CN117164701A - 一种经改造的抗体、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种经改造的抗体、其制备方法及其用途、包含其的抗体药物偶联物或药物组合物，其中通过对所述抗体的轻链的C端氨基酸序列进行突变，能够明显提高抗体的被还原能力并改善抗体的还原分布，有助于制备具有更好的药效和更低的毒性的抗体药物偶联物。

Description

一种经改造的抗体、其制备方法及其用途

本申请是申请日为2022年12月27日、发明名称为“一种经改造的抗体、其制备方法及其用途”的申请号为202211680878.5的专利申请的分案申请。

技术领域

本申请属于免疫学领域，具体而言，本申请涉及一种经改造的抗体、其制备方法及其用途、包含其的抗体药物偶联物或药物组合物。

背景技术

抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugates，ADC)是一类将具有生物学功能的分子、通常是具有细胞毒性的分子以化学键合的方式连接到抗体或抗体片段上而形成的药物。抗体药物偶联物是一类新型的靶向药物，该类药物利用抗体与抗原高特异性结合的性质将药物整体递送到病灶组织，并且通过一定的生物学机制对荷载药物(payload)进行释放，从而使荷载药物本身的生物活性得以发生。由于荷载药物已经相对稳定地连接在抗体上，一方面药物本身的系统性毒性得到了极大的降低，另一方面偶联药物的药代动力学和药物分布与具备生物活性的荷载药物有极大的差别。基于以上特征，抗体药物偶联物需要在保证不明显改变抗体本身性质的前提下，有效地把药物连接到抗体上，同时又保证药物在递送过程中的稳定性。

依照偶联方法，当前将药物偶联到抗体的方式可分为四类。第一类是利用赖氨酸残基上的氨基与连接子上的官能团进行反应，代表产品为已经上市的Mylotarg、Besponsa、Kadcyla、Elahere和Akalux。第二类是利用半胱氨酸残基上的巯基与连接子上的官能团进行反应，该半胱氨酸的来源有两种，一种是利用还原抗体的链间二硫键所得，代表产品为已经上市的Adcetris、Polivy、Padcev、Enhertu、Trodelvy、Blenrep、Tivdak、Zynlonta和爱地希；另一种则是对抗体进行点突变引入半胱氨酸，比如Genentech公司的Thiomab技术。第三类是对抗体进行点突变以引入非天然氨基酸，并利用非天然氨基酸残基上的官能团进行偶联，这个残基通常是酮基或者叠氮，比如由Ambrx公司开发的抗体偶联药物ARX788，然而，对抗体进行点突变一方面需要承担点突变带来的抗体不稳定的风险，另一方面通常会导致抗体生产的产率大幅下降，因此研发和生产成本相对来说都比较高。第四类则是利用酶反应将连接子-药物连接到抗体上，这类技术需要在抗体上具有酶识别位点(比如外加的肽段或者糖基)，用作酶的底物进行结合，这类技术比如NBE公司开发的SMAC技术，以及Synaffix公司开发的GlycoConnect技术，然而，这类技术需要进行额外的酶的生产和处理，另外通常偶联的工艺流程都会比较长，因此在生产成本上也会有较大的提高。综上，从技术实现难度和成本以及目前上市产品的数目来看，利用还原抗体链间二硫键以得到游离巯基以进行偶联的技术，目前仍是开发ADC的主流方式。

已知IgG1和IgG4抗体具有4对链间二硫键，还原链间二硫键最多可得到8个巯基，但是针对某些连接子-药物，将二硫键全部打开会导致偶联药物不稳定、药代动力学性质不佳和药效下降等问题(Nat Biotechnol.2015Jul；33(7):733-5)，因此针对不同的连接子-药物，药物偶联数量需要有不同的选择。

