CN1082821C

CN1082821C - 抗体共轭物

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Publication number: CN1082821C
Application number: CN91105586A
Authority: CN
Inventors: T·卡兰; G·赫德隆; M·多尔斯滕; E·阿克布卢姆; P·A·兰多
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Active Biotech AB
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 2002-04-17
Anticipated expiration: 2006-07-19
Also published as: ZA915646B; HU211917A9; CN1059278A; PT98396B; IL98777A0; PT98396A; IE75719B1; IL98777A; IE912555A1; IS3732A7; TW213415B; NZ238953A; SE9002479D0

Abstract

一种可溶性抗体共轭物，它含有与可被T细胞识别的结构相连接的抗体，能够导致T细胞溶解靶细胞，这些靶细胞是可以被抗体识别的。该共轭物的特征在于其结构是超级抗原。一个重要的方式是溶解靶细胞的方法，其中靶细胞与靶细胞溶解有效量的共轭物接触。这种溶解方法能部分有效地治疗癌、自身免疫、寄生虫感染以及真菌、病毒和细菌感染。本说明书还描述了例如该共轭物的合成以及药物组合物和其制备方法。

Description

抗体共轭物

本发明涉及能够活化细胞毒素T细胞(CTLS)的抗体共轭物。该共轭物对于破坏不需要的细胞是有利的，这些细胞与癌形成，自身免疫产生、寄生虫感染和细菌、病毒与真菌感染有关。

在过去的几年中曾试图将抗体与对靶细胞直接产生毒效的药剂(细胞毒素剂、细胞毒素)结合使用，以提供对靶细胞的选择作用，并且防止对其他细胞的非特异性影响以及将这种影响减至最小。所建议的这种结合物涉及到从共价键合的配合物(利用键合提供分子)和非共价键合的配合物至简单混合物(例如，Ghose等人，J.Natl.CancerInst61(1979)657-676和Carlsson等人，Biotechnology7(1989)567-73)。所建议的细胞毒素不是白喉毒素、蓖麻蛋白、蓖麻蛋白的亚单位A、gelonin和绿脓假.单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(Takeda chemical Ind.，EP-A-336405和Pastan等人，WO-A-88/00703，这两篇专利都被相关的在先申请，SE-9002479所引用。

随着杂交瘤技术的出现以及单克隆抗体的可得到性，可以使用抗体与细胞毒素剂之间的配合物概念使细胞毒素剂更专一地指向目的靶细胞群。

鉴于所认识的细胞毒素剂对除靶细胞以外的其他细胞的破坏作用，有人曾建议用免疫刺激剂代替细胞毒素剂，以激发T-淋巴细胞并活化CTLS。具体地建议涉及与下述物质共轭的抗体：

(i)直接抗T细胞受体的抗体或者能与T细胞受体结合的化合物(Mass.Inst Techn.，EP-A1-180171)；

(ii)能活化细胞毒素T细胞的化合物，例如抗原、有丝分裂原、其他外源蛋白和肽(Neorex Corp.，Ep-A1-334300)；

(iii)MHC抗原，(Behringwerke AG，Ep-A1-352761)；

(iv)使被治疗个体具有抗该抗原的免疫力的抗原(Med.Res.Counc.Wo-A-90/11779(publ.1990-10-18))；以及

(v)一种未命名的细菌肠毒素(Ochi与Wake，UCLA-Sym-posium：癌的细胞免疫力和免疫疗法，1990年1月27日-2月3日，摘要CE515，第109页)。

但是，到目前为止所建议的免疫刺激剂的作用不是太专一是就是其作用太普遍的。例如传统的抗原只能活化1/10⁵T细胞，而有丝分裂原能够活化大多数T细胞。

已经认识到，某些药剂介导T细胞中度比率活化；即它们能以较高的频率活化T细胞，但是远远达不到100％(Fleischer等人，J.Exp.Med.167(1988)1697-1707；以及White等人，cell56(1989)27-35，两篇文章都通过参考结合于本文)。这种类型的药剂是比传统的抗原更有效的活化剂，因此它们被命名为超级抗原(superantigens)(参见kappler和marrack，Science248：705，(1990))。已经进一步证实迄今为止已知的超级抗原能够将II类MHC分子结合到靶细胞上，并且能活化带有特有的T细胞受体Vβ链的细胞毒素T细胞(Dohlsten等人，Immunol.71(1990)96-100；和Hedlund等人，Cell.Immunol129(1990)426-34，两篇文章都通过参考被结合在本文中)。所公开的数据表明MHC结合是T细胞结合以及发生活化作用的先决条件。不能排除今后将发现通过T细胞受体Vα链起作用或者只在T细胞亚群上发现的其他表面结构发生作用的超级抗原。

Platsoucas等人还描述了超级抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)的免疫调节作用(Cell Immunol.97(1986)371-85)。

大多数目前已知的超级抗原作为毒素，已经被较早地识别，并且所有超级抗原都来源于微生物。葡萄球菌肠毒素例如是肠毒性的并且能活化T细胞，这两种作用是可相互鉴别的(Fleis-cher等人，Cell.Immunol.118(1989)92-101；Alber等人，J.Im-munol 144(1990)4501-06；以及Infect.Immun.59(1991)2126-34)。

以前曾有人建议使用超级抗原，以引导CTL介导携带II类MHC抗原的细胞溶解(Pharmacia AB，Wo-A-91/04053，公开日1991年4月4日)。W-A-91/04053包括了，但没有明确提到，结合到共价免疫共轭物中的超级抗原。

可是，缺乏II类MHC的细胞或者表达有限量II类MHC蛋白的细胞不能结合足够量的超级抗原以通过CTLS有效地引导其溶解。因此携载II类MHC抗原的一般丰富的细胞和在多数肿瘤细胞上无丰富的II类MHC抗原，超级抗原对于专一的杀死这些不需要的细胞的价值，应该是很低的。

但是我们已经发现，如果将超级抗原共价连接于一个抗体(该抗体对抗被杀死细胞具有特异性的抗原决定簇)上，那么就可以利用超级抗原实现由CTLs介导的专一细胞杀死作用。免疫系统的活化可以诱导缺乏II类MHC抗原的靶细胞表达，这些可以增强所需的溶解作用。

本发明涉及新的抗体共轭物

(i)含有(1)针对抗靶细胞的抗体和(2)一种超级抗原，即识别(相互作用或者结合)并且活化T细胞、特别是CTL结构的抗体共轭物。

(ii)破坏靶细胞的方法，特别是涉及对哺乳动物的治疗方法，以及特异地活化T细胞例如CTLs的方法；

(iii)合成这些共轭物的方法；以及

(iv)含有这些共轭物的药物组合物与该组合物的制备方法。破坏靶细胞的方法包括治疗癌症、自身免疫、病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染和其他疾病的治疗方法，其目的是高度准确地杀死某些细胞。本发明的共轭物可用于制备药物组合物，这些药物组合物将用于破坏与刚刚提到的疾病有关的靶细胞。接受治疗的个体是正常的动物，主要是人。共轭物的超级抗原部分

