TW213415B - - Google Patents

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213415 ΑβΙ 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明q ) 本發明是有蘭抗體共轭體，其可活化胞毒性T細胞（ CTLs)。共軛《可用於破壊不要的細胞，其像與如癌 症型式、自體免疫過程、寄生虫浸害及細菌、病毒及真菌 感染有關之細胞。 發明背畏 近年來已企圖使用抗體加上可直接於標的細胞上誘出 毒性作用之作用物（胞毒劑，胞毒素），以於標的細胞上 提供選擇作用，並避免及減低於其他細胞上之非待異性作 用。此種組合所建議的，可由利用提供連接之分子之共價 鍵合絡合物及非共價鍵合絡合物至單純的混合方式（如， Ghose et al.» J. Natl. Cancer Inst, 61 ( 1 9 7 9 )657-676¾ Carlsson et al.， Biotechnology 7 (1989) 567—73)。所建議使用之胞毒素有 :白喉毒素、箆麻蛋白、箆麻蛋白之亞單位A、白樹素（ qelonin)及緣膜桿菌外毒素 A (Takeda Chemical Ind.， EP— A — 336，405 及 Pastanet al., WO — A 一88/00703,二者與先前申請案SE—9002 4 7 9有關）。 由於融合瘤技術之出現及附隨單株抗髏之可應用性， 已可行地使用抗體及胞毒劑間絡合物之觀念，使胞毒劑可 更特異地集中於欲求之標的細胞族群。 基於胞毒劑對標的細胞以外其他細胞上之已確知之傷 害作用，有人建議以可引起T一淋巴細胞及活化CTLs 本紙張尺度逍用中國國家標準(CHS)甲4規格(210x297公龙）_ 3 - " (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線. 213415 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明¢2 ) 之免疫刺激劑取代胞毒劑。特殊的提案是關於將抗體共轭 至 (i)可直接拮抗T細胞受髏或可與細胞受體結合化 合物之抗體（Mass. Inst. Techn.EP - A1— 180， 17 1)； (Π)可活化胞毒性T細胞之化合物，如抗原，促細 胞分裂劑，其他外來蛋白質，及肽類（Neorex C〇rP., EP-A1-334, 300)； (iii) MHC 抗原（BehringwerkeAG，EP—Al - 3 5 2,7 6 1)； (iv) 抗原，其拮抗之値體僳已經處理而具免疫力者 (Med. Res. Counc. WO-A-90/1 1779 (公 告 199 ◦一 10 -18));及 (V) —種尚未命名之細菌腸毒素（〇chi and Wake， UCLA-Sympos i um' Cellular Immunity and the Immunotherapy of Cancers, January 2 1 -February 3 ， 1 9 9 0, Abstract CE 5 1 5 . p 109)。 然而，迄今所建議之免疫剌激物在其作用上不是太具 持異性就是太一般化。例如，典型的抗原每1〇5値τ細 胞中只活化約1個，而促有弱分裂劑則可有力地活化大部 份的T細胞。 已確認，某些作用物可調介中等比率T細胞之活化作 用；即其以相當高頻率活化T細胞，但不到1 00% ( Fleischer et al·» J- Exp. Med. 16T (1988) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線- 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公*)_ 4 _ 213413

經濟部中央標準局員工消費合作社印M 五、發明説明（3 ) 1697-1707;及 White etal·， Cell 56 ( 1 989) 27 - 35,二文獻均纳為本案參考）。此型 式之作用物為較典型抗原有效之活化劑，且因此其被命名 為超抗原（Superant i gens (總¾見KapplerandMarΓ-ack, Science 2 4 8 ： 7 0 5, (1990))。已進 一步證明（D o h 1 s t e n e t a 1 .，I m m u η ο 1 . 7 1 ( 1 9 9 ◦ )96 - 100;及 H e d 1 u n d e t a 1 .，C e 1 1 . I m m u η ο 1 . 129 (1990) 426-34,二文獻均列為本案參 考）目前已知之超抗原具有與標的細胞上之MHCI類分 子结合之能力，及活化帶有正確T細胞受體V;9鏈之胞毒 性T細胞。已發表之資料顯示，MHC之結合是T細胞結 合及活化發生之先決條件。無法結論，將來超抗原可經由 T細胞受體V α鐽或其他只見於T細胞亞族群表面結構而 作用。 超抗原蕕萄球菌腸毒素A (SEA)之免疫調控作用 已由 p 1 a t s 〇 u c a s 等人描述（C e 1 1 I m m u η ο 1 . 9 7 ( 1 9 8 6) 3 7 1 - 8 5) 〇 大部份目前已知之超抗原早已被確知為毒素，且均源 自細菌。例如葡萄球薗腸毒素為腸素性且可活化Τ細胞， 且二種作用可互相可分辨（Fleischer et al.，Cell· I- mmuno 1 . 1 18 (1989) 9 2 — 1 0 1 * Alber et al.， J· Immunol . 144 (1990) 4501 — 06 ;及 Infect. Immun. 59 (1991) 2126-34 )0_ 本紙張尺度通用中BS家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 5 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· .rr. 線. Ρίί件三 2ΐΜί5_ 中文説艰璨修正頁 第8Ό10 630 專利电嫌衆· 桃充 五、發明説明（夺）__ 先前己建議使用超抗原以指令搞有MHC 1[類抗原之 細胞進行C T L諝介之溶解作用（Pharnacia AB, W 〇 一 ih 先 m ih 背 而 之 注 意 事 項 填 A — 9 1/04053，公告於 199 1 一 〇4 — 〇4) 。WO — A — 9 1/04053所涵蓋的（但未明確提示 )超抗原像纳人共價免疫共轭體。 然而，不具MHC 1[類或表現最低置MHC E類蛋白 質之細胞，無法與足夠量超抗原結合，以有效指令其經由 CTL之溶解作用。 因此由於通常細胞多帶有Μ H C II類抗原而在大多數 腫瘤細胞MHCI類抗原並不多，超抗原應以低價作為特 異性殺死這類非所欲細胞。 然而，本發明發現一種由C T L s調節的待異性細胞 殺死作用，此作用可由超抗原逹成，當其共價鍵結至一抗 體，該抗體直接對抗所要特異地殺死之細胞的抗原決定位 。免疫糸統的活化作用可引發不具MHCI類抗原之標的 細胞表現該抗原，而可加強所欲之溶解作用。 發明摘藜 本發明提供新穎之抗體共軛物 (i) 包括（1)直接對抗檫的細胞的抗體， ^ 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 及（2) —超抗原，也就是可被辨識（交互作用 或結合）且可活化T細胞，尤其是 CTLs,的一種結構； (ii) 破壊檫β的細胞的方法，尤其是結合預期用於哺乳動 物以及用於Τ細胞，例如CTL s特異性活化之治 療性處理方法， (in)合成該共軛物的方法；及 (iv)包含該共軛物之藥學組成物與此組成物的製備方法 Ο 破壊標的細胞之方法對於癌症，自體免疫，病毒性感 染症，細菌性感子症，徽菌性感染症，寄生蟲感染及具有 本紙張足本遑m + β因家榣準(CNS>T4規格(210X297公 S1. 2. 20,000 Λ 6 Η 6

五、發明説明（☆/) 高度準確性，以殺死持定細胞為目的之其它疾病的治療性 處理方法。本發明之共軛物可用於製造藥學組成物，其傜 意圖用於破壞與上述疾病相關之標的細胞。所欲處理的値 體是正常的動物，主要是人類。 發明詳细描沭 共轭物之轺抗展部分 本新穎抗體共軛物，其特戡在於可被T細胞辨識的結 構是一超抗原。該共軛物在生理pH值，正常情況下是可 溶的且在活體外，可溶於血清。 經濟部+央楳準局员工消费合作社印製 閲 讀 背 而 之 >主 意 事 項 堝 寫 14 較佳的超抗原像選自葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins. SEs)，·例如 SEA、 SEB、 SEC 、SED及SEE,類毒素，其活性片段或肽及其它具有 活化C T L s之基本上相同作用模式的其它物質。超抗原 可包括其他撤生物産物（細菌以及病毒），例如來自葡萄 球菌株之産物，如毒性休克症狀毒素（TSST — 1),. 來自鋪球菌，如熱原外毒素A,及細菌性外蛋白質及由蘭 節炎枝原體所産生之蛋白質，其具有與超抗原相同方式之 與T細胞交互作用之能力。超抗原之獲得可由其天然産製 者或遣傳工程細胞（重組體技術）之培養，或可能的由合 成的肽合成法而來。用於本發明之超抗原，當應用於本案 所示之實驗模式中，應該可呈現類似本案實驗部份之作用 0 、 較佳的超抗原具有與約1 —40%與C T L S活化有 開之多形T細胞表面蛋白質之同型結合之潛在能力，較好 是T細胞受體V /8鏈。 共舨體之抗罇部份 抗體較好是單株抗體，而多株抗體也可使用，只要其 有足夠窄的特異性。所表示之抗體僳指一般的抗體，且因 此包括抗體之活性片段，及其他模倣抗體結合能力之分子 本紙張尺度逍《中Β國家«準(CNS)T4規格(210x297公;St) 81. 2. 20,000 A 6 B6 213415 五、發明説明（5 ) ，但其對討論中之標的細胞具有適當的特異性，抗體親抗 原性及親和力。此包括遣傳工程（重组體産製）之抗體及 抗體衍生物或其他類似之結合結構。於一個具體實例中， 抗體與腫瘤細胞上之抗原決定量具特異性，例如與結腸癌 有關之決定子（表位，結構）。也可想像到，抗體也可與 和自體免疫、病毒感染細胞、細菌、寄生虫或真菌或其他 不要的細胞有閼之細胞上抗原決定子具特異性。依據共轭 體之效力，抗體可與結合後將之中和之抗原有關，雖然咸 信，此種抗體特異性並非較佳。 與本案相闊所研究之單株抗體，為直接拮抗GA— 733族抗原之C2 15抗體（如見EP — A - 376, 7 4 6及此處所不之參考文歡，及Larsson et al.，

