CN115461445A - 细胞外囊泡的回收方法 - Google Patents
细胞外囊泡的回收方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115461445A CN115461445A CN202180028379.5A CN202180028379A CN115461445A CN 115461445 A CN115461445 A CN 115461445A CN 202180028379 A CN202180028379 A CN 202180028379A CN 115461445 A CN115461445 A CN 115461445A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- extracellular vesicles
- polymer
- substance
- particles
- pbs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 89
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 87
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 61
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 76
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 64
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 36
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 27
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 22
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 21
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 11
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 11
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 5
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 98
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 76
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 64
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 61
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 59
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 59
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 58
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 50
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 43
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 39
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 17
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 13
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 13
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 11
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 11
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 10
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 10
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 8
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000004721 Polyphenylene oxide Chemical class 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920000570 polyether Chemical class 0.000 description 6
- 229920001046 Nanocellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 230000002621 immunoprecipitating effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(2-hydroxyethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O URDCARMUOSMFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JYXGIOKAKDAARW-UHFFFAOYSA-N N-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acid Chemical compound OCCN(CC(O)=O)CC(O)=O JYXGIOKAKDAARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108700031126 Tetraspanins Proteins 0.000 description 3
- 102000043977 Tetraspanins Human genes 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- NFDRPXJGHKJRLJ-UHFFFAOYSA-N edtmp Chemical compound OP(O)(=O)CN(CP(O)(O)=O)CCN(CP(O)(O)=O)CP(O)(O)=O NFDRPXJGHKJRLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000011164 primary particle Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RSGFPIWWSCWCFJ-VAXZQHAWSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O RSGFPIWWSCWCFJ-VAXZQHAWSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 2
- 229920006184 cellulose methylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000011153 ceramic matrix composite Substances 0.000 description 2
- 238000012710 chemistry, manufacturing and control Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011369 resultant mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000518 rheometry Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- VLCQZHSMCYCDJL-UHFFFAOYSA-N tribenuron methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)N(C)C1=NC(C)=NC(OC)=N1 VLCQZHSMCYCDJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- ILROLYQPRYHHFG-UHFFFAOYSA-N 1-$l^{1}-oxidanylprop-2-en-1-one Chemical group [O]C(=O)C=C ILROLYQPRYHHFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOEFELLSAAJCHJ-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chlorophenyl)-2-(methylamino)propan-1-one Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=CC(Cl)=C1 VOEFELLSAAJCHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004066 1-hydroxyethyl group Chemical group [H]OC([H])([*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl Chemical group [CH2]CCO QOXOZONBQWIKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 3-phenyldioxetane Chemical compound C1OOC1C1=CC=CC=C1 UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-butyl Chemical group [CH2]CCCO SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 238000004438 BET method Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005653 Brownian motion process Effects 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000009066 Hyaluronoglucosaminidase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000010843 Qubit protein assay Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 1
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 1
- 238000005537 brownian motion Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019574 ceramide binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091016242 ceramide binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- XUWHAWMETYGRKB-UHFFFAOYSA-N delta-valerolactam Natural products O=C1CCCCN1 XUWHAWMETYGRKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940072417 peroxidase Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000023884 phosphatidylserine binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008423 phosphatidylserine binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 229910052701 rubidium Inorganic materials 0.000 description 1
- IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N rubidium atom Chemical compound [Rb] IGLNJRXAVVLDKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000004454 trace mineral analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
- 150000003953 γ-lactams Chemical class 0.000 description 1
- 150000003954 δ-lactams Chemical class 0.000 description 1
- 150000003955 ε-lactams Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/553—Metal or metal coated
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2650/00—Assays involving polymers whose constituent monomers bore biological functional groups before polymerization, i.e. vinyl, acryl derivatives of amino acids, sugars
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供能够高效地回收细胞外囊泡的、代替以往技术的方法。更具体而言，本发明提供包含以下(a)和(b)的细胞外囊泡的回收方法：(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；和(b)从所述混合液中分离所述目标粒子。在所述工序(a)和(b)之间，优选进一步包含：使所述混合液的粘度降低的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡的回收方法等。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles：EV)是从各种细胞中分泌的、具有膜结构的微小的囊泡，存在于血液等体液中或细胞培养液中。被分泌至细胞外的细胞外囊泡中包括：外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、凋亡小泡(apo ptotic bleb)。由于细胞外囊泡是含有承担细胞间的信息传达等功能的各种物质的多样的集团，因此出于诊断、制药等目的而正在被解析。因此，需要开发对这样的解析有用的细胞外囊泡的回收方法。例如，专利文献1中记载了使用了螯合剂的细胞外囊泡的回收方法。专利文献2中记载了，在2种包含聚乙烯吡咯烷酮的聚合物的存在下将含细胞外囊泡的试样离心分离，通过离心分离使2种聚合物二层化，使细胞外囊泡浓缩至其二层的边界，从而分离细胞外囊泡的方法。专利文献3中记载了，在使用了包含聚乙烯吡咯烷酮的细胞外基质形成聚合物的细胞外囊泡的共沉淀法中，通过使聚阳离子性物质共存，而分离细胞外囊泡的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/070479号
专利文献2：美国专利申请公开第2018/0164197号说明书
专利文献3：国际公开第2017/178472号
发明内容
发明所解决的技术问题
如果能够高效地从含细胞外囊泡的试样中回收细胞外囊泡，则在诊断、制药等的应用中是有希望的。然而，以往的方法中，存在不一定能够高效地回收细胞外囊泡这样的问题。
因此，本发明的目的在于：开发能够高效地回收细胞外囊泡的、代替以往技术的方法。
解决问题的技术手段
本发明人等进行了深入研究的结果，发现通过组合使用聚合物和粒子(固相)的方法，能够以高效率回收细胞外囊泡。更具体而言，通过以下(a)和(b)，能够以高效率回收细胞外囊泡，(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；(b)从该混合液中分离所述目标粒子。上述现有技术没有记载或暗示组合使用聚合物和粒子(固相)的方法。
本发明人等还发现：通过在从混合液中分离粒子之前使混合液的粘度降低，能够以更高效率回收细胞外囊泡。超声波处理在均质化(homogenization)等操作中一直被用于脂质双层膜(例如，细胞膜)的破坏。因此，当为了使包含具备脂质双层膜的细胞外囊泡的混合液的粘度降低而进行超声波处理的情况下，预计会引起细胞外囊泡的破坏，其结果，可能使细胞外囊泡的回收率降低。然而，本发明人等发现，即使在为了使包含细胞外囊泡的混合液的粘度降低而进行超声波处理的情况下，也能够出乎意料地提高细胞外囊泡的回收率等，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种细胞外囊泡的回收方法，其包含以下(a)和(b)：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)从所述混合液中分离所述目标粒子。
[2]根据[1]的方法，其包含以下(a)～(c)：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)使所述混合液的粘度降低；
(c)从所述(b)中得到的溶液中分离所述目标粒子。
[3]根据[1]或[2]的方法，其在所述目标粒子的分离后，包含：(I)清洗所述目标粒子和/或(II)使细胞外囊泡从所述目标粒子游离。
[4]根据[2]或[3]的方法，其中，通过基于超声波或具有聚合物分解能力的酶的处理来进行粘度的降低。
[5]根据[4]的方法，其中，超声波为干式或水浴式。
[6]根据[4]或[5]的方法，其中，超声波的频率为40kHz以下或950kHz以上的范围内。
[7]根据[1]～[6]中的任一种方法，其中，聚合物为多糖、蛋白质或具有含羰基的亲水性基团的聚乙烯衍生物。
[8]根据[7]的方法，其中，多糖为纤维素中的至少一个羟基的氢原子被羧基烷基或羟基烷基所取代的纤维素衍生物。
[9]根据[1]～[8]中的任一种方法，其中，聚合物具有10kDa以上的重均分子量。
[10]根据[1]～[9]中的任一种方法，其中，(a)的混合液中的聚合物浓度为0.01～10.00重量％。
[11]根据[1]～[10]中的任一种方法，其中，在(a)中，进一步混合(iv)螯合剂。
[12]根据[1]～[11]中的任一种方法，与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为针对四跨膜蛋白的抗体或针对细胞外基质金属蛋白酶诱导物质的抗体。
[13]根据[1]～[12]中的任一种方法，其中，含细胞外囊泡的试样为培养上清试样或来源于动物的液体试样。
[14]一种细胞外囊泡的分析方法，其包含以下(1)和(2)：
(1)通过[1]～[13]中的任一种方法，从含细胞外囊泡的试样中分离细胞外囊泡；
(2)对分离得到的细胞外囊泡进行分析。
[15]一种试剂盒，其包含：(a)聚合物、(b)与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质和(c)具有聚合物分解能力的酶，
所述物质为游离形态或固定于粒子的形态，
在所述物质为游离形态的情况下，可以进一步包含粒子。
[16]根据[15]的试剂盒，其中，聚合物为多糖或蛋白质，并且，具有聚合物分解能力的酶为糖分解酶或蛋白质分解酶。
发明效果
通过本发明，能够以更高效率回收细胞外囊泡。因此，与以往的方法相比，本发明能够迅速制备期望的量的细胞外囊泡和高效地制备大量的细胞外囊泡。此外，通过本发明，能够以高纯度回收细胞外囊泡。
附图说明
[图1]图1是表示用PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或各浓度的各种CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图2]图2是表示使以PBS或各浓度的CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料在4℃下一晚或者37℃下1小时的条件下与抗CD9抗体进行免疫沉淀而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图3]图3是表示用PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料的通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于纳米颗粒跟踪分析的粒子数测定结果的图。
[图4]图4是表示将血清和含有5种抗凝固剂(肝素、EDTA、柠檬酸(citrate)、ACD(酸-柠檬酸-葡萄糖，acid-citrate-dextrose)、CPD(柠檬酸-磷酸-葡萄糖，citratephosphate dextrose))的血浆用PBS、CMC-PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(“ED/EG/C”)进行了稀释的检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图5A]图5A是表示用PBS、CMC-PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(“ED/EG/C”)进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗四跨膜蛋白抗体(抗CD63抗体和抗CD81抗体)进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于抗四跨膜蛋白抗体(抗CD63抗体和抗CD81抗体)的免疫印迹的图。
[图5B]图5B是表示用PBS、CMC-PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(“ED/EG/C”)进行了稀释的血清检查材料的通过使用抗CD147抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图6]图6是表示将体液(尿和唾液分别为2个样品。表示为“#1”和“#2”)用PBS、CMC-PBS、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(“ED/EG/C”)进行了稀释的检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图7A]图7A是表示用PBS、各浓度的各种HEC-PBS或CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图7B]图7B是表示用PBS、各浓度的各种HPC-PBS或CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图7C]图7C是表示用PBS、各浓度的各种HPMC-PBS或CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图8]图8是表示用PBS或各浓度的各种PVP-PBS进行了稀释的血清检查材料的、通过使用抗CD9抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图9A]图9A是表示使以PBS或CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料在35～60℃的各温度下与抗CD9抗体进行免疫沉淀而得到的样品的、基于生物素化抗CD9抗体的免疫印迹的图。
[图9B]图9B是表示使以CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料在35～60℃的各温度下与抗CD63抗体进行免疫沉淀而得到的样品的、基于抗CD63抗体的免疫印迹的图。
[图9C]图9C是表示使以CMC-PBS进行了稀释的血清检查材料在35～60℃的各温度下与抗CD81抗体进行免疫沉淀而得到的样品的、基于抗CD81抗体的免疫印迹的图。
[图10]图10是表示用PBS、CMC-PBS(“CMC”)、EDTA/EGTA-PBS(“ED/EG”)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(“ED/EG/C”)进行了稀释的人肺癌细胞H2228的培养上清的、通过使用抗CD9抗体或抗CD63抗体进行的免疫沉淀法而得到的样品的、EML4-ALK mRNA检测量(表示相对于用PBS进行了稀释的样品的倍率变化)的图。
[图11]图11是表示使用了羧甲基纤维素(CMC)的情况下的残留磁粒子量的相对比较的图。Cellulase：纤维素酶处理；Non-US：无超声波处理。照射的超声波的频率为100kHz、200kHz、950kHz和1.6MHz。
[图12A]图12A是表示使用了CMC的情况下的残留磁粒子量的相对比较的图。Non-US：无超声波处理；US：超声波处理(30kHz)。
[图12B]图12B是表示使用了CMC的情况下的CD9的计数的相对比较的图。Non-US：无超声波处理；US：超声波处理(30kHz)。
[图12C]图12C是表示对于通过集磁操作从含CMC的溶液中回收得到的磁粒子，基于通过使用抗CD9抗体的免疫印迹法进行的CD9的检测的、EV回收效率的相对比较的图。Non-US：无超声波处理；US：超声波处理(30kHz)。