新的抗体共轭物，其特征在于通过T细胞识别的结构是超级抗原。该共轭物在生理pH下是规度可溶的，在体外可溶于血清中。

优选的超抗原选自葡萄球菌肠毒素(SEs)(例如SEA、SEB、SEC、SED和SEE)、类毒素、其活性片段或肽，以及对活化CTLs具有相同作用方式的其他物质。这些超级抗原可以包括其他微生物产物(细菌与病毒)，例如从葡萄球菌株得到的，如毒性休克综合征毒素(TSST-1)、从链球菌得到的如致热外毒素A、细菌外蛋白以及由关节炎支原体(mycoplasma arthridis)产生的蛋白，它们与T细胞的相互作用与超级抗原具有同样的能力。通过培养其天然产物或遗传工程细胞(重组技术)或者也可以通过合成肽合成，来获得超级抗原。用于本发明的超级抗原当用于本说明书中所述的实验模型时，应该产生与本说明书实验部分相类似的作用。

优选的超级抗原具有能够与活化CTLs有关的多形T细胞表面蛋白的同型，优选的是与T细胞受体Vβ链结合约1-40％的能力。共轭物的抗体部分

虽然可以使用多克隆抗体，只要它们能提供足够狭窄的专一性，但是优选的抗体是单克隆抗体。表达抗体是指总体上的抗体，因此包括抗体活性片段以及其他与抗体结合能力相仿的其他分子，只要它们对有问题的靶细胞具有合适的专一性抗体新抗原性和亲合力。这包括遗传工程(重组产生的)抗体和抗体衍生物或者其他相似的结合构建体。一个例子是，该抗体是对肿瘤细胞的抗原决定簇例如与结肠癌有关的决定簇(抗原决定簇、构建物)具有专一性的。还可以想到该抗体对于那些能对自身免疫应答的细胞、病毒感染细胞、细菌、寄生虫、真菌或者其他不需要细胞的抗原决定簇可能具有专一性。根据共轭物的效力，该抗体可以与抗原发生作用，该抗原在结合之后将使抗体内在化，尽管已确信这种抗体特异性不是优选的。

本发明所研究的单克隆抗体是对抗GA-733族(参见例如EP-A-376,746及其中所引用的文献以及Larsson等人，Int.J.Canc.42(1988)877-82)C242(Larsson等人，Int.J.canc.42(1988)877-82，和Thy-1.2(mab C，Opitz等人，Immunobiol160(1982)438-)抗原的C215抗体。可以想到对其他靶细胞表面结构具有特异性的单克隆将是有用的。对抗所选择靶细胞的抗原决定簇的单克隆的制备是本领域众所周知。参见例如上述出版物。表达，例如对抗C242抗原决定簇或C215抗原决定簇的单克隆抗体，包括与交叉反应表抗原决定簇进行反应的抗体。

迄今为止所试验的三种单克隆中，C215-共轭物可能是最不重要的，因为它们太频繁地与在正常细胞上表达的肿瘤抗原的抗原决定簇反应。根据特异性数据表明C242-共轭物较好，尽管我们的结果表明它们可能需要较高的剂量。抗Thy-1.2的MabC对于靶击人癌细胞可能价值不高，因为Thy-1.2抗原是对非人的哺乳动物肿瘤细胞具有特异性的。

产生C242单克隆抗体的杂交瘤细胞系已经于1990年1月26日保藏于欧洲动物细胞培养物保藏委员会(Porton Down，Sal-isbury，wilts，U.K.)，保藏号为ECACC 90012601。超级抗原与抗体连结的结构

在本发明优选的共轭物中，超级抗原通过一个共价键(-B-)与抗原共价偶合。如果当该共轭物施用于被杀死的细胞、例如施用于动物时不分解是重要的，那么这种键合应该在以达到效果的足够长的时间内基本上是代谢稳定的，进一步说，进行这种键合时不带来自身免疫反应升高是有利的。在此共轭物保持高效的靶细胞结合特异性(抗肿瘤、抗病毒等)和高效活化细胞毒素T细胞能力的意义上，该键合一般应该是惰性的。

在科学文献和专利文献中，已经在免疫共轭物的键合结构中建议了几个功能基团，因此在我们的新共轭物中的键-B-可包括选自下列的结构：

(i)酰胺和酰肼(酰胺＝-CONR₁-或-NR₁CO-，其中每个游离价与饱和碳原子结合，R₁可以是氢或例如低级烷基(C_1-6)的烷基取代基或天然存在的α-氨基酸的α-N-取代基，优选的是亲水氨基酸；酰肼＝-CONHNH-或-NHNHOC-，其中每个游离价与饱和碳原子结合)；

(ii)硫醚和二硫化物(-Sr-，其中每个游离价分别与饱和碳原子直接结合，S是硫原子，r是1或2的整数)；

(iii)直链、支链或环状烃链，它们是饱和的并且可以用一个或多个羟基或氨基取代；

(iv)醚(-O-，其中每个游离价直接与饱和碳原子结合)；

(v)伯胺或二取代肼(-NH-或-NH-NH-，其中每个游离价分别与饱和碳原子直接结合)。

桥的长度应该在本技术领域中常规的范围内，即少于180个原子例如＜100个原子，但是多于3-6个原子，最好多于16个原子。

优选的键合是亲水的，并且不应该含有任何芳环。可以形成键合-B-部分的优选的亲水结构是(i)天然存在的亲水α-氨基酸的多肽链(例如天冬氨酸及其酰胺、谷氨酸及其酰胺、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、以及或许有组氨酸)，(ii)，氧杂亚烷基链例如(-O(CH₂)_n)_n’-，其中n是2-5的整数，优选2-3，n’可以是1-20的整数；和(iii)-S-(硫醚)、-O-(醚)以及未取代的酰胺(-CONH-)，所有这些基团都连接在短的最好含有1或2个碳原子的未取代的烃链(C_1-4)上。

可以用(F-(pro_n)_mF型的亲水结构表示亲水氨基酸，其中F代表氨基酸序列，优选4-8个残基，其中每个氨基酸独立地选自丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸，m是1-4的整数，n是4-8的整数(cetus Corp.，Wo-A-85/03508)。

键-B-可以专一定位或随机连接在抗体或共轭物的超级抗原部分上。可能的位置是氨基末端、羧基末端和赖氨酸残基(ω氨基基团)。如果抗体或超抗原携载有硫羟基基团或二硫基基团(分别为胱氨酸或半胱氨酸)，这些基团可用于共价偶合，除非它们对该共轭物活性部分的活性不是必需的。当存在碳水化合物结构时，可以将其氧化成为醛基，然后用于连接共轭物的其他部分(cf.Cetns Corp.，EP-A-240，200)。

本发明共轭物不应含有任何显著量的酯键和不稳定的酰胺键，特别是不能分别形成苏氨酸和组氨酸残基。如果在合成过程中形成了这种键，可以使用羟胺将其除去(Endo等人，CancerRes.48(1988)3330-3335)。

每抗体活性部位存在的超级抗原部分的数目通常为1-5，优选1或2。

一种优选的模型是，该共轭物每个抗体中的超级抗原，和/或超级抗原与抗体部分中所用结合位点，和/或键合-B-等应该是实际均匀的。换句话说，共轭物中所有独立的共轭分子的这些变量应该是相同的。

这种物质应该基本上不含有未共轭的抗体或未共轭的超抗原。

超级抗原与抗体最正确的比率，即最好的共轭物的键结构是取决于所选择的单克隆(包括种、亚种、产生的克隆、特异性)以及选择的超级抗原。

用本说明书给出的实验模型可以筛选最佳参数和其他超级抗原与其他抗体。

根据本发明到申请日为止最广泛研究的实施例，链-B-

含有如下结构：

-SrRCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOY-(I)

