências para elementos de junção de RNA c-met é apresentada de forma ilustrativa na Figura 7.

O termo "célula hospedeira" (ou célula recombinante), comousado no presente, tem a intenção de se referir a uma célula que foigeneticamente alterada, ou é capaz de ser geneticamente alterada pelaintrodução de um polinucleotídeo exógeno, tal como um plasmídeo ou vetorrecombinante. Deve ser entendido que tais termos têm a intenção de se referirnão somente à célula do sujeito específico, mas também à progênie de talcélula. Devido a certas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivasdevido tanto à mutação como a influências ambientais, tais progênies podemna verdade não ser idênticas à célula parental, mas estão ainda incluídasdentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado no presente.

"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínasque possuem as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorposexibem especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinasincluem tanto anticorpos como outras moléculas similares a anticorpos quegeralmente são desprovidas de especificidade de antígeno. Polipeptídeos doúltimo tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfáticoe em níveis maiores pelos mielomas.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usadosalternadamente no mais amplo sentido e incluem anticorpos monoclonais (porexemplo, anticorpos de comprimento total ou monoclonais intactos), anticorpospoliclonais, monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos(por exemplo, anticorpos biespecíficos desde que eles exibam a atividadebiológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos(como descrito em maiores detalhes no presente). Um anticorpo pode serquimérico, humano, humanizado e/ou de afinidade maduros.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem somente uma porçãode um anticorpo intacto, em que a porção mantém preferivelmente pelomenos uma, preferivelmente a maioria ou todas, as funções normalmenteassociadas com a porção quando presente em um anticorpo intacto. Emuma realização, um fragmento de anticorpo compreende um sítio ligação deantígeno do anticorpo intacto e dessa forma mantém a capacidade de seligar ao antígeno. Em outra realização, um fragmento de anticorpo, porexemplo, aquele que compreende a região Fc, mantém pelo menos uma dasfunções biológicas normalmente associadas com a região Fc quandopresente em um anticorpo intacto, tal como ligação FcRn, modulação demeia vida do anticorpo, função ADCC e ligação complementar. Em umarealização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que temuma meia vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Porexemplo, tal como um fragmento de anticorpo pode compreender um braçode ligação de antígeno ligado a uma seqüência Fc capaz de conferir in vivoestabilidade para o fragmento.

Os termos "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando usadosno presente referem-se às regiões de um domínio variável de anticorpo quesão hipervariáveis na seqüência e/ou formas estruturalmente definidas comoloops. As letras "HC" e "LC" que antecedem os termos "HVR" ou "HV" referem-se, respectivamente, à HVR ou HV de uma cadeia pesada e cadeia leve.Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis, três na VH(H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série de delineações de regiõeshipervariáveis está em uso e são englobadas no presente. As RegiõesDeterminadas por Complementaridade (CDRs) são baseadas na variabilidadede seqüência e são mais comumente utilizadas (Kabat et al., Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia ao contrário refere-se àlocalização dos loops estruturais (Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917(1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre as CDRsde Kabat e loops estruturais de Chothia, e são usadas pelo programa demodelação de anticorpo da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de"contato" são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexasdisponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis sãoapontados abaixo.

Loop de Kabat AbM Chothia Contato

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96Η1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Numeração de Kabat)Η1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Numeração de Chothia)H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

"Região de estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos dedomínio variável, exceto os resíduos de região hipervariável como definido nopresente.

A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-seaos domínios terminais dos aminoácidos de cadeia pesada ou leve doanticorpo. Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de umanticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.

O termo "anticorpo monoclonal" como utilizado no presenterefere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpossubstancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos, exceto por possível ocorrêncianatural de mutações que podem estar presentes em menores quantidades.Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra umúnico antígeno. Além disto, em contraste com preparações de anticorpopoliclonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contradiferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigidocontra um único determinante no antígeno.

Os anticorpos monoclonais no presente especificamente incluemanticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve éidêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivadosde uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasseespecífica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ouhomóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outraespécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, assim comofragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et ai, Proc. Nati Acad. Sei.USA 81:6851-6855 (1984)).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maioria, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejadaespecificidade, afinidade e capacidade. Em alguns exemplos, resíduos daregião de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos porresíduos correspondentes não humanos. Além do mais, anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não são encontrados noanticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para,além disto, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpohumanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, etipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todosos Ioops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina nãohumana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de umaseqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmenteirá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante(Fc) da imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Paradetalhes adicionais, ver Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann etai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596(1992). Ver também os seguintes artigos de revisão e referências citadasnestes: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115(1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle eGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por umhumano e/ou foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazeranticorpos humanos como divulgado no presente. Esta definição de umanticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado quecompreende resíduos de ligação de antígeno não humanos.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais CDRs/HVRs destes, que resulta em um aprimoramentona afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpo parental quenão possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terãoafinidades nanomolar ou até afinidades picomolar para o antígeno alvo. Anticorposde afinidade madura são produzidos por processos conhecidos na técnica. Marks etai Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve a maturação da afinidade por misturade domínio VH e VL. Mutagênese randômica de CDR/HVR e/ou resíduos deestrutura é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994);Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004(1995); Jackson et ai, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Moi Bioi226:889-896 (1992).O termo "região Fe" é usado para definir a região C-terminal deuma imunoglobulina de cadeia pesada que pode ser gerada por digestão porpapaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc deseqüência nativa ou uma região Fc variante. No entanto os limites da região Fcde uma imunoglobulina de cadeia pesada podem variar, a região Fc de cadeiapesada de IgG humana é usualmente definida para alcançar desde um resíduode aminoácido aproximadamente na posição Cys226 ou aproximadamente naposição Pro230, até a terminação carboxil da região Fe. A região Fc de umaimunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínioCH2 e um domínio CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4. Por"cadeia de região Fc" no presente entende-se uma das duas cadeias depolipeptídeo de uma região Fc.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente refere-se auma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruiçãode células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (porexemplo, At211, I1311 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterápicos, e toxinas tal como toxinas demolécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas.

Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentesalquiladores tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonadostais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa,carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindoaltretamina, trietilenemelamína, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida etrimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona);delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análogatopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo adozelesina, carzelesina e bizelesina sintéticaanálogas); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio taiscomo clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas taiscomo carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, eranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo,caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicinaomega 11 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994));dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforosde neocarzinostatina e cromóforos de antibióticos enedina cromoproteínasrelacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN® morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, injeção de IipossomaHC1 doxorubicina (DOXIL®) e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina,idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácidomicofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina,puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina,tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais comometotrexato, gencitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina(XELODA®), uma epotilona, e 5-fluorouracil (5-FU); ácido fólico análogos taiscomo denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina taiscomo fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti- adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;ácido fólico restabelecedor tais como ácido frolinico; aceglatona; glicosídeo dealdofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucila;bisantrena; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina;acetato de eliptinio; etoglucideo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan;lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas;mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet;pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexospolissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana;rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A,roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®);dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina;arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®),formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina engenherada(ABRAXANE™), e doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucila; 6-tioguanina;mercaptopurina; metotrexatO; análogos platina tais como cisplatina ecarboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida;mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina(NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina;ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO);retinóides tais como ácido retinóico; sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidosou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois oumais dos acima tais como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinadade ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™)combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos dehormônios que podem promover o crescimento de câncer, e estãofreqüentemente na forma de sistêmico, ou tratamento do corpo inteiro. Elespodem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos emoduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, porexemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno(EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018,onapristona, e toremifene (FARESTON®); anti-progesteronas; baixosreguladores de receptores de estrógeno (ERDs); antagonistas de receptores doestrógeno tal como fulvestrante (FASLODEX®); agentes de função desupressão ou fechamento dos ovários, por exemplo, hormônio Iuteinizante quelibera hormônios agonistas (LHRH) tais como acetato de Ieuprolida(LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina etripterelina; outros anti-androgênicos tais como flutamida, nilutamida ebicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, a qualregula a produção de estrógeno na glândula adrenal, tais como, por exemplo,4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®),exemestano (AROMASIN®), formestano, fadrozola, vorozola (RIVISOR®),Ietrozola (FEMARA®), e anastrozola (ARIMIDEX®). Além disto, tal definiçãode agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (porexemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095,ácido zoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®),pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®);assim como troxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga);oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão degenes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal, taiscomo, por exemplo, PKC-alfa, Raf1 H-Ras1 e receptor do fator de crescimentoepidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas deterapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, evacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®);rmRH (por exemplo, ABARELIX®); Iapatinib ditosilato (uma ErbB-2 e inibidor demolécula pequena de tirosina quinase EGFR dual também conhecido comoGW572016); inibidores COX-2 tal como celocoxib (CELEBREX®; benzenosulfonamida 4-(5-(4-metilfenil)-3-(triflúormetil)-1H-pirazol-1-y1); e saisfarmaceuticamente aceitáveis , ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" éaquele que inibe ou reduz as atividades biológicas do antígeno ao qual se liga.Tais bloqueios podem ocorrer por muitos meios, por exemplo, pela inteferênciana interação proteína-proteína, tal como ligação do Iigante a um receptor. Emuma realização, anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibemsubstancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento/proliferação celular irregular. Exemplos de câncer incluem, masnão são limitados a, carcinoma, Iinfoma (por exemplo, Iinfoma de Hodgkin eIinfoma não-Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos maisespecíficos de tais cânceres incluem câncer celular escamoso, câncer depulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena,adenocarcinoma de pulmão, carcinoma escamoso de pulmão, câncer deperitônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático,câncer de glioblastoma cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer debexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal,carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma glandular salivar, câncer de rim,câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide,carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço.

Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervençãoclínica em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célulasendo tratada, e pode ser apresentado também por profilaxia ou durante ocurso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluemprevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas,diminuição de quaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas dadoença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão dadoença, melhora ou estados de alívio da doença, e moderação ouprognósticos de melhora. Em algumas realizações, moléculasmoduladoras e métodos da invenção são usados para atrasar odesenvolvimento de uma doença ou disfunção.

Uma "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, nasdosagens e pelo período de tempo necessário, para atingir o resultado terapêutico ouprofilático desejado. Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de um agenteterapêutico pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade,sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo obter uma resposta desejadano indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também aquela em quequalquer efeito tóxico ou prejudicial do agente terapêutico é excedido pelos efeitosterapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente efetiva" refere-se auma quantidade efetiva, na dosagem e por período de tempo necessário para atingiro resultado profilático desejado. Tipicamente mas não necessariamente, desde queuma dose profilática seja usada em sujeitos, anterior ou em um estágio inicial dadoença, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidadeterapeuticamente efetiva.Composições ε Métodos Da Invenção

A. Anticorpos Antagonistas De C-Met

Em uma realização, a invenção fornece anticorpos antagonistasde c-met que podem encontrar um uso no presente como agentes terapêuticose/ou de diagnóstico. Anticorpos exemplares incluem policlonais, monoclonais,humanizados, biespecíficos e anticorpos heteroconjugados. Aspectos parageração, identificação, caracterização, modificação e produção de anticorpossão bem estabelecidos na técnica, por exemplo, como descrito na patente US2005/0042216 a partir dos parágrafos 522 até 563, 604 até 608 e 617 até 688.

Anticorpos antagonistas de c-met divulgados no presente podem serformulados em qualquer forma adequada para entrega para uma célula/tecidoalvo. Por exemplo, os anticorpos podem ser formulados como imunolipossomos.

Um "lipossomo" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos,fosfolipídeos e/ou surfactante que é útil para a entrega de uma droga para ummamífero. Os componentes do lipossomo estão comumente dispostos em umaformação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.Lipossomos que contêm o anticorpo são preparados pelos métodos conhecidosna técnica tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688(1985); Hwang et al., Proc._Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); patentes US4.485.045 e 4.544.545; e documento WO 97/38731 publicado em 23 de outubrode 1997. Lipossomos com tempo de circulação aumentada estão divulgados napatente US 5.013.556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelométodo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo quecompreende fosfatidicolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG(PEG-PE). Lipossomos são retirados através de filtros com tamanho de porodefinido para produzir Iipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab'do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos Iipossomoscomo descrito em Martin et ai, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via umareação entre cadeia de bissulfeto. Um agente quimioterápico estáopcionalmente contido dentro do lipossomo. Ver Gabizon et ai J. NationalCâncer lnst.81 (19)1484 (1989).

B. Polipeptídeos Antagonistas De C-Met

Em um aspecto, um antagonista de c-met da invençãocompreende um polipeptídeo. Em uma realização, o polipeptídeo antagonistase liga e/ou antagoniza com proteína c-met hiperestabilizada em uma célula.

Em uma realização, o polipeptídeo se liga, preferivelmente especificamente ac-met hiperestabilizado. Os polipeptídeos podem ser quimicamente sintetizadosusando-se metodologias de síntese de peptídeos ou podem ser preparados epurificados usando-se tecnologia recombinante. Em uma realização,polipeptídeo antagonista de c-met é de pelo menos aproximadamente 5aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos em comprimento ou mais, em quetais polipeptídeos são capazes de inibir atividade de c-met hiperestabilizado.Estes polipeptídeos podem ser identificados sem experimentação exageradausando-se técnicas conhecidas. Com este propósito, é apontado que técnicaspara seleção de bibliotecas de oligopeptídeos para oligopeptídeos que sãocapazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo alvo são bemconhecidas (ver, por exemplo, patentes US 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871,4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; publicações PCTdocumento WO 84/03506 e documento WO 84/03564; Geysen et al., Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et ai, Proc. Nati Acad.Sei. U.S.Α., 82:178-182 (1985); Geysen et al., em Synthetic Peptides asAntigens, 130-149 (1986); Geysen et ai, J. Immunol. Meth., 102:259-274(1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al.(1990) Proc. NatL Acad. Sei. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991)Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks1 J.D. et al. (1991), J. Moi Biol., 222:581; Kang, A.S. etal. (1991) Proc. Nati Acad.Sei. USA, 88:8363, e Smith, G. P. (1991) Current Opin._Biotechnol., 2:668).

Exibição por bacteriófago (fago) é uma técnica bem conhecida quepermite selecionar amplas bibliotecas de oligopeptídeos para identificar membro(s)daquelas bibliotecas que são capazes de especificamente se ligar a um alvopolipeptídico. Exibição por fago é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes sãoexibidos como proteínas de fusão para a proteína de revestimento na superfície daspartículas de bacteriófagos (Scott, J.K. e Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). Autilidade da exibição por fago permanece no fato de que biblioteca de seletividaderandomizada de proteínas variantes (ou cDNAs clonados randômicos) podem serrapidamente e eficientemente classificadas para àquelas seqüências que se ligam auma molécula alvo com alta afinidade. Exibição de peptídeo (Cwirla, S. E. et al.(1990) Proc. Nati Acad. Sei. USA, 87:6378) ou proteína (Lowman, H.B. etal. (1991)Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. etal. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. etal. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. etal. (1991) Proc. Nati Acad. Sei. USA,88:8363) bibliotecas em fago foram usadas para selecionar milhões depolipeptídeos ou oligopeptídeos para aquelas com propriedades de ligaçãoespecíficas (Smith, G. P. (1991) Current Opin._Biotechnol., 2:668). A classificaçãode bibliotecas de fago de mutantes randômicos requer uma estratégia paraconstrução e propagação de um grande número de variantes, um procedimentopara purificação de afinidade usando-se o receptor alvo e meios para avaliação deresultados de aprimoramento de ligação. Patentes US 5.223.409, 5.403.484,5.571.689 e 5.663.143.Embora a maioria dos métodos de exibição por fago usou fagofilamentoso, sistemas de exibição por fago lambdóide (documento WO95/34683; patente US 5.627.024), sistemas de exibição por fago T4 (Ren et ai,Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Câncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998);Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et ai, Gene,195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et ai, VirusGenes, 10: 173 (1995)) e sistemas de exibição por fago T7 (Smith e Scott,Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); patente US 5.766.905) sãotambém conhecidos.

Muitos outros aprimoramentos e variações do conceito deexibição por fago básica foram agora desenvolvidos. Estes aprimoramentosaumentam a habilidade dos sistemas de exibição para seleção de bibliotecasde peptídeos para ligação a moléculas alvo selecionadas e para exibirproteínas funcionais com o potencial de seleção destas proteínas parapropriedades desejadas.

Dispositivos de reação combinatória para reações de exposiçãopor fago foram desenvolvidos (documento WO 98/14277) e bibliotecas deexibição por fago foram usadas para analisar e controlar interaçõesbiomoleculares (documento WO 98/20169; documento WO 98/20159) epropriedades de peptídeos helicoidais constritos (WO 98/20036). O documentoWO 97/35196 descreve um método de isolamento de um Iigante de afinidadena qual uma biblioteca de exibição por fago é contatada com uma solução emque o Iigante irá se ligar a uma molécula alvo e uma segunda solução na qual oIigante de afinidade não irá se ligar à molécula alvo, para isolar seletivamenteligações de ligantes. O documento WO 97/46251 descreve um método de ciclode seleção de uma biblioteca aleatória de exposição por fago com um anticorpode afinidade purificada e então isolamento de ligação de fago, seguido por umprocesso de microciclo de seleção usando-se microplacas com poços paraisolar fagos com alta afinidade de ligação. O uso de Staphlylococcus aureusproteína A como um tag de afinidade foi também reportado (Li et ai (1998) MolBiotech., 9:187). O documento WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecas desubtração de substrato para distinguir especificação de enzimas usando-seuma biblioteca combinatória que pode ser uma biblioteca de exibição por fago.Um método para seleção de enzimas adequadas para uso em detergentesusando-se exposição por fago está descrito no documento WO 97/09446.Métodos adicionais de seleção de proteínas de ligação específicas estãodescritos nas patentes US 5.498.538, 5.432.018 e documento WO 98/15833.

Métodos para geração de bibliotecas de peptídeos e seleçãodestas bibliotecas estão também divulgados nas patentes US 5.723.286,5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426,5.763.192 e 5.723.323.

Métodos para geração, identificação, caracterização, modificaçãoe produção de polipeptídeos agonistas são bem estabelecidos na técnica, porexemplo, como descrito na patente US 2005/0042216 a partir dos parágrafos606 até 614, 604 até 608 e 617 até 688.

Em uma realização, polipeptídeos para antagonizar com atividadec-met hiperestabilizada podem ser projetados baseados na estrutura deproteína c-met hiperestabilizada, por exemplo, pela seleção baseada noantigeno alvo que compreende uma seqüência mutante c-met próxima àmembrana que compreende deleção de pelo menos uma porção do exon 14como descrito no presente. Por exemplo, um antigeno alvo pode compreenderum polipeptídeo que compreende uma seqüência resultante de uma junção naestrutura do exon 13 e 15 de c-met.

C. Imunoconjugados

Em outro aspecto, a invenção imunoconjugados ou conjugaçãoanticorpo-droga (ADC), que compreende um anticorpo conjugado a um agentecitotóxico tal como um agente quimioterápico, uma droga, um agente inibitóriode crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa deorigem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas) ou umisótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

O uso de um conjugado anticorpo-droga para a entrega local deagentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para destruir ou inibir célulasde tumor no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999) AnticancerResearch 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del.Acelere. 26:151-172; na patente US 4.975.278) permite entrega direcionada docomponente droga para tumores, e acúmulo intracelular nestes, onde aadministração sistêmica destes agentes droga não conjugados podem resultarem um nível inaceitável de toxicidade para células normais assim como célulasde tumor procuradas para serem eliminadas (Baldwin et a!., (1986) Lancet pp.(Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of CytotoxicAgentsIn Câncer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies '84: Biological AndClinicai Applications, A. Pinchera et ai (ed.s), páginas. 475-506). A máximaeficiência com mínima toxicidade é procurada através disso. Ambos osanticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram reportados como úteisnestas estratégias (Rowle et ai, (1986) Câncer lmmunol. Immunother., 21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina,metotrexato, e vindesina (Rowle et ai, (1986) acima). Toxinas usadas nosconjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina dedifteria, toxinas vegetais tais como rícino, toxinas de molécula pequena talcomo geldanamicina Mandler et ai (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst.92(19):1573-1581; Mandler et ai (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791),maitansinoides (EP 1391213; Liu et ai, (1996) Proe. Nati Acad. Sei. USA93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928;Hinman et al. (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem efetuarseus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação detubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase. Algumas drogascitotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas comgrandes anticorpos ou proteína do receptor ligante.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/ldec) é um anticorpo-radioisótopo conjugado composto de um anticorpo monoclonal kappa IgGImurino direcionado contra o antígeno CD20 encontrado na superfície delinfócitos B normal e maligno e radioisótopos 111In ou 90Y ligados por umatiouréia ligante quelada (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin.OncoL 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. OncoL 20(15):3262-69). Noentanto, ZEVALIN possui atividade contra Linfoma não Hodgkin de célula-B(NHL), a administração resulta»em citopenias severas e prolongadas na maioriados pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, WyethPharmaceuticals), uma conjugação anticorpo droga composto de um anticorpohu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovada em 2000 para o tratamento deleucemia mielóide aguda por injeção (Drugs ofthe Future (2000) 25(7):686; naspatentes US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116;5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), umconjugado anticorpo-droga composto de anticorpo huC242 ligado a um liganteSPP bissulfeto ao componente droga maitansinoide, DM1, está testado para otratamento de cânceres que expressam CanAg1 tais como cólon, pancreático,gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, ImmunogenInc.), um anticorpo conjugado com droga composto de anticorpo monoclonal deantígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) e ligado aocomponente droga maitansinoide, DM1, está testado para o tratamentopotencial de tumores de próstata. Os peptídeos auristatina, auristatina E (AE) emonometilauristatina (MMAE)1 sintéticos análogos de dolastatina, foramconjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para LewisY em carcinomas) e cAC10 (específico para CD30 em malignidadeshematoiógicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) eestão em desenvolvimento terapêutico.

Agentes quimioterápicos úteis na geração de taisimunoconjugados estão descritos no presente (acima). Toxinasenzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluemcadeia de difteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina de difteria, cadeiaA de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A daabrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínasdiantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidorcarantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Ver, porexemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Umavariedade de radionuclídeos estão disponíveis para a produção de anticorposradioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131In, 90Y, e 186Re. Conjugadosde anticorpo e agente citotóxico são feitos usando-se uma variedade deagentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais deimidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tal comodisuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos bis-azido(tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônio derivados (tal comobis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos bis-ativos de flúor (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparadacomo descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcadocom carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação deradionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculapequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas,aurostatinas, um tricoteceno e CC1065, e os derivados destas toxinas quepossuem toxina ativa, são também contemplados no presente.

Maitansina E Maitansinoides

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas maitansinoides.

Maitansinoides são inibidores mitóticos que agem por inibição dapolimerização da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez doarbusto do Leste Africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111).

Subseqüentemente foi revelado que certos micróbios também produzemmaitansinoides, tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (patente US4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos destes estãodivulgados, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746,4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4.308.269, 4.309.428,4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866,4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533.

Componentes droga maitansinoides são componentes drogaatrativos em conjugados anticorpo-droga porque eles são: (i) relativamenteacessíveis para preparar por fermentação ou modificação química, derivaçãode produtos de fermentação (ii) receptivos para derivação com gruposfuncionais adequados para conjugação através de Iigantes não bissulfeto paraanticorpos (iii) estáveis no plasma e (iv) efetivos contra uma variedade delinhagens celulares de tumor.

Realizações exemplares de componentes droga maitansinoidesincluem: DM1; DM3 e DM4. Imunoconjugados que contêm maitansinoides,métodos para fazer o mesmo e seus usos terapêuticos são divulgados, porexemplo, nas patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente Européia EP 0 425235 B1, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados aopresente como referência. Liu et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623(1996) descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinoidedesignado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 diretamente contracâncer coloretal humano. Foi revelado que o conjugado é altamente citotóxicodirigido à cultura de células cancerosas de cólon, e foi mostrado ter atividadeanti-tumor em ensaios de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., CâncerResearch 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados no qual ummaitansinoide foi conjugado via um Iigante bissulfeto a um anticorpo murino A7que se liga a um antígeno de linhagem celular de câncer no cólon humano ou aoutro anticorpo monoclonal murino TA.1 que liga-se ao oncogene HER-2/neu.A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinoide foi testada in vitro emlinhagem celular SK-BR-3 de câncer de mama humano, a qual expressaantígenos de superfície 3 χ 105 HER-2 por célula. A droga conjugada atingiuum grau de citotoxicidade similar à droga maitansinoide livre, a qual poderia seraumentada para elevar o número de moléculas maitansinoide por molécula deanticorpo. O conjugado A7-maitansinoide mostrou baixa citotoxicidadesistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo maitansinoides podem ser preparadas porligações químicas em um anticorpo e uma molécula maitansinoide semdiminuição significante da atividade biológica tanto do anticorpo como damolécula maitansinoide. Ver, por exemplo, patente US 5.208.020 (a divulgaçãodestas está expressamente incorporada ao presente como referência). Emmédia de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticorpomostrou eficácia no aumento da citotoxicidade das células alvo sem afetarnegativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, no entanto poderia seresperado que até uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidadeacima do uso do anticorpo nu. Maitansinoides são bem conhecidos na técnica epodem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontesnaturais. Maitansinoides adequados são divulgados, por exemplo, na patente US5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentes referidas no presenteacima. Maitansinoides preferidos são maitansinol e maitansinol análogosmodificados em um anel aromático ou em outras posições da molécula demaitansinol, tal como vários ésteres maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica parafazer conjugações anticorpo-maitansinóides, incluindo, por exemplo, aquelesdivulgados na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1, e Chari etaí., Câncer Research 52:127-131 (1992), e pedido de patente US 10/960.602,depositada em 8 de outubro de 2004, as divulgações destas sãoexpressamente incorporadas ao presente como referência. Conjugadosanticorpo-maitansinóide que compreendem o componente Iigante SMCCpodem ser preparados como divulgado no pedido de patente US 10/960.602,depositado em 8 de outubro de 2004. Os grupos de ligação incluem gruposbissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido lábil, grupos fotolábil, grupos lábilpeptidase, ou grupos lábil esterase, como divulgado nas patentes acimaidentificadas, grupos bissulfeto e tioéter são preferidos. Grupos Iigantesadicionais estão descritos e exemplificados no presente.

Conjugação do anticorpo e maitansinóide pode ser feita usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionais taiscomo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivadosde imidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativo(tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), bis-azidocombinados (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônioderivados (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (talcomo toluerio 2,6-diisocianato), e bis-ativo flúor combinados (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmentepreferidos para fornecer uma ponte bissulfeto incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et aí., Biochem. J. 173:723-737 [1978])e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP).

O ligante pode ser anexado à molécula maitansinoide em váriasposições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, um éster de ligaçãopode ser formado por reação com um grupo hidroxil usando-se técnicasconvencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendoum grupo hidroxil, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxil, e na posição C-20 tendo um grupohidroxil. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 domaitansinol ou um maitansinol análogo.

AURtSTATlNAS E POLOSTATINAS

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção conjugado a análogos peptídicos dolastatinas oudolostatinas e derivados, as auristatinas (patentes US. 5635483; 5780588).Dolastatinas e auristatinas mostraram não interferir com a dinâmica dosmicrotúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et aí. (2001)Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividadeanticâncer (US 5663149) e antifúngica (Pettit et aí (1998) Antimicrob. AgentsChemother. 42:2961-2965). O componente droga dolastatina ou auristatinapode ser anexado ao anticorpo através da terminação N (amino) ou terminaçãoC (carboxil) do componente droga peptídica (documento WO 02/088172).

Realizações de auristatina exemplares incluem os componentesdroga monometilauristatina DE e DF1 divulgados em "MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands", US número de série10/983.340, depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta estáexpressamente incorporada ao presente como referência.

Realizações exemplares de auristatina são MMAE e MMAF.Realizações adicionais exemplares que compreendem MMAE ou MMAF evários componentes Iigantes (também descritos no presente) Ab-MC-vc-PAB-MMAF, Ab-MC-vc-PAB-MMAE, Ab-MC-MMAE e Ab-MC-MMAF.

Tipicamente, componentes droga baseados em peptídeos podemser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem serpreparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida(ver E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965,Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. Oscomponentes droga auristatina/dolastatina podem ser preparados de acordocom os métodos das: patentes US 5635483, US 5780588; Pettit et al (1989) J.Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design13:243-277; Pettit1 G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J.Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863. Ver também Doronina (2003) NatBiotechnol 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands", patente US série número 10/983,340, depositada em5 de novembro de 2004, incorporada ao presente em sua totalidade(divulgando, por exemplo, Iigantes e métodos de preparação de compostosmonometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados a ligantes).

Caliqueamicina

Em outras realizações, o imunoconjugado compreende umanticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas caliqueamicina. Afamília de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fita duplade DNA em concentrações sub-picomolar. Para a preparação de conjugaçãoda família caliqueamicina, ver patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116,5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para AmericanCyanamid Company). Estruturas análogas de caliqueamicina que podem serusadas incluem, mas não são limitadas para, γΛ 02', (J31, N-acetil-γι1, PSAG eG11 (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et ai, CâncerResearch 58:2925-2928 (1998) e as supracitadas patentes US para AmericanCyanamid). Outra droga anti-tumor que o anticorpo pode ser conjugado é QFAque é um antifolato. Ambas caliqueamicina e QFA têm sítios intracelulares deação e não atravessam de imediato a membrana plasmática. Então, apercepção celular destes agentes através da internalização mediada peloanticorpo aumenta muito seus efeitos citotóxicos.

Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados com osanticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-flúoruracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288 descrita nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, assim comoesperamicinas (patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem serusadas incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina dedifteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina,cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii,proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S),inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina,mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo,documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção, além disto, contempla um imunoconjugadoformado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (porexemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como umadesoxirribonuclease; DNase).Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreenderum átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos estãodisponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluemAt211, I1311 I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótopos radioativosde Lu. Quando a conjugação é usada para detecção, pode compreender umátomo radioativo por estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I1231 ou umspin Iabel para imagem de ressonância nuclear (NMR) (também conhecidocomo imagem de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente,iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolinio,manganês ou ferro.

O rádio ou outros marcadores podem ser incorporarados naconjugação de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode serbiosintetizado ou podem ser sintetizados por síntese química de aminoácidousando-se aminoácidos precursores adequados envolvendo, por exemplo,flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tal como tc99m ou I123, Re186, Re188e In111 podem ser anexados via um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90pode ser anexado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser usado paraincorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(ChataI1CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico pode ser feitousando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína debifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP),succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC),iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (tal como dimetiladipimidato HCI), ésteres ativo (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (talcomo glutaraldeído), bis-azido combinados (tal como bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), bis-diazônio derivados (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e bis-ativoflúor combinados (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, umaimunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agentequelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Verdocumento WO 94/11026. O Iigante pode ser um "ligante clivável" que facilita aliberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, podem ser usados umligante ácido lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetilou ligante que contém bissulfeto (Chari et al., Câncer Research 52:127-131(1992); patente US 5.208.020).

Os compostos da invenção expressamente contemplam, mas nãosão limitados a, ADC preparado com reagentes interligados: BMPS, EMCS,GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB1SMPH1 sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estãocomercialmente disponíveis (por exemplo, por meio da Pierce Biotecnologia,Inc., Rockford, IL., E.U.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 ApplicationsHandbook and Catalog.

Preparação De Conjugados Droga Anticorpo

Na conjugação droga anticorpo (ADC) da invenção, um anticorpo(Ab) é conjugado com uma ou mais drogas moieties (D), por exemplo,aproximadamente 1 para cerca de 20 componentes droga por anticorpo,através de um ligante (L). A ADC da Formula I pode ser preparada pordiversas rotas, empregando reações de química orgânica, condições, ereagentes conhecidos para aqueles técnicos no assunto, incluindo: (1) reaçãode um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente,para formar Ab-L, via uma ligação covalente, seguida por reação com umcomponente drogaD; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma drogamoiety com um reagente Iigante bivalente, para formar D-L1 via uma ligaçãocovalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo.

Métodos adicionais para preparar ADC estão descritos no presente.

Ab-(L-D)p I

O Iigante pode ser composto de um ou mais componentesligantes. Componentes Iigantes exemplares incluem 6-maleimidocaproil("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrullina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC'), e N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato("SIAB"). Componentes ligantes adicionais são conhecidos na técnica e algunsestão descritos no presente. Ver também "Monomethylvaline CompoundsCapable of Conjugation to Ligands", patente US número de série 10/983.340,depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta está expressamenteincorporada ao presente como referência.

Em algumas realização, o Iigante pode compreender resíduos deaminoácido. Componentes ligantes de aminoácido exemplares incluem umdipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeosexemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina-citrulina (gli-val-cit) eglicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendemum componente Iigante aminoácido incluem aqueles que ocorrem naturalmente,assim como, aminoácidos menores e aminoácidos análogos que não ocorremnaturalmente, tal como citrulina. Componentes ligantes aminoácido pode serprojetados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por umaenzima específica, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B,C e D, ou uma protease plasmina.Estruturas componentes Iigantes exemplares são mostradasabaixo (em que a linha ondulada indica sítios de conexão covalente para outroscomponentes do ADC).

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Componentes Iigantes exemplares adicionais e abreviações incluem(em que o anticorpo (Ab) e Iigante estão descritos, e ρ é 1 para cerca de 8):

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Grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não sãolimitados a: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadeia lateral, porexemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv)grupos de açúcares hidroxil ou amino onde o anticorpo é glicosilado. Amina,tiol e grupos hidroxil são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligaçõescovalentes com grupos eletrofílicos nos componentes Iigantes e Iigantesreagentes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS1 ésteres HOBt1haloformatos, e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides tal comohaloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxil e grupos maleimide. Certosanticorpos possuem bissulfeto intercadeia redutível, isto é, pontes de cisteína.

Anticorpos podem ser feitos por reação para conjugação com Iigantesreagentes por tratamento com um agente de redução tal como DTT(ditiotreitol). Cada ponte de cisteína irá dessa forma, teoricamente, reagir comdois tióis nucleofílicos reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos nos anticorpos através de reação de Iisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut) que resulta em conversão de uma amina em um tiol.Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento deste)pela introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos cisteína (porexemplo, preparação de anticorpos mutantes que compreendem um ou maisresíduos de aminoácido cisteína não nativos).

Conjugação droga anticorpo da invenção pode também ser produzidapor modificações do anticorpo para introduzir componentes eletrofílicos, que podemreagir com o substituinte nucleofílico no reagente Iigante ou droga. Os açúcares deanticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantesde periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupoamina de reagentes Iigantes ou componentes droga. A resultante imina dos gruposde base de Schiff pode formar uma ligação estável, ou pode ser reduzida, porexemplo, por reagentes boroidrido para formar ligações amino estáveis. Em umarealização, reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado tanto comgalactose oxidase como metaperiodato de sódio pode render grupos carbonil(aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com grupos apropriados na droga(Hermansori, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, proteínas quecontêm serina N-terminal ou resíduos treonina podem reagir com metaperiodato desódio, que resulta na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente US 5362852).Tal aldeído pode ser reagido com um componente droga ou Iigante nucleofílico.

Igualmente, grupos nucleofílicos em um componente droga incluem,mas não são limitados a: amina, tiol, hidroxil, hidrazido, oximo, hidrazino,tiosemicarbazona, hidrazino carboxilato, e grupos aril hidrazido capazes de reagirpara formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nos componentes Iigantese reagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteresHOBt, haloformatos, e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides tal comohaloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxil e grupos maleimida.

Alternativamente, uma fusão de proteína que compreende o anticorpoe agente citotóxico pode ser feito, por exemplo, por técnicas recombinantes ousíntese de peptídeo. O comprimento do DNA pode compreender respectivasregiões que codificam as duas porções da conjugação tanto adjacente uma a outracomo separada por uma região que codifica um peptídeo Iigante o qual não destróias propriedades desejadas do conjugado.

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um"receptor" (como estreptavidina) para utilização no tumor pré-direcionado emque a conjugação anticorpo receptor é administrada ao paciente, seguido porremoção de conjugação não ligada da circulação usando-se um agente delimpeza e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que éconjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Anticorpo (Ab)-MC-MMAE pode ser preparado por conjugação dequalquer um dos anticorpos fornecidos no presente com MC-MMAE comosegue. Anticorpo, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM decloreto de sódio em pH 8,0 é tratado com um excesso de 100 mM de ditiiotreitol(DTT). Após incubação a 37 0C por aproximadamente 30 minutos, o tampão étrocado por elução sobre resina Sephadex G25 resina e eluído com PBS com1mM de DTPA. O valor tiol/Ab é checado pela determinação da concentraçãode anticorpo reduzido a partir da absorbância a 280 nm da solução e aconcentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee1 Wl) edeterminação da absorbância a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido emPBS é resfriado em gelo. O reagente Iigante droga, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), isto é, MC-MMAE, dissolvido em DMSO1 édiluído em acetonitrila e água em concentração conhecida, e adicionado aoanticorpo reduzido resfriado 2H9 em PBS. Após cerca de uma hora, emexcesso de maleimida é adicionado para inibir a reação e revestir quaisquergrupos tiol de anticorpo não reagido. A mistura de reação é concentrada poralta filtração centrífuga e 2H9-MC-MMAE é purificado e dessanilizado porelução através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros 0,2 μιτι sobcondições estéreis e congelados para armazenamento.

Anticorpo-MC-MMAF pode ser preparado por conjugação dequalquer um dos anticorpos fornecidos no presente com MC-MMAE seguindo oprotocolo fornecido para preparação de Ab-MC-MMAE.

Anticorpo-MC-val-cit-PAB-MMAE é preparado por conjugação dequalquer um dos anticorpos fornecidos no presente com MC-val-cit-PAB-MMAEseguindo o protocolo fornecido para preparação de Ab-MC-MMAE.

Anticorpo-MC-val-cit-PAB-MMAF é preparado por conjugação dequalquer um dos anticorpos fornecidos no presente com MC-val-cit-PAB-MMAFseguindo o protocolo fornecido para preparação de Ab-MC-MMAE.

Anticorpo-SMCC-DMI é preparado por conjugação de qualquerum dos anticorpos fornecidos no presente com SMCC-DM1 como segue.

Anticorpo purificado é derivado com (Succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introduzir oligante SMCC. Especificamente, o anticorpo é tratado a 20 mg/mi em 50mM defosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA1 pH 6,5 com7,5 equivalentes molar de SMCC (20 mM em DMSO, 6,7 mg/ml). Apósagitação por 2 horas sob argônio em temperatura ambiente, a mistura dereação é filtrada através de uma coluna Sephadex G25 equilibrada com 50mMde fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, pH 6,5. Osanticorpos contendo frações são agrupados e analisados.

Anticorpo-SMCC preparado é então diluído com 50mM de fosfato depotássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, pH 6,5, para umaconcentração final de aproximadamente 10 mg/ml, e reagido com uma solução de10 mM de DM1 em dimetilacetamida. A reação é agitada em temperatura ambientesob argônio por 16,5 horas. A conjugação da mistura de reação é filtrada atravésde uma coluna de filtração em gel Sephadex G25 (1.5 χ 4.9 cm) com 1 χ PBS empH 6,5. A droga DM1 para razão de anticorpo (p) por ser de aproximadamente 2para 5, como medido pela absorbância a 252 nm e a 280 nm.

Ab-SPP-DMI é preparado por conjugação de qualquer um dosanticorpos fornecidos no presente com SPP-DM1 como segue. Anticorpopurificado é derivado com N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato paraintroduzir grupos ditiopiridil. Anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml) em 44.7 ml de 50mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5) contendo NaCI (50 mM) e EDTA (1mM) é tratado com SPP (5,3 equivalentes molar em 2,3 ml de etanol). Apósagitação por 90 minutos sob argônio em temperatura ambiente, a mistura dereação é filtrada através de uma coluna Sephadex G25 equilibrada com 35 mMde citrato de sódio, 154 mM de NaCI, 2 mM de EDTA. Anticorpo contendofrações foram agrupados e analisados. O grau de modificação do anticorpo édeterminado como descrito acima.

Anticorpo-SPP-Py (cerca de 10 μηιοίβε de grupos 2-tiopiridinaliberáveis) é diluído com 35 mM do tampão citrato de sódio acima, pH 6,5, parauma concentração final de aproximadamente 2,5 mg/ml. DM1 (1,7equivalentes, 17 μη-ioles) em 3,0 mM de dimetilacetamida (DMA, 3% v/v namistura de reação final) é então adicionado à solução de anticorpo. A reaçãoprossegue em temperatura ambiente sob argônio por aproximadamente 20horas. A reação é carregada em uma coluna de filtração em gel Sefacril S300(5,0 cm χ 90,0 cm, 1,77 I) equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mMde NaCI, pH 6,5. A taxa de fluxo pode ser de aproximadamente 5,0 ml/min e65 frações (20,0 ml cada) são coletadas. O número de moléculas de drogaDM1 por molécula de anticorpo (p') é determinado pela medição daabsorbância a 252 nm e 280 nm, e pode ser de aproximadamente 2 para 4componentes droga DM1 por anticorpo 2H9.

Anticorpo-BMPEO-DMI é preparado por conjugação de qualquer umdos anticorpos fornecidos no presente com BMPEO-DM1 como segue. O anticorpoé modificado pelo reagente bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), deixandoum grupo maleimido não reagido na superfície do anticorpo. Isto pode ser realizadopela dissolução de BM(PEO)4 em uma mistura de 50% de etanol/água para aconcentração de 10 mM e adição de um excesso molar vezes dez para umasolução contendo anticorpo em fosfato salino tamponado a uma concentração deaproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolar) e permitindo o mesmo reagir por 1hora para formar intermediários anticorpo-ligante, 2H9-BMPEO. O excesso deBM(PEO)4 é removido por filtração em gel (coluna HiTrap, Pharmacia) em 30 mMde citrato, pH 6 com 150 mM de tampão NaCI. Um excesso molar de dez vezes deDM1 é dissolvido em dimetil acetamida (DMA) e adicionado ao 2H9-BMPEOintermediário. Dimetil formamida (DMF) pode também ser empregado paradissolver o componente droga reagente. A reação de mistura é permitida reagirdurante a noite antes da filtração em gel ou díálise em PBS para remover DM1 nãoreagidos. Filtração em gel em colunas S200 em PBS foi usada para removeragregados de alto peso molecular e fornecer 2H9-BMPEO-DM1 purificado.D. Antagonistas De C-Met Que Compreendem Ácido Nucléico

Em um aspecto, um antagonista de c-met da invenção compreendeuma molécula de ácido nucléico. Por exemplo, a molécula de ácido nucléico podecompreender um oligonucleotídeo antisense, um RNA inibidor/de interferência (porexemplo, um RNA inibidor pequeno/de interferência (siRNA)), ou um aptâmero.Métodos para seleção, identificação e fabricação destes moduladores de ácidonucléico são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, siRNAs provaram ser capazes de modular aexpressão gênica onde antagonistas tradicionais tais como moléculaspequenas ou anticorpos falharam. (Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12(2003)). RNAs de fita dupla sintetizados in vitro que são menores que 30nucleotídeos em comprimento (tal como, aproximadamente 15 a 25, 17 a 20,18 a 20, 19 a 20 ou 21 a 23 nucleotídeos) podem agir como RNAs deinterferência (iRNAs) e podem especificamente inibir a expressão gênica(ver, por exemplo., Fire A., Trends in Genetics (1999), 391; 806-810;pedidos de patente US 09/821832, 09/215257; patente US 6.506.559;PCT/US01/10188; pedido de patente Européia série número 00126325).Acredita-se que estes iRNAs ajam pelo menos em parte na mediação dadegradação de seus RNAs alvos. No entanto, visto que possuem 30nucleotídeos em comprimento, eles não acionam um mecanismo de defesaantiviral. Tais mecanismos incluem produção de intereferon e encerramentogeral da síntese de proteína da célula. Praticamente, siRNAs podem sersintetizados e então clonados em vetores de DNA. Tais vetores podem sertransfectados e fabricados para expressar o siRNA em níveis altos. O altonível de expressão de siRNA é usado para golpear ou reduzirsignificantemente a quantidade de proteína produzida na célula, e então éútil no ambiente celular onde acredita-se que a expressão de uma proteínaesteja ligada a uma disfunção patológica.Aptâmeros são moléculas de ácido nucléico que são capazes de seligar a uma molécula alvo, tal como uma proteína c-met hiperestabilizada. Ageração e uso terapêutico de aptâmeros são bem estabelecidos na técnica. Ver, porexemplo, patente 5.475.096, e a eficácia terapêutica de Macugen® (Eyetech, NovaYork) para tratamento de degeneração macular relacionada à idade.

A tecnologia antisense é bem estabelecida na técnica. Maioresdetalhes com respeito a esta tecnologia são fornecidos abaixo.

E. Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas de antagonistas de c-met usados deacordo com a invenção são preparadas para armazenamento pela mistura doantagonista de c-met que tem o grau desejado de purificação com veículosopcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes,(Remington1S Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis,excipientes ou estabilizantes não tóxicos para receptores nas dosagens econcentrações empregadas, e incluem tampões tais como acetato, Tris,fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácidoascórbico e metionina; conservantes (tal como octadecildimetilbenzil cloreto deamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio;fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos tais como metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos debaixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas,tais como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulínas; polímeroshidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina,glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, eoutros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantestal como EDTA; agentes de tonicidade tais como trealose e cloreto de sódio,açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; surfactantes taiscomo polisorbato, formação de sais de contra íons tais como sódio; complexosde metal (por exemplo, complexo Zn-proteína); e/ou surfactantes não-iônicostais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

As formulações no presente pode também conter mais que umcomponente ativo como necessário para a indicação específica sendo tratada,preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetemcontrariamente um ao outro. Por exemplo, em adição a um antagonista de c-met, pode ser desejável incluir em uma formulação, um modulador adicional,por exemplo, um segundo anticorpo que se liga a um epítopo diferente naproteína de c-met hiperestabilizada ou a um anticorpo para algum alvo.

Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode também compreenderum agente quimioterápico, agente citotóxico, agente inibitório do crescimento,agente anti-hormonal e/ou de cardioproteção. Tais moléculas sãoadequadamente apresentadas em combinação em quantidades que sãoefetivas para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser colocados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulasde gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, emsistemas de distribuição coloidal de droga (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em RemingtorísPharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo,cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluempoliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), oupoli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável,copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRONDEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácidoglicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo devemser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membrana defiltração estéril.

F. Tratamento Com Um Antagonista De C-met Da Invenção

Antagonistas de c-met da invenção possuem várias aplicaçõesnão terapêuticas. Os antagonistas podem ser úteis para organizar ou detectaruma doença que expressa c-met hiperestabilizado (por exemplo, radioimagem).

Os anticorpos, oligopeptídeos e aptâmeros podem também ser úteis parapurificação ou imunoprecipitação de c-met hiperestabilizado de células, paradetecção e quantificação de c-met hiperestabilizado in vitro, por exemplo, emum ELISA ou Western blot, e para modular eventos celulares em umapopulação de células.

Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento docâncer envolve uma ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia pararemover tecido canceroso, radioterapia e quimioterapia. A terapia quecompreende antagonistas de c-met pode ser especialmente desejável empacientes idosos que não toleram bem a toxicidade e os efeitos colaterais daquimioterapia e na doença metastática onde a radioterapia teve utilidadelimitada. Para aplicações terapêuticas, os antagonistas de c-met podem serusados sozinhos, ou em terapia combinada com, por exemplo, hormônios,antiangiogênicos ou compostos radiomarcados, ou com cirurgia, crioterapiae/ou radioterapia. Os antagonistas de c-met podem ser administrados emconjunto com outras formas de terapia convencionais, tanto consecutivamente,pré ou pós-terapia convencional. Drogas quimioterápicas tais comoTAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel), estramustina e mitoxantronasão usadas para tratar câncer, em específico, em pacientes de risco bom. Osantagonistas de c-met seriam geralmente administrados com uma doseterapeuticamente efetiva do agente quimioterápico. Em outra realização, umantagonista de c-met é administrado em conjunto com quimioterapia parareduzir efeitos colaterais resultantes do agente quimioterápico, por exemplo,paclitaxel. O Physicians' Desk Reference (PDR) divulga dosagens destesagentes que foram usados no tratamento de vários cânceres. O regime dedosagem destas drogas quimioterápicas anteriormente mencionadas que sãoefetivas terapeuticamente irá depender do câncer específico sendo tratado, aextensão da doença e outros fatores familiares para o médico técnico noassunto e podem ser determinados pelo médico.

Os antagonistas de c-met são administrados a um pacientehumano de acordo com métodos conhecidos, tal como administraçãointravenosa, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua sobre umperíodo de tempo, por rota intramuscular, intraperitoneal, intracérobro-espinhal,subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Aadministração intravenosa ou subcutânea do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula pequena orgânica é preferida em uma realização da invenção.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com aadministração do antagonista de c-met. A administração combinada inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma formulaçãofarmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em quepreferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (ou todos) osagentes ativos simultaneamente exerçam suas atividades biológicas.Preferivelmente tal terapia combinada resulta em um efeito terapêutico sinérgicoe/ou redução dos efeitos colaterais não desejados.

Pode ser desejável combinar administração para o antagonista dec-met, com administração de um agente terapêutico dirigido contra outroantígeno associado com a condição patológica específica.

Em outra realização, os métodos terapêuticos de tratamento dapresente invenção envolvem a administração combinada de uma moléculaantagonista de c-met e um ou mais agentes quimioterápicos ou agentesinibitórios de crescimento, incluindo co-administração de coquetéis dediferentes agentes quimioterápicos. Agentes quimioterápicos incluem fosfatode estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-flúor uracil, melfalan,ciclofosfamide, hidroxiuréia e hidroxiuréia taxanos (tais como paclitaxel anddoxetaxel) e/ou antibióticos antraciclina. Preparação e programação dedosagens para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo cominstruções do fabricante ou como determinado empiricamente por um técnicono assunto. Preparação e programação de dosagens para tal quimioterapiaestão também descritas em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams &Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Antagonistas de c-met podem ser combinados com um compostoanti-hormonal, por exemplo, um composto anti-estrógeno tal como tamoxifeno,um anti-progesterona tal como onapristona (ver, patente EP 616.812), ou umanti-andrógeno tal como flutamida, em dosagens conhecidas para taismoléculas. Onde o câncer a ser tratado é câncer independente de andrógeno,o paciente pode previamente ter sido submetido a uma terapia antiandrógenoe, após o câncer se tornar independente de andrógeno, o antagonista de c-metpode ser administrado ao paciente.

Algumas vezes, pode ser benéfico também co-administrar umacardioproteção (para prevenir ou reduzir disfunção do miocárdio associada coma terapia) ou uma ou mais citocinas para o paciente. Além disso, para osregimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgicada célula cancerosa e/ou radioterapia, antes, simultaneamente, ou pós-terapiaantagonista de c-met. Dosagens adequadas para qualquer dos agentes co-administrados são aquelas atualmente usadas e podem ser diminuídas devido àação combinada (sinergia) do agente e antagonista de c-met.

Para prevenção ou tratamento da doença, a dosagem e modo deadministração serão escolhidos pelo médico de acordo com critériosconhecidos. A dosagem apropriada de antagonista de c-met irá depender dotipo de doença a ser tratada, como definido acima, a severidade e curso dadoença, se o antagonista de c-met é administrado como preventivo oupropósitos terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente eresposta ao antagonista de c-met, e a discrição do médico. O antagonista dec-met é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou sobre uma sériede tratamentos. Em uma realização, o antagonista de c-met é administrado porinfusão intravenosa ou por injeções subcutâneas. Dependendo do tipo eseveridade da doença, cerca de 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (porexemplo, 0,1-15 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicialpara administração ao paciente, se, por exemplo, para uma ou maisadministrações separadas ou por infusão contínua. Um regime de dosagempode compreender administração de uma carga de dose inicial deaproximadamente 4 mg/kg, seguido por uma manutenção de dose deaproximadamente 2 mg/kg do anticorpo antagonista de c-met. No entanto,outros regimes de dosagem podem ser aplicáveis. Uma dosagem diária típicapode variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendodos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas no decorrer devários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento éprolongado até ocorrer uma desejada supressão dos sintomas da doença Oprogresso desta terapia pode ser rapidamente monitorado por métodosconvenientes e testes, baseados em critérios conhecidos para o médico ououtras pessoas técnicas no assunto.

Com exceção da administração de um polipeptídeo modulador(por exemplo, polipeptídeo, anticorpo) ao paciente, a invenção contemplaadministração de modulador por terapia gênica. Tal administração de ácidonucléico que compreende/codifica o antagonista de c-met é englobada pelaexpressão "administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de umantagonista de c-met". Ver, por exemplo, documento WO 96/07321 publicadoem 14 de março de 1996 com respeito ao uso de terapia gênica para geraranticorpos intracelulares.

Existem duas abordagens principais para se obter o ácidonucléico (opcionalmente contido no vetor) nas células do paciente, in vivo e exvivo. Para entrega in vivo o ácido nucléico é injetado diretamente no paciente,usualmente no sítio onde o antagonista de c-met é requerido. Para otratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico éintroduzido nestas células isoladas, e as células modificadas são administradasao paciente, tanto diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro demembranas porosas que são implantadas no paciente (ver, por exemplo,Patentes US 4.892.538 e 5.283.187). Existe uma variedade de técnicasdisponíveis para introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicasvariam dependendo se o ácido nucléico é transferido em células cultivadas invitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas paraa transferência de ácido nucléico em células de mamíferos in vitro incluem ouso de lipossomos, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano,método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumenteutilizado para entrega ex vivo do gene é um vetor retroviral.

Em uma realização, técnicas de transferência de ácido nucléicoincluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Herpessimplex I, ou vírus associado a adeno) e sistemas baseados em lipídeos(iipídeos úteis para transferência de gene mediada por Iipideo são DOTMA,DOPE e DC-Chol, por exemplo). Para revisão de marcação de gene e terapiagênica atualmente conhecida ver Anderson et ai, Science 256:808-813 (1992).

Ver também documento WO 93/25673 e as referências citadas nestes.

Anticorpos antagonistas de c-met da invenção podem estar emdiferentes formas englobadas pela definição de "anticorpo" no presente. Dessaforma, os anticorpos incluem anticorpo de comprimento total ou intacto, fragmentosde anticorpo, anticorpo de seqüência nativa ou aminoácidos variantes, anticorposhumanizados, quiméricos ou de fusão e fragmentos funcionais destes.

A invenção fornece uma composição que compreende umantagonista de c-met e um veículo. Em uma realização adicional, umacomposição pode compreender um antagonista de c-met em combinação comoutros agentes terapêuticos tais como agentes citotóxicos ou inibitórios decrescimento, incluindo agentes quimioterápicos. A invenção também forneceformulações que compreendem um antagonista de c-met e um veículo. Emuma realização, a formulação é uma formulação terápica que compreende umveículo farmaceuticamente aceitável.

G. Artigos De Fabricação E Kits

Outra realização da invenção é um artigo de fabricação quecontém materiais úteis para o tratamento de uma disfunção que usaantagonista de c-met. O artigo de fabricação compreende um recipiente e umaetiqueta ou instruções de uso no recipiente ou associada a este. Recipientesadequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Osrecipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidroou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar acondição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipientepode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolhaperfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agenteativo da composição é um antagonista de c-met da invenção. A etiqueta oubula indica que a composição é usada para tratamento da doença específica.A etiqueta ou bula irá também compreender instruções para administração dacomposição ao paciente. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode, alémdisso, compreender um segundo recipiente que compreende um tampãofarmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI),fosfato salino tamponado, solução de Ringer e solução dextrose. Pode, além disso,incluir outros materiais comerciais desejáveis do ponto de vista do usuário, incluindooutros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

Kits que são úteis para vários propósitos são também fornecidos.Kits que contêm antagonista de c-met da invenção para detecção equantificação de c-met hiperestabilizado in vitro, podem ser fornecidos, porexemplo, em um ELISA ou um Western blot. Como o artigo de fabricação, o kitcompreende um recipiente e uma etiqueta ou bula no recipiente ou associada aeste. O recipiente contém uma composição que compreende pelo menos umantagonista de c-met da invenção. Recipientes adicionais que contêm, porexemplo, diluentes e tampões, controle de anticorpos, podem ser incluídos. Aetiqueta ou bula pode fornecer uma descrição da composição, assim comoinstruções para o pretendido in vitro ou uso para detecção.

H. Antagonistas De C-Met Que Compreendem Polipeptídeos. ÁcidosNucléicos E Formas Específicas De Anticorpos E Aplicações

Em uma realização, ácidos nucléicos da invenção incluemoligonucleotídeos/polinucleotídeos antisense que compreendem umaseqüência única de ácido nucléico (tanto RNA como DNA) capazes de se ligaraos ácidos nucléicos que codificam c-met hiperestabilizado endógeno.Oligonucleotídeos antisense, de acordo com a presente invenção,compreendem pelo menos um fragmento da região de codificação do DNA dec-met hiperestabilizado. Tal fragmento geralmente compreende pelo menoscerca de 14 nucleotídeos, preferivelmente cerca de 14 a 30 nucleotídeos. Ahabilidade para derivar um oligonucleotídeo antisense, baseado em umaseqüência de cDNA que codifica uma dada proteína está descrita em, porexemplo, Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et ai.(BioTechniques 6:958, 1988).

A ligação de oligonucleotídeos antisense para atingir seqüênciasde ácido nucléico resulta na formação de duplex que bloqueiam transcrição outradução da seqüência alvo por um ou mais meios, incluindo aumento dadegradação de duplex, terminação prematura de transcrição ou tradução oupor outros meios. Tais métodos são englobados pela presente invenção. Osoligonucleotídeos antisense podem, dessa forma, ser usados para bloquear aexpressão de proteínas c-met hiperestabilizadas em células. Oligonucleotídeosantisense também compreendem oligonucleotídeos que possuem estruturas deaçúcar-fosfodiéster (ou outras ligações de açúcar, tais como aquelas descritasno documento WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcar são resistentesàs nucleases endógenas. Tais oligonucleotídeos com ligações de açúcarresistentes são estáveis in vivo (isto é, capazes de resistirem à degradaçãoenzimática), mas retêm a especificidade de seqüência para serem capazes dese ligar às seqüências de nucleotídeo alvo.

Sítios intragênicos preferidos para ligação antisense incluem aregião que incorpora a iniciação de tradução/códon de início (5-AUG / 5'-ATG)ou de terminação/códon final (5-UAA, 5-UAG e 5-UGA / 5-TAA, 5-TAG e 5-TGA) do quadro de leitura aberto (ORF) do gene. Estas regiões se referem auma porção do mRNA ou gene que engloba cerca de 25 a aproximadamente50 nucleotídeos contínuos, tanto na direção (isto é, 5' ou 3') de um códon deiniciação ou terminação. Outras regiões exemplares para ligação antisenseincluem: íntrons; exons; junções íntron-exon; to quadro de leitura aberto (ORF)ou "região de codificação," que é a região entre o códon de iniciação datradução e códon de terminação da tradução; a 5' cap de um mRNA quecompreende um resíduo guanosina N7-metilado ligado ao resíduo mais 5' domRNA via uma ligação 5-5' trifosfato e inclui a própria estrutura 51 cap assimcomo os primeiros 50 nucleotídeos adjacentes ao cap; a região não traduzida 5'(5'UTR), a porção de um mRNA na direção 5' do códon de início da tradução, edessa forma incluindo nucleotídeos entre o sítio 5' cap e o códon de início datradução do mRNA ou nucleotídeos correspondentes no gene; e a região nãotraduzida 3' (3'ÜTR), a porção de um mRNA na direção 3' do códon determinação da tradução, e dessa forma incluindo nucleotídeos entre o códon determinação da tradução e o final 3' de um mRNA ou nucleotídeoscorrespondentes no gene.

Exemplos específicos de compostos antisense úteis para inibir aexpressão do polipeptídeo c-met hiperestabilizado incluem oligopeptídeos quecontêm estruturas modificadas ou ligações internucleosídeo não naturais.Oligonucleotídeos que possuem estruturas modificadas incluem aqueles queretêm um átomo de fósforo na estrutura e aqueles que não possuem um átomode fósforo na estrutura. Para os propósitos desta especificação, e comoalgumas vezes referenciados na técnica, oligonucleotídeos modificados quenão possuem um átomo de fósforo na sua estrutura internucleosídeo podetambém ser considerado como sendo oligonucleosídeos. Estruturas deoligonucleosídeos modificadas incluem, por exemplo, fosforotioatos,fosforotioatos chiral, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres,metil e outros alquil fosfonatos incluindo 3'-alquileno fosfonatos, 5'-alquilenofosfonatos e fosfonatos chiral , fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos,tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfates e borano-fosfates que possuem ligações 3-5', ligações 2-5' análogas destes, e aquelesque possuem polaridade invertida em que um ou mais ligações deinternucleotídeos são uma ligação 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2'.Oligonucleotídeos exemplares que possuem polaridade invertida compreendemuma única ligação 3' para 3' na ligação de internucleotídeo mais 3', isto é, umresíduo de nucleosídeo único invertido que pode ser abásico (a nucleobaseestá ausente ou possui um grupo hidroxil no lugar desta). Vários sais, misturasde sais e formas de ácido livres estão também incluídas. Patentesrepresentativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de ligaçõescontendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, patentes US 3.687.808;4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019;5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233;5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; e 5.550.111, 5.563.253;5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 e5.625.050, cada uma destas está incorporada ao presente pela referência.

Exemplos de estruturas de oligonucleotídeos modificadas que nãoincluem um átomo de fósforo nesta, possuem estruturas que são formadas porcadeias curtas de alquil ou ligações internucleosídeos cicloalquil, mistura deheteroátomo e ligações internucleosídeos alquil ou cicloalquil, ou uma ou maiscadeias heteroatômicas curtas ou ligações internucleosídeo heterocíclicas.Estes incluem aquelas que possuem ligações morfolino (formada em parte daporção açúcar de um nucleosídeo); estruturas siloxano; estruturas sulfeto,sulfóxido e estrutura sulfona; estruturas formacetil e tioformacetil; estruturasmetileno formacetil e tioformacetil; estruturas riboacetil; estruturas contendoalqueno; estruturas sulfamato; estruturas metileneimino e metilenehidrazino;estruturas sulfonato e sulfonamida; estruturas amida e outras que possuemmistura de partes componentes N1 O, S e CH2. Patentes representativas dosEstados Unidos que ensinam a preparação de tais oligonucleosídeos incluem,mas não estão limitadas a. Patentes US: 5.034.506: 5.166.315; 5.185.444;5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257;5.466.677, 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.453.496; 5.561.225; 5.596.086;5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; e 5.610.289, 5.618.704;5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 e 5.677.439,cada uma destas está incorporada ao presente pela referência.

Em outros exemplos de oligonucleotídeos antisense, ambas asligações de açúcar e internucleosídeos, isto é, a estrutura das unidades denucleotídeo são substituídas por novos grupos. As unidades da base sãomantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucléicoapropriado. Tal composto oligomérico, um oligonucleotídeo mimético quemostrou ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um ácidonucléico peptídico (PNA). Em compostos PNA, a estrutura de açúcar de umoligonucleotídeo é substituída por uma estrutura que contêm amida, emespecífico uma estrutura aminoetilglicina. As nucleobases são mantidas e sãodiretamente ou indiretamente ligadas aos átomos de nitrogênio aza da porçãoamida da estrutura. Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinama preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas a, patentesUS: 5.539.082; 5.714.331 e 5.719.262, cada uma destas está incorporada aopresente como referência. Ensinamentos adicionais sobre compostos PNApodem ser encontrados em Nielsen et ai, Science, 1991, 254, 1497-1500.

Exemplos de oligonucleotídeos antisense incorporam estruturasfosforotioatos e/ou estruturas heteroátomo, e em específico -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [conhecidos como metileno (metilimino) ou estrutura MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e -O-N(CH3)-CH2-CH2- [em que a estruturafosfodiéster nativa é representada como -O-P-O-CH2-] descrita na referência acimapatente US 5.489.677, e a estrutura amida da referência acima patente US5.602.240. Exemplos adicionais são oligonucleotídeos antisense que possuemestruturas morfolino da referência acima patente US 5.034.506.Oligonucleotídeos modificados também podem conter um ou maiscomponentes açúcar substituídos. Oligonucleotídeos exemplares compreendemum dos seguintes na posição 2': OH; F; O-aquil, S-aquil, ou N-aquil; O-alquenil,S-alquenil, ou N-alquenil; O-alquinil, S-alquinil ou N-alquinil; ou O-alquil-O-alquil,em que o alquil, alquenil e alquinil podem ser substituídos ou não substituídospor C1 a C1O alquil ou C2 para C1O alquenil e alquinil. Particularmente preferidossão 0[(CH2)n0]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, e0(CH2)n0N[(CH2)nCH3)]2, onde nem são de 1 para cerca de 10. Outrosoligonucleotídeos exemplares compreendem um dos seguintes na posição 2': Cia C10 alquil inferior, substituído por inferiores alquil, alquenil, alquinil, alcaril,aralquil, O-alcaril ou O-aralquil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3,SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquil, heterocicloalcaril,aminoalquilamino, polialquilamino, substituído por silil, um grupo de RNA declivagem, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar aspropriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, ou outros substituintestendo propriedades similares. Uma modificação possível inclui 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-0-(2-metoxietil) ou 2'-M0E) (Martinet ai, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) isto é, um grupo alcoxialcoxi. Umamodificação adicional preferida inclui 2'-dimetiylaminooxietoxi, isto é, um grupoO(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2-DMAOE, e 2-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2-0-dimetilaminoetoxietil ou 2-DMAEOE), isto é, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2).

Uma modificação adicional inclui Ácidos Nucléicos Locked (LNAs)em que o grupo 2-hidroxil é ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel deaçúcar, através disso formando um componente bicíclico de açúcar. A ligaçãopode ser um grupo metileno (-CH2-)n conectando o átomo de oxigênio 2' e oátomo de carbono 4' em que η é 1 ou 2. LNAs e preparações destes estãodescritas no documento WO 98/39352 e documento WO 99/14226.Outras modificações possíveis incluem 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2 NH2), 2'-alquil (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-alquil (2'-O-CH2-CH=CH2) e 2-flúor (2'-F). A modificação 2' pode ser na posição arabino(acima) ou na posição ribo (abaixo). Uma modificação 2-arabino é 2'-F.

Modificações similares podem também ser feitas em outras posições nooligonucleotídeo, particularmente a posição 3' do açúcar no nucleotídeoterminal 3' ou na ligação dos oligonucleotídeos 2-5' e na posição 5' donucleotídeo terminal 5'. Oligonucleotídeos podem também ter açúcaresmiméticos tal como componentes ciclobutil no lugar do açúcar pentafuranosil.

Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação detais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não estão limitadas a,patentes US: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878;5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722;5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633;5.792.747; e 5.700.920, cada uma destas está integralmente incorporarada aopresente como referência.

Oligonucleotídeos podem também incluir modificações ousubstituições na nucleobase (freqüentemente referida na técnica simplesmentecomo "base"). Como usado no presente, nucleobases "não modificadas" ou"naturais" incluem as bases purina, adenina (A) e guanina (G) e as basespirimidina, timina (T)1 citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadasincluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil eoutros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquilde adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila ecitosina, 5-propinil (-CfiC-CH3 ou -CH2-CfiCH) uracila e citosina e outrosderivados alquil de bases pirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila(pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil eoutras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. outrasmodificações de nucleobases adicionais incluem pirimidinas tricíclicas taiscomo fenoxazina citidina(1 H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazina-2(3H)-um),fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazina-2(3H)-ume), G-clampstal como uma fenoxazina citidina substituída (por exemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazina-2(3H)-um), carbazola citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-um), piridoindola citidina (H-pirido[3\2^4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidina-2-um). Nucleobases modificadas podem também incluir aquelas em que a basepurina ou pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobasesadicionais incluem aquelas divulgadas nas patentes US 3.687.808, aquelasdivulgadas na The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelasdivulgadas por English et ai, Angewandte Chemie1 International Edition, 1991,30, 613. Certas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar aafinidade de ligação do composto oligomárico da invenção. Isto incluipirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Substituições 5-metilcitosina mostraram aumentar aestabilidade do ácido nucléico duplex por 0,6-1,2.graus. C. (Sanghvi et al,

Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, páginas.276-278) e são substituições de bases exemplares, por exemplo, quandocombinadas com modificações de açúcares 2'-0-metoxietil. Patentesrepresentativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação denucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, patentes US3.687.808, assim como as patentes US: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066;5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177;5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985;5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.681.941 e 5.750.692, cada uma destas estáincorporarada ao presente como referência.

Outras modificações de oligonucleotídeos antisensecompreendem ligação química do oligonucleotídeo a um ou mais componentesou conjugados que aumentam a atividade, distribuição celular ou absorçãocelular do oligonucleotídeo. Os compostos da invenção podem incluir gruposconjugados covalentemente ligados a grupos funcionais tais como gruposhidroxil primários ou secundários. Grupos conjugados da invenção incluemintercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicol,poliéteres, grupos que aumentam as propriedades farmacodinâmicas dosoligômeros e grupos que aumentam as propriedades farmacocinéticas dosoligômeros. Grupos cunjugados típicos incluem colesteróis, lipídeos, lipídeoscatiônicos, fosfolipídeos, fosfolipídeos catiônicos, biotina, fenazina, folato,fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceína, rodaminas, cumarinas ecorantes. Grupos que aumentam as propriedades farmacodinâmicas nocontexto desta invenção incluem grupos que aumentam a absorção dooligômero, aumentam a resistência à degradação do oligômero, e/ou reforçama hibridização específica da seqüência com RNA. Grupos que aumentam aspropriedades farmacocinéticas no contexto desta invenção incluem grupos queaumentam a absorção do oligômero, distribuição, metabolismo ou excreção.Componentes conjugados incluem, mas não estão limitados aos componenteslipídicos tais como componente colesterol (Letsinger et ai., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et ai, Bioorg. Med.Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol(Manoharan et ai, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et ai.,Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser etal., Nuel. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo,dodecandiol ou resíduos undecil (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10,1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al.,Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietil-amônio 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., NucLAcids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia depolietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nueleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995,36, 3651-3654), um componente palmitil (Mishra et al., Bioehim. Biophys. Aeta,1995, 1264, 229-237), ou um octadecilamina ou componente hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Oligonucleotídeos da invenção podem também seconjugados às substâncias droga ativas, por exemplo, aspirina, warfarina,fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácidoflufenâmico, ácido folínico, um benzotiadiazida, clorotiazida, um diazepina,indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, uma droga sulfa, umantidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico. Conjugadosoligonucleotídeo-droga e suas preparações estão descritos no pedido depatente US 09/334.130 (depositado em 15 de junho de 1999) e patentes dosEstados Unidos: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313;5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124;5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046;4.587.044; e 4.605.735, 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941;4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013 e 5.082.830, 5.112.963; 5.214.136;5.082.830; 5.112.963; 5.214,136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536;5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463;5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481;5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941, cada umadestas está integralmente incorporada ao presente como referência.

Não é necessário para todas as posições em um dado compostoser modificado uniformemente, e na verdade mais do que uma dasmodificações mencionadas acima podem ser incorporadas em um únicocomposto ou até em um único nucleosídeo dentro de um oligonucleotídeo. Apresente invenção também inclui compostos antisense que são compostosquiméricos. Compostos antisense "quiméricos" ou "quimeras", no contextodesta invenção, são compostos antisense, particularmente oligonucleotídeos,que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma feita depelo menos uma unidade de monômero, isto é, um nucleotídeo no caso de umcomposto oligonucleotídeo. Estes oligonucleotídeos tipicamente contêm pelomenos uma região em que o oligonucleotídeo está modificado, de forma aconferir sob o aumento de resistência do oligonucleotídeo para a degradaçãoda nuclease, absorção celular aumentada, e/ou afinidade de ligaçãoaumentada para o ácido nucléico alvo. Uma região adicional dooligonucleotídeo pode servir como um substrato para enzimas, capaz de clivarhíbridos RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, RNase H é umaendonuclease celular que cliva a fita RNA de um RNA:DNA duplex. A ativaçãode Rnase H, então resulta na clivagem do RNA alvo, através disso,aumentando muito a eficiência da inibição do oligonucleotídeo de expressãogênica. Consequentemente, resultados comparáveis podem freqüentementeser obtidos com oligonucleotídeos mais curtos quando os oligonucleotídeosquiméricos são usados, comparado com fosfodioatos desoxioligonucleotídeosque hibridizam na mesma região alvo. Compostos antisense quiméricos dainvenção podem ser formados como estruturas compostas de dois ou maisoligonucleotídeos, oligonucleotídeos modificados, oligonucleosídeos e/ouoligonucleotídeos miméticos como descrito acima. Oligonucleotídeosantisense quiméricos exemplares incorporados em pelo menos um açúcarmodificado 2' (preferivelmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no 3' terminal para conferirresistência à nuclease e uma região com pelo menos 4 açúcares 2'-Hcontínuos para conferir atividade RNase. Tais compostos foram tambémreferidos na técnica como híbridos ou gapmers. Gapmers exemplares possuemuma região de açúcares modificados 2' (preferivelmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no3' terminal e no 5' terminal separados por pelo menos uma região que possui pelomenos 4 açúcares 2'-H contínuos e podem incorporar ligações fosforotioato naestrutura. Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparaçãode tais estruturas híbridas incluem, mas não estão limitadas a, patentes US:5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133;5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356 e 5.700.922; cada uma destas estáintegralmente incorporarada ao presente como referência.

Os compostos antisense usados de acordo com esta invençãopodem ser feitos convenientemente e de forma rotineira por meio de técnicasbem conhecidas de síntese de fase sólida. Equipamento para tal síntese évendido por diversos fornecedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems(Foster City, Calif.). Qualquer outro meio para tal síntese conhecida na técnicapode adicionalmente ou alternativamente ser empregado. É bem conhecido ouso de técnicas similares para preparar oligonucleotídeos tais como derivadosfosforotioatos e alquilados. Os compostos da invenção podem também sermisturados, encapsulados, conjugados ou de outra forma associados comoutras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como porexemplo, lipossomos, moléculas alvo de receptores, formulações orais, retais,tópicas ou outras, para ajudar na absorção, distribuição e/ou concentração.Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação detais formulações que ajudam na absorção, distribuição e/ou concentração,incluem, mas não estão limitadas a, patentes US: 5.108.921; 5.354.844;5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721;4.426.330; 4.534.899, 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.453.496; 5.227.170;5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; e 5.462.854,5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575 e5.595.756 cada uma destas está incorporada ao presente pela referência.

Outros exemplos de oligonucleotídeos antisense incluem aquelesoligonucleotídeos que estão covalentemente ligados a componentes orgânicos,tal como aqueles descritos no documento WO 90/10048 e outros componentesque aumentam a afinidade do oligonucleotídeo para uma seqüência de ácidonucléico alvo, tal como poli-(L-lisina). Ainda, agentes intercaladores adicionais,tal como elipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem seranexados aos oligonucleotídeos sense ou antisense para modificarespecificidades de ligação do oligonucleotídeo sense ou antisense para aseqüência de nucleotídeo alvo.

Oligonucleotídeos antisense podem ser introduzidos em umacélula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo por qualquer método detransferência de gene, incluindo, por exemplo, transfecção de DNA mediadapor CaP04, eletroporação, ou pelo uso de vetores de transferência de gene, talcomo vírus Epstein-Barr. Em um procedimento exemplar, um oligonucleotídeoantisense ou sense é inserido em um vetor retroviral adequado. Uma célula quecontém a seqüência de ácido nucléico alvo é contatada com o vetor retroviralrecombinante, tanto in vivo como ex vivo. Vetores retrovirais adequados incluem,mas não são limitados àqueles derivados de retrovírus murino M-MuLV, N2 (umretrovírus derivado de M-MuLV), ou os vetores de cópia dupla designados DCT5A,DCT5B e DCT5C (ver documento WO 90/13641).

Oligonucleotídeos antisense também podem ser introduzidos emuma célula que contém a seqüência de nucleotídeo alvo pela formação de umconjugado com uma molécula de ligação de ligante, como descrito nodocumento WO 91/04753. Moléculas de ligação do ligante adequadas incluem,mas não estão limitadas a, receptores de superfície celular, fatores decrescimento, outras citocinas, ou outros Iigantes que se ligam aos receptoresde superfície celular. Em geral, a conjugação da molécula de ligação do ligantepreferivelmente não interfere substancialmente com a habilidade da molécula deligação do ligante para se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, oubloquear a entrada do oligonucleotídeo sense ou antisense ou sua versãoconjugada na célula.

Alternativamente, um oligonucleotídeos antisense pode serintroduzidos em uma célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvopela formação de um complexo oligonucleotídeo-lipídeo, como descrito nodocumento WO 90/10448. O complexo oligonucleotídeo-lipídeo estápreferivelmente dissociado dentro da célula por uma Iipase endógena.

Moléculas de RNA ou DNA antisense são geralmente pelo menoscerca de 5 nucleotídeos em comprimento, alternativamente pelo menos cercade 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110,115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190,195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340,350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500,510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660,670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820,830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980,990, ou 1000 nucleotídes em comprimento, em que neste contexto o termo"cerca de" significa o comprimento da seqüência de nucleotídeo referenciadamais ou menos 10% desse comprimento referenciado.

RNAs e DNAs podem ser usados como agentes terapêuticos parabloquear a expressão de certos genes in vivo. Já foi mostrado queoligonucleotídeos antisense curtos podem ser importados em células onde elesagem como inibidores, apesar de suas baixas concentrações molecularescausadas pela sua absorção restrita pela membrana celular. (Zamecnik et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4143-4146 [1986]). Os oligonucleotídeos podemser modificados para aumentar sua absorção, por exemplo, pela substituição deseus grupos fosfodiéster carregados negativamente por grupos não carregados.

Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução deácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se oácido nucléico é transferido em células cultivadas in vitro ou in vivo nas célulasdo hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácidonucléico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos,eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método deprecipitação de fosfato de cálcio, etc. As técnicas atuais de transferência degene in vivo preferidas incluem transfecção com vetores virais (tipicamenteretroviral) e transfecção mediada por Iipossomo de revestimento de proteína(Dzau et ai., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). Em algumassituações é desejável fornecer a fonte de ácido nucléico com um agente queatinge as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína desuperfície de membrana celular ou a célula alvo, um Iigante para um receptorna célula alvo, etc. Onde lipossomos são empregados, proteínas que se ligama uma proteína de superfície de membrana celular associada com endocitosepodem ser usadas para atingir e/ou facilitar absorção, por exemplo, proteínascapsídeo ou fragmentos destas trópico para um tipo celular específico,anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclos, e proteínas queatingem locais intracelulares e aumentam meia vida intracelular. A técnica deendocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et ai, J. Biol.Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Nati Acad. Sei. EUA87:3410-3414 (1990). Para revisão de marcação de gene e terapia gênicaatualmente conhecida ver Anderson et ai, Science 256:808-813 (1992).

Polipeptídeos antagonistas de c-met e moléculas de ácidonucléico da invenção podem ser usadas para diagnosticar tipos de tecidos, emque polipeptídeos c-met hiperestabilizados podem ser expressadosdiferentemente em um tecido quando comparado a outro, preferivelmente emuma doença quando comparado a um tecido normal do mesmo tipo de tecido.

A invenção engloba métodos de seleção de compostos paraidentificar aqueles que modulam c-met hiperestabilizado. Testes de seleçãopara drogas antagonistas candidatas são projetadas para identificar compostosque se ligam ou formam complexos com o polipeptídeo c-met hiperestabilizado,ou de outra forma interferem com a interação dos polipeptídeos c-methiperestabilizados com outras proteínas celulares, incluindo por exemplo,inibição da expressão do polipeptídeo c-met hiperestabilizado das células.

Estes testes podem ser realizados em uma variedade deformatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de seleçãobioquímica, imunoensaios e ensaios baseados em célula, que são bemcaracterizados na técnica.

Todos os testes para antagonistas são comuns porque elesrequerem contato da droga candidata com um polipeptídeo c-methiperestabilizado sob condições e por um tempo suficiente para permitir queestes dois componentes interajam.

Nos ensaios de ligação, a interação é de ligação e o complexoformado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em umarealização específica, o polipeptídeo c-met hiperestabilizado ou a drogacandidata é imobilizada em uma fase sólida, tal como, em uma placa demicrotítulo, pelas ligações covalentes e não-covalentes. Ligação não-covalentegeralmente é efetuada pelo revestimento da superfície sólida com uma soluçãodo polipeptídeo c-met hiperestabilizado e seca. Alternativamente, um anticorpoimobilizado, tal como, um anticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeoc-met hiperestabilizado a ser imobilizado pode ser usado para ancorá-lo a umasuperfície sólida. O teste é realizado pela adição do componente não-imobilizado, que pode ser marcado por uma marca detectável, ao componenteimobilizado, tal como, a superfície de revestimento contendo o componenteancorado. Quando a reação está completa, os componentes não reagidos sãoremovidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados na fasesólida são detectados. Quando o componente originalmente carrega umamarca detectável, a detecção da marca imobilizada na superfície indica queocorreu a complexação. Onde o componente não imobilizado originalmentenão carrega uma marca detectável, a complexação pode ser detectada, porexemplo, pelo uso de um anticorpo marcado especificamente ligando ocomplexo imobilizado.

Se o composto candidato interage, mas não se liga a umpolipeptídeo c-met hiperestabilizado, sua interação com c-met hiperestabilizadopode ser testada por métodos bem conhecidos para detecção de interaçõesproteína-proteína. Tais testes incluem abordagens tradicionais, tais como,interligação, co-imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes oucoluna cromatográfica. Além disso, interações proteína-proteína podem sermonitoradas pelo uso de um sistema genético baseado em levedura descritopor Fields e colaboradores [Fields e Song, Nature (London) 340, 245-246(1989); Chien et ai., Proc. Nati Acad. Sei. USA 88, 9578-9582 (1991)] comodivulgado por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89. 5789-5793(1991). Muitos ativadores de transcrição, tais como levedura GAL4, consistemde dois domínios modulares distintos fisicamente, um agindo como o domíniode ligação de DNA1 e o outro funcionando como o domínio de ativação datranscrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicaçõesantecedentes (geralmente referido como "sistema di-híbrido") leva vantagemnesta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteínaalvo está ligada ao domínio de ligação de DNA do GAL4, e outra, em que ocandidato que ativa proteínas está ligado ao domínio de ativação. A expressãode um gene repórter GAL1-/acZ sob controle de um promotor ativado por GAL4depende da reconstituição da atividade de GAL4 via interação proteína-proteína. Colônias contendo interação de polipeptídeos são detectadas comum substrato cromogênico para β-galactosidase. Um kit completo(MATCHMAKER™) para identificação de interações proteína-proteína entreduas proteínas específicas usando-se técnica di-híbrida está comercialmentedisponível por meio da Clontech. Este sistema pode também ser estendidopara mapear domínios de proteínas envolvidos em interações específicas deproteínas, assim como para apontar resíduos de aminoácidos que são cruciaispara estas interações.

Compostos que interferem com a interação de c-methiperestabilizado e outros componentes intra ou extracelular podem sertestados como segue: Usualmente uma mistura de reação é preparadacontendo c-met hiperestabilizado e o componente intra ou extracelular sobcondições e por um tempo que permita a interação e ligação dos dois produtos.

Para testar a habilidade de um composto candidato para inibir ligação, a reaçãoé conduzida na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, umplacebo pode ser adicionado a uma terceira mistura de reação, para servircomo controle positivo. A ligação (formação do complexo) entre o composto deteste e o componente intra ou extracelular presente na mistura é monitoradacomo descrito acima. A formação de um complexo na(s) reação(ões) decontrole, mas não na mistura de reação contendo o composto de teste indicaque o composto de teste interfere com a interação do composto de teste e seuparceiro de reação.Para testar antagonistas, o composto a ser selecionado para umaatividade específica pode ser adicionado a uma célula que expressa c-methiperestabilizado, e a habilidade do composto para inibir a atividade deinteresse indica que o composto é um antagonista do polipeptídeo c-methiperestabilizado. O polipeptídeo c-met hiperestabilizado pode ser marcado, talcomo por radioatividade, tal que o número de moléculas de polipeptídeo c-methiperestabilizado presentes na célula possa ser usado para determinar aefetividade do antagonista potencial.

Um antagonista de c-met hiperestabilizado potencial é umaconstrução de RNA ou DNA antisense preparada usando-se tecnologiaantisense, onde, por exemplo, uma molécula de RNA ou DNA antisense agepara bloquear diretamente a tradução de um mRNA por hibridização para mRNAalvo e prevenção da tradução de proteína. Tecnologia antisense pode ser usadapara controlar expressão gênica através de formação de tripla hélice ou DNA ouRNA antisense, ambos os métodos são baseados na ligação de umpolinucleotídeo ao DNA ou RNA. Por exemplo, a porção de codificação 5' daseqüência de polinucleotídeo que codifica a proteína c-met hiperestabilizadamadura pode ser usada para projetar um oligonucleotídeo RNA antisense decerca de 10 a 40 pares de base no comprimento. Um oligonucleotídeo DNA éprojetado para ser complementar a uma região do gene envolvida na transcrição(tripla hélice - ver Lee et ai, Nucl._Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et ai.,Science, 241: 456 (1988); Dervan et ai, Science, 251:1360 (1991)), atravésdisso prevenindo transcrição e produção do polipeptídeo c-met hiperestabilizado.

O oligonucleotídeo RNA antisense hibridiza com o mRNA in vivo e bloqueiatradução da molécula de mRNA no polipeptídeo c-met hiperestabilizado(antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton1 FL1 1988).Os oligonucleotídeos descritos acima podem também ser entregues para célulastal que o RNA ou DNA antisense possa ser expressado in vivo para inibirprodução do polipeptídeo c-met hiperestabilizado. Quando o DNA antisense éusado, são preferidos oligodesoxirribonucleotídeos derivados do sítio deiniciação de tradução, por exemplo, entre aproximadamente posições -10 e +10da seqüência de nucleotídeo do gene alvo.

Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes decatalisar a clivagem de RNA específica. Ribozimas agem por hibridizaçãoespecífica da seqüência para o RNA alvo complementar, seguida por clivagemendonucleolítica. Sítios de clivagem de ribozimas específicos com um alvo RNApotencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para mais detalhesver, por exemplo, Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), e publicação PCTdocumento WO 97/33551 (publicado em 18 de setembro de 1997).

Moléculas de ácido nucléico na formação de tripla hélice usadaspara inibir transcrição devem ser de fita simples e compostas dedesoxinucleotídeos. A composição da base destes oligonucleotídeos éprojetada tal que promova formação de tripla hélice via regra de pareamento debase de Hoogsteen, que geralmente requer extensões consideráveis depurinas ou pirimidinas em uma fita de um dúplex. Para mais detalhes ver, porexemplo, publicação PCT documento WO 97/33551, acima.

Estas moléculas pequenas podem ser identificadas por qualquerum ou mais dos testes de seleção discutidos acima e/ou por qualquer outratécnica de seleção bem conhecida para aqueles técnicos no assunto.

Em uma realização, anticorpos que internalizam são preferidos.Anticorpos podem possuir certas características, ou modificados para possuirtais características que aumentam a distribuição de anticorpos nas células.Técnicas para atingir isto são conhecidas. Em ainda outra realização, umanticorpo pode ser expressado em uma célula alvo pela introdução de umácido nucléico capaz de expressar o anticorpo em uma célula alvo. Ver, porexemplo, patente US 6.703.019; 6.329.173; e publicação PCT 2003/077945.Lipofecções ou Iipossomos podem também ser usados para entregar oanticorpo nas células. Onde fragmentos de anticorpos são usados, o menorfragmento inibitório que se liga especificamente ao domínio de ligação daproteína alvo é geralmente vantajoso. Por exemplo, baseados nas seqüênciasde região variável de um anticorpo, podem ser projetadas moléculas depeptídeo que retêm a habilidade de ligar-se à seqüência de proteína alvo. Taispeptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologiade DNA recombinante. Ver, por exemplo, Marasco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 90: 7889-7893 (1993).

A entrada de polipeptídeos moduladores nas células alvo podeser aumentada por métodos conhecidos. Por exemplo, certas seqüências, taiscomo aquelas derivadas de HIV Tat ou de proteína de homeodomínioAntennapedia são capazes de direcionar absorção eficiente de proteínasheterólogas através de membranas celulares. Ver, por exemplo, Chen et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999), 96:4325-4329.

Anticorpos antagonistas de c-met da invenção pode ser qualqueranticorpo que seja capaz de interferir na atividade de c-met. Alguns exemplosespecíficos incluem um anticorpo anti-c-met que compreende:

(a) pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco seqüências de regiãohipervariável (HVR) do grupo que consiste de:

(i) HVR-L1 que compreende a seqüência A1-A17, em que A1-A17 éKSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4)

(ii) HVR-L2 que compreende a seqüência B1-B7, em que B1-B7 éWASTRES (SEQ ID NO:5)

(iii) HVR-L3 que compreende a seqüência C1-C9, em que C1-C9 éQQYYAYPWT (SEQ ID NO:6)

(iv) HVR-H1 que compreende a seqüência D1-D9, em que D1-D9 éGYTFTSYWLH (SEQ ID N0:20)

(ν) HVR-H2 que compreende a seqüência E1-E8, em que E1-E8 éGMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:21) e

(vi) HVR-H3 que compreende a seqüência F1-F11, em que F1-F11 éXYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:22) e X não é R; e

(b) pelo menos uma HVR variante, em que a seqüência HVR variantecompreende modificação em pelo menos um resíduo da seqüência descritanas SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 20, 21 ou 22. Em uma realização, HVR-L1 de umanticorpo da invenção compreende a seqüência da SEQ ID NO: 4. Em umarealização, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a seqüência daSEQ ID NO: 5. Em uma realização, HVR-L3 de um anticorpo da invençãocompreende a seqüência da SEQ ID NO: 6. Em uma realização, HVR-H1 deum anticorpo da invenção compreende a seqüência da SEQ ID NO: 20. Emuma realização, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende aseqüência da SEQ ID NO: 21. Em uma realização, HVR-H3 de um anticorpo dainvenção compreende a seqüência da SEQ ID NO: 22. Em uma realização,HVR-H3 compreende TYGSWSPLDY (SEQ ID NO: 23). Em uma realização,HVR-H3 compreende SYGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 24). Em uma realização,um anticorpo da invenção que compreende estas seqüências (em combinaçãocom as descritas acima) é humanizado ou humano.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo quecompreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVRcompreende, consiste ou essencialmente consiste de uma seqüênciaselecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 20, 21, 22, 23 ou24, e em que a SEQ ID NO: 4 corresponde a uma HVR-L1, SEQ ID NO: 5corresponde a uma HVR-L2, SEQ ID NO: 6 corresponde a uma HVR-L3, SEQID NO: 20 corresponde a uma HVR-H1, SEQ ID NO: 21 corresponde a umaHVR-H2, e SEQ ID NOs: 22, 23 ou 24 corresponde a uma HVR-H3. Em umarealização, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3,HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, em que cada um, em ordem, compreende SEQID NO: 4, 5, 6, 20, 21, e 23. Em uma realização, um anticorpo da invençãocompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, em quecada um, em ordem, compreende SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20, 21, e 24.

HVRs variantes em um anticorpo da invenção podem termodificações em um ou mais resíduos na HVR. Em uma realização, umaHVR-L2 variante compreende 1-5 (1, 2, 3, 4 ou 5) substituições em qualquercombinação das seguintes posições: B1 (M ou L), B2 (Ρ, T, G ou S), B3 ( N, G,R ou Τ), B4 ( I, N ou F), B5 ( Ρ, I, L ou G), B6 (A, D, T ou V) e B7 ( R, I, M ouG). Em uma realização, uma HVR-H1 variante compreende 1-5 (1, 2, 3, 4 ou5) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: D3 ( Ν, P,L, S, A, I), D5 (I, S ou Y), D6 (G, D, Τ, K, R), D7 (F, H, R, S, T ou V) e D9 (M ouV). Em uma realização, uma HVR-H2 variante compreende 1-4 (1, 2, 3 ou 4)substituições em qualquer combinação das seguintes posições: E7 (Υ), E9 (I),E10 (I), E14 (T ou Q), E15 (D, K, S, T ou V), E16 ( L), E17 (Ε, Η, N ou D) e E18(Υ, E ou H). Em uma realização, uma HVR-H3 variante compreende 1-5 (1, 2,3, 4 ou 5) substituições em qualquer combinação das seguintes posições: F1(T, S), F3 (R, S, Η, Τ, A, K), F4 (G), F6 (R, F1 Μ, Τ, E, K1 A, L, W), F7 (L, I, T1 R,Κ, V), F8 (S, A), F10 (Υ, N) e F11 (Q, S, H, F). As letras em parêntesesseguindo cada posição indicam uma substituição ilustrativa (isto é, substituição)de aminoácido, como seria evidente para aquele técnico no assunto, aadequação de outros aminoácidos como aminoácidos de substituição nocontexto descrito no presente pode ser avaliada de forma rotineira usando-setécnicas conhecidas e/ou descritas no presente. Em uma realização, uma HVR-L1 compreende a seqüência da SEQ ID NO: 4. Em uma realização, F1 em umavariante HVR-H3 é T. Em uma realização, F1 em uma variante HVR-H3 é S.

Em uma realização, F3 em uma variante HVR-H3 é R. Em uma realização, F3em uma variante HVR-H3 é S. Em uma realização, F7 em uma variante HVR-H3 é T. Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende umavariante HVR-H3 em que F1 é T ou S, F3 é R ou S e F7 é T.

Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende umavariante HVR-H3 em que F1 é T, F3 é R e F7 é T. Em uma realização, umanticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 em que F1 é S. Emuma realização, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3em que F1 é T, e F3 is R. Em uma realização, um anticorpo da invençãocompreende uma variante HVR-H3 em que F1 é S, F3 é R e F7 é T. Em umarealização, um anticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H3 emque F1 é T, F3 é S, F7 é T1 e F8 é S. Em uma realização, um anticorpo dainvenção compreende uma variante HVR-H3 em que F1 é T, F3 é S, F7 é T, eF8 é A. Em algumas realizações dita variante HVR-H3 do anticorpo tambémcompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2 em que cada umacompreende, em ordem, as seqüência descritas nas SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 20, e21. Em algumas realizações estes anticorpos também compreendem umaseqüência de estrutura consenso de cadeia pesada subgrupo III. Em umarealização destes anticorpos, a seqüência de estrutura consenso compreendesubstituições nas posições 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destesanticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destesanticorpos, estes anticorpos também compreendem uma seqüência deestrutura consenso de cadeia leve humana κΙ.

Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende umavariante HVR-L2 em que B6 é V. Em algumas realizações, dita variante HVR-L2do anticorpo também compreende HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ IDNO: 4, 6, 20, 21, e 22. Em algumas realizações, dita variante HVR-L2 doanticorpo também compreende HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3,em que cada uma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ IDNO: 4, 6, 20, 21 e 23. Em algumas realizações, dita variante HVR-L2 doanticorpo também compreende HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, e HVR-H3,em que cada uma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ IDNO: 4, 6, 20, 21 e 24. Em algumas realizações, estes anticorpos tambémcompreendem uma seqüência de estrutura consenso de cadeia pesadasubgrupo Ill humana. Em uma realização destes anticorpos, a seqüência deestrutura consenso compreende substituições nas posições 71, 73 e/ou 78. Emalgumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Emuma realização destes anticorpos, estes anticorpos também compreendem umaseqüência de estrutura consenso de cadeia leve humana κΙ.

Em uma realização, um anticorpo da invenção compreende umavariante HVR-H2 em que E14 é Τ, E15 é K e E17 é E. Em uma realização, umanticorpo da invenção compreende uma variante HVR-H2 em que E17 é E.Em algumas realizações, dita variante HVR-H3 do anticorpo tambémcompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cadauma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20e 22. Em algumas realizações, dita variante HVR-H2 do anticorpo tambémcompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cadauma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20e 23. Em algumas realizações, dita variante HVR-H2 do anticorpo tambémcompreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cadauma, em ordem, compreende a seqüência descrita nas SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20e 24. Em algumas realizações, estes anticorpos também compreendem umaseqüência de estrutura consenso de cadeia pesada subgrupo Ill humana. Emuma realização destes anticorpos, a seqüência de estrutura consensocompreende substituições nas posições 71, 73 e/ou 78. Em algumasrealizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em umarealização destes anticorpos, estes anticorpos também compreendem umaseqüência de estrutura consenso de cadeia leve humana Kl.

A formulação no presente pode também conter mais que umcomponente ativo como necessário para a indicação específica sendo tratada,preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetemcontrariamente um ao outro. Alternativamente, ou, além disso, a composiçãopode compreender um agente que aumenta esta função, tal como, porexemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterápico ou agenteinibitório de crescimento. Tais moléculas são adequadamente apresentadasem combinação em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

Os seguintes são exemplos dos métodos e composições dainvenção. É entendido que várias outras realizações podem ser praticadas,dada a descrição geral fornecida acima. Os exemplos são oferecidos somentepara propósitos ilustrativos, e não têm a intenção de limitar o escopo dapresente invenção em qualquer modo.

Exemplos

Materiais E Métodos

Cultura Celular

As linhagens celulares foram obtidas da Coleção Americana deTipos de Cultura (ATCC), NCI Divisão de Tratamento e Diagnóstico de Câncere depóstito de tumor, ou Fundação de Ciências da Saúde Japonesa. Todas aslinhagens celulares, com exceção de 293 e Rat 1A foram mantidas em RPMI1640 suplementadas com 10% de FBS (Sigma), penicilina/estreptomicina(GIBCO) e 2 nM L-glutamina. Células 293 e Rat 1A foram mantidas em DMEMcom glicose alta e suplementadas como descrito.

Plasmídeos E Linhagens Celulares EstáveisMet WT-V5/His de comprimento total foi previamente descrito(Kong-Beltran et al, 2004). Met WT-V5/His serviu como um padrão paraproduzir um ponto de mutação Y1003F usando-se primers previamentedescritos (Peschard et al, 2001) via Mutagênese Sítio Dirigida de Troca Rápida(Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Exon 14 foi deletadopelo uso de dois conjuntos de primers que criam novos sítios de restrição Nhelao redor do Met exon 14 (aa 963-1011) via Mutagênese Sítio Dirigida de TrocaRápida e então digerindo com Nhel seguido por religação do plasmídeo. Asmutações foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para gerar linhagensestáveis de Met em células Rat 1A, 10 pg de cada DNA de pRK5TKneo, MetWT-V5/His, Met Y1003F -V5/His, ou Met AEx14-V5/His foi digerido com Kpnl epurificado (Qiagen). Células Rat 1A foram transfectadas com 4 pg de cadaDNA em uma placa com 6 poços via Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordocom as instruções do fabricante. No dia seguinte as células foram tripsinizadase semeadas em placas de 10 cm. Vinte e quatro horas mais tarde 500 pg/mlde G418 (Sigma) foi adicionado. A seleção continuou por aproximadamenteduas semanas antes da seleção de clones positivos para Met por FACSusando-se anticorpo 3D6 (ver patente US 6.099.841) e coradas com PE. Umacélula foi pingada por poço. Clones expandidos foram Iisados e testados paraMet via immunoblotting com anticorpo V5 (Invitrogen).

Imunoprecipitação E Análise Western Blot

Para análise da expressão de proteínas em espécimes de tecidocongelado, o tecido (~100 mg) foi homogeneizado em 200 μΙ de tampão de Iisecelular (Cell Signaling), contendo coquetel inibidor de protease (Sigma),coquetéis Iell inibidores de inifosfatase (Sigma), 50 mM de fluoreto de sódio, e2 mM de ortovanadato de sódio usando-se um homogenizador Polytron®(Kinematica). As amostras foram então Iisadas por movimentação branda por1 hora a 4°C, antes da pré-liberação com uma mistura de Sefarose de proteínaA de Fluxo Rápido (Amersham) e Sefarose de proteína G de Fluxo Rápido(Amersham). As concentrações de proteína foram determinadas usando-sereagente Bradford (BioRad). As proteínas (20 Mg) foram subseqüentementedeterminadas por SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose, epara immunoblot com anticorpos Met (DL-21, Upstate) ou β-actina (1-19, SantaCruz). As proteínas foram visualizadas por quimioluminescência aumentada(ECL Plus, Amersham). Para estudos de co-ímunoprecipitação envolvendoMet transfectados e Cbl1 3 pg de cada construção de Met e 3 pg de Cbl-flagforam transfectados em 293 células usando-se FuGENE6 (Roche). As célulasdo dia seguinte foram estimuladas com 100 ng/ml rhuHGF por 30 minutosantes da coleta usando-se 1% de tampão de Iise NP40 [50 mM Tris (pH 7,45),150 mM de NaCI1 e 1% de Nonidet 40] contendo tablete de coquetel inibidor deprotease completo (Roche) e coquetel inibidor fosfatase II. Fragmentoscelulares foram centrifugados e 1 mg de Iisados foi imunoprecipitado tanto com1.5 μΙ de anticorpos V5 (Invitrogen) ou 2 pg de anticorpos Cbl (C-15, SantaCruz) a 4°C com rotação durante a noite seguido por incubação com ProteínaG ou beads A por 2 horas. 2X tampão de amostra (Invitrogen) contendo 20 mMDTT (Sigma) foi adicionado e as amostras foram fervidas por 5 minutos. Asamostras foram carregadas com 4-12% de géis Tris-glicine (Invitrogen) etransferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 pm (Invitrogen). Amembrana foi bloqueada com 5% de leite não gorduroso por 1 hr seguido porimmunoblotting con V5, flag policlonal (Sigma), ou anticorpos P-Tyr (4G10,Upstate). Para estudos de ligação contendo Cbl endógeno, 293 células foramtransfectadas com 6 pg de cada construção de DNA por placas de 10 cmusando-se FuGENE6. No dia seguinte as células foram estimuladas com 100ng/ml de rhuHGF por 30 minutos antes da coleta. As amostras foramimunoprecipitadas com 2 pg de Cbl ou 1,5 pg de anticorpos V5, seguido porimmunoblotting com anticorpos V5 ou Cbl. O V5 blot imunoprecipitado foiretirado usando-se tampão de retirada western blot Restore (Pierce) eresondado com P-Met Y1003 (Biosource), P-Met Υ1234ΛΊ2345 (CellSignaling), P-Met Υ1349 (Cell Signaling), ou P-Met 1365 (Biosource). Paraestudos de degradação, células 293 foram transfectadas com 0,25 pg depRK5TKneo, Met WT-V5/HÍS, Met Y1003F-V5/His, ou Met AEx14-V5/Hismutante usando-se FuGENE6 em uma placa de 6 poços. No dia seguinte ascélulas foram tratadas com 10 pg/ml de cicloheximida (Sigma) para os temposindicados. Os Iisados foram analisados por SDS-PAGE e a membrana passoupor immunoblotting com anticorpos V5 ou actina.

Teste De Ubiquitinação

Células 293 foram transfectadas com 3 μg de construções de Metconstructs, 2 μg de Cbl-flag, 1 pg de HA-ubiquitina e vetores vazios pRK5TKneoou pFlag5a quando necessário para ter 6 pg total de DNA por amostra usando-se FuGENE6. No dia seguinte as células foram tratadas com 25 pg/ml de MMG-123 (CaIbiochem) por 4 horas antes da coleta. As células foram Iisadas em1% de tampão de Iise NP-40 contendo inibidores, 25 μΜ de MG-132 e 10 mM deN-etilmaleimida. Os Iisados (1 mg) foram imunoprecipitados com 1,5 pg deanticorpo V5 e imunoblotados com anticorpo ubiquitina (P4D1, Santa Cruz) eentão retirados e resondados com anticorpo V5.

Sinalização Celular ε Estudos De Inibição

Para examinar a sinalização prolongada em clones estáveisH226, H596, H358, ou Rat IA-Met1 as células foram lavadas com PBS, entãoprivadas de soro em meio RPMI ou DMEM contendo 0,5% de BSA, 2 mM deglutamina e penicilina/estreptomicina por uma hora. rhuHGF ou o anticorpomonoclonal agonístico anti-Met, 3D6 (Genentech), foi adicionado ao meio livrede soro por 10 minutos. A monocamada de células foi então lavada com PBSe incubada com meio livre de soro até sua extração nos tempos indicados. Ascélulas foram então lavadas com PBS, Iisadas com tampão de amostra 1XSDS contendo 1X DTT (Invitrogen), brevemente sonicado e fervido por 5minutos. Para analisar inibição do receptor de Met, as células privadas de sorotiveram anticorpo anti-Met 5D5 adicionado ao meio livre de soro nasconcentrações indicadas por 30 minutos. As células foram então estimuladaspor 15 (para análise de ativação de Met) ou 30 minutos (para análise Akt eMAPK) com 100 ng/ml de rhuHGF e Iisadas com tampão de amostra 1X SDScontendo DTT. Amostras fervidas foram analisadas por SDS-PAGE eimunoblotados com P-Met (Y1230/Y1234/Y1235, BioSource), P-Met(Y1234/Y1235), Met (DL-21). P-MAPK (E10, Cell Signaling), P-MAPK (CellSignaling), P-Akt (587F11, Cell Signaling) ou Akt (Cell Signaling). Anticorpossecundários usados foram conjugado anti-rabbit-AlexaFluor680 (MolecularProbes) ou conjugado anti-mouse-IRDye800 (Rockland lmmunochemicals). Asproteínas transferidas em membranas de nitrocelulose foram detectadas porscan infravermelho usando-se Odyssey (LiCor) de acordo com as instruções dewestern blotting recomendadas pelo seguido por quantificação. Para os testesde viabilidade celular, as células foram plaqueadas em triplos a -1x104 célulaspor poço em placas de 96 poços em RPMI contendo 0,5% de FBS (meio deteste) durante a noite, antes da estimulação com meio de teste contendo 50ng/ml de rhuHGF. Meio de teste sem rhuHGF foi adicionado para poços nãoestimulados. Após 72 horas, a viabilidade celular foi medida usando-se Testede Viabilidade Celular Luminescente (Promega). Os índices de estimulaçãoforam determinados por divisão da média de unidades de viabilidade celular deculturas estimuladas por HGF pela média de unidades de viabilidade celular deculturas não estimuladas. Os índices médios de estimulação foramdeterminados a partir de um mínimo de 3 experimentos separados. Testes deinibição de crescimento foram realizados de uma maneira similar, tanto comAO-5D5 como um controle Ig adicionado no momento da estimulação HGF.

Modelo De Xenoenxerto In Vivo

Fêmeas atímicas de camundongos nus (Charles River, Hollister)foram inoculadas subcutaneamente com pools de linhagens celulares estáveisRatIA que expressam Met WT, Met Y1003F, Met ΔΕχ14 ou vetor controle (5milhões de células/camundongo, n=5). 10 mg/kg de anticorpo agonista anti-Met3D6 que reconhece somente Met humano foi administrado para estimulação doreceptor Met1 intraperitoneamente, uma vez por semana. Os tumores forammedidos duas vezes por semana usando-se um calibrador digital e os volumesdos tumores foram calculados usando-se a seguinte equação. Volume doTumor (mm3)= (π/6)(Α)(Β)(Β). A= largura maior, B=Iargura menor.

Resultados E Discussão

Nós sequenciamos todos os exons de codificação de Met a partirde um painel de espécimes de tumor de pulmão e de cólon que representamtumores primários, linhagens celulares de tumor e modelos de xenoenxerto detumor primário. Em nossos esforços para sequenciamento, nós identificamosmutações somáticas de heterozigoto em espécimes de tumor de pulmãoprimário nas regiões intrõnicas ao redor do exon 14 (Fig. 1). Estas mutaçõesforam específicas para tumores e não foram identificadas em tecido de pulmãonão neoplásico dos mesmos indivíduos (dados não mostrados). Em H596,uma linhagem celular de câncer de pulmão de célula não pequena (NSCLC),nós identificamos um ponto de mutação homozigoto no sítio doador de junção3p. A presença de mutações no sítio de junção de dinucleotídeos consenso eo trato polipirimidina a montante do exon 14, combinado com a observação deque exon 13 e exon 15 permanecem na fase, sugeriu que uma potencialtranscrição de Met desprovido do exon 14 poderia ainda produzir uma proteínaMet funcional. Para endereçar esta, nós primeiro realizamos amplificação RT-PCR do RNA de Met dos tumores mutantes e linhagem celular. Todas as trêsmutações intrõnicas resultaram em uma transcrição de comprimento mais curtocomparada com o tipo selvagem, consistente com a deleção do exon 14 (dadosnão mostrados). Nós também confirmamos a ausência do exon 14 pelosequenciamento de produtos RT-PCR e nossos resultados mostraram umadeleção na estrutura que remove os aminoácidos L964 por meio de D1010 deMet. De forma interessante, a forma mutante do receptor é a formaexpressada mais predominantemente expressada, ap esar das amostras detumor serem heterozigotos para deleção do exon 14 (dados não mostrados),indicando uma expressão preferencial da transcrição variante. Isto foi tambémconfirmado por Western blotting demonstrando a expressão predominante deuma proteína Met truncada. Espécimes que abrigam estas mutações intrônicaseram tipo selvagem para K-ras, B-raf, EGFR e HER2 pertinentes aos exonssequenciados (dados não mostrados). Considerando juntos, estes resultadosindicam a natureza dominante destas mutações intrônicas de Met. De formainteressante, uma variante de junção de Met desprovida de exon 14 foipreviamente relatada em tecido de camundongo normal, embora aconseqüência funcional com relação à tumorgênese não era clara (20,21). Noentanto, nós não detectamos expressão desta variante de junção em qualquerespécime de pulmão humano normal examinado (dados não mostrados). Afalta desta variante de junção em tecido normal foi adicionalmente comprovada,como previamente discutido (21). cDNA que compreende uma variante dejunção desprovida do exon 14 foi relatada em uma espécime NSCLC humanaprimária, no entanto o papel de mutagênese mediando defeitos de junção nãofoi avaliado, nem sua conseqüência funcional, se qualquer dos mutantes possater sido expressado (22). Visto que ácidos nucléicos que compreendemvariantes de junção não são incomuns em células cancerosas, a relevânciafuncional da variante de junção relatada era desconhecida.

A deleção do aminoácido 47 do exon 14 no domínio próximo àmembrana de Met (L964-D1010) remove o sítio de fosforilação Y1003necessário para ligação Cbl e regulação para baixo do receptor ativado.Estudos prévios mostram que uma mutação Y1003F elimina ligação Cbl emantém ativação de Met (6). Nós primeiro confirmamos a perda de ligação Cbldo mutante de Met associado ao tumor pelos estudos de coimunoprecipitação.Células 293 foram transfectadas com Met tipo selvagem (Met WT), Metmutante Y1003F (Met Y1003F), e Met com exon 14 deletado (Met ΔΕχ14) pelatransfecção destas construções de Met com Cbl-f/agr e m células 293. Nósobservamos que ligação Cbl para Met ΔΕχ14 é diminuída comparada a Met WT(Fig. 2A) e perda confirmada de ligação Cbl a Met Y1003F (6). A fosforilaçãode tirosinaCbl por Met WT e mutantes Met foram equivalentes, indicando queas mutações de Met em geral não alteraram a fosforilação de Cbl. Nossosdados também indicam que Met WT co-imunoprecipita com Cbl endógeno.masnão com Met ΔΕχ14 (Fig. 2B) que é coerente com a observação de co-expressão de Met e Cbl. Além disso, nós examinamos sítios de fosforilaçãotirosina necessários para ativação do receptor Met. Nossos dados indicam quea fosforilação de Y1234/Y1235, Y1349, e Y1365 é mantida tanto em Met WT eMet ΔΕχ14 (Fig. 2B). Como esperado, uma perda de fosforilação Y1003 emMet ΔΕχ14 foi observada em contraste com Met WT (Fig. 2B). Visto que aatividade Cbl E3-ligase é reportada para facilitar a degradação do receptormediada por ubiquitina (6, 8), testes de ubiquitinação foram realizados emcélulas transfectadas com Met WT, Met Y1003F e Met ΔΕχ14. Tanto MetΔΕχ14 e Met Y1003F mostraram ubiquitinação atenuada comparado com MetWT na presença de Cbl (Fig. 2C). Nós confirmamos que a fosforilação deΥ1234ΛΊ235 foi mantida em todas as construções Met constructs e fosfo-Y1003 foi perdido nos mutantes como antes (dados não mostrados). De formainteressante, menos Met WT processado foi detectado com co-expressão deCbl comparado aos mutantes ou expressão de Met WT sozinho (Fig. 2C).Estas observações sugerem que Met WT que se liga a Cbl é preferivelmenteubiquitinado e degradado (6, 24) em contraste ao Met ΔΕχ14. Para determinarse a diminuição de ubiquitinação de Met ΔΕχ14 leva à regulação para baixo,células foram transfectadas com construções de Met e tratadas comcicloheximida para bloquear novas sínteses de proteína. Met ΔΕχ14 mostrouatrasar a regulação para baixo do receptor ao longo do tempo comparado aMet WT (Fig. 2D). O Met Y1003F mutante mostrou resultados similares (dadosnão mostrados). Significantemente1 tumores primários que ancoram a variantede junção do exon 14 exibiram níveis elevados da proteína Met relativo tantoem tecido de pulmão adjacente aos normais em pacientes compatíveis comoem adenocarcinomas de Met tipo selvagem (dados não mostrados), apesar daexpressão de níveis equivalentes de Met no nível de transcrição. Além disto, aanálise imunohistoquímica da expressão de Met nestes tumores de pacientescom exon 14 deletado revela forte expressão membranosa em todas as célulasneoplásicas; em contraste, expressão esporádica de Met é observada emtumores com Met WT e em tecidos adjacentes normais (dados não mostrados).

Para determinar se a regulação para baixo de Met ΔΕχ14 afetou asinalização celular a jusante sob estimulação HGF, níveis de fosforilação Met1Akt1 e MAPK foram examinados em linhagens de células tumorais NSCLC queabrigam deleção do exon 14 (H596) ou Met WT (H226 e H358). Células H596mostraram que tanto níveis de fosfo-Met e fosfo-MAPK foram mantidos por até3 horas após estimulação HGF enquanto que ambas as linhagens celularesH226 e H358, que expressaram receptor Met WT1 exibiram uma constanteperda de fosforilação ao longo do tempo (Fig. 2E). De forma interessante,níveis de fosfo-Akt não foram mantidos ao longo do tempo, apesar da ativaçãoinicial em resposta a HGF. A fosforilação de Stat3 e Stat5 também foramexaminadas, mas não exibiram ativação elevada (dados não mostrados). Vistoque linhagens celulares de tumor foram derivadas de diferentes antecedentesgenéticos, nós geramos linhagens celulares estáveis em células RatIA comvetor vazio, Met WT1 e Met ΔΕχ14 para comparação. RatIA Met ΔΕχ14demonstrou fosforilação MAPK prolongada, mas não ativação Akt, comparadoa Met WT sob estimulação com o Met agonista 3D6 que ativa o receptorhumano recombinante sozinho (25) (Fig. 2F, 5), dados que corroboram obtidosdas linhagens celulares de tumor NSCLC.

A conseqüência da sinalização Met e MAPK mantida foiexaminada na proliferação mediada por HGF em células H596 que abrigamexon 14 deletado de Met no contexto de um painel de 28 linhagens celularesadicionais NSCLC (Fig. 3A). Células H596 consistentemente exibem o maisalto potencial proliferativo sob estimulação HGF neste painel de linhagenscelulares NSCLC. Além disso, para avaliar crescimento in vivo da deleção deMet1 camundongos foram inoculados com linhagens celulares estáveis Rat 1AMet ΔΕχ14 e comparados com Rat 1A Met WT para a habilidade de formartumores. O aumento da proliferação celular foi observado em ambas ascélulas, Met ΔΕχ14 e Met Y1003F Ratla comparado com Met WT (dados nãomostrados). Sob estimulação com 3D6, as células Rat 1A Met ΔΕχ14 foramaltamente tumorgênicas e desenvolveram grandes tumores comparado àquelesde Rat 1A Met WT (Fig. 3B). Estes resultados foram consistentes com umaumento do papel oncogênico para o exon 14 deletado de Met.

Para determinar se os antagonistas de Met poderiam inibir célulastumorais que ancoram a deleção de Met1 células H596 foram tratadas com uminibidor anti-c-met conhecido (também referido como anti-Met OA-5D5 (26)).

Anti-Met OA-5D5 é um anticorpo que compreende 3 polipeptídeosimunoglobulinas - uma cadeia leve intacta e uma cadeia pesada quecompreende seqüências de domínio variável (mostradas na Fig. 9), e umacadeia pesada truncada no N-terminal que compreende uma porção Fc quedimeriza com a porção Fc da cadeia pesada de comprimento total. Aconstrução e geração de anti-Met OA-5D5 estão também descritas no pedidode patente PCT PCT/US2004/042619 (depositado em 17 de dezembro de2004). Fosforilação Met e MAPK diminuiu com a adição de anti-Met OA-5D5em um modo dependente da dose (Fig. 4A, 6). Além disso, o tratamento decélulas H596 com OA-5D5 resultou na inibição da proliferação celulardependente da dose de um modo dependente do Iigante (Fig. 4B). Estesresultados apoiam uma aproximação terápica que compreende atingir cânceresque expressam c-met que é hiperestabilizado (tal como um c-met mutante queexibe deleção próxima à membrana) com um antagonista de Met.

Apesar da natureza intrínseca da junção anormal em célulastumorais, não é de certa forma esperado que uma junção variante associada atumor codifique uma proteína do receptor mutante que é mais lenta nadegradação intracelular e que exibe atividade oncogênica aumentada. Nossosdados sugerem fortemente que um evento de junção conduzido, por exemplo,por mutagênese somática, é utilizado por tumores para ativar um produto geneoncogênico. No estudo imediato, a identificação de múltiplos tipos de mutaçõesintrônicas que afetam diferentemente a montagem do spliceossoma eseletivamente excluem exon 14, destaca a relevância de tal evento mutagênicoem Met. De maneira interessante, deleções e inserções dentro do domíniopróximo à membrana aparentemente desempenham um papel na ativação decertos receptores tirosina quinase pela alteração da conformação do receptor eativação do domínio quinase (Hubbard, S Nature Rev Mol Cell Bio1 5:464, 2004).Deleção próxima à membrana de KIT (Hirota et al Science 279:577, 1998) ePDGFRa (Heinrich, MC. et al Science 299:708, 2003) foi identificada em tumoresestromais; repetições internas em conjunto próximas ã membrana ativam FLT3em leucemia mielóide aguda (Nakao, M et al Leukemia 10:1911, 1996). Noentanto, nossa identificação de uma deleção próxima à membrana caracterizaum mecanismo completamente diferente de ativação de Met que atrasa aregulação para baixo do receptor, resultando então em proteínas c-met mutantesque significantemente aumentam a estabilidade em células cancerosas. Estesdados sugerem que mutações que conduzem regulação para baixo podem levarà ativação oncogênica e conduzir desenvolvimento de tumor.Lista Parcial De Referências

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<150> US 60/665,482<151> 25-03-2005

<160> 24

<210> 1<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada

<4 00> 1Ser Tyr Trp Leu His

5

<210> 2<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 2

Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe15 10 15

Lys Asp

<210> 3<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 3

Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro Leu Asp Tyr

5 10<210> 4<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr15 10 15

Leu Ala

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada

<400> 5Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

5

<210> 6<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr

5

<210> 7<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 7

Cln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly15 10 15

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu35 40 45

Glu Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe50 55 60Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Asn Val Asp Arg Ser65 70 75

Ser Asn Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro95 100 105

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115

<210> 8<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 8

Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Val15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu20 25 30

Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys35 40 45

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg50 55 60

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr65 70 75

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val Lys Ala Asp Asp Leu Ala80 85 90

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly95 100 105

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys110

<210> 9<211> 45<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 9

gtagactacc gagctacttt tccagaaggt atatttcagt ttatt 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 10

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<210> 11<211> 45<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 11

tctttaacaa gctctttctt tctctctgtt ttaagatctg ggcag 45

<210> 12<211> 23<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12tctttaactt aagatctggg cag 23

<210> 13<211> 45<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

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<210> 14<211> 17<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14gtagacttca gtttatt 17

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<213> Homo sapiens

<400> 15

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<210> 16<211> 45<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 16

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<210> 17<211> 1390<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 17

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu15 10 15Phe Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu20 25 30

Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn35 40 45

Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His50 55 60

His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu65 70 75

Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu80 85 90

Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala95 100 105

Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu110 115 120

Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser125 130 135

Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His140 145 150

Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln155 160 165

Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu170 175 180

Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe185 190 195

Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro200 205 210

Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly215 220 225

Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser245 250 255

Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp260 265 270

Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn275 280 285

Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu290 295 300

Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn305 310 315Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala320 325 330

Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val335 340 345

Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser350 355 360

Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn365 370 375

Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr380 385 390

Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn395 400 405

Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe410 415 420

Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser425 430 435

Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu440 445 450

Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val455 460 465

Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr485 490 495

Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile500 505 510

Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser515 520 525

Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp530 535 540

Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr545 550 555

Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro560 565 570

Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly575 580 585

Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys590 595 600

Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser605 610 615Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met620 625 630

Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly635 640 645

Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr650 655 660

Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu665 670 675

Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile680 685 690

Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser695 700 705

Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile725 730 735

Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr740 745 750

Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys755 760 765

Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His770 775 780

Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn785 790 795

Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn800 805 810

Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly815 820 825

Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val830 835 840

Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu845 850 855

Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val860 865 870

Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile875 880 885

His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu890 895 900

Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile905 910 915Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn920 925 930

Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu935 940 945

Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln950 955 960

Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val965 970 975

His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser980 985 990

Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala995 1000 1005

Thr Phe Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser1010 1015 1020

Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu1025 1030 1035

Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr1040 1045 1050

Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala1055 1060 1065

Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe1070 1075 1080

Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly1085 1090 1095

Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys1100 1105 1110

Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu1115 1120 1125

Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu1130 1135 1140

Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val1145 1150 1155

Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg1160 1165 1170

Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly1175 1180 1185

Leu Gln Val Ala Lys Ala Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe1190 1195 1200

Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys1205 1210 1215Phe Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr

1220 1225 1230

Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu

1235 1240 1245

Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe

1250 1255 1260

Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu

1265 1270 1275

Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe

1280 1285 1290

Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro

1295 1300 1305

Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp

1310 1315 1320

His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser

1325 1330 1335

Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val

1340 1345 1350

His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr

1355 1360 1365

Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp

1370 1375 1380

Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser

1385 1390

<210> 18<211> 113<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<4 00> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu

20 25 30

Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

35 40 45

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

50 55 60

Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr65 70 75Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala80 85 90

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly95 100 105

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys110

<210> 19<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Trp Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe50 55 60

Asn Pro Asn Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro95 100 105

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115

<210> 20<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 20

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu His

5 10

<210> 21<211> 18<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 21

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn1 5 10 15

Phe Lys Asp

<210> 22<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> χ é qualquer aminoácido exceto R<400> 22

Xaa Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro Leu Asp Tyr

5 10

<210> 23<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada<400> 23

Thr Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro Leu Asp Tyr

5 10

<210> 24<211> 11<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Seqüência é sintetizada

<400> 24

Ser Tyr Gly Ser Tyr Val Ser Pro Leu Asp Tyr

5 10

Claims (16)

1. ANTAGONISTA QUE INIBE ATIVIDADE DESINALIZAÇÃO C-MET DE UM POLIPEPTÍDEO C-MET HIPERESTABILIZADOHUMANO, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo c-methiperestabilizado compreende uma deleção de pelo menos uma porção doexon 14 tal que sua taxa de degradação seja diminuída comparada ao c-mettipo selvagem, e em que o polipeptídio c-met hiperestabilizado possui atividadede sinalização c-met.

2. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antagonista é um anticorpo que se liga a umepítopo formado por uma junção na estrutura do exon 13 e exon 15 de c-methumano.

3. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção do exon 14 dopolipeptídeo c-met hiperestabilizado é apagada.

4. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antagonista é um RNA inibidor quepreferencialmente inibe expressão de uma molécula de ácido nucléico quecodifica uma variante de junção de c-met, em que o exon 13 é ligado ao exon 15.

5. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a inibição da atividade de sinalização de c-metpelo antagonista compreende aumento da degradação celular de proteína c-met hiperestabilizada.

6. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antagonista está ligado a uma toxina.

7. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antagonista não se liga especificamente aopolipeptídeo c-met tipo selvagem.

8. ANTAGONISTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o antagonista não inibe substancialmente aatividade do polipeptídeo c-met tipo selvagem.

9. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM TUMOR em umsujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito umantagonista, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 8, através do qual otumor é tratado.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o tumor é determinado a compreender ο-methiperestabilizado.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o tumor é determinado a compreender c-met mutante quecompreende deleção de pelo menos uma porção do exon 14.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o método compreende administrar o antagonista junto com umagente que induz degradação de proteína do receptor.

13. USO DO ANTAGONISTA, conforme descrito em uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de ummedicamento para tratamento de um tumor.

14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o tumor é determinado a compreender c-methiperestabilizado.

15. USO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelofato de que o tumor é determinado a compreender c-met mutante quecompreende deleção de pelo menos uma porção do exon 14.

16. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato do medicamento também compreender um agente que induz degradaçãode proteína do receptor.