[图13]图13是表示使用了CMC的情况下的残留磁粒子量的相对比较的图。Cellulase：纤维素酶处理；Non-US：无超声波处理。作为含CMC的溶液，使用了包含不同的最终浓度的CMC的溶液。
[图14]图14是表示使用了CMC以外的纤维素衍生物的情况下的残留磁粒子量的相对比较的图。Cellulase：纤维素酶处理；Non-US：无超声波处理。作为纤维素衍生物，使用了不同的最终浓度的羟丙基纤维素80kDa(HPC80K)或羟乙基纤维素380kDa(HEC380K)DRICH(ドリッチ)公司)。
[图15]图15是表示基于不同超声波处理的残留磁粒子量的相对比较的图。Cellulase：纤维素酶处理；Non-US：无超声波处理。超声波处理的频率为30kHz(输出10w、20w或者35w)或频率为40kHz(输出70w)。
[图16]图16是表示对于糖分解酶处理后的通过集磁操作回收得到的磁粒子，基于通过使用抗CD9抗体的免疫印迹法进行的CD9的检测的、EV回收效率的相对比较的图。
[图17]图17是表示从磁性粒子游离得到的细胞外囊泡的纳米颗粒跟踪分析的图。Non-US：无超声波处理；CMC：超声波处理(使用CMC)；HEC：超声波处理(使用HEC)。
[图18]图18是表示对于通过集磁操作而从含纤维素衍生物的溶液中回收得到的磁粒子，基于通过使用抗CD9抗体的免疫印迹法进行的CD9的检测的、EV回收效率的相对比较的图。Non-US：无超声波处理；CMC：羧甲基纤维素；HEC：羟乙基纤维素。
具体实施方式
1.细胞外囊泡的回收方法
本发明提供细胞外囊泡的回收方法。
细胞外囊泡是由各种细胞分泌的、具有膜结构的微小囊泡。作为细胞外囊泡，例如可举出：外泌体、核外颗粒体和凋亡小泡。优选细胞外囊泡为外泌体。细胞外囊泡还可根据其尺寸而规定。细胞外囊泡的尺寸，例如为30～1000nm，优选为50～300nm，更优选为80～200nm。细胞外囊泡的尺寸的测定，例如，可通过基于细胞外囊泡的布朗运动的方法、光散射法和电阻法等而进行。优选细胞外囊泡的尺寸的测定通过NanoSight(MalvernInstruments公司制)进行。
本发明的回收方法包含以下(a)和(b)的工序：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助该物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)从所述混合液中分离所述目标粒子。
所述工序(a)中，混合(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物。通过混合，(i)的试样中的细胞外囊泡与被固定于(ii)的粒子并且与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质结合，生成借助该物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子。因此，得到包含(i’)借助与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质而与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液。
所述工序(a)中，(i)～(iii)的混合只要能够得到包含(i’)借助该物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液，就没有特别限定。例如，(i)～(iii)的混合可同时或分开进行。在(i)～(iii)的混合分开进行的情况下，可以将(i)～(iii)中的两个进行混合，接下来，将得到的混合液添加至剩余的一个中并进行混合。或，可以将(i)～(iii)中的两个添加至剩余的一个中并进行混合。可以优选将(i)和(ii)添加至(iii)并进行混合。混合可通过转倒混合或搅拌来进行。
(i)的含细胞外囊泡的试样为含有细胞外囊泡的任意试样。优选含细胞外囊泡的试样为生物学性的液体试样。含细胞外囊泡的试样可以在用于本发明的方法前，进行其他处理。作为这样的处理，例如可举出：离心分离、提取、过滤、沉淀、加热、冷冻、冷藏和搅拌。
一个实施方式中，含细胞外囊泡的试样为培养上清试样。培养上清试样可以是细胞培养上清试样，也可以是组织培养上清试样。作为培养的细胞或组织的生物来源，例如可举出：哺乳动物(例如，人、猴等灵长类；小鼠、大鼠、兔子等啮齿类；牛、猪、山羊等家畜；以及马、绵羊等使役动物)、鸟类(例如，鸡)等动物、昆虫、微生物(例如，细菌类)、植物和鱼类。优选地，生物为哺乳动物，优选为人。
另一实施方式中，含细胞外囊泡的试样为来源于动物的液体试样。来源于动物的液体试样是来源于如上所述的生物的体液试样。作为体液试样，例如可举出：血液试样(例如，全血、血清和血浆)、尿、唾液、淋巴液、组织液、脑脊髓液、腹水、汗、精液、泪液、粘液、乳汁、胸腔液、支气管肺泡灌洗液和羊水。优选体液为血液试样、尿或唾液。作为血浆，例如可举出：肝素血浆、柠檬酸血浆、氟化钠血浆、含有ACD(acid-citrate-dextrose)或CPD(citrate phosphate dextrose))的血浆。通常，与培养上清相比，细胞外囊泡的回收在混入比培养上清更多量的蛋白质(例如，白蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白、组氨素、过氧化物酶、凝集素、防御素、免疫球蛋白)的体液(例如，血液、尿、唾液)中更为困难。另一方面，通过本发明的方法，从含细胞外囊泡的试样中回收的细胞外囊泡的回收量增加，即使从这样的体液中也能够高效率并且高纯度地回收细胞外囊泡。
作为(ii)的粒子，可使用固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的任意粒子。粒子只要是能够固定与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质，并且，能够从所述工序(a)中得到的混合液中回收(例如，磁性操作或离心分离)，就没有特别限定。作为粒子，例如可举出：微粒、纳米粒子、微珠、纳米珠、微球、纳米球。此外，作为粒子，例如可举出：无机粒子(例如，金属粒子、二氧化硅粒子)、有机粒子(例如，聚合物粒子)和有机无机复合粒子。粒子的形状可以是球形，可以是非球形(例如，椭圆形)。
粒子的平均一次粒径没有特别限定。从回收的容易度等观点出发，例如可以为0.001～1000μm，优选为0.01～100μm，更优选为0.1～10μm，进一步优选为0.5～5μm，特别优选为1～3μm。粒子的平均一次粒径可通过BET法进行测定。
从基于磁性操作的回收的容易度等观点出发，优选粒子为磁性粒子。磁性粒子为包含铁、镍、钴或这些的合金(例如，铁氧体)等磁性材料的粒子。磁性粒子优选具有1～3μm的平均一次粒径。
固定于粒子并且与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为具有针对细胞外囊泡的表面标志物的结合能力的物质。作为细胞外囊泡的表面标志物，例如可举出：四跨膜蛋白(EV膜特异性4次贯穿膜蛋白，例如，CD9、CD63、CD81)、细胞外基质金属蛋白酶诱导物质(例如，CD147)、热休克蛋白(HSP)70、HSP90、主要组织相容性复合体(MHC)I、溶酶体关联膜蛋白(LAMP)1、细胞间粘附分子(ICAM)-1、整联蛋白、神经酰胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、Annexins、Caveolin-I、EpCAM。细胞外囊泡的表面标志物优选为四跨膜蛋白(例如，CD9、CD63)或细胞外基质金属蛋白酶诱导物质(例如，CD81或CD147)。
作为与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质，例如可举出：针对所述细胞外囊泡的表面标志物的抗体、适体、磷脂酰丝氨酸结合蛋白、神经酰胺结合蛋白。本发明中，作为针对细胞外囊泡的表面标志物的亲和性物质，可使用单一的物质或多种(例如，2种、3种、4种)物质。
从针对细胞外囊泡的表面标志物的特异性的确保和制备的简便性等观点出发，优选与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质可以是针对细胞外囊泡膜的表面标志物的抗体。作为抗体，例如可举出：全长抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体)和其抗原结合性片段。就抗原结合性片段而言，是保持针对作为对象的EV表面标志物的结合性的抗体片段即可，可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv等。本发明中，可使用单一的抗体或多种(例如，2种、3种、4种)抗体。
作为(iii)的聚合物，可以使用聚合物本身，但由于使粘度降低易于进行混合，因此优选为使用将聚合物溶解于水溶液(例如，缓冲液)而得到的聚合物水溶液。聚合物水溶液中的聚合物浓度根据聚合物的种类和聚合度等因子而变动，例如可以为0.01～30重量％，优选为0.02～25重量％，更优选为0.05～20重量％，进一步优选为0.1～15重量％，特别优选为0.2～10重量％。优选地，聚合物可以为水溶性聚合物。水溶性聚合物是指，4～80℃(优选为4～37℃)中的任一温度下针对水的溶解度为0.01重量％以上的聚合物。水溶性聚合物在4～80℃(优选为4～37℃)下针对水的溶解度可以优选为0.05重量％以上，更优选为0.1重量％以上。
就聚合物而言，为了达成本发明的目的，例如，作为20～30℃下的1～20重量％水溶液中的粘度，可以具有1.5mPa·s以上的值。作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为5mPa·s以上，更优选为10mPa·s以上，进一步优选为20mPa·s以上，并且进一步优选为30mPa·s以上，特别优选为35mPa·s以上。作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为30000mPa·s以下，更优选为20000mPa·s以下，进一步优选为10000mPa·s以下，并且进一步优选为5000mPa·s以下，特别优选为1000mPa·s以下。更具体而言，作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为5～30000mPa·s，更优选为10～20000mPa·s，进一步优选为20～10000mPa·s，并且进一步优选为30～5000mPa·s，特别优选为35～1000mPa·s。
此外，就聚合物而言，为了达成本发明的目的，例如，作为以使得聚合物成为2重量％的方式溶解在磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的PBS溶液中的30℃下的粘度，可以具有1.5mPa·s以上的值。作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为5mPa·s以上，更优选为10mPa·s以上，进一步优选为20mPa·s以上，并且进一步优选为30mPa·s以上，特别优选为35mPa·s以上。作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为30000mPa·s以下，更优选为20000mPa·s以下，进一步优选为10000mPa·s以下，并且进一步优选为5000mPa·s以下，特别优选为1000mPa·s以下。更具体而言，作为聚合物在上述条件下的粘度，可以优选为5～30000mPa·s，更优选为10～20000mPa·s，进一步优选为20～10000mPa·s，并且进一步优选为30～5000mPa·s，特别优选为35～1000mPa·s。
聚合物的粘度，例如，可通过以下方法进行测定：对使液体试样通过旋转体旋转时在转子的外周产生的液体的粘度摩擦扭矩进行检测的方法(使用旋转粘度计的方法)或在充满试样的测定管内，使落下锤自由落下，对其落下时间进行测量的方法(使用落球粘度计的方法)。此外，聚合物的粘度，例如，可通过以下方法进行测定：在液体试样中放入振动体(粘度传感器)并使其振动时，传感器的振动振幅随着液体粘度增大而因其粘性电阻而受到抑制、降低，以克服该进行抑制的力并保持恒定振幅的方式增加振动子驱动电流，对此时的输入电流量进行测定的方法(使用振运动黏度计的方法)。聚合物的粘度可优选使用粘性解析装置(例如，RHEOLOGY SPECTROMETER SKR100，YAMATO SCIENTIFIC公司)进行测定。
此外，为了达成本发明的目的，聚合物例如可以具有10kDa以上的重均分子量。作为聚合物的重均分子量，可以优选为12kDa以上，更优选为14kDa以上，进一步优选为16kDa以上，并且进一步优选为18kDa以上，特别优选为20kDa以上。作为聚合物的重均分子量，优选为5000kDa以下，更优选为3000kDa以下，进一步优选为2000kDa以下，并且进一步优选为1000kDa以下，特别优选为500kDa以下。更具体而言，作为聚合物的重均分子量，优选为12～5000kDa，更优选为14～3000kDa，进一步优选为16～2000kDa，并且进一步优选为18～1000kDa，特别优选为20～500kDa。
作为聚合物，可使用具有如上所述的特性的任意聚合物。作为这样的聚合物，例如可举出：多糖、蛋白质、聚醚化合物、具有亲水性基团的聚乙烯衍生物。