式I中的游离价分别与活性部分连接。这种连接可以直接发生，或者通过进一步二价惰性结构发生，该二价惰性结构包括在桥-B-中。

n是大于0的整数，例如1-20，优选2或大于2，在很多情况下小于10。m是1或2。

S是硫原子，它直接连接到饱和碳原子的各个价(-Sr-＝硫醚或二硫键)。r是1或2的整数。

Y是-NH-、-NHNH-或-NHN＝CH-，其左端与式I中右端所示的CO基结合，其右端与饱和碳原子或羰基(只有当Y＝-NHNH-时)结合。

R优选的是亚烷基(有1-4个碳原子，通常有1或2个碳原子)，它可以被一个或多个(1-3个，优选的是＜2)羟基(OH)取代。

抗体一超级抗原共轭物的制备

本发明的抗体共轭物可能通过从产生该共轭物的细胞培养基中或者从其他合成它们的介质中富集并纯化它们而获得。

通过本领域已知的共轭物合成技术，即遗传工程(重组技术)或借助于合适的抗体与超级抗原在合适的官能团处进行传统的偶合反应，可以合成我们的新的共轭物。蛋白质中存在的和通常有用的官能团是：

(i)碳水化合物结构。该结构可以被氧化成为醛基，醛基然后与含有H₂NNH-基团的化合物反应，形成-C＝NH-NH-基团。

(ii)硫羟基(HS-)。该硫羟基可以与含有硫羟反应基的化合物反应，形成硫醚基或二硫基。蛋白质的游离硫羟基存在于胱氨酸残基中，并且可以通过硫解或裂解天然半胱氨酸残基中的二硫键将其引入蛋白中。

(iii)氨基酸残基中的游离氨基(H₂N-)。氨基团可以与含有亲电基团例如活化的羧基的化合物反应，形成酰胺基。游离氨基优选的是赖氨酸残基的氨基末端或ω-氨基。

(iv)氨基酸残基中的游离羧基。羧基可以转化成反应性(活化的)羧基，然后与含有氨基的化合物反应，形成酰胺基。但是必需采取预防措施，将主要与羧基一同存在于同一蛋白中的氨基形成酰胺减至最小。游离羧基优选的是二元α-氨基酸的羧基末端或羧基。

携载有H₂NNH-基、硫羟反应性基团、活化的羧基或氨基的化合物可以是双官能偶合剂或抗体或超级抗原。除H₂NNH-基团之外，这些基团直接与饱和碳原子结合，而H₂NNH-也可以与羰基碳结合。通过一般的衍生作用可以将这些基团引入抗体或超级抗原中。

重组技术为制备共轭物提供了有效的方法，在该方法中，各部份被特异地从一个部份的末端羧基连结到另一部份的末端氨基。与所应用的该技术相一致的键结构可被插入。

选择所用试剂，使它们能提供如上定义的键-B-。普通的双官能试剂具有通式Z-B’-Z’，其中Z和Z’是彼此组成相同的官能基，它们能在存在于蛋白质上的官能基处共价偶合。如上所述。B’是惰性桥，它可以含有与上面给出的键-B-相同的结构。特别是Z和Z’可以相同或不同，它们选自硫羟基、硫羟基反应性基团、活化的羧基、-CONHNH₂等。这些基团的定义见下面的标题“新的试剂”下。

在下面的实验部分中所用的共轭物我们采用的方法包括以下步骤：

(i)将抗体或超级抗原与含有硫羟反应性基团和氨基反应性基团的有机试剂反应，形成携载有硫羟基反应性基团的抗体或超抗原，并且

(ii)将超抗原与抗体的剩余部分与含有硫羟基或被护硫羟基和氨基反应性基团的有机试剂反应，形成载有硫羟基或被护硫羟基的超级抗原或抗体，于是

(iii)步骤(i)和(ii)所得产品分别相互反应，形成共轭物，该共轭物中超级抗原通过二硫键或硫醚与抗体连接。

正如蛋白质化学所应用的，每种基团的偶合条件其本身是已知的。偶合可以分段进行，或者通过产生中间官能团一步完成，该中间官能团可以通过惰性间隔臂与起始原料连接。一般来说，发生合成和纯化/回收该共轭物的条件总是对所含的蛋白质是非变性的。这通常是分别指含水基质，pH为3-10，温度为0°-50℃。精确的值依赖于反应基团和回收的共轭物。详见下面的标题“新的试剂”。新的试剂(本发明所发展的)。

为了化学合成具有键-B-的共轭物，我们发展了一种新的异双官能试剂，该试剂具有通式II：

Z₁RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mZ₁’ (II)m和n与上述式(I)的含义相同。Z₁是HS-反应性亲电子基团、硫羟基(-SH)或被护硫羟基(例如AcS-)，并规定硫羟基和羟基不能与R中的同一个碳原子结合。HS-反应性亲电基团的例子是：

(i)与饱和碳原子结合的卤素，优选α-卤代-烷羰基的形式(例如Z₁CH₂CO-)；

(ii)活化的硫羟基，优选的是称为反应性二硫键的基团(-SSR₁)，该二硫键与饱和碳原子结合；

(iii)3，5-二氧-1-氮杂-环戊-3-烯-1-基。

反应性二硫键的定义可参见例如EP-A-128885，该专利通过参考结合在本文中。

Z₁’是一个活化的羧基，即亲电基团。例如酰卤(-COCl、-COBr和-COI)、混合酸酐(-COOOCR₁)、反应性酯例如N-琥珀酰亚胺基氧羰基、-C(＝NH)-OR₂、4-硝基苯基羧酸酯(-CO-OC₆H₄NO₂)等。R₁和R₂可以是低级烷基(C₁-C₆)，R₂也可以是苄基。

我们的新的试剂优点之一是它们能够产生结构(OCH₂CH₂)_n中n为整数的均一的共轭物，即对于所给出的每个单独的共轭物分子，n是相同的。

与Z₁’和Z₁反应的官能基团可存在于天然抗体活性分子或天然超级抗原中或者可以被引导至其中，Z₁’和Z₁末端然后可以与合适的抗体或超级抗原以本身已知的方法与这些类型基团进行选择性反应。

已知技术包括从我们的新的试剂开始的链延长或被共轭的化合物的链延长作用。

我们的新的试剂所用的链延长作用可以例如产生其中-B-为如下所述的共轭物(1)-COR’-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOY-；CO与NH结合，

(2)-COR’-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCONHNH-R″NHN＝-₁N＝通常与从抗体或超级抗原中氧化的碳水化合物结构(当它是糖蛋白时)产生的sp²-杂化碳原子结合

(3)-CO(CH₂)_mO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂NHCOR’-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOY；CO-与NH结合，

(4)-CO(CH₂)_mO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂NHCOR’-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCONHNH-R″NHN＝；N＝与(2)中所述碳原子结合，

R、R’和R″与式(I)中R同样方式选择的亚烷基。r的含义同上所述。

可以从具有式III的化合物开始制备该试剂(式II)：

NH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOOH (III)m等于整数1或2。n等于整数1-20，例如2-20或3-9。

以前已经描述了某些具有式(III)的化合物(其中m＝1和2，n＝1-10)的合成(Jullien等人，Tetrahedron Letters 29(1988)3803-06；Houghton与Southby，Synth.Commun.19(18)(1989)3199-3209；和EP-A-410，280(1991年1月20日公开)以及Slama和Rando，Carbohydrate Research 88(1981)213-221和Bio-chemistry 19(1980)4595-4600)。