达到不同药物抗体比(DAR)的还原策略主要有两种，一种是平均还原两对二硫键以使平均每个抗体连接4个药物，另一种则是完全还原链间二硫键使每个抗体连接8个药物。前一种策略，需要比较严格地控制还原剂的用量，还原剂不够会导致还原的二硫键不够，从而导致最终药效不足，还原剂用量太大则导致过度还原，导致最终药物毒性增大，由于还原势能的存在，达到平均还原两对二硫键的目的所需要的还原剂如TCEP的用量通常会超过2个当量，尤其是对于IgG4抗体，通常需要相对比较剧烈的还原条件才可以达到目标还原量(参见例如US20220267467A1)。抗体的4对链间二硫键中有两对处于Hinge区，另外每个Fab区各贡献一对二硫键，打开不同位置的二硫键对于抗体药物偶联物的成药性也会产生影响，对于抗体药物偶联物，需要避免因药物距离太近而导致药物提前从抗体上掉落并产生毒性(参见例如US11173213B2)。另一方面，例如专利申请US20220267467A1也发现，对于IgG4这一类型的抗体，链间的四对二硫键并不对等，当使用大当量的TCEP将IgG4抗体平均打开两对二硫键时，体系中会留下大量的未被还原抗体，以及大量的链间二硫键全部被还原的抗体。通常对于ADC来讲，大量未被还原抗体的存在会影响到抗体将药物携带至靶细胞的效率，而二硫键全部被还原所得的ADC，则存在体内不稳定的特点，并且增加ADC毒性的同时，也降低了ADC的疗效。从这个方面来讲，利用部分还原IgG4抗体的链间二硫键来制备平均连接数为4的ADC可能是一个行不通的策略，因为大量未连接药物的抗体和连接过多药物的偶联物均会导致最终ADC的治疗窗口难以达到临床的需求。对于完全还原并形成8个游离巯基的策略，同样由于还原势能的存在，将二硫键全部打开需要的还原剂的量也会大大高于4个当量(参见例如US10195288B2)。由于常用的还原剂TCEP会和连接子反应，因此采用这种策略生产连接数为8的抗体药物偶联物时，连接子-药物的用量相应地也比较高，导致生产成本更高，同时更高当量药物的使用，可能导致抗体产生聚集以及可能发生连接子-药物与抗体进行非特异性偶联等风险。尤其是，对某些于还原势能较高的抗体，开发最终连接数为8的抗体药物偶联物对偶联工艺的挑战非常大，很可能最终做不到连接数为8。

因此，如何使还原抗体链间二硫键的操作变得更可控，包括控制还原的难易程度和还原二硫键的位置选择性，目前仍是开发此类抗体药物偶联物需要解决的问题。US11173213B2和US11478553B2分别从偶联工艺的角度提出了一些解决办法，但是它们涉及的工艺参数均非常苛刻，比如控温范围非常窄，或者共同影响因素过多，这些都对生产过程中的工艺控制提出了非常高的挑战。

发明内容

本申请的发明人注意到，抗体轻链C端的氨基酸与抗体被还原的能力相关，通过对抗体轻链C端的一个或多个氨基酸进行改造，能够使得经过轻链改造后的抗体(例如IgG1抗体或者IgG4抗体)具备更容易被还原剂打开抗体链间二硫键的性质，即，可以实现在更低还原剂用量、更温和的条件下打开适当量的抗体链间二硫键的效果，或者，可以实现在相同的还原条件下打开更多的链间二硫键的效果。同时，发明人还注意到，对抗体轻链C端的氨基酸进行改造还能够改变IgG4抗体的链间二硫键被还原时的优先级，由原来的铰链(Hinge)区二硫键优先被还原改变为Fab区和铰链区的二硫键享有基本相同的优先级。另外，在对抗体轻链C端的氨基酸进行改造后，对于还原IgG4抗体来说，还可以使得在平均打开两对二硫键时，遗留的完全未被还原的IgG4抗体和完全被还原的IgG4抗体的百分比大幅下降。

在一个方面，本申请提供了一种经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，包含其C端的氨基酸残基GEC被(X)_nC取代的轻链，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

或者，本申请提供一种经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，其中，所述经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段包括在亲本抗体的轻链的C端第1-3位氨基酸残基处进行的选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

另一方面，本申请提供了一种制备经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段的方法，包括：将亲本抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

或者，本申请提供了一种制备经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段的方法，包括：对亲本抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端第1-3位氨基酸残基进行选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

又一方面，本申请提供了一种改善抗体或其包含轻链的抗原结合片段被还原的能力的方法，包括：将所述抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

或者，本申请提供了一种改善抗体或其包含轻链的抗原结合片段被还原的能力的方法，包括：对所述抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端第1-3位氨基酸残基进行选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

又一方面，本申请提供了上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段在改善抗体药物偶联物的DAR比和/或药物分布中的用途。

或者，本申请提供了一种改善抗体药物偶联物的DAR比和/或药物分布的方法，包括：将上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段通过连接子与药物相连以形成抗体药物偶联物。

又一方面，本申请提供了一种抗体药物偶联物，包含上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段作为其抗体部分。

又一方面，本申请提供了一种药物组合物，包含上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段、或者上述的抗体药物偶联物。

有益效果

经过本申请改造的抗体(例如IgG1和IgG4抗体)可被更低当量的还原剂打开目标数量的链间二硫键，比如平均两对二硫键。尤其是对于IgG4抗体而言，经过轻链恒定区末端氨基酸改造后，还原剂的使用当量可大幅降低。上述变化带来的益处包括：一方面可以使还原和偶联的工艺更稳定、更好控制，另一方面可以减少还原剂本身对于连接子-药物的消耗量，从而降低连接子-药物的用量，节约生产成本。

经过本申请改造的IgG1和IgG4抗体由于具备更容易被还原的性质，使得还原反应的条件选择范围更大，比如可以采用更宽泛的pH值、更广的还原温度和更多的缓冲液配方。这种改变可以使得研究人员针对特定的抗体在进行制备工艺开发的时候更容易选择对抗体稳定性最有利的条件进行还原和偶联，以获得最稳定的工艺，从而降低后续商业化生产的风险。

经过本申请改造的IgG4抗体，当链间二硫键的目标还原数平均为两对时，相比未经改造的抗体，不仅还原剂的用量大幅下降，被还原的二硫键位置选择性也发生改变。未经改造的抗体具有大量的铰链区二硫键被优先还原，而经过改造的抗体二硫键的选择性更为随机。这种变化带来的效果是在进行偶联反应之后，药物在经过改造的抗体上的连接位置更为分散，更有利于药物在抗体上的稳定性，提高了抗体偶联药物的成药性。

经过本申请改造的IgG4抗体，当链间二硫键的目标还原数平均为两对时，相比未经改造的抗体，被还原的抗体的分布也有所改变。未经改造的IgG4抗体在平均打开两对二硫键时，遗留了大量的未被还原抗体，同时链间二硫键全部被打开的抗体比例也比较高，而将改造的轻链应用于IgG4抗体时，可以有效地降低未被还原抗体和完全被还原抗体的比例。这种变化带来的优势是使抗体还原的分布更为合理，采用这种还原产物制备得到的抗体药物偶联物具有更好的药效和更低的毒性。

因此，对于例如IgG1和IgG4这两种形式的抗体，在经过本申请的轻链改造后，抗体被还原剂(例如TCEP)还原的能力大幅提升，经改造的抗体可以在对抗体非常友好的缓冲液中以相对温和的条件被低当量的TCEP还原达到目标DAR值。尤其是，对于IgG4抗体，上述改造不仅提高了抗体的被还原能力，更是改变了由此得到的ADC中的各物种的含量分布。比如，采用原始序列的IgG4抗体制备平均DAR为4的ADC时，经常由于DAR为0和DAR为8的组分含量太高而无法在临床上使用，而采用本申请的改造后的IgG4抗体制备平均DAR为4的ADC，由于DAR不同的ADC分布更加合理，得到的ADC可以有效地在临床上应用。

附图说明

图1示出了抗体mAb13(轻链序列未改造)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图2示出了抗体mAb14(轻链末端序列包含GHC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图3分别示出了抗体mAb15(轻链末端序列包含GKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图(子图(a))以及抗体mAb38(轻链末端序列包含GSKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图(子图(b))。

图4示出了抗体mAb16(轻链末端序列包含GRC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图5示出了抗体mAb17(轻链末端序列包含GKSC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图6示出了抗体mAb22(轻链末端序列包含GSKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图7示出了抗体mAb31(轻链序列未改造)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图8示出了抗体mAb32(轻链末端序列包含GC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图9示出了抗体mAb33(轻链末端序列包含GHC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图10示出了抗体mAb34(轻链末端序列包含GKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图11示出了抗体mAb35(轻链末端序列包含GRC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图12示出了抗体mAb36(轻链末端序列包含KGKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图13示出了抗体mAb37(轻链末端序列包含GKSC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图14示出了抗体mAb38(轻链末端序列包含GSKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的反相高效液相色谱图。

图15示出了抗体mAb31(轻链序列未改造)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

图16示出了抗体mAb32(轻链末端序列包含GC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图

图17示出了抗体mAb33(轻链末端序列包含GHC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

图18示出了抗体mAb34(轻链末端序列包含GKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

图19示出了抗体mAb35(轻链末端序列包含GRC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

图20示出了抗体mAb36(轻链末端序列包含KGKC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

图21示出了抗体mAb37(轻链末端序列包含GKSC)经过还原并与vcMMAE偶联之后的疏水相互作用力高效液相色谱图。

具体实施方式

本领域已知的是，还原抗体的链间二硫键并保留抗体链内二硫键需要采用中等还原剂(如TCEP)并采取相对温和的还原条件。由于二硫键还原势能的存在，通常还原剂并不能在反应中被耗尽，因此通常针对不同的抗体，需要在前期进行实验探索，以找到最佳的反应缓冲液和还原剂/抗体比的组合。为了得到平均连接数为4的抗体药物偶联物，在选定其他反应条件之后，需要对还原剂和抗体的比例进行控制，尤其是对于一些敏感抗体来说，还原剂用量过多引起平均连接数偏大，而还原剂用量不够则会使平均连接的药物数不达标。

此外，还原势能的存在一方面使打开所有抗体链间二硫键所需的还原剂/抗体比远高于4，另一方面也增大了偶联过程中重新形成二硫键的可能性。还原剂/抗体比的增大会使后续进行偶联反应时需要的连接子-药物的使用当量同步增大，推高了偶联工艺的成本，而重新形成二硫键的趋势则会降低所得到的ADC中的药物的平均连接数，增大了工艺开发的难度。事实上，目前两个目标偶联数均为8的上市药物Enhertu和Trodelvy的药物的平均连接数均只能达到7.6左右。

同时，由于还原势能的存在，为了获得比较稳定的还原条件，在还原以及后续的偶联反应过程中抗体往往会被置于较高pH值或者较高温度等对于抗体不利的环境中，对于某些抗体，此类严苛的环境会引发抗体聚集等现象，从而使偶联反应失败。因此，抗体链间二硫键较高的还原势能提高了利用还原抗体的链间二硫键进行抗体偶联药物开发的难度，延长了抗体偶联药物开发周期，增大了抗体偶联药物的生产风险。该问题在IgG1和IgG4抗体中是普遍存在的，在IgG4类抗体中尤其突出。

另一方面，在使用中等还原剂如TCEP平均打开两对IgG4抗体的链间二硫键时，疏水相互作用力高效液相色谱(HIC-HPLC)显示出还原得到的混合物中存在了大量的完全未被还原的抗体，同时，混合物中四对链间二硫键完全被还原的组分比例也相当高，这两种组分均会使最终获得的抗体药物偶联物无法成药。而针对还原产物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测则显示出IgG4抗体铰链区的二硫键更容易被打开，这导致后续偶联时大部分药物连接于抗体重链的铰链区。该结构域由于空间位置有限，巯基全部被占据后导致空间相对拥挤，对抗体偶联药物的稳定性不利。因此在对IgG4抗体进行还原时，降低未被还原的抗体和完全被还原的抗体的比例、以及使经还原的二硫键相对更加分散对最终的ADC成药性将会更有利。

在一个实施方式中，本申请提供了一种经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，其中，所述经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段包括在亲本抗体的轻链的C端第1-3位氨基酸残基处进行的选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

或者，在一个实施方式中，本申请提供了一种经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，包含其C端的氨基酸残基GEC被(X)_nC取代的轻链，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基被选自G、H、K、R或S中的1-3个相同或不同的氨基酸取代；(2)在所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基的氨基端插入的选自G、H、K、R或S中的1-3个相同或不同的氨基酸；或者(3)所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基被缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基被突变为(X)_n，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同；或者(2)所述轻链的C端第2位氨基酸残基被缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基被突变为G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同；或者(2)所述轻链的C端第2位氨基酸残基被缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基被突变为GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS；或者(2)所述轻链的C端第2位氨基酸残基被缺失。

在一些实施方式中，所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基分别为E和G。

在一些实施方式中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G、G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同。

在一些优选的实施方式中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G、GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS。

在一些实施方式中，所述抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，优选IgG1抗体或IgG4抗体，例如人、小鼠、大鼠或猴的IgG1抗体或IgG4抗体。

在一些实施方式中，所述轻链为κ轻链。

在一些实施方式中，所述包含轻链的抗原结合片段可选自Fab片段、Fab'片段和F(ab')2片段。

在本文中，经改造的抗体或包含轻链的抗原结合片段能够特异性结合至与亲本抗体特异性结合的抗原相同的抗原，但是所述经改造的抗体或包含轻链的抗原结合片段表现出更强的被还原能力。

在一个实施方式中，本申请提供了一种制备经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段的方法，包括：对亲本抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端第1-3位氨基酸残基进行选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

或者，本申请提供了一种制备经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段的方法，包括：将亲本抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

在一个实施方式中，本申请提供了一种改善抗体或其包含轻链的抗原结合片段被还原的能力的方法，包括：对所述抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端第1-3位氨基酸残基进行选自插入、取代或者缺失中的至少一种的修饰。

或者，本申请提供了一种改善抗体或其包含轻链的抗原结合片段被还原的能力的方法，包括：将所述抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)将所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基用选自G、H、K、R或S中的1-3个相同或不同的氨基酸取代；(2)在所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基的氨基端插入选自G、H、K、R或S中的1-3个相同或不同的氨基酸；或者(3)将所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)将所述轻链的C端第2位和/或第3位氨基酸残基突变为(X)_n，其中，X代表G、H、K、R或S，n为1、2或3，且n为2或3时，各个X相同或不同；或者(2)将所述轻链的C端第2位氨基酸残基缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)将所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基突变为G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同；或者(2)将所述轻链的C端第2位氨基酸残基缺失。

在一些实施方式中，所述修饰包括：(1)将所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基突变为GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS；或者(2)将所述轻链的C端第2位氨基酸残基缺失。

在一些实施方式中，所述轻链的C端第2位和第3位氨基酸残基分别为E和G。

在一些实施方式中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G、G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同。

在一些优选的实施方式中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G、GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS。

在一些实施方式中，所述抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，优选IgG1抗体或IgG4抗体，例如人、小鼠、大鼠或猴的IgG1抗体或IgG4抗体。

在一些实施方式中，所述轻链为κ轻链。

在一个实施方式中，本申请提供了上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段在改善抗体药物偶联物的DAR比和/或药物分布中的用途。

或者，本申请提供了一种改善抗体药物偶联物的DAR值和/或药物分布的方法，包括：将上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段通过连接子与药物相连以形成抗体药物偶联物。

在一些实施方式中，在所述抗体药物偶联物中，所述抗体药物偶联物的平均DAR值为3-4.5时，以HPLC峰面积百分比计算，DAR值为0(未连接药物的抗体)和DAR值为8的抗体药物偶联物的总和为28％以下。在一些实施方式中，所述抗体药物偶联物的平均DAR值为2-4.5时，以HPLC峰面积百分比计，在所述抗体药物偶联物中，H1(连接了1个药物的抗体重链)组分的含量明显上升，从原来的15％左右上升为25％以上，这表明了本申请的抗体药物偶联物具有改善的药物分布。

在一个实施方式中，本申请提供了一种抗体药物偶联物，包含上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段作为其抗体部分。

在一个实施方式中，本申请提供了一种药物组合物，包含上述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段、或者上述的抗体药物偶联物。

本申请利用对抗体轻链恒定区的改造技术，例如对抗体kappa轻链恒定区(Uniprot:P01834·IGKC_HUMAN)末端第2位氨基酸进行删除或者对第2位和/或第3位氨基酸分别进行1-2个氨基酸的替换或插入，实现了抗体(例如IgG1抗体和IgG4抗体)链间二硫键还原势能的降低，使得抗体在较低当量的还原剂下即可打开目标二硫键个数。进一步地，对于IgG4抗体而言，当达到平均两对链间二硫键被还原时，除了大幅降低还原剂用量外，还可以大幅降低未被还原抗体和完全被还原抗体的比例，而且被还原的二硫键位置选择性发生了改变，从铰链区变得更为随机，这也使得在后续对还原后的抗体偶联药物时，药物在抗体上的分布更为分散。

除非另外定义，否则本文使用的各技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor，NY 1989)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier SciencePublishing Inc.，New York,USA(2012)；Abbas等，Cellular and Molecular Immunology，Elsevier Science Health Science div(2009)；何维等，医学免疫学(第2版)，人民卫生出版社，2010年。

除非另有说明，本文使用的术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或其等同物(contain、contains、containing、include、includes、including)为开放式表述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。

除非另有说明，本文所使用的表示成分的量、测量值或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比相连时，术语“约”可以表示例如±1％、优选±0.5％、更优选±0.1％。

除非上下文另有明确指示，本文中的单数术语涵盖复数的指示对象，反之亦然。类似地，除非上下文另有明确指示，本文中的词语“或”意在包括“和”。

在本文中，除非另有说明，符号“Xaa”或“X”代表未指明的氨基酸。

在本文中，除非另有说明，表述“C端第n位”表示从C端最后一个氨基酸起始的以C端至N端方向计的第n个氨基酸的位置。

在本文中，可将抗体按照如下进行还原：将抗体置换于还原缓冲液(通常是PBS缓冲液或者组氨酸缓冲液)中，然后加入一定当量的还原剂溶液(通常是TCEP)并可选地补加缓冲液，加入的还原剂当量可为2-30当量。将得到的混合液置于4℃-37℃的恒温中孵育2-24小时，使抗体与还原剂充分反应。

在本文中，可将抗体按照如下进行偶联以及还原效果的检测：向上述反应得到的溶液中加入助溶剂(通常可为有机溶剂和连接子-药物溶液，例如可采用vcMMAE作为连接子-药物)。于4℃或22℃下孵育约1小时使游离巯基与vcMMAE中的马来酰亚胺基充分反应以形成抗体药物偶联物。通过对该抗体药物偶联物进行PLRP-HPLC检测或HIC-HPLC检测，即可确定平均每个抗体上的药物连接数和药物的连接位置分布，即平均每个抗体被还原的二硫键数目以及被还原的二硫键位置。

实施例

接下来，通过实施例对本申请进行进一步详细地说明，但本申请的保护范围不限于此。在下述实施例中，除非另有说明，所涉及的试剂、材料、仪器等均为可商购得到的。

实施例1经改造的抗体的制备

以泽罗妥单抗(zilovertamab，下称“mAb1”)起始，对该抗体的轻链进行改造制备抗体mAb2-mAb7和mAb20(各抗体的轻链序列在表1中分别以SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：7示出)。

以派姆单抗(Pembrolizumab，下称“mAb8”)起始，对该抗体的轻链进行改造制备抗体mAb9-mAb12(各抗体的轻链序列在表1中分别以SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：11示出)。

以mAb13(其轻链序列与mAb1的轻链序列相同，重链序列在表1中以SEQ ID NO：12示出)起始，对该抗体的轻链进行改造制备抗体mAb14-mAb17和mAb22(各抗体的轻链序列在表1中分别以SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7示出)。

以曲妥珠单抗(Trastuzumab，下称“mAb39”)起始，对该抗体的轻链进行改造制备抗体mAb24-mAb30(各抗体的轻链序列在表1中分别以SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：19示出)。

同时，mAb31(其轻链序列与mAb39的轻链序列相同，重链序列在表1中以SEQ IDNO：20示出)起始，对该抗体的轻链进行改造制备抗体mAb32-mAb38(各抗体的轻链序列在表1中分别以SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：19示出)。

其中，抗体mAb1-mAb7委托爱康得生物科技(苏州)有限公司生产。根据抗体序列信息，按照人密码子偏好性进行优化，基因合成后，重链亚克隆至pcDNA3.4-hIgG1构建抗体重链表达载体，轻链亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc构建抗体，轻链表达载体，测序验证无误后，进行质粒抽提，制备去内毒素质粒备用。载体构建委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行。从冰箱中取出LVTransm转染试剂、抗体重链表达载体和抗体轻链表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打混匀。取2mL293培养基至6孔板的一个孔，加入50μg重链和50μg轻链抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入300μL的LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述DNA/LVTransm复合物加入到100mL的293F细胞中(细胞密度为1E6/mL)，轻轻晃动混匀，将细胞置于37℃、5％ CO₂培养箱，120RPM培养。连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用蛋白A柱亲和纯化抗体，并使用超滤管进行浓缩和缓冲液置换，将缓冲液置换为1×PBS。将纯化后的抗体使用Nanodrop测定浓度后，通过还原性SDS-PAGE检测纯度。

抗体mAb8-mAb17、mAb20、mAb22和mAb24-mAb38委托南京金斯瑞生物科技有限公司生产。根据抗体序列按照人密码子偏好性进行优化，基因合成后测序验证无误后，进行质粒抽提，制备去内毒素质粒备用。将CHO细胞于37℃、5％ CO₂培养箱悬浮培养。质粒转染前一天，将CHO细胞传代，完成质粒转染24小时后加入培养基并对CHO细胞继续进行培养，以使细胞表达所需抗体。CHO细胞完成抗体表达后离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用蛋白A柱纯化抗体，并使用超滤管进行浓缩和缓冲液置换，将缓冲液置换为1×PBS或者20mM的Histidine-Actate(pH 5.5)。将纯化后的抗体使用Nanodrop测定浓度后，通过SDS-PAGE和SEC-HPLC检测纯度。

由此，得到抗体mAb1-mAb17、mAb20、mAb22和mAb24-mAb38。

表1.抗体的序列信息

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实施例2：mAb1-mAb7的还原、偶联和检测

将抗体mAb1-mAb7(抗体类型IgG1)置换于20mM组氨酸-醋酸缓冲液(pH 5.5)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP与mAb2-mAb7中的任一者的摩尔比均为3，TCEP/mAb1的摩尔比为3.6。将得到的混合溶液置于4℃下反应3.5小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测(安捷伦1260系列高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent,PLRP-S2.1×150mm,8μm；流动相：A相为含0.05vol％三氟乙酸的纯水，B相为含0.05vol％三氟乙酸的乙腈；流速0.8mL/min；进样体积20μL；检测波长：280nm、248nm和214nm；流动相梯度：0-3min 75％ A相，3-28min 75％-50％A相，28-30min 50％-5％A相，30-32min 5％A相，32-33min 5％-75％ A相，33-40min 75％A相)。

实施例3：mAb1和mAb20的还原、偶联和检测

将抗体mAb20和mAb1(抗体类型IgG1)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb20和TCEP/mAb1的摩尔比均为2.5。将得到的混合溶液置于37℃反应2小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例4：mAb13-mAb17的还原、偶联和检测

将抗体mAb13-mAb17(抗体类型IgG4)置换于磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb13的摩尔比为7，TCEP/mAb14的摩尔比为4.5，TCEP/mAb15的摩尔比为4，TCEP/mAb16的摩尔比为3.5，TCEP/mAb17的摩尔比为7。将得到的混合溶液置于30℃反应6.5小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为8。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例5：mAb13-mAb17、mAb22的还原、偶联和检测

将抗体mAb13-mAb17、mAb22(抗体类型IgG4)置换于磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb13的摩尔比为7，TCEP/mAb14的摩尔比为4.5，TCEP/mAb15的摩尔比为4，TCEP/mAb16的摩尔比为3.5，TCEP/mAb17的摩尔比为4,TCEP/mAb22的摩尔比为4。将得到的混合溶液置于4℃反应24小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KDMWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

利用PLRP-HPLC测定结果按照如下公式计算所得的各抗体药物偶联物中的药物平均连接数，并将结果在表3中示出：

实施例6：mAb13-mAb17的还原、偶联和检测

将抗体mAb13-mAb17(抗体类型IgG4)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb13的摩尔比为30，TCEP/mAb14的摩尔比为15，TCEP/mAb15的摩尔比为12，TCEP/mAb16的摩尔比为12，TCEP/mAb17的摩尔比为10。将得到的混合溶液置于4℃反应24小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb13的摩尔比为35，vcMMAE/mAb14的摩尔比为20，vcMMAE/mAb15的摩尔比为17，vcMMAE/mAb16的摩尔比为17，vcMMAE/mAb17的摩尔比为15，继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例7：mAb8-mAb12的还原、偶联和检测

将抗体mAb8-mAb12(抗体类型IgG4)置换于磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP与mAb8-mAb12中的任一者的摩尔比均为4。将得到的混合溶液置于37℃反应2小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例8：mAb24-mAb30和mAb39的还原、偶联和检测

将抗体mAb24-mAb30和mAb39(抗体类型IgG1)置换于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP与mAb24-mAb30和mAb39中的任一者的摩尔比均为3.7。将得到的混合溶液置于4℃反应3.5小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。将所得溶液直接用于HIC-HPLC检测(安捷伦1260系列高效液相色谱仪；色谱柱：TSKgel Butyl-NPR,(2.5)4.6*35,0014947；流动相：A相为1.5M(NH₄)₂SO₄+50mM KPi,pH7.0，B相为50mM KPi+25vol％IPA,pH 7.0；流速0.5mL/min；进样体积<10μL(>30μg)；检测波长：280nm、248nm和214nm；流动相梯度：0-20min 70％-30％ A相，20-23min 30％-0％ A相，23-28min 0％ A相，28-33min0％-70％ A相，33-33.1min 70％ A相)。

实施例9：mAb31-mAb38的还原、偶联和检测

将抗体mAb31-mAb38(抗体类型IgG4)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb31的摩尔比为40，TCEP/mAb32的摩尔比为5，TCEP/mAb33的摩尔比为4.5，TCEP/mAb34的摩尔比为5，TCEP/mAb35的摩尔比为4，TCEP/mAb36的摩尔比为2.6，TCEP/mAb37的摩尔比为4，TCEP/mAb38的摩尔比为4。将得到的混合溶液置于30℃反应6小时。然后后在混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb31的摩尔比为45，vcMMAE/mAb32-mAb38中的任一者的摩尔比均为8。继续将所述溶液置于22℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。将所得溶液直接用于HIC-HPLC检测，检测操作和条件同实施例8。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

按照实施例5中的公式，利用PLRP-HPLC测定结果计算mAb31-mAb38的抗体药物偶联物中的药物平均连接数，并将结果在表3中示出。

利用HIC-HPLC测定结果按照如下公式计算mAb31-mAb38的抗体药物偶联物中的药物平均连接数，并将结果在表4中示出

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实施例10：mAb14的还原、偶联和检测

将抗体mAb14(抗体类型IgG4)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb14的摩尔比为7.5。将得到的混合溶液置于4℃反应18小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为10。继续将此溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例11：mAb16和mAb17的还原、偶联和检测

将抗体mAb16-mAb17(抗体类型IgG4)置换于磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb16的摩尔比为3.5，TCEP/mAb17的摩尔比为4。将得到的混合溶液置于30℃反应3小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为7。继续将所述溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

实施例12：mAb22的还原、偶联和检测

将抗体mAb22(抗体类型IgG4)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中，向其中加入5mM的TCEP储液，TCEP/mAb22的摩尔比为4。将该混合溶液置于37℃反应2小时。然后向混合溶液中加入N,N-二甲基乙酰胺(DMA)以及10mg/mL的vcMMAE溶于DMA中的溶液。使最终DMA的含量为10vol％，vcMMAE/mAb的摩尔比为8。继续将此溶液置于4℃反应1小时以使偶联反应充分。反应结束后使用40KD MWCO的ZebaTM离心型脱盐柱进行纯化，将偶联之后的产物(即，抗体药物偶联物)置换于20mM组氨酸-醋酸(pH 5.5)缓冲液中保存。

取20μL上述的抗体药物偶联物，向其中加入5μL浓度为1M的Tris-HCl(pH 7.5)溶液、75μL浓度为5.33M的盐酸胍溶液，混合均匀后加入2μL浓度为0.5M的TCEP溶液，于37℃孵育15分钟使抗体药物偶联物被充分还原。将所得溶液直接用于PLRP-HPLC检测，检测操作和条件同实施例2。

将上述实施例2-实施例12中涉及的抗体的还原参数在下表2中示出。

表2：抗体被还原能力对比

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表3：IgG4抗体经PLRP-HPLC检测的轻链、重链分别连接药物数分布

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注：L0、L1、H0、H1、H2和H3分别表示抗体轻链、连接了1个药物的抗体轻链、抗体重链、连接了1个药物的抗体重链、连接了2个药物的抗体重链和连接了3个药物的抗体重链。

表4：IgG4抗体经HIC-HPLC检测的抗体连接药物数分布

注：D0、D2、D4、D6和D8分别表示DAR值＝0、2、4、6和8。

由表2-表4中的结果可以看出，通过将抗体的轻链C端的第1-3位氨基酸残基(GEC)进行修饰，可以提高抗体的被还原能力(例如，在更少的还原剂用量的条件下实现了相当或者更强的还原)，同时抗体还原的分布更为合理，可以使经还原的二硫键相对更加分散(Fab区和铰链区的二硫键可享有基本相同的优先级)。

为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且，在任何国家，在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。

本领域技术人员将认识到，本申请的范围并不限于上文描述的各种具体实施方式和实施例，而是能够在不脱离本申请的精神的情况下，进行各种修改、替换、或重新组合，这都落入了本申请的保护范围内。

Claims (10)

1.一种经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，包含其C端的氨基酸残基GEC被(X)_nC取代的轻链，其中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同。

2.如权利要求1所述的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，其中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS。

3.如权利要求1或2所述的抗体或其包含轻链的抗原结合片段，其中，所述抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，优选IgG1抗体或IgG4抗体；

或者优选地，所述轻链为κ轻链；

或者优选地，所述包含轻链的抗原结合片段选自Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。

4.一种制备经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段的方法，包括：将亲本抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同。

5.一种改善抗体或其包含轻链的抗原结合片段被还原的能力的方法，包括：将所述抗体或其包含轻链的抗原结合片段的轻链的C端氨基酸残基GEC突变为(X)_nC，其中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：G(X)_m或KGX，X代表G、H、K、R或S，m为1或2，且m为2时，各个X相同或不同。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述(X)_n为选自如下中的任一种：GH、GK、GR、KGK、GKS、GSK或GGS。

7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，所述抗体为IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，优选IgG1抗体或IgG4抗体；

或者优选地，所述轻链为κ轻链。

8.权利要求1-3中任一项所述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段在改善抗体药物偶联物的DAR比和/或药物分布中的用途；

优选地，在所述抗体药物偶联物中，平均DAR值为3-4.5时，以HPLC峰面积百分比计，DAR值为0的未连接药物的抗体和DAR值为8的抗体药物偶联物的总和为28％以下；

或者优选地，平均DAR值为2-4.5时，以HPLC峰面积百分比计，在所述抗体药物偶联物中，H1占比为25％以上。

9.一种抗体药物偶联物，包含权利要求1-3中任一项所述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段作为其抗体部分。

10.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的经改造的抗体或其包含轻链的抗原结合片段、或者权利要求9所述的抗体药物偶联物。