JP2020096641A - ヘテロ多量体タンパク質複合体のアセンブリおよび産生を最適化する方法 - Google Patents
ヘテロ多量体タンパク質複合体のアセンブリおよび産生を最適化する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】タンパク質複合体の発現を改善するための方法を提供する。【解決手段】本開示の方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で開示される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされたCHO細胞の両方における生産性と最終的な二重特異的収率との有意な増加をもたらす。したがって、1つまたはいくつかのポリペプチドの発現の低減は、生産性の全体的増加をもたらすことができる。本明細書で提供される例はκλ体を使用するが、本明細書で開示される方法は他の二重特異的抗体フォーマットおよびいくつかの異なるポリペプチドで構成される任意の他のタンパク質複合体に適用可能である。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、2015年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/141,009号の優先権を主張し、当該出願の各内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
本出願は、2015年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/141,009号の優先権を主張し、当該出願の各内容は、その全体が本明細書において参考として援用される。
発明の分野
複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する方法が提供される。これらの方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で提供される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされた哺乳動物細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率との有意な増加をもたらす。
複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する方法が提供される。これらの方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で提供される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされた哺乳動物細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率との有意な増加をもたらす。
発明の背景
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を作動するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を作動するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。
一部のタンパク質は、共有結合または非共有結合的に連結することができる、複合体中で会合可能な数個のポリペプチドで構成される。抗体は、ジスルフィド結合によって連結する4つのポリペプチド(すなわち、2つの重鎖および2つの軽鎖)で構成されることからそのようなクラスのタンパク質の一例である。それらの商業上および治療上の重要性のために、CHO細胞における抗体の発現は、抗体を構成する2つの鎖の発現の最大化を目指した最適化の熱心な努力の対象であった。しかし、発現レベルは抗体間で最大200倍も変動することがあるので、大きな差が観察されることがある。
以前の最適化アプローチは、より高い生成収率を達成するためにポリペプチドの発現レベルの増加を目指した。複数のポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の場合、不均衡な発現は所望の分子のアセンブリを制限し、望ましくない生成物の生成を促進し、全体の生成収率を制限する可能性がある。したがって、タンパク質複合体の発現を改善するための方法の必要性が存在する。
本開示の方法は、複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する。以前に記載されたアプローチと対照的に、タンパク質複合体中の1つまたはいくつかのポリペプチドの発現を低減することは、タンパク質複合体のアセンブリおよび収率を増強する。本方法は、複数のポリペプチドの共発現にしばしば依存する二重特異的抗体の発現および収率を最適化するのに特に適している。構成成分の1つの不均衡な発現(必要以上に高いか必要以上に低い)は、所望の最終生成物の有意な減少および望ましくない副産物の生成の増加につながる可能性がある。この限界は、IgG様二重特異的フォーマットならびに抗体断片に基づくフォーマットの両方に影響を与え得る。
本方法は、κλ体と命名された二重特異的抗体(Fischerら、Exploiting light chains for the scalable generation and platform purification of native human bispecific IgG., Nat. Comms、6巻:6113頁(2015年))の発現の最適化のために特に適用可能である。この技術は、共通の重鎖および2つの異なる軽鎖(1つのカッパおよび1つのラムダ)で構成される完全ヒト二重特異的抗体(BsAb)を生成する(例えば、WO2012/023053を参照)。2つの単一特異的抗体IgGκおよびIgGλに加えて1本のκおよび1本のλ鎖を含有する二重特異的抗体(κλ体)を生成するために、これらの3つの鎖を含む独自のトリシストロン性ベクターが哺乳動物細胞に導入される。
原理上、2つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、3つの分子の比はIgGκ25%、IgGλ25%およびIgGκλ50%であるはずである。しかし、2つの鎖の不均衡な発現レベルが時には観察され、二重特異的収率の低下につながる。1つの解決方法は、バランスを回復するために、より低く発現される鎖の発現を増加させると予想される。しかし、このアプローチは不成功だった(本明細書で提供される実施例に示される通り)。
対照的に、本開示の方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で開示される方法は、一時的発現系ならびに安定してトランスフェクトされたCHO細胞の両方における生産性と最終的な二重特異的収率との有意な増加をもたらす。したがって、1つまたはいくつかのポリペプチドの発現の低減は、生産性の全体的増加をもたらすことができる。本明細書で提供される例はκλ体を使用するが、本明細書で開示される方法は他の二重特異的抗体フォーマットおよびいくつかの異なるポリペプチドで構成される任意の他のタンパク質複合体に適用可能である。
一部の実施形態では、本開示は、ポリペプチドの1つまたはいくつかの発現率を低下させることによって、いくつかのポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドの1つの発現の低減は、転写率、翻訳率またはmRNA安定性の改変によって達成される。一部の実施形態では、ポリペプチドの1つの発現率の低減は、mRNA二次構造の改変によって達成される。一部の実施形態では、ポリペプチドの1つの発現の低減は、転写率の改変、翻訳率の改変、mRNA安定性の改変、mRNA二次構造の改変またはこれらの要素のいずれかの組合せによって達成される。
一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、そのポリペプチドのコドン組成の変更によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変およびそのポリペプチドのコドン組成の変更によって達成される。
一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、そのタンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通して、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変、およびそのタンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。
一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変によって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、そのタンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通して、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。一部の実施形態では、タンパク質複合体中のポリペプチドの1つの発現の低減は、翻訳率の改変、およびそのタンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドのコドン組成を変更することによって達成される。
一部の実施形態では、タンパク質複合体は、多重特異的抗体である。一部の実施形態では、タンパク質複合体は、二重特異的抗体である。一部の実施形態では、二重特異的抗体は2つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される。
一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトラムダ軽鎖およびヒトカッパ軽鎖を含む。
一部の実施形態では、二重特異的抗体は第1および第2の抗原結合性領域を含み、各々は少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む。一部の実施形態では、第1および第2の抗原結合性領域は、各々少なくとも2つのCDRを含む。一部の実施形態では、第1および第2の抗原結合性領域は、各々3つのCDRを含む。一部の実施形態では、CDRは免疫グロブリン重鎖に由来する。一部の実施形態では、重鎖はヒト重鎖である。一部の実施形態では、CDRはラムダ軽鎖に由来する。一部の実施形態では、CDRはカッパ軽鎖に由来する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合性領域は第1の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、第2の抗原結合性領域は第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。
一部の実施形態では、第1および第2の免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、ヒトCDR、マウスCDR、ラットCDR、ウサギCDR、サルCDR、類人猿CDR、合成CDRおよび/またはヒト化CDRを独立して含む。一部の実施形態では、CDRはヒトであり、体細胞突然変異している。
一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトフレームワーク領域(FR)を含む。一部の実施形態では、ヒトFRは、体細胞突然変異したヒトFRである。
一部の実施形態では、二重特異的抗体は、目的の抗原に対する反応性について抗体可変領域を含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
一部の実施形態では、二重特異的抗体の第1および/または第2の抗原結合性領域は、マウス、ラット、ウサギ、サルまたは類人猿などのヒト以外の動物を目的の抗原で免疫化し、目的の抗原に特異的な可変領域をコードする抗体可変領域核酸配列を同定することによって得られる。
一部の実施形態では、二重特異的抗体は完全ヒト二重特異的抗体であり、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲内の各エピトープへの親和性を独立して有する。
一部の実施形態では、二重特異的抗体はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。一部の実施形態では、二重特異的抗体は非天然ヒトT細胞エピトープを欠く。一部の実施形態では、CH1領域の改変はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は重鎖を含み、この重鎖はヒトにおいて非免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性である。
一部の実施形態では、重鎖は、非天然のT細胞エピトープを含有しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、重鎖は、そのタンパク質分解物がヒトで免疫原性である約9アミノ酸のアミノ酸配列を形成することができないアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヒトは、抗原結合性タンパク質で治療されるヒトである。一部の実施形態では、重鎖は、そのタンパク質分解物がヒトで免疫原性である約13〜約17アミノ酸のアミノ酸配列を形成することができないアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ヒトは、抗原結合性タンパク質で治療されるヒトである。
一部の実施形態では、1を超えるタンパク質複合体が共発現される。一部の実施形態では、1を超える抗体が共発現される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
1つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
(a)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸分子を用意すること;
(b)前記核酸分子を細胞に導入すること;
(c)前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること;および
(d)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの少なくとも1つの発現を減少させること
を含む方法。
(項目2)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはmRNA安定性の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、mRNA二次構造の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、mRNA安定性の改変、mRNA二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記タンパク質複合体が多重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記二重特異的抗体が2つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、項目9に記載の方法。
(項目11)
1つを超えるタンパク質複合体が共発現される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記タンパク質複合体が抗体であり、1つを超える抗体が共発現される、項目11に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
1つを超えるポリペプチドを含むタンパク質複合体の生成収率を増加させる方法であって、
(a)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸分子を用意すること;
(b)前記核酸分子を細胞に導入すること;
(c)前記タンパク質複合体中のポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること;および
(d)前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの少なくとも1つの発現を減少させること
を含む方法。
(項目2)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率、翻訳率またはmRNA安定性の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、mRNA二次構造の改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、転写率の改変、翻訳率の改変、mRNA安定性の改変、mRNA二次構造の改変、またはこれらの要素の任意の組合せの改変によって達成される、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、そのポリペプチドのコドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記タンパク質複合体中の前記ポリペプチドの1つの発現の低減が、前記タンパク質複合体の発現のために使用される哺乳動物宿主細胞においてより低い頻度で使用されるコドンでのある特定のコドンの置き換えを通してそのポリペプチドの前記コドン組成を変更することによる翻訳率の改変によって達成される、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記タンパク質複合体が多重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記タンパク質複合体が二重特異的抗体である、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記二重特異的抗体が2つの異なる軽鎖および共通の重鎖で構成される、項目9に記載の方法。
(項目11)
1つを超えるタンパク質複合体が共発現される、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記タンパク質複合体が抗体であり、1つを超える抗体が共発現される、項目11に記載の方法。
細菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物の細胞での組換え発現は、研究ならびに治療的適用のために使用されるタンパク質の生成のための基礎となる。最近、培地組成、発酵パラメータなどの複数のパラメータを最適化することによって、ならびに目的の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を推進するために使用される構築物の最適化によって、チャイニーズハムスター卵巣細胞での組換えタンパク質発現の収率が有意に増強された。これらには、転写および翻訳レベルでの、ならびにmRNAの二次構造および安定性での改善が含まれる。別の重要な要素は、それが発現宿主に適合し、低い存在度のtRNAによる限界を回避するように、コドン利用を最適化することである。最適化過程には、配列反復配列、キラーモチーフおよびスプライス部位の除去が含まれてもよく、安定したRNA二次構造は回避される。コドン利用およびGC含有量は、CHO細胞または他の宿主細胞での発現のために同時に調整することができる。そのような改変の狙いは、所望のポリペプチドの翻訳、したがって発現が最大になるように、RNAの翻訳および安定性を最大にすることである。
一部のタンパク質は、共有結合または非共有結合的に連結することができる、複合体中で会合可能な数個のポリペプチドで構成される。抗体はジスルフィド結合によって連結する4つのポリペプチド(すなわち、2つの重鎖および2つの軽鎖)で構成されることからそのようなクラスのタンパク質の一例である。抗体は、Fab部分によって作動される標的抗原への特有の特異性を有し、それらのFc部分を通して免疫にかかわることができる。がんのためのいくつかの現在使用されている生物学的療法は、標的化がん細胞によって過剰発現される抗原に対するモノクローナル抗体である。そのような抗体が腫瘍細胞に結合するとき、抗体依存性の細胞毒性(ADCC)、抗体依存性の細胞性食作用または補体依存性細胞傷害性(CDC)などのいくつかの過程を誘発することができる。それらの商業上および治療上の重要性のために、CHO細胞における抗体の発現は、抗体を構成する2つの鎖の発現の最大化を目指した最適化の熱心な努力の対象であった。しかし、発現レベルは抗体間で最大200倍も変動することがあるので、大きな差が観察されることがある。発現レベルは、軽鎖合成のレベル、ならびにアセンブリのための重鎖および軽鎖の適合性を含むいくつかの要素によって決定される。軽鎖の高い発現が、完全抗体の全体的な分泌速度のために有益であるようである(Strutzenbergerら、Changes during subclone development and ageing of human antibody-producing recombinant CHO cells、J. Biotechnol.、69巻(2〜3号):215〜16頁(1999年))。実際に、軽鎖発現の低減は小胞体での重鎖の蓄積につながり、生産性を制限する。
モノクローナル抗体で単一タンパク質を標的にするかまたは中和することは、効能を達成するのに必ずしも十分でなく、このことはモノクローナル抗体の治療的使用を制限する。いくつかの疾患で、生物系の1つの構成成分の中和は有益な効果を提供するのに十分でないことがますます明らかになっている。したがって、1つを超える抗原を係合することが可能な多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体が開発されている。多数の二重特異的抗体フォーマットが記載されており、2つの二重特異的抗体がこれまで承認され、他の多くは現在臨床試験中である(Kontermann RE、Brinkmann U.、Bispecific antibodies、Drug Discover Today、(2015年)、dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2015.02.2008で入手可能)。多くの場合に、二重特異的抗体は2つを超えるポリペプチドで構成される。正しいアセンブリは、そこから二重特異的抗体を精製することができる分子の混合物につながる、鎖のランダムな対形成に基づくことができる。あるいは、所望の対形成を好ましくは得ることができるように、鎖の接点を工学的に操作することができる。いずれの場合も、複数の鎖の共発現は、より高い複雑性および相対的な発現率を伴い、したがって、二重特異的分子を構成する鎖の存在度は、全体的な収率およびアセンブリの効率に大きな影響を潜在的に及ぼす可能性がある。
以前の最適化アプローチは、より高い生成収率を達成するためにポリペプチドの発現レベルの増加を目指した。複数のポリペプチドで構成されるタンパク質複合体の場合、不均衡な発現は所望の分子のアセンブリを制限し、望ましくない生成物の生成を促進し、全体の生成収率を制限する可能性がある。
本開示の方法は、複合体のアセンブリのために必要とされる各構成成分の発現レベルを調整することによってタンパク質複合体の発現を改善する。本開示の方法は、優勢な鎖の発現を制限し、こうしてそれらの相対的存在度を平衡させるのに有効である。本明細書で開示される方法は、一時的発現系に加えて安定してトランスフェクトされたCHO細胞の両方における生産性と最終二重特異的収率の有意な増加をもたらす。したがって、1つまたはいくつかのポリペプチドの発現の低減は、生産性の全体的増加をもたらすことができる。
表1は、異なる配列最適化および脱最適化レベルで生成された構築物を表す表である。
使用される配列は、下の表1.1、1.2および1.3に示す。
表2は、各構築物のための以下のデータ:精製の後の全IgGおよび二重特異的抗体の量ならびにHICで決定された二重特異性の割合を示す表である。
表3は、各構築物の代表的プールのための、全体のIgG生産性、プロテインA精製の後のHICによる二重特異性%、およびCHO細胞培養上清からの精製された二重特異性の量を表す。
本明細書で提供される方法で使用されるポリヌクレオチドおよびその構築物は、当業者に公知のいくつかの異なるプロトコールによって合成的に生成することができる。適当なポリヌクレオチド構築物は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2版、(1989年)Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに記載される標準の組換えDNA技術を使用して、および、United States Dept.of HHS、National Institute of Health(NIH)による組換えDNA研究のためのガイドラインに記載される現在の規制の下で精製される。
ベクターに挿入された本明細書に記載される核酸を含む構築物も提供され、そのような構築物は、下でより詳細に記載されるようにいくつかの異なるスクリーニング適用のために使用することができる。一部の実施形態では、単一のベクター(例えば、プラスミド)は、単一のペプチド提示足場のための核酸コード配列を含有する。他の実施形態では、単一のベクター(例えば、プラスミド)は、2つまたはそれを超えるペプチド提示足場のための核酸コード配列を含有する。
プラスミドを含むウイルスおよび非ウイルスベクターを調製し、使用することができ、それらは宿主細胞でバイオセンサーをコードするDNAの複製および/または発現を可能にする。ベクターの選択は、増殖が所望される細胞型および増殖の目的に依存する。大量の所望のDNA配列を増幅し、作製するために、ある特定のベクターが有益である。培養の細胞での発現のために、他のベクターが適する。全体の動物またはヒトの細胞での形質転換および発現のために、さらに他のベクターが適する。適当なベクターの選択は、当分野の技術の範囲内である。多くのそのようなベクターが市販されている。構築物を調製するために、一般的にベクター中の切断された制限酵素部位へのDNAリガーゼ結合によって、部分的または完全長のポリヌクレオチドがベクターに挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列を、in vivoで相同組換えによって挿入することができる。一般的に、これは、所望のヌクレオチド配列に隣接して、ベクターに相同領域を付着させることによって達成される。オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または、例えば相同領域および所望のヌクレオチド配列の一部を含むプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって、相同領域は追加される。
他の適用がある中でとりわけ、ペプチド提示足場の合成で使用できる、発現カセットまたは系も提供される。発現のために、本開示のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子生成物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳動物の系を含む任意の便利な発現系で発現される。適するベクターおよび宿主細胞は、米国特許第5,654,173号に記載される。発現ベクターでは、所望の発現特性を得るために、ポリヌクレオチドは適宜調節配列に連結される。これらの調節配列には、プロモーター(センス鎖の5’末端またはアンチセンス鎖の3’末端のいずれかに付着する)、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサーを含めることができる。プロモーターは調節することができるか、または構成的であってもよい。一部の状況では、組織特異的または発達段階特異的プロモーターなどの、条件付きで活性なプロモーターを使用することが望ましいことがある。ベクターへの連結のために上で記載の技術を使用して、これらは所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野で公知である任意の技術を使用することができる。言い換えると、発現ベクターは、誘導可能または構成的であり得る転写および翻訳の開始領域を提供し、コード領域は、転写開始領域ならびに転写および翻訳の終止領域の転写制御下で作動可能に連結される。これらの制御領域は、その核酸が得られる種に固有のものであってもよいし、または外因性供与源に由来してもよい。
使用に適する真核生物のプロモーターには、限定されずに以下のものが含まれる:マウスメタロチオネインI遺伝子配列のプロモーター(Hamerら、J. Mol. Appl. Gen.1巻:273〜288頁、1982年);ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight、Cell 31巻:355〜365頁、1982年);SV40初期プロモーター(Benoistら、Nature(London)290巻:304〜310頁、1981年);酵母ゴール遺伝子配列プロモーター(Johnstonら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)79巻:6971〜6975頁、1982年);Silverら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)81巻:5951〜59SS頁(1984年)、CMVプロモーター、EF−1プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターなど。
プロモーターは、さらに、構成的または調節可能であってもよい。誘導可能なエレメントは、プロモーターと連携して作用し、リプレッサー(例えば、E.coliのlacO/LAC Iqリプレッサー系)またはインデューサー(例えば、酵母のゴール/GAL4インデューサー系)に結合することができる、DNA配列エレメントである。そのような場合、プロモーターが脱抑制または誘導されるまで転写は事実上「オフ」にされ、その時点で転写は「オン」にされる。
発現ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能にするために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を一般的に有する。発現宿主で作動可能な選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、とりわけ、後にさらに詳しく記載されるスクリーニング方法のために使用することができる。
転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終止領域を含む発現カセットを調製することができる。DNAの導入の後、構築物を含有する細胞を選択マーカーによって選択することができ、細胞を増殖させ、その後発現のために使用することができる。
上記の発現系は、発現の目的によって、従来の方法に従って原核生物または真核生物で用いることができる。一部の実施形態では、単細胞生物、例えばE.coli、B.subtilis、S.cerevisiae、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物などのより高等な生物体の細胞、例えば、COS7細胞、HEK293、CHO、アフリカツメガエル卵細胞などを、発現宿主細胞として使用することができる。他の状況では、真核生物の細胞を使用することが望ましく、その場合、発現されるタンパク質は天然の折畳みおよび翻訳後修飾から恩恵を受ける。
目的の具体的な発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞由来の発現系が含まれる。細菌の発現系には、Changら、Nature(1978年)275巻:615頁;Goeddelら、Nature(1979年)281巻:544頁;Goeddelら、Nucleic Acids Res.(1980年)8巻:4057頁;欧州特許第0 036,776号;米国特許第4,551,433号;DeBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)(1983年)80巻:21〜25頁;およびSiebenlistら、Cell(1980年)20巻:269頁に記載される発現系が含まれる。
哺乳動物の発現は、Dijkemaら、EMBO J.(1985年)4巻:761頁、Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1982年)79巻:6777頁、Boshartら、Cell(1985年)、41巻:521頁および米国特許第4,399,216号に記載されている通りに達成される。哺乳動物の発現の他の特徴は、HamおよびWallace、Meth. Enz.(1979年)58巻:44頁、BarnesおよびSato、Anal. Biochem.(1980年)102巻:255頁、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開第90/103430号、国際公開第87/00195号およびU.S.RE30,985に記載されている通りに促進される。
当業者によって認められるように、使用に適する宿主細胞型は広く異なり得る。一部の実施形態では、細胞は細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、生物学的実体は細菌細胞である。一部の実施形態では、細菌細胞はEscherichia coli、Shigella sonnei、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Salmonella typhii、Salmonella typhimurium、Salmonella enterica、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Yersinia pestis、Bacillus cereus、Bacillus subtilisまたはKlebsiella pneumoniaeである。
この構築物は、本開示の細胞系を生成するために当業者によって実施される標準手段のいずれか1つによって、宿主細胞に導入することができる。核酸構築物は、例えば、カチオン性脂質によって(Goddardら、Gene Therapy、4巻:1231〜1236頁、1997年;Gormanら、Gene Therapy4巻:983〜992頁、1997年;Chadwickら、Gene Therapy4巻:937〜942頁、1997年;Gokhaleら、Gene Therapy4巻:1289〜1299頁、1997年;GaoおよびHuang、Gene Therapy2巻:710〜722頁、1995年、この全ては参照により本明細書に組み込まれる)、ウイルスベクターを使用して(Monahanら、Gene Therapy4巻:40〜49頁、1997年;Onoderaら、Blood91巻:30〜36頁、1998年、この全ては参照により本明細書に組み込まれる)、「ネイキッドDNA」の取り込み、などによって送達することができる。
定義
特記されない限り、本開示に関連して使用される科学的および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から特に必要とされない限り、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびその技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。組換えDNAおよびオリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)のために、標準技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載される通りに実行される。前述の技術および手順は、当技術分野で周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書全体において引用され、議論される様々な一般的およびより特定の参考文献に記載される通りに一般的に実行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年))を参照。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達および患者の治療のために、標準技術が使用される。
特記されない限り、本開示に関連して使用される科学的および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈から特に必要とされない限り、単数形用語は複数形を含み、複数形用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴ−またはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、およびその技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。組換えDNAおよびオリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)のために、標準技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載される通りに実行される。前述の技術および手順は、当技術分野で周知である従来の方法に従って、ならびに本明細書全体において引用され、議論される様々な一般的およびより特定の参考文献に記載される通りに一般的に実行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989年))を参照。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、送達および患者の治療のために、標準技術が使用される。
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする:
本明細書で言及される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形の、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドのポリマーホウ素を意味する。この用語は、DNAの一本鎖および二本鎖形を含む。
本明細書で用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片または突然変異体を指す一般的な用語として使用される。したがって、天然タンパク質、断片、および突然変異体は、ポリペプチド属の種である。本開示による好ましいポリペプチドは、サイトカインおよび抗体を含む。
本明細書で用いるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン(Ig)分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する(免疫反応する)抗原結合性部位を含有する分子とを指す。そのような抗体には、限定されずに、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片、およびFab発現ライブラリー中の抗体が含まれる。「特異的に結合する」または「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応(すなわち、結合)しないか、または他のポリペプチドとかなりより低い親和性(Kd>10−6)で結合することを意味する。
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一の対で構成され、各対は1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100から110またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして規定する。軽鎖および重鎖の中で、可変および定常領域は約12またはそれを超えるアミノ酸の「J」領域によって連結され、重鎖は約10多くのアミノ酸の「D」領域も含む。一般的に、Fundamental Immunology7章(Paul, W.、各、2版、Raven Press、N.Y.(1989年))を参照。各軽/重鎖対の可変領域は、抗体結合性部位を形成する。
本明細書で用いるように、用語「モノクローナル抗体」(MAb)または「モノクローナル抗体組成物」は、固有の軽鎖遺伝子生成物および固有の重鎖遺伝子生成物からなる抗体分子の1分子種だけを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)は、集団の全ての分子で同一である。MAbは、それへの固有の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合性部位を含有する。
一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのいずれかに関し、それらは分子に存在する重鎖の性質によってお互いに異なる。ある特定のクラスは、IgG1、IgG2その他などのサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であることができる。
本明細書で用いるように用語「その断片」とは、全体の配列の長さより短いポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のセグメントを意味する。断片は、本明細書で用いるように機能的および非機能的領域を含んだ。異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列からの断片が交換または組み合わされて、ハイブリッドまたは「キメラ」分子を生成する。ポリヌクレオチド配列または他のポリペプチドへのポリペプチド結合特性をモジュレートするためにも、断片が使用される。
本明細書で用いるように、用語「プロモーター配列」とは、そこで開始および転写速度が制御される遺伝子の領域を含むポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター配列は、RNAポリメラーゼ結合部位ならびに他の正負の調節エレメントのための結合部位を含む。正の調節エレメントは、プロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を促進する。負の調節エレメントは、プロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を抑制する。本明細書で用いられるプロモーター配列は、調節される遺伝子の上流または内部に見出される。具体的には、用語「第1のプロモーター配列」対「第2のプロモーター配列」は、発現ベクターの中のプロモーター配列の相対的な位置を指す。第1のプロモーター配列は、第2のプロモーター配列の上流にある。
本明細書で用いるように用語「選択遺伝子」とは、所与の培養条件で細胞の生存に必要であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列コードを意味する。細胞が目的の遺伝子を運ぶ発現ベクターを選択遺伝子とともに首尾よく組み込んだならば、その細胞はそれが敵対的な培養条件下で選択的に生存することを可能にするエレメントを生成する。「選択された」細胞は、選択圧の下で生存し、発現ベクターを組み込んでいるに違いない細胞である。本明細書で用いるように用語「選択圧」とは、DNA組成物を受けていない細胞の生存を阻害するエレメントの、細胞培地への添加を意味する。
本明細書で用いるように用語「内因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列の中に包含される遺伝子を意味する。本明細書で用いるように用語「外因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列の中に包含されない遺伝子を意味する。外因性遺伝子は、本方法によって細胞に導入される。本明細書で用いるように用語「導入遺伝子」とは、1つの生物体から別の生物体に移された遺伝子を意味する。
本明細書で用いるように、従来の20アミノ酸およびそれらの略記号は、従来の用法に従う。Immunology - A Synthesis(2版、E.S. GolubおよびD.R. Gren編、Sinauer Associates、Sunderland Mass.(1991年))を参照。従来の20アミノ酸の立体異性体(例えば、D−アミノ酸)、非天然アミノ酸、例えばα−、α−二基置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型のアミノ酸も、本開示のポリペプチドの適する構成成分であり得る。非従来型のアミノ酸の例には、以下のものが含まれる:4ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−N,N,N−トリメチルリシン、ε−N−アセチルリシン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリシン、σ−N−メチルアルギニンおよび他の類似のアミノ酸およびイミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)。本明細書で用いられるポリペプチド表記では、標準の用法および規則に従い、左方向はアミノ末端方向であり、右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は5’方向と呼ばれる。発生期のRNA転写物の5’から3’付加の方向は、転写方向と呼ばれ、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の5’末端の5’であるDNA鎖の上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の3’末端の3’であるDNA鎖の上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
サイレントまたは保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する一群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり;脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する一群のアミノ酸は、セリンおよびトレオニンであり;アミド含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、アスパラギンおよびグルタミンであり;芳香族側鎖を有する一群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり;塩基性側鎖を有する一群のアミノ酸は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり;および硫黄含有側鎖を有する一群のアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、以下の通りである:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミン。
サイレントまたは保存的な置き換えは、それらの側鎖が近縁のアミノ酸のファミリーの中で起こるものである。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、以下のファミリーに一般的に分けられる:(1)酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である;(2)塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンである;(3)非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、(4)非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、セリンおよびトレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが含まれる。他のファミリーのアミノ酸には、(i)脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン;(ii)アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン;(iii)脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン;ならびに(iv)芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるトレオニンの孤立した置き換え、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似の置き換えは、特に置き換えがフレームワーク部位の中のアミノ酸を関与させない場合は、結果として生じる分子の結合性または特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性を分析することによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書で詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者が容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ−およびカルボキシ−末端は、機能的ドメインの境界近くで起こる。構造的および機能的ドメインは、公開のまたは所有権付きの配列データベースとのヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列データの比較によって同定することができる。好ましくは、公知の構造および/または機能の他のタンパク質で見られる配列モチーフまたは予測されるタンパク質立体配座ドメインを同定するために、コンピュータ化された比較方法が使用される。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は、公知である。Bowieら、Science253巻:164頁(1991年)。したがって、前述の例は、本開示による構造的および機能的ドメインを規定するために使用することができる配列モチーフおよび構造的立体配座を当業者が認めることができることを実証する。
サイレントまたは保存的なアミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えないであろう(例えば、置き換えアミノ酸は親配列で見られるヘリックスを壊すか、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向がないであろう)。当技術分野で認められたポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton編、W. H. Freeman and Company、New York(1984年));Introduction to Protein Structure(C. BrandenおよびJ. Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.(1991年));およびThorntonら、Nature354巻:105頁(1991年)に記載される。
本明細書の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S.編、McGraw-Hill、San Francisco(1985年))によって例示されるように、当技術分野の従来の用法に従って使用される。
(実施例1)哺乳動物の細胞でコドン最適化および脱最適化のためにラムダ軽鎖に導入された突然変異
κλ体技術に基づく抗CD19×抗CD47二重特異的抗体44は、共通の重鎖および2つの異なる軽鎖によって構成される。これらの鎖は、プラスミド構築物44によってコードされる(表1)。この発現プラスミドが哺乳動物の細胞でトランスフェクトされるとき、3本の鎖のランダムなアセンブリによって3つの分子が生成される:単一特異的なIgGκ(2つの同一のκ軽鎖を含有する)、単一特異的なIgGλ(2つの同一のλ軽鎖を含有する)および二重特異的IgGκλ(1つのκ軽鎖および1つのλ軽鎖を含有する)。2つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、3つの分子の理論比はIgGκ25%、IgGλ25%およびIgGκλ50%であるはずである。構築物44の場合、二重特異的抗体の最適以下の発現および収率につながるλ軽鎖の優先発現がある。この状況を改善するために、鎖の相対比を調整するために異なる鎖の最適化ならびに脱最適化が実行された。
κλ体技術に基づく抗CD19×抗CD47二重特異的抗体44は、共通の重鎖および2つの異なる軽鎖によって構成される。これらの鎖は、プラスミド構築物44によってコードされる(表1)。この発現プラスミドが哺乳動物の細胞でトランスフェクトされるとき、3本の鎖のランダムなアセンブリによって3つの分子が生成される:単一特異的なIgGκ(2つの同一のκ軽鎖を含有する)、単一特異的なIgGλ(2つの同一のλ軽鎖を含有する)および二重特異的IgGκλ(1つのκ軽鎖および1つのλ軽鎖を含有する)。2つの軽鎖が同じ発現率で発現され、同じようにアセンブルされるならば、3つの分子の理論比はIgGκ25%、IgGλ25%およびIgGκλ50%であるはずである。構築物44の場合、二重特異的抗体の最適以下の発現および収率につながるλ軽鎖の優先発現がある。この状況を改善するために、鎖の相対比を調整するために異なる鎖の最適化ならびに脱最適化が実行された。
コドン最適化は、重鎖、カッパ鎖およびラムダ鎖に対してGeneOptimizer(登録商標)ソフトウェア(GeneArt)で実行した。二重特異的抗体44をコードする野生型プラスミドに最適化されたかまたはされていない鎖をクローニングすることによって、異なる候補を生成した。
過度に発現されるラムダ鎖に対して、3つの異なるレベルのコドン脱最適化を実行した。3つの構築物(3、13および19の脱最適化ラムダ鎖)を生成し、最適化された重鎖およびカッパ鎖と組み合わせた。異なる程度の脱最適化を、λ軽鎖に適用した。構築物3、13および19は、ますます脱最適化された配列を含有していた(それぞれVLCL2−1、VLCL2−2およびVLCL2−3、図1を参照)。最適化されたラムダ鎖を有する構築物17および15も生成した(表1)。
(実施例2)Peak細胞で発現されるIgGのクローニングおよび特徴付け
共通の重鎖および2本の軽鎖(1つのカッパおよび1つのラムダ)の野生型、最適化または脱最適化されたコドンを、3つの独立したCMVプロモーターの下に単一の哺乳動物の発現pNOVIベクターにクローニングした。配列検証の後、Lipofectamine2000を使用して2つの独立した一時的トランスフェクションによって、各構築物のIgG生産性をPeak細胞で評価した。トランスフェクションの7日後に、全体のIgG発現をOctet技術によって評価した。候補15を除いて、全体のIgG生産性に関して候補間に大きな差は観察されなかった。全ての鎖が最適化された構築物15で、生産性の低下傾向が観察された(図2)。PEAK細胞での10日間の生成の後、全体のIgGをFc XL樹脂で精製した。
共通の重鎖および2本の軽鎖(1つのカッパおよび1つのラムダ)の野生型、最適化または脱最適化されたコドンを、3つの独立したCMVプロモーターの下に単一の哺乳動物の発現pNOVIベクターにクローニングした。配列検証の後、Lipofectamine2000を使用して2つの独立した一時的トランスフェクションによって、各構築物のIgG生産性をPeak細胞で評価した。トランスフェクションの7日後に、全体のIgG発現をOctet技術によって評価した。候補15を除いて、全体のIgG生産性に関して候補間に大きな差は観察されなかった。全ての鎖が最適化された構築物15で、生産性の低下傾向が観察された(図2)。PEAK細胞での10日間の生成の後、全体のIgGをFc XL樹脂で精製した。
IgGの3つの異なる形、単一特異的ラムダ、単一特異的カッパおよび二重特異的抗体の分布を、ProPac HIC−10カラム(Dionex)を使用してHIC−HPLC分析によって決定した(図3A)。85から35%への移動相A(0.001Mリン酸緩衝液+1M硫酸アンモニウム、pH3.5)の勾配、および15%から100%への移動相B(0.001Mリン酸緩衝液+アセトニトリル10%、pH3.5)の漸増勾配を適用した。ブランクは、移動相A(pH7)で実行した。HIC面積ピークの分析(図3B)は、野生型44ならびに最適化15および17と比較した脱最適化候補3、13および19についての二重特異的の百分率の増加の傾向を示す。3、13および19についての単一特異的なカッパおよびラムダの比は、44と比較して有意に異なった。
全体のIgGの分布を評価するために、IEF7〜11%も実行した(図4)。ラムダ最適化を有する候補は、クローン44と比較して単一特異的ラムダの増加ならびにより少ない単一特異的カッパおよび二重特異的を示す。候補3、13および19は、単一特異的カッパおよび二重特異的の有意な増加を示した。
表2では、PEAK細胞で発現された候補について得られたデータを要約する。候補3、13および19については、得られた二重特異的の最終百分率はより高く、二重特異的比の増加は44に対する21.6%から候補13に対する42.9%であった。興味深いことに、ラムダ鎖の最も高いコドン脱最適化(構築物19)レベルは、二重特異的抗体の生産性を増加させる。
(実施例3)安定してトランスフェクトされたCHO細胞でのIgG発現
エレクトロポレーションによるトランスフェクションおよびMSXによる選択の後、FACSによるスクリーニングを実行した。流加条件での生産のために、最も高い生産性のプールを選択した。Octet技術によって、全体のIgG生産性を異なるプールについて評価した(図5)。プロテインAによる精製の後、還元および変性条件で重鎖および軽鎖のサイズをモニタリングするAgilentタンパク質80チップでの電気泳動によって、異なる鎖の比を評価した。
エレクトロポレーションによるトランスフェクションおよびMSXによる選択の後、FACSによるスクリーニングを実行した。流加条件での生産のために、最も高い生産性のプールを選択した。Octet技術によって、全体のIgG生産性を異なるプールについて評価した(図5)。プロテインAによる精製の後、還元および変性条件で重鎖および軽鎖のサイズをモニタリングするAgilentタンパク質80チップでの電気泳動によって、異なる鎖の比を評価した。
Agilent分析(図6A)に示すように、44については、ラムダ鎖はカッパ鎖より多く示された。いくつかのCHOプールについては、構築物3および13は2つの軽鎖の間の平衡を改善した。ラムダ鎖の増加した脱最適化により、初期構築物と比較したとき、比は逆転した(44対19)。これは、2つの軽鎖の間の比を計算することによって確認された(図6B)。したがって、44ではラムダ鎖に有利であった2つの軽鎖の間の平衡は徐々に覆され、脱最適化のレベルと相関した。全ての生産的なプールを分析するとき、候補13、19と候補44の間で有意な差を観察することができ、カッパ軽鎖がより多く、ラムダ軽鎖はより少ない。これらの結果に基づくと、2つの軽鎖はより同等のレベルで発現されるので、候補3および13はBsAb発現の増加を示すはずである。プロテインAによる精製の後、全てのIgG生産性プールについて、IgGの異なる形の比をHICによって評価した(図7)。データは、単一特異的なラムダのレベルが脱最適化レベルと一緒に徐々に減少することを示し、単一特異的なカッパでは逆のパターンが観察される。構築物3および13では、二重特異的レベルは概ね40%の最大値に到達し、非常に均一な分布である。対照的に、2つの鎖(44または19の場合のように)のうちの1つの不均衡な発現は、二重特異的生成レベルの低減につながる。
それらの標的に対する特異的結合性を確認するために、ELISAによってhCD19およびhCD47への結合について全ての候補を評価した(図8)。二重特異的抗体の2つの特異的標的およびPBS中の2μg/mLの無関係なタンパク質を、96ウェルのストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートに4℃で一晩コーティングした。PBS0.05%(v/v)Tween(PBST)による3回の洗浄の後、PBST 1%BSAで2μg/mLに希釈した精製抗体を、プレートの中において37℃で30分間インキュベートした。ウェルをPBSTで3回洗浄し、次に、二次抗体(ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗ヒトIgG Fc)を追加して、37℃で1時間インキュベートした。ELISAを明らかにするためにテトラメチルベンジジンを使用し、硫酸でブロックした。吸光度を、450nmで読み取った。
各候補の発現をスケールアップし、10日後に上清を収集し、遠心分離により1,300gで10分間清澄化した。精製過程は、3つの親和性ステップで構成された。1番目に、CaptureSelect IgG−CH1親和性マトリックス(Life Technologies)をPBSで洗浄し、次に清澄化した上清に加えた。4℃で一晩のインキュベーションの後、上清を1,000gで10分間遠心分離し、上清を捨て、樹脂をPBSで2回洗浄した。次に、樹脂をスピンカラムに移し、pH2.7の50mMグリシン含有溶液を溶出のために使用した。
いくつかの溶出分画を採取し、プールし、50kDaのAmicon超遠心分離フィルターユニット(Merck KGaA)を使用してPBSに対して脱塩した。上清からの全体のヒトIgGを含有する最終生成物は、Nanodrop分光計(NanoDrop Technologies、Wilmington、DE)を使用して定量し、KappaSelect親和性樹脂(GE Healthcare)の適当な量と一緒に室温および20rpmで15分間インキュベートした。インキュベーション、樹脂回収、溶出および脱塩ステップは、以前に記載されるように実行した(Fischerら、Nature Comms.2015年)。最後の親和性精製ステップは、LambdaFabSelect親和性樹脂を使用して実行した。全体のIgG、HICで測定される二重特異的抗体百分率、およびCHO細胞プールからの精製された二重特異的生産性は、表3に要約される。データは、ラムダ鎖の脱最適化および低減された発現が、全体のIgG生産性および二重特異的生成物の増加につながることを示す。最適化方法は、2.5倍の二重特異的抗体の収率の増加を起こさせた。
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