多糖为糖聚合物。作为多糖，例如可举出：单纯多糖(例如，纤维素、纤维素衍生物、淀粉、糖原)和复合多糖(例如，透明质酸、硫酸软骨素、肝素)。从细胞外囊泡的回收效率的提高、水溶性的提高、入手的容易性等观点出发，多糖优选为纤维素衍生物。
纤维素衍生物为纤维素的至少一个羟基的氢原子被亲水性基团所取代的纤维素衍生物。作为纤维素衍生物中的亲水性基团，例如可举出：羧基烷基(例如，羧基C1～6烷基)、羟基烷基(例如，羟基C1～6烷基)。纤维素衍生物中的亲水性基团优选为羧基烷基或羟基烷基。
作为羧基烷基，例如可举出：羧甲基、羧基乙基(1-羧基乙基、2-羧基乙基)、羧基丙基(1-羧基丙基、2-羧基丙基、3-羧基丙基)、羧基异丙基(1-羧基-2-甲基乙基、2-羧基-2-甲基乙基)、羧基丁基(1-羧基丁基、2-羧基丁基、3-羧基丁基、4-羧基丁基)、羧基叔丁基、羧基戊基(1-羧基戊基、2-羧基戊基、3-羧基戊基、4-羧基戊基、5-羧基戊基)、羧基己基(1-羧基己基、2-羧基己基、3-羧基己基、4-羧基己基、5-羧基己基、6-羧基己基)。
作为羟基烷基，例如可举出：羟甲基、羟乙基(1-羟乙基、2-羟乙基)、羟丙基(1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基)、羟基异丙基(1-羟基-2-甲基乙基、2-羟基-2-甲基乙基)、羟基丁基(1-羟基丁基、2-羟基丁基、3-羟基丁基、4-羟基丁基)、羟基叔丁基、羟基戊基(1-羟基戊基、2-羟基戊基、3-羟基戊基、4-羟基戊基、5-羟基戊基)、羟基己基(1-羟基己基、2-羟基己基、3-羟基己基、4-羟基己基、5-羟基己基、6-羟基己基)。
作为纤维素衍生物的具体例，可举出：羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
此外，纤维素衍生物还包含纳米纤维素衍生物。纳米纤维素衍生物为纳米纤维素的衍生物。纳米纤维素是指，具有纳米量级的纤维宽度的纤维状纤维素。纳米纤维素的纤维宽度，例如可以为500nm以下，优选为200nm以下，更优选为100nm以下，进一步优选为50nm以下，并且进一步优选为10nm以下，特别是更优选为5nm以下。
蛋白质是也被称为多肽的氨基酸聚合物。作为蛋白质，例如可举出：明胶、酪蛋白、白蛋白、胶原蛋白、海藻酸。
聚醚化合物是重复单元的主链中包含醚结构的聚合物。作为聚醚化合物，例如可举出聚亚烷基氧基化合物(例如，聚C1～6亚烷基氧基化合物)。作为聚亚烷基氧基化合物，例如可举出：聚乙二醇、聚丙二醇。聚亚烷基氧基化合物优选为聚乙二醇。
具有亲水性基团的聚乙烯衍生物是至少一个氢原子被亲水性基团所取代的聚乙烯衍生物，优选为亚甲基单元中的1个氢原子被亲水性基团所取代的聚乙烯衍生物。作为聚乙烯衍生物的亲水性基团，例如可举出：含羰基的亲水性基团、含羧基的亲水性基团、含氮亲水性基团、含环(碳环或杂环)的亲水性基团。聚乙烯衍生物的亲水性基团优选为含羰基的亲水性基团、含氮亲水性基团或含杂环的亲水性基团，更优选为内酰胺(例如，α-内酰胺、β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰胺、ε-内酰胺)。作为具有亲水性基团的聚乙烯衍生物的具体例，可举出聚乙烯吡咯烷酮。
多糖、蛋白质、具有亲水性基团的聚乙烯衍生物和聚醚化合物等聚合物中还包含它们的盐。作为盐，例如可举出：金属(例如，锂、钠、钾、铷和铯等一价的金属和钙、镁和锌等二价的金属)的盐和无机碱(例如，氨)的盐。
聚合物优选为多糖、蛋白质或聚醚化合物，更优选为多糖或蛋白质，进一步优选为多糖，特别优选为纤维素衍生物。
就混合液中的聚合物的浓度而言，只要是与不包含聚合物的情况相比，能够以高效率回收细胞外囊泡，并且能够将聚合物溶解在混合液中的浓度，就没有特别限定。这样的浓度根据聚合物的种类而不同，例如可以为0.01～10.00重量％，优选为0.05～7.50重量％，更优选为0.10～5.00重量％。
所述工序(a)中的混合在足以生成借助与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质而与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子的条件下进行。这样的温度条件，例如为4～60℃，优选为15～50℃，更优选为20～45℃。混合液的制备所需要的时间，例如为30秒以下，优选为20秒以下，更优选为15秒以下。通过在这样的条件下进行混合，能够增加与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子的量。
本发明的方法在所述工序(a)的混合后，进一步包含孵育混合液的步骤。就孵育时间而言，根据混合液的制备所需要的时间、细胞外囊泡的期望的回收量、孵育温度等因子而变动，例如为48小时以下，优选为24小时以下，更优选为120分钟以下，进一步优选为60分钟以下。从迅速处理等观点出发，孵育时间可以进一步优选为30分钟以下，特别优选为20分钟以下、10分钟以下或5分钟以下。孵育温度与上述混合中的温度条件同样。
在所述工序(b)中，从所述工序(a)中得到的混合液中分离目标粒子。目标粒子借助与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质而与细胞外囊泡进行了结合。因此，通过目标粒子的分离，能够分离与目标粒子进行了结合的细胞外囊泡。
从混合液中的目标粒子的分离可通过任意的方法进行。通过该分离，能够实现将固定于固相(目标粒子)的因子与不固定于固相(目标粒子)的因子分离的、所谓的B(结合(bound))/F(游离(free))分离。例如，可通过对工序(a)中得到的混合液进行离心分离，接着除去上清，而从混合液中分离目标粒子。此外，在工序(a)中使用磁性粒子的情况下，可通过以集磁操作回收目标粒子，来从工序(a)中得到的混合液中分离目标粒子。
优选的实施方式中，本发明的方法可以进一步包含使上述工序(a)中得到的混合液的粘度降低的步骤。即，本实施方式中，本发明的方法可以包含以下(a)～(c)：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)使所述混合液的粘度降低；
(c)从所述(b)中得到的溶液中分离所述目标粒子。
本实施方式中的工序(a)和(c)可分别与上述方法中的工序(a)和(b)同样地进行。
所述优选的实施方式中的工序(b)可通过能够使所述工序(a)中得到的混合液的粘度降低的任意方法来进行。从简便的实施等观点出发，该工序(b)优选通过基于超声波或具有聚合物分解能力的酶的处理进行。
基于超声波的处理可通过干式或水浴式进行。基于干式超声波的处理是指，可通过不通过水浴等而将超声波的产生部分与包含目标溶液(例如，本发明中为(a)中得到的混合液)的容器(例如，管)直接或者间接性地接触来达成的直接性的超声波处理。基于水浴式超声波的处理是指，可通过将包含目标溶液的容器(例如，管)浸泡在超声波的产生装置的水浴中来达成的间接性的超声波处理。超声波的处理时间只要能降低混合液的粘度，就没有特别限定，根据超声波的条件等因子而变动，例如为10秒～30分钟，优选为20秒～20分钟，更优选为30秒～10分钟。
就超声波的频率(Hz)和输出(w)而言，只要能够降低混合液的粘度，进而，在所述工序(c)中，易于从所述工序(b)中得到的溶液中分离目标粒子，就没有特别限定。这样的频率例如为5kHz～5.0MHz。从任意的超声波的产生振动子或产生装置能够广泛利用的频率区域的采用等的观点出发，频率可以优选为10kHz～3.0MHz，更优选为20kHz～2.5MHz，进一步优选为30kHz～2.0MHz。输出例如为5～300w。从与频率同样的观点出发，输出可以优选为10～200w。
特定的实施方式中，超声波的频率(Hz)可以以使得能够显著提高与目标粒子进行了结合的细胞外囊泡的回收效率的方式进行设定。这样的频率例如可以为40kHz以下的范围(优选为10kHz～40kHz，更优选为20kHz～40kHz，进一步优选为30kHz～40kHz)或950kHz以上的范围(优选为950kHz～3.0MHz，更优选为950kHz～2.5MHz，进一步优选为950kHz～2.0MHz)。
基于具有聚合物分解能力的酶的处理可根据所述工序(a)中使用的聚合物的种类，通过适宜选择并使用具有该聚合物的分解能力的酶来进行。
例如，(a)中使用的聚合物为纤维素衍生物等多糖时，可使用糖分解酶。作为糖分解酶，例如可举出：纤维素酶、糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、神经氨酸苷酶、转化酶、透明质酸酶、溶菌酶。此外，作为糖分解酶，可使用内切(endo)型酶或外切(exo)型酶。从短时间内效率良好地切断聚合物，进而效率良好地降低粘度的观点出发，糖分解酶优选为内切型酶。糖分解酶可根据多糖的种类而进行选择。例如，(a)中使用的聚合物为纤维素衍生物时，可使用纤维素酶、内切葡聚糖酶等分解纤维素衍生物的糖分解酶。
此外，(b)中使用的聚合物为蛋白质时，可使用蛋白质分解酶。作为蛋白质分解酶，例如可举出：天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶。此外，作为蛋白质分解酶，可使用内切蛋白酶(例如，胰朊酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶)或外切蛋白酶(例如，亮氨酸氨基肽酶、羧基肽酶、二肽氨基肽酶)。从短时间内效率良好地切断聚合物，进而效率良好地降低粘度的观点出发，蛋白质分解酶可以优选为内切蛋白酶。
在本发明中使用的与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为具有针对细胞外囊泡的表面标志蛋白的结合能力的物质的情况下，从防止表面标志蛋白的分解的观点出发，具有聚合物分解能力的酶优选为糖分解酶。
作为基于具有聚合物分解能力的酶的处理的条件，例如可应用通常的酶反应的条件(例如，25～40℃下1～60分钟)。
本发明中使用的聚合物可以根据使混合液的粘度降低的处理的种类而适宜选择。例如，在使混合液的粘度降低的处理为超声波处理的情况下，作为聚合物，例如可适宜选择多糖、蛋白质、具有亲水性基团的聚乙烯衍生物或聚醚化合物。另一方面，在使混合液的粘度降低的处理为基于具有聚合物分解能力的酶的处理的情况下，从这样的酶的入手的容易性等观点出发，聚合物优选为多糖(优选为纤维素衍生物)或蛋白质。在本发明中使用的与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为具有针对细胞外囊泡的表面标志蛋白的结合能力的物质的情况下，从防止表面标志蛋白的分解的观点出发，聚合物优选为多糖。
就本发明的方法而言，为了提高细胞外囊泡的回收率，在所述工序(a)的混合中，可以组合使用螯合剂。可通过用螯合剂处理含细胞外囊泡的试样，来提高细胞外囊泡的回收率(例如，国际公开第2018/070479号)。
螯合剂为具有能够与金属离子配位结合的配位部分的化合物或其盐。配位部分的个数优选为2个以上，更优选为3个以上(例如，3个或6个)。作为充当配位部分的配位原子，例如可举出：氧原子、磷原子、氮原子、硫原子和氯原子。配位原子优选为氧原子或磷原子，更优选为氧原子。作为充当配位部分的配位基团，例如可举出具有所述配位原子的基团。配位基团优选为羧酸基或磷酸基，更优选为羧酸基。
作为螯合剂，例如可举出：羟乙基亚氨基二乙酸(HIDA)、氨三乙酸(NTA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、以及它们的盐。作为盐，例如可举出：金属盐(例如，钠盐、钾盐等一价的金属盐和钙盐、镁盐等二价的金属盐)、无机盐(例如，氟化物、氯化物、溴化物、碘化物等卤化物盐和铵盐)、有机盐(例如，被烷基所取代的铵盐)和酸加成盐(例如，与硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的盐和乙酸、草酸、乳酸、柠檬酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸等有机酸等的盐)。
螯合剂也可以是通常用作临床检查用的采血管中包含的成分的螯合剂。作为这样的螯合剂，例如可举出：EDTA、EGTA、NTA、HEDTA、EDTMP、HIDA、柠檬酸和它们的盐。本发明中，这样的螯合剂的使用从临床应用的观点出发也是优选的。
本发明中，可以单独使用1种螯合剂，可以组合使用多种(例如，2种、3种、4种)螯合剂。螯合剂的浓度也根据与螯合剂组合使用的其他成分的种类和浓度等因子而变动，例如为10mM～1000mM。
本发明的方法在借助与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质而与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子的分离后，可以进一步包含：(I)清洗该目标粒子和/或(II)使细胞外囊泡从该目标粒子游离。
目标粒子的清洗可使用水溶液(例如，缓冲液)进行。清洗次数通常为1～3次。
细胞外囊泡从目标粒子的游离，可通过能够使与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质和细胞外囊泡之间的结合解离的任意方法来进行。作为这样的方法，例如可举出：使用了酸、碱的处理、热处理。
2.细胞外囊泡的分析方法
本发明还提供包含以下(1)和(2)的细胞外囊泡的分析方法：
(1)从含细胞外囊泡的试样中分离细胞外囊泡；
(2)对分离得到的细胞外囊泡进行分析。
本发明的分析方法中的工序(1)可与本发明的细胞外囊泡的回收方法同样地进行。