Int. J. Cane. 42 (1988) 877 - 8 2 )，C 2 4 2 ( Larsson et al.， Int. J. Cane. 4 2 ( 1 9 88) 877 — 82)及 T. hy —1.2(mabC，0pit-zetal.， Immunobiol. 160 (1982) 438 —） 。也可想像到，具有與其他標的細胞表面结構具特異性之 單株抗體將是有用的。直接拮抗與所選用之標的細胞具獨 特性表位之單株抗體，其製備是技藝中熟知的。如見上述 之申請案。所表示的，如直接拮抗C242表位或C 215表位之i株抗體，涵蓋可與交叉反應表位反應之抗 m 〇 在受試的三個單株抗體中，目前C215—共扼體最 可能最不重要，因為其可與腫瘤抗原上之表位反應，而該 本紙張尺度逍用中國國家榣準(CNS)甲4規格(210X297公龙）_ 7 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 213413 A 6 Β6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) 腫瘤抗原像不常表現於正常細胞上的。依據特異性，C 242—共軛體似乎較佳，雖然我們的結果顯示其可能需 要較高的劑量。直接拮抗Thy—1. 2之Mab C於 標的於人類癌細胞上價值可能較低，因為Thy—1. 2 抗原與非人類哺乳動物腫瘤細胞具特異性。 産製C242單株抗髏之融合瘤細胞株，已於 199 ◦年 1 月 26 日，以 ECACC 9 0 0 1 2 6 0 1貯置於歐洲動物細胞培養收集所，Porton Down，Sali-sbury， Wilts， U· Κ·〇 镩榕龆抗M革抗體之結構 於本發明的較佳共軛體中，超抗原像經由共價連接（ 一 Β_)而共價偶合至抗原。若其僳重要的，則共軛體當 投予至欲殺死之細胞中時會分解，如至動動，連接應該在 基本上可維持足夠時間之代謝穩定，以達到其作用。再者 ，如此之連接應是有益的，本身不致生成免疫反應。在共 軛體保有有效的標的細胞結合持異性（抗一腫瘤；抗病毒 等）及有效活化胞毒Τ細胞能力之意義上，連接應是惰性 的。 在科學及專利文獻上，在免疫共軛體之連接結構上已 建議許多官能基。因此，連接一Β—在我們新穎的共軛體 上可含有選自下列之結構： (i)醯胺及醯肼（醯胺=一 C0NR:—或一 NR:C0 一，其中毎個自由價結合至飽和的碩原子，且 本紙張尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公¢) _ 8 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂· 線. 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（7 ) 可為氫或烷基取代基，如低碩烷基（C:—)或自 然生成的α胺基酸之α_Ν—取代基，較好是親水 性胺基酸，及醛阱=一CONHNH—或一NHN HOC—其中毎個自由價結合至飽和的碩原子）； 秦 (Π)硫醚及二硫化物（一 Sr —其中每値自由價直接結 合至一個飽和的硪原子，分別地，且S是硫原子， 及r是1或2之整數）； (iii) 直、分支或環狀烴鐽，其像飽和的且可能可被一個 以上羥基或胺基所取代； (iv) 醚（一〇 —，其中毎値自由價直接結合至飽和的碩 原子）；及 (v) —级胺或二取代的肼（一 NH—或一 NH_NH_ ，其中每個自由價直接結合至一個飽和的碩原子） 0 橋接之長度應該在技術領域之範圍内，即少於（8 0 値原子，如<100原子，但長於3 — 6,較好是16個 原子。 較佳的連接是親水性，且不應含有任何芳族環。可形 成連接一B—部份之較佳親水性結構為：（i)自然生成 之親水性《胺基酸之多肽鍵（如：天冬胺酸及其醯胺，穀 胺酸及其醛胺、賴胺酸、精胺酸、甘胺酸、蘇胺酸，絲胺 酸、及可能也有組胺酸）；（ii)晖伸烷銻，如一 0 — （ CH2)n)n，一其中η是2 — 5之整數（較好是2 — 3,且 η·可為1一20的整數；及（iii)-S-(硫醚），一 本紙張尺度逍用中Β國家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙）_ 9 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 2i34li> A6 ____B_6_ 五、發明説明（8 ) 〇—（醚）及未經取代的醯胺（一CONH —）均連接至 短的未經取代之烴鍵（C,—)，較好含有（或2個碩原 子。 親水性胺基酸可呈（F _ ( P r o ) n ) » F之親水性結 構型式存在，其中F代表胺基酸序列，較好是4 — 8値殘 基，其中每傾胺基酸値別選自絲胺酸、甘胺酸及蘇胺酸， m是1一4之整數，且η是4 — 8之整數（Cetus Corp. WO-A-85/03508) 〇 連接-B-可接在抗體或共軛體超抗原部份之任一特 異位置，或任意地。可能的位置有胺基末端，羧基末端及 賴胺酸殘基（omega胺基酸）。若抗體或超抗原帶有硫醇 基或二硫化物基（分別是胱胺酸及半胱胺酸），這些基圍 也可用於共價偶合，除非其對共軛體活性部份之活性並非 必要。當存在時，碩水化合物結構可被氣化成醛基，其依 序可再用於共軛體其他部份之連接（參見Cetus Corp., EP-A-240, 200) 〇 本發明的共軛體應不含任何顯著量之酯鍵及不穩定的 醯胺鍵，特別是分別不與酪胺酸及組胺酸殘基形成。若此 種鐽於合成中被形成，其可利用翔胺除去（Endo et al.， Cancer Res. 4 8 (1988) 3330—3335)。 每抗體活性部份可存在之超抗原部份數目，通常在1 一 5 ,較好是1或2。 在一個較佳的模式中，共軛體物質在每抗體之超抗原 ，及/或分別應用超抗原及抗體部份之結合位置，及/或 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂. 線· 本紙張尺度逍用中國國家標準（CMS)甲4規格(210x297公理)_ 1〇 - 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明© ) 連接一B—等方面應是實質上均勻的。換言之，所有於共 軛饈物質中之個別共軛體分子在這些變數上應均相同的。 物質應實質上不含未共軛的抗體或未共轭的超抗原。 超抗原對抗體之確實比率及於最佳共轭體之連接結構 ，均依所選擇之單株抗體（包括種類，亞類，産製純条， 特異性）及所選擇之超抗原而定。本案所給之實驗模式也 可尋求其他超抗原及其他抗體之最佳指數。 依據本發明至今研究最詳盡之具體實例，連接一B— 包括以下結構 -SrRC0NHCH2CH2(OCH2CH山0(CH2KCOY- · (I) 式I中之自由價分別連接至活性部份。此可直接地或 經由進一步二價的惰性結構（其包括在橋接一 B —内）而 發生。 η是70之整數，如1一20,較好2或72且於許 多例子是<10。m是1或2。 S是硫原子，且直接結合至其化合價上的飽和磺原子 上（一 Sr — =硫醚或二硫化物）。Γ是1或2的整數。 Υ是一ΝΗ-,-ΝΗΝΗ-或一NHN=CH—其 在左端結合至CO基圍並示於式之右末端，且在其右端結 合至飽和的碩原子或至羰基（共有當Y等於一 NHNH-時）〇 R較好是伸烷基（具有1 一 4値碩原子，常是1或2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公¢) _ 1;1 _ 21341ο A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10) 個碩原子），其可能可被一個以上（1 一 3，較好是<2 )個羥基所取代。 製備枯:艚一貂抗原#舨膳 本發明之抗塍共軛體，可自産製細胞之培養基中加豐 及纯化而得，或得自其他其合成之培養基中。 我們此新穎共軛體之合成，可以共軛體合成技藝中已 知之技術來完成，即，遣傳工程（重組體技術）或經由適 當的抗體及超抗原，在適當的官能基上行典型的偶合反應 。存在於蛋白質中且可正常被利用之官能基有： (i )磺水化合物結構。此結構可氣化成醛基，其再與含 有N2NNH —基圍之化合物反應，以形成一 C = NH — NH —基圍。 (ii) 硫醇（HS-)基團。硫醇基圍可與含有硫醇反應 性基圍之化合物反應，以形成硫醚基或二硫化物基 團。蛋白質之自由硫醇基存在於胱胺酸殘基中，且 可以硫醇作用引入蛋白質中，或於天然半胱胺酸殘 基中行二硫化物之分裂。 (iii) 於胺基酸殘基中之自由胺基（H2N-)。胺基可與 含親電子基圍之化合物反應，如活化之羧基，以形 成醯胺基。自由胺基較好是胺基末端或賴胺酸殘基 之奧墨伽胺基。 (iv) 於胺基酸殘基中之自由羧基。羧基可轉形成反應性 (活化的）羧基，其再與含胺基之化合物反應以形 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂- 線….f 本紙張尺度边用中B國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 12 _ 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（11) 成醯胺基圃。然而，要小心以減少與胺基形成醛胺 ,胺基係最常與羧基一起存在於相同蛋白質中的。 自由羧基較好是羧基末端，或二酸性0(胺基酸之羧 基。 搛有H2NNH—基，硫醇一反應性基圍，活化羧基 ，或胺基之化合物可為雙官能偶合試劑，或抗體或超抗原 。基圍可直接結合至飽和的碩原子，除了 H2NNH—基 以外，其也可結合至羰基碩。基圍可利用普通的衍生作用 引入抗髏或超抗原中。 重組體技術提供製造共軛體之有效方法，其中自一部 份中之末端羧基待異地連接至另一部份中之末端胺基。可 嵌入符合的應用技術之連接結構。 選擇試劑，使其可提供上文所定義之連接一 B —。一 般的雙官能試劑具Ζ_Β·_Ζ·化式，其中Z及Z •為官 能基，其互相配合，且可與蛋白質上之官能基共價偶合。 具上文。Β·是惰性橋接，其可含有如上示一 Β —中之結 構。特言之，Ζ及Ζ_可相同或不同，且可選自硫醇，硫 醇反應性基圍，活性羧基，一 C〇NHNH2等。關於這 些基團之定義，具下文標題為新穎試劑部份。 應用於實驗部份共軛體之方法包括以下步驟： (i )反應抗體或超抗原與含硫醇反應基及胺基反應 基之有機試劑，以形成撝有硫醇反應基之抗體 或超抗原，及 (ii)反應超抗原及抗體剩餘部份與含硫醇基或經保 本紙張尺度边用中a B家標準(CNS)甲4規格(210x297公藿）_ 13 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂- 線- A 6 B6 213415 五、發明説明（12) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 護之硫醇基及胺基反應基之有機試劑，以形成 攜有硫醇或經保護硫醇基之超抗原或抗體，因 此 (i i i )自（i )及（i i)步驟所得之産物分別互相反 應以形成共軛體，其中超抗原經由二硫化物或 硫醚連接至抗體。 每一基團之偶合條件是應用至蛋白質化學本身已知的 。偶合可逐步進行或以一步驟完成，生成中間官能基其可 經惰性之空間臂連接至起始物質上。一般而言，共軛體合 成及純化/回收之條件，總是對所涉及之蛋白質不致變性 的。此通常表示水性介質及在pH3_10及0° —50 C範圍内之pH值及溫度。確實之數值依據欲反應之基圍 及欲回收之共軛體而定。見標題為新穎試劑章節。 新黯試割（斑發昍一起發屏） 關於具連接-B—之共軛體之化學合成，已發展出可 符合通式I之新穎的雜雙官能試劑： 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 Z,RC0NHCH2CH2(0CH2CH2)n0(CH2)mZ/ * ( I ) m及n具如上式（1)之相同定義。Z/是HS —反應性 親電子基圃，硫醇（_SH)或經保護之硫醇（如Ac S -），但硫醇基及羥基必須不可結合至H S —反應性親電 子基團參考賁例的一個且相同碩原子上，有：__ 本紙張尺度逍用中困國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 14 _ A 6 B6 213415 五、發明説明（13) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (i) 結合至飽和硪原子上之鹵，較好呈α—鹵一烷 基羰基型式（如Z:CH2CO_); (ii) 活性硫醇，較好是所諝的二硫化物（一 SSRi ),其結合至飽和的硪原子； (iii) 3, 5 — 二氧基一 1—吖一環戊一 3 — 烯一 1 一基〇 關於反應性二硫化物之意義，具如EP — A_1 28 ,885,其已列為本案參考。 Z 是活性羧基，即，親電子基圃。實例有羧酸鹵化 物（一 C0C1、一 COBr,及一 COI),混合羧酸 酐（一 COOOCR:),反應性酯，如N —琥珀醯亞胺 基氣基羰基，一 C ( = CH) — 0R2，4 一硝基苯基羧 酸酯（-C〇-〇CsH4N〇2 )等。R/SR2 可為低 硪烷基（Ci_Ce)且R2也可為苄基。 我們這些新穎試劑的好處之一，即其在結構（〇ch2 C Η 之整數η方面可造成均勻的共軛體物質，即n在 一給定共軛體物質之各別分子上是相同的。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 與反應之官能基，可存在於天然抗體活性 分子或天然超抗原上，或可引入其中。2,’及2：,末端可 與適當抗體或超抗原選擇性反應，以基圃型式本身已知方 式進行。 已知之技術包括鏈之加長作用，不論是始自我們新穎 的試劑或是欲共軛之化合物。 利用新穎試劑行鍵加長作用，可造成其中之一Β—如 本紙張尺度逍用中困國家標準(CNS)甲4規格(210x297公货）_ 15 _ ' 21341^3 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（14)下之共軛體： (1) -COR'-Sr-RCONHCH2CH2(0CH2CH2)„0(CH2)mCOY-； OP結合至NH， (2) -COR ,-S,.-RCONHCH2CH2 (0CH^CH2 ) „0(CH2 ) m CONHNH-R1 'NHN^.-;Ν»是常結合至Sp2 —雜交之碩上，衍自抗 體或超抗原中之經氣化碩水化合物結構（當是 糖蛋白時）， (3) -g_0(CH2 )ra〇(CH2CH20) nCH2CH3NHCOR ' -Sr-(繼绩） (繼續）-RCONHCH2CH2 (0CH2CH2 )„0(CH2 )„>C0Y-; a〇-是結合至NH，(4) -CtHCHaKiHCHaCHjOhCHaCIUNHCOR'-Sr-(繼續） (繼缅 J-RCONHCHsCKOCHjiCHaKiHCDmCONHNH-P.， NHN^.；^如上（2)般結合.R, R·及R"為伸烷基，選擇方式如式（I)中之 Re Γ具如上之相同意義。試劑（式I)可由式Μ化合物開始製備： NH2CH2CH2(0CH2CH2)„0(CH山C00H ( I )m相當於1或2之整數。η相當於1一20的整數，如2 -2 0 或 3 - 9。符合式Μ的某些化合物之合作，其中m=l及2，且 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度边用中國0家楳準(CNS)甲4規格(210父297公龙·）_ _ 21341? 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（15) η = 1 _ 1 0，已先前有述（Ju】lien et al.，Tetrahe-dron Letters 29 (1988) 3803 — 0 6 » Houghton and Southby. Synth· Commun. 19 (18)( 1989) 3199-3209;及 EP-A-410, 280 (公告於 20. 1 . 9 1)及 Slama & Rando, Carbohydrate Research 88 (1981) 213— 2 2 1 及81〇〇11611113七” 19(1980)4595- 4 6 0 0)。 符合式I之新穎試劑，可由式M化合物與式Z_B’ 一Ζ·之雙官能基試劑反應而合成，其中Z=Z:, Β· =R"其如先前R及R·所定義的，且=活性羧基， 如先前所定義的。反應後，一C00H官能基轉形成活性 羧基，如Z，=活性酯，如N —琥珀醛亞胺基氧基羰基， 4一硝基苯基氧基羰基，2,4—二硝基苯基氧基羰基等 〇 式（M)之新穎化合物及其新穎的衍生物，符合具下 通式之多醚： XCH2CH2(OCH^CHz-)n〇CH2Y (IV ) η是2 — 20之整數，較好是3 — 2 ◦或3 — 9。X是 Η2Ν —包括其質子化型式或經取代2Η2Ν —，其可轉 形成Η2Ν _，較好是經由水解作用或還原作用。實例有 未經取代之胺基（Η2Ν_ );硝基；醯胺基（脲基）， 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公理·）_ _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線-