通过式III化合物与本身已知的式Z-B’-Z’其中Z＝Z₁，B’＝R″，R和R′是如上所定义的并且，Z′＝如上定义的活化的羧基的双官能试剂反应可以合成式II的新的试剂。反应后，-COOH功能团转化成为活化的羧基，例如Z₁’＝活化的酯如N-琥珀酰亚胺氧羰基、4-硝基苯基氧羰基、2，4-二硝基苯基氧羰基等。

式(III)的新化合物及其新的衍生物含有具有以下通式的聚醚：

XCH₂CH₂(OCH₂CH₂-)_nOCH₂Y (IV)n是整数2-20，优选3-20或3-9。X是包括其质子化形式(⁺H₃N-)的H₂N-或者可转化成为H₂N-(优选通过水解或还原反应)的取代的H₂N-。例如未取代的氨基(H₂N-)；硝基；酰氨基(碳酰氨基)，例如含有酰氨基的低级酰氨基(甲酰氨基、乙酰氨基……己酰氨基)，它们在酰基部分的α碳原子上具有吸电子取代基，优选的是CF₃CONH-、CH₃COCH₂CONH-等；可以是环取代的苯二酰亚氨基，氨基甲酰基(carbamato)(特别是R₁’OCONH-和(R₁’OCO)(R₂’OCO)N-，例如N-(叔丁氧羰基)氨基(Boc)、N-(苄氧羰基)氨基)和二(N-(苄氧羰基))氨基(分别为Z和diZ)，它们可以是环取代的，烷氨基，其中与氮原子结合的碳原子是芳香系统中的α碳，例如N-苄氨基和二苄氨基、N-三苯甲基氨基(三苯基甲氨基)等，包括其中甲基碳原子(包括苄基碳原子)被硅原子(si)取代的类似基团，例如N，N-二(叔丁基甲硅烷基)氨基；以及4-氧-1，3，5-三嗪-1-基，包括在其3-和/5-位被低级烷基取代的基团。

上述的和以后的R₁’和R₂’代表低级烷基，特别是仲和叔烷基，以及被可能是环取代的1-3个苯基取代的甲基。低级烷基和低级酰基有1-6个碳原子。

Y是羧基(-COOH，包括-COO^-)转化成羧基的基团，最好是被水解或氧化的基团。最重要的是酯基，其中羰基碳原子或者原酸酯的相应原子与式(I)右端的亚甲基结合。例如烷基酯基(-COOR₁’)；原酸酯基(-C(OR₃′)₃)以及如上定义的反应性酯基。R₃’的含义与前述R₁’的定义相同。

其他基团Y是-CHO、-CN、-CONH₂、-CONR₁’R₂’，其中R₁’和R₂’与前述含义相同。

通过本身已知的化合方法，从已知的起始原料可以合成式IV化合物。合适的合成途径是：A、形成该链。B、转化末端官能团。C、将对称的聚醚转化成为非对称的醚。D、将双对称的链裂解成为二个相同的片段。

具有重复单位-OCH₂CH₂-的方便的起始原料可以购买到。例如含有2-6个重复单位的寡乙二醇。其他具有相同末端基团的合适的化合物是相应的二羧酸和二胺。

具有不同末端基团的方便的起始原料是ω-羟基一元羧酸，其中末端基团被纯的聚环氧乙烷桥分隔开。这种具有多达5个重复单位的化合物在现有技术中已有描述(Nakatsuji，Kawamura和Okahara，Synthesis(1981)第42页)。药物组合物及其制备

本发明的药物组合物含有本领域已知的配方，只是现在含有我们的新共轭物。因此该组合物的形式可以是冻干颗粒材料、灭菌或无菌制备的溶液、片剂和安瓿剂等。可以存在赋形剂，例如水(最好缓冲至生理pH值例如PBS)或可以存在其他的情性固体或液体材料。一般说来，通过该共轭物与一种或多种水不溶的或水溶的、含水的或不含水的赋形剂混合、溶解于该赋形剂中、与该赋形剂结合或者化合，可以制备该组合物，如果需要，与合适的添加剂和佐剂混合。该赋形剂与条件绝对不能对该共轭物的活性产生不利影响。因此所述赋形剂中含有水。用药及使用方法。

通常该共轭物以预先调配好的剂量出售和服用，根据目前的结果，可以确信，每一剂量含有有效量的共轭物的剂量范围是10μg-50mg。准确的剂量随着不同的病例以及根据患者的体重和年龄、服用途径、疾病的类型、抗体、超级抗原、键(-B-)等而变化。

用药途径如本领域通常已知的，即将靶细胞溶解有效量的或者治疗有效量的本发明共轭物与靶细胞接触。上面特别指明的途径主要是指非肠道给药例如给哺乳动物(例如人)注射或者输注(皮下、静脉、动脉内、肌内)。该共轭物可以给被治疗的个体局部或系统用药。

“靶细胞溶解有效量”是指能有效地活化CTL和对它产生作用以破坏靶细胞的量。

权利要求书定义了本发明，这也是本发明说明书的一部分。本发明将通过一些实施例来说明，但是这些实施例不是对我们所发现的一般概念的限制。实验部分表示在第1部分共轭物的化学合成以及第II部分中实施例4所制备的共轭物活化T细胞对于溶融靶细胞的效果。

实验部分第1部分ω-氨基-PEG-羧酸的制备。8-羟基-3，6-二恶-辛酸异丙酯(1)在氮气氛下将小片的钠(23g，1.0mole)分批加入二乙二醇(500ml)中。当钠反应完全后，将混合物冷却至室温，并在搅拌下加入溴乙酸(76g，0.5mole)。在100℃反应18小时后，于大约4mmHg条件下蒸出过量的二乙二醇。然后加入异丙醇(400ml)以及分批加入乙酰氯(51g，0.65mole)。在65℃搅拌18小时后，将混合物冷却至室温，并用乙酸钠(3.5g，0.15mole)中和。将混合物过滤，并将滤液蒸发至接近干燥，然后将其溶于水(200ml)中。用1，1，1-三氯乙烷(3×50ml)萃取水相。合并的有机相用水(20ml)洗用二氯甲烷(50ml)从合并的水相中萃取产物，然后蒸发得到油(55g)。11-羟基-3，6，9-三恶-十一烷酸异丙酯(2)。在氮气氛下，将小片的钠(23g，1.0mol)分批加至三乙二醇(700ml)中。当钠反应完全时，将混合物冷却至室温，并在搅拌下加入溴乙酸(76g，0.5mole)。在100℃反应18小时后，在4mmHg条件下蒸去过量的三乙二醇。然后加入异丙醇(400ml)，并且分批加入乙酰氯(51g，0.65mole)。在65℃搅拌18小时后，将混合物冷却至室温，并用乙酸钠(3.5g，0.15mole)中和。将混合物过滤并将滤液蒸发至接近干燥，然后将其溶于水(200ml)中。用1，1，1-三氯乙烷(3×50ml)萃取水相。用水(20ml)洗涤合并的有机相。用二氯甲烷(50ml)从合并的水相中萃取产物，然后蒸发得到油。′H-n.m.r.(CDCl₃)；δ1.26(d，6H)；3.07(s，2H)；3.6-3.8(m，12H)；4.11(s，2H)；5.09(m，1H)8-(N-苯二酰亚氨基)-3.6，-二恶-辛醇(3)。将8-氯-3，6-二恶-辛醇(365g，2.2mole，从三乙二醇和SOCl₂制备)溶于二甲基甲酰胺(400ml)中，并在搅拌下加入苯邻二甲酰亚按(370g，2.0mole)。在110℃搅拌18小时后，减压蒸去二甲基甲酰胺。在40-50℃下将残余物悬浮于甲苯(1.5升)中，并滤出氯化钾。冷却(-10℃)使产物结晶。通过浓缩母液并重复结晶方法，可以从母液中得到第二馏分。