在所述工序(2)中，作为细胞外囊泡的分析中的分析对象，例如可举出：细胞外囊泡中包含的成分(例如，细胞外囊泡的内部中包含的成分、细胞外囊泡的膜成分、存在于细胞外囊泡的膜表面的成分)和细胞外囊泡本身。
细胞外囊泡中包含的成分的分析可定性或定量地进行。这样的分析也是一个成分或多个成分的分析。作为待分析的成分，例如可举出：蛋白质、核酸(例如，RNA、DNA)、糖、脂质、氨基酸、维生素类、聚胺和肽。通过本发明，由于细胞外囊泡的回收量增加，因此能够以高精度分析细胞外囊泡中的成分。
成分的分析可通过任意的方法进行。
在待分析的成分为蛋白质的情况下，作为分析方法，例如可举出免疫测定、质谱法。作为免疫测定，例如可举出：直接竞争法、间接竞争法和夹心法。此外，作为这样的免疫测定，可举出：化学发光免疫测定(CLIA)[例如，化学发光酶免疫测定法(CLEIA)]、免疫比浊法(TIA)、酶免疫测定法(EIA)(例如，直接竞争ELISA、间接竞争ELISA和夹心ELISA)、放射免疫测定(RIA)、乳胶凝集反应法、荧光免疫测定(FIA)和免疫层析法、免疫印迹、免疫染色、荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)。在分析多个成分的情况下，可以进行蛋白质组学分析。
在待分析的成分为核酸的情况下，作为分析方法，例如可举出：使用探针的杂交法、使用引物(例如，2、3或4个引物)的基因扩增法、质谱法。
在待分析的成分为蛋白质和核酸以外的成分的情况下，作为分析方法，例如可举出：免疫测定、质谱法。在分析多个成分的情况下，可以进行代谢组学分析。
细胞外囊泡本身的分析还可定性或定量地进行。例如，细胞外囊泡的分析可通过粒子分析机器、电子显微镜、流式细胞仪(Flowcytometer)等机器进行。该情况下，可对细胞外囊泡的粒子数、粒子的尺寸和形状、以及它们的分布进行分析。
据报道，细胞外囊泡可能参与癌等各种疾病(国际公开第2014/003053号；国际公开第2014/152622号；Taylor et al.，Gynecologic Oncol，100(2008)pp13-21)。因此，本发明例如可用于基于细胞外囊泡的诊断和制药。
3.试剂盒
本发明还提供能够用于所述本发明的方法的试剂盒。
本发明的试剂盒包含以下(a)～(c)：
(a)聚合物；
(b)与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质；
(c)具有聚合物分解能力的酶。
本发明的试剂盒中，与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为游离形态或固定于粒子的形态。在与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为游离形态的情况下，本发明的试剂盒可以进一步包含粒子。本发明的试剂盒还可以进一步包含螯合剂。聚合物、与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质、具有聚合物分解能力的酶和螯合剂的定义、实例和优选的实例与本发明的方法中所述的同样。本发明的试剂盒例如可用于简便并且迅速地实施本发明的方法。
实施例
以下，将通过实施例对本发明详细地进行说明，但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)
对市售的3种CMC钠盐(以下，简称为“CMC”。CAS No.9004-32-4，NACALAI TESQUE公司#07326-95(平均分子量不明)，SIGMA-ALDRICH公司#C5678(平均分子量90kDa)，#C4888(平均分子量250kDa))的、EV回收的效果进行了探讨。EV回收使用抗CD9抗体进行。
将健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将200μL的血清用200μL的PBS(2.9mM NaH2PO4，9.0mM Na2HPO4，137mM NaCl)、EDTA/EGTA-PBS(以使得将血清稀释后的各终浓度为50mM的方式包含EDTA和EGTA的PBS)(ED/EG)或终浓度0.2～2.5重量％的CMC-PBS(以使得将血清稀释后的终浓度为0.2～2.5重量％的方式溶解有CMC的PBS)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFETECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在4℃下旋转反应一晚后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。在免疫印迹用样品中，通过用SDS处理包含外泌体的样品，而破坏外泌体，外泌体的标志蛋白(例如，CD9)被放出至样品溶液中。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体(本公司制)的免疫印迹法对免疫沉淀效率进行了解析(图1)。在全部的3种CMC中，与PBS稀释样品相比，观察到EV回收效率提高的效果。
实施例中使用的CMC的各物理性质值总结于以下的表1中。
[表1]
表1.实施例中使用的CMC的列表
(实施例2)
对CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)的浓度(0.06重量％～1.0重量％的终浓度)和反应温度(4℃，37℃)对EV回收的效果进行了探讨。
将健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将200μL的血清用200μL的PBS或者CMC-PBS(以使得血清稀释后的终浓度为0.06～1.0重量％的方式溶解有CMC的PBS)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在4℃下旋转反应一晚或者在37℃下旋转反应1小时后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体的免疫印迹法对EV的回收效率进行了解析(图2)。在反应温度4℃和37℃下，CMC的终浓度0.25重量％～1重量％的范围内，与PBS稀释样品相比，观察到EV回收效率提高的效果。
(实施例3)
通过纳米颗粒跟踪分析(NanoSight LM10，QUANTUM DESIGN公司)对CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)对EV回收的效果进行了探讨。
将200μL的健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，在其上清中用200μL的PBS、EDTA/EGTA-PBS(以使得血清稀释后的各终浓度为50mM的方式包含EDTA和EGTA的PBS)(ED/EG)或CMC-PBS(以使得血清稀释后的终浓度为0.5重量％的方式溶解有CMC的PBS)(CMC)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在37℃下旋转反应30分钟后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用40μL BRUB(Britton&Robinson Universal Buffer)(pH2.6)进行5分钟反应后，用20μL的1M Tris-HCl(pH8.0)进行中和而使细胞外囊泡从抗体磁性粒子游离。通过Qubit protein assay(LIFE TECHNOLOGIES公司)对总蛋白质浓度进行定量后，添加PBS450μL通过NanoSight对粒子数进行了解析(图3)。在用CMC进行稀释的条件下，观察到EV的总回收粒子数和总蛋白质单位重量的粒子数的增加，显示了以高纯度回收了细胞外囊泡。
(实施例4)
在血清和含有5种抗凝固剂(肝素、EDTA、柠檬酸(citrate)、ACD(酸-柠檬酸-葡萄糖；acid-citrate-dextrose)、CPD(柠檬酸-磷酸-葡萄糖；citrate phosphate dextrose))的血浆中，对CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)的EV回收的效果进行了探讨。
将200μL的健康人血清和含抗凝固剂的健康人血浆在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，在其上清中用200μL的PBS、EDTA/EGTA-PBS(以使得血清或血浆稀释后的各终浓度为50mM的方式包含EDTA和EGTA的PBS)(ED/EG)、CMC-PBS(以使得血清或血浆稀释后的终浓度为0.5重量％的方式溶解有CMC的PBS)(CMC)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(以使得血清或血浆稀释后的各个终浓度为37.5mM/37.5mM/0.5重量％的方式包含EDTA、EGTA和CMC的PBS)(ED/EG/C)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在37℃下旋转反应1小时后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体的免疫印迹法对免疫沉淀效率进行了解析(图4)。无论是哪种抗凝固剂，都在血浆检查材料中观察到基于CMC的EV回收效率提高的效果。此外，通过将CMC和螯合剂组合，EV回收效率进一步提高。
(实施例5)
对CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)对EV回收的效果进行了探讨，所述EV回收使用了针对CD9以外的2种四跨膜蛋白(CD63和CD81)和细胞外基质金属蛋白酶诱导物质(CD147)的抗体。
将200μL的健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将其上清用200μL的PBS、EDTA/EGTA-PBS(血清稀释后的各终浓度为50mM)(ED/EG)，CMC-PBS(血清稀释后的终浓度为0.5重量％)(CMC)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(血清稀释后的各个终浓度为37.5mM/37.5mM/0.5重量％)(ED/EG/C)进行稀释，添加固定有抗CD63抗体(8A12：COSMO BIO公司)、抗CD81抗体(M38：ABCAM公司)和抗CD147抗体(MEM-M6/1：ABCAM公司)的各抗体的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在4℃下旋转反应一晚后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过基于抗CD63抗体(本公司制)、抗CD81抗体(12C4：COSMO BIO公司)和生物素化抗CD9抗体(本公司制)的免疫印迹法对EV回收效率进行了解析(图5A和图5B)。在使用了针对CD63、CD81和CD147的抗体的情况下，也观察到基于CMC的EV回收效率提高的效果。此外，通过将CMC和螯合剂组合，EV回收效率进一步提高。
(实施例6)
在2种体液(尿和唾液)中，对CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)对EV回收的效果进行了探讨。
将200μL的健康人尿和唾液(分别为2个样品。表示为“#1”和“#2”)在15000×g、4℃下进行15分钟离心，通过0.22μm过滤器进行过滤后，用200μL的PBS、EDTA/EGTA-PBS(尿或唾液稀释后的各终浓度为50mM)(ED/EG)、CMC-PBS(尿或唾液稀释后的终浓度为0.5重量％)(CMC)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(尿或唾液稀释后的各个终浓度为37.5mM/37.5mM/0.5重量％)(ED/EG/C)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在37℃下旋转反应1小时后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体的免疫印迹法对免疫沉淀效率进行了解析(图6)。不仅在血清、血浆中，在尿和唾液中也观察到基于CMC的EV回收效率提高的效果。
(实施例7)
对下述表2表示的纤维素衍生物(0.13重量％～4.0重量％的各终浓度)的、EV回收的效果进行了探讨。
将健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将200μL的血清用200μL的PBS、CMC-PBS(血清稀释后的终浓度为0.5重量％)(CMC)或溶解于PBS中的纤维素衍生物(血清稀释后的各终浓度为0.13～4.0重量％)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在37℃下旋转反应1小时后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体的免疫印迹法对EV的回收效率进行了解析(图7A～C)。即使在CMC以外的3种纤维素衍生物中，与PBS稀释样品相比，都观察到EV回收效率提高的效果(HEC在0.13重量％～2.0重量％的范围，HPC在0.25重量％～4.0重量％的范围，HPMC在0.25重量％～2.0重量％的范围中)。
[表2]
表2.实施例中使用的纤维素衍生物的列表(制造者都是SIGMA-ALDRICH公司)
(实施例8)
对下述表3表示的聚乙烯吡咯烷酮(1重量％、2重量％、4重量％的各终浓度)的、EV回收的效果进行了探讨。
将健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将200μL的血清用200μL的PBS或溶解于PBS中的聚乙烯吡咯烷酮(血清稀释后的各终浓度为1.0～4.0重量％)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在37℃下旋转反应1小时后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过使用进行了生物素化的抗CD9抗体的免疫印迹法对EV的回收效率进行了解析(图8)。聚乙烯吡咯烷酮在1.0重量％～4.0重量％的范围内，与PBS稀释样品相比，观察到EV回收效率提高的效果。
[表3]
表3.实施例中使用的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的列表
(实施例9)
对于CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)，对35℃～60℃的各反应温度下的EV回收的效果进行了探讨。
将健康人血清在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，将100μL的血清用100μL的PBS或CMC-PBS(血清稀释后的终浓度为0.5重量％)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体(本公司制)、抗CD63抗体(8A12：COSMO BIO公司)或抗CD81抗体(12C4：COSMO BIO公司)的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司))并使其为0.26mg/mL。在各反应温度下反应5分钟后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行稀释而作为免疫印迹用样品。通过基于进行了生物素化的抗CD9抗体(本公司制)、抗CD63抗体(本公司制)和抗CD81抗体(12C4：COSMO BIO公司)的免疫印迹法对EV的回收效率进行了解析(图9A～图9C)。通过CMC添加而在35℃～60℃的各反应温度下观察到EV回收效率提高的效果。进而在40℃以上的高温条件下通过CMC添加而观察到EV回收效率提高的、更高的效果。此外，观察到基于CMC的EV回收效率提高效果在短时间的反应中也有效果。
(实施例10)
对实施例7中使用的纤维素衍生物和实施例8中使用的聚乙烯吡咯烷酮的PBS溶液中的粘度进行测定。具体而言，将以成为2重量％的方式将各纤维素衍生物或聚乙烯吡咯烷酮溶解于PBS中而制备的各PBS溶液，使用粘性解析装置RHEOLOGY SPECTROMETER SKR100(YAMATO SCIENTIFIC公司)，作为在30℃、测定时间60秒下，在200rpm、400rpm、600rpm、800rpm的各旋转速度下测定得到的结果的平均而求得(表4)。
[表4]
表4.实施例中使用的纤维素衍生物和聚乙烯吡咯烷酮的粘度
(实施例11)
对通过使用了CMC(SIGMA-ALDRICH公司#C4888)和针对四跨膜蛋白(CD9和CD63)的抗体的免疫沉淀法进行的EV回收和来自EV的标志物(EML4-ALK融合基因)RNA的检测的效果进行了探讨。
使用在无血清培养基中培养了3天的人肺癌细胞H2228的培养上清作为样品。将培养上清在2000×g、4℃下进行5分钟离心，通过0.22μm过滤器(MILLIPORE公司制)过滤后，使用Amicon Ultra-15(MILLIPORE公司制)浓缩至100倍。
将浓缩物用等量的PBS、EDTA/EGTA-PBS(稀释了浓缩物后的各终浓度为50mM)(ED/EG)、CMC-PBS(稀释了浓缩物后的终浓度为0.5重量％)(CMC)或EDTA/EGTA/CMC-PBS(稀释了浓缩物后的各个终浓度为37.5mM/37.5mM/0.5重量％)(ED/EG/C)进行稀释，分别添加固定有抗CD9抗体(本公司制)、抗CD63抗体(本公司制)的各抗体的Dynabeads M-280tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司)并使其为0.26mg/mL。在4℃下旋转反应一晚后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，将分离得到的磁性粒子用PBS-T清洗3次，使用miRNeasy micro kit(QIAGEN公司制)纯化总RNA。使用SuperScript(商标)IVFirst-Strand Synthesis System(Thermo Fisher Scientific公司制)从纯化的总RNA制成cDNA，使用Droplet Digital PCR(BioRad公司制)对EML4-ALK mRNA进行了定量(图10)。
EML4-ALK mRNA的检测使用了以下的表5表示的序列的引物和荧光探针。作为荧光探针，使用了在5’末端具有荧光物质HEX、在探针的内部具有ZEN猝灭剂以及在3’末端具有Iowa Black(注册商标)猝灭剂(IABkFQ)的双猝灭剂探针。通过使用表5表示的序列的引物和荧光探针，可检测EML4-ALK融合基因的变体3a和3b。
[表5]
表5.EML4-ALK mRNA的检测用探针和引物
对通过免疫沉淀法回收的EV中包含的EML4-ALK进行了检测。通过使用CMC，观察到EML4-ALK mRNA检测量增大、EV回收效率的提高效果。此外，通过添加螯合剂，观察到EML4-ALK mRNA检测量进一步增大、EV回收效率进一步提高的效果。
(实施例12)
超声波对磁性粒子的集磁效率的效果的探讨(1)
通过在羧甲基纤维素(CMC)存在下使细胞外囊泡(EV)和抗体结合磁性粒子反应后，照射(水槽)超声波，而对超声波对磁性粒子的集磁效率的效果进行了探讨。
将从固定有抗CD9抗体的磁性粒子(Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFETECHNOLOGIES公司#14204))final 1.2mg/mL和DU145(人前列腺癌细胞株)而回收的EV35.4ng添加至2mL管中的EDTA/EGTA/CMC-PBS(分别为终浓度50mM/50mM/0.5重量％)溶液600μL中，在37℃下反应1小时而使其结合，使用超声波产生装置(水浴式)((株式会社)KAIJO QUAVAmini QR-001和QR-003)，在100kHz(50w)、200kHz(100w)、950kHz(100w)、1.6MHz(100w)的各频率下对管照射3分钟。作为阴性对照，准备不照射的组。此外，准备代替超声波的照射而添加溶液的1/150分量的纤维素酶(Cellulase from Asp ergillussp.SIGMA#C2605-50ML)，在37℃下进行5分钟反应而得到物质。作为超声波装置的振动子，使用了水浴式的振动子。各条件均为超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值评价磁性粒子的混入程度。使用的CMC为平均分子量250kDa#C4888(SIGMA-ALDRICH公司)。
其结果，950kHz以上的照射中，与不照射相比，B/F分离后的溶液中混入的磁性粒子的量大幅减少。由此，950kHz以上的照射中，集磁效率显著提高，观察到较高的集磁效率(图11)。此外，通过纤维素酶添加也观察到同等的较高的集磁效率。
(实施例13)
超声波对磁性粒子的集磁效率的效果的探讨(2)
通过在CMC存在下使EV和抗体结合粒子反应后照射超声波，而对超声波的集磁效率改善对EV的回收的效果进行了探讨。
将从固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司#14204)final 1.2mg/mL和BxPC3(人胰脏线癌细胞株)而回收的EV 1.3μg添加至2mL管中的EDTA/EGTA/CMC-PBS(分别为终浓度50mM/50mM/0.5重量％)溶液600μL中，在37℃下反应1小时而使其结合，对得到的物质以频率30kHz(35w)((株式会社)KAIJO QUAVAmini QR-001)照射3分钟。作为阴性对照，准备不照射的组。作为超声波装置的振动子，使用了干式的振动子。超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收(回收上清)分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值对回收上清中的磁粒子的混入进行了比较评价(图12A)。
此外，通过使用了抗CD9抗体的夹心CLEIA法，对回收的溶液中包含的CD9的量进行了评价(图12B)。
此外，对于B/F分离后的磁性粒子，通过基于使用抗CD9抗体的免疫印迹法的检测(25kDa)，对EV的回收效率进行了解析(图12C)。
所述使用了抗CD9抗体的夹心CLEIA法，具体而言，通过以下的方法进行。首先，将固定有抗CD9抗体的Dynabeads和回收的溶液混合，将得到的混合液在37℃下孵育8分钟。在B/F分离·清洗后，进一步添加用碱性磷酸酶进行了标识的抗CD9抗体50μL，搅拌后在37℃下孵育8分钟，进行B/F分离·清洗。然后，分注包含作为化学发光基质的3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷·2钠盐的LUMIPULSE(注册商标)基质液(FUJIREBIO公司)200μL，搅拌后在37℃下孵育4分钟后，使用光度计测定发光量。作为测定值，得到计数值。发光量的测定通过全自动化学发光酶免疫测定系统(LUMIPULSE L2400(FUJIREBIO公司))进行。可以说回收的溶液中包含的CD9的量越少(CD9的计数值越小)，EV的回收效率越高。
其结果，超声波照射样品与不照射相比，观察到集磁效率和EV的回收效率的提高(图12A～12C)。
(实施例14)
CMC浓度对磁性粒子的集磁效率的影响的探讨
对CMC浓度对磁性粒子的集磁效率的影响进行了探讨。
在将CMC浓度设为1重量％、0.5重量％、0.25重量％这3种的EDTA/EGTA/CMC-PBS(分别为终浓度50mM/50mM/1重量％、0.5重量％、0.25重量％)溶液600μL中，添加从固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司#14204)final1.2mg/mL和BxPC3(人胰脏线癌细胞株)而回收的EV 1.3μg，在37℃下反应1小时而使其结合，对得到的物质以频率30kHz(35w)((株式会社)KAIJO QUAVAmini QR-001)照射3分钟。作为阴性对照，准备使用添加了0.5重量％CMC浓度的EDTA/EGTA/CMC-PBS溶液并且不照射超声波的组。作为超声波装置的振动子，使用了干式的振动子。超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值对磁性粒子的混入进行了比较。
其结果，在将CMC浓度设定为0.5重量％以下的EDTA/EGTA/CMC溶液中，超声波照射样品与不照射相比，观察到集磁效率的提高(图13)。
(实施例15)
超声波对包含CMC以外的纤维素衍生物的溶液中的磁性粒子的集磁效率的效果的探讨
对在包含CMC以外的纤维素衍生物的溶液中，通过超声波是否提高磁性粒子的集磁效率进行了比较探讨。
向溶解于PBS的纤维素衍生物溶液(0.25重量％-4.0重量％)600μL中添加从固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司#14204)final1.2mg/mL和BxPC3(人胰脏线癌细胞株)而回收的EV 1.3μg。在37℃下反应1小时而使其结合，对得到的物质以频率30kHz(35w)((株式会社)KAIJO QUAVAmini QR-001)照射3分钟。作为阴性对照，准备使用添加了0.5重量％CMC浓度的EDTA/EGTA/CMC-PBS溶液并且不照射的组。作为超声波装置的振动子，使用了干式的振动子。超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值对磁性粒子的混入进行了比较。使用的纤维素衍生物为羟丙基纤维素(HPC)：平均分子量80kDa#435007和羟乙基纤维素(HEC)：平均分子量380kDa#308633(均为SIGMA-ALDRICH公司)。
其结果，即使在包含CMC以外的纤维素衍生物的溶液中，超声波照射样品与不照射超声波相比，也观察到磁性粒子的集磁效率的提高。特别是，HPC为2.0重量％以下，HEC为0.5重量％以下时其效果显著(图14)。
(实施例16)
超声波输出对磁性粒子的集磁效率的影响的探讨
对超声波输出是否影响磁性粒子的集磁效率进行了探讨。
将从固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司#14204)final 1.2mg/mL和BxPC3(人胰脏线癌细胞株)而回收的EV 1.3μg添加至2mL管中的EDTA/EGTA/CMC-PBS(分别为终浓度50mM/50mM/0.5重量％)溶液600μL中，在37℃下1小时使其结合。以频率30kHz，将输出设定为10w、20w、35w，照射了3分钟((株式会社)KAIJOQUA VAmini QR-001)。此外，代替干式超声波装置，还进行了水槽式(频率40kHz，输出70w，EMERSON BRANSONIC M1800-J)的照射。作为阴性对照，准备不照射的组。超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值对磁性粒子的混入进行了比较。
其结果，超声波照射样品在任一输出条件下，都与不照射相比，观察到集磁效率的提高(图15)。
(实施例17)
糖分解酶对EV回收效率的效果的探讨
对在含纤维素衍生物的溶液中，糖分解酶是否提高EV回收效率进行了探讨。
将200μL的健康人血浆在20000×g、4℃下进行15分钟离心后，用200μL的EDTA/EGTA/CMC-PBS(分别为终浓度37.5mM/37.5mM/0.5重量％)进行稀释，添加固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFE TECHNOLOGIES公司)并使其为0.26mg/mL。在4℃下旋转反应一晚后，通过添加内切葡聚糖酶分解CMC以降低溶液的粘度。然后，从溶液中回收磁性粒子(B/F分离)，在37℃下用PBS-T清洗3次。接下来，以用于免疫印迹的样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行样品化，通过基于抗CD9抗体的免疫印迹法对EV回收效率进行了解析。
其结果，观察到糖分解酶提高EV回收效率(图16)。认为糖分解酶通过磁性粒子的集磁效率的提高而显示EV回收效率的提高。
(实施例18)
检查材料的种类对EV回收效率的效果的探讨
对基于超声波的集磁效率的提高效果是否也在血清检查材料中观察到进行了探讨。
向管中添加血清检查材料300μL和CMC(终浓度0.5重量％)、HEC(终浓度0.25重量％溶液)300μL，添加固定有抗CD9抗体的Dynabeads M-280 tosylactivated(LIFETECHNOLOGIES公司#14204)final 1.2mg/mL。在4℃下旋转反应一晚，以频率30kHz(35w)((株式会社)KAIJO QUAVAmini QR-001)照射3分钟。作为阴性对照，准备在CMC(终浓度0.5重量％)的条件下，不照射的组。超声波的照射后，通过集磁将磁性粒子和其以外的溶液分离(B/F分离)，回收分离得到的溶液，通过分光光度计(波长500nm)(JASCO(株式会社)V-650)的测定值对磁性粒子的混入进行了比较(表6，磁性粒子混入度)。此外，将除去分离得到的溶液后的管中的磁性粒子用PBS-T清洗3次后，分为2根，1根用40μL BRUB(Britton&Robinson Universal Buffer)(pH2.6)反应5分钟后，用20μL的1M Tris-HCl(pH8.0)中和，从而使细胞外囊泡从抗体粒子游离，用于纳米颗粒跟踪分析(NanoSight LM10，QUANTUMDESIGN公司)(图17)。另1根用样品缓冲液(BIO-RAD公司)进行免疫印迹的样品化，通过基于抗CD9抗体的免疫印迹法对EV回收效率进行了解析(图18)。
图17表示从磁性粒子游离得到的细胞外囊泡的纳米颗粒跟踪分析，在横轴上描绘了粒径，在纵轴描绘了粒子数/mL。将从图17的结果计算得到的、从磁性粒子游离得到的细胞外囊泡的浓度示于表6(粒子数/mL)。其结果，即使在血清检查材料中，与不照射超声波相比，通过进行超声波处理，也观察到集磁效率的提高和EV的回收效率的提高(表6、图17、18)。
[表6]
表6.使用了血清检查材料的情况下的磁性粒子的混入的评价和回收得到的细胞外囊泡浓度
序列表
<110> 合同会社予幸集团中央研究所
<120> 细胞外囊泡的回收方法
<130> PRBA-22342
<150> JP 2020-073131
<151> 2020-04-15
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测EML4-ALK mRNA的正向引物
<400> 1
cagatgatag ccgtaataaa ttgtcg 26
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测EML4-ALK mRNA的反向引物
<400> 2
cttccggcgg tacacttgg 19
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测EML4-ALK mRNA的荧光探针
<400> 3
actgcagaca agcataaaga tgtca 25
Claims (16)
1.一种细胞外囊泡的回收方法，其包含以下(a)和(b)：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)从所述混合液中分离所述目标粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其包含以下(a)～(c)：
(a)将(i)含细胞外囊泡的试样、(ii)固定有与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质的粒子和(iii)聚合物进行混合，得到包含(i’)借助所述物质与细胞外囊泡进行了结合的目标粒子和(ii’)聚合物的混合液；
(b)使所述混合液的粘度降低；
(c)从所述(b)中得到的溶液中分离所述目标粒子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其在所述目标粒子的分离后，包含：(I)清洗所述目标粒子和/或(II)使细胞外囊泡从所述目标粒子游离。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
通过基于超声波或具有聚合物分解能力的酶的处理来进行粘度的降低。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，
超声波为干式或水浴式。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，
超声波的频率为40kHz以下或950kHz以上的范围内。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
聚合物为多糖、蛋白质或具有含羰基的亲水性基团的聚乙烯衍生物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，
多糖为纤维素中的至少一个羟基的氢原子被羧基烷基或羟基烷基所取代的纤维素衍生物。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
聚合物具有10kDa以上的重均分子量。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
(a)的混合液中的聚合物浓度为0.01～10.00重量％。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
在(a)中，进一步混合(iv)螯合剂。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质为针对四跨膜蛋白的抗体或针对细胞外基质金属蛋白酶诱导物质的抗体。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
含细胞外囊泡的试样为培养上清试样或来源于动物的液体试样。
14.一种细胞外囊泡的分析方法，其包含以下(1)和(2)：
(1)通过权利要求1～13中任一项所述的方法，从含细胞外囊泡的试样中分离细胞外囊泡；
(2)对分离得到的细胞外囊泡进行分析。
15.一种试剂盒，其包含：(a)聚合物、(b)与细胞外囊泡膜具有亲和性的物质和(c)具有聚合物分解能力的酶，
所述物质为游离形态或固定于粒子的形态，
在所述物质为游离形态的情况下，可以进一步包含粒子。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，
聚合物为多糖或蛋白质，并且，具有聚合物分解能力的酶为糖分解酶或蛋白质分解酶。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020073131 | 2020-04-15 | ||
| JP2020-073131 | 2020-04-15 | ||
| PCT/JP2021/015500 WO2021210622A1 (ja) | 2020-04-15 | 2021-04-14 | 細胞外小胞の回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115461445A true CN115461445A (zh) | 2022-12-09 |
Family
ID=78085175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180028379.5A Pending CN115461445A (zh) | 2020-04-15 | 2021-04-14 | 细胞外囊泡的回收方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230227916A1 (zh) |
| EP (1) | EP4137559A4 (zh) |
| JP (1) | JPWO2021210622A1 (zh) |
| CN (1) | CN115461445A (zh) |
| WO (1) | WO2021210622A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112877274A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-01 | 南京大学 | 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用 |
| CN114752561A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-07-15 | 青岛大学 | 基于聚多巴胺纳米粒子的细胞外囊泡分离方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013045432A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Qiagen Gmbh | Rapid method for isolating extracellular nucleic acids |
| US20150010951A1 (en) * | 2010-10-28 | 2015-01-08 | Clinical Genomics Pty. Ltd. | Method of microvesicle enrichment |
| CN104302667A (zh) * | 2011-12-26 | 2015-01-21 | 盐野义制药株式会社 | 外来体检测用单克隆抗体 |
| WO2017154951A1 (ja) * | 2016-03-09 | 2017-09-14 | 国立大学法人名古屋大学 | 細胞外小胞の回収方法 |
| CN109153968A (zh) * | 2016-04-12 | 2019-01-04 | 联合细胞Ev股份公司 | 从生物流体样品中分离细胞外囊泡（ev） |
| CN109576207A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-05 | 贺川江 | 一种基于金属离子络合剂的细胞外囊泡的分离方法 |
| CN109891236A (zh) * | 2016-10-13 | 2019-06-14 | 合同会社明乐康中央研究所 | 回收胞外囊泡的方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5093087B2 (ja) * | 2008-12-18 | 2012-12-05 | 東ソー株式会社 | ポリエチレングリコールおよび尿素による免疫反応増強方法 |
| JP5461910B2 (ja) * | 2009-07-24 | 2014-04-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 微粒子の凝集抑制方法及び保存液 |
| CA2819260A1 (en) * | 2010-12-15 | 2012-06-21 | Cytosed, Inc. | Antibody-linked immuno-sedimentation agent and method of isolating a target from a sample using same |
| US20130273544A1 (en) * | 2012-04-17 | 2013-10-17 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for exosome isolation |
| WO2014003053A1 (ja) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | 独立行政法人国立がん研究センター | 膵臓がんの検出方法及び検出用キット |
| EP2971162B1 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Mirna biogenesis in exosomes for diagnosis and therapy |
| US9829483B2 (en) * | 2013-09-26 | 2017-11-28 | The General Hospital Corporation | Methods of isolating extracellular vesicles |
| KR101761680B1 (ko) | 2015-03-31 | 2017-08-23 | 포항공과대학교 산학협력단 | 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법 |
| JP2017038566A (ja) * | 2015-08-20 | 2017-02-23 | 国立大学法人広島大学 | エクソソームの精製用組成物 |
| WO2017197399A1 (en) * | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Exosome Diagnostics, Inc. | Automated and manual methods for isolation of extracellular vesicles and co-isolation of cell-free dna from biofluids |
| JP2018186739A (ja) * | 2017-05-01 | 2018-11-29 | Jsr株式会社 | 小胞凝集物の回収方法、小胞の回収方法、並びに小胞凝集物回収用の複合体及びキット |
| JP6712383B2 (ja) * | 2017-08-22 | 2020-06-24 | 国立大学法人広島大学 | エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット |
| WO2019160519A2 (en) * | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Yeditepe Universitesi | Exosome isolation method by two phase fluid system |
| US20190301985A1 (en) * | 2018-04-03 | 2019-10-03 | Tymora Analytical Operations, Inc. | Methods for affinity-based non-antibody capture and purification of extracellular vesicles |
| US20190324023A1 (en) * | 2018-04-20 | 2019-10-24 | Imra America, Inc. | Detection of extracellular vesicles using nanoparticles |
| US20210389304A1 (en) * | 2018-05-17 | 2021-12-16 | Meso Scale Technologies, Llc. | Methods for isolating surface marker displaying agents |
| WO2020080387A1 (ja) * | 2018-10-17 | 2020-04-23 | 合同会社みらか中央研究所 | 細胞外小胞の回収方法 |
| CN110231207B (zh) * | 2019-05-23 | 2021-10-08 | 上海迈景纳米科技有限公司 | 一种分离外泌体的方法 |
| WO2021055770A2 (en) * | 2019-09-18 | 2021-03-25 | Exosome Diagnostics, Inc. | Compositions, methods, and kits for the isolation of extracellular vesicles |
-
2021
- 2021-04-14 WO PCT/JP2021/015500 patent/WO2021210622A1/ja unknown
- 2021-04-14 JP JP2022515423A patent/JPWO2021210622A1/ja active Pending
- 2021-04-14 CN CN202180028379.5A patent/CN115461445A/zh active Pending
- 2021-04-14 US US17/996,048 patent/US20230227916A1/en active Pending
- 2021-04-14 EP EP21789510.1A patent/EP4137559A4/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150010951A1 (en) * | 2010-10-28 | 2015-01-08 | Clinical Genomics Pty. Ltd. | Method of microvesicle enrichment |
| WO2013045432A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Qiagen Gmbh | Rapid method for isolating extracellular nucleic acids |
| CN104302667A (zh) * | 2011-12-26 | 2015-01-21 | 盐野义制药株式会社 | 外来体检测用单克隆抗体 |
| WO2017154951A1 (ja) * | 2016-03-09 | 2017-09-14 | 国立大学法人名古屋大学 | 細胞外小胞の回収方法 |
| CN109153968A (zh) * | 2016-04-12 | 2019-01-04 | 联合细胞Ev股份公司 | 从生物流体样品中分离细胞外囊泡（ev） |
| CN109891236A (zh) * | 2016-10-13 | 2019-06-14 | 合同会社明乐康中央研究所 | 回收胞外囊泡的方法 |
| CN109576207A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-05 | 贺川江 | 一种基于金属离子络合剂的细胞外囊泡的分离方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张维;俞立;陈扬;: "细胞外囊泡检测分析方法研究进展", 中国细胞生物学学报, no. 01, 15 January 2020 (2020-01-15) * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112877274A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-01 | 南京大学 | 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用 |
| CN112877274B (zh) * | 2021-01-29 | 2024-02-09 | 南京大学 | 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用 |
| CN114752561A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-07-15 | 青岛大学 | 基于聚多巴胺纳米粒子的细胞外囊泡分离方法 |
| CN114752561B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-07-11 | 青岛大学 | 基于聚多巴胺纳米粒子的细胞外囊泡分离方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230227916A1 (en) | 2023-07-20 |
| EP4137559A1 (en) | 2023-02-22 |
| WO2021210622A1 (ja) | 2021-10-21 |
| JPWO2021210622A1 (zh) | 2021-10-21 |
| EP4137559A4 (en) | 2024-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jia et al. | Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications | |
| CN115461445A (zh) | 细胞外囊泡的回收方法 | |
| EP3869177A1 (en) | Method for recovering extracellular vesicles | |
| IL247413A (en) | Methods and compositions for isolating exosomes | |
| JP7163192B2 (ja) | Ｃｏ２プラズマ活性化表面にカップリングする水性生体分子 | |
| CN105452466A (zh) | 适体及其用途 | |
| CN107614458A (zh) | 稳定的纳米磁性颗粒分散体 | |
| US9988686B2 (en) | Stimulus-sensitive microparticles and methods of use | |
| EP3805759A1 (en) | Method for the isolation of intact extracellular vesicles | |
| JP7426447B2 (ja) | 細胞外小胞の固定および保持 | |
| US7208281B2 (en) | Ligands used for detecting prions | |
| US11493412B2 (en) | Method and kit for exosomes and associated biomacromolecules capture | |
| Kowalczyk et al. | Parallel SPR and QCM-D Quantitative Analysis of CD9, CD63, and CD81 Tetraspanins: A Simple and Sensitive Way to Determine the Concentration of Extracellular Vesicles Isolated from Human Lung Cancer Cells | |
| JP2019215342A (ja) | ヒト尿からのマイクロベシクルの分離方法及び分析方法 | |
| US20140011192A1 (en) | Particle complex and method of isolating target cell | |
| JP2008275534A (ja) | 標的高分子の精製方法及び検出方法 | |
| CN114323863B (zh) | 一种外泌体阵列捕获探针的制备方法与应用 | |
| Wang et al. | Single microbead-based fluorescent aptasensor (SMFA) for direct isolation and in situ quantification of exosomes from plasma | |
| JP2017079635A (ja) | 腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアー | |
| Brambilla | IMMUNO-AFFINITY CAPTURE AND RELEASE OF EXTRACELLULAR VESICLES AND THEIR CHARACTERIZATION AS NOVEL DIAGNOSTIC TOOLS | |
| Yin et al. | Progress, challenges, and prospects of small extracellular vesicles isolation and characterization | |
| Goldbloom-Helzner et al. | Assessing the conjugation efficiency of surface-modified extracellular vesicles using single nanovesicle analysis technologies | |
| KR20220117758A (ko) | 생물학적 표적의 분리를 위한 나노 입자 복합체 및 이의 제조 방법 | |
| Dilsiz | Isolation and characterization of exosomes | |
| Gundersen et al. | Immune recognition of exposed xenoantigens on the surface of PEGylated bovine red blood cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |