CN106459981A - 包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法 - Google Patents

包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106459981A
CN106459981A CN201480075958.5A CN201480075958A CN106459981A CN 106459981 A CN106459981 A CN 106459981A CN 201480075958 A CN201480075958 A CN 201480075958A CN 106459981 A CN106459981 A CN 106459981A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
aminoacid
spacer
light chain
cysteine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480075958.5A
Other languages
English (en)
Inventor
J.巴布库克
J.R.里奇
J.P.贝里奎斯特
S.D.巴恩谢尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zymeworks BC Inc
Original Assignee
Zymeworks Inc Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymeworks Inc Canada filed Critical Zymeworks Inc Canada
Publication of CN106459981A publication Critical patent/CN106459981A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0039—Coumarin dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开提供了包含C端延伸的轻链多肽，及含有此类经修饰的轻链多肽的抗体和抗体缀合物，其中所述C端延伸包含一个或多个半胱氨酸残基。还提供了缀合物，其包含经由所述C端氨基酸延伸的所述半胱氨酸残基与试剂缀合的本公开的抗体。本公开还提供了编码包含C端氨基酸延伸的抗体轻链多肽的核酸，所述C端氨基酸延伸包含半胱氨酸残基。还提供了包含本公开的所述抗体或缀合物的药物组合物，也提供了制备和使用本公开的所述经修饰的抗体和缀合物的方法。

Description

包含C端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
按照35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年12月23日提交的美国临时专利申请序列号61/920,425的提交日的优先权，该申请的公开以引用方式并入本文。
简介
最近几年中已经对开发对治疗的特定疾病的病因学下的细胞具有改善的选择性的治疗剂做出相当大的进展。已经利用抗体的抗原特异性提供药物有效负载的抗原特异性递送。
此类携带药物的抗体称为抗体药物缀合物(ADC)。ADC一般由经常经由接头与药物(例如细胞毒性药物)化学或酶促缀合的抗体构成。ADC通常设计为在循环中稳定并且在抗原特异性结合以及在一些情况中ADC的内在化后实现胞内药物释放。由于ADC可以设计为将“有效负载”(如细胞毒性药物)递送到细胞靶标，通过试剂进行的靶细胞调控(例如靶细胞杀伤)的效率在ADC的背景中与单独的相应抗体或药物相比可能大得多。
出于许多原因，包括抗体药物缀合物制备中的产物同质性的愿望，提供在抗体中的选择位点上缀合药物有效负载的ADC是感兴趣的。为此，一些小组已经利用抗体内的特定位点上的氨基酸取代以试图在维持抗体结构和功能的情况下促进位点特异性有效负载附着。例如，Shen等已经系统性检查抗体重链和轻链内的各个位置上的半胱氨酸取代以揭示位点选择对缀合物稳定性的影响(例如Nat.Biotech.,30:184-189,2012)。值得注意地，这些研究已经揭示了抗体上的附着位点的溶剂可达性可以负面影响所得的ADC的稳定性。
此外，负面影响抗体稳定性(包括轻链与重链联合)的修饰可损害抗体对抗原的亲和力及ADC稳定性，从而提高毒性，降低特异性并且减少效用。定位或创建适合于在不显著损害抗体亲和力或所得ADC的稳定性的情况下以位点特异性方式附着有效负载的位点是高度期望的。
还已经利用抗体的抗原特异性提供掺入标记剂并且识别表位和/或细胞的诊断和成像工具，其告知诊断或预后确定和治疗过程。此类诊断和预后工具依赖于用于抗原检测的工具抗体的亲和力，并且依赖于通过工具抗体保留标记剂以特异性发信号。因而，与ADC一样，定位或创建适合于在不显著损害抗体亲和力或所得缀合物的稳定性的情况下以位点特异性方式附着标记物的位点是高度期望的。
概述
本公开提供了包含C端氨基酸延伸的抗体轻链多肽，以及含有此类经修饰的轻链多肽的抗体和抗体缀合物，其中C端延伸包含一个或多个半胱氨酸残基。还提供了缀合物，其包含经由C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基与试剂缀合的本公开的抗体。本公开进一步提供了编码包含C端氨基酸延伸的抗体轻链多肽的核酸，所述C端氨基酸延伸包含半胱氨酸残基。还提供了包含本公开的抗体或缀合物的药物组合物，也提供了制备和使用本公开的抗体和缀合物的方法。
在某些方面中，本公开提供了包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。
在一些实施方案中，本公开提供了包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，其中C端氨基酸延伸不特异性结合抗原(例如延伸不包含抗体的抗原结合部分或抗体片段的抗原结合部分)。
在某些方面中，本公开提供了包含至少一个单表位抗原结合二聚体的抗体，其中单表位抗原结合二聚体包含重链多肽和包含C端氨基酸延伸的轻链多肽，该延伸包含半胱氨酸残基。两个单表位二聚体的每个可以结合相同表位。在其它方面中，两个单表位二聚体的每个结合不同表位。
根据某些实施方案，上文概述的抗体中任一种的C端氨基酸延伸包含氨基酸间隔区，所述氨基酸间隔区不包含半胱氨酸残基。在某些方面中，间隔区是1至30个氨基酸、3至20个氨基酸或4至17个氨基酸。在某些实施方案中，间隔区包含甘氨酸(G)残基和丝氨酸(S)残基。例如，间隔区可以由一个或多个甘氨酸(G)残基和一个或多个丝氨酸(S)残基组成。任选地，此种间隔区具有序列GGGS。在某些实施方案中，延伸包含内源人氨基酸序列或经修饰的人氨基酸序列。这些可以包括人抗体铰链区序列、T细胞受体序列或其它人序列。在某些方面中，延伸可以包含胞外蛋白质氨基酸序列和/或存在于细胞表面上的蛋白质的胞外结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，延伸包含内源人氨基酸序列，所述内源人氨基酸序列包含一个或多个天然存在的半胱氨酸残基。这些可以包括人抗体铰链区序列、T细胞受体序列或其它含有半胱氨酸的人蛋白质序列。在某些方面中，延伸可以包含胞外蛋白质氨基酸序列和/或存在于细胞表面上的蛋白质的胞外结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，延伸包含经修饰的人氨基酸序列，其中已经通过插入或取代对内源人氨基酸序列引入一个或多个半胱氨酸。
本公开的抗体的C端氨基酸延伸可以包含超过一个间隔区。例如，C端氨基酸延伸可以包含2至10个间隔区。间隔区可以具有相同的氨基酸序列。在其它方面中，间隔区中至少两个的氨基酸是不同的。根据某些实施方案，半胱氨酸存在于间隔区的每个之间。或者，间隔区的至少两个可以是连续的，例如C端氨基酸延伸中的间隔区的至少两个在间隔区间不包含任何氨基酸(例如任何半胱氨酸)。在一个实施方案中，C端氨基酸延伸以半胱氨酸终止。
在某些方面中，本公开的抗体的C端氨基酸延伸内的半胱氨酸包含被还原的巯基基团。根据某些实施方案，抗体包含与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合的试剂。在一个实施方案中，试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基直接缀合。在一个实施方案中，试剂经由接头与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基间接缀合。在一个实施方案中，相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基，试剂优先与轻链的C端氨基酸延伸的半胱氨酸缀合。在一个实施方案中，试剂仅经由抗体轻链的C端氨基酸延伸的半胱氨酸与抗体缀合。在某些方面中，试剂是治疗剂(例如细胞毒剂)或标记剂(例如体内成像剂)。根据某些实施方案，C端氨基酸延伸包含两个或更多个各自与试剂缀合的半胱氨酸，所述试剂独立选自治疗剂和标记剂。
在一个实施方案中，两种或更多种试剂独立地与C端氨基酸延伸的两个或更多个半胱氨酸残基直接或间隔缀合。在一个实施方案中，相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基，试剂优先与轻链的C端氨基酸延伸的半胱氨酸缀合。在一个实施方案中，试剂仅经由抗体轻链的C端氨基酸延伸的半胱氨酸与抗体缀合。
本公开的抗体可以是抗体或其结合片段。例如，抗体可以是IgG、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、ScFv、双特异性抗体，等等。
本公开还提供了缀合物。根据一些实施方案，缀合物包含含有轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。
在某些方面中，缀合物包含含有轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，其中C端氨基酸延伸不特异性结合抗原(例如，延伸不包含抗体的抗原结合部分或抗体片段的抗原结合部分)。
在一些实施方案中，缀合物包含含有至少一个单表位抗原结合二聚体的抗体，其中单表位抗原结合二聚体包含重链多肽和包含C端氨基酸延伸的轻链多肽，该延伸包含半胱氨酸残基。此类缀合物的抗体可以包含两个单表位抗原结合二聚体。两个单表位二聚体的每个可以结合相同的表位。在其它方面中，两个单表位二聚体的每个结合不同的表位。
缀合物进一步包含经由C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基与抗体缀合的试剂。本公开的缀合物的抗体和试剂可以具有上文概述或下文的具体实施方式和实施例部分中描述的任何抗体和试剂特征，并且可以使用本文中描述的缀合策略或提供相同缀合结果的任何其它合适的策略缀合。
本公开的方面包括编码本公开的抗体的全部或部分的核酸。例如，提供了编码抗体轻链多肽的核酸，所述抗体轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。C端氨基酸延伸可以包含上文就本公开的抗体而言概述，并且如下文的具体实施方式和实施例部分中描述的任何特征。还提供了包含此类核酸的载体，和包含本公开的核酸和载体的宿主细胞(例如原核或真核宿主细胞)。
在某些方面中，本公开提供了药物组合物。根据某些实施方案，药物组合物包含上文就本公开的抗体和缀合物而言概述，并且如下文的具体实施方式和实施例部分中描述的任何抗体或缀合物。还提供了方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的上文就本公开的抗体和缀合物而言概述，并且如下文的具体实施方式和实施例部分中描述的任何药物组合物、抗体或缀合物。
还提供了制备抗体的轻链的方法。此类方法包括在宿主细胞中表达编码抗体轻链多肽的核酸，所述抗体轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。在某些方面中，方法进一步包括还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。在一个实施方案中，所述方法包括比C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基还原优先(或“有偏”)还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。在一个实施方案中，方法包括相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基的还原，仅还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。
在某些方面中，C端氨基酸延伸包含两个或更多个半胱氨酸残基。在某些方面中，方法进一步包括还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。在一个实施方案中，方法包括比C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基还原优先(或“有偏”)还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。在一个实施方案中，方法包括相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基的还原，仅还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团。
本公开的方法包括制备抗体缀合物的方法。方法包括缀合试剂与包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，其中试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合。制备抗体缀合物的方法可以进一步包括在缀合试剂与抗体前还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸的巯基基团。在某些方面中，缀合包括使用马来酰亚胺反应化学、卤代乙酰基反应化学、乙烯基砜反应化学或吡啶基二硫化物反应化学交联试剂与被还原的巯基基团。根据某些方面，与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合的试剂是治疗剂或标记剂。在一个实施方案中，相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基，试剂优先与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合。在一个实施方案中，试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基而不与C端氨基酸延伸外部的任何半胱氨酸残基缀合。
在某些方面中，C端氨基酸延伸包含两个或更多个半胱氨酸残基，并且两种或更多种试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合。制备此类抗体缀合物的方法可以进一步包括在缀合试剂与抗体前还原C端氨基酸延伸中的半胱氨酸的巯基基团。在某些方面中，缀合包括使用马来酰亚胺反应化学、卤代乙酰基反应化学、乙烯基砜反应化学或吡啶基二硫化物反应化学交联试剂与被还原的巯基基团。根据某些方面，与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合的试剂是治疗剂和/或标记剂。在一个实施方案中，相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基，试剂优先与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基缀合。在一个实施方案中，试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基而不与C端氨基酸延伸外部的任何半胱氨酸残基缀合。
附图简述
图1是抗体的示意图，所述抗体包含根据本公开的一个实施方案的C链轻链延伸。
图2是根据本公开的一个实施方案的缀合物的示意图。
图3提供了根据本公开的实施方案的两种示例抗体缀合物的癌细胞存活力数据。
图4，小图A和B显示了根据本公开的某些实施方案的未缀合抗体的抗体结合数据。
图5，小图A和B显示了根据本公开的某些实施方案的抗体-药物缀合物的抗体结合数据。
图6显示了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体的差示扫描量热法(DSC)数据。
图7是凝胶图像，其显示了根据本公开的一个实施方案的Alexa488与抗体的缀合。
图8显示了小鼠中随时间的体内肿瘤体积变化，所述小鼠施用了根据本公开的某些方面的抗体或抗体缀合物。
图9，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-VLcys1)的大小排阻层析-质谱术(SEC-MS)数据。
图10，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-VLcys2)的SEC-MS数据。
图11，小图A和B提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-VLcys4)的SEC-MS数据。
图12，小图A和B提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP2)的SEC-MS数据。
图13，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP3)的SEC-MS数据。
图14，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP4)的SEC-MS数据。
图15，小图A和B提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP5)的SEC-MS数据。
图16，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP6)的SEC-MS数据。
图17，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP7)的SEC-MS数据。
图18，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP10)的SEC-MS数据。
图19，小图A-C提供了根据本公开的一个实施方案的具有C端轻链延伸的抗体(T-SP11)的SEC-MS数据。
图20显示了Tsp2-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.92。
图21显示了Tsp3-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.12。
图22显示了Tsp4-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.16。
图23显示了Tsp5-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.46。
图24显示了Tsp6-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是0.98。
图25显示了Tsp9-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.64。
图26显示了Tsp10-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是2.0。
图27显示了Tsp11-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是2.66。
图28显示了TVLCys1-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是2.66。
图29显示了TVLCys2-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是0.22。
图30显示了TVLCys4-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是0.70。
图31显示了Tsp10-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是2.12。
图32显示了Tsp10-毒素4的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是3.76，其中平均附着是1.88。
图33显示了Tsp10-毒素1的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是1.94。
图34显示了Tsp4-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是2.46。
图35显示了Tsp6-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱(较大的标度)。平均药物负载值是1.82。
图36显示了T-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是0.16。
图37显示了Bsp10-MCvcPABC-MMAE的缀合反应产物的HIC层析谱，其中“B”是布妥昔单抗抗CD30抗体的缩写。平均药物负载值是2.12。
图38显示了Bsp10-毒素4的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.96。
图39显示了Bsp10-毒素5的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是2.18。
图40显示了Bsp10-毒素3的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.98。
图41显示了Bsp10-毒素6的缀合反应产物的HIC层析谱。平均药物负载值是1.87。