¹H-n.m.r.(CDCl₃)；δ2.90(s，1H)；3.51-3.58(m，2H)；3.60-3.68(m，6H)；3.73-3.78(t，2H)；3.89-3.94(t，2H)；7.70-7.89(m，4H)。17-(N-苯二酰亚氨基)-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸异丙酯(4)。在约-5℃和搅拌下，将吡啶(2.8ml，35mmole)在二氯甲烷(30ml)中的溶液滴加至8-(N-苯二酰亚氨基)-3，6-二恶-辛醇(3)(8.5g，36mmole)和三氟甲烷磺酸酐(10.2g，36mmole)在二氯甲烷中的溶液中。约30分钟后，用0.5M盐酸和水洗涤有机相。经干燥(Na₂SO₄)并过滤后，加入8-羟基-3，6-二恶-辛酸异丙酯(1)(12g，48mmole)和Na₂PO₄(6.5g，46m-mole)，在室温将此混合物剧烈搅拌20小时。将反应混合物过滤并蒸发滤液。将残留物在1，1，1-三氯乙烷和水之间分配。蒸发有机相，得到油(13g)。

¹H-n.m.r.(CDCl₃)；δ1.26(d，6H)；3.58-3.76(m，18H)；3.90(t，2H)；4.11(s，2H)；5.09(m，1H)；7.70-7.89(m，4H)。17-(N-苯二酰亚氨基)-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸(5)。将17-(N-苯二酰亚氨基)-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸异丙酯(4)(13g)溶于四氢呋喃(50ml)和浓盐酸(50ml)中。在室温反应16小时后，用水(200ml)稀释该溶液，并减压除去四氢呋喃。用甲苯(1×)洗涤水相，并用二氯甲烷(2×)萃取。干燥(Na₂SO₄)并蒸发有机相，得到油状产物(8.5g)。

¹H-n.m.r.(CDCl₃)；δ3.57-3.76(m，18H)；3.91(t，2H)；4.11(s，2H)；4.8(br，2H)；7.65-7.90(m，4H)17-氨基-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸异丙酯(6)将17-(N-苯二酰亚氨基)-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸(5)(8.5g)溶于150ml乙醇和3ml水合肼中。将溶液在室温搅拌16小时，加入HCl(100ml，3M)，然后将该溶液回流3小时。冷却至室温并过滤后，调节pH(pH9，NaOH)将滤液蒸发至近干。加入水并再次蒸发至近快干，调节该溶液的pH(pH4，HCl)，然后蒸发至于。在室温用异丙醇(100ml)和乙酰氯(2ml)处理该产物过夜并蒸发。在水中收集残余物，并在碱性pH(7-11)下用二氯甲烷萃取。蒸发得到产物(3.3g)。¹H-n.m.r(CH₃OD)：δ1.26(d，6H)；3.17(t，2H)；3.65-3.80(m，1gH)；4.16(s，2H)；5.07(m，1H)

合成的氨基-PEG-羧酸的分子式。

H-(OCH₂CH₂)_nCH₂CO-OCH(CH₃)₂

化合物1：n＝1

化合物2：n＝2

phtN-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₂OH

化合物3，phtN-＝N-苯二酰亚氨基

phtN-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₄CH₂CO-OCH(CH₃)₂

化合物4，phtN-＝N-苯二酰亚氨基

phtN-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₄CH₂CO-OH

化合物5

H₂N-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)₄CH₂CO-OH

化合物6双官能试剂和偶合产物的制备结构式在单独一页中列出。实施例1.17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸的N

-羟基琥珀酰亚胺酯的制备A.17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸(A)的制备将17-氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸异丙酯(参见实验部分的第I部分)(1.1g，3.2mmole)溶于3ml1M氢氧化钠溶液中，并在室温放置30分钟。加入1.5ml6M盐酸，将该混合物蒸发至干。将残余物溶于二氯甲烷中并过滤，蒸发掉溶剂后得到545mg17-氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸。将460mg(1.39mmoles)该化合物溶于10mlpH8.4的硼酸缓冲液中。用氮气将该溶液脱气。用1分钟时间滴加432mg(1.52mmoles)2-碘乙酸-N-琥珀酰亚胺酯在5ml二恶烷中的溶液，通过加入5MNaOH保持pH为8.4。将该反应溶液搅拌15分钟，同时通入氮气。根据薄层色谱(洗脱剂：CH₂Cl₂-MeOH 60∶35)，反应在很多分钟内完全。15分钟后，将该反应溶液的pH调至3，将该溶液冷冻并冻干。采用含有0.1％三氟乙酸的0-13％梯度乙腈，在反相柱PEP-RPC HR 30/26(Pharmacia Biosystems AB)上使反应混合物分层，然后在13％乙腈、0.1％TFA中isocratic分离。将所需峰的组分合并冻干，得到351mg17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶-十七烷酸(A)。产率：76％。借助其NMR谱，确立该产物的结构。以δ值表示的¹H NMR谱(D₂O)：

-OCH₂CHO-3.71-3.76，-NHCH₂CH₂O-3.65t，-HNCH₂CH₂O-3.41B.17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五(恶十七烷酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(B)的制备在反应瓶中称取羟基琥珀酰亚胺(4.5mg，39μmole)。将17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸(A)(18.3mg，39μmole)溶于0.55ml干燥的二恶烷中并加到反应瓶中。用氮气使反应瓶脱气，然后向反应瓶中滴加8.0mg(39μmole)二环己基碳二亚胺在0.15ml干燥二恶烷中的溶液。向反应瓶中充入氮气、密闭并置于黑暗中。将反应溶液搅拌3.5小时。过滤除去所形成的沉淀。通过NMR分析测定滤液中产物B形成的百分数，为89％。实施例2.(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨

基)-免疫球蛋白(C)的制备A.单克隆抗体Mab C215将IgG2a类免疫球蛋白的单克隆抗体(MabC215)(34mg，0.218μmole)溶于17.7mlpH8.1含有0.9％氯化钠的0.1M硼酸缓冲液中，加入反应瓶中。将146μl含有3.6mg(6.4μmole)17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(B)的二恶烷溶液注射进该缓冲液中，在室温搅拌25分钟使反应完全。用folie覆盖反应瓶使其避光。用pH7.5含有0.9％氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲液作为洗脱剂，在Sepbadex G 25k 26/40柱上分层。除去过量的试剂B。将含有所需产物C的组分合并。在Amicon室中通过YM30滤器将该溶液(22ml)浓缩至8ml。用氨基酸分析法测定浓缩物及取代程度，结果分别为4.7mg/ml和18个间隔基/每个Mab C215。B.单克隆抗体Mab C242按照实施例2.A所述方法，将IgG1类免疫球蛋白的单克隆抗体(Mab C242)分别与15倍、20倍和22倍摩尔过量的17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五噁十七烷酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(B)反应，得到九、十二和十四(17-碘乙酰氨基)-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)-Mab C242(C)。C.单克隆抗体Mab C按照实施例2A所述方法，将IgG2a类免疫球蛋白的单克隆抗体(Mab C)分别与14和18倍摩尔过量的17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五噁十七烷酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到四和七(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)-MabC。(C)实施例3.2-巯基丙酰氨基-Eu³⁺-标记的葡萄球菌肠毒素A

(SEA)的制备A.Eu³⁺标记的SEA(D)的制备将SEA(从Toxin Technology Inc.得到的冻干产物)(2mg，72nmole)溶于722μl milli-Q水中，并加至15ml聚丙烯管中。加入100μlpH8.6的0.1M硼酸盐缓冲液，然后加入在178μl milli-Q中的2160nmoles Eu³⁺-螯合剂(Pharmacia WallacOy)。在室温过夜使反应完全。用0.1M pH8.0的磷酸盐缓冲液作为洗脱剂，在Sephadex G25 PD10柱(Pharmacia Biosystems AB)上，通过分层将反应溶液除去过量的试剂。将含有所需产物D的组分合并。在Amicon室中通过YM5滤器将该溶液(3ml)浓缩至0.8ml体积。用氨基酸分析法测定其浓度为1.7mg/ml。通过与EuCl₃标准溶液比较，测定取代程度为0.8Eu³⁺/每个SEA。B1.3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基Eu³⁺标记的SEA(E)和3-

巯基丙酰氨基Eu³⁺标记的SEA(F)的制备将在0.75ml pH8.0的0.1M磷酸缓冲液中的Eu³⁺-SEA(1。24mg，44.8nmoles)加至15ml聚丙烯管中。将35μl(180nmole)1.6mg 3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的N-琥珀酰亚胺酯在1ml乙醇中的溶液加到该试管中，将反应溶液在室温搅拌30分钟。在被还原成产物F之前，不分离所得产物E。向上述反应溶液中加入20μl 0.2M Eu³⁺-柠檬酸溶液，并加入50μl 2M乙酸将pH调至5。然后加入3.1mg二硫苏糖醇(Merck)在0.1ml0.9％氯化钠中的溶液，并在室温将该反应溶液搅拌20分钟。然后加入50μl0.9％氯化钠溶液将总体积调至1ml。将反应溶液(1ml)装入Sephadex G 25 NAP-10柱(Pharmacia Biosystems AB)上，通过加入1.5ml含0.9％氯化钠的pH7.5的0.1M磷酸盐缓冲液将所需产物F洗脱。将洗脱的产物F收集在15ml聚丙烯管中，并立即用于合成产物G，以避免二硫化物再次氧化。B2.2-巯基丙酰氨基葡萄球菌肠毒素A(SEA)(F2)的制备按照实施例3B1所述方法，将天然SEA(从Toxin Technology Inc获得的冻干产物)或重组制备的SEA(rSEA)与2倍摩尔过量的3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的N-琥珀酰亚胺酯反应。按照Carlsson等人所述(Biochem.J.173(1978)723-737)，通过UV-分析法测定的取代程度为1.9个巯基丙酰基/每个SEA。实施例4.SEA-单克隆抗体共轭物(G1 och G2)的制备A.Eu³⁺与Mab C215之间的共轭物(G1)向实施例3B所述的4-巯基丙酰氨基Eu³⁺标记的SEA(F)溶液中加入1.2ml十八(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C215(C)(4mg)在含有0.9％氯化钠的pH7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的溶液中。在室温放置过夜使反应完全。然后加入20μl巯基乙醇在1ml水中的5μl(1.2μmole)溶液，使未反应的碘烷基团封闭。将反应溶液在室温放置4小时后过滤。然后用含有0.9％氯化钠的pH7.5的0.002M磷酸盐缓冲液作为洗脱剂，将滤液在Superose 12HR16/50柱(Pharmacia BiosystemsAB)上分层。合并含有所需产物G的组分并进行分析。通过氨基酸分析法测定的蛋白质含量为0.22mg/ml。通过Eu³⁺测定法测定的取代程度是一个SEA/每个IgG。还对该产物进行免疫刺激性质和抗体结合能力的研究。通过提高化合物(F)相对于化合物(C)的量，可以获得更高的取代程度。B.rSEA与MabC215之间的共轭物(G2)按照实施例4A所述方法，将十八(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C215(C)与1.8倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。在Phast-Gel^TM梯度4-15上通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGI)对该共轭物的组成进行分析，并且用Phast IMAGE(Pharmacia Biosys-tems AB)对结合体进行扫描。所得共轭物由6％含三个SEA的、15％含2个SEA的、28％含一个SEA的Mab C215和51％未取代的Mab C215组成。在另外一个实验中，使用2.7倍摩尔过量的F2，得到的共轭物的组份为15％含三个SEA、25％含二个SEA、34％含一个SEA的Mab C215和26％未取代的Mab C215。C.rSEA和Mab C242之间的共轭物C1.按照实施例4A所述方法，将十四(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C242(C)与3.2倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。按照实施例4B所述对该共轭物的组成进行分析，发现其组成为4％含四个SEA、12％含三个SEA、28％含二个SEA、36％含一个SEA的Mab C242和20％未取代的Mab C242。进行同样的反应，只是在柱分层以除去MabC242与间隔基之间和SEA与巯基丙酰基之间不稳定的结合体之前，用0.2M羟胺处理反应产物4小时。所形成的共轭物具有以下组成：1％含四个SEA、12％含三个SEA、27％含二个SEA、36％含1个SEA的Mab C242以及24％未取代的Mab。C2.按照实施例4A所述方法，将十二(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C242(C)与3倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。所得共轭物的组成是6％含二个SEA、26％含二个SEA、36％含一个SEA的Mab C242以及31％未取代的MabC2242。C3.按照实施例4A所述方法，对九(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C242(C)与3倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。所得共轭物的组成是13％含二个SEA、39％含一个SEA的Mab C242以及46％未取代的MabC242。D.rSEA与MabC之间的共轭物D1.按照实施例4A所述方法，将七(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五噁十七烷酰氨基)Mab C与5.4倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。按照实施例4B所述方法对共轭物的组成进行分析，发现其组成为：15％含四个SEA、24％含三个SEA、29％含二个SEA、19％含一个SEA的Mab C、3％未取代的Mab C以及10％的二聚形式。进行同样的反应，用0.2M羟胺除去Mab C与间隔基之间和SEA与巯基丙酰基之间不稳定的结合体。所形成的共轭物具有以下组成：11％含三个SEA、24％含二个SEA、30％含一个SEA的Mab C、18％未取代的Mab C以及17％二聚形式。D2.按照实施例4B所述方法，将四(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C与5.7倍摩尔过量的2-巯基丙酰氨基-rSEA(F2)反应。该共轭物具有以下组成：8％含四个SEA、18％含三个SEA、30％含二个SEA、26％含一个SEA的Mab C、5％未取代的Mab C以及12％二聚形式。实施例5.[17-(3-巯基丙酰氨基)-3，6，9，12，15-五恶十七

烷酰氨基]-rSEA(I)的制备A.17-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)-rSEA(H)的制备将17-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]-3，6，9，12，15-五噁十七烷酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(K)(0.53mg，896nmoles)在43μl二恶烷中的溶液注射至3.67mg(128nmoles)rSEA在1ml含0.9％氯化钠的pH7.5的磷酸盐缓冲液中的溶液中。在室温放置30分钟使反应完全。取100μl进行取代程度分析。将剩余部分冷冻贮存，直至将其还原成产物(I)。通过在Sephadex G50 NICK柱(Pharmacia Biosystems AB)上将100μl反应溶液脱盐，测定取代程度，并且按照Carlsson等人所述(Biochem.J.173(1978)723-737)用紫外光谱分析洗脱液。2.7个间隔基与rSEA偶合。B.[17-(3-巯基丙酰氨基)-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基]-rSEA(I)的制备将含有产物H的反应溶液(0.9ml)的pH用2HCl调至pH4.4，并加入溶于75μl0.9％氯化钠中的2.9mg二硫苏糖醇。用30分钟使还原反应完全。将反应溶液加至Sephadex G25 NAP10柱(Phar-macia Biosystems AB)上，用1.5ml含0.9％Nacl的pH 7.5的0.1M磷酸盐缓冲液洗脱，并立即用于合成实施例11中的产物J。实施例6.含有双间隔基的SEA-单克隆抗体共轭物的制备在氮气氛下和黑暗条件下，将十二(17-碘乙酰氨基-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基)Mab C242(C)(4.2mg，27nmoles，在1.0ml含0.9％Nacl的pH7.5的0.1M磷酸盐缓冲液中)与[17-(3-巯基丙酰氨基)-3，6，9，12，15-五恶十七烷酰氨基]-rSEA(I)(1.17mg，42nmoles)，在1ml上述缓冲液中)反应43小时。然后加入1.14μmole巯基乙醇。再反应1小时后，将反应溶液在Superdex 200HR 16/65柱上进行分层。用含有0.9％Nacl的pH7.5的2mM磷酸盐缓冲液洗脱产物。合并含有所需产物J的组分，并按照实施例4B所述进行分析。该共轭物由9％含二个SEA、25％含一个SEA的MabC242和66％未取代的Mab C242组成。

实验部分II超级抗原一抗体共轭物对细胞的作用

用于下述实验的细菌毒素是从Toxin Technologies(WI；USA)获得的葡萄球菌肠毒素A(SEA)或者从大肠杆菌(E.coli)中产生的重组蛋白。

抗体是C215、C242和Thy-1.2mAbs。C215是一种提高的抗人克隆肿瘤细胞系的IgG2a mAb，它与几种人克隆细胞系上的37kD蛋白抗原反应。这些mAbs的参考文献已在上文中给出。按照前面部分所述制备这些共轭物。

在优先权日之前，只对Eu³⁺标记的SEA-C215mAb共轭物进行了研究。在优先权的一年中，已经检验了未标记的SEA-215、SEA-242和SEA-Thy-1.2mAb共轭物的结果。现在引入的结果是指未标记的共轭物。

为了测定由SEA-C215mAb共轭物和未共轭的SEA与C215mAb介导的抗缺乏II类MHC或H类MHC表达很低而不可检测量的克隆肿瘤细胞的细胞毒性，我们使用了各种人SEA扩大的T细胞系作为效应器细胞，用一组克隆肿瘤细胞和II⁺类MHC Raji细胞作为靶细胞。根据用抗HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ的mAbs染色以及FACS分析法测定，克隆肿瘤细胞系Colo205.SW620和WiDr都缺乏II类MHC的表达。在重组体IL-2(20单位/ml)存在下，通过用丝裂霉素C弱重复刺激，处理预先用SEA包衣的II⁺类MHC BSM淋巴细胞从外周血液中建立了SEA扩增的T细胞系。这些T细胞系对用SEA包衣的Raji或BSM细胞具有强细胞毒性，但是对未包衣的细胞或用葡萄球菌肠毒素B(SEB)包衣的细胞不具有细胞毒性。根据通过采用封阻HLA-DR抗体、II^-类MHC Raji突变细胞和HLA-DR转染的L细胞进行的测定(Dohlsten等人，Immunology71(1990)96-100)，SEA引起杀灭作用依赖于SEA与II类MHC在靶细胞上的相互作用。这些T细胞系能够被C215-SEA共轭物活化，从而杀死C215 +II^-类MHC克隆肿瘤细胞。相反未共轭的SEA和C215mAb只能诱导有限量的抗C215⁺II^-类MHC克隆肿瘤细胞的T细胞杀灭作用。葡萄球菌肠毒素抗体共轭物依赖的细胞介导的细胞毒性依赖于C215⁺肿瘤细胞共轭地与SEA-C215mAb的结合。通过以下事实证明了这种结合中的特异性，即未共轭的C215mAb过量，却与抑制克隆肿瘤细胞溶解的C242和W6/32 mAbs不相关。CD₄ ⁺和CD_a ⁺T细胞被证实能杀死SEA-C215处理的C215⁺克隆肿瘤细胞，但不能溶解SEA处理的细胞。根据较早证实的SEA诱导的杀死II⁺类MHC细胞的作用，T细胞与结合在II^-类MHC肿瘤细胞上的SEA-C215mAb共轭物的相互作用似乎包括了与特异性VβTCR序列以同样方式的相互作用。这一点通过SEA特异性而不是自体的SEB特异性T细胞系与C215-SEA共轭物的相互作用被证明。C242mAb和Thy-1.2mAb共轭物证实了与C215mAb共轭物具有相似的活性。铬标记以及用SEA培养靶细胞

在37℃、100μl体积中，将0.75×10⁶靶细胞和150μCi⁵¹铬(Amersham Corp.，Arlington Hights，England)培养45分钟。将细胞保留在含有RPMI-1640基质(Gibco，Paisley，GBR)、补充了2.8％(v/v)7.5％NaHCO₃、1％丙酮酸钠、2％200mML-谷氨酰胺、1％1M Hepes、1％10mg/ml庆大霉素和10％胎牛血清(FCS，Gibco，Paisley，GBR)的完全培养基中，培养之后，用不含FCS的完全培养基将细胞洗涤一次，并在37℃培养60分钟，洗涤并再悬浮于含10％FCS的完全培养基中。向U型底96孔微滴板(Costar，Cambridge，USA)的每个孔中加入5×10³靶细胞。细胞毒性分析

以各种效应器/靶细胞比率向各孔中加入效应器细胞。每孔的最终体积是200μl。每个试验做三份。在37℃将此板培养4小时，然后收集释放出的铬。在γ-记数器(Cobra Auto-gamma，Packard)中测定⁵¹Cr的量。通过下式计算细胞毒性百分数：％细胞毒性＝(X-M)/(T-M)*100，其中X是从试验样品中获得的铬释放量，以cpm表示，M是用培养基培养的靶细胞的自发铬释放量，T是用1％十二烷基硫酸钠培养靶细胞所获得的总的铬释放量。结果

SEA-C242、SEA-C215和SEA-抗-Thy-1.2mAb共轭物分别与表达相应mAbs的抗原决定簇的细胞结合，并且与II⁺类MHC细胞结合。相反，未共轭的SEA只与II⁺类MHC细胞结合。未共轭的C215、C242和Thy-1.2mAbs与相应的细胞结合，但不与Raji细胞结合。(表1)

在存在SEA-C215mAb共轭物，但是不存在未共轭SEA和C215mAb时，人T细胞系溶解II^-类MHC SW620、Colo205和WiDr细胞(图1)。在10-100ng/ml SEA-C215mAb共轭物存在下观察到克隆肿瘤细胞溶解。用抗SW620的SEA-215mAb共轭物观察到在各种效应器对靶的比率高水平的溶解(图1)。相反，在所有试验的效应器对靶的比率下，未共轭的SEA或C215mAb都不能介导抗SW620细胞的细胞毒性。这表明溶解II^-类MHC Colo205细胞的能力仅限于共轭物，并且该作用不能被未共轭的SEA和C215mAb诱导。SEA和SEA-C215mAb共轭物介导了II⁺类MHCRaji细胞和干扰素处理的II⁺类MHCColo205细胞的T细胞杀灭作用，而C215mAb却不能。(图1)。

为了证实SEA-C215mAb共轭物介导的溶解包括了该共轭物在靶细胞上与C215mAb分子的共轭特异性结合，我们用过量的未共轭C215mAb和mAbC242进行了封阻研究，它们在克隆肿瘤细胞上与不相干的抗原结合(关于C215mAb结合)。加入mAb C215很强地封阻细胞毒性，相反C242mAb没有影响(图2)。由SEA-C242mAb共轭物介导的相似的溶解被过量未共轭的C24mAb而不是C215mAb特异性封阻。

在CD₄ ⁺和CD₈ ⁺T细胞群中都观察到了SEA-C215mAb共轭物诱导II类MHC克隆肿瘤细胞的T细胞依赖性溶解的能力(表2)。SEA不能活化任何这些T细胞亚系以介导SW620细胞的杀灭作用，但是它能诱导II⁺类MHC Raji细胞的溶解(表2)。

SEA-C215mAb共轭物通过SEA扩增的T细胞系，而不是通过SEB扩增的T细胞系引起SW620和Raji细胞溶解(图3)。当置于Raji细胞中时，通过它们分别对SEA和SEB的选择性应答表明了SEA和SEB系的特异性(图4)。这表明对未共轭SEA来说，SEA-C215mAb共轭物保持了相似的VβTCR特异性。

对图的说明

图1.SEA-C215mAb共轭物导致了抗II^-类MHC克隆肿瘤细胞的CTL。上面的左边一组证明了在不存在(一)或存在SEA-C215mAb共轭物、SEA、C215、C215与SEA的混合物(C215+SEA)条件下(每种添加物的浓度为1μg/ml)、在各种效应器对靶的比率下，抗SW620细胞的SEA应答CTL的作用。另一组证明了抗II^-类C215+MHC克隆肿瘤细胞系SW620、Colo2-05和WiDr、II⁺类MHC C215⁺干扰素处理的Colo205细胞和II⁺类MHC C215-Raji细胞的SEA-C215 mAb共轭物和SEA对靶SEA应答CTLs的能力。效应器对靶的比率为30∶1。加入几种浓度的未共轭C215mAb都不能引起任何抗这些细胞系的CTL。对于检测任何II类MHC表面表达，使用抗HLA-DR、-DP、-DQ的mAb对SW620细胞、Colo205和WiDr细胞进行FACS分析都是失败的，但是在Raji细胞上却检测到丰富的HLA-DR、-DP和-DQ的表达，并且在于扰素处理的Colo205细胞上检测到丰富的HLA-DR和-DP的表达。在用于CTL分析之前，将Colo205细胞用1000单位/ml重组体干扰素-γ处理48小时。

图2.SEA-C215mAb共轭物和SEA-C242mAb共轭物诱导的抗克隆肿瘤细胞的CTL依赖于mAb的抗原选择性。通过分别加入未共轭的C215和C242mAb(30μg/ml)，封阻了SEA-C215mAb和SEA-C242mAb共轭物(3μg/ml)存在下SEA应答的CTL系介导的Colo205细胞的溶解。在加入共轭物之前10分钟，将未共轭的mAb或对照培养基(一)加到靶细胞中。

图3通过SEA而不是SEB应答的CTL介导了SEA-C215mAb共轭物包衣的克隆肿瘤细胞的溶解。在不存在(对照)或存在SEA-C215mAb共轭物，未共轭的C215mAb和SEA的混合物(C215+SEB)和未共轭的C215mAb与SEB的混合物(C215+SEA)(每种添加物浓度为1μg/ml)条件下，在效应器对靶的比率为10∶1条件下，把用自体SEA和SEB选择性T细胞系用于抗SW620和Raji靶细胞。

图4由SEA-C242mAb共轭物和SEA-抗-Thy-1，2mAb共轭物诱导的抗它们的靶细胞(分别是Colo205肿瘤细胞和EL-4肿瘤细胞)的细胞毒性。

表1

SEA-C215mAb共轭物与C215⁺克隆肿瘤细胞和II⁺类MHC Raji细胞结合试剂细胞 Facs分析SEA-C215mAb Colo205 阳性

Raji 阳性C215mAb Colo205 阳性

Raji 阴性SEA-C242mAb Colo205 阳性

Raji 阳性C242mAb Colo205 阳性

Raji 阴性SEA-抗-Thy-1.2mAb EL-4 阳性抗-Thy-1.2mAb EL-4 阳性SEA Colo205 阴性

Raji 阳性对照 Colo205 阴性

Raji 阴性

EL-4 阴性在冰上用各种对照添加物(PBS-BSA)培养细胞30分钟，洗涤并按下面所述进行操作。用FITC标记的兔抗鼠Ig检测C215mAb和C242mAb与Colol205细胞结合的染色以及抗-Thy-1.2与EL-4细胞结合的染色。用兔抗-SEA血清，然后用FTTC-猪抗兔1g检测SEA对Raji细胞的染色。用上面对C215mAb和SEA所述的方法检测SEA-C215mAb与Colo205和Raji细胞共轭的染色。在FACS star plus(从Becton和Dickinson得到)上进行FACS分析。用只包括第二和第三步的染色法确定底数。表2

CD₄ ⁺和CD₈ ⁺CTLs溶解含有C215-SEA共轭物的克隆肿瘤细胞。

％细胞毒性效应器^A) 靶对照 SEA C215-SEACD4⁺ sw620 2 5 50CD4⁺ Raji 0 41 43CD8⁺ sw620 0 1 23CD8⁺ Raji 2 72 68A)在SEA和C215-SEA不存在(对照)条件下或存在1μg/mlSEA和C215-SEA条件下，在效应器对靶的比率为30∶1条件下，使用CTL(SEA-3)。

Claims

1.一种制备可溶的抗体共轭物的方法，所述方法包括将抗体和超级抗原共价连接。

2.权利要求1的方法，其中

(1)所述抗体对与疾病有关的靶细胞的表面结构有特异性；

(2)所述超级抗原可被T细胞识别并能激活细胞毒性T细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述超级抗原能与T细胞受体复合物的部分相互作用。

4.权利要求3的方法，其中超级抗原与T细胞受体Vβ链相互作用。

5.利要求2-4中任一权项的方法，其中与疾病有关的靶细胞选自癌、自体免疫、寄生虫感染和微生物感染，抗体特异性地针对所述靶细胞上呈递的抗原决定簇。

6.权利要求2-4中任一权项的方法，其中疾病是癌症，抗体针对肿瘤细胞上呈递的抗原决定簇。

7.权利要求6的方法，其中肿瘤细胞是结肠癌相关细胞。

8.权利要求1-4中任一权项的方法，其中抗体特异性针对C242表位。

9.权利要求1-4中任一权项的方法，其中每个抗体部分有至少1-5个超级抗原部分。

10.权利要求1-4中任一权项的方法，其中抗体是单克隆抗体。

11.权利要求1-4中任一权项的方法，其中超级抗原是葡萄球菌肠毒素。

12.权利要求1-4中任一权项的方法，其中超级抗原是葡萄球菌肠毒素A。

13.权利要求1-4中任一权项的方法，其中超级抗原部分和抗体部分是通过含有至少一个酰胺结构的有机连接结构-B-而连接在-起的。

14.权利要求1-4中任一权项的方法，其中共轭物是重组产生的。

15.用权利要求2-14中任一权项的方法制备的共轭物在制备用于破坏哺乳动物中不需要的细胞的药物组合物中的应用，所述细胞表达共轭物的抗体部分所针对的结构。

16.权利要求15的应用，其中哺乳动物是人。

17.权利要求15的应用，其中不需要的细胞与癌症、自身免疫、病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染有关。