21341S A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（16) 如低碩醛基醛胺基（甲醛醯胺基，乙醛醯胺基……己醛醛 胺基），包括在醯基部份α硪原子上具電子消除之取代基 ,且再來特別是CF3CONH_, CH3C0CH2C0NH-等，·酞醯亞胺 ，其可能在環上被取代的；烷酯胺基（特別是^2’0(：0間-及（R^’OCOHR^OCCnN-,如N — （第三，丁氣羰基）胺基 (Boc) , N — （苄氣羰基）胺基及二（N —苄氧羰基 ))胺基（Z及d iZ分別），其可在環上被取代；烷基 胺基，其中結合至氮原子上之碩原子為芳族条之c(，如N 一單苄胺基及二笮胺基，N—三苯甲胺基等，包括其中甲 基（包括苄基之磺原子）之碩原子被矽原子（S i)取代 之類似基圃，如N, N —二（第三，丁基矽烷基）胺基； 及4 一氣基一 1, 3, 5 —三嗪一1_基，包括在3 —及 /或5位置上為低碩烷基取代者。 上文及下文之1^^及1^2'代表低碩烷基，特別是二级 及三级烷基，及一個甲基，其可被1一3個苯基取代，且 本身可能在環上有所取代。低碩烷基及低碩醯基具有1 一 6値硪原子。 Y是羧基（一COOH包括一 C00 —)或可轉形成 羧基之基圃，較好是採水解作用或氣化作用。最重要的是 酯基，其中羰基碩原子或在原酸酯上之相當原子，結合至 式（I)右端之亞甲基上。實例有烷基酯基圃（-C Ο O R 7 ');原酸酯基（一 C ( 0 R 3’）3)及如上所定 義之反應性基團。R〆具如前Ri’之相同定義。 其他的 Y 基團有一CHO, -CN, -C0NH2, -C0NR2，R〆， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度边用中國B家標準(CNS)甲4規格(210x297公；ϊ)_ 18 _ A6 _B6__ 五、發明説明（17) 其中具如前之相同定義。 式IV化合物可以混合本身已知的方法，自己知之起始 物質合成。適當的合成路徑有： A .鐽之形成， B. 末端官能基之轉形作用， C. 對稱多醚至不對稱醚之轉形作用， D. 二對稱鐽分裂成二個相同的片段。 具一 OCH2CH2—重覆單位之合宜的起始物質是可買到 的。實例有具2至6艏重覆單位之寡乙二醇。其他具相同 末端基圍之適當化合物，為相當的二羧酸及二胺類。 具有不同的末端基画之合宜的起始物質為奧墨伽一羥 基單羧酸，其中末端基圍以一個純的聚氣化乙烯橋分開。 此種多逹5個重覆單位之化合物，已述於先前文獻中（ Nakatsuj i » Kawamura and Okahara，Synthesis ( 19 8 1) p 4 2 )。 越璺紐成物及其梨法 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的藥學組成物包括此領域已知之調和物，但不 含我們新穎的共軛體。因此，組成物可呈冷凍乾燥粒子型 式，無菌或滅菌産製之溶液，錠劑，或安瓿等。賦形劑， 如水（較好缓衝成生理pH值，如PBS),或其他惰性 固體或液體物質也可存在。一般而言組成物之製備僳將共 軛體與一種以上水不溶性或水可溶性水或非水性賦形劑混 合，溶於其中，與之結合或另外加上，且必要時可加上適 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公釐）_ _

21341S A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（18) 當的添加物及佐劑。不可避免地，賦形劑及條件均不可不 利地影響共軛髏之活性。水包括在賦形劑中。 持鐾及用法 通常共軛體為固體，且呈預諝劑之劑量投予，各自含 有有效劑量的共軛體，其依據目前呈現之結果，咸信在 1◦微克-50毫克範圍内。確實的劑量依例子而異，並 依據病人的體重及年齡，投藥路徑，疾病型式，抗體，超 抗原，連接（一 B —）等而定。 投藥路徑是領域中一般已知的，即將本發明的共軛髏 以標的細胞溶解有效量或治療有效量，與標的細胞接觸。 針對上示，以腸外投藥為最佳，如注射或輸注（皮下，靜 脈内，動脈内，肌内）至哺乳動物，如人類。共軛體可局 部或糸統性投予至欲治療之値體。 而v標的細胞溶解有效量〃表示此量足以有效活化及 指令C T L s破痰標的細胞。 本發明以所附之申請專利範圍予以定義，其也為本説 明書一部份。現在將以許多具體實例說明本發明，且不欲 以任何方式限制我們所發現之一般概念。實驗部份，於I 部份是共軛體之化學合成，I部份為實例4所製備共軛髏 之作用，用以活化T細胞溶解標的細胞。 奮驗部份.I部份 班墨伽一胺某一PEG—筠酸之製備 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -線.

