KR100189024B1 - 항체 및 초항원을 포함하는 가용성 항체 결합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체 및 초항원을 포함하는 가용성 항체 접합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 T세포에 의해 인지 가능한 구조인 초항원과 결합하는 항체를 포함하는 가용성 항체 접합체의 표적 세포 용해 유효량과 관련된 표적 세포의 세포 용해 방법에 관한 것이다.
또한 상기 접합체를 포함하는 제약학적 조성물 및 그의 제조 방법을 포함하는 신규한 가용성 항체 접합체에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
항체 및 초항원을 포함하는 가용성 항체 결합체 및 그 제조방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 항체 및 초항원을 포함하는 가용성 항체 결합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상기 항체는 콜론 암종 관련 세포상에 존재하는 항원결정인자(에피토프)에 대응하는 항체이고, 상기 초항원은 포도상구균 장독소 A이다. 또한 본 발명은 세포독성 T-세포(CTLs)를 활성화 할 수 있는 항체 결합체에 관한 것으로, 본 결합체는 암과 관련된 원하지 않는 세포를 파괴시키는 데 유용하다.
[본 발명의 배경]
표적세포에 선택적으로 작용하여 다른 세포에 대한 비특이 효과를 최소화하고 예방하기 위해 표적세포에 독성 효과를 직접 가하는 인자(세포독성 인자, 세포독소)를 항체와 결합시켜 이용하려고 지난 여러해 동안 시도해 왔다. 제시한 이 결합체는 결합-제공 분자를 사용하는 공유결합 복합체 및 혼합을 단순화하기 위한 비공유결합 복합체로 분류된다[Ghose등의 J. Natl. Cancer Inst. 61(1979) 657-676 및 Carlsson등의 Biotechnology 7(1989) 567-73 참조]. 제시한 세폭 독소는 디프테리아 독소, 리신, 리신의 서브유니트 A, 겔로닌 및 녹농균(슈도모나스 에루지노사; Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 이다(타케다 케미컬 인더스트리의 제EP-A-336,405호 및 Pastan등의, 제WO-A-88/00703호 참조. 둘 다 선출원 제SE-9002479호와 관련하여 인용된 것임).
하이브리도마 기술의 도래와 이에 수반되는 모노클로날 항체의 유용성으로, 세포독성 인자가 좀 더 특이하게 의도된 표적세포 집단으로 향하도록 항체와 세포독성 인자간의 복합체 개념이 이용 가능하게 되었다.
표적세포 보다는 다른 세포에서 세포독성 인자의 손상 효과가 인지된다는 점을 고려하여, 세포독성 인자를 T-임파구를 유도하여 CTLs를 활성화시키는 면역자극물질로 대체할 수 있다는 한 방법이 제시되었다. 이와 같은 특정 제안은 다음과 결합하는 항체와 관련이 있다.
(ⅰ) T-세포 수용체에 대응하는 항체 또는 T-세포 수용체와 결합할 수 있는 화합물(매스 인스티튜트 테크놀로지의 제EP-A1-180,171호 참조);
(ⅱ) 항원, 유사분열 물질, 다른 외래 단백질 같은 화합물, 및 세포독성 T-세포를 활성화하는 펩티드(네오렉스 코포레이션의 제EP-A1-334,300호 참조);
(ⅲ) MHC항원(베링워크 악티엔게젤샤프트의 제EP-A1-352,761호 참조);
(ⅳ) 면역성을 갖는 처리된 각각의 개체에 대한 항원[Med. Res. Counc의 제WO-A-90/11779호(1990년 10월 18일자 공개) 참조]; 및
(ⅴ) 미명의 박테리아 장독소(Ochi 및 Wake의, UCLA-심포지움:Cellular Immuniity and the Immunotherapy of Cancers, 1990년 1월 27일-2월 3일, 초록 CE 515 페이지 109 참조).
그러나 지금까지 제안된 면역자극물질은 그들의 작용면에서 지나치게 특이적이거나 지나치게 일반적이다. 예를 들어 유사분열 물질이 잠정적으로 대부분의 T-세포를 활성화할 수 있는 반면 전형적인 항원은 단지 약 1∼105T-세포만을 활성화한다.
특정 인자가 적당한 비율로 T-세포의 활성화를 조절한다고 인지되었다:즉, 이 인자는 상대적으로 고빈도로 T-세포를 활성화하지만 100%에는 미치지 못한다(Fleischer등의, J. Exp. Med. 167(1988) 1697-1707; 및 White등의 Cell 56(1989) 27-35, 상기 두 문헌을 참고로 인용하였음). 이러한 유형의 인자는 전형적인 항원보다 더 효과적인 활성인자이며 이를 초항원(Superantigens)이라 명명하였다(Kappler 및 Marrack등의, Science 248:705, (1990) 참조).
이 인자에 대해 다음 문헌(Dohlsten등의, Immunol. 71(1990) 96-100; 및 Hedlund등의, Cell. Immunol 129(1990) 426-34, 상기 두 문헌을 참고로 인용)에서 좀 더 구체적으로 기술하였는데, 지금까지 초항원은 표적세포상의 MHC Class Ⅱ 분자와 결합하여 적합한 T-세포 수용체 V베타 사슬을 포함하는 세포독성 T-세포를 활성화하는 능력을 갖는 것으로 알려졌다. 이 공개 데이터는 MHC 결합이 T-세포 결합과 활성화를 위한 선결조건임을 시사한다. 장차 T-세포 수용체 V 알파 사슬을 통한 작용이나 단지 T-세포의 준모집단(subpopulations)에서만 발견되는 다른 표면 구조가 발견될 수도 있는 초항원들도 배제할 수 없다.
초항원 포도상구균 장독소 A(SEA)의 면역 조절 효과는 Platsoucas등의 Cell Immunol. 97(1986) 317-85 문헌에 기술되어 있다.
지금까지 알려진 대부분의 초항원은 일찍이 독소로 알려졌으며 그들 모두는 미생물 기원을 갖고 있다. 예를 들어 포도상구균 장독소는 장독성이며 T-세포를 활성화하는데, 이 두가지 효과는 상호간에 식별이 가능하다(Fleischer등의 Cell. Immunol. 118(1989) 92-101; Alber등의, J. Immunol. 144(1990) 4501-06; 및 Infect. Immun. 59(1991) 2126-34 참조).
CTL이 MHC Class Ⅱ 항원을 수반하는 세포의 용해를 매개하도록 지시하기 위해 초항원을 사용하는 문제가 일찍부터 제시되어 왔다(파마시아 에이비의 제WO-A-91/04053호 1991년 4월 4일자 공개). 제WO-A-91/04053호는 명확한 언급은 하고 있지 않지만, 초항원이 공유 면역결합체로 결합한다고 기술하고 있다.
그러나 MHC Class Ⅱ 항원결여 세포 또는 MHC Class Ⅱ 단백질의 최저 한계량을 발현하는 세포는 CTLs에 의한 세포 용해를 효율적으로 지시하기에 충분한 양의 초항원과 결합하지 못한다. 따라서 MHC Class Ⅱ 항원을 수반하는 일반적으로 풍부한 세포 및 대부분의 종양 세포 상에서 MHC Class Ⅱ 항원이 풍부하지 않으므로 초항원은 특정세포, 원하지 않는 세포 치사에 대한 유용성이 낮아야만 한다.
그러나 CTLs에 의해 매개되는 특정 세포 치사 효과가 초항원으로도 이뤄질 수 있는 경우는 초항원이 상기 세포를 치사시키는데 특이한 에피토프에 대한 항체와 공유결합할 경우라는 것을 발견하였다. 면역계의 활성화는 그들의 발현을 위해 MHC Class Ⅱ 항원이 결여된 표적세포를 유도해내고, 원하는 용해 효과를 가능하게 할지도 모른다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 (ⅰ)(1) 표적세포에 대응하는 항체, 및 (2) T-세포, 특히 CTLs를 상호작용이나 결합함으로써 인지하여 활성화할 수 있는 구조인 초항원을 포함하는 새로운 항체 결합체; (ⅱ) 특히 CTLs와 같은 T-세포의 특이적 활성화를 위해 포유동물에서 계획된 치료학적 치료법과 관련된, 표적세포의 용해방법; (ⅲ) 결합체의 합성방법; 및 (ⅳ) 결합체를 포함하는 제약학적 조성물 및 그 조성물의 제조 방법을 제공한다.
표적세포 파괴 방법은 암, 자가면역, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 기생충 감염 및 높은 정확도를 갖는 특정 세포 치사를 위한 목적으로서 다른 질병의 치료학적 치료법도 포함한다. 본 발명의 결합체는 단지 상기 기술한 질병과 관련된 표적세포의 파괴뿐만 아니라 제약학적 조성물 제조에도 이용할 수 있다. 치료하고자 하는 각각의 대상은 1차적으로 인간이고 통상적으로 동물이다.
[본 발명의 상세한 설명]
[결합체의 초항원 부위]
새로운 항체 결합체는 T-세포를 인지하는 구조가 초항원임을 특징으로 한다. 이 결합체는 통상적으로 생리학적 pH에서 가용성이며 시험관내 결합체는 혈청내에서 가용성이다.
바람직한 초항원은 SEA, SEB, SEC, SED 및 SEE와 같은 포도상구균 장독소(SEs), 유독소, 활성단편이나 그 펩티드 및 CTLs 활성을 위해 필수적으로 동일한 방식의 작용을 갖는 그외 기질로 구성된 그룹으로 부터 선택한 것이다. 초항원은 포도상구균 균주로 부터의 독소 쇼크 증후군 독소(TSST-1), 연쇄상 구균으로 부터의 발열질 외독소 A, 및 박테리아 외단백질 및 마이코 플라즈마 관절염에 의해 생성된 단백질 등과 같은 그 밖의 미생물 산물(박테리아 및 바이러스)을 포함하며, 이것은 초항원과 동일한 방식으로 T-세포와 상호 결합하는 유사한 능력을 갖는다. 초항원은 그것의 천연 생산자 또는 유전자 공학에 의해 생산된 세포(재조합기술)를 배양함으로써나 잠정적으로 합성펩티드 합성법으로 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용한 초항원을 본 명세서에 제시한 실험 모델에 적용할 때, 본 명세서의 실험 부분에 제시한 것과 유사한 효과를 발휘해야만 한다.
바람직한 초항원은 CTLs, 바람직하게는 T-세포 수용체 V 베타 사슬의 활성화와 관련된 다형 T-세포 표면 단백질의 약 1-40%의 동형과 결합하는 잠재력을 갖는다.
[결합체의 항체 부위]
충분히 제한된 특이성을 제공하는 한, 폴리클로날 항체를 사용할 수 있을지라도 바람직한 항체는 모노클로날 항체(mab)이다. 발현 항체란 일반적으로 항체를 말하며, 따라서 이 발현 항체는 항체 활성 단편, 및 문제의 표적세포에 대해 적절한 특이성, 화합력 및 친화력을 제공하는, 항체의 결합력과 흡사한 다른 분자를 포함한다. 이것은 유전자 공학에 의해 생산된(재조합으로 생성된) 항체 및 항체 유도체 또는 다른 유사한 결합구조를 포함한다. 한 실시형태에 있어서 이 항체는 종양 세포에 대한 항원 결정인자, 예를 들면 콜론 암종 관련 결정인자(에피토프, 구조)에 특이적이다. 또한 이 항체는 자가면역의 원인이 되는 세포, 바이러스 감염 세포, 박테리아, 기생충, 곰팡이 또는 다른 원하지 않는 세포상의 항원 결정인자에 대해서도 특이적일 수 있다. 결합체의 효능에 따라, 항체는 이러한 항체 특이성이 바람직하지 않다 하더라도 결합후 항체를 내재화할 항원을 향하게 될 것이다.
본 발명과 관련하여 연구된 모노클로날 항체는 GA-733 패밀리 항원에 대응하는 C215 항체(예를 들면 제EP-A-376,746호 및 본원에 참고 문헌으로 인용한 Larsson등의, Int. J. Canc. 42(1988) 877-82 참조), C242 항체(Larsson등의 INt. J. Canc. 42(1988) 877-82) 및 Thy-1.2항체(mabC, Opitz등의 Immunobiol. 160(1982) 438-)이다. 다른 표적세포 표면 구조에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체도 유용할 것이다. 선택한 표적세포에 대한 유일한 에피토프에 대응하는 모노클로날의 제조방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 상기 언급한 공개 자료를 참조하라. C242 에피토프 또는 C215 에피토프에 대응하는 모노클로날 항체와 같은 발현 항체는 교차반응 에피토프와 반응하는 항체를 포함한다.
지금까지 시험된 3개의 모노클로날 중 C215-결합체 대부분은 그들이 빈번히 정상 세포상에서 발현되는 종양 항원상의 에피토프와 상호 작용하기 때문에 보다 덜 중요하다. C242-결합체는 고 투여량을 요구하는 것으로 나타난 결과에도 불구하고 특징적인 데이타를 근거로한 결과 더 유용한 것으로 나타났다. Thy-1.2에 대한 MabC는 Thy-1.2 항원이 비 인체 포유동물의 종양세포에 대해 특이적이기 때문에 인체 암세포를 표적하는 데 저조한 유용성을 가질 것이다.
[항체에 초항원을 결합시키는 구조]
본 발명의 바람직한 결합체에 있어 초항원은 공유결합(-B-)을 통하여 항체와 결합한다. 세포를 사멸시키기 위해, 예를 들면 동물에 이 결합체를 투여했을 때 이것의 성분은 분해될 수 없다는 점이 중요하며, 필수적으로 이 결합은 효과가 획득되기 위한 충분한 기간 동안 신진대사적으로 안정해야만 한다. 또한, 이 공유결합은 자체내에서는 면역 반응이 일어나지 않는다는 잇점을 가지고 있다. 일반적으로 이 결합은 상기 결합체가 유효한 표적세포 결합 특이성(항종양, 항바이러스) 및 세포독성 T-세포를 활성화하는 효능을 보유하고 있다는 의미에서 비활성일 것이다.
몇몇 그룹의 특허 문헌 뿐만 아니라 과학 문헌에서 면역 결합체의 결합 구조에 대해 제시하여 왔다. 본원의 새로운 결합체내의 공유결합(-B-)에 따르면, 다음 중에서 선택한 구조를 포함한다.
(ⅰ) 아미드 및 히드라지드(아미드=-CONR1- 또는 -NR1CO-, 여기서 각각의 유리 원자가는 포화 탄소원자와 결합하고, R1은 수소이거나 저급 알킬(C1-6) 같은 알킬 치환기 또는 자연 발생적인 알파 아미노산, 바람직하게는 친수성 아미노산의 알파 N- 치환기, 및 히드라지드=-CONHNH- 또는 -NHNHOC-, 여기서 각각의 유리 원자가는 포화 탄소원자와 결합한다); (ⅱ) 티오에테르 및 디설파이드(-Sr-, 여기서 각각의 유리 원자가는 직접 포화 탄소원자와 결합하고, S는 황원자, r은 정수 1 또는 2이다); (ⅲ) 하나 이상의 수산기나 아미노기로 치환되는 것이 가능할 수 있는, 곧은, 분지된 또는 고리형인 포화 탄화수소 사슬; (ⅳ) 에테르(-O-, 여기서 각각의 유리 원자가는 직접 포화 탄소원자와 결합한다); 및 (ⅴ) 일차 아민 또는 이치환 히드라진(-NH- 또는 -NH-NH-, 여기서 각각의 유리 원자가는 직접 포화 탄소원자와 결합한다).
다리의 길이는 본 기술분야 내에서 계획된 일반 범주, 즉 100원자와 같이 180원자 보다는 짧게, 그러나 3-6보다는 길게, 바람직하게는 16원자 보다 길어야만 한다.
이 바람직한 결합은 친수성이며 어떤 방향족 고리도 포함해서는 안된다. 공유결합(-B-)의 부분을 형성할 수 있는 바람직한 친수성 구조는 다음과 같다:
(ⅰ) 자연 발생적인 친수성 알파 아미노산의 폴리펩티드 사슬(예를 들면, 아스파라긴산 및 그의 아미드, 글루타민산 및 그의 아미드, 리신, 아르기닌, 글리신, 트레오닌, 세린 및 또한 가능한 히스티딘); (ⅱ) (-O-(CH2)n)n'-와 옥사 알킬렌 사슬, 여기서 n은 정수 2-5, 바람직하게는 2-3, 및 n'는 정수 1-20일 것이다; 및 (ⅲ) -S-(티오에테르), -O-(에테르) 및 치환되지 않은 아미드(-CONH-)로서 이들 모두 바람직하게 1 또는 2개의 탄소원자를 포함하는 치환되지 않은 짧은 탄화수소 사슬(C1-4)에 결합되어 있다.
친수성 아미노산은 (F-(pro)n)mF 유형의 친수성 구조내에 존재할 수 있으며, 여기서 F는 아미노산 서열, 바람직하게는 4-8개의 잔기를 나타내고, 여기서 각각의 아미노산은 세린, 글리신 및 트레오닌 중에서 각각 선택하였으며, m은 정수 1-4이고 n은 정수 4-8이다(세터스 코포레이션의 제WO-A-85/03508호 참조).
공유결합(-B-)은 결합체의 항체 또는 초항원 부분의 특정 위치나 아니면 임의 위치에 결합될 수 있다. 잠재 위치는 아미노 말단, 카르복시 말단 및 리신 잔기(오메가 아미노기)이다. 항체 또는 초항원이 티올기나 디설파이드기(각각 시스틴 또는 시스테인)를 운반할 경우, 이들 기가 결합체의 활성 부분의 활성도에 필수적이지 않는한 공유결합에 사용될 수 있다. 탄수화물 구조는 교대로 결합체(새터스 코포레이션의 제EP-A-240,200호와 비교)의 다른 성분과 결합하는데 사용할 수 있는 알데히드기로 산화될 수 있다.
본 발명의 결합체는 유의량의 에스테르 결합과 불안정한 아미드 결합중 어떤 것도 포함해서는 안되며, 특히 각각 티로신 및 히스티딘 잔기와 함께 형성되어서도 안된다. 이러한 결합이 합성기간 중에 형성된다면 히드록실 아민을 사용하여 제거할 수 있다(Endo등의 Cancer Res. 48(1988) 3330-3335 참조).
항체 활성 성분당 존재할 수 있는 초항원 성분수는 일반적으로 1-5, 바람직하게는 1 또는 2이다.
바람직한 유형중의 하나로, 결합체 기질은 항체 당 초항원 및/또는 초항원과 항체 성분내 사용된 결합 부위, 및/또는 공유결합(-B-) 등에 관해서는 실질적으로 동형일 것이다. 다시 말해서 결합체 기질 내의 모든 각각의 결합체 분자는 이러한 다양성에 관해서는 동일해야만 한다.
이 기질은 비결합 항체나 비결합 초항원을 필수적으로 함유하지 않아야 한다.
최적의 결합을 위해 항체에 대한 초항원의 정확한 비율, 결합구조등은 선택한 모노클로날(특이적으로 클론을 생산하는 강, 아강 포함) 및 선택한 초항원에 달려 있다. 본 명세서에 제시한 실험모델은 최적의 변수 및 다른 초항원과 다른 항체들을 선별가능하게 한다.
최근 출원일까지 광범위하게 연구된 본 발명의 실시형태에 의하면 공유결합(-B-)은 다음과 같은 구조를 포함한다.
일반식 Ⅰ의 유리 원자가는 각각 활성부위와 결합한다. 이 결합은 직접적으로 또는 공유결합 다리(-B-)내에 포함된 2가의 비활성 구조를 통해 형성된다.
n은 정수0, 예를 들면 1-20, 바람직하게는 2 또는 2이며 대부분의 경우 10이고, m은 1 또는 2이다. S는 황원자이고 그것의 각 원자가에서 직접 포화 탄소원자와 결합(-Sr-=티오에테르 또는 디설파이드)하며 r은 정수 1 또는 2이다. Y는 -NH-, -NHNH- 또는 -NHN=CH-이고, 그것의 좌 말단은 일반식 Ⅰ의 우 말단에 나타난 CO기와 결합하며 그것의 우 말단은 포화 탄소원자와 결합하거나 카르보닐기(단 Y=-NHNH- 일 때)와 결합한다. R은 바람직하게 알킬렌(1-4개의 탄소원자를 갖거나 종종 1 또는 2개의 탄소원자를 갖는다)이고 하나 이상(1-3, 바람직한 경우 2)의 히드록시기(OH)로 치환이 가능하다.
[항체-초항원 결합체의 제조방법]
본 발명의 항체 결합체는 이 결합체를 생산하는 세포 배지나, 이를 합성한 다른 배지로 부터 이들을 강화시키고 정제함으로써 수득할 수 있다.
본원의 새로운 결합체의 합성은 결합체 합성을 위해 본 분야에 공지된 기술, 즉 유전공학(재조합기술) 또는 적합한 작용기에서의 전형적인 결합 반응을 통한 적절한 항체와 초항원을 통해 이루어질 수 있다. 단백질내에 존재하는 작용기 및 일반적으로 사용되는 작용기는 다음과 같다;
(ⅰ) 탄수화물 구조. 이 구조는 -C=NH-NH- 기를 형성하도록 H2NNH- 기를 포함하는 화합물과 차례로 반응하여 알데히드기로 산화될 수 있다.
(ⅱ) 티올기(HS-). 이 티올기는 티오에테르기나 디설파이드기를 형성하도록 티올-반응기를 포함하는 화합물과 반응시킨다. 단백질의 유리 티올기는 시스틴 잔기내에 존재하며 이것은 티올화 또는 천연 시스테인 잔기 내부의 디설파이드의 분해에 의해 단백질상으로 삽입될 수 있다.
(ⅲ) 아미노산 잔기내의 유리 아미노기(HN-). 아미노기는 아미드기를 형성하도록 활성화된 카르복시기와 같은 친전자성기를 포함하는 화합물과 반응한다. 유리 아미노기는 바람직하게 아미노 말단이거나 리신 잔기의 오메가 아미노기이다.
(ⅳ) 아미노산 잔기내의 유리 카르복시기. 이 카르복시기는 반응(활성화된) 카르복시기로 전환된 후 아미드기를 형성하도록 아미노기를 포함하는 화합물과 반응시킨다. 그러나, 예방책으로 대부분 동일 단백질내의 카르복시기와 함께 존재하는 아미노기와 함께 아미드형성을 최소화 하도록 해야만 한다. 유리 카르복시기는 바람직하게 카르복시 말단이거나 이산 알파 아미노산의 카르복시기이다.
H2NNH- 기, 티올-반응기, 활성화된 카르복시기, 또는 아미노기를 운반하는 화합물은 이작용기성 결합시약이거나 항체 또는 초항원일 수 있다. 상기 작용기들은 택일적으로 카르보닐 탄소와 결합할 수 있는 H2NNH- 기를 제외하면 포화 탄소원자와 직접적으로 결합한다. 이 작용기들은 일반적인 유도체화로 항체나 초항원상에 삽입될 수 있다.
본원의 결합체 제조를 위한 효율적인 수단을 제공하는 재조합 기술은 한 성분내의 말단 카르복시기로 부터 다른 성분내의 말단 아미노기까지 특이적으로 결합하게 한다. 적용한 기술과 일치하는 결합 구조가 삽입될 수도 있다.
사용한 시약은 상기 기술한 바와 같은 공유결합(-B-)을 제공할 수 있는 것으로 선택하였다. 일반적인 이작용기성 시약은 Z-B'-Z'와 같은 일반식을 갖는데 여기서 Z와 Z'는 상호간에 서로 일치하며 단백질상에 존재하는 작용기에서 공유결합하도록 하는 작용기이다. 상기 참조. B'는 상기 공유결합(-B-)에 대해 주어진 구조와 동일한 구조를 포함하는 비활성 다리이다. 특히 Z와 Z'는 동일하거나 다를 수 있으며 티올기, 티올 반응기, 활성화된 카르복시기, -CONHNH2중에서 선택한 것이다. 상기 기에 대한 정의는 하기 표제의 신규한 시약을 참조하시오.
실험 부분에서 사용된 결합체에 사용한 방법은 다음 단계를 포함한다:
(ⅰ) 티올 반응기를 운반하는 항체 또는 초항원을 형성하도록 항체나 초항원을 티올 반응기와 아미노 반응기를 포함하는 유기 시약과 반응시키고, (ⅱ) 티올기나 보호된 티올기를 운반하는 초항원 또는 항체를 형성하도록 초항원과 항체의 잔존 부위를 티올기나 보호된 티올기 및 아미노 반응기와 반응시키고, (ⅲ) 각각의 (ⅰ) 및 (ⅱ) 단계에서 수득한 산물을, 초항원이 디설파이드나 티오에테르를 통해 항체와 결합해 있는 결합체가 형성되도록 서로 반응시킨다.
각각의 기에 대한 결합 조건은 단백질 화학 작용에서 볼 수 있듯이 잘 알려진 것이다. 이 결합은 단계적으로 진행할 수 있으며, 또는 비활성 스페이서 아암에 의해 출발물질에 결합할 수 있는 중간 작용기를 생성시킴으로써 일단계로 진행할 수 있다. 일반적으로 결합체의 합성 및 정제/회수가 발생하기 위한 조건은 단백질이 포함될 수 있도록 항상 비변성이다. 일반적으로 상기 조건은 각각 수용성 배지와 pH 3-10 범위의 pH 값과 0-50℃의 온도를 의미한다. 정확한 pH 값은 반응하는 작용기와 회수되어지는 결합체에 따라 다르다. 하기 표제 신규 시약을 참조하시오.
[신규 시약(본 발명과 관련하여 개발)]
공유결합(-B-)을 갖는 결합체의 화학 합성을 위해 다음과 같은 일반식 Ⅱ를 갖는 신규한 이종 이작용기 시약을 개발하였다:
m과 n은 상기 일반식(Ⅰ)에서와 같은 의미를 갖는다. Z1은 HS-반응 친전자성기, 티올(-SH) 또는 보호된 티올기(예를 들면, AcS-)이되 티올기와 히드록기는 R내에 존재하는 하나 및 동일 탄소원자와 결합해서는 안된다. HS-반응 친전자성기의 예는 다음과 같다:
(ⅰ) 바람직하게는 알파-할로-알킬카르보닐(예를 들면, Z1CH2CO-)의 형태로 포화 탄소원자와 결합하는 할로겐; (ⅱ) 바람직하게는 소위 반응 디설파이드(-SSR1)라 불리는, 포화 탄소원자와 결합하는 활성화된 티올; (ⅲ) 3,5-디옥소-1-아자-시클로펜트-3-엔-1-일.
반응 디설파이드에 대해서는 본원에서 참고 문헌으로 인용한 제EP-A-128,885호를 참조하시오. Z1'는 활성화된 카르복시, 즉 친전자성기이다. 그 예로는 카르복실산 할로겐화물(-COC1, -COBr, 및 -COl), 혼합된 카르복실산 무수물(-COOOCR1), N-숙신이미딜옥시 카르보닐과 같은 반응 에스테르, -C(=NH)-OR2, 4-니트로페닐카르보닐레이트(-CO-OC6H4NO2) 등이 있다. R1과 R2는 저급 알킬(C1-C6)이고 R2는 또한 벤질일 수 있다.
본원의 신규한 시약의 장점중의 하나는 이 시약이 구조(OCH2CH2)n내의 정수 n-n은 주어진 결합체 기질의 각각의 분자에 대해 동일함-에 관하여 결과적으로 균일한 결합체 기질을 생성한다는 것이다. Z1' 및 Z1과 반응하는 작용기는 천연 항체 활성 분자나 천연 초항원상에 존재할 수 있으며 또는 상기 Z1' 및 Z1에 삽입시킬 수도 있다. 그 후 Z1' 및 Z1말단은 상기 유형의 기에 대해 공지된 방식으로 적합한 항체나 초항원과 선택적으로 반응한다.
공지된 기술은 본원의 신규 시약에서 부터나 아니면 결합될 화합물로 부터 출발하는 사슬 신장을 포함한다. 신규 시약을 사용하는 사슬 신장은 예를 들어, 결과적으로 다음과 같은 공유결합(-B-)을 갖는 결합체를 초래한다:
(1) -COR'-Sr-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY-;
CO는 NH와 결합한다:
(2) -COR'-Sr-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCONHNH-RNHN=-;
N=는 일반적으로 항체나 초항원의 산화된 탄수화물 구조로 부터 유도된 SP2-혼성화 탄소와 결합한다(당단백질이 존재할 때).
(3) -CO(CH2)mO(CH2CH2O)nCH2CH2NHCOR'-Sr-(연속됨)(연속됨)
-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY-;
CO는 NH와 결합한다.
(4) -CO(CH2)mO(CH2CH2O)nCH2CH2NHCOR'-Sr-(연속됨)(연속됨)
-RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCONHNH-RNHN=;
N=은 상기 (2)에서와 같은 방식으로 결합한다.
R, R' 및 R는 일반식(Ⅰ)내의 R과 같은 방식으로 선택한 알킬렌이다. r은 상기와 동일한 의미를 갖는다. 이 시약(일반식 Ⅱ)은 다음과 같은 일반식 Ⅲ을 갖는 화합물로 부터 제조할 수 있다:
m은 정수 1 또는 2이며 n은 정수 1-20, 이를테면 2-20이거나 3-9이다.
m=1 및 2이고 n=1-10인 일반식 Ⅲ에 따른 특정 화합물의 합성은 문헌(Jullien등의 Tetrahedron Letters 29(1988) 3803-06: Houghton 및 Southby의 Synth. Commun. 19(18)(1989) 3199-3209: 및 제EP-A-410,280(1991년 1월 20일 공개) 및 Slama와 Rando의 Carbohydrate Research 88(1981) 213-222 및 Biochemistry 19(1980) 4595-4600)에 기술되어 있다.
일반식 Ⅱ에 따른 신규 시약은 일반식 Ⅲ의 화합물과 이미 알려진 일반식 Z-B'-Z'의 이작용기 시약을 반응시킴으로써 합성할 수 있고, 앞에서 R과 R'에 대해 정의한 바와 같이 Z=Z1, B'=R, Z'=활성화된 카르복시이다. 반응후 -COOH 작용기는 활성화된 카르복시기 예를 들면 N-숙신이미딜옥시카르보닐, 4-니트로페닐옥시 카르보닐, 2,4-디니트로페닐옥시카르보닐 등과 같은 Z1'=활성화된 에스테르로 전환된다.
일반식(Ⅲ)의 신규 화합물과 그것의 신규 유도체는 다음과 같은 일반식을 갖는 폴리에스테르이다:
여기서 n은 정수 2-20, 바람직하게는 3-20 또는 3-9이다. X는 양성자 공여형(+H3N-)을 포함하는 H2N- 이거나 바람직하게는 가수분해나 환원에 의해 H2N-으로 전환이 가능한 치환된 H2N-이다. 그 예로는 치환되지 않은 아미노(H2N-); 니트로; 아실 성분 특히 ; CH3CONH-, CH3COCH2CONH- 등의 알파 탄소원자상에 전자 인출 치환기를 갖는 아실아미도기를 포함하는 저급 아실아미도(포르밀아미도, 아세틸아미도...헥사노일아미도)와 같은 아미도(카르바미도); 고리로 치환 가능한 프탈이미도일; 고리로 치환이 가능한 카르바마토[특히 R1'OCONH- 및 (R1'OCO)(R2'OCO)N-, 이를테면 N-(t-부틸옥시카르보닐)아미노(BOC), N-(벤질옥시카르보닐)아미노 및 디(N-(벤질옥시카르보닐))아미노(각각 Z 및 디 Z)]; 질소원자와 결합하는 탄소원자가, 메틸 탄소원자(벤질자리의 탄소원자 포함)가 N,N-(3차-부틸시릴)아미노와 같은 실리콘원자(Si)로 치환되는 경우에 유사기를 포함하는 N-모노벤질아미노 및 디벤질아미노, N-트리틸아미노(트리페닐메틸아미노) 등과 같은 방향족계의 알파인 알킬 아미노; 3- 및/또는 5-위치에 있는 저급 알킬과 치환한 것을 포함하는 4-옥소-1,3,5-트리아진-1-일.
상기 및 하기의 R1' 및 R2'는 저급 알킬, 특히 2차 및 3차 알킬기를 나타내며, 메틸기는 고리로 치환이 가능한 1-3 페닐기와 치환한다. 저급 알킬기 및 저급 아실기는 1-6 탄소원자를 갖는다.
Y는 카르복시(-COO-를 포함하는 -COOH) 또는 바람직하게는 가수분해나 산화를 통해 카르복시로 전환이 가능한 기이다. 가장 중요한 기는 카르보닐 탄소원자내의 에스테르기이거나 일반식(Ⅰ)의 우 말단의 메틸렌기와 결합하는 에스테르와 동일한 원자이다. 그 예로는 알킬 에스테르기(-COOR1'):또는 에스테르기(-C(OR3')3) 및 상기 기술한 바와 같은 반응 에스테르기 등이다. R3'은 R1'과 동일한 의미를 갖는다. 다른 기인 Y는 -CHO, -CN, -CONH2, -CONR1'R2'이며 R1' R2'는 앞에서 정의한 바와 동일한 의미를 갖는다. 일반식(Ⅳ)의 화합물은 본 분야에 공지된 결합법에서 잘 알려진 출발 물질로 부터 합성할 수 있다. 고유의 합성 단계는 다음과 같다.
A. 사슬 형성
B. 말단 작용기의 전환
C. 대칭 폴리에스테르기가 비대칭 에테르로 전환
D. 이대칭 사슬이 2개의 동일 단편으로 분해.
-OCH2CH2-의 반복 단위를 갖는 알맞은 출발 물질은 상업적으로 손쉽게 구입이 가능하다. 그 예로는 2 내지 6개의 반복 단위를 갖는 올리고에틸렌 글리콜이 있다. 상이한 말단기를 갖는 출발물질은 말단기가 순수한 폴리에틸렌 옥시드 다리에 의해 분리되어 공간을 이루는 오메가-히드록시 모노카르복실산이다. 5개 이상의 반복 단위를 갖는 이러한 화합물은 선행기술에서 기술한 바 있다(Nakatsuji, Kawamura Okahara의 Synthesis(1981) 42페이지 참조).
[제약학적 조성물 및 그의 제조방법]
본 발명의 제약학적 조성물은 본 기술 분야에 공지된 바 있지만 현재 본원의 새로운 결합체를 함유하는 제제형을 포함한다. 따라서 이 조성물은 동결건조 미립자 물질, 멸균 또는 무균적으로 만든 용액, 정제, 앰플 등의 형태일 수 있다. 물(바람직하게는 PBS와 같은 생리적 pH 값으로 완충)과 같은 부형제이거나 다른 비활성 고형물이나 액성 물질이 존재할 수도 있다. 일반적인 용어인 이 조성물은 결합체를 하나 이상의 비수용성 또는 수용성 부형제에 용해시켜 결합하여 혼합하거나, 이들과 결합하여 제조하며, 필요하다면 적절한 첨가제 및 보조제를 넣어 제조할 수 있다. 상기 부형제 및 조건은 결합체의 활성도에 역효과를 미쳐서는 절대로 안된다. 위와 같은 물은 발현 부형제의 범주에 속한다.
[투약 및 사용방법]
일반적으로 결합체는 시판 가능하며 예비조제한 투여량으로 투여할 수 있는데, 현재 나타나 있는 결과를 기초로 하면 결합체의 유효량은 10μg-50mg 범위내이다. 정확한 투여량은 환자들의 체중 및 연령, 투여 경로, 질병유형, 항체, 초항원 공유결합(-B-)등 여러 가지 경우에 따라 변한다. 투여 경로는 본 기술분야에 일반적으로 공지된 것과 동일하다. 즉, 표적세포 용해 유효량이나 본 발명에 따른 결합체의 제약학적 유효량은 표적세포와 관련이 깊다. 이에 대한 구체적인 적용은 주사나 주입(피하, 정맥, 동맥, 근육주사)과 같은 비경구적 투여를 의미한다. 치료하고자 하는 개인에 대해 국부적으로 전신적으로 결합체를 투여한다.
표적세포 용해 유효량이란 표적세포를 파괴하기 위해 CTLs를 활성화하고 지시하는데 효과적인 양을 의미한다.
본 발명은 명세서의 일부인 특허청구의 범위로 한정된다. 본 발명은 지금까지 연구해온 일반적인 개념들을 한정하는 일 없이 여러가지 실시형태로 설명하고자 한다. 실험부문 Ⅰ은 결합체의 화학 합성에 대해 기술하고 있으며 실험부문 Ⅱ는 실시예 4에서 제조한 결합체가 표적세포를 용해시키기 위한 T-세포 활성화에 미치는 영향에 대해 기술하고 있다.
[실험부문 Ⅰ]
[오메가-아미노-폴리에틸렌 글리콜-카르복실산의 제조방법]
[이소프로필 8-히드록시-3,6-디옥시-옥타노에이트(1)]
칩 형태의 나트륨(23g,1.0몰)을 질소 대기압하에서 디에틸렌 글리콜(500ml)에 일부 첨가하였다. 나트륨이 완전히 반응하면 이 혼합물을 상온에서 냉각시키고 브롬아세트산(76g,0.5몰)을 교반시키면서 첨가하였다. 100℃에서 18시간 후 디에틸렌 글리콜의 여분을 약 4mmHg에서 증류시켜 제거하였다. 그 다음 이소프로필 알콜(400ml)과 염화 아세틸(51g,0.65몰)을 첨가하였다. 65℃에서 18시간 동안 교반시킨 후 이 혼합물을 상온에서 냉각시키고 아세트산 나트륨(3.5g,0.15몰)으로 중화시켰다. 이 혼합물을 여과한 후 여액을 거의 건조될 때까지 증발시킨 후 물(200ml)에 용해하였다. 1,1,1-트리클로로에틸렌(3×50ml)으로 물상을 추출하였다. 풀로 된(pooled) 유기상은 물(200ml)로 세척하였다. 디클로로메탄(500ml)으로 풀로 된 물상으로 부터 생성물을 추출한 후 증발시켜 오일(55g)을 산출하였다.
[이소프로필 11-히드록시 3,6,9-트리옥사-운데카노에이트(2)]
칩 형태의 나트륨(23g,1.0몰)을 질소 대기압하에서 트리에틸렌 글리콜(700ml)에 일부 첨가하였다. 나트륨이 완전히 반응하면 이 혼합물을 상온에서 냉각시킨 후 브롬아세트산(76g,0.5몰)을 교반시키면서 첨가하였다. 100℃에서 18시간 후 디에틸렌 글리콜의 여분을 약 4mmHg에서 증류시켜 제거하였다. 그 다음 이소프로필 알콜(400ml)과 염화 아세틸(51g,0.65몰)을 첨가하였다. 65℃에서 18시간 동안 교반시킨 후 이 혼합물을 상온에서 냉각시키고 아세트산 나트륨(3.5g,0.15몰)으로 중화시켰다. 혼합물을 여과한 후 여액을 거의 건조될 때까지 증발시킨 후 물(200ml)에 용해하였다. 1,1,1-트리클로로에탄(3×50ml)으로 물상을 추출하였다. 풀로 되어 있는 유기상은 물(20ml)로 세척하였다. 디클로로메탄(50ml)으로 풀로 되어 있는 물상으로 부터 생성물을 추출한 후 증발시켜 오일을 수득하였다.
1H-n.m.r.(CDCl3); 1.26(d,1H); 3.07(s,2H); 3.6-3.8(m,12H); 4.11(s,2H); 5.09(m,1H).
[8-(N-프탈이미도일)-3,6-디옥사-옥탄올(3)]
8-클로로-3,6-디옥사-옥탄올(365g,2.2몰, 트리에틸렌 글리콜과 SOCl2로 부터 제조)을 디메틸 포름아미드(400ml)에 용해한 후 프탈아미드 칼륨(370g,2.0몰)을 교반시키면서 첨가하였다. 110℃에서 18시간 교반시킨 후 감압하에서 디메틸 포름아미드를 증류시켜 제거하였다. 잔여물은 40-50℃에서 톨루엔(1.5ℓ)에 현탁시키고 염화 칼륨은 여과시켜 제거하였다. 생성물을 -10℃에서 냉각시켜 결정화하였다. 제2분획은 잔여물을 농축시키고 결정화 과정을 반복함으로써 원액으로 부터 이용가능하다.
1H-n.m.r.(CDCl3); 2.90(s,1H); 3.51-3.58(m,2H); 3.60-3.68(m,6H); 3.73-7.78(t,2H); 3.89-3.94(t,2H); 7.70-7.89(m,4H).
[이소프로필 17-(N-프탈이미도일)-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데카노에이트(4)]
디클로로메탄(30ml)내에 함유되어 있는 피리딘 용액(2.8ml,35밀리몰)을 디클로로메탄내에 함유되어 있는 8-(N-프탈이미도일)-3,6-디옥사-옥탄올(3)(8.5g,36밀리몰) 및 트리플루오로메탄술폰산 무수물(10.2g,36밀리몰) 용액에 -5℃에서 교반시키면서 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 약 30분 후에 0.5M의 염산과 물로 유기상을 세척하였다. 건조(Na2SO4)시킨 후 여과 이소프로필 8-히드록시-3,6-디옥사-옥타노에이트(1)(12g,48밀리몰)과 Na2PO4(6.5g,46밀리몰)을 첨가한 후 이 혼합물을 실온에서 20시간 동안 격렬하게 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고 여액은 증발시켰다. 잔여물은 1,1,1-트리클로로에탄과 물 사이에서 분배되었다. 유기상을 증발시켜 오일(13g)을 산출하였다.
1H-n.m.r.(CDCl3):δ 1.26(d,6H); 3.58-3.76(m,18H); 3.90(t,2H); 4.11(s,2H); 5.09(m,1H); 7.70-7.89(m,4H).
[17-(N-프탈이미도일)-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데칸산(5)]
이소프로필 17-(N-프탈이미도일)-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데카노에이트(4)(13g)를 테트라히드로푸란(50ml)과 염산(진한 것, 50ml)에 용해하였다. 16시간 후에 이 용액을 물(200ml)로 희석시킨 후 감압하에서 테트라히드로푸란을 제거하였다. 물상을 톨루엔(1X)으로 세척한 후 디클로로메탄(2X)으로 추출하였다. 건조(Na2SO4)시킨 후 유기상을 증발시켜 오일형(8.5g)의 생성물을 수득하였다.
1H-n.m.r.(CDCl3):δ 3.57-3.76)(m,18H); 3.91(t,2H); 4.11(s,2H); 4.8(br,2H); 7.65-7.90(m,4H).
[이소프로필 17-아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데카노에이트(6)]
17-(N-프탈이미도일)-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타데칸산(5)(8.5g)을 150ml의 에탄올과 3ml의 히드라진 수화물에 용해하였다. 이 용액을 실온에서 16시간 동안 교반시키고 HCl(100ml,3M)을 첨가한 후 3시간 동안 환류하였다. 실온에서 냉각시킨 후 여과 pH를 pH 9의 NaOH으로 조정하고 여액은 거의 건조될 때까지 증발시켰다. 물을 첨가하여 건조될 때까지 재증발시킨 후, 용액의 pH를 pH 4의 HCl로 조정하고 나서 건조를 위해 증발시켰다. 생성물을 이소프로판올(100ml)과 염화아세틸(2ml)로 실온에서 밤동안 처리한 후 증발시켰다. 잔여물을 물내에 모으고 알칼리성 pH(7-11)에서 디클로로메탄으로 추출하였다. 증발시켜 3.3g의 생성물을 산출하였다.
1H-n.m.r.(CD3OD):δ 1.26(d,6H); 3.17(t,2H); 3.65-3.80(m,18H); 4.16(s,2H); 5.07(m.1H).
[합성된 아미노-폴리에틸렌 글리콜-카르복실산의 일반식]
H-(OCH2CH2)nCH2CO-OCH(CH3)2
화합물 1:n=1
화합물 2:n=1
PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)2OH
화합물 3, PhtN-=N-프탈이미도일
PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OCH(CH3)2
화합물 4, PhtN-=N-프탈이미도일
PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OH
화합물 5
H2N-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OH
화합물 6
[이작용기 시약 및 카플링 산물의 제조방법]
구조식은 별도의 페이지에 제시되어 있다.
[실시예 1]
17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산의 N-히드록시숙시니미드 에스테르의 제조방법
A. 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산(A)의 제조방법
이소프로필 17-아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노에이트(실험부문 Ⅰ을 참조)를 1M의 수산화나트륨 용액 3ml에 용해하고 실온에서 30분간 놔둔다. 6M의 염산 1.5ml를 첨가하고 그 혼합물이 건조되도록 증발시킨다. 잔유물을 디클로로메탄에 흡수시키고, 용매를 증발시킨 후 545mg의 17-아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산이 되도록 여과한다. 이 화합물 460mg(1.39밀리몰)을 pH 8.4의 붕산염 완충액 10ml에 용해한다. 용액을 질소 기체로 탈기시킨다. 432mg(1.52밀리몰)의 N-숙시니미딜-2-요오도아세테이트를 함유하는 5ml의 디옥산 용액에 pH가 8.4로 유지되도록 1분간 5M 수산화나트륨을 첨가하여 적하한다. 질소기체를 유입시키는 동안 반응액을 15분간 교반한다. 얇은 막 크로마토그래피(용리액:CH2Cl2-MeOH 60:35)에 따라 몇 분간 반응을 완성시킨다. 15분 후 반응 용액의 pH가 3이 되도록 조절하고 용액을 동결건조한다. 반응 혼합물을 1-13%의 아세토니트릴과 0.1%의 트리플루오로 아세트산을 이용하는 역상 컬럼 PEP-RPC HR 30/26(파마시아 바이오시스템 에이비에서 구입)상에서 분획화한 다음 13%의 아세토니트릴, 0.1%의 TFA에서 똑같이 분리한다. 목적 피크로 부터 얻은 단편을 모으고, 351mg의 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사-헵타-데칸산(A)이 되도록 동결건조한다. 수득율:76%. 생성물의 구조는 NMR 스펙트럼을 이용하여 확인하였다.1H NMR 스펙트럼(D2O)은 δ값으로 나타냈다:
B. 17-요오도-아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산의 N-히드록시숙시니미드 에스테르(B)의 제조방법
히드록시숙시니미드(4.5mg,39μmole)를 반응 유리병에서 칭량한다. 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산(A)(18.3mg,39μmole)을 건조시킨 디옥산 0.55ml에 용해하고 반응 유리병에 첨가한다. 그 유리병을 질소기체로 탈기시킨 다음 0.15ml의 건조시킨 디옥산에 용해한 8.0mg(39μmole)의 디시클로헥실카르보디이미드 용액을 반응 유리병에 적하한다. 유리병을 질소기체로 채우고 밀폐시켜 암실에 놔둔다. 반응 용액을 3시간 반 동안 교반한다. 형성된 침전물은 여과하여 제거한다. 여과물내에서 생성된 생성물 B의 백분율은 NMR 분석한 결과 89%인 것으로 나타났다.
[실시예 2]
[(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노)-면역글로불린(C)의 제조방법]
A. 모노클로날 항체 Mab C215
0.9%의 염화나트륨을 포함하는 pH 8.1의 0.1M 붕산염 완충액 17.7ml에 용해한 면역글로불린 부류 lgG2a의 모노클로날 항체(34mg,0.218μmole)를 반응 유리병에 탄소원자첨가한다. 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산의 N-히드록시숙시니미드 에스테르(B) 3.6mg(6.4μmole)을 포함하는 디옥산 용액 146μl를 그 완충용액에 주입하고 실온에서 25분간 교반하는 동안 반응을 완성시킨다. 반응 유리병은 빛이 차단되도록 풀리(folie)로 싸둔다. 과잉의 B시약은 용리액인 0.9%의 염화나트륨을 포함하는 pH 7.5의 0.1M 인산염 완충액을 이용하여 세파덱스 G 25 K 26/40 컬럼상에 분획화하여 제거한다. 원하는 생성물 C를 포함하는 단편을 모은다. 용액(22ml)은 YM30 여과기를 통해 아미콘 셀(Amicon cell)에서 8ml로 농축시킨다. 그 농도 및 치환 정도는 아미노산 분석하여 Mab C215당 각각 4.7mg/ml 및 18 스페이서인 것으로 나타났다.
B. 모노클로날 항체 Mab C242
면역글로불린 부류 lgG1의 모노클로날 항체(Mab C242)는 실시예 2.A에 기술되어 있는 방법에 따라, 각각 노나, 도데카 및 테트라데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노)-Mab C242(C)가 제공되도록 15, 20 및 22배 몰 과잉의 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산의 N-히드록시숙시니미드 에스테르(B)와 반응시킨다.
C. 모노클로날 항체 Mab C
면역글로불린 부류 lgG2a의 모노클로날 항체(Mab C)는 실시예 2A에 기술되어 있는 방법에 따라, 각각 테트라 및 헵타(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노아미노)-Mab C(C)가 제공되도록 14 및 18배 몰 과잉의 17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산(B)와 반응시킨다.
[실시예 3]
[2-머캅토프로피오닐아미노-Eu3+표지-포도상구균 장독소 A(SEA)]
A. Eu3+표지 SEA(D)의 제조방법
SEA(톡신 테크놀로지 인코포레이티드로 부터 구입한 동결건조 산물)(2mg,72nmole)를 722μl의 밀리-Q물에 용해하고 15ml의 폴리프로필렌관에 첨가한다. pH 8.6의 0.1M 붕산염 완충액 100μl를 첨가한 다음 178μl의 밀리-Q물에 2160nmoles의 Eu3+-킬레이트 시약(파마시아 왈악 오이)을 첨가한다. 반응은 실온에서 밤새도록 완성시킨다. 과잉 시약은 용리액은 pH 8.0의 0.1M 인산염 완충액을 이용하여 세파덱스 G 25 PD 10컬럼(파마시아 바이오시스템즈 에이비) 상에서 반응 용액을 분획화하여 제거한다. 원하는 생성물 D를 가진 단편을 모은다. 그 용액(3ml)을 YM5 여과기를 통해 0.8ml의 부피가 되도록 아미콘 셀에서 농축시킨다. 농도는 아미노산 분석하여 1.7mg/ml인 것으로 나타났다. 치환 정도는 EuCl3표준 용액과 비교하여 SEA당 0.8Eu3+인 것으로 나타났다.
B1. 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐아미노 Eu3+표지 SEA(E) 및 3-머캅토 프로피오닐아미노 Eu3+표지 SEA(F)의 제조방법
pH 8.0의 0.1M 인산염 완충액 0.75ml에 용해시킨 Eu3+-SEA(1.24mg/44.8nmoles)를 15ml의 폴리프로필렌 관에 첨가한다. 1ml의 에탄올에 용해시킨 1.6mg의 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트의 용액 35μl(180nmole)를 폴리프로필렌관에 첨가하고 반응 용액을 실온에서 30분간 교반한다. 수득된 생성물 E는 생성물 F로 환원되기 전에는 분리되지 않는다.
pH 5가 되도록 지금까지의 반응 용액에 20μl의 0.2M Eu3+-시트레이트 용액 및 50μl의 2M 아세트산을 첨가한다. 그런다음 0.9%의 염화나트륨 0.1ml에 용해시킨 3.1mg의 디티오트레이톨(머크)의 용액을 첨가하고 반응 용액을 실온에서 20분간 교반한다. 그런다음 0.9%의 염화나트륨 용액 50μl를 첨가하여 전체부피를 1ml로 조절한다. 반응 용액(1ml)을 세파덱스 G 25 NAP-10컬럼(파마시아 바이오 시스템즈 에이비)상에 두고 원하는 생성물 F를 0.9%의 염화나트륨을 포함하는 pH 7.5의 0.1M 인산염 완충액 1.5ml를 첨가하여 용리시킨다. 용리된 생성물 F를 15ml의 폴리프로필렌관에 수집하고, 디설파이드 화합물로 재산화되는 것을 막기위해 생성물 G를 합성하는데 직접 사용한다.
B2. 2-머캅토프로피오닐아미노-포도상구균 장독소 A(SEA)(F2)의 제조방법
천연 SEA(톡신 테크놀로지 인코포레이티드로 부터 구입한 동결건조 산물) 또는 재조합하여 제조한 SEA(rSEA)를 실시예 3B1에서 기술한 방법에 따라 2배 몰 과잉의 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트와 반응시킨다. 치환 정도는 Carlsson등(Biochem. J. 173(1978) 723-737)의 방법에 따라 UV 분석하여 SEA당 1.9 머캅토프로피오닐기인 것으로 나타났다.
[실시예 4]
[SEA-모노클로날 항체 결합체(G1 및 G2)의 제조방법]
A. Eu3+-SEA와 Mab C215 사이의 결합체(G1)
실시예 3B에서 기술한 4-머캅토프로피오닐아미노 Eu3+표지 SEA(F)의 용액에 0.9%의 염화나트륨을 포함하는 pH 7.5의 0.1M에 인산염 완충액에 함유되어 있는 옥타데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C215(C) 용액 1.2ml(4mg)를 첨가한다. 반응은 실온에서 밤새도록 놔두어 완성시킨다. 그런다음 반응하지 않은 요오도알킬기는 1ml의 물에 용해한 20μl의 머캅토에탄올 용액 5μl(1.2μmole)를 첨가하여 차단시킨다. 그 반응 용액을 실온에서 4시간 동안 놔둔 다음 여과한다. 그런다음 여과물은 0.9%의 염화나트륨을 포함하는 pH 7.5의 0.002M 인산염 완충액을 용리액으로 사용하여 슈퍼로스 12HR 16/50 컬럼(파마시아 바이오 시스템즈 에이비)상에서 분획화한다. 원하는 생성물 G를 가진 단편을 모아서 분석한다. 단백질 함량은 아미노산 분석에 의해 0.22mg/ml인 것으로 나타났다. 치환 정도는 Eu3+결정에 의해 lgG당 하나의 SEA인 것으로 나타났다. 또한 그 생성물의 면역자극성 및 항체 결합능을 연구하였다.
화합물(C)와 관련하여 화합물(F)의 양을 증가시킴으로써 고도의 치환 정도를 획득하였다.
B. rSEA와 Mab C215 사이의 결합체(G2)
옥타데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C215(C)를 실시예 4A에 기술된 방법에 따라 1.8배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 결합체의 조성물은 파스트-겔(Phast-GelTM) 구배 4-15상에서 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하고 결합은 파스트 이미지(Phast IMAGE)(파마시아 바이오 시스템즈 에이비에서 구입)로 스캐닝하였다. 수득된 결합체는 세 개의 SEA를 가진 6% Mab C215, 두 개의 SEA를 가진 15%의 Mab C215, 하나의 SEA를 가진 28%의 Mab C215 및 51%의 치환되지 않은 Mab C215로 구성되어 있다.
다른 실험에서는 2.7배 몰 과잉의 F2가 세 개의 SEA를 가진 25%의 Mab C215, 두 개의 SEA를 가진 25%의 Mab C215, 하나의 SEA를 가진 34%의 Mab C215 및 26%의 치환되지 않은 Mab C215로 구성된 조성물을 가진 결합체를 제공하는데 사용된다.
C. rSEA와 Mab C242 사이의 결합체
C1. 테트라데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C242(C)는 실시예 4A에 기술된 방법에 따라 3.2배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 결합체의 조성물은 실시예 4B에 기술된 바와 같이 분석하여 네 개의 SEA를 가진 4%의 Mab C242, 세 개의 SEA를 가진 12%의 Mab C242, 두 개의 SEA를 가진 28%의 Mab C242, 하나의 SEA를 가진 36%의 Mab C242 및 20%의 치환되지 않은 Mab C242인 것으로 나타났다.
동일한 반응이 계속되지만 반응생성물을 Mab C242와 그 스페이서 사이 및 SEA와 머캅토프로피오닐기 사이의 불안정한 결합을 제거하기 위해 컬럼 분획화하기 전에 0.2M 히드록실아민으로 4시간 처리한다. 수득된 결합체는 네 개의 SEA를 가진 1% Mab C242, 세 개의 SEA를 가진 12%의 Mab C242, 두 개의 SEA를 가진 27%의 Mab C242, 하나의 SEA를 가진 36%의 Mab C242 및 24%의 치환되지 않은 Mab C242로 구성된 조성물을 가진다.
C2. 도데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C242(C)를 실시예 4A에서 기술한 바와 같은 방법에 따라 3배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 수득한 결합체는 세 개의 SEA를 가진 6%의 Mab C242, 두 개의 SEA를 가진 26%의 Mab C242, 하나의 SEA를 가진 36%의 Mab C242 및 31%의 치환되지 않은 Mab C242로 구성된 조성물을 가진다.
C3. 노나(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타-데카노일아미노) Mab C242(C)를 실시예 4A에 기술한 바와 같은 방법에 따라 3배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 수득한 결합체는 두 개의 SEA를 가진 13%의 Mab C242, 하나의 SEA를 가진 39%의 Mab C242, 및 46%의 치환되지 않은 Mab C242로 구성된 조성물을 가진다.
D. rSEA와 Mab C 사이의 결합체
D1. 헵타(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C를 실시예 4A에 기술된 바와 같은 방법에 따라 5.4배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 결합체의 조성물을 실시예 4B에 기술된 바와 같이 분석하고 네 개의 SEA를 가진 15%의 Mab C, 세 개의 SEA를 가진 24%의 Mab C, 두 개의 SEA를 가진 29%의 Mab C, 하나의 SEA를 가진 19%의 Mab C, 3%의 치환되지 않은 Mab C 및 10%의 이합체형 Mab C인 것을 밝혔다.
Mab C와 스페이서 사이 및 SEA와 머캅토프로피오닐기 사이의 불안정한 결합을 제거하기 위해 제시되는 0.2M의 히드록실아민으로 동일한 반응을 계속 진행시킨다. 형성된 결합체는 세 개의 SEA를 가진 11%의 Mab C, 두 개의 SEA를 가진 24%의 Mab C, 하나의 SEA를 가진 30%의 Mab C, 18%의 치환되지 않은 Mab C 및 17%의 이합체형 Mab C로 구성된 조성물을 가진다.
D2. 테트라(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C를 실시예 4B에 기술된 방법에 따라 5.7배 몰 과잉의 2-머캅토프로피오닐아미노-rSEA(F2)와 반응시킨다. 결합체는 네 개의 SEA를 가진 8% Mab C2, 세 개의 SEA를 가진 18%의 Mab C2, 두 개의 SEA를 가진 30%의 Mab C2, 하나의 SEA를 가진 26%의 Mab C2, 5%의 치환되지 않은 Mab C 및 12%의 이합체형 Mab C2로 구성된 조성물을 가진다.
[실시예 5]
[[17-(3-머캅토프로피오닐아미노)-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노]-rSEA(I)의 제조방법]
A. 17-[3-(2-피리딜디티오)프로피오닐아미노]-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노)-rSEA(H)의 제조방법
17-[3-(2-피리딜디티오)프로피오닐아미노]-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸산의 N-히드록시숙시니미드 에스테르 용액(K)(43μl의 디옥산내에 함유된 0.53mg(896nmoles))을 0.9%의 염화나트륨을 함유하는 pH 7.5의 0.1M 인산염 완충액 1ml내에 함유된 3.67mg(128nmoles)의 rSEA 용액에 주입한다. 반응은 실온에서 30분 동안에 완성시킨다. 치환 정도를 분석하기 위해 100μl를 취한다. 잔류물은 생성물 Ⅰ로 환원될 때까지 냉동시켜 보관한다.
치환 정도는 세파덱스 G50 NICK 컬럼(파마시아 바이오 시스템즈 에이비)상에 100μl의 반응 용액을 탈염시키고 Carlsson등의(Biochem. J. 173(1978) 723-737) 방법에 따라 UV-분광학으로 용리액을 분석한다. 2.7 스페이서를 rSEA에 결합시킨다.
B. [17-(3-머캅토프로피오닐아미노)-3,6,9,12,15-페ㅈ타옥사헵타데카노일아미노]-rSEA(I)의 제조방법
2HCl을 이용하여 생성물 H를 가진 반응 용액(0.9ml)의 pH를 pH 4.4로 조절하고 75μl의 0.9% 염화나트륨에 용해한 2.9mg의 디티오트레이톨을 첨가한다. 반응은 30분 동안에 완성시킨다. 반응 용액을 세파덱스 G25 NAP 10 컬럼(파마시아 바이오 시스템즈 에이비)에 첨가하고, 0.9%의 NaCl을 가진 pH 7.5의 0.1M 인산염 완충액 1.5ml로 용리시켜 즉시 실시예 6의 생성물 J를 합성하는데 사용한다.
[실시예 6]
[이중 스페이서를 가진 SEA-모노클로날 항체 결합체 J의 제조방법]
도데카(17-요오도아세틸아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노) Mab C242(C)(4.2mg, 0.9%의 NaCl을 수반한 pH 7.5의 0.1M 인산염 완충액 1.0ml로 27nmoles)는 질소 대기중의 암실에서 43시간 동안 [17-(3-머캅토프로피오닐아미노)-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데카노일아미노]-rSEA(I)(1.17mg, 상기 완충액 1ml로 42nmoles)와 반응시킨다. 그런다음 1.14μmole의 머캅토에탄올을 첨가한다. 그 후 1시간 후에 반응 용액을 수퍼덱스 200HR 16/65 컬럼상에서 분획화한다. 생성물을 0.9%의 NaCl을 가진 pH 7.5의 2mM 인산염 완충액으로 용리시킨다. 원하는 생성물 J를 가진 단편을 모으고 실시예 4B에 기술되어 있는 바와 같이 분석한다. 결합체는 두 개의 SEA를 가진 9%의 Mab C242, 하나의 SEA를 가진 25%의 Mab C242 및 66%의 치환되지 않은 Mab C242로 구성되어 있다.
[실험부문 Ⅱ]
[초항원-항체 결합체가 세포에 미치는 영향]
다음 실험에 사용한 박테리아 독소는 톡신 테크놀로지(미국 위스콘신)로 부터 수득한 포도상구균 장독소 A(SEA)이거나 대장균으로 부터 재조합 단백질로서 생산한 것이다.
항체는 C215, C242 및 Thy-1.2mAbs이다. C215는 인체의 콜론 암종 세포주에 대해 생긴 lgG2a mAb이고 몇몇 인체의 콜론 세포주상의 37KD 단백질 항원과 반응한다. 이들 mAbs에 대한 참고문헌은 상기한 바와 같다. 결합체는 선행 실험 부문에서 기술한 바와 같이 제조한다.
우선권 주장일 이전의 연구에서는 Eu3+표지 SEA-C215mAb 결합체로만 수행되었다. 우선권을 주장한 그 해 동안에 표지하지 않은 SEA-215, SEA-242 및 SEA-Thy-1.2mAb 결합체에 대한 결과가 입증되었다. 이번에 통합한 결과는 표지하지 않은 결합체와 관련된 것이다.
SEA-C215mAb 결합체, 및 MHC Class Ⅱ가 결여되어 있거나 낮지만 검출불가능한 양의 MHC Class Ⅱ를 발현하는 콜론 암종 세포에 대한 C215mAb와 비결합된 SEA에 의해 매개되는 세포독성을 결정하기 위해, 본 발명자는 작동인자 세포로서 다양한 인체 SEA 확장 T세포주와 표적세포로서 콜론 암종 세포 및 MHC Class Ⅱ+Raji 세포를 사용하였다. 콜론 암종 세포주 Colo205(ATCC 제CCL 222호), SW620(ATCC 제CCL 227호) 및 WiDr(ATCC 제CCL 218호)은 모두 HLA-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ에 대한 mAbs로 염색하고 FACS 분석하여 결정한 바와 같이 MHC Class Ⅱ의 형질발현이 되지 않았다. SEA 확장 T세포주는, 재조합 IL-2(20유닛/ml)의 존재하에서 SEA로 예비피복한 마이토마이신 C 처리한 MHC Class Ⅱ+BSM 림포아 세포로 약하게 재자극시킴으로써 말초 혈액으로 부터 확립시켰다. 이들 T세포주는 SEA로 피복한 Raji 또는 BSM 세포를 향해 강하게 세포독성을 띄지만, 포도상구균 장독소 B(SEB)로 피복시키거나 피복시키지 않은 세퐁는 세포독성을 띄지 않는다. 이 SEA로 유도된 치사는 차단하는 HLA-DR 항체, MHC Class Ⅱ_Raji 돌연변이 세포 및 HLA-DR로 형질감염된 L-세포를 이용하여 결정한 바와 같이 표적세포상에서의 SEA와 MHC Class Ⅱ의 상호작용에 의존한다(Dohlsten등, Immunology 71)(1990) 96-100 참조). 이들 T세포주는 C215-SEA 결합체에 의해 C215+MHC Class Ⅱ_콜론 암종 세포를 치사하기 위해 활성화될 수 있다.
이와는 대조적으로, 비바된 SEA 및 C215mAb는 C215+MHC Class Ⅱ_콜론 암종 세포에 대해 최조 이상의 T세포 치사를 유도할 수 없다. 포도상구균 장독소 항체 결합체에 의존하는 세포 중재 세포독성은 C215+종양세포에 대한 SEA-C215mAb 결합체의 결합에 의존한다.
이 결합의 특이성은 부적절한 C242 및 W6/32mAbs가 아닌 과잉의 비결합 C215mAb가 콜론 암종 세포의 용해를 저해한다는 사실에 의해 입증되었다. CD4+및 CD8+T세포들은 SEA-C215로 처리한 C215+콜론 암종 세포를 치사한 것을 입증하였지만 SEA로 처리한 세포를 용해시키지 못했다. MHC Class Ⅱ_종양 세포에 결합한 SEA-C215mAb 결합체와 T세포의 상호작용은 MHC Class Ⅱ+세포의 SEA 유도 치사에 대해 입증한 바와 같은 초기의 방식대로 특이적인 V-베타 TCR 시퀀스와 상호작용하는 것과 관련이 있는 것으로 나타났다. 이것은 C215-SEA 결합체와 자가조직의 SEB 특이 T세포주가 아닌 SEA 특이 T세포주의 상호작용에 의해 나타난다. C242mAb 및 Thy-1.2mAb 결합체는 C215mAb 결합체와 유사한 활성도를 나타내었다.
[SEA를 수반한 표적세포의 크롬 표지 및 항온]
0.75×106의 표적세포와 150μCi의51크롬(영국 알링톤 하이츠에 소재하는 애머샴 코포레이션에서 구입)을 100μl의 부피로 37℃에서 45분간 항온하였다. 2.8%(v/v)의 7.5% NaHCO3, 1%의 소듐 피로베이트, 2%의 200mM L-글루타민, 1%의 1M 헵스, 1%의 10mg/ml 겐타마이신 및 10%의 태아 소혈청(FCS, 영국 페이즐리에 소재하는 집코에서 구입)을 보충한 RPMI-1640 배지(영국 페이즐리에 소재하는 집코에서 구입)를 함유하는 완전 배지에 상기 세포를 보존하였다. 항온한 후 FCS가 없는 완전배지에서 1회 세척하고 37℃에서 60분간 항온하고 세척하여 10%의 FCS를 함유하는 완전배지에 재분산한다. 5×103의 표적세포를 U자형 바닥을 가진 96웰 현미 적정 평판(미국 캠브릿지에 소재하는 코스타에서 구입)의 각 웰에 첨가한다.
[세포독성 검정]
작동인자 세포는 작동인자/표적세포의 비를 다양하게 하여 웰에 첨가한다. 각 웰내의 최종 부피는 200μl이다. 각 실험은 세 번 중복하여 실시한다. 평판을 37℃에서 4시간 항온한 후 방출된 크롬을 수확한다.51Cr의 양은 감마-계수기(팩카드에 소재하는 코브라 오토-감마에서 구입)로 결정한다. 세포독성 백분율은 다음의 일반식에 의해 계산된다:
%세포독성=(X-M)/(T-M)*100
여기서 X는 실험 표본에서 얻어지는 cpm으로서 크롬 방출량이고 M은 배지와 함께 항온시킨 표적세포의 자발적인 크롬 방출량이고 T는 1%의 소듐 도데실 설페이트와 함께 표적세포를 항온시킴으로써 수득되는 총 크롬 방출량이다.
[결과]
SEA-C242, SEA-C215 및 SEA-항-Thy-1.2mAb 결합체는 mAbs의 관련 에피토프를 형질발현하는 세포와 MHC Class Ⅱ+세포에 각각 결합한다. 다른 한편으로는 비결합 SEA가 MHC Class Ⅱ+세포에만 결합한다. 비결합 C215, C242 및 Thy-1.2mAbs는 Raji 세포(ATCC 제CCL 86호)가 아닌 관련 세포에 결합한다(표 1).
인체 T세포주는 비결합 SEA 및 C215mAb의 존재하에서가 아닌 SEA-C215mAb 결합체의 존재하에서 MHC Class Ⅱ-SW620, Colo205 및 WiDr 세포를 용해한다(Fig. 1). 콜론 암종 세포의 용해는 10-100ng/ml의 SEA-C215mAb 결합체에서 나타났다. 표적세포에 대한 작동인자의 다양한 비 정도에서 SW620에 대한 SEA-C215mAb 결합체와 함께 높은 수준의 용해가 일어나는 것으로 나타났다(Fig. 1). 이와는 대조적으로, 비결합 SEA 또는 C215mAb는 표적세포에 대한 모든 처리한 작동인자의 비에서 SW620 세포에 대한 세포독성을 중재하지 않는다. MHC Class Ⅱ-Colo205 세포를 용해시키는 능력은 결합체에 한정되어 있고 결합되지 않은 SEA 및 C215mAb에 의해 유도될 수 없다는 점을 지적해준다. C215mAb가 아닌 SEA 및 SEA-C215mAb 결합체는 MHC Class Ⅱ+Raji 세포 및 인터페론으로 처리한 MHC Class Ⅱ+Colo205 세포를 치사하는 T세포를 중재한다(Fig. 1).
SEA-C215mAb 결합체에 의해 중재된 용해는 표적세포상의 C215mAb 분자에 대한 결합체의 특이적 결합과 관련된다는 것을 입증하기 위해, 본 발명자는(C215mAb 결합에 관하여) 콜론 암종 세포상의 부적절한 항원에 결합하는 과잉의 결합되지 않은 C215mAb 및 mAb 242를 가지고 차단 연구를 수행하였다. 첨가한 mAb C215는 강하게 세포독성을 차단하는 반면 C242mAb는 아무런 영향을 미치지 못했다(Fig. 2). 유사하게 SEA-C242mAb 결합체에 의한 용해는 C215mAb가 아닌 과잉의 결합되지 않은 C242mAb에 의해 특이적으로 차단되었다.
MHC ClasS Ⅱ SW620 콜론 암종 세포의 T세포 의존 용해를 유도하기 위한 SEA-C215mAb 결합체의 능력은 CD4+와 CD8+T세포 집단에서 나타났다(표 2). SEA는 SW620 세포의 치사를 중재하기 위해 이들 모든 T세포 부집단은 활성화되지 못하지만 MHC Class Ⅱ+Raji 세포의 용해를 유도하였다(표 2).
SEA-C215mAb 결합체는 SEB 확장 T세포주에 의해서가 아닌 SEA 확장 T세포주에 의해 SW620 및 Raji 세포의 용해를 유도하였다(Fig. 3). SEA 및 SEB 확장 T세포주의 특이성은 Raji 세포에 노출될 때 각각 SEA 및 SEB에 대한 선택적인 반응에 의해 지적되어 있다(Fig. 4). 이것은 SEA-C215mAb 결합체가 결합되지 않은 SEA의 경우와 유사한 V-베타 TCR 특이성을 유지하고 있음을 지적해준다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 SEA-C215mAb 결합체는 MHC Class Ⅱ_콜론 암종 세포에 대하여 CTLs을 향하게 한다. 왼쪽 패널 상단은 각각 1μg/ml의 농도로 첨가한 SEA-C215mAb 결합체, SEA, C215 및 C215와 SEA의 혼합물(C215+SEA)의 존재 또는 부재(-) 하에서 표적세포에 대한 작동인자의 비를 다양하게 하여 SW620 세포에 대한 SEA 반응 CTLs의 효과를 입증한 것이다. 다른 패널들은 SEA-C215mAb 결합체, C215+MHC Class Ⅱ_콜론 암종 세포주 SW620, Colo205 및 WiDr에 대한 표적 SEA 반응 CTLs에 대한 SEA, MHC Class Ⅱ+C215+인터페론 처리한 Colo205 세포 및 C215-MHC Class Ⅱ+Raji 세포의 용량을 입증한 것이다. 표적에 대한 작동인자의 비는 30:1이다. 몇몇 농도의 비결합 C215mAb를 첨가하였을 때 이들 세포주에 대해 표적을 삼은 모든 CTL은 유도되지 않았다. HLA-DR, -DP, -DQ에 대한 mAbs를 이용하여 SW620 세포, Colo205 및 WiDr 세포에 대해 FACS 분석하였을때 모든 표면 MHC Class Ⅱ 형질발현이 검출되지 않은 반면, HLA-DR, -DP 및 -DQ의 풍부한 형질발현이 Raji 세포 및 인터페론을 처리한 Colo205 세포상의 HLA-DR 및 -DP상에서 검출되었다. Colo205 세포는 CTL 분석에 사용하기 전 48시간 동안 100유닛/ml의 재조합 인터페론-감마로 처리한다.
제2도는 SEA-C215mAb 결합체 및 SEA-C242mAb 결합체에 의해 유도된, 콜론 암종 세포를 표적으로 삼은 CTL은 mAb의 항원 선택성에 의존한다. SEA-C215mAb 및 SEA-C242mAb 결합체(3μg/ml) 존재하에서 SEA 반응성 CTL 주에 의한 Colo205 세포의 용해는 각각 결합되지 않은 C215 및 C242mAbs(30μg/ml)를 첨가함으로써 차단된다. 치환되지 않은 mAb 또는 대조배지(-)는 그 결합체를 첨가하기 10분 전에 표적세포에 첨가한다.
제3도는 SEA-C215mAb 결합체로 피복된 콜론 암종 세포의 용해는 SEB 반응 CTLs가 아닌 SEA 반응 CTLs에 의해 중재된다. 자가 SEA 및 SEB 선택 T세포주는, 각각 1μg/ml의 농도로 첨가한 SEA-C215mAb 결합체, 비결합 C215mAb와 SEA(C215+SEA) 및 비결합 C215mAb와 SEB(C215+SEB)의 존재 또는 부재하에서 SW620 및 Raji 표적세포에 대항하는 10:1의 표적세포에 대한 작동인자의 비로 사용하였다.
제4도는 세포독성은 그들의 표적세포(각각 Colo205 종양세포 및 EL-4 종양세포)에 대한 SEA-C242mAb 결합체 및 SEA-항-Thy-1.2mAb 결합체에 의해 유도된다.
다양한 첨가제로 된 대조(PBS-BAS)와 함께 세포를 얼음에서 30분간 항온하고, 세척하여 아래에 기술된 바와 같이 실시한다. Colo205 세포에 결합한 C215mAb 및 C242mAb와 EL-4 세포(ATCC 제TIB 39호)에 결합한 항-Thy-1.2의 염색은 FITC로 표지된 토끼의 항마우스 1g을 이용하여 검출한다. Raji 세포에 대한 SEA의 염색은 토끼의 항-SEA 혈청을 이용하여 검출한 후 FITC-돼지 항 토끼 1g을 이용하여 검출한다. Colo205 및 Raji 세포에 대한 SEA-C215mAb 결합체의 염색은 C215mAb 및 SEA에 대해 상기한 방법들을 이용하여 검출한다. FACS 분석은 벡톤 및 디킨슨으로 부터 수득한 FACS 스타상에서 실시한다. 두번째와 세번째 단계의 염색은 단지 배경을 명확히 하기 위해서 이용된다.

Claims (17)

  1. 항체 및 초항원을 포함하는 가용성 항체 결합체로서, 상기 항체는 콜론 암종 관련 세포상에 존재하는 항원결정인자(에피토프)에 대응하는 항체이고 상기 초항원은 포도상구균 장독소 A인 가용성 항체 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 C242 에피토프와 특이적으로 대응함을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 항체는 GA-733 패밀리에 속하는 단백질상의 에피토프, 특히 C215 에피토프와 특이적으로 대응함을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합체의 초항원 성분/항체 성분이 적어도 1-5임을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 초항원과 항체는 적어도 하나의 아미드 구조를 포함하고 적어도 6개 원자 길이의 사슬을 제공하는 친수성인 유기 공유결합 구조(-B-)로 결합하고 있음을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  7. 제6항에 있어서, 공유결합(-B-)이 다음과 같은 일반식(Ⅰ)을 포함함을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
    여기서, r은 정수 1 또는 2; R은 1-4개의 탄소원자를 갖는 알킬렌; n은 정수 1-20; m은 정수 1 또는 2; 및 Y는 -NH-, -NHNH- 또는 -NHN=CH-이다.
  8. 제1항에 있어서, 상기 결합체가 결합체의 항체 성분에 대응하는 표적세포 표면구조를 수반하는 표적세포의 용해에 사용됨을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체.
  9. 표적세포의 세포용해 방법에 있어서, 초항원에 결합된 항체를 포함하는 가용성 항체 결합체의 표적세포 용해 유효량을 표적세포와 접촉시키되, 상기 항체는 표적세포, 즉 콜론 암종 관련 세포상에 존재하는 항원결정인자(에피토프)에 대해 특이적이며 초항원은 포도상구균 장독소 A인 표적세포의 세포용해 방법.
  10. 제9항에 있어서, 초항원, 항체 및 초항원에 항체를 결합시키는 결합 구조는 제1, 5-8 및 11-13항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같음을 특징으로 하는 표적세포의 세포용해 방법.
  11. (ⅰ) (a) 탄수화물 구조, 및 (b) 작용기:티올기, 디설파이드기, 카르복시기 및 아미노기 중에서 선택한 적어도 하나의 구조에 의해 초항원을 항체와 공유결합시킴으로써 항체 및 초항원, 또는 항체 또는 초항원으로 부터 결합체를 합성하되, 상기 항체는 콜론 암종 관련 세포상에 존재하는 항원결정인자(에피토프)에 대응하는 항체이고 상기 초항원은 포도상구균 장독소 A이며, (ⅱ) 결합체가 합성된 배지로 부터 결합체를 회수하는 단계로 구성되는 가용성 항체 결합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 공유결합이 초항원 및 항체, 또는 초항원 또는 항체내의 아미노기에서 진행됨을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 공유결합이 (ⅰ) 티올 반응기를 수반하는 항체나 초항원을 형성하기 위해 항체 또는 초항원을 티올 반응기 및 아미노 반응기를 포함하는 유기 시약과 반응시키고, (ⅱ) 티올기나 보호된 티올기를 수반하는 항체나 초항원을 형성하기 위해 초항원 및 항체의 잔여부분을 티올기나 보호된 티올기 및 아미노 반응기를 포함하는 유기 시약과 반응시키며, (ⅲ) 각각의 (ⅰ) 및 (ⅱ) 단계로 부터 수득한 생성물을 서로 반응시켜 디설파이드나 티오에테르에 의해 항체와 결합한 초항원의 결합체를 형성하도록 하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 티올 반응기를 포함하는 아미노 반응 시약은 알파-할로아세틸 할로겐화물이되, 티올기나 보호된 티올기를 포함하는 이 화합물은 이작용기 결합 시약이며 다음과 같은 일반식(Ⅱ)을 가짐을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체의 제조방법.
    여기서, m은 정수 1 또는 2이고, n은 정수 1-20, Z1은 HS-반응 친전자성기, 티올기(-SH) 또는 보호된 티올기(AcS-)이되, 티올기와 히드록시기는 R내에 존재하는 하나 및 동일 탄소원자와 결합해서는 안된다는 것을 전제조건으로 하며, Z1'은 활성화된 카르복시기이다.
  15. 제11-14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초항원과 항체는 제1 및 2-5항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 초항원 및 항체임을 특징으로 하는 가용성 항체 결합체의 제조방법.
  16. 암으로 고통받는 인간을 제외하는 포유동물의 질병 치료방법에 있어서, 이 방법은 제1, 2-5 및 6-7항 중 어느 한 항에 따른 결합체의 표적세포 용해 유효량을 상기 포유동물에 투여함을 포함하되, 상기 표적세포는 치료하고자 하는 질병과 관련된 것임을 특징으로 하는 인간을 제외하는 포유동물의 질병 치료방법.
  17. 제1, 2-5 및 6-7항 중 어느 한 항에 따른 가용성 항체 결합체의 표적세포 용해 유효량을 함유하는 암 치료용 제약학적 조성물.
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