JP6740244B2

JP6740244B2 - ヘテロ多量体タンパク質複合体のアセンブリおよび産生を最適化する方法

Info

Publication number: JP6740244B2
Application number: JP2017550891A
Authority: JP
Inventors: ジョヴァンニマジストレッリ，; ポリーヌマランジェ，; イヴポワトヴァン，; ニコラスフィッシャー，
Original assignee: ノビミューンエスアー
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2020-08-12
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: WO2016156537A1; JP2018509922A; EP3277821B1; EP3277821A1; CN108040485A; US10113193B2; US20190226001A1; AU2016239683A1; AU2016239683B2; CA2981204C; ES2752054T3; CA2981204A1; DK3277821T3; US20160289727A1; PT3277821T; JP2020096641A

Description

関連出願
本出願は、２０１５年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／１４１，００９号の優先権を主張し、当該出願の各内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。

発明の分野
複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する方法が提供される。これらの方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で提供される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされた哺乳動物細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率との有意な増加をもたらす。

発明の背景
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を作動するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。

一部のタンパク質は、共有結合または非共有結合的に連結することができる、複合体中で会合可能な数個のポリペプチドで構成される。抗体は、ジスルフィド結合によって連結する４つのポリペプチド（すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖）で構成されることからそのようなクラスのタンパク質の一例である。それらの商業上および治療上の重要性のために、ＣＨＯ細胞における抗体の発現は、抗体を構成する２つの鎖の発現の最大化を目指した最適化の熱心な努力の対象であった。しかし、発現レベルは抗体間で最大２００倍も変動することがあるので、大きな差が観察されることがある。

以前の最適化アプローチは、より高い生成収率を達成するためにポリペプチドの発現レベルの増加を目指した。複数のポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の場合、不均衡な発現は所望の分子のアセンブリを制限し、望ましくない生成物の生成を促進し、全体の生成収率を制限する可能性がある。したがって、タンパク質複合体の発現を改善するための方法の必要性が存在する。

本開示の方法は、複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する。以前に記載されたアプローチと対照的に、タンパク質複合体中の１つまたはいくつかのポリペプチドの発現を低減することは、タンパク質複合体のアセンブリおよび収率を増強する。本方法は、複数のポリペプチドの共発現にしばしば依存する二重特異的抗体の発現および収率を最適化するのに特に適している。構成成分の１つの不均衡な発現（必要以上に高いか必要以上に低い）は、所望の最終生成物の有意な減少および望ましくない副産物の生成の増加につながる可能性がある。この限界は、ＩｇＧ様二重特異的フォーマットならびに抗体断片に基づくフォーマットの両方に影響を与え得る。

本方法は、κλ体と命名された二重特異的抗体（Fischerら、Exploiting light chains for the scalable generation and platform purification of native human bispecific IgG., Nat. Comms、６巻：６１１３頁（２０１５年））の発現の最適化のために特に適用可能である。この技術は、共通の重鎖および２つの異なる軽鎖（１つのカッパおよび１つのラムダ）で構成される完全ヒト二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）を生成する（例えば、ＷＯ２０１２／０２３０５３を参照）。２つの単一特異的抗体ＩｇＧκおよびＩｇＧλに加えて１本のκおよび１本のλ鎖を含有する二重特異的抗体（κλ体）を生成するために、これらの３つの鎖を含む独自のトリシストロン性ベクターが哺乳動物細胞に導入される。

原理上、２つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、３つの分子の比はＩｇＧκ２５％、ＩｇＧλ２５％およびＩｇＧκλ５０％であるはずである。しかし、２つの鎖の不均衡な発現レベルが時には観察され、二重特異的収率の低下につながる。１つの解決方法は、バランスを回復するために、より低く発現される鎖の発現を増加させると予想される。しかし、このアプローチは不成功だった（本明細書で提供される実施例に示される通り）。

対照的に、本開示の方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で開示される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の両方における生産性と最終的な二重特異的収率との有意な増加をもたらす。したがって、１つまたはいくつかのポリペプチドの発現の低減は、生産性の全体的増加をもたらすことができる。本明細書で提供される例はκλ体を使用するが、本明細書で開示される方法は他の二重特異的抗体フォーマットおよびいくつかの異なるポリペプチドで構成される任意の他のタンパク質複合体に適用可能である。

一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドの１つまたはいくつかの発現率を低下させることによって、いくつかのポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドの１つの発現の低減は、転写率、翻訳率またはｍＲＮＡ安定性の改変によって達成される。一部の実施形態では、ポリペプチドの１つの発現率の低減は、ｍＲＮＡ二次構造の改変によって達成される。一部の実施形態では、ポリペプチドの１つの発現の低減は、転写率の改変、翻訳率の改変、ｍＲＮＡ安定性の改変、ｍＲＮＡ二次構造の改変またはこれらの要素のいずれかの組合せによって達成される。

一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、そのポリペプチドのコドン組成の変更によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変およびそのポリペプチドのコドン組成の変更によって達成される。

一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、そのタンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通して、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変、およびそのタンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。

一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、そのタンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通して、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの１つの発現の低減は、翻訳率の改変、およびそのタンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。

一部の実施形態では、タンパク質複合体は、多重特異的抗体である。一部の実施形態では、タンパク質複合体は、二重特異的抗体である。一部の実施形態では、二重特異的抗体は２つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される。

一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトラムダ軽鎖およびヒトカッパ軽鎖を含む。

一部の実施形態では、二重特異的抗体は第１および第２の抗原結合性領域を含み、各々は少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、第１および第２の抗原結合性領域は、各々少なくとも２つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、第１および第２の抗原結合性領域は、各々３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＣＤＲは免疫グロブリン重鎖に由来する。一部の実施形態では、重鎖はヒト重鎖である。一部の実施形態では、ＣＤＲはラムダ軽鎖に由来する。一部の実施形態では、ＣＤＲはカッパ軽鎖に由来する。

一部の実施形態では、第１の抗原結合性領域は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、第２の抗原結合性領域は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。

一部の実施形態では、第１および第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、ヒトＣＤＲ、マウスＣＤＲ、ラットＣＤＲ、ウサギＣＤＲ、サルＣＤＲ、類人猿ＣＤＲ、合成ＣＤＲおよび／またはヒト化ＣＤＲを独立して含む。一部の実施形態では、ＣＤＲはヒトであり、体細胞突然変異している。

一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。一部の実施形態では、ヒトＦＲは、体細胞突然変異したヒトＦＲである。

一部の実施形態では、二重特異的抗体は、目的の抗原に対する反応性について抗体可変領域を含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。

一部の実施形態では、二重特異的抗体の第１および／または第２の抗原結合性領域は、マウス、ラット、ウサギ、サルまたは類人猿などのヒト以外の動物を目的の抗原で免疫化し、目的の抗原に特異的な可変領域をコードする抗体可変領域核酸配列を同定することによって得られる。

一部の実施形態では、二重特異的抗体は完全ヒト二重特異的抗体であり、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲内の各エピトープへの親和性を独立して有する。

一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。一部の実施形態では、二重特異的抗体は非天然ヒトＴ細胞エピトープを欠く。一部の実施形態では、ＣＨ１領域の改変はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。

一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は重鎖を含み、この重鎖はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。

一部の実施形態では、重鎖は、非天然のＴ細胞エピトープを含有しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、重鎖は、そのタンパク質分解物がヒトで免疫原性である約９アミノ酸のアミノ酸配列を形成することができないアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヒトは、抗原結合性タンパク質で治療されるヒトである。一部の実施形態では、重鎖は、そのタンパク質分解物がヒトで免疫原性である約１３〜約１７アミノ酸のアミノ酸配列を形成することができないアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヒトは、抗原結合性タンパク質で治療されるヒトである。

一部の実施形態では、１を超えるタンパク質複合体が共発現される。一部の実施形態では、１を超える抗体が共発現される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
１つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
（ａ）前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子を用意すること；
（ｂ）前記核酸分子を細胞に導入すること；
（ｃ）前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること；および
（ｄ）前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの少なくとも１つの発現を減少させること
を含む方法。
（項目２）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはｍＲＮＡ安定性の改変によって達成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、ｍＲＮＡ二次構造の改変によって達成される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、ｍＲＮＡ安定性の改変、ｍＲＮＡ二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記タンパク質複合体が多重特異的抗体である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記二重特異的抗体が２つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
１つを超えるタンパク質複合体が共発現される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記タンパク質複合体が抗体であり、１つを超える抗体が共発現される、項目１１に記載の方法。

図１は、その発現をモジュレートするためにラムダ軽鎖に導入された突然変異を表す図示である。ＶＬＣＬ２、野生型配列；ＶＬＣＬ２＿０、最適化配列；ＶＬＣＬ２＿１、ＶＬＣＬ２＿２、ＶＬＣＬ２＿３、脱最適化のレベルが増加した配列。

図２は、ＯＣＴＥＴ技術を使用して測定した、産生Ｐｅａｋ細胞の上清において得られたＩｇＧ１抗体の濃度を表すグラフである。

図３Ａは、全体の精製されたＩｇＧのＨＩＣプロファイルのグラフである。

図３Ｂは、ＨＩＣプロファイルから導かれた、異なる構築物についての単一特異的カッパ抗体、単一特異的ラムダ抗体および二重特異的ＩｇＧの異なる百分率を表すグラフである。

図４は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＩｇＧＦｃＸＬ樹脂による親和性精製の後のモノクローナルおよび二重特異的抗体の発現を示す、等電点電気泳動ポリアクリルアミドゲルである。

図５は、いくつかのＣＨＯ細胞プールからの異なる構築物についての全体のＩｇＧ生産性を表す一連のグラフである。

図６Ａは、還元および変性条件における精製されたＩｇＧからの重鎖および軽鎖のサイズをモニタリングした、Ａｇｉｌｅｎｔタンパク質８０チップランのゲル様画像表示である。

図６Ｂは、各構築物についてのいくつかのＣＨＯプールの全体のカッパおよびラムダ軽鎖の比を示すグラフである。

図７は、いくつかのＣＨＯ細胞プールによって発現された単一カッパ、単一ラムダおよび二重特異的抗体の％で表した分布を示す一連のグラフである。

図８は、２つの標的（ｈＣＤ１９およびｈＣＤ４７）ならびに無関係な対照タンパク質（ｈＩＬ６Ｒ）に対する二重特異的抗体の各腕の特異的結合を示すＥＬＩＳＡの結果を表すグラフである。

細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を推進するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。これらには、転写および翻訳レベルでの、ならびにｍＲＮＡの二次構造および安定性での改善が含まれる。別の重要な要素は、それが発現宿主に適合し、低い存在度のｔＲＮＡによる限界を回避するように、コドン利用を最適化することである。最適化過程には、配列反復配列、キラーモチーフおよびスプライス部位の除去が含まれてもよく、安定したＲＮＡ二次構造は回避される。コドン利用およびＧＣ含有量は、ＣＨＯ細胞または他の宿主細胞での発現のために同時に調整することができる。そのような改変の狙いは、所望のポリペプチドの翻訳、したがって発現が最大になるように、ＲＮＡの翻訳および安定性を最大にすることである。

一部のタンパク質は、共有結合または非共有結合的に連結することができる、複合体中で会合可能な数個のポリペプチドで構成される。抗体はジスルフィド結合によって連結する４つのポリペプチド（すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖）で構成されることからそのようなクラスのタンパク質の一例である。抗体は、Ｆａｂ部分によって作動される標的抗原への特有の特異性を有し、それらのＦｃ部分を通して免疫にかかわることができる。がんのためのいくつかの現在使用されている生物学的療法は、標的化がん細胞によって過剰発現される抗原に対するモノクローナル抗体である。そのような抗体が腫瘍細胞に結合するとき、抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性の細胞性食作用または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）などのいくつかの過程を誘発することができる。それらの商業上および治療上の重要性のために、ＣＨＯ細胞における抗体の発現は、抗体を構成する２つの鎖の発現の最大化を目指した最適化の熱心な努力の対象であった。しかし、発現レベルは抗体間で最大２００倍も変動することがあるので、大きな差が観察されることがある。発現レベルは、軽鎖合成のレベル、ならびにアセンブリのための重鎖および軽鎖の適合性を含むいくつかの要素によって決定される。軽鎖の高い発現が、完全抗体の全体的な分泌速度のために有益であるようである（Strutzenbergerら、Changes during subclone development and ageing of human antibody-producing recombinant CHO cells、J. Biotechnol.、６９巻（２〜３号）：２１５〜１６頁（１９９９年））。実際に、軽鎖発現の低減は小胞体での重鎖の蓄積につながり、生産性を制限する。

モノクローナル抗体で単一タンパク質を標的にするかまたは中和することは、効能を達成するのに必ずしも十分でなく、このことはモノクローナル抗体の治療的使用を制限する。いくつかの疾患で、生物系の１つの構成成分の中和は有益な効果を提供するのに十分でないことがますます明らかになっている。したがって、１つを超える抗原を係合することが可能な多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体が開発されている。多数の二重特異的抗体フォーマットが記載されており、２つの二重特異的抗体がこれまで承認され、他の多くは現在臨床試験中である（Kontermann RE、Brinkmann U.、Bispecific antibodies、Drug Discover Today、（２０１５年）、dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2015.02.2008で入手可能）。多くの場合に、二重特異的抗体は２つを超えるポリペプチドで構成される。正しいアセンブリは、そこから二重特異的抗体を精製することができる分子の混合物につながる、鎖のランダムな対形成に基づくことができる。あるいは、所望の対形成を好ましくは得ることができるように、鎖の接点を工学的に操作することができる。いずれの場合も、複数の鎖の共発現は、より高い複雑性および相対的な発現率を伴い、したがって、二重特異的分子を構成する鎖の存在度は、全体的な収率およびアセンブリの効率に大きな影響を潜在的に及ぼす可能性がある。

以前の最適化アプローチは、より高い生成収率を達成するためにポリペプチドの発現レベルの増加を目指した。複数のポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の場合、不均衡な発現は所望の分子のアセンブリを制限し、望ましくない生成物の生成を促進し、全体の生成収率を制限する可能性がある。

本開示の方法は、複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する。本開示の方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で開示される方法は、一時的発現系に加えて安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率の有意な増加をもたらす。したがって、１つまたはいくつかのポリペプチドの発現の低減は、生産性の全体的増加をもたらすことができる。

表１は、異なる配列最適化および脱最適化レベルで生成された構築物を表す表である。

使用される配列は、下の表１．１、１．２および１．３に示す。

表２は、各構築物のための以下のデータ：精製の後の全ＩｇＧおよび二重特異的抗体の量ならびにＨＩＣで決定された二重特異性の割合を示す表である。

表３は、各構築物の代表的プールのための、全体のＩｇＧ生産性、プロテインＡ精製の後のＨＩＣによる二重特異性％、およびＣＨＯ細胞培養上清からの精製された二重特異性の量を表す。

本明細書で提供される方法で使用されるポリヌクレオチドおよびその構築物は、当業者に公知のいくつかの異なるプロトコールによって合成的に生成することができる。適当なポリヌクレオチド構築物は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、２版、（１９８９年）Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに記載される標準の組換えＤＮＡ技術を使用して、および、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅｐｔ．ｏｆＨＨＳ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）による組換えＤＮＡ研究のためのガイドラインに記載される現在の規制の下で精製される。

ベクターに挿入された本明細書に記載される核酸を含む構築物も提供され、そのような構築物は、下でより詳細に記載されるようにいくつかの異なるスクリーニング適用のために使用することができる。一部の実施形態では、単一のベクター（例えば、プラスミド）は、単一のペプチド提示足場のための核酸コード配列を含有する。他の実施形態では、単一のベクター（例えば、プラスミド）は、２つまたはそれを超えるペプチド提示足場のための核酸コード配列を含有する。

プラスミドを含むウイルスおよび非ウイルスベクターを調製し、使用することができ、それらは宿主細胞でバイオセンサーをコードするＤＮＡの複製および／または発現を可能にする。ベクターの選択は、増殖が所望される細胞型および増殖の目的に依存する。大量の所望のＤＮＡ配列を増幅し、作製するために、ある特定のベクターが有益である。培養の細胞での発現のために、他のベクターが適する。全体の動物またはヒトの細胞での形質転換および発現のために、さらに他のベクターが適する。適当なベクターの選択は、当分野の技術の範囲内である。多くのそのようなベクターが市販されている。構築物を調製するために、一般的にベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合によって、部分的または完全長のポリヌクレオチドがベクターに挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列を、ｉｎｖｉｖｏで相同組換えによって挿入することができる。一般的に、これは、所望のヌクレオチド配列に隣接して、ベクターに相同領域を付着させることによって達成される。オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または、例えば相同領域および所望のヌクレオチド配列の一部を含むプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって、相同領域は追加される。

他の適用がある中でとりわけ、ペプチド提示足場の合成で使用できる、発現カセットまたは系も提供される。発現のために、本開示のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子生成物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳動物の系を含む任意の便利な発現系で発現される。適するベクターおよび宿主細胞は、米国特許第５，６５４，１７３号に記載される。発現ベクターでは、所望の発現特性を得るために、ポリヌクレオチドは適宜調節配列に連結される。これらの調節配列には、プロモーター（センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端のいずれかに付着する）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサーを含めることができる。プロモーターは調節することができるか、または構成的であってもよい。一部の状況では、組織特異的または発達段階特異的プロモーターなどの、条件付きで活性なプロモーターを使用することが望ましいことがある。ベクターへの連結のために上で記載の技術を使用して、これらは所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野で公知である任意の技術を使用することができる。言い換えると、発現ベクターは、誘導可能または構成的であり得る転写および翻訳の開始領域を提供し、コード領域は、転写開始領域ならびに転写および翻訳の終止領域の転写制御下で作動可能に連結される。これらの制御領域は、その核酸が得られる種に固有のものであってもよいし、または外因性供与源に由来してもよい。

使用に適する真核生物のプロモーターには、限定されずに以下のものが含まれる：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Hamerら、J. Mol. Appl. Gen.１巻：２７３〜２８８頁、１９８２年）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight、Cell ３１巻：３５５〜３６５頁、１９８２年）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoistら、Nature（London）２９０巻：３０４〜３１０頁、１９８１年）；酵母ゴール遺伝子配列プロモーター（Johnstonら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）７９巻：６９７１〜６９７５頁、１９８２年）；Silverら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）８１巻：５９５１〜５９ＳＳ頁（１９８４年）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなど。

プロモーターは、さらに、構成的または調節可能であってもよい。誘導可能なエレメントは、プロモーターと連携して作用し、リプレッサー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＯ／ＬＡＣＩｑリプレッサー系）またはインデューサー（例えば、酵母のゴール／ＧＡＬ４インデューサー系）に結合することができる、ＤＮＡ配列エレメントである。そのような場合、プロモーターが脱抑制または誘導されるまで転写は事実上「オフ」にされ、その時点で転写は「オン」にされる。

発現ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能にするために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を一般的に有する。発現宿主で作動可能な選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、とりわけ、後にさらに詳しく記載されるスクリーニング方法のために使用することができる。

転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終止領域を含む発現カセットを調製することができる。ＤＮＡの導入の後、構築物を含有する細胞を選択マーカーによって選択することができ、細胞を増殖させ、その後発現のために使用することができる。

上記の発現系は、発現の目的によって、従来の方法に従って原核生物または真核生物で用いることができる。一部の実施形態では、単細胞生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物などのより高等な生物体の細胞、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル卵細胞などを、発現宿主細胞として使用することができる。他の状況では、真核生物の細胞を使用することが望ましく、その場合、発現されるタンパク質は天然の折畳みおよび翻訳後修飾から恩恵を受ける。

目的の具体的な発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞由来の発現系が含まれる。細菌の発現系には、Changら、Nature（１９７８年）２７５巻：６１５頁；Goeddelら、Nature（１９７９年）２８１巻：５４４頁；Goeddelら、Nucleic Acids Res.（１９８０年）８巻：４０５７頁；欧州特許第００３６，７７６号；米国特許第４，５５１，４３３号；DeBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（１９８３年）８０巻：２１〜２５頁；およびSiebenlistら、Cell（１９８０年）２０巻：２６９頁に記載される発現系が含まれる。

哺乳動物の発現は、Dijkemaら、EMBO J.（１９８５年）４巻：７６１頁、Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)（１９８２年）７９巻：６７７７頁、Boshartら、Cell（１９８５年）、４１巻：５２１頁および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている通りに達成される。哺乳動物の発現の他の特徴は、HamおよびWallace、Meth. Enz.（１９７９年）５８巻：４４頁、BarnesおよびSato、Anal. Biochem.（１９８０年）１０２巻：２５５頁、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、国際公開第９０／１０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号およびＵ．Ｓ．ＲＥ３０，９８５に記載されている通りに促進される。

当業者によって認められるように、使用に適する宿主細胞型は広く異なり得る。一部の実施形態では、細胞は細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、生物学的実体は細菌細胞である。一部の実施形態では、細菌細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。

この構築物は、本開示の細胞系を生成するために当業者によって実施される標準手段のいずれか１つによって、宿主細胞に導入することができる。核酸構築物は、例えば、カチオン性脂質によって（Goddardら、Gene Therapy、４巻：１２３１〜１２３６頁、１９９７年；Gormanら、Gene Therapy４巻：９８３〜９９２頁、１９９７年；Chadwickら、Gene Therapy４巻：９３７〜９４２頁、１９９７年；Gokhaleら、Gene Therapy４巻：１２８９〜１２９９頁、１９９７年；GaoおよびHuang、Gene Therapy２巻：７１０〜７２２頁、１９９５年、この全ては参照により本明細書に組み込まれる）、ウイルスベクターを使用して（Monahanら、Gene Therapy４巻：４０〜４９頁、１９９７年；Onoderaら、Blood９１巻：３０〜３６頁、１９９８年、この全ては参照により本明細書に組み込まれる）、「ネイキッドＤＮＡ」の取り込み、などによって送達することができる。

定義
特記されない限り、本開示に関連して使用される科学的および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から特に必要とされない限り、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびその技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために、標準技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載される通りに実行される。前述の技術および手順は、当技術分野で周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書全体において引用され、議論される様々な一般的およびより特定の参考文献に記載される通りに一般的に実行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（１９８９年））を参照。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達および患者の治療のために、標準技術が使用される。

本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：

本明細書で言及される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形の、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマーホウ素を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形を含む。

本明細書で用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片または突然変異体を指す一般的な用語として使用される。したがって、天然タンパク質、断片、および突然変異体は、ポリペプチド属の種である。本開示による好ましいポリペプチドは、サイトカインおよび抗体を含む。

本明細書で用いるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合性部位を含有する分子とを指す。そのような抗体には、限定されずに、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆ_ａｂ、Ｆ_ａｂ’およびＦ_{（ａｂ’）２}断片、およびＦ_ａｂ発現ライブラリー中の抗体が含まれる。「特異的に結合する」または「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応（すなわち、結合）しないか、または他のポリペプチドとかなりより低い親和性（Ｋ_ｄ＞１０^−６）で結合することを意味する。

基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００から１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして規定する。軽鎖および重鎖の中で、可変および定常領域は約１２またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約１０多くのアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Fundamental Immunology７章（Paul, W.、各、２版、Raven Press、N.Y.（１９８９年））を参照。各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合性部位を形成する。

本明細書で用いるように、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、固有の軽鎖遺伝子生成物および固有の重鎖遺伝子生成物からなる抗体分子の１分子種だけを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子で同一である。ＭＡｂは、それへの固有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合性部位を含有する。

一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関し、それらは分子に存在する重鎖の性質によってお互いに異なる。ある特定のクラスは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２その他などのサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であることができる。

本明細書で用いるように用語「その断片」とは、全体の配列の長さより短いポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のセグメントを意味する。断片は、本明細書で用いるように機能的および非機能的領域を含んだ。異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列からの断片が交換または組み合わされて、ハイブリッドまたは「キメラ」分子を生成する。ポリヌクレオチド配列または他のポリペプチドへのポリペプチド結合特性をモジュレートするためにも、断片が使用される。

本明細書で用いるように、用語「プロモーター配列」とは、そこで開始および転写速度が制御される遺伝子の領域を含むポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位ならびに他の正負の調節エレメントのための結合部位を含む。正の調節エレメントは、プロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を促進する。負の調節エレメントは、プロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を抑制する。本明細書で用いられるプロモーター配列は、調節される遺伝子の上流または内部に見出される。具体的には、用語「第１のプロモーター配列」対「第２のプロモーター配列」は、発現ベクターの中のプロモーター配列の相対的な位置を指す。第１のプロモーター配列は、第２のプロモーター配列の上流にある。

本明細書で用いるように用語「選択遺伝子」とは、所与の培養条件で細胞の生存に必要であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列コードを意味する。細胞が目的の遺伝子を運ぶ発現ベクターを選択遺伝子とともに首尾よく組み込んだならば、その細胞はそれが敵対的な培養条件下で選択的に生存することを可能にするエレメントを生成する。「選択された」細胞は、選択圧の下で生存し、発現ベクターを組み込んでいるに違いない細胞である。本明細書で用いるように用語「選択圧」とは、ＤＮＡ組成物を受けていない細胞の生存を阻害するエレメントの、細胞培地への添加を意味する。

本明細書で用いるように用語「内因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列の中に包含される遺伝子を意味する。本明細書で用いるように用語「外因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列の中に包含されない遺伝子を意味する。外因性遺伝子は、本方法によって細胞に導入される。本明細書で用いるように用語「導入遺伝子」とは、１つの生物体から別の生物体に移された遺伝子を意味する。

本明細書で用いるように、従来の２０アミノ酸およびそれらの略記号は、従来の用法に従う。Immunology - A Synthesis（２版、E.S. GolubおよびD.R. Gren編、Sinauer Associates、Sunderland Mass.（１９９１年））を参照。従来の２０アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−、α−二基置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型のアミノ酸も、本開示のポリペプチドの適する構成成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例には、以下のものが含まれる：４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニンおよび他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で用いられるポリペプチド表記では、標準の用法および規則に従い、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。

同様に、特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。発生期のＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’であるＤＮＡ鎖の上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’であるＤＮＡ鎖の上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。

サイレントまたは保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；および硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、以下の通りである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミン。

サイレントまたは保存的な置き換えは、それらの側鎖が近縁のアミノ酸のファミリーの中で起こるものである。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、以下のファミリーに一般的に分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンである；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびトレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる。他のファミリーのアミノ酸には、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニンの孤立した置き換え、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の置き換えは、特に置き換えがフレームワーク部位の中のアミノ酸を関与させない場合は、結果として生じる分子の結合性または特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性を分析することによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書で詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者が容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ−およびカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くで起こる。構造的および機能的ドメインは、公開のまたは所有権付きの配列データベースとのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの比較によって同定することができる。好ましくは、公知の構造および／または機能の他のタンパク質で見られる配列モチーフまたは予測されるタンパク質立体配座ドメインを同定するために、コンピュータ化された比較方法が使用される。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Bowieら、Science２５３巻：１６４頁（１９９１年）。したがって、前述の例は、本開示による構造的および機能的ドメインを規定するために使用することができる配列モチーフおよび構造的立体配座を当業者が認めることができることを実証する。

サイレントまたは保存的なアミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えないであろう（例えば、置き換えアミノ酸は親配列で見られるヘリックスを壊すか、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向がないであろう）。当技術分野で認められたポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles（Creighton編、W. H. Freeman and Company、New York（１９８４年））；Introduction to Protein Structure（C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.（１９９１年））；およびThorntonら、Nature３５４巻：１０５頁（１９９１年）に記載される。

本明細書の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（Parker, S.編、McGraw-Hill、San Francisco（１９８５年））によって例示されるように、当技術分野の従来の用法に従って使用される。

（実施例１）哺乳動物の細胞でコドン最適化および脱最適化のためにラムダ軽鎖に導入された突然変異
κλ体技術に基づく抗ＣＤ１９×抗ＣＤ４７二重特異的抗体４４は、共通の重鎖および２つの異なる軽鎖によって構成される。これらの鎖は、プラスミド構築物４４によってコードされる（表１）。この発現プラスミドが哺乳動物の細胞でトランスフェクトされるとき、３本の鎖のランダムなアセンブリによって３つの分子が生成される：単一特異的なＩｇＧκ（２つの同一のκ軽鎖を含有する）、単一特異的なＩｇＧλ（２つの同一のλ軽鎖を含有する）および二重特異的ＩｇＧκλ（１つのκ軽鎖および１つのλ軽鎖を含有する）。２つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、３つの分子の理論比はＩｇＧκ２５％、ＩｇＧλ２５％およびＩｇＧκλ５０％であるはずである。構築物４４の場合、二重特異的抗体の最適以下の発現および収率につながるλ軽鎖の優先発現がある。この状況を改善するために、鎖の相対比を調整するために異なる鎖の最適化ならびに脱最適化が実行された。

コドン最適化は、重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖に対してＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ）で実行した。二重特異的抗体４４をコードする野生型プラスミドに最適化されたかまたはされていない鎖をクローニングすることによって、異なる候補を生成した。

過度に発現されるラムダ鎖に対して、３つの異なるレベルのコドン脱最適化を実行した。３つの構築物（３、１３および１９の脱最適化ラムダ鎖）を生成し、最適化された重鎖およびカッパ鎖と組み合わせた。異なる程度の脱最適化を、λ軽鎖に適用した。構築物３、１３および１９は、ますます脱最適化された配列を含有していた（それぞれＶＬＣＬ２−１、ＶＬＣＬ２−２およびＶＬＣＬ２−３、図１を参照）。最適化されたラムダ鎖を有する構築物１７および１５も生成した（表１）。

（実施例２）Ｐｅａｋ細胞で発現されるＩｇＧのクローニングおよび特徴付け
共通の重鎖および２本の軽鎖（１つのカッパおよび１つのラムダ）の野生型、最適化または脱最適化されたコドンを、３つの独立したＣＭＶプロモーターの下に単一の哺乳動物の発現ｐＮＯＶＩベクターにクローニングした。配列検証の後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して２つの独立した一時的トランスフェクションによって、各構築物のＩｇＧ生産性をＰｅａｋ細胞で評価した。トランスフェクションの７日後に、全体のＩｇＧ発現をＯｃｔｅｔ技術によって評価した。候補１５を除いて、全体のＩｇＧ生産性に関して候補間に大きな差は観察されなかった。全ての鎖が最適化された構築物１５で、生産性の低下傾向が観察された（図２）。ＰＥＡＫ細胞での１０日間の生成の後、全体のＩｇＧをＦｃＸＬ樹脂で精製した。

ＩｇＧの３つの異なる形、単一特異的ラムダ、単一特異的カッパおよび二重特異的抗体の分布を、ＰｒｏＰａｃＨＩＣ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用してＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析によって決定した（図３Ａ）。８５から３５％への移動相Ａ（０．００１Ｍリン酸緩衝液＋１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ３．５）の勾配、および１５％から１００％への移動相Ｂ（０．００１Ｍリン酸緩衝液＋アセトニトリル１０％、ｐＨ３．５）の漸増勾配を適用した。ブランクは、移動相Ａ（ｐＨ７）で実行した。ＨＩＣ面積ピークの分析（図３Ｂ）は、野生型４４ならびに最適化１５および１７と比較した脱最適化候補３、１３および１９についての二重特異的の百分率の増加の傾向を示す。３、１３および１９についての単一特異的なカッパおよびラムダの比は、４４と比較して有意に異なった。

全体のＩｇＧの分布を評価するために、ＩＥＦ７〜１１％も実行した（図４）。ラムダ最適化を有する候補は、クローン４４と比較して単一特異的ラムダの増加ならびにより少ない単一特異的カッパおよび二重特異的を示す。候補３、１３および１９は、単一特異的カッパおよび二重特異的の有意な増加を示した。

表２では、ＰＥＡＫ細胞で発現された候補について得られたデータを要約する。候補３、１３および１９については、得られた二重特異的の最終百分率はより高く、二重特異的比の増加は４４に対する２１．６％から候補１３に対する４２．９％であった。興味深いことに、ラムダ鎖の最も高いコドン脱最適化（構築物１９）レベルは、二重特異的抗体の生産性を増加させる。

（実施例３）安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞でのＩｇＧ発現
エレクトロポレーションによるトランスフェクションおよびＭＳＸによる選択の後、ＦＡＣＳによるスクリーニングを実行した。流加条件での生産のために、最も高い生産性のプールを選択した。Ｏｃｔｅｔ技術によって、全体のＩｇＧ生産性を異なるプールについて評価した（図５）。プロテインＡによる精製の後、還元および変性条件で重鎖および軽鎖のサイズをモニタリングするＡｇｉｌｅｎｔタンパク質８０チップでの電気泳動によって、異なる鎖の比を評価した。

Ａｇｉｌｅｎｔ分析（図６Ａ）に示すように、４４については、ラムダ鎖はカッパ鎖より多く示された。いくつかのＣＨＯプールについては、構築物３および１３は２つの軽鎖の間の平衡を改善した。ラムダ鎖の増加した脱最適化により、初期構築物と比較したとき、比は逆転した（４４対１９）。これは、２つの軽鎖の間の比を計算することによって確認された（図６Ｂ）。したがって、４４ではラムダ鎖に有利であった２つの軽鎖の間の平衡は徐々に覆され、脱最適化のレベルと相関した。全ての生産的なプールを分析するとき、候補１３、１９と候補４４の間で有意な差を観察することができ、カッパ軽鎖がより多く、ラムダ軽鎖はより少ない。これらの結果に基づくと、２つの軽鎖はより同等のレベルで発現されるので、候補３および１３はＢｓＡｂ発現の増加を示すはずである。プロテインＡによる精製の後、全てのＩｇＧ生産性プールについて、ＩｇＧの異なる形の比をＨＩＣによって評価した（図７）。データは、単一特異的なラムダのレベルが脱最適化レベルと一緒に徐々に減少することを示し、単一特異的なカッパでは逆のパターンが観察される。構築物３および１３では、二重特異的レベルは概ね４０％の最大値に到達し、非常に均一な分布である。対照的に、２つの鎖（４４または１９の場合のように）のうちの１つの不均衡な発現は、二重特異的生成レベルの低減につながる。

それらの標的に対する特異的結合性を確認するために、ＥＬＩＳＡによってｈＣＤ１９およびｈＣＤ４７への結合について全ての候補を評価した（図８）。二重特異的抗体の２つの特異的標的およびＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬの無関係なタンパク質を、９６ウェルのストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）による３回の洗浄の後、ＰＢＳＴ１％ＢＳＡで２μｇ／ｍＬに希釈した精製抗体を、プレートの中において３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗ヒトＩｇＧＦｃ）を追加して、３７℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡを明らかにするためにテトラメチルベンジジンを使用し、硫酸でブロックした。吸光度を、４５０ｎｍで読み取った。

各候補の発現をスケールアップし、１０日後に上清を収集し、遠心分離により１，３００ｇで１０分間清澄化した。精製過程は、３つの親和性ステップで構成された。１番目に、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＩｇＧ−ＣＨ１親和性マトリックス（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＰＢＳで洗浄し、次に清澄化した上清に加えた。４℃で一晩のインキュベーションの後、上清を１，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、樹脂をＰＢＳで２回洗浄した。次に、樹脂をスピンカラムに移し、ｐＨ２．７の５０ｍＭグリシン含有溶液を溶出のために使用した。

いくつかの溶出分画を採取し、プールし、５０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルターユニット（ＭｅｒｃｋＫＧａＡ）を使用してＰＢＳに対して脱塩した。上清からの全体のヒトＩｇＧを含有する最終生成物は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）の適当な量と一緒に室温および２０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。インキュベーション、樹脂回収、溶出および脱塩ステップは、以前に記載されるように実行した（Fischerら、Nature Comms.２０１５年）。最後の親和性精製ステップは、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂を使用して実行した。全体のＩｇＧ、ＨＩＣで測定される二重特異的抗体百分率、およびＣＨＯ細胞プールからの精製された二重特異的生産性は、表３に要約される。データは、ラムダ鎖の脱最適化および低減された発現が、全体のＩｇＧ生産性および二重特異的生成物の増加につながることを示す。最適化方法は、２．５倍の二重特異的抗体の収率の増加を起こさせた。

Claims

１つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
（ａ）前記複合体中の他のポリペプチドと比較して、細胞内でより豊富に発現される前記複合体中の１つまたは複数のポリペプチドを同定すること；
（ｂ）前記複合体中の前記より豊富に発現されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を改変して、それがコードする前記ポリペプチドの発現の低減をもたらすこと；
（ｃ）前記核酸分子を細胞に導入すること；および
（ｄ）前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること
を含み、前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはｍＲＮＡ安定性の改変によって達成される、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、ｍＲＮＡ二次構造の改変によって達成される、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、ｍＲＮＡ安定性の改変、ｍＲＮＡ二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項４に記載の方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項５に記載の方法。
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの１つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、請求項６に記載の方法。
前記二重特異的抗体が２つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
１つを超えるタンパク質複合体が共発現される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。