图42显示了用Her2表达性HCC1954细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述Her2表达性HCC1954细胞用Tsp4-毒素3、Tsp3-毒素3、Tsp2-毒素3和游离的毒素1处理。
图43显示了用Her2表达性HCC1954细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述Her2表达性HCC1954细胞用Tsp5-毒素3、Tsp6-毒素3、Tsp9-毒素3和游离的毒素1处理。
图44显示了用Her2表达性HCC1954细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述Her2表达性HCC1954细胞用Tsp10-毒素3、Tsp11-毒素3、TVLCys1-毒素3和游离的毒素l处理。
图45显示了用HER2抗原阴性Jurkat细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阴性Jurkat细胞用Tsp4-毒素3、Tsp3-毒素3、Tsp2-毒素3和游离的毒素l处理。
图46显示了用HER2抗原阴性Jurkat细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阴性Jurkat细胞用Tsp5-毒素3、Tsp6-毒素3、Tsp9-毒素3和游离的毒素l处理。
图47显示了用HER2抗原阳性HCC1954细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阳性HCC1954细胞用Tsp10-毒素3、Tsp11-毒素3、TVLCys1-毒素3和游离的毒素1处理。
图48显示了用HER2抗原阴性Jurkat细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阴性Jurkat细胞用Tsp10-毒素3、Tsp11-毒素3、TVLCys1-毒素3和游离的毒素l处理。
图49显示了用HER2抗原阳性N87细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阳性N87细胞用Tsp10-毒素3、Tsp11-毒素3和TVLCys1-毒素3处理。
图50显示了用HER2抗原阳性N87细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阳性N87细胞用Tsp10-毒素l和Tsp10-毒素4处理。
图51显示了用HER2抗原阴性Jurkat细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阴性Jurkat细胞用Tsp10-毒素1和Tsp10-毒素4处理。
图52显示了用HER2抗原阳性N87细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阳性N87细胞用Tsp5-毒素3、Tsp6-毒素3和Tsp9-毒素3处理。
图53显示了用HER2抗原阳性N87细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述HER2抗原阳性N87细胞用Tsp2-毒素3、Tsp3-毒素3和Tsp4-毒素3处理。
图54显示了用CD30抗原阳性Karpas 299细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述CD30抗原阳性Karpas 299细胞用布妥昔单抗和Bsp10处理。
图55显示了用CD30抗原阳性Karpas 299细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述CD30抗原阳性Karpas 299细胞用Bsp10-毒素5处理。
图56显示了用CD30抗原阳性Karpas 299细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述CD30抗原阳性Karpas 299细胞用Bsp10-毒素3和Bsp10-毒素4处理。
图57显示了用CD30抗原阳性Karpas 299细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述CD30抗原阳性Karpas 299细胞用Bsp10-毒素6处理。
图58显示了用CD30抗原阳性Karpas 299细胞得到的体外细胞增殖测定法结果的图，所述CD30抗原阳性Karpas 299细胞用Bsp10-MCvcPABC-MMAE处理。
图59是凝胶图像，其显示了在固定的蛋白A上纯化后的曲妥珠单抗(trastuzumab)轻链延伸变体的非还原性变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)。左到右，1-12泳道：分子大小标志物；TSp2；TSp3；TSp4；TSp5；TSp6；TSp9；Tsp10；TSp11；TVLCys1；TVLCys2；TVLCys4。第1泳道中的大小标志物梯指示完整的蛋白质是约150kDa。
图60是凝胶图像，其显示了曲妥珠单抗轻链延伸变体的还原性(+DTT)变性PAGE。左到右，第1-12泳道：分子大小标志物；TSp2；TSp3；TSp4；TSp5；TSp6；TSp9；Tsp10；TSp11；TVLCys1；TVLCys2；TVLCys4。第1泳道中的大小标志物梯指示被还原的蛋白质含有约50kDa的重链片段，和约25kDa的轻链片段。
图61是凝胶图像，其显示了曲妥珠单抗轻链延伸抗体药物缀合物的非还原性变性PAGE。左到右，第1-12泳道：分子大小标志物；Tsp2-毒素3(DAR 1.92)；Tsp3-毒素3(DAR1.88)；Tsp4-毒素3(DAR 2.06)；Tsp5-毒素3(DAR 1.46)；Tsp6-毒素3(DAR 1.80)；Tsp9-毒素3(DAR 1.32)；Tsp10-毒素3(DAR 2.12)；Tsp10-毒素4(DAR 1.66)；Tsp10-毒素1(DAR2.04)；Tsp11-毒素3(DAR 2.02)；TVLCys1-毒素3(DAR 1.06)。
图62是凝胶图像，其显示了曲妥珠单抗轻链延伸抗体药物缀合物的还原性(+DTT)变性PAGE。左到右，第1-12泳道：分子大小标志物；Tsp2-毒素3(DAR 1.92)；Tsp3-毒素3(DAR1.88)；Tsp4-毒素3(DAR 2.06)；Tsp5-毒素3(DAR 1.46)；Tsp6-毒素3(DAR 1.80)；Tsp9-毒素3(DAR 1.32)；Tsp10-毒素3(DAR 2.12)；Tsp10-MP-毒素4(DAR 1.66)；Tsp10-毒素1(DAR2.04)；Tsp11-毒素3(DAR 2.02)；TVLCys1-毒素3(DAR 1.06)。
图63提供了如使用热稳定性测定法测定的曲妥珠单抗轻链延伸抗体药物缀合物的稳定性数据。
详述
评估抗体轻链间的结构差异及其对抗体稳定性的影响的研究人员已经预测了对抗体轻链的C端的氨基酸添加将具有去稳定(destabilize)效应(Shen等,mAbs 5:3,418-431,2013)。实际上，其他人已经报告了连接scFv和单结构域蛋白质支架与IgG轻链的C端以产生多特异性抗体使轻链-重链二硫化物不稳定，导致部分装配的IgG融合分子的增加(Orcutt等,Prot.Eng.Des.Sel,23:221-228,2010；Spangler等,J Mol Biol,422:532-544,2012)。另外，已经报告了有效负载附着的位点的溶剂可达性可以负面影响ADC稳定性(Shen等,Nat.Biotech.,30:184-189,2012)。与这些报告相反，本发明部分从下述令人惊讶的发现得到：与抗体轻链的C端共价连接的作为其延伸的C端氨基酸延伸(在本文中又称为“有效负载衔接头”)可以为有效负载提供稳定的附着点，产生稳定并保留对抗原的亲和力的抗体有效负载缀合物。
因而，本公开提供了包含C端氨基酸延伸的抗体轻链多肽以及含有此类经修饰的轻链多肽的抗体和抗体缀合物，其中C端延伸包含一个或多个半胱氨酸残基。还提供了缀合物，其包含经由C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基与试剂缀合的本公开的抗体。本公开进一步提供了编码抗体轻链多肽的核酸，所述抗体轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。还提供了包含本公开的抗体或缀合物的药物组合物，也提供了制备和使用本公开的经修饰的抗体和缀合物的方法。
在更为详细描述本公开的抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法前，应当理解本公开的此类方面不限于描述的具体实施方案，因为它们当然可以有所变化。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图为限制性的，因为本公开的抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法的范围仅将以所附权利要求书为限。
如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值(直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指出)以及该所述范围内的任何其它所述值或居间值均涵盖在抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法内。这些较小范围的上限和下限可以独立包含在该较小范围中，并且也涵盖在抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法内，服从陈述的范围中的任何明确排除的限度。在陈述的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度的任一或两者的范围也包括在抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法中。
本文使用前面带有术语“约”的数值来提供某些范围。在本文中，将术语“约”用于提供对其后的精确数字以及接近或靠近该术语之后的数字的数字的字面支持。在确定数字是否接近或靠近具体列举的数字时，接近或靠近未列举的数字可以是在其所处背景中提供与具体列举的数字基本上等同效果的数字。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义具有相同含义。虽然与本文中描述的那些抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法相似或等同的任何抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法也可以用于实施或测试抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法，但是现在描述了代表性的示例性抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法。
本说明书中引用的所用出版物和专利以引用方式并入本文中就像具体和单独地指明每一出版物或专利以引用方式并入一样，并且以引用方式并入本文中以结合所引用的出版物公开和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用仅是为了揭示在本申请的提交日之前的背景技术，这些背景技术不应解释为承认在先发明揭示了本发明的方法。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。
应当注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。例如，如本文中使用，“包含半胱氨酸”或描述为“包含半胱氨酸”的C端氨基酸延伸可以含有多个半胱氨酸残基(即，延伸包含至少一个半胱氨酸)。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为在结合权利要求要素的详述使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语时或使用“负”限制时的前置基础。
应当理解，抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法的某些特征(为了清楚，它们可以在分开的实施方案的背景中描述)也可以在单一实施方案中组合提供。相反，抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法的各个特征(为了简要，它们可以在单一实施方案的背景中描述)也可以分开或以任何合适的子组合提供。实施方案的所有组合由本发明具体包括，并且在本文中就像每种组合单独和明确地公开一样以此类组合包括可操作的抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法的程度公开。另外，在描述此类变量的实施方案中列举的所有子组合也由本抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法包括，并且在本文中就像每种此类子组合单独和明确地在本文中公开一样公开。
在阅读本公开后对本领域的技术人员将显而易见的是，本文所述和所示的各个实施方案的每一个具有分立的组件和功能，它们可在不脱离本发明的抗体、缀合物、核酸、药物组合物和方法的范围或精神的情况下与其它若干实施方案任一个的特征相分离或相组合。任何列举的方法均可按列举的事件顺序或按任何其它在逻辑上可行的顺序执行。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、全抗体(例如由四聚体构成的抗体，所述四聚体继而由重链和轻链多肽的两个异二聚体构成，包括全IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体)；半抗体(例如包含重链和轻链多肽的单个二聚体的抗体)；保留对感兴趣的抗原的特异性结合的抗体片段(例如全抗体的片段，如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体的片段)，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv、双特异性抗体和双抗体(diabody)；嵌合抗体；单克隆抗体；人源化抗体(例如人源化单克隆抗体，或人源化抗体片段)；或完全人抗体(仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体)。还包括拥有体细胞突变和/或由于V-D-J重排所致的N或P核苷酸添加和缺失的人单克隆抗体。还包括已经将合成序列插入CDR中的人抗体(见例如Miersch S&Sidhu SS(2012)Synthetic antibodies:concepts,potential andpractical considerations.Methods 57(4):486-98；及Knappik等(2000)Fully synthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based onmodular consensus frameworks and CDRs randomized withtrinucleotides.J.Mol.Biol.296(1):57-86)。在某些方面中，本公开的抗体选自IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)、Fab、F(ab’)2和Fab’。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个各自具有单一抗原结合位点的称作“Fab”片段的相同抗原结合片段和残留的“Fc”片段(反映容易结晶的能力的名称)。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”包含含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小限度抗体片段。此区域由紧密、非共价联合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体构成。正是在此构造中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管以比整个结合位点低的亲和力。
“Fab”片段也含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的差异在于在重链CH1结构域的羧基端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中的恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初以Fab’片段对产生，所述Fab’片段对具有它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成对于抗原结合期望的结构。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含同一多肽链(VH-VL)中的与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而无法使同一链上的两个结构域配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
如本文中使用，“轻链多肽”指至少具有抗体轻链可变区(VL)的多肽。轻链多肽可以包含部分或全长抗体轻链恒定区(CL)。“全长轻链多肽”包括全长轻链可变区(VL)和全长轻链恒定区(CL)。轻链多肽可以来自任何脊椎动物物种(例如哺乳动物，例如人、啮齿类，等等)。
如本文中使用，“重链多肽”或“重链”指至少具有抗体重链可变区(VH)的多肽。重链多肽可以包含部分或全长抗体重链恒定区(CH)，其包含CH1、CH2和CH3结构域。“全长重链多肽”包括全长重链可变区(VL)和全长重链恒定区(CH)。涵盖来自任何脊椎动物物种(例如哺乳动物，例如啮齿类、人，等等)和任何免疫球蛋白类别的抗体(免疫球蛋白)的重链多肽。基于重链多肽的恒定结构域的氨基酸序列，重链多肽和含有此类重链多肽的抗体分类成类。免疫球蛋白有五种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
如本文中使用，术语“重组”抗体意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有抗体，如(i)使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；(ii)从重组组合抗体文库分离的抗体；(iii)从对于人免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体；或(iv)通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段，包括例如体外翻译技术(参见例如Yin等(2012)Aglycosylated antibodies and antibodyfragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system,Landes Bioscience,第4卷,第2期)制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组抗体包括人源化的、CDR移植的、嵌合的、去免疫的(deimmunized)和体外产生的抗体；并且可以任选包含从人种系免疫球蛋白序列衍生的恒定区。
术语“人源化抗体”指含有从非人免疫球蛋白衍生的最小限度序列的免疫球蛋白、半抗体、免疫球蛋白链(例如轻链多肽)或其片段(如Fv、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体可以是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、美洲驼(lama)、骆驼或兔的CDR的残基替换。在一些情况中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含既不存在于接受抗体中又不在输入CDR或框架序列中的残基。
人轻链多肽通常分类为κ和λ轻链。此外，人重链多肽通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含多约10个氨基酸的“D”区。
“治疗/处理”意指减轻或消除疾病或病症和/或其伴随症状中的至少一种。如本文中使用，为了“减轻”疾病或病症意味着降低疾病或病症的症状的严重性和/或发生频率。应当理解，在本文中提到“治疗/处理”包括提到治愈性、姑息性和预防性治疗/处理。
“治疗有效量”或“有效量”意指与对照相比足以产生期望的结果的剂量，例如足以实现有益或期望的治疗(包括预防)结果，如疾病(例如癌症或感兴趣的任何其它疾病)的症状减轻的量。“治疗有效量”会随抗体或缀合物、疾病及其严重性、待治疗的患者的年龄、重量等而变化。
具有C端延伸(“有效负载衔接头”)的轻链多肽
在一个方面中，本公开提供了用于将有效负载附着于抗体的有效负载衔接头(在本文中又称为“C端氨基酸延伸”或“C端延伸”)，及包含此类有效负载衔接头的抗体。
本公开的有效负载衔接头是充当用于共价附着有效负载的基底的蛋白质模块，每个有效负载衔接头构成抗体轻链的C端延伸，并且由此将一个或多个有效负载与抗体连接。有效负载衔接头包含至少一个用于有效负载附着的半胱氨酸残基。
本公开的有效负载衔接头能够以抗体轻链的C端延伸表达，并且能够通过使用合适的化学与极其多种有效负载共价缀合，使得包含有效负载和有效负载衔接头的抗体展现出稳定性，并且保留对抗原的亲和力。
在一个实施方案中，包含本公开的有效负载衔接头的抗体在其天然抗体序列内不包含半胱氨酸取代，其可以在其它情况中引入以提供容纳多肽对轻链的C端末端的添加的补偿性二硫键。因此，在一个实施方案中，包含本公开的有效负载衔接头的抗体含有存在于亲本抗体中的所有半胱氨酸残基。在一个实施方案中，有效负载衔接头包含多个半胱氨酸残基，其不形成分子内二硫键或与另一个有效负载衔接头形成二硫键。
在一个实施方案中，有效负载衔接头不特异性结合抗原。在一个实施方案中，有效负载衔接头不将表位结合活性贡献给本发明的抗体或抗体缀合物。在此实施方案中，本公开的抗体和抗体缀合物的抗原结合由除了有效负载衔接头外的元件决定。在一个实施方案中，有效负载衔接头不含生长因子受体(如EGF受体)的配体结合结构域。在另一个实施方案中，有效负载衔接头不含生长因子受体的配体(例如不含EGF受体的配体)。
更具体地，如上文概述，本公开提供了具有C端延伸的轻链多肽和具有此类经修饰的轻链多肽中的至少一种的抗体，所述C端延伸具有一个或多个半胱氨酸残基。具有C端延伸的轻链多肽可以含有任何类型(例如拉姆达(λ)或卡帕(κ)轻链多肽)的轻链多肽的氨基酸序列，并且可以含有感兴趣的任何起源，例如任何脊椎动物物种(例如哺乳动物，例如啮齿类、人，等等)的轻链多肽的氨基酸序列。
术语“C端轻链多肽延伸”、“C端轻链氨基酸延伸”、“C端延伸”、“有效负载衔接头”及其等同物在本文中用于指位于轻链多肽残基的C端的一个氨基酸(例如半胱氨酸)或两个或更多个氨基酸的连续区段，所述残基在其它情况下会构成缺乏延伸的亲本轻链多肽中的C端残基。
在某些方面中，亲本轻链多肽仅包含轻链可变区(VL)(例如，亲本抗体可以是ScFv)，使得延伸在残基的C端(例如，从该残基延伸)，所述残基在其它情况中会构成亲本轻链多肽中的VL的C端。在其它方面中，亲本轻链多肽包含轻链可变区(VL)和部分轻链恒定区(CL)，使得延伸在残基的C端(例如，从该残基延伸)，所述残基在其它情况下会构成亲本轻链多肽中的部分CL中的C端。
根据某些实施方案，亲本轻链多肽是全长轻链多肽，其包含全长轻链可变区(VL)和全长轻链恒定区(CL)，使得延伸在残基的C端(例如，从该残基延伸)，所述残基在其它情况下会构成亲本轻链多肽中的全长CL的C端。根据一个实施方案，延伸的N端部分至少包含序列的部分，该部分在其它情况下会存在于全长亲本轻链多肽中，使得延伸亲本轻链多肽的C端包括“加回”亲本序列作为“延伸”的一部分。
根据一些实施方案，亲本轻链多肽包含通常存在于全长野生型轻链多肽的C端的末端半胱氨酸的缺失，使得轻链延伸在残基的C端(例如从残基延伸)，所述残基直接在缺失C端半胱氨酸的位置的N端。在一个实施方案中，亲本轻链多肽包含通常存在于全长野生型轻链多肽的C端的末端半胱氨酸的取代。
在某些方面中，亲本抗体具有截短的重链多肽，例如仅包含重链可变区(VH)的重链多肽，或包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)的一部分的重链多肽。根据这些方面，C端轻链多肽延伸可以包含与重链多肽序列未配对的天然(例如野生型)轻链多肽序列(由于截短所致)。根据一个实施方案，此种C端轻链多肽延伸可以进一步包含一个或多个非天然的氨基酸(例如一个或多个不存在于亲本轻链多肽中的半胱氨酸)，其在某些方面中可以是两个或更多个氨基酸的非天然序列。
在某些方面中，本公开提供了包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。
在一些实施方案中，本公开提供了包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，该C端氨基酸延伸不特异性结合抗原(例如，延伸不包含抗体的抗原结合部分或抗体片段的抗原结合部分)。
在某些方面中，本公开提供了包含至少一个单表位抗原结合二聚体的抗体，其中单表位抗原结合二聚体包含重链多肽和包含C端氨基酸延伸的轻链多肽，该延伸包含半胱氨酸残基。两个单表位二聚体的每个可以结合相同的表位。在其它方面中，两个单表位二聚体的每个结合不同的表位。
如本文中使用，“单表位抗原结合结构域”指示由重链多肽的CDR和轻链多肽的CDR的相互作用形成的抗原结合结构域。“单表位抗原结合结构域”可以由例如包含重链多肽和轻链多肽的二聚体，或者在单链抗体(ScFv)的情况下包含重链多肽和轻链多肽的单体融合蛋白限定。因此，在包含轻链C端氨基酸延伸的单表位抗原结合结构域中，轻链多肽的氨基酸延伸不特异性结合抗原。本公开的抗体包括包含相同或不同单表位抗原结合二聚体的抗体。例如，包含异二聚体的二聚体(即四聚体)的抗体可以包含：1)包含重链多肽和轻链多肽的第一单表位抗原结合结构域，和包含重链多肽和轻链多肽的第二单表位抗原结合结构域，其中轻链多肽中的一个或两者包含C端氨基酸延伸，并且其中第一和第二单表位抗原结合结构域结合相同表位；或2)第一和第二单表位抗原结合结构域，其中该结构域的轻链多肽中的一个或两者包含C端氨基酸延伸，其中第一单表位抗原结合结构域的抗原结合区结合与由第二单表位抗原结合结构域结合的表位不同的表位。
C端延伸可以是任何期望的长度。根据某些实施方案，延伸是1至200个氨基酸、1至150个氨基酸、1至100个氨基酸、1至75个氨基酸、1至50个氨基酸、1至25个氨基酸、1至20个氨基酸、1至15个氨基酸、1至10个氨基酸或1至5个氨基酸的长度，并且可以是5至200个氨基酸、5至150个氨基酸、5至100个氨基酸、5至75个氨基酸、5至50个氨基酸、5至25个氨基酸、5至20个氨基酸、5至15个氨基酸或5至10个氨基酸的长度。在某些方面中，延伸是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的长度。
C端延伸可以含有任何期望数目的半胱氨酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个半胱氨酸。在一些实施方案中，C端延伸含有至少2、3、4、5或更多个半胱氨酸。在一些实施方案中，C端延伸含有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个半胱氨酸。在某些方面中，延伸包含1至5个半胱氨酸、6至10个半胱氨酸、11至15个半胱氨酸或16至20个半胱氨酸。
根据某些实施方案，C端延伸包含两个或更多个连续半胱氨酸。例如，延伸可以包含两个相邻半胱氨酸，在两个相邻半胱氨酸的N端和C端具有含有不含半胱氨酸的间隔区序列。例如，在C端延伸中具有连续的半胱氨酸(例如两个相邻半胱氨酸)当缀合或标记策略包括金属螯合时，当缀合或标记策略牵涉“桥接”时(例如，某些二卤代马来酰亚胺化学等就是如此)使用。因而，在某些方面中，本公开提供了缀合物和制备缀合物的方法，其中将试剂(例如，药物或标记剂)直接或经由一个或多个接头附着于多个连续的半胱氨酸(例如，2个相邻的半胱氨酸)。
在一个实施方案中，C端延伸包含N端半胱氨酸，所述N端半胱氨酸当与亲本多肽末端半胱氨酸一起采用时提供得到如上文所述的应用的两个连续的半胱氨酸。
在某些方面中，本公开提供了缀合物和制备缀合物的方法，其中将试剂(例如，药物或标记剂)直接或经由一个或多个接头附着于多个非连续的半胱氨酸。
在一些实施方案中，C端延伸的半胱氨酸以一个或多个间隔区分开，使得半胱氨酸不是C端延伸的连续残基。“间隔区”意指布置在延伸中的两个半胱氨酸残基之间；在其它情况下会构成轻链多肽或其含有轻链可变区的片段的C端残基的残基和轻链恒定区的至少一部分之间的一个或多个连续非半胱氨酸氨基酸；和/或任选地，布置在延伸中的最C端的半胱氨酸的C端的一个或多个连续非半胱氨酸氨基酸。可以在C端延伸中提供任何数目的间隔区。根据某些实施方案，C端延伸可以包含1至50个间隔区、1至40个间隔区、1至30个间隔区、1至20个间隔区、1至10个间隔区(例如，2至10个间隔区)或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个间隔区。
当C端延伸包含2个或更多个间隔区时，间隔区的每个可以具有相同的氨基酸序列。或者，当延伸包含2个或更多个间隔区时，间隔区中的至少两个的氨基酸序列可以是不同的。当延伸包含多个间隔区时，半胱氨酸可以存在于间隔区的每个之间。在其它方面中，当延伸包含多个间隔区时，间隔区的至少两个是连续的，例如，间隔区不以一个或多个半胱氨酸残基分开。
间隔区可以包含20种非半胱氨酸、天然存在的、遗传编码的氨基酸(丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和/或缬氨酸(V))、其变体(例如，由于翻译后修饰而产生的变体)、天然存在的非编码的或非天然的氨基酸中的任一种，并且可以是任何期望的序列和长度的。在某些方面中，间隔区包含1至30个氨基酸，如3至20个氨基酸、3至15个氨基酸、3至10个氨基酸、3至5个氨基酸，并且可以是例如，4至17个氨基酸。例如，间隔区可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多个氨基酸，并且在一些情况中可以含有不超过30或超过25个氨基酸，可以是任何期望的氨基酸序列的，条件是间隔区不包含半胱氨酸残基。
在某些方面中，间隔区包含至少一个甘氨酸(G)残基和至少一个丝氨酸(S)残基。例如，间隔区可以含有一个或多个甘氨酸残基和一个或多个丝氨酸残基。
感兴趣的间隔区的例子是具有序列GGGS(SEQ ID NO:1)的间隔区。在其它方面中，间隔区可以包含下列氨基酸序列的任一项或由下列氨基酸序列的任一项组成：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:2)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:3)；AKTTPKLGG(SEQ IDNO:4)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:5)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:6)；SAKTTP(SEQ IDNO:7)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:8)；RADAAP(SEQ ID NO:9)；RADAAPTVS(SEQ ID NO:10)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO:11)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO:12),SAKTTP(SEQ ID NO:13)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO:14)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:15)；ADAAP(SEQ ID NO:16)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO:17)；TVAAP(SEQ ID NO:18)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO:19)；QPKAAP(SEQ ID NO:20)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO:21)；AKTTPP(SEQ ID NO:22)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO:23)；AKTTAP(SEQ ID NO:24)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO:25)；ASTKGP(SEQ ID NO:26)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:27)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:28)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO:29)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO:30)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO:31)；AA；GGGGS(SEQ ID NO:128)；GGGGSSGGGGSS；(SEQ IDNO:131)；或其包含1、2、3、4或5个氨基酸取代的变体。
在某些方面中，轻链多肽的C端延伸包含具有内源人氨基酸序列或经修饰的人氨基酸序列。这些可以包含人抗体铰链区序列、T细胞受体序列或感兴趣的任何其它人蛋白质序列。可以采用的另外的氨基酸序列包括但不限于胞外蛋白质氨基酸序列，及存在于细胞表面上的蛋白质的胞外结构域的序列。在一个实施方案中，延伸包含内源人氨基酸序列，所述内源人氨基酸序列包含一个或多个天然存在的半胱氨酸残基。当此类天然的人序列包含一个或多个半胱氨酸残基时，在缺乏序列修饰的情况下，在半胱氨酸残基的N端和C端的不含半胱氨酸的氨基酸序列构成C端延伸的间隔区序列。在一个实施方案中，延伸包含经修饰的人氨基酸序列，其中已经通过插入或取代对内源人氨基酸序列引入一个或多个半胱氨酸。在此类序列的背景中也可以取代或缺失天然存在的半胱氨酸残基。
根据某些实施方案，当C端延伸包含内源人氨基酸序列或经修饰的人氨基酸序列时，与缺乏人氨基酸序列或经修饰的人氨基酸序列的相应的延伸相比，在对患者施用时的抗体(或其缀合物)的免疫原性降低。
优选的间隔区包含与野生型IgM、IgG、IgA、IgE或IgD抗体分子或T细胞受体的野生型序列，如铰链区的一部分，或其片段具有至少85％、90％、95％、98％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个方面中，“铰链”区指位于重链多肽，例如IgG、IgA或IgD抗体的重链多肽的CH1和CH2结构域之间的抗体的氨基酸序列(如在图1和2的实例中描绘)。本公开的构建体的铰链区可以在长度和氨基酸序列上有所变化。例如，人IgG1、IgG2和IgG4的铰链区的长度是12-15个氨基酸，而人IgG3具有62个氨基酸的铰链区。人IgD抗体分子具有64个氨基酸的铰链区。根据某些实施方案，当C端延伸包含铰链区序列或其序列变体时，与缺乏铰链区序列的相应的延伸相比，当对患者施用时的抗体(或其缀合物)的免疫原性降低，并且延伸的柔性相对于缺乏铰链区序列的延伸可以增加。
铰链区氨基酸序列(该序列的全部或其部分(例如至少2、3、4、5、6或更多个连续残基)可以包含在本公开的C端延伸中)的非限制性实例包括但不限于ESSCDVKLVEKSFET(SEQID NO:32)(T细胞受体α恒定)；DCGFTS(SEQ ID NO:33)(T细胞受体β恒定)；DVITMDPKDNCSKDAN(SEQ ID NO:34)(T细胞受体γ恒定)；DHVKPKETENTKQPSKSCHKPK(SEQ IDNO:35)(T细胞受体δ恒定)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:36)(IgCHG1)；ERKCCVECPPCP(SEQID NO:37)(IgCHG2)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:38)(IgCH3-H1)；EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO:39)(IgCH3-H2、IgCH3-H3和IgCH3-H4)；ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:40)(IgH4)；VPPPPP(SEQ ID NO:41)(IgA2)和ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID NO:42)。
从铰链区氨基酸序列(该序列的全部或其部分(例如，至少2、3、4、5、6或更多个连续残基)可以用作本公开的C端延伸中的间隔区)的非限制性实例包括但不限于ESS(SEQ IDNO:43)；DVKLVEKSFET(SEQ ID NO:44)；GFTS(SEQ ID NO:45)；DVITMDPKDN(SEQ ID NO:46)；SKDAN(SEQ ID NO:47)；DHVKPKETENTKQPSKS(SEQ ID NO:48)；HKPK(SEQ ID NO:49)；EPKS(SEQ ID NO:50)；DKTHT(SEQ ID NO:51)；ERK(SEQ ID NO:52)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO:53)；DTPPP(SEQ ID NO:54)；VE(SEQ ID NO:55)；PR(SEQ ID NO:56)；PP(SEQ ID NO:57)；PS(SEQ ID NO:58)；ESKYGPP(SEQ ID NO:59)；和DVKLV(SEQ ID NO:91)。
本公开的轻链多肽的C端延伸可以设计为包含一个或多个间隔区(或无间隔区)和一个或多个半胱氨酸残基的任何期望的组合。因此，本公开的一个方面提供了轻链多肽的C端的延伸，其具有一个或多个半胱氨酸(例如，彼此隔开或彼此不隔开；与亲本轻链多肽的C端隔开或不与亲本轻链多肽的C端隔开；和/或与轻链延伸的C端隔开或不与轻链延伸的C端隔开)，使得可以控制此种抗体的缀合产物中与此类半胱氨酸连接的试剂(例如细胞毒剂、标记剂和/或等等)的相应数目和间隔。
根据某些实施方案，C端延伸包含从N端至C端可以通过式I代表的氨基酸序列：
(XaCb)c(X’dCe)f (I)
其中
X和X’代表一个或多个氨基酸的间隔区，其中每个X和X’的氨基酸序列独立选自感兴趣的任何氨基酸序列，包括本文中提供的间隔区氨基酸序列的实例的任一种；
C代表半胱氨酸残基，
a、b、c、d、e和f是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数，其中b和e的总和是至少1，并且c和f的总和是至少1。X和X’可以是相同或不同的。在c大于1的情况下，则(XaCb)c的每个X在(XaCb)c的每个重复单元内可以是相同或不同的氨基酸序列。在d大于1的情况下，则(X’dCe)f的每个X’在(X’dCe)f的每个重复单元内可以是相同或不同的氨基酸序列。
本公开还提供了编码式I的C端延伸的核酸，以及编码包含式I的C端延伸的轻链多肽的核酸。
在某些实施方案中，从N端至C端可以通过上述式I代表C端延伸，其中b和e是独立选自0、1和2的整数，其中b和e的总和是至少1，并且a、c、d和f是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数，其中c和f的总和是至少1。
在某些实施方案中，从N端至C端可以通过上述式I代表C端延伸，其中b和e是独立选自0、1和2的整数，其中b和e的总和是至少2，并且a、c、d和f是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数，其中c和f的总和是至少1。
在某些实施方案中，从N端至C端可以通过上述式I代表C端延伸，其中b和e是独立选自0、1和2的整数，其中b和e的总和是至少1，a和d是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，并且c和f是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，其中c和f的总和是至少1。
在某些实施方案中，从N端至C端可以通过上述式I代表C端延伸，其中b和e是独立选自0、1和2的整数，其中b和e的总和是至少2，a和d是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，并且c和f是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，其中c和f的总和是至少1。
作为一个实例，参考式I，其中出于阐述目的，X是具有序列GGGS(SEQ ID NO:1)的间隔区；a、b和c各＝1；和f＝0，则C端延伸具有序列GGGSC(SEQ ID NO:60)(在本文中又称为“Cys1”)。图1中示意性显示了具有轻链多肽的抗体的实例，所述轻链多肽具有根据此实施方案的C端延伸。如显示，抗体100包含两个包含轻链可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域的轻链多肽，和从(CL)结构域中的每个的C端残基延伸的C端延伸102和104，其具有序列GGGSC。
在一个实施方案中，当X是GGGS(SEQ ID NO:1)，a是1，c是1，并且f是0。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是具有序列GGGS(SEQ IDNO:1)的间隔区；a和c各＝1，b＝2，和f＝0，则C端延伸具有序列GGGSCC(SEQ ID NO:61)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，其中a＝2，b＝1，c＝1，和f＝0，当每个间隔区序列相同时，C端延伸具有序列GGGSGGGSC(SEQ IDNO:62)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且其中a＝1，b＝1，c＝2，和f＝0，当每个间隔区序列相同时，C端延伸具有序列GGGSCGGGSC(SEQ ID NO:63)(在本文中又称为“Cys2”)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且其中a＝l，b＝l，c＝4，和f＝0，在每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列GGGSCGGGSCGGGSCGGGSC(SEQ ID NO:64)(在本文中又称为“Cys4”)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且其中a＝1，b＝1，c＝1，d＝3，e＝1，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列GGGSCGGGSGGGSGGGSC(SEQ ID NO:65)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且其中a＝2，b＝l，c＝l，d＝l，e＝l，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列GGGSGGGSCGGGSC(SEQ ID NO:66)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且其中a＝l，b＝l，c＝l，d＝2，e＝1，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列GGGSCGGGSGGGSC(SEQ ID NO:67)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是GGGS(SEQ ID NO:1)并且X’是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:2)，并且其中a＝1，b＝l，c＝l，d＝2，e＝1，和f＝1，延伸会具有序列GGGSCAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:89)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，c＝2并且X在(XaCb)c的第一次出现的背景中是GGGS(SEQ ID NO:1)，并且X在(XaCb)c的第二次出现的背景中是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:2)，并且X’是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:2)，并且其中a＝1，b＝1，c＝2，d＝2，e＝1，和f＝1，延伸会具有序列GGGSCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:90)。
作为一个实例，参考式I，其中出于例示的目的，X是具有序列AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO:2)的间隔区，其中a、b和c各是＝1；和f＝0，则C端延伸具有序列AKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:68)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，其中a＝2，b＝1，c＝1，和f＝0，当每个间隔区序列相同时，C端延伸具有序列AKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:69)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，和其中a＝1，b＝1，c＝2，和f＝0，当每个间隔区序列相同时，C端延伸具有序列AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:70)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，和其中a＝1，b＝1，c＝4，和f＝0，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEE GEFSEARC(SEQ IDNO:71)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，和其中a＝1，b＝1，c＝1，d＝3，e＝1，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEF SEARC(SEQ ID NO:72)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，和其中a＝2，b＝1，c＝1，d＝1，e＝1，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列AKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:73)。
在一个实例中，参考上述式I，其中出于例示的目的，X是AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO:2)，和其中a＝1，b＝1，c＝1，d＝2，e＝1，和f＝1，当每个间隔区序列相同时，延伸会具有序列AKTTPKLEEGEFSEARCAKTTPKLEEGEFSEARAKTTPKLEEGEFSEARC(SEQ ID NO:74)。
在另一个实例中，可以通过式II代表本公开的C端延伸：
(XaCb)c(X’dCe)f(X”gCh)i (II)
其中
X、X’和X”代表一个或多个氨基酸的间隔区，其中每个X、X’和X”的氨基酸序列独立选自感兴趣的任何氨基酸序列，包括本文中提供的间隔区氨基酸序列的实例的任一种；
C是半胱氨酸残基；并且
a、b、c、d、e、f、g、h和i是独立选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数，其中b、e和h的总和是至少1，并且c、f和i的总和是至少1。X、X’和X”可以是相同或不同的。在c大于1的情况下，则(XaCb)c的每个X在(XaCb)c的每个重复单元内可以是相同或不同的氨基酸序列。在d或f大于1的情况下，则(X’dCe)f的每个X’在(X’dCe)f的每个重复单元内可以是相同或不同的氨基酸序列。在g或i大于1的情况下，则(X”gCh)i的每个X”在(X”gCh)i的每个重复单元内可以是相同或不同的氨基酸序列。
本公开的C端延伸可以包含氨基酸序列(例如由氨基酸序列组成)，所述氨基酸序列选自：EPKSCDKTHTC(SEQ ID NO:92)(在本文中又称为延伸1)；EPKSCDKTHTCPPC(SEQ IDNO:93)(在本文中又称为延伸2)；EPKSC(SEQ ID NO:94)(在本文中又称为延伸3)；ESKYGPPC(SEQ ID NO:95)(在本文中又称为延伸4)；ERKCCVECPPC(SEQ ID NO:96)(在本文中又称为延伸5)；ERKC(SEQ ID NO:97)(在本文中又称为延伸6)；DVITMDPKDNC(SEQ ID NO:98)(在本文中又称为延伸7)；DHVKPKETENTKQPSKSCHKPK(SEQ ID NO:99)(在本文中又称为延伸8)；ESSC(SEQ ID NO:100)(在本文中又称为延伸9)；ESSCDVKLV(SEQ ID NO:101)(在本文中又称为延伸10)；DHVKPKETENTKQPSKSC(SEQ ID NO:102)(在本文中又称为延伸11)；DVITMDPKDNCSKDAN(SEQ ID NO:103)(在本文中又称为延伸12)；CAA,CCAA(SEQ ID NO:128),AACAA(SEQ ID NO:129)，和GGGGSCAA(SEQ ID NO:130)。
本公开还提供了编码本文中描述的C端延伸(例如式II的C端延伸等)的任一种的核酸，及编码本文中描述的轻链多肽(例如包含式II的C端延伸的轻链多肽等)的任一种的核酸。
本公开提供了具有至少一个轻链多肽的抗体，所述轻链多肽具有本公开的C端延伸。在一些实施方案中，抗体具有两个具有本公开的C端延伸的轻链多肽。在一些实施方案中，可以通过对存在于抗体的轻链多肽的至少一个中的C端延伸中的至少一个半胱氨酸的共价附着将此类抗体与试剂/有效负载(例如药物)缀合。在一个实施方案中，将有效负载直接附着于C端延伸的半胱氨酸。在另一个实施方案中，经由接头将有效负载附着于C端延伸的半胱氨酸。在一个实施方案中，相对于C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸，有效负载优先附着于C端延伸的半胱氨酸。在一个实施方案中，有效负载仅附着于C端延伸的半胱氨酸。
核酸、载体和宿主细胞
本公开提供了编码具有C端氨基酸延伸的轻链多肽(为了方便，在本文中称为“经修饰的轻链多肽”)的核酸，以及含有此类核酸的载体和宿主细胞。由核酸编码的经修饰的轻链多肽可以包含任何组合的上文描述的特征的任一种。例如，轻链多肽的C端延伸部分可以包含上文就延伸的长度、延伸的氨基酸序列、延伸中的间隔区的数目及其氨基酸序列、基于一个或多个间隔区和一个或多个半胱氨酸残基的组合的延伸构造描述的C端延伸特征的任一种，和上文和本文中别处描述的C端延伸的任何其它方面。
可以将编码含有C端延伸的轻链多肽的核酸(例如，DNA或RNA)与一种或多种调节元件，如启动子和增强子可操作连接，所述调节元件容许在宿主细胞(例如，经遗传修饰而合成编码的经修饰的轻链多肽的细胞)中表达核酸。
例如，在宿主细胞是原核宿主细胞的情况下，启动子的实例包括但不限于噬菌体T7RNA聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子，等等；araBAD启动子；体内调节启动子，如ssaG启动子或相关启动子，pagC启动子；nirB启动子；sigma70启动子，例如，共有sigma70启动子；稳定期启动子，例如，dps启动子，spv启动子，等等；自致病性岛SPI-2衍生的启动子；actA启动子；rpsM启动子；tet启动子；SP6启动子；等等。用于原核生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)的强启动子的实例包括但不限于Trc、Tac、T5、T7和Pλ。用于细菌宿主细胞的操纵基因的非限制性实例包括乳糖启动子操纵基因(LacI阻抑物蛋白在与乳糖接触时改变构象，从而阻止LacI阻抑物蛋白结合操纵基因)、色氨酸启动子操纵基因(当与色氨酸复合时，TrpR阻抑物蛋白具有结合操纵基因的构象；在缺乏色氨酸的情况下，TrpR阻抑物蛋白具有不结合操纵基因的构象)和tac启动子操纵基因。
在一些实施方案中，例如，为了在酵母细胞中表达，启动子可以是组成性启动子，如ADH1启动子、PGK1启动子、ENO启动子、PYK1启动子，等等；或调节型启动子，如GAL1启动子、GAL10启动子、ADH2启动子、PH05启动子、CUP1启动子、GAL7启动子、MET25启动子、MET3启动子、CYC1启动子、HIS3启动子、ADH1启动子、PGK启动子、GAPDH启动子、ADC1启动子、TRP1启动子、URA3启动子、LEU2启动子、ENO启动子、TP1启动子和AOX1(例如，用于毕赤酵母(Pichia))。
编码经修饰的轻链多肽的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。当期望表达经修饰的轻链多肽和抗体的一个或多个其它多肽组分，例如以提供具有本公开的经修饰的轻链多肽的抗体时，可以在同一或分开的载体中克隆编码两种或更多种多肽的相应的核苷酸序列。表达载体可以包含选择标志物、复制起点和提供载体的复制和/或维持的其它特征。
表达载体一般具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入。表达载体的实例包括但不限于病毒载体(例如，基于痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒；腺伴随病毒；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒的病毒载体；逆转录病毒(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒，和从逆转录病毒，如劳斯(Rous)肉瘤病毒、哈维(Harvey)肉瘤病毒、禽造白细胞组织增生病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒衍生的载体)；等等。
还提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码经修饰的轻链多肽的核酸的任一种或包含所述核酸的载体。在某些方面中，宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞。宿主细胞可以是分离的经遗传修饰的宿主细胞(例如，体外细胞)，其用本公开的核酸遗传修饰(例如转化或转染)。在一些实施方案中，本公开的经遗传修饰的宿主细胞可以产生本公开的经修饰的轻链多肽，该抗体轻链多肽可以具有本文中别处描述的特征的任一种。
宿主细胞的实例包括真核宿主细胞，如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；和原核细胞，如细菌细胞。例如，可以通过磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知的方法实现核酸对宿主细胞的导入。
哺乳动物宿主细胞的实例包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿类(例如，小鼠，大鼠)细胞系，等等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC No.CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCC No.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC No.CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC 20 No.CRL1573)、HLHepG2细胞，等等。
酵母宿主细胞的实例包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、嗜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichiakoclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichiapijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种(Fusarium sp.)、Fusarium gramineum、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等等。
原核细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella sp.)、志贺氏菌属物种(Shigella sp.)等的多种实验菌株的任一种。可以在本发明中采用的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)。合适的志贺氏菌属菌株包括但不限于弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和痢疾志贺氏菌(Shigella disenteriae)。通常，实验室菌株是非病原性的菌株。其它合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、夹馍红细菌(Rhodobacter capsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)等等。
产生抗体轻链多肽和抗体的方法
如上文讨论，本公开提供了制备经修饰的轻链多肽(即具有本公开的C端延伸的轻链多肽)以及含有此类经修饰的轻链多肽中的一种或多种的抗体的方法。
根据一个实施方案，提供了制备抗体的轻链多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码轻链多肽的核酸，所述轻链多肽包含如本文中描述的C端氨基酸延伸。可以通过任何方便的方法，例如，用于蛋白质合成的常规合成方法、重组DNA方法等产生轻链多肽。具有C端氨基酸延伸的轻链多肽可以与感兴趣的重链多肽的产生组合产生，或者可以在产生后与重链多肽组合(例如，通过融合重组细胞，所述重组细胞分开表达本公开的轻链多肽和重链多肽)。
可以使用重组方法产生轻链多肽。例如，可以将编码感兴趣的轻链多肽的核酸插入表达载体中。可以将编码轻链多肽的核酸区段与表达载体中确保轻链多肽的表达的一种或多种控制序列可操作连接。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然关联或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)的载体中的真核启动子系统。一旦已经将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的期望的表达水平，和轻链多肽的收集和纯化的条件下维持宿主。
由于遗传密码的简并性，多种核酸序列可以编码期望的轻链多肽。可以通过从头固相DNA合成，通过编码缺乏C端氨基酸延伸的亲本抗体的轻链多肽的核酸的聚合酶链式反应(PCR)诱变(例如，重叠PCR)产生编码轻链多肽的核酸序列。在本文中的实施例部分中详细描述了实例方法，其利用重叠PCR生成编码具有C端氨基酸延伸的轻链多肽的核酸。
合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分可复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞。上文讨论了表达载体和宿主细胞的实例。例如，宿主细胞可以是原核细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种，等等)、酵母细胞(例如，酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母)、毕赤酵母属等)和哺乳动物细胞(例如，CHO细胞系、Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞、杂交瘤等)。
虽然化学合成轻链多肽，但是可以经由液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)是适合于化学合成轻链多肽的方法的一个实例，其中将序列的C端氨基酸附着于不溶性支持物，接着相继添加序列中剩余的氨基酸。各种形式的SPPS，如Fmoc和Boc可用于合成轻链多肽。用于固相合成的技术是本领域中可用的。例如，用功能性单元处理小的不溶性多孔珠，在所述功能性单元上建立肽链。在偶合/脱保护的重复循环后，将被附着的固相的游离N端胺与单个经N保护的氨基酸单元偶合。然后，脱保护此单元，露出新的N端胺，对该新的N端胺可以附着进一步的氨基酸。肽在固相上保持固定，并且在被切下前经历过滤工艺。
一旦(重组或化学)合成，可以根据标准的方案纯化单独的或作为抗体的一部分的经修饰的轻链多肽。单独的或作为抗体的一部分的经修饰的轻链多肽可以是基本上纯的，例如，至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％以上纯的，例如，不含污染物，如细胞碎片，除了轻链多肽外的大分子，等等。
根据某些实施方案，通过体外翻译产生轻链多肽。参见例如，Yin等(2012)Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable invitro transcription-translation system,Landes Bioscience,第4卷，第2期。
抗体可以是重组抗体，例如，嵌合的、人源化的、完全人的、双特异性、去免疫的抗体和/或体外产生的抗体。
缀合物
本公开提供了具有至少一个含有C端延伸的轻链多肽的抗体，其中C端延伸的至少一个半胱氨酸与试剂(例如药物)缀合。
本公开的缀合物的抗体部分的具有C端延伸的轻链多肽可以包含上文描述的并且任意组合的特征的任一种。例如，缀合物的抗体部分的C端延伸可以包含上文就延伸的长度、延伸的氨基酸序列、延伸中的间隔区的数目及其氨基酸序列、基于一个或多个间隔区和一个或多个半胱氨酸残基的组合的延伸构造描述的C端延伸特征的任一个，和上文和本文中别处描述的C端延伸的任何其它方面。
因而，本公开的抗体缀合物具有至少一个具有C端延伸的轻链多肽，其中C端延伸的至少一个半胱氨酸残基与试剂缀合。在一些实施方案中，本公开的抗体缀合物的轻链多肽的每个具有C端延伸，其中经修饰的轻链多肽中每个的C端延伸的至少一个半胱氨酸残基与试剂缀合。例如，第一试剂可以与第一经修饰的轻链多肽的C端延伸的半胱氨酸残基缀合，并且第二试剂可以与第二轻链多肽的C端延伸的半胱氨酸残基缀合。在一个实施方案中，试剂优先附着于C端延伸的半胱氨酸残基而不是C端氨基酸延伸外部的半胱氨酸残基。在某些方面中，试剂仅附着于C端延伸的半胱氨酸残基。根据可用于缀合的C端延伸中的半胱氨酸的数目，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或更多个半胱氨酸，本公开的抗体缀合物可以包含与经修饰的轻链多肽的C端延伸缀合的任何数目的试剂。在一些实施方案中，抗体的经修饰的轻链多肽的C端延伸经由对C端延伸的至少1、2、3、4、5或更多个半胱氨酸的共价结合与一种或多种试剂缀合。在一些实施方案中，抗体的经修饰的轻链多肽的C端延伸经由对C端延伸的不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个半胱氨酸的共价结合与一种或多种试剂缀合。在某些方面中，延伸包含直接或经由一个或多个接头与延伸中的两个或更多个相邻半胱氨酸残基缀合的试剂。例如，延伸可以包含与延伸中的两个相邻半胱氨酸残基缀合的试剂。
在某些实施方案中，可以通过药物与抗体比率(DAR)表征与抗体的经修饰的轻链多肽的C端延伸缀合的试剂的数目。在一些情况中，可以通过测量分布中的抗体缀合物的平均DAR表征多个抗体缀合物的分布，其中平均DAR指示与分布中的抗体的经修饰的轻链多肽的C端延伸缀合的试剂的平均数目。“平均”意味着算术平均。在某些情况中，通过疏水性相互作用层析(HIC)测定平均DAR。因此，平均DAR提供了通过DAR测定法提供的分布中的抗体缀合物的平均药物与抗体比率的指标。
