JPH07238100A - ヒトのｍａｓｐに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒトのｍａｓｐに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH07238100A JPH07238100A JP6052677A JP5267794A JPH07238100A JP H07238100 A JPH07238100 A JP H07238100A JP 6052677 A JP6052677 A JP 6052677A JP 5267794 A JP5267794 A JP 5267794A JP H07238100 A JPH07238100 A JP H07238100A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セリンプロテア
ーゼ）に対するモノクローナル抗体またはその活性フラ
グメント、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの提供。 【構成】 齧歯類動物をヒトのＭＡＳＰで免疫感作し、
免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して常法に従ってマ
ウスのミエローマ細胞と融合し、選択的培養法により抗
体産生細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマ
を選別し、限界希釈法により、単一クローンにし、この
単一クローンのハイブリドーマの培養上清液からモノク
ローナル抗体を回収して得られるヒトのＭＡＳＰに対す
るモノクローナル抗体、その製造方法、及び上記のハイ
ブリドーマ。
ーゼ）に対するモノクローナル抗体またはその活性フラ
グメント、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの提供。 【構成】 齧歯類動物をヒトのＭＡＳＰで免疫感作し、
免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して常法に従ってマ
ウスのミエローマ細胞と融合し、選択的培養法により抗
体産生細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマ
を選別し、限界希釈法により、単一クローンにし、この
単一クローンのハイブリドーマの培養上清液からモノク
ローナル抗体を回収して得られるヒトのＭＡＳＰに対す
るモノクローナル抗体、その製造方法、及び上記のハイ
ブリドーマ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体に
関し、さらに詳しくは、ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セ
リンプロテアーゼ）に特異的に反応するモノクローナル
抗体、その活性フラグメント、該モノクローナル抗体の
製造方法、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマに関する。なお、本発明において、モノクロー
ナル抗体の活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を
有するフラグメントを指称し、具体的には、Ｆ（ａ
ｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ
体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などである。
関し、さらに詳しくは、ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セ
リンプロテアーゼ）に特異的に反応するモノクローナル
抗体、その活性フラグメント、該モノクローナル抗体の
製造方法、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマに関する。なお、本発明において、モノクロー
ナル抗体の活性フラグメントとは、抗原抗体反応活性を
有するフラグメントを指称し、具体的には、Ｆ（ａ
ｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ
体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）などである。
【０００２】
【従来の技術】血清中には、酵母マンナンに結合するＭ
ＢＰ（マンノース結合タンパクまたはマンナン結合タン
パクの略；ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）と呼ばれる動物レクチンが存在しており、現在
までに、ヒト、ウシ、ウサギ、ラットから単離されてい
る。いずれのＭＢＰも、分子量３０〜４０ｋＤのサブユ
ニット分子がジスルフィド結合した高分子量のポリマー
である。ＭＢＰは、マンノースとＮ−アセチルグルコサ
ミンに親和性があり、結合にカルシウムイオンを要求す
るいわゆるＣ型レクチンに属している。
ＢＰ（マンノース結合タンパクまたはマンナン結合タン
パクの略；ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）と呼ばれる動物レクチンが存在しており、現在
までに、ヒト、ウシ、ウサギ、ラットから単離されてい
る。いずれのＭＢＰも、分子量３０〜４０ｋＤのサブユ
ニット分子がジスルフィド結合した高分子量のポリマー
である。ＭＢＰは、マンノースとＮ−アセチルグルコサ
ミンに親和性があり、結合にカルシウムイオンを要求す
るいわゆるＣ型レクチンに属している。
【０００３】ＭＢＰのサブユニットは、構造上の特徴と
して、次の三つのドメインより構成されている。 ＮＨ2末側のシステインに富むドメイン、 これに続くグリシンが２つ置きに繰り返し出現するコ
ラーゲン様構造、及び ＣＯＯＨ末側のＣ型レクチンに共通して存在する高い
相同性を有するアミノ酸より構成されるＣＲＤ（ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｄｏｍａ
ｉｎ）と呼ばれる糖類認識部位。
して、次の三つのドメインより構成されている。 ＮＨ2末側のシステインに富むドメイン、 これに続くグリシンが２つ置きに繰り返し出現するコ
ラーゲン様構造、及び ＣＯＯＨ末側のＣ型レクチンに共通して存在する高い
相同性を有するアミノ酸より構成されるＣＲＤ（ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｄｏｍａ
ｉｎ）と呼ばれる糖類認識部位。
【０００４】ＭＢＰは、このサブユニットの三分子がＮ
Ｈ2末側のシステイン残基間のジスルフィド結合を介し
てつながり、一つの構造単位となっている。さらに、構
造単位どうしが、ジスルフィド結合により、分子サイズ
が多様なポリマーを形成しているが、ペンタマーとヘキ
サマーが主なポリマーである。
Ｈ2末側のシステイン残基間のジスルフィド結合を介し
てつながり、一つの構造単位となっている。さらに、構
造単位どうしが、ジスルフィド結合により、分子サイズ
が多様なポリマーを形成しているが、ペンタマーとヘキ
サマーが主なポリマーである。
【０００５】血清ＭＢＰは、グラム陰性細菌のリポ多糖
（ＬＰＳ）やウイルスの表面にあるマンノースやＮ−ア
セチルグルコサミンに結合後、次に挙げるように、生体
防御因子として機能することが次第に明らかになってき
た。 （１）ＭＢＰは、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｏｎｔｅｖ
ｉｄｅｏに結合して、食細胞機能を亢進させるオプソニ
ンとなる。これは、ＭＢＰの分子構造がＣ１ｑに類似し
ていることに基づく。Ｃｌｑは、食細胞上のＣｌｑレセ
プターを介してオプソニン活性を発揮するが、ＭＢＰも
Ｃｌｑレセプターに結合できてＣｌｑと同様な活性を示
す。 （２）ＭＢＰは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の高
マンノース型糖タンパク質のｇｐ１２０への結合によ
り、ＨＩＶの細胞への感染を抑制する。 （３）ＭＢＰには、補体活性化古典的経路及び補体活性
化第二経路による活性化能があり、ある種のグラム陰性
菌に結合後、血清存在下で殺菌的に働く。細菌表面上で
のＭＢＰによる補体活性化反応は、オプソニンであるＣ
３ｂやｉＣ３ｂの産生につながり、食細胞の貧食能を高
める結果となる。近年、酵母マンナンへのオプソニン化
不全血清が発見され、その中のＭＢＰ量が異常な低値で
あることが明らかとなり、このような血清を持つ小児に
おいて、細菌の繰り返し感染などの症状を呈する例が報
告されている。
（ＬＰＳ）やウイルスの表面にあるマンノースやＮ−ア
セチルグルコサミンに結合後、次に挙げるように、生体
防御因子として機能することが次第に明らかになってき
た。 （１）ＭＢＰは、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｏｎｔｅｖ
ｉｄｅｏに結合して、食細胞機能を亢進させるオプソニ
ンとなる。これは、ＭＢＰの分子構造がＣ１ｑに類似し
ていることに基づく。Ｃｌｑは、食細胞上のＣｌｑレセ
プターを介してオプソニン活性を発揮するが、ＭＢＰも
Ｃｌｑレセプターに結合できてＣｌｑと同様な活性を示
す。 （２）ＭＢＰは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の高
マンノース型糖タンパク質のｇｐ１２０への結合によ
り、ＨＩＶの細胞への感染を抑制する。 （３）ＭＢＰには、補体活性化古典的経路及び補体活性
化第二経路による活性化能があり、ある種のグラム陰性
菌に結合後、血清存在下で殺菌的に働く。細菌表面上で
のＭＢＰによる補体活性化反応は、オプソニンであるＣ
３ｂやｉＣ３ｂの産生につながり、食細胞の貧食能を高
める結果となる。近年、酵母マンナンへのオプソニン化
不全血清が発見され、その中のＭＢＰ量が異常な低値で
あることが明らかとなり、このような血清を持つ小児に
おいて、細菌の繰り返し感染などの症状を呈する例が報
告されている。
【０００６】ＭＢＰによる補体活性化古典的経路の活性
化のメカニズムの研究は、川嵜及びＲｅｉｄの二つのグ
ループにより行われ、１９９０年にそれぞれ発表され
た。両グループとも、マンナン上のヒトＭＢＰに補体第
一成分の亜成分の未活性型Ｃｌｒ2Ｃ１ｓ2（ヘテロ四量
体）が結合後、Ｃｌｓが活性型へ変換することを再構成
実験で示した。この結果から、補体活性化古典的経路に
おいて、ＭＢＰは、Ｃ１ｑと同様に、血清中のＣ１ｒと
Ｃ１ｓをプロテアーゼ成分として利用すると推定され
た。これに対して、最近、本発明者らは、ＭＢＰによる
補体活性化反応には、Ｃ１ｒやＣ１ｓとは別の、ＭＢＰ
と結合性を有する新たなセリンプロテアーゼが関与して
いることを明らかにした。以下に、その研究について概
要を紹介する。
化のメカニズムの研究は、川嵜及びＲｅｉｄの二つのグ
ループにより行われ、１９９０年にそれぞれ発表され
た。両グループとも、マンナン上のヒトＭＢＰに補体第
一成分の亜成分の未活性型Ｃｌｒ2Ｃ１ｓ2（ヘテロ四量
体）が結合後、Ｃｌｓが活性型へ変換することを再構成
実験で示した。この結果から、補体活性化古典的経路に
おいて、ＭＢＰは、Ｃ１ｑと同様に、血清中のＣ１ｒと
Ｃ１ｓをプロテアーゼ成分として利用すると推定され
た。これに対して、最近、本発明者らは、ＭＢＰによる
補体活性化反応には、Ｃ１ｒやＣ１ｓとは別の、ＭＢＰ
と結合性を有する新たなセリンプロテアーゼが関与して
いることを明らかにした。以下に、その研究について概
要を紹介する。
【０００７】（ＭＡＳＰの単離）従来より、血清ＭＢＰ
の精製は、固定化マンナンカラムを用いてアフィニティ
ークロマトグラフィーにより行われてきた。ＭＢＰによ
る補体活性化古典的経路における活性化のメカニズムに
関する川嵜やＲｅｉｄらの実験結果に基づけば、この精
製方法では、血清がマンナンカラムを通過すると、ＭＢ
Ｐによる補体活性化が起こり、ＭＢＰには、活性型Ｃ１
ｒ2Ｃ１ｓ2がカルシウムイオンを介して結合している可
能性があった。しかし、従来の精製方法では、たとえＭ
ＢＰ−Ｃ１ｒ2−Ｃ１ｓ2複合体がマンナン上で形成され
たとしても、ＭＢＰのマンナンカラムからの溶出にＥＤ
ＴＡが用いられていたために、精製の過程でＭＢＰとＣ
１ｒ、Ｃ１ｓが解離して、結果的にＭＢＰのみ単離され
ていたと思われた。このことは、ＭＢＰにＣ１ｒ、Ｃ１
ｓ以外の同様な活性を持つプロテアーゼがカルシウムイ
オンを介して結合していたとしても、精製過程でそれら
が失われていた可能性も含まれることを意味していた。
そこで筆者らは、ＭＢＰを複合体のまま精製する目的
で、マンナンカラムからのＭＢＰの溶出に、カルシウム
イオン存在下マンノースを用いる方法を適用した。この
溶出画分より出発して、最終的には抗ＭＢＰセファロー
スカラムを用いることにより純度の高いＭＢＰを精製し
た。次に、このようにして得られたＭＢＰ画分のＣ１ｓ
活性の有無を、古典的経路での活性化能を指標として検
討した。マンナン結合ヒツジ赤血球（Ｅｍａｎｎａｎ）
に、ＭＢＰ画分を吸着後、Ｃ４とＣ２を反応させる。こ
こで、ＭＢＰ画分中にＣ４とＣ２を活性化するＣ１ｓ活
性を持つプロテアーゼが含まれているならば、Ｅｍａｎ
ｎａｎ上で古典的経路のＣ３コンベルターゼ（Ｃ４ｂ２
ａ）が形成され、そこにＣ３からＣ９までの補体成分が
加われば、Ｅｍａｎｎａｎの溶血が起こることになる。
の精製は、固定化マンナンカラムを用いてアフィニティ
ークロマトグラフィーにより行われてきた。ＭＢＰによ
る補体活性化古典的経路における活性化のメカニズムに
関する川嵜やＲｅｉｄらの実験結果に基づけば、この精
製方法では、血清がマンナンカラムを通過すると、ＭＢ
Ｐによる補体活性化が起こり、ＭＢＰには、活性型Ｃ１
ｒ2Ｃ１ｓ2がカルシウムイオンを介して結合している可
能性があった。しかし、従来の精製方法では、たとえＭ
ＢＰ−Ｃ１ｒ2−Ｃ１ｓ2複合体がマンナン上で形成され
たとしても、ＭＢＰのマンナンカラムからの溶出にＥＤ
ＴＡが用いられていたために、精製の過程でＭＢＰとＣ
１ｒ、Ｃ１ｓが解離して、結果的にＭＢＰのみ単離され
ていたと思われた。このことは、ＭＢＰにＣ１ｒ、Ｃ１
ｓ以外の同様な活性を持つプロテアーゼがカルシウムイ
オンを介して結合していたとしても、精製過程でそれら
が失われていた可能性も含まれることを意味していた。
そこで筆者らは、ＭＢＰを複合体のまま精製する目的
で、マンナンカラムからのＭＢＰの溶出に、カルシウム
イオン存在下マンノースを用いる方法を適用した。この
溶出画分より出発して、最終的には抗ＭＢＰセファロー
スカラムを用いることにより純度の高いＭＢＰを精製し
た。次に、このようにして得られたＭＢＰ画分のＣ１ｓ
活性の有無を、古典的経路での活性化能を指標として検
討した。マンナン結合ヒツジ赤血球（Ｅｍａｎｎａｎ）
に、ＭＢＰ画分を吸着後、Ｃ４とＣ２を反応させる。こ
こで、ＭＢＰ画分中にＣ４とＣ２を活性化するＣ１ｓ活
性を持つプロテアーゼが含まれているならば、Ｅｍａｎ
ｎａｎ上で古典的経路のＣ３コンベルターゼ（Ｃ４ｂ２
ａ）が形成され、そこにＣ３からＣ９までの補体成分が
加われば、Ｅｍａｎｎａｎの溶血が起こることになる。
【０００８】本方法でアツセイすると、ＭＢＰ画分には
Ｃ４とＣ２を活性化するプロテアーゼ成分が含まれてい
ること、さらに、このＣ１ｓ様プロテアーゼ活性は、ｐ
−ＡＰＭＳＦで阻害されることから、セリンプロテアー
ゼが活性の本体であることが判明した。また、ＭＢＰ画
分には、Ｃ１ｓと同様なＣ４消費活性が認められた。そ
こで、次に、ＭＢＰ画分中のＣ１ｓ様セリンプロテアー
ゼの単離を試みた。ＥＤＴＡ存在下、ＭＢＰ画分を抗Ｍ
ＢＰセファロースカラムに通すことにより、Ｃ４消費活
性を有するＣ１ｓ様セリンプロテアーゼは、非吸着画分
に回収されてＭＢＰと分離した。このＣ１ｓ様セリンプ
ロテアーゼは、非還元下分子量約８３ｋＤで、６６ｋＤ
（Ｈ鎖）と３１ｋＤ（Ｌ鎖）の二本鎖構造の単一成分で
あった。そこで、この成分をＭＢＰ−ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＭＢＰ会合セ
リンプロテアーゼ、ＭＡＳＰ）と命名した。
Ｃ４とＣ２を活性化するプロテアーゼ成分が含まれてい
ること、さらに、このＣ１ｓ様プロテアーゼ活性は、ｐ
−ＡＰＭＳＦで阻害されることから、セリンプロテアー
ゼが活性の本体であることが判明した。また、ＭＢＰ画
分には、Ｃ１ｓと同様なＣ４消費活性が認められた。そ
こで、次に、ＭＢＰ画分中のＣ１ｓ様セリンプロテアー
ゼの単離を試みた。ＥＤＴＡ存在下、ＭＢＰ画分を抗Ｍ
ＢＰセファロースカラムに通すことにより、Ｃ４消費活
性を有するＣ１ｓ様セリンプロテアーゼは、非吸着画分
に回収されてＭＢＰと分離した。このＣ１ｓ様セリンプ
ロテアーゼは、非還元下分子量約８３ｋＤで、６６ｋＤ
（Ｈ鎖）と３１ｋＤ（Ｌ鎖）の二本鎖構造の単一成分で
あった。そこで、この成分をＭＢＰ−ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＭＢＰ会合セ
リンプロテアーゼ、ＭＡＳＰ）と命名した。
【０００９】（ＭＡＳＰとＣ１ｓの比較）ＭＡＳＰは、
ＭＢＰと複合体を形成しているＣｌｓ活性を持つセリン
プロテアーゼであり、従来の仮説によれば、Ｃ１ｓが最
有力候補として考えられた。そこで、ＭＡＳＰとＣ１ｓ
の性状を比較検討した。両者に分子サイズの明らかな違
いが見られる。Ｃ１ｓのＬ鎖にはセリンプロテアーゼの
活性セリン残基があり、これに結合するトリチウム標識
Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ（3Ｈ−ＤＦＰ）はＬ鎖に収り込まれるが、ＭＡＳ
Ｐも同様にＬ鎖がラベルされることがわかった。ポリク
ローナル抗Ｃ１ｓ抗体は、Ｃ１ｓによるＣ４消費活性を
完全に阻害するが、ＭＡＳＰによる消費活性には全く影
響を与えなかった。なお、Ｃ１ｓによるＣ４消費活性
は、Ｃ４のＣ１ａとＣ４ｂへの限定分解を意味している
が、ＭＡＳＰによってもＣ４の限定分解が確認された。
Ｃ１ｓは、Ｃ４のほかにＣ２の消費活性もあるプロテア
ーゼであるが、ＭＡＳＰも同様にＣ２消費活性を持って
いる。ＭＡＳＰのＬ鎖のＮＨ2未側部分アミノ酸配列を
決定したところ、部分的にＣ１ｓとアミノ酸の一致が見
られたが、両成分は異なるプロテアーゼであった。以上
の結果より、ＭＡＳＰとＣ１ｓとは、機能的にも構造的
にも極めて類似しているが、異なる成分であることが明
らかとなった。
ＭＢＰと複合体を形成しているＣｌｓ活性を持つセリン
プロテアーゼであり、従来の仮説によれば、Ｃ１ｓが最
有力候補として考えられた。そこで、ＭＡＳＰとＣ１ｓ
の性状を比較検討した。両者に分子サイズの明らかな違
いが見られる。Ｃ１ｓのＬ鎖にはセリンプロテアーゼの
活性セリン残基があり、これに結合するトリチウム標識
Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ（3Ｈ−ＤＦＰ）はＬ鎖に収り込まれるが、ＭＡＳ
Ｐも同様にＬ鎖がラベルされることがわかった。ポリク
ローナル抗Ｃ１ｓ抗体は、Ｃ１ｓによるＣ４消費活性を
完全に阻害するが、ＭＡＳＰによる消費活性には全く影
響を与えなかった。なお、Ｃ１ｓによるＣ４消費活性
は、Ｃ４のＣ１ａとＣ４ｂへの限定分解を意味している
が、ＭＡＳＰによってもＣ４の限定分解が確認された。
Ｃ１ｓは、Ｃ４のほかにＣ２の消費活性もあるプロテア
ーゼであるが、ＭＡＳＰも同様にＣ２消費活性を持って
いる。ＭＡＳＰのＬ鎖のＮＨ2未側部分アミノ酸配列を
決定したところ、部分的にＣ１ｓとアミノ酸の一致が見
られたが、両成分は異なるプロテアーゼであった。以上
の結果より、ＭＡＳＰとＣ１ｓとは、機能的にも構造的
にも極めて類似しているが、異なる成分であることが明
らかとなった。
【００１０】（ＭＡＳＰの活性化）ＥＤＴＡ存在下、抗
ＭＢＰセファロースカラムを用いてＭＢＰとＭＡＳＰを
分離する以前のＭＢＰ画分には、マンナンへの結合によ
るＣ４とＣ２を活性化して古典的経路のＣ３コンベルタ
ーゼを形成させる能力がある。しかし、両成分が分離す
ると、それぞれ単独では本活性は失われる。そこで、Ｍ
ＢＰとＭＡＳＰによる再構成により、活性の回復の有無
を検討した。その結果、ＥｍａｎｎａｎにＭＢＰとＭＡ
ＳＰを同時に反応させることにより、マンナン上でのＣ
３コンペルターゼ形成能が再現された。この結果は、Ｍ
ＢＰとＭＡＳＰが再会合したことを示している。
ＭＢＰセファロースカラムを用いてＭＢＰとＭＡＳＰを
分離する以前のＭＢＰ画分には、マンナンへの結合によ
るＣ４とＣ２を活性化して古典的経路のＣ３コンベルタ
ーゼを形成させる能力がある。しかし、両成分が分離す
ると、それぞれ単独では本活性は失われる。そこで、Ｍ
ＢＰとＭＡＳＰによる再構成により、活性の回復の有無
を検討した。その結果、ＥｍａｎｎａｎにＭＢＰとＭＡ
ＳＰを同時に反応させることにより、マンナン上でのＣ
３コンペルターゼ形成能が再現された。この結果は、Ｍ
ＢＰとＭＡＳＰが再会合したことを示している。
【００１１】Ｃ１ｓとの類似性より、これまで述べてき
た二本鎖構造のＭＡＳＰは、Ｃ１ｓの活性型に相当する
と推定された。このため、ＭＢＰ−ＭＡＳＰによる補体
活性化においても、ＭＡＳＰに未活性型の一本鎖ｐｒｏ
ｅｎｚｙｍｅが存在して、ＭＢＰがリガンドに結合する
ことにより、これが活性型ＭＡＳＰに変換することが予
想された。そこで、筆者らは、ヒト血清中から活性化の
抑制が期待できる条件下ＭＡＳＰを精製したところ、分
子量約９３ｋＤの一本鎖のｐｒｏｅｎｚｙｍｅを得た。
このｐｒｏｅｎｚｙｍｅＭＡＳＰは未活性型であり、Ｃ
４消費活性を持たないが、マンナン結合のＭＢＰと反応
して活性型へ変換した。
た二本鎖構造のＭＡＳＰは、Ｃ１ｓの活性型に相当する
と推定された。このため、ＭＢＰ−ＭＡＳＰによる補体
活性化においても、ＭＡＳＰに未活性型の一本鎖ｐｒｏ
ｅｎｚｙｍｅが存在して、ＭＢＰがリガンドに結合する
ことにより、これが活性型ＭＡＳＰに変換することが予
想された。そこで、筆者らは、ヒト血清中から活性化の
抑制が期待できる条件下ＭＡＳＰを精製したところ、分
子量約９３ｋＤの一本鎖のｐｒｏｅｎｚｙｍｅを得た。
このｐｒｏｅｎｚｙｍｅＭＡＳＰは未活性型であり、Ｃ
４消費活性を持たないが、マンナン結合のＭＢＰと反応
して活性型へ変換した。
【００１２】（ＭＢＰ−ＭＡＳＰとＲａ−ｒｅａｃｔｉ
ｖｅ ｆａｃｔｏｒ）脊椎動物の血清中には、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ菌のＲａタイプや大腸菌のＲ２タイプのＬ
ＰＳに含まれるグリセロマンノヘプトースやＮ−アセチ
ルグルコサミンに結合後補体活性化を起こして殺菌作用
を示すレクチンのＲａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏ
ｒ（ＲａＲＦ）が存在している。川上らによりＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｃｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに結合するマウ
スＲａＲＦについて詳細に研究されてきた。その結果、
マウスＲａＲＦとＭＢＰとの類似性が明らかとなってき
た。マウスＲａＲＦの構成成分は、少なくともＬＰＳの
糖鎖を認識する成分とＣ４／Ｃ２を活性化するセリンプ
ロテアーゼ成分からなり、前者は、ＭＢＰと、一方後者
は、ＭＡＳＰと類似している。最近、ヒトＭＢＰは、ヒ
トＲａＲＦの糖鎖認識成分であることが明らかとなっ
た。これらの事実より、ＭＢＰ−ＭＡＳＰ複合体とＲａ
ＲＦとは同一成分と考えられる。
ｖｅ ｆａｃｔｏｒ）脊椎動物の血清中には、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ菌のＲａタイプや大腸菌のＲ２タイプのＬ
ＰＳに含まれるグリセロマンノヘプトースやＮ−アセチ
ルグルコサミンに結合後補体活性化を起こして殺菌作用
を示すレクチンのＲａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏ
ｒ（ＲａＲＦ）が存在している。川上らによりＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｃｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに結合するマウ
スＲａＲＦについて詳細に研究されてきた。その結果、
マウスＲａＲＦとＭＢＰとの類似性が明らかとなってき
た。マウスＲａＲＦの構成成分は、少なくともＬＰＳの
糖鎖を認識する成分とＣ４／Ｃ２を活性化するセリンプ
ロテアーゼ成分からなり、前者は、ＭＢＰと、一方後者
は、ＭＡＳＰと類似している。最近、ヒトＭＢＰは、ヒ
トＲａＲＦの糖鎖認識成分であることが明らかとなっ
た。これらの事実より、ＭＢＰ−ＭＡＳＰ複合体とＲａ
ＲＦとは同一成分と考えられる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】ＭＢＰ−ＭＡＳＰによ
る補体活性化経路は、マンノースやＮ−アセチルグルコ
サミンを有する侵入異物を標的にして排除するシステム
であり、特に感染初期や免疫系が未発達な幼児期におい
て重要な役割を担っていると考えられる。補体活性化経
路は、これまでに、抗体を介さない第二経路と抗体が引
き金となる古典的経路とが知られていた。ＭＢＰ−ＭＡ
ＳＰの経路は、Ｃ１に始まる古典的経路とは独立した新
たな抗体を介さない活性化経路と言える。しかし、両経
路は、Ｃ１またはＭＢＰ−ＭＡＳＰが活性化物質に結合
後、未活性型セリンプロテアーゼが活性化されてＣ４と
Ｃ２の分解活性を獲得する点で極めて類似の性質を持っ
ている。ただし、Ｃ１は、抗原抗体複合体に結合後、ま
ずセリンプロテアーゼＣ１ｒが活性化されて、次に活性
型Ｃ１ｒがＣ１ｓを活性化するのに対して、ＭＢＰ画分
中にはＭＡＳＰ以外のセリンプロテアーゼ活性を持つ成
分の存在は確認されておらず、ＭＡＳＰは、Ｃ１ｒ活性
も兼ね備えたセリンプロテアーゼであると推定される。
補体系の進化上、ＭＢＰは、Ｃ１ｑよりも先に出現した
と考えられることから、Ｃ１に相当するＭＢＰ−ＭＡＳ
Ｐ複合体による活性化経路の解析は、今後古典的経路の
起源を理解する上で重要な情報を提供するものと期待さ
れる。しかし、ＭＡＳＰが生理的にどう作用するかにつ
いては、その特異抗体がないことから十分なされていな
いのが現状である。
る補体活性化経路は、マンノースやＮ−アセチルグルコ
サミンを有する侵入異物を標的にして排除するシステム
であり、特に感染初期や免疫系が未発達な幼児期におい
て重要な役割を担っていると考えられる。補体活性化経
路は、これまでに、抗体を介さない第二経路と抗体が引
き金となる古典的経路とが知られていた。ＭＢＰ−ＭＡ
ＳＰの経路は、Ｃ１に始まる古典的経路とは独立した新
たな抗体を介さない活性化経路と言える。しかし、両経
路は、Ｃ１またはＭＢＰ−ＭＡＳＰが活性化物質に結合
後、未活性型セリンプロテアーゼが活性化されてＣ４と
Ｃ２の分解活性を獲得する点で極めて類似の性質を持っ
ている。ただし、Ｃ１は、抗原抗体複合体に結合後、ま
ずセリンプロテアーゼＣ１ｒが活性化されて、次に活性
型Ｃ１ｒがＣ１ｓを活性化するのに対して、ＭＢＰ画分
中にはＭＡＳＰ以外のセリンプロテアーゼ活性を持つ成
分の存在は確認されておらず、ＭＡＳＰは、Ｃ１ｒ活性
も兼ね備えたセリンプロテアーゼであると推定される。
補体系の進化上、ＭＢＰは、Ｃ１ｑよりも先に出現した
と考えられることから、Ｃ１に相当するＭＢＰ−ＭＡＳ
Ｐ複合体による活性化経路の解析は、今後古典的経路の
起源を理解する上で重要な情報を提供するものと期待さ
れる。しかし、ＭＡＳＰが生理的にどう作用するかにつ
いては、その特異抗体がないことから十分なされていな
いのが現状である。
【００１４】本発明の目的は、ヒトのＭＡＳＰに特異的
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することに
ある。本発明者らは、ＭＡＳＰ、特に活性型ＭＡＳＰに
反応する抗体を作製すれば、容易にＭＡＳＰの生理的機
能をはじめ多くのことが解析できるのではと考え、抗体
の作製を試みた。そして、活性型ＭＡＳＰを免疫するこ
とにより、９３ｋｄのＭＡＳＰと反応するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することに成功
し、本発明を完成するに至った。
に反応するモノクローナル抗体、その活性フラグメン
ト、該モノクローナル抗体の製造方法、及び該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することに
ある。本発明者らは、ＭＡＳＰ、特に活性型ＭＡＳＰに
反応する抗体を作製すれば、容易にＭＡＳＰの生理的機
能をはじめ多くのことが解析できるのではと考え、抗体
の作製を試みた。そして、活性型ＭＡＳＰを免疫するこ
とにより、９３ｋｄのＭＡＳＰと反応するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することに成功
し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セリンプロテアーゼ）
に対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
トが提供される。また、本発明によれば、（１）齧歯類
動物をヒトのＭＡＳＰで免疫感作し、（２）免疫した齧
歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞の懸濁液を形成
し、（３）該脾細胞懸濁をマウスのミエローマ細胞と融
合促進剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、（４）
融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持しない媒
質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエローマ細
胞が融合したハイブリドーマを選別し、（５）ハイブリ
ドーマを含有する各培養穴中の上清液について、免疫感
作したＭＡＳＰとの反応性を指標として、抗体の存在を
確認し、（６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを
選択した後、限界希釈法により、単一クローンにし、
（７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収することを特徴とするヒ
トのＭＡＳＰに対するモノクローナル抗体の製造方法が
提供される。さらに、本発明によれば、ヒトのＭＡＳＰ
に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
が提供される。
ば、ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セリンプロテアーゼ）
に対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン
トが提供される。また、本発明によれば、（１）齧歯類
動物をヒトのＭＡＳＰで免疫感作し、（２）免疫した齧
歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞の懸濁液を形成
し、（３）該脾細胞懸濁をマウスのミエローマ細胞と融
合促進剤の存在下で混合して、両細胞を融合し、（４）
融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持しない媒
質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエローマ細
胞が融合したハイブリドーマを選別し、（５）ハイブリ
ドーマを含有する各培養穴中の上清液について、免疫感
作したＭＡＳＰとの反応性を指標として、抗体の存在を
確認し、（６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを
選択した後、限界希釈法により、単一クローンにし、
（７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収することを特徴とするヒ
トのＭＡＳＰに対するモノクローナル抗体の製造方法が
提供される。さらに、本発明によれば、ヒトのＭＡＳＰ
に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
が提供される。
【００１６】以下、本発明について詳述する。本発明の
モノクローナル抗体は、ヒトのＭＡＳＰに特異的に反応
するモノクローナル抗体である。より具体的には、ＭＡ
ＳＰの分子量９３ｋｄのタンパク質と反応するモノクロ
ーナル抗体である。このモノクローナル抗体の活性フラ
グメントとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメント
を指称し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆ
ａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）などが挙げられる。
モノクローナル抗体は、ヒトのＭＡＳＰに特異的に反応
するモノクローナル抗体である。より具体的には、ＭＡ
ＳＰの分子量９３ｋｄのタンパク質と反応するモノクロ
ーナル抗体である。このモノクローナル抗体の活性フラ
グメントとは、抗原抗体反応活性を有するフラグメント
を指称し、具体的には、Ｆ（ａｂ′）2、Ｆａｂ′、Ｆ
ａｂ、Ｆｖ、及び組み替えＦｖ体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）などが挙げられる。
【００１７】本発明に係るヒトのＭＡＳＰに対するモノ
クローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、以下の工程を含む方法により製造す
ることができる。 （１）前記した方法により、ヒト血清から未活性型ＭＡ
ＳＰを回収し、活性型に変換する。このヒトＭＡＳＰを
抗原として齧歯類動物（例、マウス）を免疫感作する。
免疫感作は、通常、マウスの皮下に行う。 （２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を形成する。 （３）該脾細胞懸濁液を、あらかじめ培養しておいたマ
ウスのミエローマ細胞と融合促進剤（例、ポリエチレン
グリコール）の存在下で混合して、両細胞を融合させ
る。ここで用いるミエローマ細胞としては、次の選択培
養において、抗体産生細胞と識別可能なもの（例、８−
アザグアニン耐性株）を用いる。 （４）融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持し
ない媒質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞が融合したハイブリドーマを選別する。すなわ
ち、抗体産生細胞は生存できるが、ミエローマ細胞は死
滅する選択培地（例、ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン培地；ＨＡＴ培地）中で培養することによ
り、ハイブリドーマを選別する。
クローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマは、以下の工程を含む方法により製造す
ることができる。 （１）前記した方法により、ヒト血清から未活性型ＭＡ
ＳＰを回収し、活性型に変換する。このヒトＭＡＳＰを
抗原として齧歯類動物（例、マウス）を免疫感作する。
免疫感作は、通常、マウスの皮下に行う。 （２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出して、脾細胞
の懸濁液を形成する。 （３）該脾細胞懸濁液を、あらかじめ培養しておいたマ
ウスのミエローマ細胞と融合促進剤（例、ポリエチレン
グリコール）の存在下で混合して、両細胞を融合させ
る。ここで用いるミエローマ細胞としては、次の選択培
養において、抗体産生細胞と識別可能なもの（例、８−
アザグアニン耐性株）を用いる。 （４）融合した細胞を未融合のミエローマ細胞を支持し
ない媒質中で希釈して培養して、抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞が融合したハイブリドーマを選別する。すなわ
ち、抗体産生細胞は生存できるが、ミエローマ細胞は死
滅する選択培地（例、ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン培地；ＨＡＴ培地）中で培養することによ
り、ハイブリドーマを選別する。
【００１８】（５）ハイブリドーマを含有する各培養穴
中の上清液について、前記免疫感作に用いたＭＡＳＰと
の反応性を指標として、抗体の存在を確認する（例、Ｅ
ＬＩＳＡ法）。これにより、選択培地中で増殖した細胞
の培養上清中に分泌されている抗体が、所望の抗原に対
するものか否かを決定する。 （６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した
後、限界希釈法によりクローニングして、単一クローン
にする。 （７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収する。 （８）回収したモノクローナル抗体が活性型のＭＡＳＰ
の９３ｋｄの分子量のタンパク質を識別するという特徴
を備えていることを確認する。
中の上清液について、前記免疫感作に用いたＭＡＳＰと
の反応性を指標として、抗体の存在を確認する（例、Ｅ
ＬＩＳＡ法）。これにより、選択培地中で増殖した細胞
の培養上清中に分泌されている抗体が、所望の抗原に対
するものか否かを決定する。 （６）所望の抗体を生成するハイブリドーマを選択した
後、限界希釈法によりクローニングして、単一クローン
にする。 （７）この単一クローンのハイブリドーマの培養上清液
からモノクローナル抗体を回収する。 （８）回収したモノクローナル抗体が活性型のＭＡＳＰ
の９３ｋｄの分子量のタンパク質を識別するという特徴
を備えていることを確認する。
【００１９】
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明についてより
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【００２０】［実施例１］ （１）ＭＡＳＰの精製 ヒト血清１００ｍｌからＭＡＳＰの精製を行った。精製
法は、血清１００ｍｌに対し、マンナン−セファロース
（ファルマシア社製）１０ｍｌを用いて、吸着部分を回
収した（２５ｍｌ）。この画分をさらに抗ＭＢＰ−セフ
ァロース（ファルマシア社製）５ｍｌを用いてアフィニ
ティー精製した。最終的に未活性型ＭＡＳＰ５ｍｇを回
収した。
法は、血清１００ｍｌに対し、マンナン−セファロース
（ファルマシア社製）１０ｍｌを用いて、吸着部分を回
収した（２５ｍｌ）。この画分をさらに抗ＭＢＰ−セフ
ァロース（ファルマシア社製）５ｍｌを用いてアフィニ
ティー精製した。最終的に未活性型ＭＡＳＰ５ｍｇを回
収した。
【００２１】（２）免疫感作 精製した未活性型ＭＡＳＰをＥＤＴＡ処理により活性型
ＭＡＳＰに変換した。この活性型ＭＡＳＰ１００μｇを
フロイント完全アジュバンド１００μｇと混合し、Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスの皮下に免疫感作した。１週間後、活性
型ＭＡＳＰ１００μｇをフロイント不完全アジュバント
１００μｇと混合し、同マウスの皮下に追加免疫感作し
た。この操作を１週間に１回合計４回繰り返し、免疫感
作を実施した。
ＭＡＳＰに変換した。この活性型ＭＡＳＰ１００μｇを
フロイント完全アジュバンド１００μｇと混合し、Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスの皮下に免疫感作した。１週間後、活性
型ＭＡＳＰ１００μｇをフロイント不完全アジュバント
１００μｇと混合し、同マウスの皮下に追加免疫感作し
た。この操作を１週間に１回合計４回繰り返し、免疫感
作を実施した。
【００２２】（３）融 合 上記で免疫感作したマウスから脾臓を取り出した。取り
出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６
４０培地に浮遊させ、脾細胞１×１０8個を得た。この
脾細胞を、マウス由来の８−アザグアニン耐性株（ヒポ
キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
欠損株）Ｐ３Ｕ１（２×１０7個）と、約５：１の割合
で混合し、遠心した（１５００ｒｐｍ、５分）。得られ
た細胞のペレットに、融合促進剤として５０％ポリエチ
レングリコール４０００（メルク社製）／ＲＰＭＩ１６
４０溶液２ｍｌを３７℃の温水中で撹拌しながら６分間
を要して加え、細胞融合を行った。融合後、大量（約４
０ｍｌ）のＲＰＭＩ１６４０液を加え、遠心分離して上
清を除去した。次いで、ヒポキサンチン（１００μ
Ｍ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、チミジン（１０
μＭ）を含む１０％ＦＢＳ−ＲＭＰＩ１６４０培地（Ｈ
ＡＴ）培地にて、脾細胞が１×１０6個／ｍｌになるよ
うに調製した。
出した脾臓を細断後、メッシュで濾過し、ＲＰＭＩ１６
４０培地に浮遊させ、脾細胞１×１０8個を得た。この
脾細胞を、マウス由来の８−アザグアニン耐性株（ヒポ
キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
欠損株）Ｐ３Ｕ１（２×１０7個）と、約５：１の割合
で混合し、遠心した（１５００ｒｐｍ、５分）。得られ
た細胞のペレットに、融合促進剤として５０％ポリエチ
レングリコール４０００（メルク社製）／ＲＰＭＩ１６
４０溶液２ｍｌを３７℃の温水中で撹拌しながら６分間
を要して加え、細胞融合を行った。融合後、大量（約４
０ｍｌ）のＲＰＭＩ１６４０液を加え、遠心分離して上
清を除去した。次いで、ヒポキサンチン（１００μ
Ｍ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、チミジン（１０
μＭ）を含む１０％ＦＢＳ−ＲＭＰＩ１６４０培地（Ｈ
ＡＴ）培地にて、脾細胞が１×１０6個／ｍｌになるよ
うに調製した。
【００２３】（４）ハイブリドーマの選択 上記で調製した細胞浮遊液を９６ウェル（培養穴）、マ
イクロプレート５枚に２００μｌずつ分注し、３７℃５
％ＣＯ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養し
た。２週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形
成し、増殖していることが確認できた。
イクロプレート５枚に２００μｌずつ分注し、３７℃５
％ＣＯ2下にあるＣＯ2インキュベータで細胞を培養し
た。２週間後には、ハイブリドーマのみがコロニーを形
成し、増殖していることが確認できた。
【００２４】（５）抗体の検出 ハイブリドーマが十分増殖していることが確認されたの
で、その培養上清を用い、ＭＡＳＰとの反応性をＥＬＩ
ＳＡ法にて検出することにより、抗体の検出を行った。
９６ウェルマイクロプレート（イムロン２）に、ＭＡＳ
Ｐ１０μｇ／ｍｌで、１００μｌずつコーティングした
（４℃、一晩）。その後、ＭＡＳＰを吸引除去した後、
１％ＢＳＡ・ＰＢＳを２００μｌ加え、ブロッキングを
行った（室温、２ｈ）。その後、ＰＢＳで洗浄を行い、
ハイブリドーマの培養上清２００μｌずつ加え反応させ
た。１時間の反応後、ＰＢＳで洗浄を行い、２次抗体
（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ）を加え、さらに
１時間後反応した。その後、ＰＢＳで洗浄し、オルト・
フェニレンジアミン、過酸化水素水を基質として発色反
応を行った。その後、イムノリーダーで発色しているウ
ェルの吸光度を測定した。その結果、発色しているウェ
ルの細胞を選別した。
で、その培養上清を用い、ＭＡＳＰとの反応性をＥＬＩ
ＳＡ法にて検出することにより、抗体の検出を行った。
９６ウェルマイクロプレート（イムロン２）に、ＭＡＳ
Ｐ１０μｇ／ｍｌで、１００μｌずつコーティングした
（４℃、一晩）。その後、ＭＡＳＰを吸引除去した後、
１％ＢＳＡ・ＰＢＳを２００μｌ加え、ブロッキングを
行った（室温、２ｈ）。その後、ＰＢＳで洗浄を行い、
ハイブリドーマの培養上清２００μｌずつ加え反応させ
た。１時間の反応後、ＰＢＳで洗浄を行い、２次抗体
（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ）を加え、さらに
１時間後反応した。その後、ＰＢＳで洗浄し、オルト・
フェニレンジアミン、過酸化水素水を基質として発色反
応を行った。その後、イムノリーダーで発色しているウ
ェルの吸光度を測定した。その結果、発色しているウェ
ルの細胞を選別した。
【００２５】（６）クローニング 抗体産生細胞を、限界希釈法により１コ／ウェルとなる
ように、９６ウェル・マイクロプレートに分注し、培養
した。１０日間の培養後、シングルコロニーの増殖が確
認できたため、再び（５）の抗体検出の操作を施した。
その結果、活性型ＭＡＳＰに対するクローンが得られ
た。得られたクローンは、ＩｇＧ1型のモノクローナル
抗体であり、これをＭＡＳＰ−１と命名した。
ように、９６ウェル・マイクロプレートに分注し、培養
した。１０日間の培養後、シングルコロニーの増殖が確
認できたため、再び（５）の抗体検出の操作を施した。
その結果、活性型ＭＡＳＰに対するクローンが得られ
た。得られたクローンは、ＩｇＧ1型のモノクローナル
抗体であり、これをＭＡＳＰ−１と命名した。
【００２６】（７）ウエスタンブロット 得られたモノクローナル抗体ＭＡＳＰ−１を用いて、Ｍ
ＢＰ会合性セリンプロテアーゼとの反応性を調べた。そ
の結果、９３ｋｄの分子と反応することが判明した。
ＢＰ会合性セリンプロテアーゼとの反応性を調べた。そ
の結果、９３ｋｄの分子と反応することが判明した。
【００２７】
【発明の効果】本発明のヒトのＭＡＳＰに対するモノク
ローナル抗体は、以下に述べるような種々の用途が考え
られる。本発明のモノクローナル抗体を用いることによ
り、生体内におけるＭＡＳＰの生理的役割がわかるとと
もに、補体活性化経路の新たな経路の解明に役立つ。さ
らに、この新たな補体活性化経路が、感染初期あるいは
免疫系が未発達な幼児期においての役割が解明でき、幼
児の治療への有用な手がかりを与えることになる。した
がって、本発明のモノクローナル抗体は、生体内におけ
るＭＡＳＰの生理的役割等を解明するための薬剤等とし
て、免疫系分野における研究と関連産業分野において有
用である。
ローナル抗体は、以下に述べるような種々の用途が考え
られる。本発明のモノクローナル抗体を用いることによ
り、生体内におけるＭＡＳＰの生理的役割がわかるとと
もに、補体活性化経路の新たな経路の解明に役立つ。さ
らに、この新たな補体活性化経路が、感染初期あるいは
免疫系が未発達な幼児期においての役割が解明でき、幼
児の治療への有用な手がかりを与えることになる。した
がって、本発明のモノクローナル抗体は、生体内におけ
るＭＡＳＰの生理的役割等を解明するための薬剤等とし
て、免疫系分野における研究と関連産業分野において有
用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトのＭＡＳＰ（ＭＢＰ会合セリンプロ
テアーゼ）に対するモノクローナル抗体またはその活性
フラグメント。 - 【請求項２】 ヒトのＭＡＳＰが活性型であるものに対
する請求項１記載のモノクローナル抗体またはその活性
フラグメント。 - 【請求項３】 （１）齧歯類動物をヒトのＭＡＳＰで免
疫感作し、（２）免疫した齧歯類動物から脾臓を摘出し
て、脾細胞の懸濁液を形成し、（３）該脾細胞懸濁をマ
ウスのミエローマ細胞と融合促進剤の存在下で混合し
て、両細胞を融合し、（４）融合した細胞を未融合のミ
エローマ細胞を支持しない媒質中で希釈して培養して、
抗体産生細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドー
マを選別し、（５）ハイブリドーマを含有する各培養穴
中の上清液について、免疫感作したＭＡＳＰとの反応性
を指標として、抗体の存在を確認し、（６）所望の抗体
を生成するハイブリドーマを選択した後、限界希釈法に
より、単一クローンにし、（７）この単一クローンのハ
イブリドーマの培養上清液からモノクローナル抗体を回
収することを特徴とするヒトのＭＡＳＰに対するモノク
ローナル抗体の製造方法。 - 【請求項４】 さらに、（８）回収したモノクローナル
抗体が活性型のＭＡＳＰの９３ｋｄの分子量のタンパク
質を識別するという特徴を備えていることを確認する請
求項３記載の製造方法。 - 【請求項５】 ヒトのＭＡＳＰに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6052677A JPH07238100A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | ヒトのｍａｓｐに対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6052677A JPH07238100A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | ヒトのｍａｓｐに対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07238100A true JPH07238100A (ja) | 1995-09-12 |
Family
ID=12921519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6052677A Pending JPH07238100A (ja) | 1994-02-25 | 1994-02-25 | ヒトのｍａｓｐに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07238100A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1140171A1 (en) * | 1998-12-15 | 2001-10-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| US7083786B2 (en) * | 1997-04-03 | 2006-08-01 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
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| US8652477B2 (en) | 2009-10-16 | 2014-02-18 | Omeros Corporation | Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting MASP-2 dependent complement activation |
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-
1994
- 1994-02-25 JP JP6052677A patent/JPH07238100A/ja active Pending
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| US7273925B1 (en) | 1998-12-15 | 2007-09-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
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