PT98396B - Processo para a preparacao de conjugados de anticorpos - Google Patents

Description

Descrição

A presente invenção refere-se a um conjugado de anticorpos que são susceptíveis de activar as células-T citotóxicas (CTL). Os conjugados são úteis para destruir as células indesejáveis que estão associadas eom, por exemplo, formas cancerígenas, processos autoimunes, infestações de para sitas e infecções bacterianas, virais e por fungos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

J.M.

Têm sido feitas tentativas nos últimos anos para utilizar anticorpos em combinação com agentes que exercem directamente um efeito tóxico nas células alvo (agentes citotóxicos, citotoxinas) de modo a proporcionar uma acção selectiva nas células alvo e evitar e minimizar o efeito não específico em outras células. As combinações sugeridas têm variado desde complexos covalentemente ligados utilizando moléculas que proporcionam ligação e complexos não covalentemente

ligados para misturas para misturas simples (por exemplo Ghose e col., J. Natl. Câncer Inst. 61 (1979) 657-676 e Carls^ son e col., Biotechnology 7 (1989) 567-73)· As oitotoxinas sugeridas têm sido por exemplo, toxina da difteria, ricina, subunidade A da ricina, gelonina e exotoxina A da Pseudomonas aeroginosa (Takeda Chemical Ind., EP-A-336,405 and Pastan e col., WO-A-88/007703, em que ambas têm sido citadas em ligação com o pedido de prioridade, SE-9002479).

Com 0 desenvolvimento da tecnologia dos hibridomas e disponibilidade consequente dos anticorpos monoclonais, tornou-se praticável utilizar um conceito de complexos formados entre anticorpos e agentes citotóxicos para dirigir mais espeoificamente os agentes oitotóxioos à população das células alvo pretendida.

Tendo em conta o efeito danificante reconhecido dos agentes citotóxicos ou outras células diferentes das células alvo, foi sugerido substituir os agentes citotóxicos por estimuladores imunes que actuam nos linfócitos T e activam os CTL. Foram feitas propostas específicas referentes a anticorpos conjugados para (i) anticorpos que são dirigidos contra um receptor de células T ou compostos que são susceptíveis de se ligarem a um receptor de células T (Mass. Inst. Techn. , EP-A1 -180,171 ) (ii) compostos, tais como antigénios, mitogénuos, outras proteínas estranhas, e péptidos que activam as células T citotóxicas (Neorex Corp., EP-A1-334,300);

(iii) antigénios MRC, (Behringwerke Ag, EP-A1-352,761);

(iv) antigénios contra os quais o indivíduo a tratar tem imunidade, (Med. Res. Counc. W0-A-90/11779 (publ. 1990-10-18)); e (v) uma enterotoxina bacteriana não designada (Ochi e Wake, UCLA-Symposium: Cellular Immunity and the Immunother apy of Cancers”, Janeiro 27-Fevereiro 3, 1990, Abstract

CE 515. página 109).

Contudo, os estimuladores imunes até ago ra sugeridos têm sido ou demasiadamente específicos ou demasiadamente gerais na sua acção. Por exemplo os antigénios clássicos activam apenas cerca de 1 de entre IO⁵ células T enquanto que os mitogénios são potencialmente susceptíveis de activar a maior parte das células T.

Foi reconhecido que alguns agentes efectuam a mediação de activação numa taxa moderada de células T; isto é, eles activam células T a uma frequência relativamente elevada, mas longue de 100% (Fleischer e col., J. Exp. Med. 167(1988) 1697-1707); e White e col., Cell 56(1989) 27-35, sendo ambos os artigos aqui incorporados como referência). Este tipo de agentes são activadores mais eficazes do que os antigéios clássicos e eles têm assim sido designados por superantigénios (para uma revisão ver Kappler e Marrack, Sience 248: :705, (1990)). Foi ainda demonstrado (Dohlsten e col., Immunol. 71(1990)96-100; e Hedlund e col., Cell. Immunol 129 (1990)426-34, sendo ambos os artigos aqui incorporados como re ferência, que os superantigénios conhecidos até agora têm a capacidade de se ligar a moléculas de MHC classe II em células alvo e activam células T citotóxicas contendo o receptor de células T adequado com a cadeia beta V. Os dados publicados indicam que a ligação de MHC é um pré-requisito para a ligação de células T e para que ocorra a activação. Não pode ser excluído que no futuro se verificará que os superantigénios actuam através de uma cadeia alfa receptor de células T ou de outras estruturas superficiais encontradas em sub-populações de células-T.

efeito imunomodelador do superantigénio Staphylococcus esterotoxina A (SEA) foi também descrito por Platsoucas e col., (Cell Immunol. 97(1986)371-85).

A maior parte dos superantigénios actual = 3 =

mente conhecidos foram anteriormente reconhecidos como toxinas e todos têm origem microbiana. As enterotoxinas de estafilococ cus, por exemplo, são enterotóxicas e activam células T, e os dois efeitos são distinguíveis um do outro (Fleischer e col., Cell Immunol. 118(1989)92-101; Alber e col., J. Immunol 144 (1990)4501-06; e Infect, Immun. 59(1991)2126-34).

Foi anteriormente sugerida a utilização de superantigénios de modo a dirigir a lise mediada por CTL das células contendo antigénios MHC Classe II (Pharmacia AB, W0-A-91/04053, publ. 1991-04-04). 0 documento WO-A-91/04053 cobre, mas não mensiona explicitamente, os superantigénios que são incorporados em imunoconjugados covalentes.

As células a que falta MHC Classe II ou que expressam quantidades marginais de proteínas MHC Classe II não ligam, contudo, quantidades suficientes de superantigénios de modo a dirigir oom eficiência a lise delas por CTL. Assim, devido à abundância geral de células contendo antigénios' MHC Classe II e a não abundância de antigénios MHC Classe II na maior parte das células de tumor, os superantigénios devem ter um pequeno valor para a distribuição específica dessas células indesejáveis.

Contudo, foi verificado que pode serccor seguido com superantigénios um efeito de exterminação específi ca de células mediado por CTL, se eles forem covalentemente ligados a um anticorpo dirigido contra um anticorpo que é específico para a célula que se pretende destruir. A activação do sistema imune pode induzir células alvo a que faltam antigénios MHC Classe II a expressá-los, que podem potenciar o efeito de lise desejado.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novos conjugados de anticorpos (i) compreende (1) um anticorpo dirigido contra cé4

lulas alvo e (2) um superantigénio, isto é uma estrutura que é reconhecida (interactua ou está ligada a) e activa células-T, em particular os CTL;

(ii) Processo para destruir células alvo, em particular em ligação com processos de tratamento terapêutico utilizados em mamíferos, e para a activação específica de células T, tais como CTL;

(iii) processo de síntese para os conjugados; e (iv) composições farmacêuticas contendo os conjugados e processos de preparação para essas composições.

processo para a destruição de células alvo engrossa processos terapêuticos de tratamento para o cancro, autoimunidade, infecções virais, infecções bactéria nas, infecções por fungos, infestações de parasitas e outras doenças que o objecto é exterminar certas células com um ele vado grau de precisão. Os conjugados da invenção podem ser utilizados para a preparação de composições farmacêuticas dirigidas à utilização para a destruição de células alvo associadas com as doenças acima mencionadas. Os indivíduos a tratar são normalmente animais, principalmente seres humanos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Parte de superantigénio do conjugado

Os novos conjugados de anticorpos são caracterizados pela estrutura que é reconhecida pela célula T como sendo um superantigénio. Os conjugados são habitualmente solúveis a valores de pH fisiológicos e in vitro eles são so lúveis no soro.

Os superantigénios de preferência são escolhidos de entre o grupo consistindo em enterotoxinas de es tafilococcus (SE), tais como SEA, SEB, SEC, SED, e SEE, toxóides, fragmentos aetivos ou os seus péptidos e outras substâncias que possuem essencialmente o mesmo modo de acção

para activar os CTL. Os superantigénios podem incluir outros produtos microbianos (bactérias e vírus), tais como produtos da estirpe de estafilococcus, por exemplo as toxinas do Sindroma do Choque Tóxico (TSST-1), de Estreptococcus, por exemplo a exotoxina pirogénica A, e exoproteínas bacterianas e proteínas produzidas por artrite do micoplasma, que têm capacidade semelhante para interactuar com células-T da mesma forma como os antigénios o fazem. Os superantigénios que podem ser obtidos por cultura dos seus produtores naturais ou por em células obtidas por engenharia genética (técnicas recombinantes) ou também potencialmente por síntese de péptidos sintéticos. Um superantigénio para ser utilizado na invenção deve, quando apli cado ao modelo experimental apresentado neste especificação, exercer efeitos em analogia com aqueles que são apresentados na parte experimental desta especificação.

Os superantigénios preferidos têm a capacidade potencial para ligar de cerca de 1 a 40 $ das isoformas de uma proteína de superfície de uma célula-T polimórfica associada com activação de CTL, de preferência a cadeia beta receptora V das células T.

A parte do anticorpo do conjugado anticorpo é de preferência um anticorpo monoclonal embora possam ser utilizados policlonais desde que eles proporcionem uma especificidade suficientemente precisa. A expressão anticorpo refere-se a anticorpos em geral e inclui assim fragmentos activos de anticorpos, e outras moléculas que simulam a capacidade de ligação de um anticorpo, desde que tenham a especificidade, potência e afinidade adquadas para a célula alvo em questão. Isto inclui anticorpos obtidos por engenharia genética (obtidos por técnicas recombinantes) e derivados de anticorpos ou outras estruturas ligantes semelhantes. Na outra realização o anticorpo é específico para um determinante antigénico nas células de tumor, por exemplo um de terminante associado com um carcinoma do cólon (epitopo, estru = 6 =

tura). É também possível que o anticorpo possa ser específico para um determinante antigénioo nas células responsáveis pela autoimunidade, células infectadas com vírus, bactérias, para sitas, fungos ou outras células indesejáveis. Dependendo da eficiência do conjugado, o anticorpo pode ser dirigido a um antigénio que fará a internalização do anticorpo após ligação,embora se pense que essas especificidades de anticorpo não sejam preferidas.

Os anticorpos monoclonais estudados em ligação com esta invenção são o anticorpo C215 dirigida contra um antigénio na família de GA-733 (ver por exemplo EP-A-376 746 e as referências citadas neste documento e Larson e col., Int. J. Canc., 42(1988)788-82), C242 (Larsson e col.,Int

I. Canc. 42(1988)877-82) e Thy-1,2 (mab C, Opitz e col., Immunobiol. 160(1982)438-). Pode pensar-se que os monoclonais que possuem especificidades para outras estruturas da superfície da célula alvo também serão úteis. A preparação dos monoclonais dirigidos contra epitopos únicos para células alvo escolhidas são bem conhecidos. Podem ver-se por exemplo as publicações acima mencionadas. As expressões, tais como anticorpos monoclonais dirigidos contra um epitopo C242 ou epitopo C215, englobam anticorpos que reagem oom epitopos de reacções cruzadas.

Dos três monoclonais ensaiados até agora os conjugados C215 serão mais provavelmente de importância menor dado que eles reagem com um epitopo ou um antigénio de tumor de forma que é demasiadamente frequente expresso em células normais. Os conjugados C-242 parecem ser melhor baseados em dados de especificidade embora os resultados desta invenção in diquem que eles possam necessitar de maior dosagem. Mab C dirigido contra Thy-1.2 será provavelmente de pouco valor para dirigir as células de cancro humano dado que o antigénio Thy-1.2 é específico para uma célula de tumor de mamífero não-humano.

Foi depositada em 26 de Janeiro de 1990 = 7 =

uma linha de células de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal C242, sob o número ECACC 90012601 na European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wilts, Reino Unido.

A estrutura que liga o superantigénio ao anticorpo

No conjugado preferido da invenção o superantigénio é covalentemente acoplado ao antigénio através de uma ligação covaiente (-B-). Se for importante que o conjuga do não se decomponha quando administrado as células para exterminar, por exemplo a um animal, a ligação deve ser essencia^ mente estável do ponto de vista metabólico por um longo período de tempo suficiente para que o efeito seja conseguido. Além dis so, é também vantajoso que esta ligação não dê origem às próprias reacções imunológicas. Em geral a ligação deve ser inerte no sentido de que o conjugado retenha uma especificidade de ligação a células alvo eficiente (anti-tumor, antiviral, etc.) e uma capacidade eficiente para activar células T citotéxicas.

Na literatura científica de patentes têm sido sugeridos vários grupos funcionais em estruturas de liga ção de imunoconjugados. Assim a ligação -β- nestes novos conjugados podem conter estruturas escolhidas no grupo consistindo em (i) amidas e hidrazidas (amidas = -CONR^- ou -NR^CO-, em que cada uma das três covalênoias se ligam a um áto mo de carbono saturado, e R₁ pode ser hidrogénio ou um substituinte alquilo tal como alquilo inferior (1-6C) ou o substituinte alfa-N ou um alfa aminoácido de ocorrência natural, de preferência um aminoácido hidrofilico, e hidrazidas = = -CONHNH- ou -NHNHOC- em que cada uma das valências livres se liga a um átomos de carbono saturado);

(ii) tioéter e dissulfureto (-Sr- em que cada uma das valnclas livres se liga directamente a um átomos de car bono saturado, respectivamente, e S é um átomo de enxofre, e = 8 =

r um inteiro 1 ou 2);

(iii) cadeias de hidrocarboneto lineares, ramificados ou cíclicos que são saturados e que podem possivelmente ser substituídos oom um ou mais grupos hidroxi ou amino;

(iv) éter (-0-, em que cada uma das valências livres se liga directamente a um átomo de carbono saturado); e (v) uma amina primária ou hidrazina dissubstituída (-NH- ou -NH-NH-, respectivamente, em que cada uma das valências livres se liga directamente a um átomo de earbono saturado) comprimento da ponte deve estar na gama normalmente incluída dentro do âmbito técnico, isto é mais pequena que 180 átomos, tal como < 100 átomos, mas maior do que 3 a 6, de preferência mais comprimida do que a 16 átomos.

A ligação preferida é hidrofílica e não de ve conter qualquer anel aromático. As estruturas hidrofílicas preferidas que se podem fazer parte da ligação -B- são: (i) cadeias de polipeptidos dos alfa aminoácidos hidrofílicos de ocorrência natural (por exemplo ácido asparagínieo e a sua amida, ácido glutamínico e a sua amida, lisina, arginina, glicina, treonina, serina e possivelmente também histidina); (ii) cadeias de oxoalquileno, tais como (-0(CH₂)_n)_n,- ^{em que n} ® um inteiro de 2 a 5, de preferência 2 a 3» e n’ pode ser um inteiro de 1 a 20; e (iii) -S- (tioéteres) e amidas não subs_ tituídas (-C0NH-) sendo todos ligados a cadeias de hidrocarboneto não substituídas (1-4C), contendo de preferência 1 ou 2 átomos de carbono.

Os aminoácidos hidrofílicos podem estar presentes nas estruturas hidrofílicas do tipo (F-(Pro) ) F, em que F representa uma sequência de aminoácidos, de preferên cia 4 a 8 resíduos, em que cada aminoácido é individualmente escolhido de entre serina, glicina e treonina, m é um inteiro de 1 a 4 e n é um inteiro de 4 a 8 (Cetus Corp. WO-A-85/ . /03508).

A ligação -Β- pode ser ligada quer em lo cais específicos na parte de anticorpo ou de superantigénio do conjugado ou aleatoriamente. Os locais potenciais são um terminal de amino, um terminal carboxi e um resíduo de lisina (grupo omega amino). Se o anticorpo ou o superantigénio contiver um grupo tiol ou um grupo dissulfureto (cistina ou cisteína, res pectivamente) esses grupos podem também ser utilizados para acoplamento covalente, a menos que não sejam essenciais para a actividade das partes activas do conjugado. Quando presentes, as estruturas de carbohidrato podem ser oxidadas para grupos aldeído que por sua vez podem ser utilizados para a ligação a outro radical do conjugado (cf. Cetus Corp. , EP-A-240 200).

conjugado da invenção não deve conter quaisquer quantidades significativas de ligações de tipo éster e ligações de amida lábeis, em particular não formadas com resíduos de tirosina e de histidina, respectivamente. Se estas ligações tiverem sido formadas durante a síntese elas podem ser removidas por utilização de hídroxilamina (Endo e col., Câncer Res. 48(1988)3330-3335.

número de radicais de superantigénio que podem estar presentes por radical activo de anticorpo é normalmente de 1 a 5, de preferência 1 ou 2.

Num dos modos preferidos a substância conjugada deve ser essencialmente uniforme em relação ao superantigénio por anticorpo, e/ou posições ligantes utilizadas nos radicais de superantigénio e de anticorpo, respectivamente, e/ou ligação -B- etc. Por outras palavras todas as moléculas do conjugado individual da substância conjugada devem ser iguais em relação a estas variáveis.

A substância deve ser essencialmente isenta de anticorpos não conjugados ou de superantigénios não conju gados.

A proporção exacta de superantigénio em relação a anticorpo, estrutura de ligação eto. para o conjugado óptimo dependerá do superantigénio monoclonal escolhido (incluin

do classe, subclasse, clone de produção, especificidade) e superantigénio escolhido. Os modelos experimentais dados nesta especificação permitirão um escrutínio para os parâmetros óptimos também para outros superantigénios e outros anticorpos.

De acordo com uma das realizações da invenção estudada em maior profundidade até a data do pedido, a ligação -B- compreende a estrutura -S^RCONHCHgC^COCH^CH^)^ ^0(CH2)m^{C0Y (I)}

As ligações livres na fórmula I ligam as partes activas, respeçtivamente. Isto tem lugar quer directamente quer através de outras estruturas divalentes inertes que estão compreendidas dentro da ponte -B-.

n é um inteiro 0, por exemplo 1 a 20, de preferência 2 ou '7 2 e em muitos casos cí 10. m é 1 ou 2.

S é um átomo de enxofre que se liga directamente a um átomo de earbono saturado em cada uma das suas valências (-S - = um tioéter ou um dissulfureto). r é um inteiro 1 r

ou 2.

Y é -NH-, -NHNH- ou -NHN=CH- tal que nas suas extremidades esquerdas se liga ao grupo CO que se mostra no terminal direito na fórmula I e nas suas extremidades direitas a um átomo de carbono saturado ou a um grupo carbonilo (ape nas quando Y é igual a -NHNH-).

R é de preferncia alquileno (possuindo 1 a 4 átomos de carbono, frequentemente 1 ou 2 átomos de carbono), que possivelmente é substituído por 1 ou mais (1 a 3, no caso preferido 2) grupos hidroxi (OH).

Preparação do conjugado anticorpo-suprantigénio

Os conjugados de anticorpo da presente in venção podem ser obtidos por enriquecimento e purificação sua de meios de cultura ou células que os produzem, ou de outros meios em que eles foram sintetizados.

A sintese dos novos conjugados pode ser feita por técnicas conhecidas para a síntese de conjugado,isto é engenharia genética (técnicas recombinantes) ou através de anticorpos e superantigénios convencionais adequados por acoplamento clássicas em grupos funcionais adequados. Os grupos funcionais presentes em proteínas e normalmente utilizados são (i) Estruturas de carbohidrato. Esta estrutura pode ser oxidada para grupos aldeído que por sua vez são feitos rea gir com um composto que contém o grupo l^NNH- para a formação de um grupo -C=NH-NH-.

(ii) Grupo tiol (HS-). 0 grupo tiol pode ser feito reagir com um composto contendo um grupo tiol reactivo para a formação de um grupo tioéter ou grupo dissulfureto. Os grupos tiol livres de proteínas estão presentes em resí. duos de cistina e podem ser introduzidos em proteínas por tiolação ou dividindo os dissulfuretos em resíduos de cisteína nativos.

(iii) Grupos amino livres (H₂N-) em resíduos de aminoácidos. Pode ser feito reagir um grupo amino com um composto contendo um grupo electrófilo, tal como um grupo carboxi activado, para a formação de um grupo amido. 0 grupo amino livre é de preferência um terminal amino do grupo amino omega de um resíduo de lisina.

(iv) Grupos carboxi livres em resíduos de aminoácidos. Pode ser transformado um grupo carboxi num grupo carboxi reac tivo (activado) e em seguida feito reagir com um composto contendo um grupo amino para a formação de um grupo amido. Contudo, devem ser tomadas em consideração precauções para minimizar a formação de amida com os grupos amino que estão na maior parte presentes em conjunto com os grupos carboxi na mesma proteína. 0 grupo

-carboxi livre é de preferência um grupo carboxi terminal ou um grupo carboxi de um alfa aminoácido diacídico.

Os compostos que contêm um grupo E^NNHuml grupo reactivo com tiol, um grupo carboxi activado, ou = 12 =

um grupo amino podem ser reagentes de acoplamento bifuncionais ou um anticorpo ou um superantigénio. Os grupos estão ligados directamente a átomos de carbono saturados com excepção do grupo H₂NNH- que como alternativa pode ser ligado a um grupo earbonilo. Os grupos podem ser introduzidos no anticorpo ou no superantigénio por derivação comum.

As técnicas recombinantes proporcionam um sistema eficiente para a preparação de conjugados em que as partes são especificamente ligadas em conjunto a partir de um grupo carboxi terminal num radical a um grupo amino terminal no outro radical. Pode ser inserida uma estrutura de ligação consistente oom a técnica aplicada.

Os reagentes utilizados são escolhidos de forma a proporcionar a ligação -B- tal como acima definida. Os reagentes bifuncionais comuns têm a fórmula Z-B’-Z’ em que Z e Z’ são grupos funcionais que são mutuamente coerentes uns com os outros e que permitem o acoplamento covalente num grupo funcional presente numa proteína. Ver acima. B’ é uma ponte inerte que pode conter as mesmas estruturas dadas para a ligação -B- anterior. Z e Z’ podem em particular ser idên ticos ou diferentes e serem escolhidos de entre um grupo tiol, um grupo tiol reactivo, um grupo carboxi activado, -C0NHNH₂> etc. Para uma definição deste grupo ver abaixo segundo o título Reagentes Novos.

processo que foi utilizado para os con jugados utilizados na parte experimental compreende as fases de (i) fazer-se reagir o anticorpo ou o superantigénio com um reagente orgânico contendo um grupo reactivo com teol e um grupo reactivo com amino para a formação de um anticorpo ou de um superantigénio tendo o grupo reactivo com tiol, e (ii) fazer-se reagir a parte restante do superantigénio e do anticorpo com um reagente orgânico contendo um

grupo tiol ou um grupo tiol protegido e um grupo reac· tivo com amino para a formação de um superantigénio ou de um anticorpo contendo o grupo tiol ou um grupo tiol protegido, e em seguida (iii) os produtos obtidos das fases (i) e (ii), respectivamente, são feitos reagir uns com os outros para a formação de um conjugado em que o superantigénio está ligado ao anticorpo através de um dissulfureto ou de um tioéter.

As condições de acoplamento para cada gru po são conhecidas e são as aplicadas à química das proteínas.

A reacção de acoplamento pode dar-se em fases ou de uma só vez por criação de grupos intermédios que podem estar ligados ao material de partida por braços espaçadores inertes. Em geral as condições que a síntese e a purificação/recuperação do conjugado tem lugar são sempre não-desnaturantes para as proteínas envolvidas. Isto normalmente significa meios aquosos e um valor de pH e temperatura na gama de pH 3 a 10 e 0 a 509C, respectivamente. Os valores exactos dependem dos grupos que se preten dem fazer reagir e do conjugado a ser recuperado. Ver mais por menores segundo o título Reagentes Novos.

Reagentes novos (desenvolvidos em ligação com a invenção).

Para a síntese química em conjugados que possuem a ligação -Β-, foi desenvolvido um novo reagente heterobifuncional que obedece à fórmula geral (II):

z₁rconhch₂ch₂(och₂ch₂)_no(ch₂)_mz₁’ (II) men têm a mesma significação anterior para a fórmula (I).

Z^ é um grupo electrofilo reactivo com HS, um grupo tiol (-SH) ou tiol protegido por exemplo AcS-, com a condição de não estar ligado um grupo tiol e um grupo hidroxi a um mesmo átomo de carbono em R. Exemplos de grupos electrófilos reagentes eom S são:

(i) halogéneo que está ligado a um átomo de carbono

saturado, de preferência sob a forma de um alfa-halo-alquilcarbonilo (por exemplo Z^CHgCO-);

(ii) tiol activado, de preferência um designado por dissulfureto (-SSRp que está ligado a um átomo de carbono saturado ;

(iii) 3,5-dioxo-1-a2a-ciclopent-3-en-1-ilo.

Para uma definição de dissulfureto reactivo por exemplo ver EP-A- 128 885 que é aqui incorporada oomo referência.

Z^’ é um grupo carboxi activado, isto é um grupo electrofílico. Exemplos são halogenetos de ácidos carboxílicos (-COC1, -COBr, e -COI), anidridos de ácidos carboxílicos mistos (-COOORp, ésteres reactivos, tal como N-succinimidiloxicarbonilo, -C(=NH), -OR , 4-nitrofenilcarboxilato (-ΟΟ-ΟΟθΗ^ΝΟ^), etc. R^ e Rg podem ser alquilo inferior (1-6C) e Rg também benzilo.

Uma das vantagens destes novos reagentes é de que eles resultam numas substâncias conjugadas uniformes em relação ao inteiro n na estrutura (OCHgCHg)^, isto é, n é o mesmo para cada molécula individual de uma da da substância conjugada.

Os grupos funcionais que reagem com Z^^f e Z^ podem estar presentes nas moléculas activas de anticorpo nativo ou de superantigénios nativos ou podem ser introduzidos neles. Os terminais Z^’ e Z^ podem em seguida ser rea gidos selectivamente com o anticorpo ou superantigénio adquado de forma conhecida para este tipo de grupos.

As técnicas conhecidas incluem o alongamento da cadeia quer partindo do novo reagente que de compos tos que serão conjugados.

alongamento de cadeia que utiliza o nosso reagente pode por exemplo resultar em conjugados em que

-B- é:

(1 ) -C0R’-S_r-RC0NHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)_n0(CH₂)_mC0Y-;

CO liga-se a NH, (2) -C0R’-S_r-RC0NHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)_n0(CH₂)_mC0NHNH-R’ NHN+-;

N= está habitualmente ligado a um átomo de carbono hibridizado em sp derivado de uma estrutura de carbo-hidrato oxidada num anticorpo ou superantigénio (quando for uma glicoproteina), (3) -CG(CH_O) O(CH₉CH„O) CH₉CH„NHCOR’-S -(cont.) — 2 m 2 2 n 2 2 r (cont.)-rconhch₂ch₂)och₂ch₂)_n°(ch₂)_mcoY-;

(4) -C0(CH₂)_m0(CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂NHC0R’-S_r-(cont.) (oont.)-RC0NHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)_n0(CH₂)_mCONHNH-RNHN+;

está ligado como acima em (2),

R, R’ e R” são alquileno escolhido da mesma forma que R na fórmula (I). r tem a mesma significação anterior.

reagente com a fórmula (II) pode ser preparado partindo de compostos que obedecem à fórmula III:

nh₂ch₂ch₂(och₂ch₂)_no(ch₂)_mCOOH (III) m é igual ao inteiro 1 ou 2. n é igual a um inteiro 1 a 20, como por exemplo 2 a 20 ou 3 a 9.

A síntese de alguns compostos que obedecem à fórmula III em que n = 1 e 2, e n = 1 a 10 foram já descritos (Jullien e col., Tetrahedron Letters 29(1988)3803-06; Houghton e Southby, Synth. Commun. 19(18)(1989)3199-3209; e EP-A-410,280 (publ. 20.1.91) e Slama e Rando, Carbohydrate Research 88(1981)213-221 e Biochemistry 19(1980) 4595-4600).

Os novos reagentes que obedecem à fórmula II podem ser sintetizados fazendo reagir um composto com

a fórmula III com um reagente bifuncional eom a fórmula Z-B’-Z’ conhecido, em que Z = Zp B’=R” isto é como anteriormente definido para R e R’,e Z’ é carboxi activado tal como anteriormente definido. Após a reacção a função -CCOH é transformada num grupo carboxi activado, por exemplo Z^’ é um éster activado, como por exemplo N-succinimidiloxicarbonilo, 4-nitrofeniloxlcarbonilo, 2,4-dinitrofeniloxicarbonilo, etc.

Os novos compostos com a fórmula (III) e os seus novos derivados são poliéteres com a seguinte fórmula geral:

xch₂ch₂(och₂ch₂-)_n0CH₂Y (IV) n é um número inteiro de 2 a 20, de preferência de 3 a 20 ou 3 a 9. X é H₂N- incluindo a sua forma protonada (⁺H^N-) ou H₂N- substituído que se pode transformar em HgN-, de preferência por hidrólise ou redução. Exemplos são grupos amino (H₂N-) não substituídos; nitro; amido (carbamido), como por exemplo acllamido inferior (formilamido, acetilamido.......

hexanoilamido) incluindo grupos acilamido que têm substituintes que absorvem electrões no átomo de carbono alfa do radical acilo e em seguida particularmente CF^CONH-, CH^CONE^CONH, etc; ftalimidoilo que é possivelmente substituído no anel; carbamato (particularmente R^’OCONH- e (R^OCO) (R₂’0C0)N-, tal como N-(t-butiloxicarbonil)amino (Boc), N-(benziloxicarbonllo)amlno e di-(N-(benziloxícarbonilamino))amino (Z e diZ, respectivamente) que possivelmente são substituídos no anel; alquil amino em que o átomo de carbono que está ligado ao átomo de azoto está em posição alfa num sistema aromático, como por exemplo N-monobenzilamino e dibenzilamino, N-trietilamino (trifenilmetilamino) etc., incluindo grupos análogos em que o átomo de carbono de metilo (incluindo o átomo de carbono benzílico) é substituído com um átomo de silício (Si), como por exemplo N,N-di(t-butilsilil)amino; e 4-oxo-1,3,5-triazin-1-ilo incluindo aqueles que são substituídos com alquilo nas suas posições 3- e/ou 5-.

= 17 =

No que se disse anteriormente e também a seguir R^’ e R ' representam alquilo inferior, particularmente grupos alquilo secundários e terciários, e um grupo metilo que é substituído com 1 a 3 grupos fenilo que possivelmente são substituídos no anel. Os grupos alquilo inferior e acilo inferior têm 1 a 6 átomos de carbono.

Y é carboxi (-COOH incluindo -COO) ou um grupo que é transf o rmá vel em carboxi, de preferência por hi. drólise ou oxidação. Os grupos mais importantes são os grupos éster em que o átomo de carbono de carbonilo ou o átomo correspondente nos ésteres orto está ligado ao grupo metileno no terminal direito da fórmula (I). Exemplos são grupos de ésteres de alquilo (-COOR^); grupos de éster orto (CÍOR^* )β) e grupos de éster reactivo tal como acima definido. R^’ tem a mesma significação anteriormente definida para R^ ’.

Os grupos Y são -CHO, -CN, -C0NH₂, -C0NRi’R₂’ em que R^’ e R₂’ têm a mesma significação anterior .

composto com a fórmula IV pode ser sintetizado a partir de materiais de partida conhecidos por combinação de processos que são conhecidos. As vias sintéticas adequadas são:

A. Formação da cadeia.

B. Transformação dos grupos funcionais terminais.

C. Transformação de um poliéter simétrico num éter não simétrico .

D. Decomposição de uma cadeia bissimétrica em dois fragmentos idênticos.

Os materiais de partida convenientes que têm a unidade de repetição -0CH₂CH₂- estão comercialmente disponíveis. Exemplos são os oilogoetileno glicóis possuindo 2 a 6 unidades de repetição. Outros compostos adequados com os grupos terminais idênticos são os ácidos dicarboxílicos e diaminas correspondentes.

=

Os materiais de partida convenientes que possuem grupos terminais diferentes são os ácidos omega-hidroxi monocarboxílicos em que os grupos terminais estão afastados por uma ponte de polioxido de etileno puro. Estes compostos possuindo até 5 unidades de repetição foram descritos já anteriormente (Nakatsuji, Kawamura e Okahara, Synthesis (1981) p. 42).

Composições farmacêuticas e sua preparação

A composição farmacêutica da composição compreende formulações que são conhecidas no campo mas que contêm agora um novo conjugado. Assim as composições podem ter a forma de um material em partículas liofilizado, uma solução obtida esterilizada ou assepticamente obtida, um comprimido, uma ampola, etc. Podem ser utilizados veículos tal como PBS água (de preferência tamponada a um valor de pH fisiológico tal como PBS ou outro material sólido ou líquido. Em termos gerais as composições são preparadas sendo o conjugado misturado nela, dissolvido ou de outra forma combinado com um ou mais veículos insolúveis em água ou solúveis em água aquosos ou não aquosos, se necessário em associação com aditivos e ad juvantes adequados j é imperativo que os aditivos e as condições não afectem prejudicialmente a actividade do conjugado. A água é incluída tal e qual dentro dos veículos descritos. Administração e métodos de utilização

Geralmente os conjugados são vendidos e administrados em dosagens pré-fixadas, contendo cada uma uma quantidade eficaz do conjugado que, com base no resultado que agora se apresenta se pensa ser na gama de 10/ug a 50 mg. A dosagem exaeta varia de caso para caso e depende do peso e da idade do paciente, via de administração, tipo de doença, ant£ corpo, superantigénio, ligação (-B-) etc.

A via de administração é a habitualmente conhecida no campo, isto é uma quantidade eficaz para efectuar a lise de uma célula alvo ou uma quantidade terapeu

ticamente eficaz de um conjugado de acordo com a invenção que é feito contactar com as células alvo. Para as indicações aci ma especificadas isto representa principalmente uma administra ção parentérica, como por exemplo uma injecção ou infusão (sub cutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular) a um mamífero, como por exemplo um ser humano. 0 conjugado pode ser administrado localmente ou sistemicamente ao indivíduo que se pretende tratar.

Por quantidade que efectua a lise da cé lula alvo pretende-se dizer que a quantidade é eficaz na activação e deslocação de CTL para destruir a célula alvo.

A invenção é definida nas reivindicações anexas que constituem parte da descrição. A invenção será ago ra ilustrada por algumas realizações que de modo algum limitam o conceito geral da descoberta. A parte experimental apre senta na Parte I a síntese química dos conjugados e na Parte II os efeitos dos conjugados preparados no exemplo 4 na activação das células-T para lise de células alvo.

PARTE EXPERIMENTAL. PARTE 1.

PREPARAÇÃO DO ÁCIDO ómega-AMINO-PEG-CARBOXÍLICO

8-Hidroxi-3,6-dioxa-octanoato de isopropilo (1),

Foi adicionado sódio (23 g, 1,0 moles) sob a forma de aparas em porções a dietileno glicol (500 ml) numa atmosfera de azoto. Quando o sódio reagiu completamente a mistura foi arrefecida para a temperatura ambiente e foi adi. cionado ácido bromoacético (76 g, 0,5 moles) com agitação. Passadas 18 horas a 100°C foi separado por destilação o excesso do dietileno glicol a uma porção de cerca de 532 Pa. Em seguida foram adicionados álcool isopropílico (400 ml) e em porções cloreto de acetilo (51 g, 0,65 moles). Após agitação durante 18 horas a 65°C a mistura foi arrefecida para.a. temperatura ambiente e neutralizada com acetato de sódio (3,5 g, ,-X'*'’

0,15 mmoles. A mistura foi filtrada e o filtrado foi evaporado quase até à secura, após o que foi dissolvido em água (200 ml). Foi extraída a fase aquosa com 1,1,1-tricloroetano (3 x 50ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água (20 ml). 0 produto foi extraída das fases aquosa combinadas com diclorometano (50 ml) que após evaporação produziu um óleo (55 g).

1l-Hidroxi-3,6,9-trioxa-undecanoato de isopropilo (2).

Foi adicionado sódio (23 g, 1,0 mole) sob a forma de aparas em porções a trietileno glicol (700 ml) numa atmosfera de azoto. Quando o sódio reagiu completamente, a mistura foi arrefecida para a temperatura ambiente e foi adi cionado ácido bromoacético (76 g, 0,5 moles) com agitação. Passadas 18 horas a 100°C foi separado por destilação o excesso de dietileno glicol a uma pressão de cerca de 532 Pa. Em segui da foram adicionados álcool isopropílico (400 ml) e em porções cloreto de acetilo (51 g, 0,65 moles). Após agitação durante 18 horas a 65°C a mistura foi arrefecida para a temperatura ambite e neutralizada com acetato de sódio (3,5 g, 0,15 moles) A mistura foi filtrada e o filtrado foi evaporado quase até a secura, após o que foi dissolvido em água (200 ml). Foi extraí da a fase aquosa com 1,1,1-tricloroetano (3 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com água (20 ml). 0 pro duto foi extraído das fases aquosa combinadas com diclorometano (50 ml) que após evaporação produziu um óleo.

¹H-r.m.n. (CDClg); £ 1,26 (d, 6H); 3,07 (s, 2H); 3,6-3,8 (m, 12H); 4,11 (s, 2H); 5,09 (m, 1H)

8-(N-ftalimidoilo) -3,6-dioxa-octanol (3)»

Foi dissolvido o 8-cloro-3,6-dioxa-octa nol (365 g, 2,2 moles preparado de trietileno glicol e SOC1₂) em dimetilformamida (400 ml) e foi adicionado com agitação ftalimida de potássio (370 g, 2,0 moles). Após agitação durante 18 horas a 110°C foi separada por destilação a dimetil21

no (1,5 1) a 40-50°C e foi separado por filtração o cloreto de potássio. 0 produto cristaliza por arrefecimento (-10°C). For ma-se uma segunda fracção a partir das águas mães por concentração sua e por repetição do procedimento de cristalização.

¹H-r.m.n. (CDCl^; J' 2,90 (s, 1H); 3,51-3,58 (m, 2H); 3,60-3,68 (m, 6H); 3,73-3,78 (t, 2H); 3,89

-3,94 (t, 2H); 7,70-7,89 (m, 4H).

17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentahoxa-heptadecanoato de isopropilo (4).

Foi adicionada gota a gota com agitação a cerca de -5°C uma solução de piridina (2,8 ml, 35 mmoles) em diclorometano (30 ml) a uma solução (8-(N-ftalimidoil)-3,6-dioxa-octanol (3) (8,5 g, 36 mmoles) e anidrido do ácido trifluorometanossulfónico (10,2 g, 36 mmoles) emdiclorometano. Após cerca de 30 minutos a fase orgânica foi lavada com ácido clorídrico 0,5 M e água. Após secagem (Na₂SD0^) e filtração foram adicionados 8-hidroxi-3,6-dioxa-octanoato de isopropilo (1) (12 g, 48 mmoles) e ^Na2^POi| (6,5 g, 46 mmoles), e a mis tura foi vigorosamente agitada durante 20 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado foi evaporado. A mistura foi repetida entre 1,1,1-tricloroetano e água. A evaporação da fase orgânica produziu um óleo (13g)· ¹H-r.m.n. (CDCl^; J 1,26 (d, 6H); 3,58-3,76 (m, 18H);

3,90 (t, 2H); 4,11 (s, 2H); 5,09 (m,

1H); 7,70-7,89 (m, 4H).

Acido 17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxa-heptadecanóioo (5).

Foi dissolvido o 17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoato de isopropilo (4) (13g) em tetrahidrofurano (50 ml) e áoido clorídrico (cone., 50 ml).

Passadas 16 horas à temperatura ambiente a solução foi diluída com água (200 ml) e foi removido o tetrahidrofurnao a pressão reduzida. A fase aquosa foi lavada com tolueno (1 x) e extraí da com diclorometano (2 χ). A secagem (Na₂S0^) e evaporação da fase orgânica produziram um produto sob a forma de um óleo (8,5 g).

¹H-r.m.n. (CDClg); 3,57-3,76 (m, 18H); 3,91 (t, 2H);

4,11 (s, 2H); 4,8 (largo, 2H); 7,65-7,90 (m, 4H)

17-Amino-3,6,9,12,15-pentaoxa-heptadecanoato de isopropilo (6)

Foi dissolvido o ácido 17-(N-ftalimidoil)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (5) (8,5 g) em 150 ml de etanol e 3 ml de hidrato de hidrazina. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas e em seguida foi adicionado HCl (100 ml, 3M) e a solução foi em seguida submetida a refluxo durante 3 horas. Após arrefecimento à temperatura ambiente e filtração, o pH foi ajustado (pH 9, NaOH) e o filtrado foi evaporado quase até à secura. Foi adicionada água e a evaporação quase até à secura foi de novo efectuada, após o que foi ajustado o valor do pH da solução (pH 4, HCl) seguido de evaporação à secura. 0 produto foi tratado com isopropanol (100 ml) e cloreto de acetilo (2 ml) à temperatura ambiente durante a noite e em seguida evaporada. Foi recolhido resíduo em água e extraído em diclorometano a um valor de pH alcalino (7-11). A evaporação deu origem ao produto (3,3 g).

¹H-r.m.n. (CHgOD): cf 1,26 (d, 6H); 3,17 (t, 2H); 3,65-3,80 (m, 18H); 4,16 (s, 2H); 5,07 (m, 1H) = 23

FÓRMULAS DOS ÁCIDOS AMINO-PEG-CARBOXÍLICOS SINTETIZADOS

N-(0CH₂CH₂)_nCH₂C0-0CH(CH₃)₂

Composto 1: n = 1 Composto 2: n = 1

PhtN-CH₂CH₂-(0CH₂CH₂)₂OH Composto 3, PthN- = N-ftalimidoil

PhtN-CH₂CH₂-(0CH₂CH₂)₄CH₂CO-OCH(CH₃)_p Composto 4, PhtN- = N-ftalimidoilo

PhtN-CH₂CH₂- (0CH₂CH₂) ^C^CO-OH Composto 5 h₂n-ch₂ch₂-(och₂ch₂)₄ch₂co-oh

Composto 6

PREPARAÇÃO DOS REAGENTES BIFUNCIONAIS E PRODUTOS DE

ACOPLAMENTO

As fórmulas de estrutura são as apresentadas numa página sepa rada.

Exemplo 1. Preparação do éster de N-hidroxisuccinimida do áeido 17-iodoaeetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóieo

A. Preparação do ácido 17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (A)

Foi dissolvido o 17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoato de isopropilo (ver parte I da parte experimental) (1,1 g, 3,2 mmoies) em 3 ml de = 24

uma solução 1M de hidróxido de sódio e deixou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos, Foram adicionados 1,5 ml de ácido clorídrico 6M e a mistura foi evaporada à secura. 0 resíduo foi retomado em diclorometano e fil_ trado para se obterem 545 mg de ácido 17-amino-3,6,9,

12,15-pentaoxaheptadecanóico após evaporação do solvente. Foram dissolvidos 460 mg (1,39 mmoles) deste composto em 10 ml de tampão de borato a pH 8,4. A solução foi desarejada com azoto aquoso. Foi adicionada gota a gota uma solução de 432 mg (1,52 mmoles) de 2-iodoacetato de N-suceinimidilo em 5 ml de dioxano durante 1 minuto e o valor de pH foi mantido a 8,4 por adição de NaOH 5 Μ. A solução reaccional foi agitada durante 15 minutos com admissão de azoto gasoso. De acordo com a cromatografia de camada fina (eluente: CH₂Cl₂“MeOH 60:35) a reacção foi considerada completa em apenas alguns minutos. Passados 15 minutos o valor do pH da solução reaccional foi ajustada a 3 e a solução foi congelada e liofilizada. A mistura reaccional foi fraccionada numa coluna de fase inver sa PEP-RPC HR 30/26 (Pharmacia Biosystems AB) utilizando um gradiente de 0 a 13 $ de acetonitrilo com 0,1 % de ácido trifluoroacético seguido de separação isocrática a 13 $ de acetonitrilo, 0,1 de TFA. As fracções do pico desejado foram combinadas e liofilizadas obtendo-se 351 mg de ácido 17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (A). Rendimento: 76 $.

A estrutura do produto foi estabelecida com o auxílio do seu espectro de RMN. 0 espectro de q

H RMN (0₂0) expresso em valores-d:

ICH₂C 4,23 s, 0CH₂C0H 3,76 s 0 0

-0CH₂CH₂0- 3,71-3,76, -NHCH₂CH₂0- 3,65 t,

-NHCH₂CH₂0- 3,41 = 25 =

Β. Preparação do éster de N-(hidroxisuccinimida) do ácido

17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (B)

Foi pesada hidroxisuccinimida (34,5 mg, 39 umoles) num frasco de reacção. Foi dissolvido o ácido 17-iodoacetilamino-3 6 ,9,12,5-pentahexaheptadecanóico (A) (18,3 mg, 39 umoles) em 0,55 ml de dioxano seco e foi adi cionado ao frasco da reacção. 0 frasco foi desarejado com azoto gasoso e em seguida foi adicionada gota a gota uma solução de 8,0 mg (39 umoles) de diciclohexilcarbodiimida em 0,15 ml de dioxano seco ao frasco da reacção. 0 frasco foi cheio com azoto gasoso, fechado e colocado no escuro. Agitou-se a solução reaccional durante 3,5 horas. 0 precipitado formado foi removido por filtração. A percentagem do produto B formado no filtrado foi determinada por análise de RMN e deu o valor de 89 5&.

Exemplo 2. Preparação de (17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadeeanoilamino)-imunoglobulina (C)

A. Anticorpo monoclonal Mab C215

Foi adicionado ao frasco de reacção um anticorpo monoclonal da imonoglobulina classe IgG2a (Mab C215) (34 mg,

0,218 /imoles) em 17,7 ml de tampão de borato 0,1 M pH 8,1 contendo 0,9 $ de cloreto de sódio. Foram injectados 146 ul de uma solução em dioxano contendo 3,6 mg (6,4 jumoles) do éster de N-hidroxisuccinimida do ácido 17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (B) na solução tampão e a reacção foi completada oom agitação durante 25 minutos à temperatura ambiente. 0 frasco da reacção foi coberto com uma folha para evitar a absorção de luz. 0 excesso do reagente B foi removido por fraccionamento numa coluna Sephadex G 25 K 26/40 utilizando um tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,5 contendo 0,9 $ de cio reto de sódio como eluente. As fracções contendo o produto C desejado foram combinadas. Concentrou-se a solução (22 ml) numa célula Amicon através de um filtro

ΥΜ 30 até 8 ml. A concentração eo grau de substituiçãô fo ram determinados com auxílio de análises de aminoácidos e deram o valor de 4,7 mg/ml e 18 espaçadores por Mab C215 respectivamente.

B. Anticorpo monoclonal Mab C242

Fez-se reagir um anticorpo monoclonal (Mab C242) da classe das imunoglobulinas IgG 1 com 15,20 e 22 vezes o excesso molar do éster do N-hidroxisuccinimida do ácido 17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (B) respectivamente de acordo com o procedimento descrito no exemplo 2-A produzindo nona, dodeca e tetradeca(17-iodoacetilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico)-Mab C242. (C)

C. Anticorpo monoclonal Mab C

Fez-se reagir um anticorpo monoclonal (Mab C) da classe das imunoglobulinas IgG 2a com 14 e 18 vezes o excesso molar do éster de N-succinimida do áci. do 17-iodoacetilamino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanóico (B) respectivamente de acordo com o procedimento descrito no exemplo 2A produzindo tetra e hepta (17-iodoacetilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxa-heptadecanoilamino)-Mab C.(C)

Exemplo 3· Preparação de enterotoxina A de estafiloeoeos 3 marcada com 2-mercaptopropionolamino-Eu (SEA) +*

A. Preparação do SEA (D) marcado com Eu—

Foi dissolvido o SEA (produto liofilizado da Toxin Technology Inc.) (2 mg, 72 nmols) em 722 /il de água milli-Q e adicionou-se a uma tubo de 15 ml de po. lipropileno. Foram adicionados 100 /il de tampão de fosfato 0,1 M a pH 8,6 e em seguida 2160 nmoles de reagentes de Eu'⁵⁺-quelato (Pha rmaeia Wallac OY) em 178 /il de milli -Q. A reacção foi completada à temperatura ambiente duran= 27 te a noite. 0 reagente em excesso foi removido por fraccionação da solução reaccional numa coluna Sephadex G 25 PD 10 (Pharmacia Biosystems AB) utilizando um tampão de fosfato 0,1 M a pH 8,0 como eluente. As fracções com o produto pretendido B foram combinadas. A solução (3 ml) foi concentrada numa célula Amicon através de um filtro de YM5 para o volume de 0,8 ml. A concentração foi determinada com a análise de aminoácidos e deu o valor de 1,7 mg/ml. 0 grau de substituição foi determinado comparando com uma solução padrão de EuCl^ θ deu o valor de 0,8 Eu^J+ por SEA.

Preparação de SEA (E) marcado com 3-(2-piridiltio)propionolamino Eu— e SEA (F) marcado com 3-mercapropropionol„ 3+ amino-Eu

Foi adicionado Eu^⁺-SEA (1,24 mg, 44,8 nmoles) em 0,75 ml de tampão de fosfato 0,1 M a pH 8,0 a um tubo de 15 ml de polipropileno. Foram adicionados 35 /il (180 nmoles) de uma solução de 1,6 mg de 3-(2-piridiltio)-propionato de N-succinimidilo em 1 ml de etanol ao tubo e a solução reaccional foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. 0 produto obtido E não foi isolado antes de ser reduzido para o produto F.

À solução reaccional acima obtida foram 3 i adicionados 20 Ail de uma solução 0,2 M de Eu³ -citrato e 50/ul de ácido acético 2M para ajustar o valor de pH a 5. Em seguida foi adicionada uma solução de 3,1 mg de ditiotreitol (Merck) em 0,1 ml de uma solução a 0,9 $ de cio reto de sódio e a solução reaccional foi agitada durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi ajustado o volume total a 1 ml por adição de 50 ul de uma solução a 0,9 % de cloreto de sódio. A solução reaccional (1 jul) foi colocada numa coluna Sephadex G25 NAP 10 (Pharmacia Biosystems AB) e o produto desejado F foi eluído por adição de 1,5 ml de um tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,5 con

tendo 0,9 $ de cloreto de sódio. 0 produto eluído F foi recolhido num tubo de 15 ml de polipropileno e foi imediatamente utilizado na síntese do produto G para evitar a re-oxidação para um composto do tipo dissulfureto.

B. 2. Preparação de enterotoxina A de estafilococos de 2-mercapropropionilamino SEA (F2)

Fez-se reagir SEA nativo (produto liofilizado da Toxin Technology Inc.) ou SEA preparado por técnicas recombinantes (rSEA) com 2 vezes o excesso molar de 3-(2-piridiltio)-propionato de N-succinimidilo de acordo com o procedimento descrito no exemplo 3B1.

grau de substituição foideterminado por análise de UV de acordo com Carlsson e col. (Biochem. J. 173(1978)723-737) e deu o valor de 1,9 grupos de mercaptopropionilo por SEA.

Exemplo 4. Preparação do conjugado SEA-antieorpo monoclonal (G1 oeh G2)

A. Conjugados entre Eu^⁺-SEA e Mab C215 (G1)

À solução de SEA (F) marcada com 4-merπ .captopropionilamino Eu^J+ descrita no exemplo 3B foram adicionados 1,2 ml de uma solução de octadeca(17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino) Mab C215 (C) (4 mg) em tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,5 con tendo 0,9 % de cloreto de sódio. A solução foi completada por repouso à temperatura ambiente durante a noite.Os grupos de iodoalquilo não reagidos foram em seguida bloqueados por adição de 5/ul (1,2 umoles) de uma solução de 20 Ail de mercaptoetanol em 1 ml de água. A solução reaccional foi deixada durante 4 horas à temperatura ambiente e em seguida filtrada. 0 filtrado foi em seguida frac cionado numa coluna Superose 12 HR 16/50 (Pharmacia Biosystems AB) utilizando como eluente tampão de fosfato de

0,002 M a ρΗ 7,5 contendo 0,9 $ de cloreto de sódio. As fracções com o produto G pretendido foram combinadas e analisadas. 0 teor de proteína era de 0,002 mg/ml determinado por análise de aminoácidos. 0 grau de substituição era de um SEA por IgG determinado por avaliação de Eu° . 0 produto foi também estudado para determinar as proprie dades imunoestimulantes e capacidades de ligação a anticorpos .

Aumentando a quantidade do composto (F) em relação ao composto (C) foi obtido um maior grau de substituição.

B. Conjugados entre rSEA e Mab C215 (G2)

Fez-se reagir o (17-iodoacetil~amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino)Mab C215 (C) com um excesso de 1,8 vezes molar de 2-mercaptopropionolamino-rSEA (F2) de acordo com o procedimento descdrito no exemplo 4A. A composição do conjugado foi utilizada por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) num gradiente de 4 a 15 e as ligações foram escrutinadas com PHast IMAGE (Pharmacia Biosystems AB). 0 conjugado obtido éra constituído por 6 % de Mab C215 com três SEA, 15 % oom dois SEA, 28 % com um SEA e 51 % com Mab C125 não substituído.

Noutra experiência foi utilizado um ex-^; cesso 2,7 vezes molar de F2 obtendo-se um conjugado com a composição de 15 $ de Mab C215 com três SEA, 25 $ com dois SEA, 34 % com um SEA e 26 $ com Mab C215 nãosubstituído.

C. Conjugados entre rSEA e Mab C242

C1. Fez-se reagir o tetradeca(17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15 -pentaoxaheptadecanoilamino)Mab C242 (C) com um excesso 3,2 vezes molar de 2-mercaptopropionoloamino-rSEA (F2) de acordo com o procedimento descrito no exemplo 4A. A = 30 =

composição do conjugado foi analisada da forma descrita no exemplo 4B e verificou-se ser de 4 % Mab C242 com quatro s SEA, 12 $ com três SEA, 28 $ oom dois SEA, 36$ com um SEA e 20 $ com Mab C242 não substituído.

Foi efectuada a mesma reacção mas o pro duto da reacção foi tratado durante quatro horas com hi droxilamina 0,2 N antes da fraccionação em coluna para remover as ligações instáveis entre Mab C242 e 0 espaçador e entre SEA e o grupo mercaptopropionilo. 0 conju gado formado tinha a composição de 1 % Mab C242 com quatro SEA, 12 % com três SEA, 27 % com dois SEA, 36 5Ê com um SEA e 24 $ com Mab não substituído.

C2. Fez-se reagir 0 dodeca(17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15pentahexaheptadecanoilamino)Mab C242 (C) com um excesso 3 vezes molar de 2-mercaptopropionoloamino-rSEA (F2) de acordo com o procedimento descrito no exemplo 4A. A composição do conjugado foi analisada da forma descrita no exemplo 4B e verificou-se ser de 6 $ Mab C242 com três SEA, 26 $ com dois SEA, 36 % com um SEA e 31 % com Mab C242 não substituído.

C3. Fez-se reagir o nona(17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15pentaoxaheptadecanoilamino)Mab C242 (C) com um excesso três vezes molar de 2-mercaptopropionoloamino-rSEA (F2) de acordo com o procedimento descrito no exemplo 4A. A composição do conjugado foi analisada da forma des_ crita no exemplo 4B e verificou-se ser de 13 $ Mab C242 com dois SEA, 39 $ com um SEA, e 46 $ com Mab C242 não substituído.

D. Conjugado entre rSEA e Mab C

D1. Fez-se reagir o Hepta(17-iodoacetil-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino)Mab C com um excesso 5,4 vezes molar de 2-mereaptopropioniloamino-rSEA (F2) de acor do com o procedimento descrito no exemplo 4A. A compo31

sição de conjugado foi analisada da forma descrita no exemplo 4B e verificou-se ser de 15 $ Mab C242 com quatro SEA, 24 $ com três SEA, 29 com dois SEA, 19% com Mab C não substituído e 10 $ numa forma dimétrica.

Foi efectuada a mesma reacção com hidroxilamina a 0,2 M presente para remover as ligações instáveis entre Mab C e o espaçador e entre SEA e o grupo mercaptopropionilo. 0 conjugado formado tinha a seguinte composição de 11 % com três SEA Mab C, 24 % com dois SEA, 30 $ com um SEA, 18 $ com Mab C e 17 % numa forma dimétrica.

D2. Foi feito reagir o tetra(17-iodoacetilamino)-3,6,9,12, 15-pentaoxaheptadecanoilamino)Mab C com um excesso 5,7 vezes molar de 2-mercaptopropionilamino-rSEA (F2) de acordo com o procedimento descrito no exemplo 4B. 0 conjugado tinha seguinte composição a 8 jí de Mab C2 com quatro SEA, 18 % com três SEA, 30 $ com dois SEA, 26$ com um SEA, 5 $ de Mab C não substituído e 12 $ numa forma dimétrica.

Exemplo 5 Preparação de [17-(3-mercaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxadeeanoilamino]-rSEA (I)

A. preparação de 17E3-(2-piridiltio)propionilamino]-3,6,9,12,15-pentaoxodeoanoilamino]-rSEA (H)

Foi injectada uma solução de éster de N-hidroxisuccinimida do ácido 17[3-(2-piridiltio)propionilamino]-3,6,

9,12,15-pentaoxodecanóico) (K) (0,53 mg (896 nmoles) em 43/ul de dioxano) numa solução de 3,67 mg (128 nmoles) de rSEA em 1 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7,5 contendo 0,9 $ de cloreto de sódio. A reacção foi completada em 30 minutos à temperatura ambiente. Foram retomados 100 /ul para a análise do grau de substituição. A parte restante foi liofilizada até ser reduzida para o produto I.

grau de substituição foi determinado por dessalinização de 100/ul da solução reaccional numa coluna Sephadex G50 NICK (Pharmacia Biosystems AB) e ana lisando o eluato oom espectrosoopia de UV de acordo com Carlsson e col (Biochem. J. 173(1978)723-737). Foram acoplados 2,7 espaçadores a rSEA.

B. Preparação de [17-(3-mercaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino)-rSEA (I)

Foi ajustado o valor de pH da solução reaccional oom 0' produto H (0,9 ml) com HCI 2M até pH 4,4 e foram adicionados 2,9 mg de ditiotreitol dissolvidos em 75/il de cloreto de sódio a 0,9 t>. a redução foi completada em 30 minutos. A solução reaccioanl foi adicionada a uma coluna Sephadex G25 NAP 10 (Pharmacia Biosystems AB) e eluída com 1,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M a pH 7,5 com 0,9 $ de NaCl e imediatamente utilizada na síntese do produto J no Exemplo 11.

Exemplo 6 Preparação do conjugado SEA-anticorpo monoclonal J com duplo espaçador

Foi feito reagir o dodeca(17-iodoacetilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino)Mab 0242 (C) (4,2 mg, 27 nmoles em 1,0 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7,5 com 0,9 % de NaCl) durante 43 h oom [17-(3-mercaptopropionilamino)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadecanoilamino)-rSEA (I) (1,17 mg, 42 nmoles em 1 ml do tampão acima referido) no escuro numa atmosfera de azoto. Em seguida foram adicionados 1,14 /imoles de mercaptoetanol. Passada mais 1 hora a solução reaccional foi fraccionada nuam coluna Superdex 200 HR 16/65.

produto foi eluído com tampão de fosfato 2 mM pH 7,5 com 0,9$ de NaCl. As fracções do produto J pretendido foram combinadas e analisadas da forma descrita no exemplo 4B. 0 conjugado era constituído por 9 $ de Mab C242 oom dois SEA, 25 % com um SEA e 66 $ de Mab C242 não substituído.

= 33 =

ICH₂CNHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)₄0CH₂C00H

A

ICH₂CNHCH₂CH₂(0CH₂CH₂)₄0CH₂C0N

IgG-(NHCCH₂0(CH₂CH₂0)₄CH₂CH₂NHCCH₂I)_n n = 4, 7, 9, 12, 14, 18

FI

SEA(NHCCH₀CH SH)» _o

II ^{2 9}

F2 = 34 =

S' (NHCCH₉0(CH_oCH_o0)..CH_oCH_oNHCCH_oSCH_oCH„CNH-Eu³⁺-SEA) . ., 2 2 2 4 2 2 j| 2 2 2_i(

IgG (NHCCH_o0(CH_oCH_o0)..CH_oCH_oNHCCH_oSCH_oCH₉0H;)_1fi

II ^{2 2 2 4 2 2} il ^{2 2 2 18}0 0

Gl [ NHCCH_o0( CH„CH„O)CH_oCH_oNHCCH_oSCtL0H_nCNH-SEA] f ii c. d. c. 4 2 2 jj c. 2 2 y m

0 0

G2

IgG ^k[NHCCH„0(0H_nCH_o0)..CH_oCH_oNHCCH_oSCH_oCH_o0H] || ^{2 2 2 4 2 2} |l ^{2 2 2 n}0 0 //Λ )n rSEA(NHCCH₂0(CH₂CH₂0)₄CH₂CH₂NHCCH₂CH₂SS( rSEA(NHCCH₂0(CH CH_?kCH₂CH NHCCH₂CH_?SH)

II ^ ⁴ || =

Ό

Ο

ÕD

Η

Ε

Ο (Ν

Ε

Ο <\Ι

Ε

Ο ω

Ε

Ε ο__

Ε

Ε c\i

Ε

Ο

CM

Ε

Ο ·=!·

Ο

Ε

Ε

Ο

Ε

Ε

Ο ο

Ε

Ε

Ο = 0

Ε

Ε = 36 =

PARTE EXPERIMENTAL II

Efeitos dos conjugados de superantigénio-anticorpo em células

A toxina bacteriana utilizada nas seguin tes experiências foi a enterotoxina A de stafilococus (SEA) obtida de Toxin Technologies (WI; Estados Unidos da América) ou produzida como proteína recombinante de E. Coli.

Os anticorpos foram os C215, C242 e Thy -1.2 mAb. C215 é um lGG2a mAb criado contra a linha de células do carcinoma do cólon humano e reage com o antigénio da proteína de 37kD em várias linhas de células do cíon humano. Foram dadas referências a este mAb acima. Os conjugados foram preparados da forma descrita na parte anterior.

Antes da data de prioridade foram feitos apenas estudos com conjugados SEA-C215 mAb marcados com Eu^J+. Durante o ano de prioridade os resultados foram verificados com conjugados SEA-215. SEA-242 e SEA-Thy-1.2 mAb não marcados, Os resultados agora incorporados referem-se a conjugados não marcados.

Para determinar a citocixidade mediada pelo conjugado SEA-C215 mAb e SEA C215 mAb não conjugados contra as células do carcinoma de cólon a que falta MHC da classe II ou que expressam quantidades baixas mas não detectáveis de MHC da classe II foram utilizadas várias linhas de células T expandidas com SEA humano como células efectoras e um painel de células de caroinona do cólon e células MHC Classe II⁺ Raji como células alvo. As linhas de células de carcinoma do cólon Colo205, SW620 e WlDr, eram todas definientes na expressão de MHC Classe II, como determinado por revelação com mAb contra a análise de HLA-DR, HLA-DP e HLA-DO e PACS. As linhas de células T expandidas com SEA foram estabelecidas a partir de sangue periférico por reestimulações semanais com mitomicina C tratada com células de linfoma MHC Classe II⁺ BSM pré-revestidas com SEA na presença de IL-2 recombinante (20 unidades/ml). Estas linhas de células T eram fortemente oito= 37 =

tóxicas contra células Raji ou BSM revestidas com SEA mas não a células revestidas ou a células revestidas com enterotoxina B de estafilococos (SEB). Esta eliminação induzida por SEA é dependente da interacção do SEA com MHC Classe II na célula alvo como é determinado pela utilização de anticorpos bloqueantes HLA-DR, células mutantes MHC II^- Raji e células L transfeetadas com HLA-DR (Dohlsten e col., Immunology 71 (1990) 96-100. Estas linhas de células T podiam ser activadas de forma a exterminarem as células de carcinoma de oólon pelo conjugado C215-SEA. Em contraste SEA e 0215 mAb não conjugados foram incapazes de induzir mais do que a exterminação de células T marginais contra as células de carcinoma de cólon C215⁺ MHC Classe II^- . A citotoxicidade mediada por células dependentes do conjugado de anticorpos de enterotoxina de estafilococos era dependente da ligação do conjugado SEA-C215 mAb para as células de tumor C215⁺. A especificidade nesta ligação foi demonstrada pelo facto de o excesso do conjugado C215 mAb mas não o irrelevante 0242 e W6/32 mAb que inibia a lise das células do carcinoma do oólon. As células CD4⁺ e CD8⁺ demonstraram a morte de células do carcinoma do cólon C215⁺ tratadas com SEA-C215, mas não efectuavam a lise das células tratadas com SEA. A interacção das células T com o conjugado SEA-C215 mAb ligado a células de tumor MHC Classe II parece envolver a interacção oom sequências específicas de V-beta TCR numa forma semelhante à já demonstrada para a morte induzida por SEA das células MHC Classe II⁺. Isto foi indicado pela interacção de SEA específico mas não a linhas de células T específicas de SEB autólogo com o conjugado C215-SEA. Os conjugados C242 mAb e Thy-1.2 mAb demonstram actividade em analogia oom o conjugado C215 mAb.

Marcação com crómio e incubação das células alvo com SEA

Foram incubadas 0,75 x 10θ células 51 alvo e 150 >uCi de crómio de (Amersham Corp. , Arlington Hights, Inglaterra) durante 45 minutos a 37°C num volume de 100 /il. As células forma mantidas num meio completo contendo o = 38 =

meio RPMI-164O (Gibco, Paisley, GBR) suplementado com 2,8 # (v/v) de NaHCO^ a 7,5 $, 1 $ de piruvato de sódio, 2 $ de L-glutamina 200 mM, 1 $ de Hepes 1M, 1 $ de gentamicina a 10 mg/ml e 10 $ de soro de vitela fetal (FCS. Gibco, Paisley, Grã-Bretanha). Após a incubação as células foram lavadas uma vez em meio completo sem FCS e incubadas durante 60 minutos a 37°C e lavadas e ressuspensas em meio completo contendo 10 $ de FCS (soro de vitela fetal). Foram adicionadas 5 x 10 células al_ vo a cada célula em placas de microtitulação de 96 furos de fun do redondo (Costar, Cambridge, Estados Unidos da Amérioa).

Ensaios de citotoxicidade

Foram adicionadas células efectoras aos furos a várias proporções de efector/células alvo. 0 volume fi nal em cada furo era de /ul. Cada ensaio foi conduzido em triplicado. As placas foram incubadas durante 4 horas a 37°C após o que foi recolhido o crómio libertado. A quantidade de Cr foi determinada num contador de raios gama (Cobra Auto-gamma, Packard). A percentagem de citotoxicidade foi calculada por meio da fórmual l de citotoxicidade = (X-M)/(T-M) * 100, em que X é a libertação do crómio e com cpm obtida da amostra de ensaio, M é a libertação espontânea de crómio nas células al vo incubadas com o meio, e T é a libertação total de crómio ob tido por incubação das células alvo com 1 % de dodecil sulfato de sódio.

RESULTADOS OBTIDOS

Os conjugados SEA-C242, SEA-C215 e SEA-anti-Thy-1.2 mAb ligam-se a células que expressam os epitopos relevantes de mAb respectivamente, e a células MHC Classe II⁺ 0 SEA não conjugado liga-se por outro lado apenas a células MHC Classe II⁺. Os C215, C242 e Thy-1.2 mAb não conjugados li gam-se às células relevantes mas não às células Raji. (Tabela 1)

As linhas de células T humanas lisavam as = 39 =

células MHC Classe Il“ SW620, Colo205 e WiDr na presença do conjugado SEA-C215 mAb mas não na presença de SEA e C2154 mAb não conjugado (Fig. Γ). A lise de células do eareinoma do cólon foi observada a 10-100 ng/ml do conjugado SEA C215 mAb. Foram observados elevados níveis de lise a várias proporções de efector para alvo com o conjugado SEA-C215 mAb contra SW620 (Fig. 1). Pelo contrário o SEA ou C215 mAb não conjugado não mediava a citotoxicidade contra células SW620 para todas as proporções de efector para alvo ensaiadas. Isto indica que a ca paeidade para a lise das células MHC Classe II^- Colo205 é res_ tringida ao conjugado então pode ser induzida por SEA e C215 mAb não conjugado. 0 conjugado SEA e SEA-C215 mAb mas não C215 mAb mediavam a morte de células T de células MHC Classe II⁺ Raji e de células MHC Classe II⁺ Colo205 (Fig. 1) tratadas com interferão.

Para demonstrar que a lise mediada pelo conjugado SEA-C215 mAb envolvia a ligação específica do conjugado à molécula C215 mAb nas células alvo, foram efectuados estudos de bloqueamento com C215 mAb e mAb C242 não conjugados, que se ligam a um antigénio irrelevante nas células do carcinoma do cólon (em relação à ligação de C215 mAb). A adição de mAb influenciava fortemente a citotoxicidade, enquanto que C242 mAb não tinha influência (Fig. 2). De forma semelhante a lise por um conjugado SEA-C242 mAb era especifieamente bloqueada por excesso de C242 mAb não conjugado mas não por C215 mAb.

A capacidade do conjugado SEA-C215 mAb para induzir a lise dependente de células T de células do carcinoma do cólon MHC Classe II SW620 foi verificado em populações de células T CD4⁺ e CD8⁺ (Tabela 2). SEA não fazia a activação de qualquer dos subconjuntos de células T para mediar a morte de células SW620 mas induzia a lise de células MHC Cias, se II⁺ Raji (Tabela 2).

conjugado SEA-C215 mAb induzia a lise de células SW620 e Taji por uma linha de células T expandidas • com SEA, mas não por uma linha de células T expandidas com SEB = 40

(Fig. 3). A especificidade das linhas de SEA e SEB é indicada pela sua resposta seleotiva a SEA e SEB, respectivamente, quan do expostas a células Raji (Fig. 4). Isto indioa que o conjuga do SEA-C215 mAb retem uma especificidade semelhante a V-beta TCR tal eomo para o SEA não conjugado.

Legendas das figuras

FIG. 1. 0 conjugado SEA-C215 mAb dirige

CTL contra as células do carcinoma do cólon MHC Classe II . 0 painel esquerdo superior demonstra o efeito dos CTL que respon dem a SEA contra células SW620 para várias proporções de efctor para alvo na ausência (-) ou presença do conjugado SEA-C215 mAb, SEA, C215 e mistura de C215 e SEA (C215 + SEA)a uma concentração de 1 ug/ml de cada aditivo. Os outros painéis demostram a capacidade do conjugado SEA-C215 mAb, e SEA para dirigir CTL que respondem a SEA contra as linhas de células do carcinoma do cólon C215 + MHC Classe II SW620, Colo205 e + + <

WiDr, MHC Classe II C215 tratadas com interferão células Colo 205 e células 0215- MHC Classe II⁺ Raji. A proporção de efector para alvo era de 30:1. A adição de C215 mAb não conjugado, a várias concentrações, não induzia qualquer deslocação de CTL contra essas linhas de células. A análise de FACS em cé lulas SW620, Colo205 e WiDr utilizando os mAb contra HLA-DR, -DP, -DQ, não detectava qualquer expressão superficial de MHC Classe II, enquanto que foi detectada expressão abundante de HLA-DR e -DP e -DQ em células Raji e células Colo205 tratadas com interferão. As células Colo205 foram tratadas com 1000 unidades/ml de interferão-gama recombínante durante 48 horas antes da utilização no ensaio de CTL.

Fig. 2. 0 conjugado SEA-C215 mAb e o conjugado SEA-C242 mAb induziam a deslocação de CTL contra linhas do carcinoma do cólon dependente da selectividade de antigénio do mAb. A lise das células Colo205 por uma linha de CTL que respondem a SEA na presença do conjugado SEA-C215 mAb e SEA-C242 mAb (3 (Ug/ml) é bloqueada pela adição de C215 não con= 41

jugado e C242 mAb (30 /ug/ml), respectivamente. Os mAb não conjugados ou o meio de controlo (-) foram adicionados às células alvo 10 minutos antes dos conjugados.

Fig. 3. A lise das células do carcinoma do cólon revestidas com 0 conjugado SEA-C215 mAb é mediada pelos CTL respondem a SEA mas não a SEB. Foram utilizadas linhas de células T selectivas e SEA e SEB autólogas a uma proporção de efector para alvo de 10:1 contra células alvo SW620 e Raji na ausência (controlo) ou presença do conjugado SEA-C215 mAb, uma mistura de C215 mAb e SEA (C215+SEA) não conjugado e de C215 mAb e SEB (C215+SEB) não conjugado a uma concentração de 1 yug/ /ml de eada aditivo.

Fig. 4. Citotoxicidade induzida pelo conjugado SEA, C242 mAb e conjugado SEA-Anti-Thy-1.2 mAb contra as suas células alvo (células de tumor Colo205 e células de tumor AL-4, respectivamentre).

Tabela 1 do carcinoma do colon conjugado SEA-C215 mAb liga-se a células C215⁺ e células MHC Classe II⁺ Raji.

Reagente	Célula	Análise <
SEA-C215 mAb	Colo205	Pos
	Raji	Pos
C215 mAb	Colo205	Pos
	Raji	Neg
SEA-C242 mAb	Colo205	Pos
	Raji	Pos
C242 mAb	Colo205	Pos
	Raji	Neg

= 42

Tabela 1 (Cont.)

Reagente Célula Análise de Facs

SEA-anti-Thy-1.2 mAb	EL-4	Pos
anti-Thy-1.2 mAb	EL-4	Post
SEA	Colo205	Neg
	Raji	Pos
Controlo	Colo205	Neg
	Raji	Neg
	EL-4	Neg

As células foram incubadas com os vários aditivos de controlo (PBS-BSA) durante 30 minutos em gelo, lava das e processadas da forma a seguir descrita. A revelação de C215 mAb e C242 mAb ligados a células Colo205 e anti-Thy-1.2 ligado a células EL-4 foi detectada utilizando 1g de FITC mar cado de coelho anti-rato. A revelação de SEA a células Raji foi detectada utilizando um soro de coelho anti-SEA seguido de 1g de FITC de suíno anti-coelho. A revelação do conjugado SEA-C215 mAb para células Colo205 e Raji foi detectada utilizando os procedimentos acima descritos para C215 mAb e SEA. A análise de FACS foi efectuada num dispositivo FACS ”star plus” de Becton e Dickinson. A revelação com apenas a segunda e terceira fases foi utilizada para definir o fundo.

Tabela 2

Os CTL de CD4⁺ e CD8⁺ efectuam lise das células do carcinoma do cólon apresentando o conjugado C215-SEA

X eitotoxieidade Al

Efector_Alvo_Controlo_SEA_C215-SEA

CD4⁺ SW620 2 5 50 = 43 =

Tabela 2 (Cont.) citotoxicidade

Efector^	Alvo	Controlo	SEA	C215-SEA
CD4+	Raji	0	41	43
CD8+	SW620	0	1	23
CD8+	Raji	2	72	68
A) Os CTL	(SEA-3) foram	utilizados	em proporções de efec

torpara alvo de 30:1 na ausência (controlo) ou na presença de SEA e C215-SEA a 1 /ug/ml.

Claims (1)

1. = REIVINDICAÇÕES =

   - 1§ Processo para a preparação de um conjugado caracterizado por compreender as fases:

   (i) sintetizar-se o conjugado de um anticorpo e/ou um superantigénio por acoplamento de forma conhe cida do superantigénio ao anticorpo através de pelo menos uma estrutura escolhida de entre (a) estruturas de carbohidrato, e (b) os grupos fun cionais; grupos tiol, grupos dissulfureto, gru pos carboxi e grupos amino, e (ii) recuperar-se o conjugado do meio em que ele foi sintetizado.

   = 44

   Processo de acordo com a reivindicação 1 em que se deixa prosseguir o acoplamento num grupo amino no superantigénio e/ou anticorpo e caracterizado por compreender preferivelmente as fases de (i) fazer-se reagir o anticorpo ou o superantigénio com um reagente orgânico contendo um grupo tiol reactivo e um grupo amino reactivo para a formação de um anticorpo ou de um superantigénio contendo o grupo tiol reactivo, e (ii) fazer-se reagir a parte restante do superantigénio e do anticorpo com um reagente orgânico contendo um grupo tiol ou um grupo tiol protegido e um grupo amino reactivo para a formação de um superantigénio ou de um anticorpo contendo o grupo tiol ou o grupo tiol protegido, e em seguida (iii) fazerem-se reagir os produtos obtidos das fases (i) e (ii), respectivamente, um com o outro para a formação de um conjugado em que o superantigénio está ligado ao anticorpo por meio de dissulfureto ou tioéter.

   _ ₃ã _

   Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o reagente de amino reactivo contendo o gru po tiol reactivo ser um halogeneto de alfa-haloacetilo e o composto contendo o grupo tiol ou o grupo tiol protegido ser um reagente de acoplamento bifuncional com a fórmula II

   Z₁RC0NHCH„CH„(0CH„CH_o) O(CH„) Z,’ (II) ι 2 2 2 2 n 2 m I na qual m é o inteiro 1 ou 2, n é um inteiro 1-20, é = 45 = um grupo electrófilo reactivo HS, tiol (-SH) ou tiol protegido (por exemplo AcS-), com a condição de o grupo tiol e o grupo hidroxi não estarem ligados a um mesmo átomo de carbono em R, e Zp ser um carboxi activo.

   - 4a Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 3, caracterizado por o referido superantigénio ser reconhecível por células T e ser susceptível de activar células T citotóxioas (CTLs), de preferência por interactuação com partes do complexo receptor de células T, partieularmente uma cadeia beta V de receptores de células T.

   _ 5a _

   Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 4 caracterizado por o anticorpo ser dirigido espe cifieamente contra um determinante antigénico (epitopo) presen te numa célula de tumor, como a célula associada com o carcinoma do cólon.

   - 6ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por o anticorpo ser dirigido especificamente contra o epitopo C242.

   - 7a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o anticorpo ser dirigido especificamente contra um epitopo numa proteína que pertence à família GA-733, em particular 0 epitopo C215.

   - 8§ Processo de acordo com qualquer das réi46 vindicaçSes 1 a 7 caracterizado por se acoplarem pelo menos 1 a 5, de preferência 1 a 3, partes de superantigénio serem acopladas a cada parte de anticorpo.

   _ ga _

   Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 8 caracterizado por o anticorpo ser monoclonal.

   - 10ã Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 9 caracterizado por o superantigénio ser de origem bacteriana e ser em particular escolhido no grupo consistindo em enterotoxinas de estafiloeoeos.

   - 11- Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 10 caracterizado por o superantigénio ser o SEA.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente Sueco, apresentado em 20 de Julho de 1990, sob o número de série SE 9002479-5.