在一些情况中，根据本公开的抗体缀合物的DAR范围为0至20，如1至17、或1至15、或1至12、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3。例如，DAR为0指示抗体是未缀合的；DAR为1指示一个试剂(例如，药物)与抗体的经修饰的轻链多肽的一个C端延伸缀合；DAR为2指示两个试剂与抗体的经修饰的轻链多肽的一个或多个C端延伸缀合；DAR为3指示三个试剂与抗体的经修饰的轻链多肽的一个或多个C端延伸缀合；DAR为4指示四个试剂与抗体的经修饰的轻链多肽的一个或多个C端延伸缀合；等等。在一些情况中，根据本公开的抗体缀合物的DAR是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些情况中，根据本公开的抗体缀合物的分布的平均DAR范围为0至20，如1至17、或1至15、或1至12、或1至10、或1至9、或1至8、或1至7、或1至6、或1至5、或1至4、或1至3。例如，平均DAR为0指示平均而言，分布中的抗体是未缀合的；平均DAR为1指示平均而言，一个试剂(例如，药物)与分布中的每个抗体缀合；平均DAR为2指示平均而言，两个试剂与分布中的每个抗体缀合；平均DAR为3指示平均而言，三个试剂与分布中的每个抗体缀合；平均DAR为4指示平均而言，四个试剂与分布中的每个抗体缀合；等等。在一些情况中，根据本公开的抗体缀合物的分布的平均DAR是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在某些实施方案中，含有根据本公开的抗体缀合物的样品包含未缀合的和缀合的(例如，单缀合的、二缀合的、三缀合的，等等)抗体的分布的混合物。可以测定抗体缀合物的每种分布的平均DAR(例如，通过HIC)。例如，含有抗体缀合物的样品可以包含未缀合的抗体(即具有平均DAR＝0的抗体缀合物)的分布、单缀合的抗体(即具有平均DAR＝1的抗体缀合物)的分布、二缀合的抗体(即具有平均DAR＝2的抗体缀合物)的分布、三缀合的抗体(即具有平均DAR＝3的抗体缀合物)的分布等等。
图2中示意性显示了根据本公开的实施方案的实例抗体缀合物。如显示，缀合物200包含抗体，该抗体具有两个包含轻链可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域的轻链多肽，和从(CL)结构域中的每个的C端残基延伸的C端延伸，其具有序列GGGSC。缀合物200进一步包含经由接头与延伸的半胱氨酸残基连接的试剂202和204。
接头
在某些方面中，试剂经由接头与半胱氨酸残基缀合。在本公开的缀合中使用的接头包括马来酰亚胺或基于马来酰亚胺的接头；缬氨酸-瓜氨酸接头；腙接头；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)接头；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)接头；基于乙烯基砜的接头；牵涉与半胱氨酸配位的金属原子的接头；包含聚乙二醇(PEG)的接头，如但不限于三缩四乙二醇；包含丙酸的接头；包含癸烯酸的接头；包含聚合物(Mersana Therapeutics,Cambridge,MA)的接头或用于将药物附着于Fleximer聚合物的接头(参见例如USPN 8,524,214，其以引用方式整体并入本文)；和包含其任何组合的接头。
在某些方面中，接头是化学不稳定接头，如酸可切割接头，其在中性pH(血流pH7.3-7.5)是稳定的，但是在内在化到靶细胞(例如癌细胞)的轻度酸性内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH 4.5-5.0)中时经历水解。化学不稳定接头包括但不限于基于腙的接头。根据某些实施方案，接头是酶不稳定接头，如在血流中稳定，但是在内在化到靶细胞中时经历例如通过靶细胞(例如癌细胞)的溶酶体中的溶酶体蛋白酶(如组织蛋白酶或纤溶酶)的酶促切割的酶不稳定接头。酶不稳定接头包括但不限于包含肽键的接头，例如，缬氨酸-瓜氨酸接头，如马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苄基(MC-vc-PAB)接头，等等。在某些方面中，接头是不可切割的接头，如包含不可切割的硫醚键的接头。化学不稳定接头、酶不稳定接头和不可切割的接头是已知的，并且详细记载于例如Ducry&Stump(2010)Bioconjugate Chem.21:5-13。
根据某些实施方案，接头是(或包含)巯基反应性化学基团，其能够与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基的一个或多个被还原的巯基基团(或者硫醇，-SH)起反应。在连接试剂与C端延伸的半胱氨酸中使用的巯基反应性化学基团包括但不限于马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、氮丙啶、丙烯酰、芳基化剂、乙烯基砜、TNB-硫醇、金属和二硫化物还原剂。此类基团可以通过烷基化(例如通过形成硫醚键)、二硫化物交换(形成二硫键)等与巯基缀合。
试剂
作为本公开的抗体缀合物的有效负载的试剂可以是任何合适的试剂。选择用于在本公开的抗体缀合物中使用的试剂会随采用缀合物的应用(例如杀伤、防止细胞增殖、激素疗法、靶标成像和/或基因疗法等)而变化。感兴趣的试剂包括但不限于治疗剂(例如药物(例如细胞毒剂))、可检测剂(例如体内成像剂)和/或可用于感兴趣的基于抗体的具体应用的任何其它试剂。
此类试剂的非限制性实例包括毒素、毒素片段、凝集素、烷化剂、酶、抗生素(如抗细菌剂、抗真菌剂、抗支原体剂等)、抗病毒剂、抗代谢物、抗增殖剂或抗肿瘤剂、DNA、射线不透性染料、放射性同位素(例如，I123、I131以及放射性金属离子)、金属离子、荧光化合物、标志物化合物和改变细胞膜通透性的化合物。在某些方面中，试剂是(或包含)特异性结合对的成员，例如，生物素(其与抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白形成特异性结合对)。
根据某些实施方案，试剂是治疗剂。感兴趣的治疗剂包括能够影响细胞/组织的功能的试剂，缀合物经由缀合物的抗体部分对所述细胞/组织的表面上的抗原的特异性结合而结合所述细胞/组织。例如，试剂可以加强缀合物特异性结合的细胞/组织的功能。或者，当细胞/组织的功能是病理性时，可以采用降低细胞/组织的功能的试剂。在某些方面中，本公开的缀合物包含通过抑制细胞增殖和/或杀死细胞/组织降低靶细胞/组织功能的试剂。此类试剂可以有所变化，并且包括细胞抑制剂和细胞毒剂(例如，能够在或不在被内在化到靶细胞中的情况下杀死靶细胞组织的试剂)。
在某些方面中，治疗剂是细胞毒剂，其选自烯二炔、莱希菌素(lexitropsin)、多卡米星(duocarmycin)、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀(dolastatin)、美登素生物碱(maytansinoid)和长春花生物碱。在一些实施方案中，细胞毒素是紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、CC-1065、CPT-11(SN-38)、托泊替康(topotecan)、多柔比星、吗啉代-多柔比星、根霉素(rhizoxin)、氰基吗啉代-多柔比星、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀(combretastatin)、加利车霉素、美坦辛(maytansine)、美坦辛DM1、美坦辛DM4、DM-1、澳瑞他汀(auristatin)或其它多拉司他汀衍生物，如澳瑞他汀E或澳瑞他汀F、AEB(AEB-071)、AEVB(5-苯甲酰基戊酸-AE酯)、AEFP(抗体-内皮他丁融合蛋白)、MMAE(单甲基澳瑞他汀E)、MMAF(单甲基澳瑞他汀F)、吡咯苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines)(PBD)、eleutherobin、纺缍菌素或其任何组合。
根据某些实施方案，试剂是蛋白质毒素，其选自哈米特林(hemiasterlin)和哈米特林类似物，如HTI-286(例如，参见USPN 7,579,323；WO 2004/026293；和USPN 8,129,407，其全部公开以引用方式并入本文)、相思豆毒蛋白、马钱子碱(brucine)、毒芹素(cicutoxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、箭毒蛙毒素(batrachotoxin)、腊肠毒素(botulism toxin)、志贺毒素、内毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇(falcarinol)、烟曲霉毒素B1、烟曲霉毒素B2、黄曲霉毒素(aflatoxin)、马拉毒素(maurotoxin)、agitoxin、卡律蝎毒素(charybdotoxin)、玛格毒素(margatoxin)、斯罗毒素(slotoxin)、希拉毒素(scyllatoxin)、赫福毒素(hefutoxin)、calciseptine、太卡毒素(taicatoxin)、卡西鲁定(calcicludine)、格尔德霉素(geldanamycin)、白树毒素(gelonin)、百脉根苷(lotaustralin)、ocratoxin A、棒曲霉素(patulin)、蓖麻毒蛋白、士的宁(strychnine)、单端孢霉烯(trichothecene)、玉米赤霉烯酮(zearlenone)和河豚毒素。可以采用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白蛋白质(dianthinproteins)、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(eomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes)。
在某些方面中，试剂是标记剂。“标记剂”(或“可检测标记物”)意指试剂可检测标记抗体，使得可以在感兴趣的应用(例如体外和/或体内研究和/或临床应用)中检测抗体。感兴趣的可检测标记物包括放射性同位素、产生可检测产物的酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光蛋白、顺磁性原子，等等。在某些方面中，抗体与可检测标记物的特异性结合配偶缀合(例如，与生物素缀合，使得可以经由包含抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白的可检测标记物发生检测)。
根据某些实施方案，试剂是标记剂，其在体内成像，如近红外(NIR)光学成像、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)/CT成像、正电子发射断层摄影术(PET)、核磁共振(NMR)光谱法等中使用。在此类应用中使用的标记剂包括但不限于荧光标记物、放射性同位素等。在某些方面中，标记剂是多模式体内成像剂，其允许使用两种或更多种成像方法进行体内成像(例如，参见Thorp-Greenwood and Coogan(2011)Dalton Trans.40:6129-6143)。
在某些方面中，标记剂是在近红外(NIR)成像应用中使用的体内成像剂，该试剂选自Kodak X-SIGHT染料、Pz 247、DyLight 750和800Fluor、Cy 5.5和7Fluors、Alexa Fluor680和750染料、IRDye 680和800CW Fluor。根据某些实施方案，标记剂是在SPECT成像应用中使用的体内成像剂，该试剂选自99mTc、111In、123In、201Tl和133Xe。在某些方面中，标记剂是在正电子发射断层摄影术(PET)成像应用中使用的体内成像剂，该试剂选自11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb和68Ga。
缀合方法
本公开还提供了制备抗体缀合物的方法。该方法包括将试剂与包含含有C端氨基酸延伸的轻链多肽的抗体缀合，该延伸包含半胱氨酸残基，其中试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基(直接或间接(例如经由接头))缀合。在一个实施方案中，方法牵涉将试剂与C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基，而不是C端延伸外部的半胱氨酸残基优先(或“有偏”)缀合。在某些方面中，缀合包括将接头与半胱氨酸残基的巯基基团缀合，例如，使用马来酰亚胺反应化学、卤代乙酰基反应化学、吡啶基二硫化物反应化学或如本文中描述的任何其它合适的反应化学进行。制备缀合物的方法可以进一步包括在缀合步骤前将半胱氨酸残基还原成巯基基团(即硫醇)，例如，如上文描述使用合适的还原剂和还原条件。合适的还原剂包括但不限于DTPA、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、其组合等等。在某些实施方案中，制备缀合物的方法包括使包含含有C端氨基酸延伸的轻链多肽的抗体与还原剂接触。在某些实施方案中，制备缀合物的方法包括使包含含有C端氨基酸延伸的轻链多肽的抗体与第一还原剂接触，接着使包含含有C端氨基酸延伸的轻链多肽的抗体与第二还原剂接触。本公开的一个备选实施方案不需要还原步骤，因为轻链延伸内的半胱氨酸作为合成产物已经为还原状态。在某些实施方案中，可以使被还原的抗体与合适的氧化剂接触。合适的氧化剂包括但不限于去氢抗坏血酸(DHAA)等。与抗体缀合的试剂可以是任何有用的试剂。在某些方面中，试剂是治疗剂或标记剂，该试剂在本文中别处描述。
在某些方面中，使用马来酰亚胺反应化学将试剂与C端延伸的半胱氨酸连接。当反应混合物的pH介于pH 6.5和7.5之间时，马来酰亚胺基团可以与巯基基团特异性起反应，从而导致稳定的硫醚连接的形成。例如，可以使经马来酰亚胺基修饰的试剂(例如，药物)与C端氨基酸延伸的被还原的半胱氨酸(例如，巯基或硫醇基团)起反应以在试剂和抗体之间形成硫醚连接。在更为碱性的条件(pH>8.5)下，伯胺可以与硫醇竞争与马来酰亚胺的反应，并且还提高马来酰亚胺基团到非反应性马来酰胺酸的水解速率。马来酰亚胺不与酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸起反应。采用基于马来酰亚胺的接头的生物缀合方法记载于例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,第2版San Diego,CAAcademic Press 2008；Aslam&Dent,Bioconjugation:Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences,London Macmillan Reference Ltd 1998；Kalia&Raines,Advances inBioconjugation,Curr.Org.Chem.14(2):138-147。本文中的实施例部分中详细描述了根据本公开的实施方案的使用基于马来酰亚胺的接头的合适的缀合方法的实例。
根据某些实施方案，使用卤代乙酰基反应化学将试剂与C端延伸的半胱氨酸连接。在某些方面中，采用包含碘代乙酰基或溴代乙酰基基团的卤代乙酰基接头。在某些实施方案中，卤代乙酰基在生理pH与巯基基团起反应。通过用来自巯基基团的硫原子对碘的亲核取代进行碘代乙酰基基团的反应，从而产生稳定的硫醚连接。
在某些方面中，使用吡啶基二硫化物反应化学将试剂与C端延伸的半胱氨酸连接。在某些实施方案中，吡啶基二硫化物在宽pH范围内(pH 4至5是最佳的)与巯基基团起反应以形成二硫键。在反应期间，抗体的巯基基团和经2-吡啶基二硫醇修饰的试剂之间发生二硫化物交换。因此，吡啶-2-硫酮得到释放，并且可以以分光光度法测量(Amax＝343nm)以监测反应的进展。
为了产生可以(例如经由接头)附着试剂的C端氨基酸延伸的半胱氨酸中的被还原的巯基，可以在足以产生被还原的巯基基团的条件下使半胱氨酸与合适的还原剂接触。在某些方面中，还原剂选自盐酸半胱胺、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙胺、三(2-羧基)膦(TCEP)、半胱氨酸HCl、N-乙基马来酰亚胺、Nacystelyn、dornase alfa、胸腺素β4、愈创甘油醚TCEP HCl、及其任意组合。用于此类还原剂的反应条件是本领域中已知的，并且可以经优化，例如以与存在于亲本抗体中的半胱氨酸残基(例如，参与轻链和重链的CL和CH1之间，和/或重链的铰链区之间的二硫键键合的半胱氨酸残基)形成对比，促进存在于C端延伸中的半胱氨酸还原的选择性或“偏爱”。本发明的备选实施方案不需要还原步骤，因为轻链延伸内的半胱氨酸作为合成产物已经为还原态。
可以通过选择合适的还原条件实现C端氨基酸延伸的半胱氨酸相对于C端氨基酸延伸外部的一个或多个半胱氨酸残基的优先还原(或者仅还原C端氨基酸延伸的半胱氨酸)。在某些方面中，合适的还原条件包括适当选择下列一项或多项：温和的还原剂和/或具有空间体积的还原剂，所述空间体积对还原剂赋予用于还原C端氨基酸延伸的半胱氨酸的偏爱；还原剂和底物的浓度；实施还原反应的温度，还原反应混合物的pH；还原反应中使用的缓冲液；和/或培养表达延伸的C端轻链多肽的细胞(例如以获得C端延伸上的游离硫醇和/或以产生容易还原的分子间二硫化物)的条件。
药物组合物
如上文概述，本公开提供了组合物。本公开的组合物可以包含上文描述的抗体、缀合物、核酸、载体和/或宿主细胞的任一种。本公开的方面包括药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含本文中别处描述的抗体的任一种(例如，如上文描述的包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸)或本文中别处描述的缀合物的任一种(例如，如上文描述的包含抗体组分的缀合物，所述抗体组分具有轻链多肽，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸)和药学上可接受的赋形剂。存在于药物组合物中的抗体或缀合物可以包含任意组合的上文就本公开的抗体或本公开的缀合物而言描述的特征的任一种。例如，抗体或缀合物的抗体部分的C端延伸可以包含上文就延伸的长度、延伸的氨基酸构成、延伸中的间隔区的数目及其氨基酸序列、基于一个或多个间隔区和一个或多个半胱氨酸残基的组合的延伸构造描述的C端延伸特征的任一个，和上文和本文中别处描述的C端延伸的任何其它方面。
药物组合物一般包含治疗有效量的本公开的抗体或缀合物。可以在一次或多次施用中施用有效量。
可以使用能够产生期望的治疗效果或诊断效果的任何方便的手段对患者施用本公开的抗体或缀合物。因此，可以将抗体或缀合物掺入用于治疗性施用的多种配制剂中。更具体地，可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合将抗体配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液、注射液、吸入剂和气雾剂。
适合于对患者施用(例如适合于人施用)的本公开的抗体或缀合物的配制剂一般是无菌的，并且可以进一步不含可检测的热原或其它污染物，其根据选择的施用途径对于对患者施用是禁忌的。
在药物剂量形式中，抗体可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独或与其它药学活性化合物以合适的联合以及组合使用。以下方法和赋形剂仅仅是实例，并且绝不是限制性的。
对于口服制剂，抗体或缀合物可以单独或与适合于制备片剂、粉末、颗粒剂或胶囊的添加剂组合使用，例如与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；和若需要的话，与稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂和芳香剂组合使用。
抗体或缀合物可以通过在水性或非水性溶剂，如植物油或其它相似的油，合成的脂肪族酸甘油酯，高级脂肪酸或丙二醇的酯；和若需要的话，用常规的添加剂，如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂溶解、悬浮或乳化它们来配制成注射用制剂。
可以通过混合具有期望纯度的抗体或缀合物与任选的生理学可接受载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂制备本公开的药物组合物。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在采用的剂量和浓度时对接受者是无毒的，并且包含缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖，二糖和其它碳水化合物；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂如EDTA；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺，和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如Tween、BrijPluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物可以为液体形式、冻干形式或从冻干形式重建的液体形式，其中冻干制剂在施用前要用无菌溶液重建。用于重建冻干组合物的标准方案是加回一定体积的纯水(通常等同于冻干期间除去的体积)；然而，可以使用包含抗细菌剂的溶液产生供胃肠外施用的药物组合物。
根据本公开的药物组合物中的实例抗体或缀合物浓度范围可以为约1mg/mL至约200mg/ml或约50mg/mL至约200mg/mL，或约150mg/mL至约200mg/mL。
可以在pH缓冲溶液(例如，在范围为约4.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或备选地约5.5的pH)中制备抗体或缀合物的水性配制剂。适合于此范围内的pH的缓冲剂的实例包括磷酸盐、组氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐缓冲剂和其它有机酸缓冲剂。根据例如缓冲剂和配制剂的期望张力，缓冲剂浓度可以为约1mM至约100mM，或约5mM至约50mM。
抗体或缀合物配制剂中可以包含张力剂以调节配制剂的张力。实例张力剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖及其组合的组的任何组分。在一些实施方案中，水性配制剂是等张的，尽管高张或低压溶液可能是合适的。术语“等张”表示与同其比较的一些其它溶液，如生理盐溶液或血清具有相同张力的溶液。张力剂可以以约5mM至约350mM的量，例如，以100mM至350mM的量使用。
也可以对抗体或缀合物配制剂添加表面活性剂以降低配制的抗体或缀合物的聚集和/或最小化配制剂中的颗粒形成和/或降低吸附。实例表面活性剂包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯的实例是聚山梨酯20(在商标Tween 20TM下出售)和聚山梨酯80(在商标Tween 80TM下出售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的实例是那些在名称F68或Poloxamer 188TM下出售的。合适的聚氧乙烯烷基醚的实例是那些在商标BrijTM下出售的。表面活性剂的实例浓度范围可以为约0.001％至约1％w/v。
也可以添加冻干保护剂以保护活性成分(例如抗体或缀合物)免于冻干过程期间的脱稳定条件。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以以约10mM至500nM的量包含冻干保护剂。
在某些方面中，配制剂包含本公开的抗体或缀合物，和上文鉴定的试剂(例如表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)中的一种或多种，并且基本上不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苯甲醇、酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵或其组合。在其它实施方案中，防腐剂例如以范围为约0.001至约2％(w/v)的浓度包含在配制剂中。
例如，配制剂可以是适合于胃肠外施用的液体(例如，水性溶液或乳剂)或其冻干配制剂，并且可以包含：约1mg/mL至约200mg/mL受试抗体或缀合物；约0.001％至约1％至少一种表面活性剂；约1mM至约100mM缓冲剂；任选地约10mM至约500mM稳定剂；和约5mM至约305mM张力剂；并且具有约4.0至约7.0的pH。
可以在有待经由吸入施用的气雾剂配制剂中利用本公开的抗体或缀合物。可以将抗体配制到加压的可接受推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
可以提供供口服施用的单位剂量形式，如糖浆剂、酏剂和悬浮液，其中每个剂量单位，例如，茶匙、大汤匙或片剂，含有预先确定量的含有一种或多种已知的组合物。类似地，供注射或静脉内施用的单位剂量形式可以在作为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液的组合物中包含抗体或缀合物。
如本文中使用，术语“单位剂量形式”指适合作为用于人和动物受试者的单一剂量的物理离散单位，每个单位含有以足以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物联合产生期望效果的量计算的预先确定量的本发明的化合物。关于感兴趣的抗体或缀合物的规格可以取决于采用的具体抗体和要实现的效果，和宿主中的与每种抗体有关的药效学。
在某些方面中，药物组合物(任选地以单位剂量形式提供)包含以约10mg/mL至约1000mg/mL，例如，约25mg/mL至约500mg/mL，约50mg/mL至约250mg/mL，约75mg/mL至约200mg/mL或约100mg/mL至约150mg/mL(例如，约125mg/mL)的浓度存在的本公开的抗体或缀合物。
在一些实施方案中，将抗体或缀合物配制为受控释放配制剂。可以使用本领域中公知的方法制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中基质为成形物品形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不能降解的乙烯-乙烯基乙酸盐、水凝胶、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本发明的范围内的受控释放可以理解为意指许多延长释放剂量形式的任一种。出于本发明的目的，可以认为以下术语基本上等同于受控释放：连续释放、受控释放、延迟释放、储存库(depot)、逐渐释放、长期释放、程序性释放、延长释放、成比例释放、拖延释放、贮藏库(repository)、延迟、缓慢释放、间隔释放、持续释放、时间涂层(time coat)、定时释放、延迟作用、延长作用、分层时间作用、长效、持久作用、重复作用、减缓作用、持续作用、持续作用药物和延长释放。
基于各种临床因素，主治内科医生或其它有资格的医学人员可以确定合适的剂量。如医学技术中公知的，用于任一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体表面积、年龄、待施用的具体抗体或缀合物、患者的性别、次数和施用途径、一般健康和同时施用的其它药物。可以以每剂1ng/kg体重和25mg/kg体重之间，例如0.1mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如0.5mg/kg体重至8mg/kg体重之间，例如1mg/kg体重至6mg/kg体重之间，例如2mg/kg体重至5mg/kg体重之间的量施用本公开的抗体或缀合物；然而，预想低于或高于这些实例范围的剂量，尤其考虑前述因素。若方案是连续输注，则它也可以在每千克体重每分钟1μg至10mg的范围中。
技术人员会容易理解剂量水平可以作为具体抗体、症状的严重性和受试者对副作用的易感性的函数而变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种手段容易地确定。
常规且药学上可接受的施用途径包括静脉内、动脉内、肌肉内、鼻内、气管内、皮下、皮内、局部应用、鼻、口腔和其它肠和胃肠外施用途径。若需要的话，可以组合施用途径，或者根据抗体或缀合物和/或期望的效果而调节施用途径。可以以单剂或以多剂施用药物组合物。在一些实施方案中，静脉内施用组合物。在一些实施方案中，口服施用组合物。在一些实施方案中，经由吸入途径施用组合物。在一些实施方案中，鼻内施用组合物。在一些实施方案中，局部施用组合物。在一些实施方案中，颅内施用组合物。
治疗方法
本公开提供了治疗疾病或病症的方法。方法可以包括对有此需要的患者施用治疗有效量的本文中别处描述的抗体、缀合物或药物组合物的任一种。可以单独(例如，在单一疗法中)或者与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，在联合疗法中)施用抗体或缀合物。
在一些实施方案中，抗体或缀合物的有效量是当以一剂或多剂单独施用(例如，在单一疗法中)或者与一种或多种另外的治疗剂组合施用(例如，在联合疗法中)时，与缺乏用抗体或缀合物治疗的情况下的个体中的症状相比有效降低个体中的疾病或病症的症状达至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或更多的量。
可以采用本公开的方法治疗感兴趣的任何疾病或病症。在某些方面中，采用方法治疗癌症。例如，在一些实施方案中，当以有效量施用抗体或缀合物时，本公开的抗体或缀合物抑制宿主中的癌细胞的生长、转移和/或侵入性。“癌细胞”意指展现新生物性细胞性表型的细胞，所述新生物性细胞性表型可以以下列一项或多项为特征：例如，细胞生长异常、细胞性增殖异常、密度依赖性生长抑制的丧失、不依赖于锚定的生长潜力、促进肿瘤生长的能力和/或免疫受损的非人动物模型中的形成和/或细胞转化的任何合适的指标。“癌细胞”在本文中可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌性细胞”可互换使用，并且包括实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。
在某些方面中，当方法用于治疗癌症时，抗体或缀合物的抗体组分特异性结合癌细胞表面上的抗原。术语“抗原”和“表位”是本领域中完全理解的，并且指大分子(例如多肽)中被免疫系统的组分，例如抗体或T细胞抗原受体特异性识别的部分。如本文中使用，术语“抗原”包括抗原性表位，例如，抗原中作为抗原性表位的片段。半抗原也是抗原的实例。表位可以由溶液(例如不含其它分子)中的抗体识别。当表位与I类或II类主要组织相容性复合物分子结合时，表位可以由T细胞抗原受体识别。
在癌症治疗的背景中的感兴趣的抗原包括肿瘤特异性抗原，例如，存在于恶性细胞表面上而不存在于非恶性细胞上的抗原。在其它方面中，由抗体结合的抗原是肿瘤相关抗原。“肿瘤相关抗原”意指在恶性细胞上表达且在正常组织的细胞上有限表达的抗原、相对于正常细胞在恶性细胞上以高得多的密度表达的抗原或发育表达的抗原。
任何肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原可以由本公开的抗体或缀合物靶向。在某些方面中，当本公开的方法用于治疗癌症时，由本公开的抗体或缀合物的抗体组分特异性结合的抗原可以包括但不限于HER2、CD 19、CD22、CD30、CD33、CD56、CD66/CEACAM5、CD70、CD74、CD79b、CD138、柄蛋白(Nectin)-4、间皮蛋白(Mesothelin)、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、SLC44A4、CA6、CA-IX或感兴趣的任何其它肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。
在抗体特征的背景中的“特异性结合”指抗体优先结合存在于不同抗原的同质混合物中的具体抗原的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用将区分样品或生物体(例如人)中的期望的抗原和不期望的抗原(或“靶标”和“非靶标”抗原)，在一些实施方案中，超过约10至100倍或更多(例如，超过约1000或10,000倍)。在某些实施方案中，抗体和抗原之间的当它们在抗体-抗原复合物中特异性结合时的亲和力以小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M或小于约10-12M或更小的KD(解离常数)为特征。
可以使用本公开的方法治疗的癌症包括但不限于实体瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤和可以使用基于抗体的疗法或基于抗体-缀合物的疗法治疗的任何其它癌症类型。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒。根据某些实施方案，试剂盒可以包含本公开的抗体、缀合物或药物组合物的任一种，其具有如本文中别处描述的特征的任一种。或者/另外，试剂盒可以包含可用于产生本公开的抗体或其轻链多肽，或本公开的缀合物的任一种的任何试剂。例如，试剂盒可以包含编码抗体轻链多肽的核酸，所述抗体轻链多肽包含含有半胱氨酸的C端氨基酸延伸。此类试剂盒可以包含例如在产生本公开的抗体或缀合物中使用的感受态细胞或已经含有编码一种或多种抗体轻链和/或重链多肽的核酸的细胞、用于还原C端轻链多肽延伸中的半胱氨酸残基的巯基基团的还原剂、用于将试剂与半胱氨酸残基的被还原的巯基缀合的接头、试剂(其可以附着于接头或者与接头分开)、试剂、缓冲剂、纯化柱等，或其任何组合。例如，试剂盒在使人能够实施本公开的方法，如治疗疾病或病症的方法、制备抗体轻链多肽的方法和/或制备抗体缀合物的方法中使用。
用于实施方法的试剂盒可以包含一种或多种包含本文中描述的抗体或缀合物的药物组合物。因而，试剂盒可以包含以一个或多个单位剂量存在的单一药物组合物。仍在其它实施方案中，试剂盒可以包含两种或更多种分开的药物组合物。
试剂盒的组分可以存在于分开的容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。在某些实施方案中，可能方便的是以冻干形式提供组分，使得它们是即用的，并且可以方便在室温贮存。
除了上文提及的组分外，本公开的试剂盒可以进一步包含关于使用试剂盒的组分的说明书，例如以使用本公开的抗体或缀合物治疗疾病或病症，或者以制备本公开的抗体或缀合物。一般在合适的记录介质上记录说明书。例如，可以在基底，如纸或塑料等上印刷说明书。因而，说明书可以以包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即与包装或分包装结合)，等等。在其它实施方案中，说明书以电子存储数据文件存在，所述电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM、软盘、硬盘驱动器(HDD)等。仍在其它实施方案中，实际的说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于从远程来源获得说明书的手段，例如经由因特网。此实施方案的一个实例是包含网址的试剂盒，在该网址中可以观看说明书和/或从该网址中可以下载说明书。与说明书一样，在合适的基底上记录此种用于获得说明书的手段。
以下实施例作为例示而不作为限制提供。
实施例
实施例1：克隆编码抗体的核酸，所述抗体具有含有半胱氨酸的C端轻链多肽延伸
为了产生人IgG 1C和人IgGkC克隆载体，将人IgGC和IgkC区克隆到pTT5载体中(图1)。为了便于与恒定区以符合读码框的方式克隆可变区，将限制性位点引入恒定区的5’端中。将重链恒定区序列从GCC TCC改变为GCT AGC，这引入NheI限制性位点，同时维持初始氨基酸序列。将轻链多肽恒定区序列从CGA ACT改变为CGT ACG以产生BsiWI限制性位点，同时维持初始氨基酸序列。通过设计购自Operon–Eurofins的错配PCR引物引入变化。由于pTT5载体不含BsiWI位点，IgkC 5’引物设计为具有5’NheI突出端以促进对载体中的克隆。3’引物设计为在终止密码子的3’具有BamHI限制性位点。
为了产生用于PCR反应的cDNA模板，使用微量制备试剂盒从人外周血中提取RNA，并且使用的oligodT引物和来自InvitrogenTM的III逆转录酶合成cDNA。
在PCR后，使用相关的限制酶消化片段和载体，并且在1％琼脂糖凝胶上分离。使用Qiagen凝胶提取试剂盒从凝胶中提取经消化的片段，并且使用T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)连接到载体中。转化感受态DH5α大肠杆菌(Invitrogen)，并且在氨苄青霉素选择性LB板上在37℃培养单细胞菌落过夜。为了分离质粒，将单细胞菌落接种到液体LB-氨苄青霉素培养基中，在37℃培养过夜，并且使用旋转微量制备试剂盒分离质粒。通过微量制备DNA消化物筛选克隆，并且通过使用来自Biomatters的Geneious序列比对、装配和分析软件进行的序列分析确认。表1中提供了用于克隆的引物序列。
表1：IgGC和IgkC克隆引物
为了产生ERBB特异性抗体，以来自(Integrated DNA Technologies)的基因片段合成4D5人源化变体8、赫赛汀(herceptin)V基因。表2中提供了合成的序列。
表2：赫赛汀V序列
如上文所述，对于重链使用EcoRI和NheI消化物和对于轻链多肽使用EcoRI和BsiWI消化物将片段克隆到提及的恒定区pTT5载体中。
为了对轻链多肽添加(GGGSC)x延伸，其中x是添加的重复的数目，设计3’端引物，并且从Eurofins MWG Operon订购，具有表3中显示的期望的序列。在PCR反应中使用先前描述的赫赛汀VK构建体作为模板进行标准的克隆方案。为了产生4半胱氨酸构建体，采用两步重叠方法，其中在第一PCR中使用引物Igk_rev_3_cys，接着使用引物Igk_rev_4_cys_Bam和来自第一PCR的PCR产物作为模板进行扩增。所有反应中使用的5’引物是pTT5_for(表3)。如上文描述，消化、克隆并分析PCR片段。
表3：用于对轻链多肽C端添加半胱氨酸的克隆引物
实施例2：抗体产生和纯化
进行上文实施例1中产生的质粒的Qiagen大量制备(maxiprep)以分离转染就绪质粒。使用293 fectin(Invitrogen)，用赫赛汀重链和赫赛汀轻链-cys构建体共转染HEK293细胞。在补充有0.1％Pluronic F68(Gibco)溶液的Freestyle 293表达培养基(Gibco)中培养细胞5天。在转染后24小时，给细胞补充0,5％胰蛋白胨。收集上清液，并且使用蛋白A琼脂糖批次重力方案(GEHealthcare)纯化分泌性抗体，接着使用具有30kDa MW截留(Millipore)的 Ultra 15滤器将缓冲液更换成PBS PH 7.4。
实施例3：赫赛汀-VLCysX二硫键的还原
将PBS中的赫赛汀和赫赛汀-VLCysX(X＝1、2或4)的样品(1-5mg)应用于用100mM磷酸盐、50mM NaCl、2mM DTPA，pH 6.1预处理的ZebaTM旋转柱(Pierce，目录编号87767)，并且根据制造商的说明书更换缓冲液。使用赫赛汀作为标准品以建立蛋白质浓度，并且用埃尔曼(Ellman)试剂使用半胱氨酸作为标准品以建立游离硫醇基团的缺乏，使用双金鸡宁酸测定法(Pierce,#23225)测定洗脱液。
赫赛汀或赫赛汀VLCysX(在100mM磷酸盐、50mM NaCl、2mM DTPA，pH 6.1中的5-30μM)通过添加来自相同缓冲液中的1.0M储液的盐酸半胱胺(5至10mM)，并且在室温或37℃孵育40-180分钟还原。在冷冻到室温后，通过在用100mM磷酸盐、50mM NaCl、2mM DTPA，pH 6.1预处理的ZebaTM旋转柱(40KDa MWCO)上通过从反应混合物除去半胱胺。为了确保已经除去过量的半胱胺，采用通过半胱胺连续稀释的测定法产生的标准曲线，用埃尔曼试剂测定洗脱液。此种测定法还提供了每个蛋白质的平均硫醇含量的一些测量。
实施例4：赫赛汀-VLCysX与细胞毒剂的缀合
在冰上冷却来自上文实施例3的洗脱液后，从10mM DMSO储备溶液中添加马来酰亚胺毒素(毒素1或毒素2)(一般每个硫醇2.0个当量，对被还原的赫赛汀对照(赫赛汀-毒素2)添加相等量)。让缀合反应在冰上进行介于30和70分钟之间，之后纯化并将缓冲液更换成20mM柠檬酸钠，pH 5.5。将纯化的缀合物无菌过滤( 0.22um离心滤器，#8161)，并使用BCA试剂测定总蛋白质含量。
如本文中使用，“毒素1”是MC-vc-PABC-毒素，其中毒素是(S,E)-N-(4-(氨基甲基)苄基磺酰基)-2,5-二甲基-4-((S)-N,3,3-三甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-3-苯基丁酰胺基)丁酰胺基)己-2-烯酰胺。
如本文中使用，“毒素2”是MC-vc-毒素，其中毒素是(S,E)-N-(4-氨基苄基磺酰基)-2,5-二甲基-4-((S)-N,3,3-三甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-3-苯基丁酰胺基)丁酰胺基)己-2-烯酰胺。
如本文中使用，“毒素3”是MT-vc-毒素，其中毒素是(S,E)-N-(4-氨基苯基磺酰基)-2,5-二甲基-4-((S)-N,3,3-三甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-3-苯基丁酰胺基)丁酰胺基)己-2-烯酰胺。
如本文中使用，“毒素4”是MP(T-vc-毒素)2，其中毒素是(S,E)-N-(4-氨基苯基磺酰基)-2,5-二甲基-4-((S)-N,3,3-三甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-3-苯基丁酰胺基)丁酰胺基)己-2-烯酰胺。
如本文中使用，“毒素5”是MT-vc-PABC-毒素，其中毒素是(S,E)-N-(4-(氨基甲基)苄基磺酰基)-2,5-二甲基-4-((S)-N,3,3-三甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-3-苯基丁酰胺基)丁酰胺基)己-2-烯酰胺。
如本文中使用，“毒素6”是MT-vc-毒素，其中毒素是：
实施例5：测试赫赛汀VLCysX对癌细胞存活力的影响
针对Her2阳性人乳腺癌细胞系HCC1954，在不同浓度时测试上文实施例4中产生的抗体药物缀合物。在添加化合物前一天，使用完全生长培养基，以2500个细胞/100μL培养基的密度将HCC1954细胞(100μL)添加到不透明壁的清晰底部的经组织培养处理的96孔微量滴定板。在37℃/5％CO2将HCC1954细胞孵育1晚，以使细胞附着于微量滴定板表面。在完全生长培养基中以期望的最大终浓度的5倍稀释抗体药物缀合物，然后在相同培养基中以1:3将化合物滴定8步。在每个微量滴定板上包含无化合物的对照(仅生长培养基)，一式六份。将制备的化合物滴定物一式三份添加(25μL/孔)到HCC1954细胞。在37℃/5％CO2将细胞和化合物滴定物孵育3或5晚。在孵育后，通过将30μL制备的添加到每个测定孔，使用试剂测量细胞存活力。将混合物孵育最少20分钟，之后在使用微板发光计测量发光(500ms积分时间)。使用上文提及的仅生长培养基的对照，将收集的相对发光单位(RLU)转化成％细胞毒性(％细胞毒性＝1-[孔RLU/仅培养基的对照的平均RLU])。使用Prism Graph Pad软件可用的非线性回归方法将数据拟合到曲线。图3中提供了显示来自此研究的数据的图。表4中显示了Her-VLCys2-毒素2、Her-VLCys1-毒素1和赫赛汀-毒素2的EC50值。
表4：Her-VLCys2-毒素、Her-VLCys1-毒素和赫赛汀-毒素的EC50值
EC50(nM)
Her-VLCys2-毒素2 0.04
Her-VLCys1-毒素1 0.12
赫赛汀-毒素2 22.68
实施例6：克隆编码另外的抗体的核酸，所述抗体具有含有半胱氨酸的C端轻链多 肽延伸
为了产生另外的轻链延伸，以期望的序列订购来自的合成的基因片段，并且使用Gibson装配克隆试剂盒(New England Biolabs)以符合读码框的方式克隆到赫赛汀VK中。如上文在实施例1中所述，确认并分析所有克隆。
下文表5中提供了轻链氨基酸序列和编码轻链氨基酸序列的核酸序列。
表5：关于另外的抗体轻链的氨基酸序列，和编码该氨基酸序列的核酸序列
实施例7：抗体产生和纯化
进行实施例6中产生的克隆的Qiagen大量制备以分离转染就绪质粒。使用293fectin(Invitrogen)，用赫赛汀重链和赫赛汀轻链-cys构建体共转染HEK293细胞。在补充有0.1％Pluronic F68(Gibco)溶液的Freestyle 293表达培养基(Gibco)中培养细胞5天。在转染后24小时，给细胞补充0.5％胰蛋白胨。收集上清液，并且使用仪器和HiTrap Mab Select SuRe柱(目录编号11-0034-93)从上清液中纯化分泌性抗体，接着使用具有30kDa MW截留(Millipore)的 Ultra 15滤器将缓冲液更换成PBS PH 7.4。
实施例8：双重还原和缀合
通过添加来自2.5mM，pH 6.7储备溶液的1.25mM在PBS中的二乙烯三胺五乙酸盐(DTPA)，接着添加来自1.0M储液的盐酸半胱胺(终浓度1mM)还原赫赛汀VLSpacerX(PBS中的30μM)。在37℃孵育样品120分钟。在冷却到室温后，通过在用PBS+1mM DTPA pH7.3预处理的ZebaTM旋转柱(40KDa MWCO)上通过从反应混合物除去半胱胺。
在冷却洗脱液后，从10mM DMSO储备溶液添加马来酰亚胺毒素(毒素1、毒素3或毒素4)(基于抗体浓度，一般为5.0个当量，对被还原的赫赛汀对照添加相等量)。使缀合反应在冰上进行介于30和70分钟之间，之后在用PBS预处理的ZebaTM旋转柱(40KDa MWCO)上通过。
为了实现较高的药物负载，使用缀合的材料作为起始材料重复上文描述的还原和缀合方案。
实施例9：制备轻链延伸抗体以通过还原和再氧化缀合
在37℃在PBS和1mM DTPA中以抗体终浓度2.5mg/mL用约12倍的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)还原全长轻链延伸单克隆抗体达2小时。将被还原的轻链延伸抗体负载到ZebaTM旋转脱盐柱，40K MWCO，并用PBS洗脱。在室温用10个当量的10mM在PBS中的去氢抗坏血酸(DHAA)处理洗脱的被还原的抗体达30分钟。
实施例10：缀合轻链延伸抗体
相对于抗体以3.5摩尔当量组合来自实施例9的再氧化的抗体，混合，并且于室温竖立约1小时以实现缀合并且形成轻链延伸抗体-药物缀合物(ADC)，包括Tsp2-毒素3、Tsp3-毒素3、Tsp4-毒素3、Tsp5-毒素3、Tsp6-毒素3、Tsp9-毒素3、Tsp10-毒素3、Tsp10-毒素4、Tsp10-毒素1、Tsp 11-毒素3、TVLCys1-毒素3(DAR 1.06)、Bsp10-毒素3、Bsp10-毒素4、Bsp10-毒素1、Bsp10-毒素6和Bsp10-MC-vc-PABC-MMAE。将缀合混合物负载到ZebaTM旋转脱盐柱，40K MWCO，并且用PBS洗脱。
实施例11：抗体结合测定
将HER2表达性MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶处理并计数，并且在4℃在50μl总体积中将每个样品50,000个细胞与未缀合的MAb或与缀合的ADC孵育24小时。在补充有10％胎牛血清的Leibovitz L15培养基中以20000、4000、800、160、32、6.4、1.28和0.256ng/ml应用抗体。在孵育后，在冰冷的PBS+1％FBS中清洗细胞两次，并且与Alexa 647标记的山羊抗人IgGFc(2ug/mL)二抗+2.5ug/mL 7-氨基放线菌素D一起孵育。将细胞孵育30分钟，并且清洗两次，在50μl PBS+1％FBS中重悬，并且通过流式细胞术分析。未缀合的抗体的结合结果显示于图4(小图A和B)，而ADC的结合结果显示于图5(小图A和B)。“TSP2”是具有SEQ ID NO:105的轻链多肽的抗体。“TSP3”是具有SEQ ID NO:106的轻链多肽的抗体。“TSP4”是具有SEQID NO:107的轻链多肽的抗体。“TSP5”是具有SEQ ID NO:108的轻链多肽的抗体。“TSP6”是具有SEQ ID NO:109的轻链多肽的抗体。“TSP9”是具有SEQ ID NO:112的轻链多肽的抗体。“TSP10”是具有SEQ ID NO:113的轻链多肽的抗体。“TSP11”是具有SEQ ID NO:114的轻链多肽的抗体。VLcys1是具有C端轻链延伸GGGSC(SEQ ID NO:60)的曲妥珠单抗。
实施例12：差示扫描量热法(DSC)
对样品：PBS pH 7.4中的具有延伸10的曲妥珠单抗(TSP10)和曲妥珠单抗(T)进行差示扫描量热法(DSC)实验。在DSC池中负载样品前，在室温平衡样品，用缓冲液稀释，并且在真空下在搅拌情况下脱气8分钟。使用VPCapillary-DSC，MicroCal以60℃/h的扫描速率从10至100℃扫描样品。参照细胞含有PBS缓冲液。图6中显示了结果。
实施例13：ALEXA488缀合
使用上文描述的还原/缀合方法将5-马来酰亚胺基-Alexa488与MAb缀合。以从PBS中的100μg/ml起1:15至1:40的稀释度使用样品，并且在每泳道中负载20μl，通过SDS PAGE分析抗体。使用测量Alexa488的荧光的Typhoon TrioTM成像仪(GE Healthcare LifeSciences)成像凝胶。图7中显示了结果。
实施例14：体内研究方案
用总体积100μl中的与基质胶以1:1混合的5*106个NCI-N87肿瘤细胞(ATCC目录编号CRL-5822)接种7-8周龄雌性NOD/SCID γ(NSG)小鼠(Jackson)。每个星期一、星期三和星期五测量肿瘤。一旦肿瘤达到150-200mm3的大小，将动物分配到如下文表6中显示的处理组，以平衡组间的平均肿瘤大小。“T”是曲妥珠单抗的缩写。
表6：体内研究组
组# 组名称 剂量(mg/kg) DAR
1 媒介物 N/A N/A
2 TSP6-毒素3 12 1.8
3 TSP4-毒素3 12 2.06
4 TSP 10-毒素4 12 1.66
5 TSP 10-毒素1 12 2.04
6 TSP 10-毒素3 12 2.12
7 TSP10 12 N/A
以表6中指定的浓度以单次静脉内注射将动物用其各自的测试品处理，并且每个星期一、星期三和星期五继续肿瘤测量，直到60天为止或者直至肿瘤大小达到800mm3。所有动物接受注射记录中指定的剂量。使用注射后临床观察记录(PICOR)表监测注射后的急性毒性。在任何组中没有观察到显著的体重减轻，并且在PICOR文件中没有记录注射后的急性毒性响应。图8中显示了体内研究的结果。
实施例15：通过疏水性相互作用层析(HIC)分析抗体-药物缀合物
使用TSKgel丁基-NPR柱(2.5uM,4.6mm x 3.5cm)，以280nm在具有DAD的HP 1100系列HPLC上实施抗体药物缀合物的HIC分析。在12分钟内以1mL/min从95％至5％流动相A的线性梯度及再平衡回到95％A达3分钟运行方法(A：1.5M硫酸铵和25mM磷酸二氢钠，pH 4.4；B：25mM磷酸钠中的25％IPA，pH 4.73)。使用Chemstation软件进行数据收集、分析和峰面积量化。图20-41中显示了结果。
实施例16：通过天然大小排阻层析分析抗体和抗体-药物缀合物
使用AcquityUPLC BEH 200SEC柱(1.7uM,4.6mmx 150cm)，以280nm在具有DAD的HP1100系列HPLC上实施重组抗体和抗体药物缀合物的非变性SEC分析。用25mM磷酸钠和150mM氯化钠缓冲液，pH 6.8以0.2mL/min在20分钟内使用等度洗脱进行分析。使用Chemstation软件进行数据收集、分析和峰面积量化。
制备PBS，pH 7中的Tsp10、Tsp10-毒素3、Tsp10-毒素1,Tsp10-毒素4、TSp6-毒素3、TSp4-毒素3的1mg/mL溶液的单独的等分试样。在孵育前的时间0时在37℃以10μL的注射体积进行非变性SEC-UV分析(先前描述)。在孵育191小时后以及在孵育330小时后通过非变性SEC-UV分析每个样品的等分试样。每个种类的百分比单体峰面积相对于其各自的0时间点测量调节。
对于曲妥珠单抗对照，99.36％蛋白质样品为单体状态，而一个不同的聚集体种类以0.63％存在。对于T-VLCys1，98.39％的蛋白质样品为单体状态，而其它聚集体种类以1.16％、0.266％和0.175％存在。对于T-SP2，96.5％的蛋白质样品为单体状态，而两种不同的聚集体种类以0.3％、1.5％和1.8％存在。对于T-SP3，98.5％的蛋白质为单体状态，而两种不同聚集体种类以1.17％和0.35％存在。对于T-SP4，98％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以1.4％、0.39％和0.22％存在。对于T-SP5，94％的蛋白质样品为单体状态，而两种不同聚集体种类以2.1％和3.2％存在。对于T-SP6，89％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以1.5％和8.8％存在。对于T-SP7，95.95％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以3％、0.51％和0.50％存在。对于T-SP9，94.5％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以0.6％、3.8％和1％存在。对于T-SP10，97.3％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以2.2％、0.27％和0.22％存在。对于T-SP-11，77.7％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以6.3％、8.6％、2.7％和4.5％存在。对于T-SP12，87.5％的蛋白质样品为单体状态，而其它不同聚集体种类以2.2％、1.6％、8.6％和4.5％存在。
实施例17：通过大小排阻层析-完整质量分析抗体和抗体-药物缀合物
利用Acquity UPLC BEH 200SEC柱(1.7uM,4.6mm x 150cm)，以280nm在具有PDA检测的Waters Acquity H Class UPLC上进行用于重组抗体和抗体药物缀合物的完整质量分析的变性SEC-高分辨率质谱术(HRMS)。使用具有250-4900m/z的扫描范围的MicroMass Q-TOF Premier实现高分辨率质谱术检测。用70/30H20/具有0.1％TFA和0.1％FA的CAN，在11分钟内以0.25ml/min使用等度洗脱进行分析。用MassLynx 4.1完成数据收集和分析，用MaxEnt1使谱解卷积。
在图9，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:60的延伸的抗体(T-VLcys1)的结果。在图10，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:63的延伸的抗体(T-VLcys2)的结果。在图11，小图A和B中显示了具有SEQ ID NO:64的延伸的抗体(T-VLcys4)的结果。在图12，小图A和B中显示了具有SEQ ID NO:105的轻链的抗体的结果。在图13，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:106的轻链的抗体的结果。在图14，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:107的轻链的抗体的结果。在图15，小图A和B中显示了具有SEQ ID NO:108的轻链的抗体的结果。在图16，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:109的轻链的抗体的结果。在图17，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:110的轻链的抗体的结果。在图18，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:113的轻链的抗体的结果。在图19，小图A-C中显示了具有SEQ ID NO:114的轻链的抗体的结果。
实施例18：体外细胞增殖测定法
通过用各种基于曲妥珠单抗(“T”)的ADC和对照处理HER2表达性HCC1954细胞、HER2表达性N87细胞和HER2抗原阴性Jurkat细胞，使用与上文的实施例5中描述的方案相似的方案进行体外细胞增殖测定法。“游离的毒素1”是其游离形式(即不与抗体缀合)的如上文定义的毒素3。结果显示于图42-53中并且在下文汇总于表7和8中。
表7：体外细胞增殖测定结果(HCC1954和Jurkat细胞)
表8：体外细胞增殖测定结果(N87细胞)
还通过用各种基于布妥昔单抗(“B”)的ADC和对照处理CD30抗原阳性Karpas 299细胞进行体外细胞增殖测定法。结果显示于图54-58中并且在下文汇总于表9中。
表9：体外细胞增殖测定结果(Karpas 299细胞)
实施例19：曲妥珠单抗C端轻链延伸变体的变性PAGE
将曲妥珠单抗轻链延伸变体在固定的蛋白A上纯化，并且进行非还原性变性或还原性(+DTT)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。图59-62中显示了结果。
实施例20：缀合物稳定性
使用热稳定性测定法评估ADC稳定性。制备PBS，pH 7中的Tsp10、Tsp10-毒素3、Tsp10-毒素1、Tsp10-毒素4、TSp6-毒素3、TSp9-毒素3的1mg/mL溶液的单独的等分试样。在孵育前的时间0时在37℃以10μL的注射体积进行非变性SEC-UV分析(先前描述)。在孵育191小时后以及在孵育330小时后通过非变性SEC-UV分析每个样品的等分试样。每个种类的百分比单体峰面积相对于其各自的0时间点测量调节。图63，小图A和B中显示了结果。
虽然已通过举例说明和实例出于清晰理解的目的比较详细地描述了前述发明，但是按照本发明的教导对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神和范围的情况下可对本发明作出某些变化和修改。
因此，前文仅仅阐述了本发明的原理。应当理解，本领域的技术人员将能够设想出虽然本文未明确描述或示出但体现本发明原理并包括在其精神和范围内的各种安排。此外，本文详述的所有实例和条件语言主要是为了有助于读者理解本发明的原理以及使发明人贡献的概念促进本领域的发展，并且应当视为对此类具体详述的实例和条件没有限制。此外，本文详述本发明原理、方面和实施方案及其具体实例时的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物两者。另外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物以及将来开发的等同物，即，执行相同功能的所开发的任何要素，而无论结构如何。本发明的范围因此不旨在限于本文所示和所述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。

Claims (78)

1.一种包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，其中所述C端氨基酸延伸不特异性结合抗原。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述C端氨基酸延伸包含氨基酸间隔区，所述氨基酸间隔区不包含半胱氨酸残基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述间隔区包含1至30个氨基酸。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述间隔区包含3至20个氨基酸。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中所述间隔区包含4至17个氨基酸。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的抗体，其中所述间隔区包含甘氨酸(G)残基和丝氨酸(S)残基。
7.根据权利要求2至5中任一项所述的抗体，其中所述间隔区由a)一个或多个甘氨酸(G)残基和b)一个或多个丝氨酸(S)残基组成。
8.根据权利要求2至5中任一项所述的抗体，其中所述间隔区包含序列GGGS。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的抗体，其中所述C端氨基酸延伸包含2至10个间隔区。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述间隔区具有相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的抗体，其中所述间隔区中的至少两个的氨基酸序列是不同的。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的抗体，其中半胱氨酸存在于所述间隔区的每个之间。
13.根据权利要求9至11中任一项所述的抗体，其中所述间隔区中的至少两个是连续的。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中所述延伸包含人氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述人氨基酸序列包含人抗体铰链区或T细胞受体铰链区的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述半胱氨酸包含被还原的巯基基团。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其包含经由所述C端氨基酸延伸的所述半胱氨酸残基与所述抗体缀合的试剂。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述试剂经由接头与所述半胱氨酸残基缀合。
19.根据权利要求17或18所述的抗体，其中所述试剂是治疗剂。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中所述治疗剂是细胞毒剂。
21.根据权利要求17或18所述的抗体，其中所述试剂是标记剂。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中所述标记剂是体内成像剂。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体不包含与除了所述C端氨基酸延伸的所述半胱氨酸残基外的半胱氨酸缀合的试剂。
24.根据权利要求17至22中任一项所述的抗体，其中所述C端氨基酸延伸包含两个或更多个半胱氨酸，并且其中所述两个或更多个半胱氨酸中的至少两个与试剂缀合，所述试剂独立选自治疗剂和标记剂。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的抗体或其结合片段：IgG、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、ScFv和双特异性抗体。
26.一种缀合物，其包含：
包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸；和
试剂，所述试剂经由所述C端氨基酸延伸的所述半胱氨酸残基与所述抗体缀合。
27.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述试剂经由接头与所述半胱氨酸残基缀合。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的缀合物，其中所述C端氨基酸延伸包含氨基酸间隔区，所述氨基酸间隔区不包含半胱氨酸残基。
29.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述间隔区包含1至30个氨基酸。
30.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述间隔区包含3至20个氨基酸。
31.根据权利要求28所述的缀合物，其中所述间隔区包含4至17个氨基酸。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的缀合物，其中所述间隔区包含甘氨酸(G)残基和丝氨酸(S)残基。
33.根据权利要求28至31中任一项所述的缀合物，其中所述间隔区由一个或多个甘氨酸(G)残基和一个或多个丝氨酸(S)残基组成。
34.根据权利要求28至31中任一项所述的缀合物，其中所述间隔区具有序列GGGS。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的缀合物，其中所述C端氨基酸延伸包含2至10个间隔区。
36.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述间隔区具有相同的氨基酸序列。
37.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述间隔区中的至少两个的氨基酸序列是不同的。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的缀合物，其中半胱氨酸存在于所述间隔区的每个之间。
39.根据权利要求35至37中任一项所述的缀合物，其中所述间隔区中的至少两个是连续的。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的缀合物，其中所述延伸包含人氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的缀合物，其中所述人氨基酸序列包含人抗体铰链区或T细胞受体铰链区的氨基酸序列。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的缀合物，其中所述半胱氨酸包含被还原的巯基基团。
43.根据权利要求26至42中任一项所述的缀合物，其中所述试剂是治疗剂。
44.根据权利要求43所述的缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒剂。
45.根据权利要求26至42中任一项所述的缀合物，其中所述试剂是标记剂。
46.根据权利要求45所述的缀合物，其中所述标记剂是体内成像剂。
47.根据权利要求26至46中任一项所述的缀合物，其中所述抗体不包含与除了所述C端氨基酸延伸的半胱氨酸残基外的半胱氨酸缀合的试剂。
48.根据权利要求26至47中任一项所述的缀合物，其中所述C端氨基酸延伸包含两个或更多个半胱氨酸，并且其中所述两个或更多个半胱氨酸中的至少两个与试剂缀合，所述试剂独立选自治疗剂和标记剂。
49.根据权利要求26至48中任一项所述的缀合物，其中所述抗体是选自以下的抗体或其结合片段：IgG、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、ScFv和双特异性抗体。
50.一种核酸，其编码抗体轻链多肽，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。
51.根据权利要求50所述的核酸，其中所述C端氨基酸延伸包含氨基酸间隔区，所述氨基酸间隔区不包含半胱氨酸残基。
52.根据权利要求51所述的核酸，其中所述间隔区包含1至30个氨基酸。
53.根据权利要求52所述的核酸，其中所述间隔区包含3至20个氨基酸。
54.根据权利要求53所述的核酸，其中所述间隔区包含4至17个氨基酸。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的核酸，其中所述间隔区包含甘氨酸(G)残基和丝氨酸(S)残基。
56.根据权利要求51至54中任一项所述的核酸，其中所述间隔区由一个或多个甘氨酸(G)残基和一个或多个丝氨酸(S)残基组成。
57.根据权利要求51至54中任一项所述的核酸，其中所述间隔区具有序列GGGS。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的核酸，其中所述C端氨基酸延伸包含2至10个间隔区。
59.根据权利要求58所述的核酸，其中所述间隔区具有相同的氨基酸序列。
60.根据权利要求50至59中任一项所述的核酸，其中所述延伸包含人氨基酸序列。
61.根据权利要求60所述的核酸，其中所述人氨基酸序列包含人抗体铰链区的氨基酸序列。
62.根据权利要求58所述的核酸，其中所述间隔区中的至少两个的氨基酸序列是不同的。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的核酸，其中半胱氨酸存在于所述间隔区的每个之间。
64.根据权利要求58至62中任一项所述的核酸，其中所述间隔区中的至少两个是连续的。
65.根据权利要求50至64中任一项所述的核酸，其中所述抗体是选自以下的抗体或其结合片段：IgG、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、ScFv和双特异性抗体。
66.一种载体，其包含根据权利要求50至65中任一项所述的核酸。
67.一种宿主细胞，其包含根据权利要求50至65中任一项所述的核酸或根据权利要求66所述的载体。
68.根据权利要求67所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
69.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求1至25中任一项所述的抗体或根据权利要求26至49中任一项所述的缀合物；和
药学上可接受的赋形剂。
70.一种方法，其包括对有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至25中任一项所述的抗体、根据权利要求26至49中任一项所述的缀合物或根据权利要求69所述的药物组合物。
71.一种制备抗体轻链的方法，其包括：
在宿主细胞中表达编码抗体轻链多肽的核酸，所述抗体轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述方法进一步包括还原所述C端氨基酸延伸中的所述半胱氨酸的巯基基团。
73.一种制备抗体缀合物的方法，其包括：
缀合试剂与包含轻链多肽的抗体，所述轻链多肽包含含有半胱氨酸残基的C端氨基酸延伸，其中所述试剂与所述C端氨基酸延伸的所述半胱氨酸残基缀合。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述方法进一步包括在缀合所述试剂与所述抗体前还原所述C端氨基酸延伸中的所述半胱氨酸的巯基基团。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述还原包括比不在所述C端氨基酸延伸中的半胱氨酸优先还原所述C端氨基酸延伸中的一个或多个半胱氨酸。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述还原包括还原所述C端氨基酸延伸中的一个或多个半胱氨酸，并且不还原不在所述C端氨基酸延伸中的任何半胱氨酸。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述缀合包括使用马来酰亚胺反应化学、卤代乙酰基反应化学、乙烯基砜反应化学或吡啶基二硫化物反应化学交联所述试剂与所述被还原的巯基基团。
78.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述试剂是治疗剂或标记剂。
CN201480075958.5A 2013-12-23 2014-12-23 包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法 Pending CN106459981A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920425P 2013-12-23 2013-12-23
US61/920425 2013-12-23
PCT/CA2014/051263 WO2015095972A1 (en) 2013-12-23 2014-12-23 Antibodies comprising c-terminal light chain polypeptide extensions and conjugates and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106459981A true CN106459981A (zh) 2017-02-22

Family

ID=53477259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480075958.5A Pending CN106459981A (zh) 2013-12-23 2014-12-23 包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11208497B2 (zh)
EP (1) EP3087185A4 (zh)
JP (1) JP6585600B2 (zh)
KR (1) KR20160122127A (zh)
CN (1) CN106459981A (zh)
AU (1) AU2014373593B2 (zh)
BR (1) BR112016014913A8 (zh)
CA (1) CA2934818C (zh)
IL (1) IL246371A0 (zh)
MX (1) MX2016008355A (zh)
RU (1) RU2016129724A (zh)
SG (1) SG11201605093VA (zh)
WO (1) WO2015095972A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3134115A4 (en) 2014-04-25 2017-10-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for treating metastatic breast cancer and other cancers in the brain
WO2018071913A2 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modular tetrameric bispecific antibody platform
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN111093710A (zh) 2017-07-13 2020-05-01 希望之城 硫代磷酸酯缀合的肽及其使用方法
WO2019014650A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 City Of Hope ANTICANCER CONJUGATES OF PEPTIDE COUPLED WITH PHOSPHOROTHIOATE AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019051308A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD16 BINDING PROTEINS AND ANTIGEN ASSOCIATED WITH A TUMOR
US11884733B2 (en) 2018-02-08 2024-01-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
MX2020011529A (es) * 2018-05-01 2021-01-29 Ambrx Inc Un metodo para optimizar la expresion de anticuerpos.
WO2020112588A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibody comprising a glutamine-containing light chain c-terminal extension, conjugates thereof, and methods and uses
CN117164701A (zh) * 2022-12-27 2023-12-05 优洛生物(上海)有限公司 一种经改造的抗体、其制备方法及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165476A (en) * 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
US20090068202A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-12 Genentech, Inc. Humanized Anti-CD79B Antibodies and Immunoconjugates and Methods of Use
WO2010108153A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2170589C2 (ru) 1992-10-28 2001-07-20 Генентек Инк. Композиция для ингибирования ангиогенеза, моноклональное антитело, полипептид, способ ингибирования роста опухоли (варианты)
ATE367827T1 (de) * 1992-11-16 2007-08-15 Centocor Inc Verfahren zur reduzierung der immunogenizität der variablen regionen von antikörpern
US20050159343A1 (en) 1999-03-26 2005-07-21 Board Of Regents, University Of Texas System Inhibitors of glycosaminoglycans
US20030161809A1 (en) 2000-10-02 2003-08-28 Houston L. L. Compositions and methods for the transport of biologically active agents across cellular barriers
US7834258B2 (en) * 2003-06-30 2010-11-16 Mu-Hyeon Choe Dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same
WO2007103288A2 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibody drug conjugates
KR101571027B1 (ko) * 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
EP2069401A4 (en) 2007-07-31 2011-02-23 Medimmune Llc MULTISPECIENT EPITOP BINDING PROTEINS AND THEIR USE
WO2009026274A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
CN104650235A (zh) * 2007-11-30 2015-05-27 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
US8454960B2 (en) * 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
GEP20156390B (en) 2008-01-03 2015-11-10 Scripps Research Inst Antibody targeting through a modular recognition domain
EA032828B1 (ru) * 2008-10-10 2019-07-31 Аптево Рисёрч Энд Девелопмент Ллс Иммунотерапевтические средства против комплекса tcr
JP6105477B2 (ja) * 2010-11-05 2017-03-29 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 操作されたポリペプチドコンジュゲートおよびトランスグルタミナーゼを用いてそれを作製する方法
SG194875A1 (en) * 2011-05-08 2013-12-30 Legochem Biosciences Inc Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
CA2837169C (en) 2011-05-24 2021-11-09 Zyngenia, Inc. Multispecific complexes comprising angiopoietin-2-binding peptide and their uses
US20130011394A1 (en) * 2011-06-22 2013-01-10 Hoffmann-La Roche Inc. Complexes comprising mhc class i fusion polypeptides and antigen-specific antibodies and methods of use
CA2854806A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
WO2013096829A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Arizona Biomedical Research Commission Activation of cellular assault processes in the treatment of glioblastoma multiforme
JP6415987B2 (ja) * 2012-03-02 2018-10-31 アブリンクス エン．ヴェー． シュードモナス・エルギノーサのＰｃｒＶに結合する単一可変ドメイン抗体
MX2015007931A (es) 2012-12-18 2015-10-05 Novartis Ag Composiciones y metodos que utilizan una etiqueta de peptido que se une a hialuronano.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165476A (en) * 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
US20090068202A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-12 Genentech, Inc. Humanized Anti-CD79B Antibodies and Immunoconjugates and Methods of Use
WO2010108153A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOLDMACHER, V.S. ET AL: "Antibody-drug conjugates: using monoclonal antibodies for delivery of cytotoxic payloads to cancer cells", 《THERAPEUTIC DELIVERY》 *
ORCUTT, K.D. ET AL: "A modular IgG-scFv bispecific antibody topology", 《PROTEIN ENGINEERING》 *
STROP, S. ET AL.: "Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates", 《CHEMISTRY AND BIOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016008355A (es) 2016-10-28
EP3087185A1 (en) 2016-11-02
JP6585600B2 (ja) 2019-10-02
JP2017501728A (ja) 2017-01-19
SG11201605093VA (en) 2016-07-28
US11208497B2 (en) 2021-12-28
CA2934818A1 (en) 2015-07-02
KR20160122127A (ko) 2016-10-21
RU2016129724A3 (zh) 2018-10-18
CA2934818C (en) 2022-05-17
WO2015095972A1 (en) 2015-07-02
AU2014373593A1 (en) 2016-07-14
IL246371A0 (en) 2016-08-31
BR112016014913A2 (zh) 2017-08-08
BR112016014913A8 (pt) 2020-06-09
US20170008970A1 (en) 2017-01-12
RU2016129724A (ru) 2018-01-30
EP3087185A4 (en) 2017-09-06
AU2014373593B2 (en) 2020-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106459981A (zh) 包含c端轻链多肽延伸的抗体和缀合物及其使用方法
US10960083B2 (en) Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
US10758556B2 (en) Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
WO2015165413A1 (zh) 一种新型的稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途
US11833222B2 (en) CL and/or CH1 mutated antibodies for drug conjugation
CN105899540A (zh) 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用
JP2021073279A (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌処置のためのアドレッシングビヒクルとしてのその使用
CN105873616A (zh) 共价连接的多肽毒素-抗体缀合物
US20180244789A1 (en) Anti-prlr antibody-drug conjugates (adc) and uses thereof
CN109496149A (zh) 抗体及其药物缀合物的制剂
Liu et al. High antitumor activity of Sortase A-generated anti-CD20 antibody fragment drug conjugates
JP7547205B2 (ja) 抗ｈｅｒ２バイパラトピック抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
CN106687476A (zh) 抗brdu抗体及使用方法
US12121527B2 (en) Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
WO2023141714A1 (en) Methods of using anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates in the treatment of cancer
WO2023178451A1 (en) Anti-folate receptor alpha antibodies and methods of use
AU2020369479A1 (en) Novel conjugation chemistry for catalytic antibody 38C2
EA040604B1 (ru) Конъюгаты, связывающие белок-лекарственное средство, содержащие производные антрациклина

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170222

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication