JP5733693B2 - 組換え型ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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[態様1]
遺伝子組換え細胞により産生されるポリペプチドを可溶化し、精製し、得られたポリペプチド溶液の段階的透析により巻き戻しを行なうことを含む、生物活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、巻き戻し前のポリペプチド、巻き戻し後に形成されるポリペプチドの可溶性凝集体若しくは不溶性凝集体、又は、段階的透析過程におけるポリペプチドの巻き戻し中間体のいずれかを化学修飾することを特徴とする、前記製造方法。
[態様2]
ポリペプチドに塩酸グアニジンを作用させることで可溶化を行ない、段階的透析の開始時におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が3 Mより大であり、終了時における塩酸グアニジン濃度が0 Mであることを特徴とする、態様1記載の製造方法。
[態様3]
段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が3 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、態様1又は2記載の製造方法。
[態様4]
段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が2 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、態様3記載の製造方法。
[態様5]
段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が0.5 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、態様3記載の製造方法。
[態様6]
透析外液に所定量のL-アルギニンを添加することを特徴とする、態様1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様7]
化学修飾がポリエチレングリコール(PEG)により行なわれることを特徴とする、態様1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様8]
ポリペプチドが抗体分子又はそれを構成する一部であることを特徴とする、態様1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様9]
遺伝子組換え細胞により産生されるポリペプチドが不溶性の細胞質封入体を形成していることを特徴とする、態様1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様10]
遺伝子組換え細胞が大腸菌であることを特徴とする、態様1〜9のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様11]
ポリペプチドがヒト由来であることを特徴とする、態様1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様12]
態様1〜11のいずれか一項に記載の製造方法で得られる組換え型ポリペプチドを有効成分として含有する生物製剤。
ゲルろ過クロマトグラフィによる分子量測定:
GE Healthcar社製Hiload Superdex 200-pg 10/300カラムを用いて、流速0.5mL/min、4℃、サンプル量300 μLでGE Healthcare社製AKTA explorer 10Sにて行った。
DLSによる粒子測定:
試料は、ポリスチレン製セルに入れ、Malvern Instruments 社製 Zetasizer Nano 装置を用いて測定。屈折率はwaterを使用。
CDスペクトルによる構造解析:
試料は、光路長 1.0 mmのセルに入れ、Proterion社製のAVIV- CD装置を用いて測定。分解能0.2 nm,平均時間 4 s, 積算回数1回のパラメータにて測定。
細胞に対する結合評価:
標的細胞に対しサンプルを添加後30分、4℃で静置後、0.1%NaN3/PBSで2回Washし、続いて検出抗体としてanti-c-myc抗体を加え同様の操作を行い蛍光を測定した。ネガティブコントロール(N.C.)は検出抗体以降の操作を行い、ポジティブコントロール(P.C.)には、抗EGFR IgG抗体、あるいはFvを用いた。測定は、Becton Dickinson 社製FACSCaliburを用いて行った。尚、これに用いた各種細胞は当業者に公知のものであり、ATCC等から容易に入手可能である。
Claims (13)
- 遺伝子組換え細胞により産生されるポリペプチドを可溶化し、精製し、得られたポリペプチド溶液の段階的透析により巻き戻しを行なうことを含む、生物活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドが抗体分子又はそれを構成する一部であり、巻き戻し後に形成されるポリペプチドの可溶性凝集体若しくは不溶性凝集体、又は、段階的透析過程におけるポリペプチドの巻き戻し中間体のいずれかをポリエチレングリコール(PEG)により化学修飾することを特徴とする、前記製造方法。
- ポリエチレングリコール(PEG)がポリペプチドのC末端に付加されたシステイン残基を修飾することを特徴とする、請求項1記載の製造方法。
- ポリエチレングリコール(PEG)の分子量が20kDa又は5kDaであることを特徴とする、請求項1又は2記載の製造方法。
- ポリペプチドに塩酸グアニジンを作用させることで可溶化を行ない、段階的透析の開始時におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が3 Mより大であり、終了時における塩酸グアニジン濃度が0 Mであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が3 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、請求項4に記載の製造方法。
- 段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が2 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、請求項5記載の製造方法。
- 段階的透析におけるポリペプチド溶液の塩酸グアニジン濃度が0.5 M以下の段階において、ポリペプチドの巻き戻し中間体を化学修飾することを特徴とする、請求項6記載の製造方法。
- 透析外液に所定量のL-アルギニンを添加することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
- ポリペプチドが1本鎖抗体(ScFv)若しくはその誘導体又は二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 二重特異性抗体がダイアボディ型又はタンデム型であることを特徴とする、請求項9に記載の製造方法。
- 遺伝子組換え細胞により産生されるポリペプチドが不溶性の細胞質封入体を形成していることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 遺伝子組換え細胞が大腸菌であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- ポリペプチドがヒト由来であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の製造方法。
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