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 213415A6----B6_ 五、發明説明（19)3 —經基一 3. 6 —二曙一辛酸里两某酿、 呈碎片狀的鈉（23克，〇莫耳）在氮大氣下分 批加至二乙二醇（500毫升）中。—旦鈉完全反應，混 合物冷卻至室溫，且在攪拌下加入溴乙酸（76克， 0. 5莫耳）。於100¾下18小時後，過多的二乙二 醇以4毫米汞柱蒸餾除去。之後異丙醇（4〇〇毫升）及 部份的乙醛基氯（5 1克，〇. 65某耳）加入。在65 t：下攪拌1 8小時後，混合物冷卻至室溫，並以醋酸鈉中 和（3. 5克，0. 15莫耳）。混合物過濾，且濾液蒸 發至幾乎乾，因此將之溶於水中（200毫升）。水相以 1, 1, 1 一三氛乙烷（3X50毫升）萃取。匯集的有 機相水洗（20毫升）。産物自匯集的水相中以二氛甲烷 萃取（50毫升），其再蒸發可得油狀物（55克）。丄1 一羥基一 3，6, 9 —三曙一十一烷酸里丙某醅（2) 呈碎片狀之鈉（23克，1. 0某耳）分批加至三乙 二醇（700毫升）中。並在氮大氣下。當鈉完全反應，混合物冷卻至室溫且以攪拌方式加入溴醋酸（76克， 0. 5莫耳）。在1001C下18小時後，過多的二乙二醇在約4毫米汞柱下蒸餾除去。之後加入異丙醇（400毫升）及部份的乙醯基氯（51克，0. 65莫耳）。經 65¾下攪拌18小時後，混合物冷卻至室溫再以醋酸鈉 (3. 5克，0.15莫耳）中和。混合物過濾，且濾液 蒸發至幾乎乾，由此將之溶於水中（200毫升）。水相 本紙張尺度逍用中國困家橾準（CNS)曱4規格（210x297公釐）_ 21 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（20) 以1, 1, 1_三氯乙烷（3X50毫升）萃取。匯集的 有機相水洗（2 0毫升）。産物自匯集的水相中以二氯甲 烷（50毫升）萃取，之後蒸發可生成油狀物。 2 Η - N M R ( C D C 1 3) ； δ 1.26 (d, 6 Η )；3 . 0 7 ( s , 2 Η ) ；3. 6-3. 8 (m, 12 H ) ； 4 . 11 ( s , 2 H ) ； 5 . 0 9 ( m , 1 H ) 〇 8_ (N-酞醅亞胺醅某）一3. 6 —二暉一辛醇（3) 8 —氛一 3, 6 —二嗶一辛醇（365克，2. 2莫 耳，製備自三乙二醇及S0C 1 2 )溶於二甲替甲醛胺（ 400毫升）中，再以攪拌方式加入酞醯亞胺鉀（370 克，2. 0莫耳）。經1 IOC下攪拌18小時後，二甲 替甲醯胺減壓蒸餾除去。殘留物懸浮於甲苯中（1. 5升 ),於40 — 50¾下，再過濾除去氯化鉀。産物冷卻（ 7 Ot：)使結晶。第二次流份是自母液中濃縮並重覆結晶 步驟而得。 JH-NMR (CDC1J ; δ 2. 90 ( s , 1 Η )；3 . 5 1 - 3 . 5 8 ( m , 2 Η ) ; 3 . 6 0- 3. 68 ( m , 6 Η ) ; 3 . 7 3 - 3. 78 ( t , 2 Η );3· 89-3. 94 ( t , 2 Η ) ; 7 . 7 0- 7 . 8 9 ( m , 4 Η ) 〇 17 — （Ν — 酞醅亞胺醯基）一 3. 6. 9. 12. 15 一五皞+十烷酴里丙基酯（4) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中BB家標準(CNS)甲4規格(210x297公潑）_ 22 _ 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（21) 吡啶（2. 8毫升，35毫莫耳）於二氛甲烷（30 毫升）之溶液，在約—5t下以攪拌方式逐滴加至8— （ N —酞醯亞胺醛基）一3, 6 —二噚一辛醇（3)( 8. 5克，36毫莫耳）及三氟甲烷磺酸酐（10. 2克 ,36毫莫耳）於二氯甲烷之溶液中。約30分鐘後，有 機相以0. 5M氫氯酸及水洗。乾燥（Na2S〇4)及過 濾後，加入8 —羥基一 3, 6 —二哼辛酸異丙基酯（1) (12 克，48 毫莫耳）及 Na2P〇4(6. 5 克，46 毫莫耳），混合物在室溫下劇烈攪拌2 0小時。反應混合 物過濾，且濾液蒸發。殘留物分配於1,1,1一三氯乙 烷及水中。有機相蒸發可生成油狀物（13克）。 2H-NMR (CDC1.) ; δ 1. 26 ( d , 6 Η )；3 . 58-3. 76 (m, 18Η) ； 3 . 9 0 ( t ，2 Η ) ;4. 11 ( s , 2 Η ) ； 5 . 09 ( m , 1 H )；7 . 7 0 - 7 . 8 9 ( m , 4 H ) 〇 17- (N -酞醯亞胺醚甚）一·？. 6. 9. 12. 15 一五曙--十院酸（5) 將17 — （N—酞醯亞胺醛基）_3, 6, 9, 1 2 ,15 —五噚十1：烷酸異丙酯（4) (13克）溶於四氫 呋喃（50毫升）及氫氣酸中（濃的，50毫升）。經室 溫下16小時後，溶液加水（200毫升）稀釋，四氫呋 喃並減壓除去。水相以甲苯（IX)洗滌，再以二氯甲烷 萃取（2X)。有機相乾燥(Na2S〇d及蒸發後可生 本紙張尺度边用中8國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 23 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 線- 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22) 成呈油狀之産物（8. 5克）。 2H-NMR (CDC13) ; δ 3. 57 - 3. 76 (m , 1 8 Η ) ； 3 . 91 ( t , 2 Η ) ; 4 . 11 ( s ,2 Η ) ； 4 . 8 (hr, 2 Η ) ； 7 . 65-7. 9 Ο (m , 4 Η ) 〇 17—胺基一6. 9.12.15—艽皞一十七烷酸 異丙醋（6 ) 17 — （Ν —酞醯亞胺醯基）一 3, 6，9, 12, 15—五腭一十七烷酸（5) (8. 5克）溶於150毫 升乙醇及3毫升水合胼中。溶液在室溫下攪拌16小時， 而後加入HCi? (100毫升，3M)溶液再迴流3小時 。經冷卻至室溫並過濾後，調整pH值（pH 9, NaOH),且濾液蒸發至幾乎乾。加水，再蒸發至幾乎 乾，之後調整溶液之pH值（pH4, HCj?)再蒸發至 乾。産物在室溫下以異丙醇（100毫升）及乙酿基氣（ 2毫升）處理一夜，並蒸發。殘留物收集於水中，並以二 氣甲院宰取至齡性pH值（7 — 1 1)。蒸發生成産物（ 3 . 3 克）。 ;H-NMR (CD^OD) ; δ 1. 26 ( d 0 H )；3 . 17 ( t , 2 H ) ； 3 . 6 5-3. 8 〇 (m， 1 8 H ) ； 4 . 16 ( s , 2 H ) ； 5 . 0 7 (m, 1H )〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 線. 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 24 _ 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局貝Η消費合作社印製 五、發明説明（23) 所合成的胺基一P E G_羧酴：> 仆.式 H-(0CH2CH2)„CH2C〇-〇CH(CHj)2 化合物1 : η = 1 化合物2 : η = 1 PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)20Η 化合物3, phtN--N-酞醯亞胺醯基 PhtN-CH2CH2-(OCH2CH2)4CH2CO-OCH(CH3)2 化合物4, phtN —N-酞醯亞胺醯基 phtN-CH2CH2-(0CH2CH2)4CH2C0-0H 化合物5 H2N-CH2CH2-(0CH2CH2)4CH2C0-0H 化合物6 雙官能試割及偶会産物夕郸備 結構式分開示出 實例1製備17 —碘乙醯胺基一 3, 6, 9, 12, 15 -五鸣一十七烷酸之N-羥基琥珀醯亞胺酯 A .製備17 —碘乙醯胺基一3. 6. 9. IP. 15 — 五喟_+十烷酴（A) 17 —胺基一3, 6，9, 12, 15 —五聘—h 七 院酸異丙基酯（1. 1克，3. 2毫莫耳）溶於3毫升1 Μ氫氧化鈉溶液中，並留在室溫下30分。加1. 5毫升 的6Μ氫氯酸，混合物再蒸發至乾。殘留物加入二氯甲烷 ,並過濾以生成545毫克的17 —胺基一 3, 6, 9, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂_

L 本紙張尺度逍用中Η國家標準(CNS)甲4規格(210x297公茇）一 25 - 213415 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24) 12， 15—五噚十七烷酸，之前並將溶劑蒸發除去。此 化合物取46 ◦毫克（1. 39毫莫耳）溶於pH8. 4 之10毫升硼酸鹽缓衝溶液中。溶液以氮氣除去空氣。1 分鐘内逐滴加入432毫克（1. 52毫莫耳）N-琥珀 醯亞胺基2-碘醋酸酯於5毫升二腭烷之溶液，並加5M NaOH以保持在8. 4之pH值下。充入氮氣時，反應 溶液攪拌1 5小時。依據薄層層析（溶離劑：C H 2 C 1 2 -M e Ο Η 60 : 35),反應於數分鐘内完全。15 分鐘後，反應溶液之pH值調整至3,溶液冷凍乾燥。反 應混合物於逆相管柱PEP—RPC HR30/26 ( Pharmacia Biosystems AB)上分级分離，利用加有0. 1 %三氟醋酸之0—13%乙睛梯度，再來是13%乙睛， 0.1%TFA之等密度分離。匯集欲求峰之流份，經冷 凍乾燥可生成351毫克的17—碘乙醯胺基一3, 6， 9，12, 15 -五噚一十七烷酸（A)。産率：76% 0 産物之結構藉其NMR光譜之助確定。N M R 光譜（D2〇)以δ —值表示： ICH2C 4 . 2 3s, OCH^COH 3.76s 0 0 -OCH2CH2O- 3-71-3.76 ,-NHCH2CH20- 3 ·6 5 t , -NHCH2CH2〇- 3.41 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝. 線·

經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 21341ο Α6 _Β6_ 五、發明説明（25) Β .製備17 —碘乙醅胺基—3. 6. 9. 12. 15 — 7Γ瞎一 +十烷酸之Ν —锊某琥珀醅亞胺酯（R) 在反應小瓶中稱重羥基琥珀酵亞胺（4. 5毫克， 30微莫耳）。17 —碘乙醯胺基一 3，6, 9, 12, 15 —五嗶一十七烷酸（Α) (18. 3毫克，39徹莫 耳）溶於0. 5 5毫升之無水二噚烷中，再加至反應小瓶 。小瓶以氮氣除去空氣，再將8. 0毫克（39微莫耳） 二環己基碩化二亞胺於0.15毫升無水二噚烷之溶液， 逐滴加至反應小瓶中。小瓶内充滿氮氣，密閉再置暗處。 反應溶液攪拌3. 5小時。形成之沈澱以過濾除去。濾液 中産物Β之形成百分率以NMR分析決定知為8 9%。 奮例2製備17 -碘基乙醯胺基_3, 6, 9, 12， 15—五喟十七醯基胺基）免疫球蛋白（C) A .蜇抶杭鵲Mab C 2 1 5 免疫球蛋白I gG2a之單株抗體（Mab C 215) (34毫克，0.218微莫耳）溶於17. 7 毫升之0.1M硼酸鹽缓衝溶液中，pH8.1，並含 ◦. 9%氯化鈉，並加至反應小瓶中。146微升含有 3. 6毫克（6. 4微莫耳）17 —碘乙醯胺基一 3, 6 ,9，*12, 15 —五噚一十七烷酸之N —羥基琥珀醯亞 胺酯（B )之二曙烷溶液，注入緩衝溶液中，且反應在室 溫下攪拌2 5分鐘可完全。反應小瓶加蓋以避光。過多的 試劑B於Sephadex G 2 5 K26/4 ◦管柱上分级分 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂· 線. 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)曱4規格(210x297公龙）_ 27 _ A6 B6 21341^ 五、發明説明（26) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 離除去，利用含有0. 9%氣化鈉之Ο.1M磷酸鹽缓衝 溶液PH7. 5為溶離劑。匯集含欲求産物C之流份。溶 液（22毫升）以Am icon裝置，經YM30濾紙濃縮成 8毫升。以胺基酸分析決定濃度及取代作用程度，分別為 4. 7毫克/毫升及每锢Mab C215有18値空間 子。 B .簠抶抗騁Mab C 2 4- 2 免疫球蛋白I gGI之單株抗體（Mab C 2 4 2 )依據實例2A之步驟，分別與15, 20及22倍莫耳 濃度過量之17 —碘乙醯基胺基一 3, 6, 9, 12' 15 —五腭一十七烷酸之N —羥基琥珀醯亞胺酯（B)反 應，生成九、+及+四（17-碘乙醯基胺基）一 3 , 6 ,9, 12, 15 —五嗶一十t醯基胺基）一 Mab C 2 4 2 . ( C ) 〇

C.星株杭體Mah C 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 免疫球蛋白I gG2a之單株抗體（Mab C)依 據實例2A之步驟，分別與14及18倍其耳濃度過量之 17 —碘乙醯基胺基一 3, 6, , 9, 12, 15_五B等 十七烷酸之N -羥基琥珀醯亞胺酯（B)反應，可生成四 及七（17_碘乙醯胺基一3， 6， 9,12， i5_五 嘴一十七醯胺基）_Mab C (C)。 本紙張尺度边用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 28 - A 6 B 6 213415 五、發明説明（27) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 啻例3製備2 -镟基丙醯胺基一 Eu3 —經標記之葡萄球 菌腸毒素A ( S E A) A ·製備P：u 〃猙檫記的SEA (D) S E A (Toxin Technology Inc.之冷凍乾燥産品） (2毫克，72毫微莫耳）溶於722微升之Mill i-Q水 中，再加至15毫升聚丙烯管中加入100微升0. 1M 硼酸鈉缓衝溶液，PH8. 6，之後是2 160毫微莫耳 溶於178微升Milli-Q水中之Eu〃-嵌合試劑（Pharmacia Wallac Oy) 。 反應在室溫下一夜可完全。 過多的 試劑可將反應溶液於Sephadex G25 pDIO管柱上 (Pharmacia Biosystems AB)行分鈒分離而除去，利用 0. 1M磷酸鹽缓衝溶液，PH8. ◦為溶離劑。匯集具 欲求産物D之流份。溶液（3毫升）以Am icon裝置經 YMS濾紙濃縮成0. 8毫升體積。以胺基酸分析決定濃 縮為1 . 7毫克/毫升。取代程度與EuC 1 3標準溶液 比較為每SEA有◦. 8Eu3、 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 B 1 .製備3 — （ 2 -吡啶基二硫某）丙醯胺基E u 〃檁

記之S E A

(E )及3 —镟基丙醯胺某Ει】3♦擇記之SEA (F

Eu3i- SEA (1. 24 毫克，44. 8 毫莫耳） 於0♦ 75毫升0.1M磷酸鹽缓衝溶液，PH8. 0, 加至15毫升之聚丙烯試管中。35微升（180毫微莫 本紙張尺度边用中困國家標準(CNS)甲4規格(210x297公度) 29 - 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 213415 A6 _B6 _ 五、發明説明（28) 耳）的1. 6毫克3— （2—吡啶基二硫）一丙酸N—琥 珀醛亞胺酯於1毫升乙醇之溶液加至管中，且反應溶液在 室溫下攪拌30分鐘。所得産物E在還原成産物F前不分 離。 對上述之反應溶液加入20微升的〇. 2M E u3* 一檸樣酸鹽溶液及5 0微升2M醋酸以將pH調至5。之 後，加入3. 1毫升二硫異赤絲藻醇（Merck )於0. 1毫 升0. 9%氣化鈉之溶液，且反應溶液在室溫下攪拌20 分。之後加50撤升的0. 9%氛化鈉溶液，使總體積調 至1毫升。反應溶液（1毫升）置於Sephadex G 2 5 NAP — 1 0 管柱上（Pharmacia Biosystems AB),並加 1. 5毫升含有0. 9%氣化鈉之◦.1M磷酸鹽缓衝溶 液PH7. 5以溶離出欲求的産物F。經溶離的産物F收 集於15毫升聚丙烯管中，並立即用於産物G之合成以避 免再氧化成二硫化物産物。 B 2製備2 —镟某丙醅胺某蕕萄球崮睹羞素A ( S E A) (F 2 ) 天然的S E A (自Toxin Technology Inc之冷凍乾 燥産品）或重組體製備之（SEA (r SEA)，依實例 3B1之方法，與2倍莫耳濃度量之3— （2—吡啶基二 硫）丙酸N —琥珀醯亞胺基酯反應。 取代作用程度以UV-分析，依據Garlsson等人之 方法進行決定（B i ochem .J. 173 (1978) 723 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂- 線. 本紙張尺度逍用中國國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公龙）_ 30 -

21341S A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29) 一 737)，為每SEA有1. 9個巯基丙醯基圃。 實例4製備SEA —單株抗體共轭體（G1 o c h G 2 ) A , E u p — S E A 及 M a b C 2 1 5 ( G 1 )間夕共 舨體 對實例3 B所述之4 一魏基丙醯胺基E u3#標記之S EA (F)溶液，加入1. 2毫升含有Ο. 9%氣化鈉， 1. 2毫升十八（17 —碘乙醯胺基一 3, 6, 9, 12 ,15 —五曙十1：醛基胺基）Mab C 2 1 5 ( C )( 4毫克）於Ο.1M磷酸鹽缓衝溶液，PH7. 5之溶液 。反應在室溫下靜置一夜可完全。未反應之碘烷基，再加 5微升（1. 2微某耳）2 0微升颈基乙醇於1毫升水之 溶液以阻斷。令反應溶液置室溫下4小時，再過濾。之後 ,濾液於 Superose 12 HR16/50 管柱上（Phe- rmacia Biosystem AB)分级分離，以含有〇. 9 %氣化鈉 之0. 002M磷酸鹽缓衝溶液為溶離劑。匯集具有欲求 産物G之流份並分析。以胺基酸分析決定出蛋白質含量為 0. 22毫克/毫升。以Eu〃決定出取代程度為每 I gG有1値SEA。也研究産物之免疫剌激特性及抗體 結合能力。 藉著增加相對於化合物（C)之化合物（F)之量， 可得高程度之取代作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -訂- 本紙張尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公贽）_ 31 _ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 21341^ A6 __B_6__ 五、發明説明（30) B . r S _E A 及 M a b C 2 1 5 間夕共舨體（Π P.) 十八（17-碘乙醯胺基一 3, 6, 9, 12, 1 5 一五噚十七醯胺基）Mab C215 (C)，依據實例 4A之步驟，與1. 8倍莫耳濃度多量之2—皲基丙醯胺 基一 r SEA (F2)反應。共轭體之組成以硫酸十二酯 鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS — DAGE)分析，於 Phermacia Biosystems AB)掃描。所得的共軛體含有6% 的Mab C215加三個SEA,15%加上二値SE A, 28%加上一個SEA及51%未經取代的Mab C 2 1 5 〇 於另一賁驗，使用7倍莫耳濃度過量之F2,可 生成共軛體其中15% Mab C215有三個SEA ,25%有二個SEA, 34%有一個SEA,及26% 未經取代之Mab C215。 C . r SEA及Mab 0242間之共舨體 C1·十四（17 —碘乙醛胺基一3，6, 9, 12, 15 —五噚十七醛基胺基）Mab C242 (C)與 3. 2倍某耳濃度過量的2—颞基丙醯胺基一rSEA ( F 2),依據實例4A之方法反應。共軛體之組成如實例 4B般分析，且發現有4%Mab C242有四値SE A,12%有三値SEA, 28%有二個SEA， 36% 有一値SEA且20%為未經取代之Mab C 2 4 2 〇 本紙張尺度逍用中國S家標準(CNS)甲4規格(210><297公《) _ 32 _ "" (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝< -線. 21341^ A 6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（31) 進行相同反應，但反應産物在管柱分级分離前，以 Ο. 2M羥胺處理4小時，以除去Mab C242及空 間子間，及S E A及魏丙醯基間之不安定鍵。所形成之共 鈪體中l%Mab C242有四個SEA,12%有三 個SEA, 27%有二値SEA, 36%有一個SEA且 24¾為未經取代的Ma b。 C2. +二（17 —碘乙醛胺基一 3, 6, 9, 12, 15—五嗶十七醯胺基）Mab C242 (C)與3倍 莫耳濃度過量的2—巯基丙醯胺基_rSEA (F2)依 實例4A之方法反應。所得共軛體之组成為6%Mab C 2 4 2 有三個 S E A , 2 6 %有二値 S E A , 3 6 %有 一個SEA及31%未經取代之Mab C242。 C3.九（17 —碘乙醛胺基一 3, 6, 9，12，15 一五腭十t醯胺基）Mab C242 (C)與3倍莫耳 濃度過量之2—魏基丙醯胺基一ΓSEA (F2)依實例 4A之方法反應。所得共軛體之組成為1 3%Ma b C 242帶二値SEA, 39%有一値SEA及46%未經 取代之Mab C242。 D. rSEA及Mab C間之共轭體 D1.七（17 —碘乙醛胺基一 3, 6，9, 12, 15 —五嚀十七醯胺基）Mab C與5.4倍莫耳濃度過童 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 本紙張尺度边用中國Η家標準(CiJS)<H規格(210x297公龙）_ 33 21341^ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A 6 ___B_6_ 五、發明説明（32) 的2-頸基丙醯胺基一rSEA (F2),依實例4A之 步驟反應。如實例4B所述地分析共軛體之組成，且發現 有15%具四個SEA, 24%有三値SEA, 29%二 個SEA,19%—値SEA, 3%未經取代之Mab C及1 0 %呈二聚型式。 Ο. 2M羥胺存在下進行相同反應，以除去Mab C及空間子及SEA及颈基丙酷基間之不穩定鍵。所形成 之共軛體具以下組成：1l%Mab C有三個SEA, 24%有二個SEA, 30%有一個SEA,18%為未 取代之Mab C,且17%呈二聚型式。 D2.四（17 —碘乙醛胺基）一3, 6, 9, 12， 15—五噚十七醛胺基）Mab C與5. 7倍其耳濃度 過量之2-镟基丙醯胺基一rSEA (F2),依實例4 B之所述方法反應。共軛體具以下組成：8%Ma b C 2有四値SEA,18%有三個SEA, 30%有二値S EA, 26%有一個SEA, 5%是未經取代的Mab C ,且1 2 %呈二聚型式。 奮例5 .製備〔17 — （3 —镟基丙醯基胺基）一 3, 6 ,9, 12, 15 —五噚十七醯胺基〕一 r S E A ( I ) A .製備1 7 _〔 3 — （ 2 —吡啶基二硫甚）丙醅某胺某 Ί 一3, 6, 9, 12. 15 —五曄+ +轉某胺基） 本紙張尺度逍用中國Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公藿）_ 34 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A 6 B6 五、發明説明（33) r S E A ( Η ) 將17— 〔3- （2-吡啶基二硫）丙醛基胺基〕一 3,6,9,12,15—五腭十t烷酸之N_羥基琥珀 醯亞胺酯（K)之溶液（0. 53毫克（896毫微莫耳 )於43微升二噚烷）注入3. 67毫克（128毫微莫 耳）rSEA於1毫升◦.1M磷酸鹽緩衝溶液，pH 7. 5,其中含有0. 9%氣化鈉。反應在室溫下進行 30分鐘可完金。取出100微升用以分析取代程度。其 餘冷凍貯存直到其還原成産物I。 將1 0 0微升反應溶液於Sephadex G 5 ◦ NIC K管柱上（Pharmacia Biosystems AB)脱鹽，且溶離液以 UV —分光光度計分析，依Carlsson之方法（Biochem. J. 173 (1978) 723 — 737)可決定取代作 用程度。將2. 7個空間子偶合至rSEA。 B ·製備f 17 — (3 —镟甚丙醅甚胺甚）-3 . B ,9 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝< -訂- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製

.12. 15 —五P驾+十醯基胺甚]一 rSEA (T 加有産物Η (0. 9毫升）之反應溶液，以2Ν HCi?調至ρΗ4. 4,並加入2. 9毫克二硫異赤絲藻 醇於75微升0. 9%氛化鈉之溶液。於30分鐘内完全 還原反應。反應溶液加至Sephadex G25 NAP10 管柱（Pharmacia Biosystems AB),再以加有 〇. 9% NaC)2之1. 5毫升0. 1M磷酸鹽缓衝溶液pH 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210父297公婕) 35 - 21341^ A6 -------B6_ 五、發明説明（34) 7. 5溶離，並立即用於實例11中産物J之合成。 竄製備有雙重空間子之S EA -單株抗體共軛體J 十二（17 —碘乙醯胺基）一 3, 6, 9, 12, 15 -五噚十七醯胺基）Mab C 2 4 2 ( C )( 4· 2毫克，27毫微莫耳於1. 0毫升Ο.1M磷酸鹽 缓衝溶液，PH7. 5加有◦. 9%NaCiM與〔17 一 （3 -魏基丙醯胺基）一 3，6，9, 12, 15 —五 嘴十七醯胺基〕一rSEA(I) (1.17毫克，42 毫微莫耳於1毫升上述缓衝溶液）在氮大氣之暗處反應 43小時。之後，1.14微莫耳魏基乙醇加入。再經1 小時後，反應溶液於Superdex 2 0 0 H R 1 6 / 65管柱上分级分離。産物以有0. 9%NaCi?之2 mM磷酸鹽缓衝溶液pH7. 5溶離。匯集有欲求産物J 之流份，並如實例4B般分析。共軛髏之組成有：9% Mab C 242有二個SEA, 25%—個SEA, 及66%未經取代的Mab C242。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公龙）_ 36 _ 213415 A 6 B6

五、發明説明（35) ich2cvkch2ch2(〇ch2ch2)4〇CH2COOH

A ο ο 工CH2CMHCH2CH2(och2ch2)4och2con 0 0 〇

IgG-(NHCCH20(CH2CH2〇)4CH2CH2NHCCH2I)n 0 o n = 4, 7, 9, 12, 14, 18

B c

SEA-MHCNH-^ V I W CH2-N*

M (EU3+-SEA)

D COO* COO" COO* COO' V ^y Eu3+Na+ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 0

Eu3+-SEA-(mhcch2ch2ss

，3-4

E •ΤΓ-

Eu3+-SEA-(NHCCH2CH2SH)3_4 0

FI 線< SEA( NHCCH2CH2SH ) _ g o F2 (NH(|jCH2〇(CH2CH2〇)4CH2CH2NH〒CH2SCH2CH2CjNH_Eu：3+_SEA)ra

O

O 經濟部中央標準局员工消費合作社印製

IgG

figG (NH(^CH2〇( CH2CH2〇 ) 4CH2CH2NHCCH2SCH2CH20H) 18_ 〇 〇 m G1 [NHCCH2〇(CH2CH2〇)4CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CNH—SEA] II 〇 1 m G2 [nhcch2o(ch2ch2o)4ch2ch2nhcch2sch2ch2oh]n_m o o 本紙張尺度边用中國a家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙）_ _ 21341^ A 6 B6 五、發明説明（36)

IgG / (NHCCH2〇(CH2CH2〇)4nH2s2NH=nCH2SCH2CH20H) n. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (NHCCI(CHS20)4CH2CH2NH_12SCH2CH21CH32(§2CH2)48H2D=oNH-rsE>)【 Ο 〇 rsEA( NHCS2CK nH2CH2 ) 4nH2nH2NH=RH2nH2SH ) 一 rsEMNHCCH2〇(CH2CH2〇)4212c=2--_BI2s2ss

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 乂 裝.....··:線·

J 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公龙） -38 - 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 2l34ii> A 6 ____B_6__ 五、發明説明（37) 奮驗部份H 轺抗原一抗鵲共舨鵲對細朐作用 用於以下實驗之細菌性毒素為得自ToxinTechnolo-giesiWI ;USA) 之葡萄球菌 腸毒素 A (SEA) , 或呈重組蛋白質自大腸桿菌。 抗髏為（215, C242 及 Thy — 1, 2 mAbs。C215 為一種 IgG2a mAb,由括抗 人類結腸癌細胞株而生成，並可與許多人類結腸細胞株上 之37KD蛋白質抗原反應。這些mAb s之參考文獻已 示於上。共轭塍之製備如先前部份所述。 在此之前的研究只利用E u 〃標記之S E A — C 2 1 5 mAb共軛體。在先前幾年，已用未標記之SEA— 215,3£八一242及3£八-丁）17-1.2 mAb共軛體確認。結果目前納入未標記共軛體之參考。 為決定由SEA—C215 mAb共軛體及未共軛 SEA及C215 mAb拮抗結腸癌細胞所調介之胞毒 性，其中該類細胞僳不具有MHCI類或只表現低但未可 測及量之MHCI類者，於是應用各種人類SEA脹大之 T細胞株及效應细胞，及一組結腸癌細胞及MHCI*類 Raji細胞為標的細胞。結腸癌細胞株Colo 2 0 5，SW 620及WiDr,均缺乏MHCII類之表，此傜以拮抗 HLA — DR，HLA — DP 及 HLA — DQ 之 mAb 染 色及FACS分析而決定的。SEA脹大的T細胞株俗自 週邊血液所確立的，係以經絲裂徽素（mitomycin C)處理 (請先閲讀背面之注意事項再嶙窝本頁) 裝- 訂· 線- -39 _ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 213413 Α6 _Β6_ 五、發明説明（38) 且以SEA預先塗覆之MHCI*類BSM淋巴瘤細胞， 在重组體IL — 2存在下（20單位/毫升）每週再剌激 所致。這些T細胞株對塗覆有SEA之Raji或BSM細 胞具強胞毒性，但對未塗S細胞或葡萄球菌腸毒素B ( SEB)塗覆的細胞則否。此由SEA誘生之殺拭作用俗 依據SEA與MHCI類（位於檫的細胞上）之交互作用 而定，僳使用阻斷之HLA — DR抗體，MHCI -類 只以1突變細胞及只1^八一0只轉感之1^一細胞來決定（0-ohlsten et al·. Immunology 71 (1990) 96— 1 〇◦)。這些T細胞株可為C2 1 5 - SEA共軛體所 活化，以殺死C2 15 + MHC1[…類結腸癌细胞。相反 的，未共軛的SEA及C2 1 5 mAb無法誘生足以殺 死C215* MHCI·類結腸癌細胞之足夠的T細胞量 。依賴葡萄球菌腸毒素抗體共軛體之細胞所調介之胞毒性 ,俗依據SEA-C215 mAb共轭體至C215* 腫瘤細胞之結合。此結合的特異性可由以下事實明示，即 多量未共轭的C215 mAb,但非不相關之C242 及W6/32 mAb可抑制結腸癌細胞之溶解。 CD4*及CD8* T細胞說明以SEA-C215處理 之C2 15*結腸癌細胞之殺拭作用，但並未溶解以 SEA處理之細胞。T細胞與結合至MHCI-類腫瘤細 胞上SEA—C215 mAb共軛體之交互作用，似乎 涉及與特異V — /3 TCR序列之交互作用，其方式類似 先前由SEA誘導的MHCI*細胞之殺拭作用。此可由 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 4〇 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂- 線< 21341^ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（39) SEA待異但非自體SEB特異性T細胞株與C2 1 5 — S E A共軛體之交互作用示出。C 2 4 2 mAb及 Thy—1. 2mAb共軛體說明活性類似C215 m A b共扼體。 鉻檁記及檁的细睢ISIS E A之共置 Ο. 75X105標的細胞與150微居里52鉻（ Amersham Corp.， Arlington Hights， England)在 3 7¾ 及1 00微升髏積中共置45分。細胞保持於含RPM I —1 6 4 0培養基（Gibco，Paisley，GBR)之完全培養基 中，其中添加有 2. 8% (V/V) 7.5%NaHC〇3 ,1 %丙酮酸鈉，2 % 2 0 0 mM L -穀胺酸，1% 1 M Hepes, 1 % 1 〇毫克/毫升健大霉素及1 0 %胎牛 血清（FCS, Gibco，Paisley, GBR)。共置後，細胞以無 FCS之完全培養基洗一次，再於371C下共置6 ◦分， 並洗滌及再懸浮於含10%FCS之完金培養基中。對U 型底之9 6孔洞微滴定盤（Costar, Cambridge, USA)的 每一孔洞加入5 χ 1 0 3個標的細胞。 朐羞袢分析 以各種效應細胞/標的細胞比率，將效應細胞加至孔 洞中。各孔洞之终體積為200微升。每一試驗分析三次 。培養盤在3 7t：下共置4小時，之後可回收釋出之鉻。 5;Cr 之量以 7 —計數器決定（Cobra Auto-gamma，Pac- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂· - 本紙張尺度边用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公龙）_ 41 - 2l34ib A 6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（40) kard)。胞毒性百分率，以調和物之胞毒性％= (X — Μ )/ (Τ 一 Μ) * 10 ◦電腦算出，其中X為釋出之鉻， 為受試樣品中所得之C Pm, Μ是標的細胞與培養基共置 後自動釋出之鉻，且Τ是檫的細胞與1%硫酸十二酯鈉共 置後所得之總釋出鉻。 結果 SEA - C242, SEA-C215 及 SEA -抗 一Thy—1. 2mAb共軛髓可分別與表現相關mAb 表位之細胞，及MHCI*細胞結合。S—方面，未共軛 之SEA只與MHCI*類結合。未共軛的C2 15、C 242及Thy—1. 2mAbs結合至相關的細胞但非 Raji細胞（表1 )。 人類T細胞可於SEA-C215 mAb共軛體存 在下，溶解 MHCI -類 SW620, C〇l〇205 及 WiDr細胞，但在未共軛的SEA及C215 mAb 存在下則否（圖1)。結腸癌細胞之溶解，可見於10_ 100毫撤克/毫升之SEA—C215mAb共軛體。 在各種效應細胞對檫的細胞比率下，以拮抗SW620之 SEA — 2 1 5mAb共轭體可見高水平之溶解（圖1) 。相反的，在所試驗的所有效應細胞對標的細胞比率下， 未共軛之SEA或C215 mAb仍無法諝介拮抗SW 620細胞之胞毒性。由此顯示，溶解MHCI -類Colo 205細胞之能力受限於共軛髏，且並不由未共軛之 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS)甲4規格(210x297公泄）_ 42 - "" ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂- 線- 213415 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（41) SEA及C215 mAb所誘導。SEA及SEA—C 215 mAb共軛體但非c215 mAb可調介T細 胞之MHCI<類Raji細胞之殺拭作用，及經干擾素處 理的Μ H C I +類Colo 2 0 5細胞之殺拭作用（圖1 ) 0 為了證明SEA — C2 15 mAb共轭體所諝介之 溶解作用涉及共軛髏與標的細胞上C215 mAb分子 之特異結合，於是進行以過量未共軛之C215 mAb 及mAb C242之阻斷研究，其可與結腸癌細胞上不 相關抗原結合（有關C2 15 mAb結合）。mAb C215之加入可強烈地阻斷胞毒性，而C242 mAb則無影礬（圖2)。由SEA — C242 mAb 共軛體可達到之相似的溶解，可由過量未共扼之C 2 4 2 mAb而非C215 mAb特異地阻斷。 SEA-C215 mAb共軛體誘生T細胞依賴性 MHCI類SW620結腸癌細胞之溶解作用，可見於 CD4*及CD8* T細胞族群（表2)。SEA並不活 化這些T細胞亞群中任一者以調介SW6 2 0細胞之殺拭 作用，但可誘導MHCI<類Raji細胞之溶解（表2) 〇 SEA — C2 15 mAb共扼體可透導由SEA擴 大之T細胞株對SW620及Raji細胞之溶解作用，但 非SEB擴大之T細胞株（圖3) 。SEA及SEB株之 特異性，可由其對SEA及SEB分別之選擇性反應來證 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ 線- 本紙張尺度逍用中國困家標準(CNS)甲4規格(210x297公*)_ 43 _ 213415 A 6 B6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製

五、發明説明（42) 知，此偽當曝於Raji细胞而言（圔4)。此顯示， S E A - C 2 1 5 mAb共軛體保有如未共轭之SEA 般相似的V — /3 TCR待異性。 圖解 f圖1 . S E A — C 2 1 5 mAb共軛體可指令 CTLs拮抗MHCI -類結腸癌細胞。)左上說明S E A 反應性CTLs拮抗SW620細胞作用，像在各種效應 細胞對標的細胞比率下，並不存在（-）或存在有SEA -C 2 1 5 mAb 共轭體，SEA. C215 及 C 215及SEA之混合（C215 + SEA),濃度各1 徹克/毫升。其他示出SEA — C2 15 mAb共軛體 ，及SEA標的至SEA反應性CTLs拮抗C 2 1 5 + MHCH -類結腸癌細胞株SW620、C〇l〇205及 WiDr、MHCI*類C215*經干擾素處理之Colo 205細胞及C2 15-MHCII*類Raji細胞之能力 。效應細胞對標的細胞之比率為30 : 1。加入各種濃度 之未共軛C2 1 5 mAb ,不會誘導拮抗這些細胞株的 任何CTL標的作用。SW62 ◦細胞、C〇l〇2〇5及 WiDr 細胞，利用拮抗HLA — DR、一 DP、一 DQ 之mAb進行FACS分析，無法偵測任何表面MHC I 類之表現，而可在Raj i細胞上偵測到豐富的HLA — DR、一 DP及一 DQ之表現，在經干擾素處理的Colo 205細胞t是HLA-DR及一DP之表現。在CTL (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 装. 訂_ 線- 本紙張尺度逍用中國國家標準(CHS)甲4規格(210x297公货）_ 44 _ 213415 A 6 B 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（43) 分析前，C〇l〇2〇5細胞以1 000個單位/毫升之重組 體一 7 —干擾素處理48小時。 € 圖> SEA-C215 mAb 共軛體及 SEA-C 2 4 2 mAb共軛體誘導的拮抗結腸癌細胞之CTL 檫的作用，傜依據mAb之抗原選擇性SEA — C 215 mAb及SEA—C242 mAb共軛體存在 下（3徹克/毫升）C〇l〇2 0 5細胞為SEA反應性 CTL細胞株之溶解作用，可分別加入未共軛的C2 15 及C242 mAbs (30撤克/毫升）而予以阻斷。 在共軛之前，未共軛的mAb或對照用培養基（一）加至 檫的細胞1 0分鐘。 I圖3塗覆有SEA — C215 mAb共軛體之結腸 癌細胞之溶解作用，僳由SEA而非SEB反應CTL所 調介。>體3£八及SEB選擇性T細胞株，以10 : 1 之效應ά胞對標的細胞比率使用以拮抗SW 6 2 0及Raji 檫的細胞，於SEA—C215 mAb共軛髏、未共轭 的C215 mAb 及 SEA混合物（C215 + SEA )及未共軛的C215 mAb及SEB (C215+ SEA)存在或不存在下（對照組），濃度各1微克/毫 升。 I圖4.由SEA — C242 mAb共軛體及SEA 一抗一Thy—l. 2共扼體括抗其標的細胞（C〇l〇2〇 5腫瘤細胞及EL—4腫瘤細胞）所誘生之胞毒性。^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂· 線- 本紙張尺度逍用中困國家標準(CNS)甲4規格(210x297公着) 45 - 21341^ A6 _B6_ 五、發明説明（44) 表1 SEA—C215 mAb共軛體結合至C215* 結腸癌細胞及MHCI*類Raji細胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

e e N N 試劑 細脫 FACS SEA-C215 mAb C〇1〇205 Po s Ra j i Po s C215 mAb Co 1〇205 Po s Ra j i Neg SEA-C242 mAb C〇1〇205 Po s Ra j i Po s C215 mAb Co 1 〇205 Po s Raj i Neg SEA-抗-Thy-1.2 mAb EL-4 Po s 抗-Thy-1·2 mAb EL-4 Po s SEA Co 1〇205 Neg Ra j i Po s 對照組 C〇1〇205 Neg 本紙張尺度边用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公龙）_ 46 _ 21341^ 五、發明説明（45) 細胞與各種對照組添加物（PBS — BSA)共置於 冰上30分，洗滌再如前述般處理。利用FITC標記之 兔子抗老鼠偵測C2 1 5 mAb,及結合至C〇l〇2〇5 細胞之C242 mAb及結合至EL—4細胞之抗一 Thy — 1. 2之染色。SEA至Raji細胞之染色可利 用兔子抗一SEA血清，之後是FITC-豬抗兔子來偵 測。SEA — C2 15 m A b 共軛體對C〇l〇2 0 5 及 Raji細胞之染色，可利用上述用於C2 1 5 mAb及S EA之步驟來偵測。FACS分析利用Becton及Dickinson 之 F A C S "Plus 進行。只進行第二及三步驟之 染色是用來界定背景。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度边用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 47 A 6 B6

21341S 五、發明説明（46) 表2 CD4*及CD8* CTLs可溶解呈現C215 — S E A共軛體之結腸癌細胞。 胞毒性％

效應細睢〜 檁的細朐 對照組 SEA C215-SEA (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. CD4" SW620 2 5 50 CD4* Ra j i 0 41 43 CD8* SW620 0 1 23 CD8* Ra j i 2 72 68 A)在效應細胞對標的細胞比率在30 : 1下使用 CTLs (SEA—3)並有1微克/毫升SEA及 C2 15 — SEA之不存在（對照組）或存在之下。 訂- 線. 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐）_ 48 _

Claims (1)

1. 六、申請專利範園 本办年r月/〇B 濟 部 中 央 標 準 Ά 工 消 费 合 作 社 印 S 1補充 附件一A:第80106304號專利申請案 中文申請專利範園修正本 民國82年5月修正 體共軛 ( 表面結 ( 化胞毒 受體錯 2 胞與下 生物感 特異地 3 是癌症 (表位 4 抗體是 5 抗體是 位，特 •-種 雔，其 i )該 構具特 Π )該 性T細 合物交 •根據 列疾病 染如病 拮抗存 •根據 ，且抗 )，如 •根據 直接特 •根據 直接特 別是C •根據 包括單株 界定如下 nta 1/1- 1 ^ - !_ 單株抗體 異性，且 葡萄球菌 胞（C T 互作用， 申請專利 有關：癌1 毒感染， 在於該標 申請專利 體是接拮 與結腸癌 申請專利 異地拮抗 申請專利 異地拮抗 2 1 5表 申請專利 抗體及葡萄球菌內毒素的可溶性抗 與和疾病有關之標的細胞上之細胞 內毒素 L s ) 如與T 範圍第 症，自 眞菌感 的細胞 範圍第 抗存在 相關之 範圍第 C 2 4 範圍第 靥於G 位。 範園第 可爲T —細 ，較好是可 細胞受體V 1項之共輥 體免疫，寄 染和細菌感 上之抗原決 2項之共軛 於腫瘤細胞 細胞。 3項之共軛 2表位。 胞確認，且可活 與部份的T細胞 冷鏈。 體，其中標的細 生虫侵襲，及微 染，且抗體直接 定基。 體，其中的疾病 上之抗原決定基 體，其中的單株 3項之共軛體，其中的單株 A — 7 3 3族蛋白質上之表 1 _ 5項中任一項之共軛體 本纸張又度適用宁33家橒準（CNS) 37 4規格（21❶X 297 X货） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂. 21341^ A7 B7 C7 D7 π、申請專利範園 ’其中每個抗體部份至少有1 一 5，較好是1 一 3個葡荀 球菌內毒素部份。 7·根據申請專利範圍第1—_中任一項之共軛雅 ν·：·^ί ，其中的葡荀球菌內毒素是葡萄球( S E A ) 。 8 ·根據申請專利範圍第1 一 5項中任一項之共軛髏 ，其中的葡萄球菌內毒素及單株抗髅係經由共價的有機連 接結構~ B —保持一起，其較好包括至少一個醯胺結構， 且較好是一個可提供至少6個原子長鏈之親水性結構。 9 ·根據申請專利範圍第8項之共軛體，其中連接一 B —包括以下結構： •SrRCOMCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)mCOY- ( I ) 其中 r是1或2之整數； R是具1 一 4個碳原子之伸烷基； η是1 一 2 0之整數； m是1或2之整數；且 Y 是—NH -，— NHNH —或一 NHN = CH —。 v/ 1 0 .根據申請專利範圍第1 — 5項中任一項之共軛 體，用於攜有細胞表面結構之標的細胞溶解之用，此結構 係共轭體之抗體部份所直接拮抗的。 1 1 _如申請專利範圍第1項之可溶性抗體共軛體， (請先閲讀背面之注意事項再塥寫本頁) 丨裝. 訂. 本纸張又沒通甲'^33京抒準（CNS)甲4找-格（210 X 29? ) 絰濟部中央標準曷8工消费合作杜印製 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 其係用於檩的細胞之溶解，其中檩的細胞與標的細胞溶解 有效量之可溶性抗體共軛體接觸，此共轭體包括連接至葡 * 萄球菌內毒索之單株抗體；該單株抗體與檫的細胞具特異 性，且該葡荀球菌內毒素可爲τ細胞所確認，且可活化胞 毒性T細胞（CTLs)。 1 2_·根據申請專利範圍第1 1項之可溶性抗體共扼 體，其中葡萄球菌內毒素，單株抗體及連接單株抗雔至葡 荀球菌內毒素之連接結構，如申請專利範圍第1 一 1 2項 中任一項所定義y。 1 3 ·—種製備如申請專利範圍第1項之可溶性抗體 共軛體的方法，該方法包括如下步驟： (i )藉由偶合對於疾病有關之標的細胞上的細胞表 面結構具有特異性之單株抗體而合成共轭體，該抗體及葡 萄球菌內毒素之產製與偶合，係採用重組技術；且 (ii)自其已被產製之培養基中，回收該共軛體。 1 4 ·—種製備如申請專利範圍第1項之可溶性抗體 共軛體的方法，該方法包括如下歩驟： (i )自單株抗髏及/或葡萄球菌內毒素以菊萄球菌 內毒素至單株抗體本身已知方式偶合而合成共 軛體，其係經由至少一個選自下列之結構： (a )碳水化合物結構，及（b)官能基：硫醇 基，二硫化物基，羧基及胺基：及 (ii)自其所合成之培養基中回收共軛體。 1 5 ·根據申請專利範圍第1 4項之共軛體製法，其 ΉΙ.----------^---f-------裝------訂-----(t (請先閲讀t'面·-?.-注_意事項再填寫本頁) 表纸張又/l遛呵办家咩運（CNS) 37 ΐ设哼X 么、兮） A7 B7 C7 D7 77、申請專利範園 +的偶合係在葡萄球菌內毒素及/或單株抗體中之胺基上 進行。 1 6 ·根據申請專利範圍第1 5項之共轭髏製法，其 中的偶合包括以下步驟： (i )將單株抗镫或葡萄球菌內毒素與含硫醇反應性 基團及胺基反應性基團之有機試劑反應，以形 成攜有硫醇反應性基團之抗體或葡萄球菌內毒 素，及 (ii) 將葡萄球菌內毒素及單株抗體其餘部份與含有 硫醇基或經保護硫醇基及胺基反應性基團之有 機試劑反應，以形成攜有硫醇基或經保護硫醇 基之葡萄球菌內毒素或抗體，由是 (iii) 自.（i )及（ii)步騄分別所得之產物，再互 相反應以形成共轭體，其中葡萄球菌內毒素經 由二硫化物或硫醚連接至抗雅。 1 7 ·根據申請專利範圍第1 6項之共轭體製法，其 中含有硫醇反應性基團的胺基反應性試劑是一種α —鹵乙 醯鹵化物，且含有硫醇或經保護硫醇基之化合物是含下式 II之雙官能偶合試劑： Z1RCONHCH2CH2(OCH2CH2)nO(CH2)InZi, ( II ) 其中m是整數1或2，η是整數1 — 2 0，Zi是113 — 反應性親電子基團，硫醇（一 SH)或經保護的硫醇（如 參紙張尺度速用中國困家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再埸寫本頁) —裝. 訂_ 緩濟部中央襟準局貝工消费合作社印製 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 A c S -），但硫醇基及羥基必須不可結合至r上—個且 相同的碳原子上，且Ζχ’是活化的羧基。 1 8 ·根據申請專利範圍第1 3 — 1 7項中任一項之 共軛體之製法，其中該葡荀球菌內毒素及該抗體如申請專 利範圍第1 一 7項中任一項所定義者。 1 9 '·根據申請專利範園第1 一 5項中任一項之共軛 體，其可用於製造藥學組成物以治療癌症，自髗免疫，由 病毒，細菌或眞菌所造成的感染，或由寄生虫所造成之侵 襲。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝‘ 訂· 1 绶濟部中央標準局工消费合作社印製 本纸張尺度適用家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公爻） 21341ο <Ρ/ ^ > 附件二a : 第80106304號專利申請案 中文說明性資料 單株杭镣 細胞毒性分析 法所測得效力 C 215 卅 C 242 卄 A 33 卅 B 3 卄 民國81年10月呈 抗原決定某 蛋白質，上皮層抗原 醣類，局限之上皮層抗原 可能爲醣類抗原，局限於大腸 醣類，上皮層之局限抗原 Y4 (21 參X297公釐） 1B 2ϋ 附件二： i、％年 a 第80106304號專利申請案中文補充實施例 民國81年5月里 Terje Kail and，Mikael Dohlsten, Lars Abrahmsen， Gunnar Hedlund, Per Bjork, Peter A. Lando and Peter Lind將於1 99 2年8月，布逹佩斯之第八屆免疫 學國際會議上發表。 T細胞活化性超抗原一抗體重組融合蛋白質：一類新賴 的抗腫瘤劑 細菌的超抗原葡萄球菌腸毒素A (SEA)是一極強的Τ淋巴 球活化劑。由於SEA不活化溶液中的T淋巴球.其可以作為 一引起T細胞攻擊腫瘤細胞的理想候選者，當出現在腫瘤細 胞表面時，具有限的全身性副作用。因此吾等在SEA與2種 可辨識人類腸癌的2種單株抗體C215與C242之間，發明重組 之融合蛋白質。 SEA與全長抗體的構築體是在292細胞内表現，而利用易 修改肽連接子區隔的SEA-Fab與SEA-scFv是在大腸捍菌内 表現。所有的融合蛋&質皆保有極佳的抗原結合能力。以 SEA-Fab與SEA-scFv预先培養的人類T細胞株，能有效地溶 T4 (210x297公隻） 一 / — 2134^ 1 6 is 解結腸癌細胞。而在SEA與抗體的存在下，不見腫瘤細胞的 死亡。全長抗體的構築物只有少數腫瘤細胞被殺死的現象 ,但是加入位於SEA與抗體之間之肽連接子後，殺腫瘤細胞 現象明顯改善。這些結果顯示，在一細菌之超抗原與抗體 之抗原結合部位之間的重組融合蛋白質可以成功地用在T 淋巴球以使腫瘤細胞溶解。這種融合蛋白質作為抗腫瘤劑 而全身性使用，其係由超抗原所帶來之極佳T -細胞活化能 力的優點 Distr：Ca-parm, TNE,HDO,PB. PAL,ASU.GAF.KOB,CJJ,POG. KG,JMU P Lind, S Josephsson, (Bioscience Center)E Akerb1〇m〇 T4 (210X2974S*)