KR20010097731A

KR20010097731A - 다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법.

Info

Publication number: KR20010097731A
Application number: KR1020000022047A
Authority: KR
Inventors: 김희태
Original assignee: 김희태
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2001-11-08

Abstract

본 발명은 바닥이 편평하게 제조된 0.2ml PCR용 Tube의 직경 4mm의 바닥 표면에 다양한 종류의 Primer들을 각각 위치별 차이를 주어 각각 부착하고 PCR반응을 위하여 준비된 반응액 속에는 Tube 바닥에 부착된 Primer와 상응하여 PCR반응을 수 행할 수 있는 Primer( 이하 용액상의 미부착 Primer )를 넣어준다. 이들과 분석하고자 하는 핵산 시료와 PCR 반응을 이루어지도록 하여준다. PCR 반응이후 alkali 용액을 처리하여 용액상의 미부착 Primer에 의하여 합성된 PCR 결과물을 제거하고 여기에 표지자가 부착된 Probe를 가하여 Tube 바닥에 부착된 Primer에 의해 형성된 PCR 결과물과 Hybridization 시켜준다. 본 Probe는 PCR 결과물의 내부 핵산의 염기서열로 구성되어 비 특이적인 PCR 반응의 결과물과는 핵산 결합 반응을 이루지 않는다. 상기의 실험 결과물을 Laser scanner등의 판독기구를 활용하여 표지자가 부착된 Probe의 PCR Tube 바닥에서의 위치를 확인하는 방법으로 유전 정보를 분석하는 실험기법이다.

Description

다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를 피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하 피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된 탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어 유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법.{Multiplexed PCR in one tube with numerous different type of primers that bound on tube bottom surface at specific site to each other primers( one strand of sense or antisense ) and detected by hybridization with labelled Probe.}

본 발명은 바닥이 편평하게 제조된 0.2ml PCR용 Tube의 직경 4mm의 바닥 표면에 다양한 종류의 Primer들을 각각 위치별 차이를 주어 각각 부착하고 PCR반응을 위하여 준비된 반응액 속에는 Tube 바닥에 부착된 Primer와 상응하여 PCR반응을 수행할 수 있는 Primer( 이하 용액상의 미부착 Primer )를 넣어준다. 이들과 분석하고자 하는 핵산 시료와 PCR 반응을 이루어지도록 하여준다. PCR 반응이후 alkali 용액을 처리하여 용액상의 미부착 Primer에 의하여 합성된 PCR 결과물을 제거하고 여기에 표지자가 부착된 Probe를 가하여 Tube 바닥에 부착된 Primer에 의해 형성된 PCR 결과물과 Hybridization 시켜준다. 본 Probe는 PCR 결과물의 내부 핵산의 염기서열로 구성되어 비 특이적인 PCR 반응의 결과물과는 핵산 결합 반응을 이루지 않는다. 상기의 실험 결과물을 Laser scanner등의 판독기구를 활용하여 표지자가 부착된 Probe의 PCR Tube 바닥에서의 위치를 확인하는 방법으로 유전 정보를 분석하는 실험기법이다.

기존의 기법은 DNA Probe를 membrane또는 Glass Plate에 DNA probe를 부착하고 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 시켜주어 분석을 하는 Hybridization기법( Sequence specific oligonucleotide 이하 SSO )과 여러 종류의 Primer들을 각각 따로 PCR 반응을 시켜주어 이를 전기영동 하여 확인하는 기법( Sequence specific Primer 이하 SSP )들이 주로 활용되고 있다. 각 방법의 특징과 단점은 아래와 같다.

첫 번째 방법인 Membrane을 활용한 기법( SSO 기법)은 Membrane 표면에 여러 종류의 DNA Probe를 부착하여준 후 여기에 확인하고자 하는 DNA를 PCR등의 과정을 거쳐 표지자를 부착한 이후 이를 화학적인 방법으로 변성 시켜주고 이를 준비된 membrane에 특정한 핵산 결합 용액과 함께 가하여준 뒤 온도를 일정하게 유지시켜 반응시킨 뒤 다양한 표식 확인 방법을 활용하여 핵산 결합 여부를 확인하는 기법이다.단점은 Membrane을 사용하는 기법도 PCR이라는 핵산 증폭과정을 따로 수행하여야 하며 이 과정에서 얻어진 PCR 결과물을 Membrane에서 다양한 Probe와의 핵산 결합으로 확인하고자 하는 핵산의 유무를 확인하는 기법이기에 기본적으로 시험과정이 복잡하며 긴 시간이 소요되고 다량의 검사에는 부적합하다.

두 번째 방법은 각 Primer 별로 각각 PCR을 수행하고 이를 전기영동으로 확인하는 SSP기법은 분석하고자 하는 핵산을 여러 종류의 Primer와 PCR 반응을 각각 시켜주고 이를 전기영동으로 분석하는 방법으로 현재 주로 HLA와 암 유전자 확인에 활용되고 있는 기법이다.단점은 본 기법은 한 종류의 핵산을 검사하기 위하여 한번에 많은 PCR 반응을 수행하여야 하며 전기영동의 경우에도 많은 수의 전기영동을 수행하여야 한다. 이러한 이유로 본 기법은 소수의 시료의 경우에는 가능하나 시료가 다수일 경우에는 적용이 불가능하다.

세 번째 방법은 Glass Plate표면에 DNA Probe를 부착하여 활용하는 기법(이하 DNA Chip)은 glass 표면에 여러 종류의 DNA Probe를 부착하여 준 뒤 여기에 확인하고자 하는 PCR 결과물을 주입하여 반응시킨 뒤 이를 세척하고 핵산 결합 여부와 정도를 laser scanner등을 활용하여 읽어 내는 방법이다.

단점은 본 기법은 1개의 Glass plate에 여러 개의 probe를 부착할 수 있는 장점으로 한 종류의 핵산 시료로부터 많은 정보를 얻어낼 수 있지만 한번에 1개의 Plate에 하나의 시료만을 처리하여야 하기에 동시에 여러 개의 시료를 처리하는 것은 불가능하다.

상기와 같은 기존의 기법들은 각각의 불편한 점을 내포하고 있기에 새로운 기법의 발명이 요구되었으며 본 발명은 이러한 요구에 부합하는 경제적이며 효율적인 실험 기법이다.

그리고 본 기법을 활용할 경우 기존에 PCR과 hybridization그리고 미생물 배양 등을 주로 사용하여 시험하였던 HLA Typing이나 암 유전자 확인, 수(헌)혈 혈액내 감염여부 확인 그리고 농수축산물의 미생물검역 등과 같이 한 종류의 핵산 시료에서 다수의 검사가 함께 시행되어야만 하는 실험에 활용할 수 있으며 이와 함께 핵산 추출 이후의 모든 과정이 자동화될 수 있어 다수의 핵산 시료 분석에 적합하다.

(1)다양한 종류의 DNA Primer를 그림 1과 같이 PCR Tube의 표면에 부착하여 주는 기술을 개발한다.

(2)상기(1)에서 준비된 PCR Tube내에서 PCR 반응에 의하여 분석하고자 하는 핵산의 유전 정보들이 효과적으로 분석 될 수 있는 PCR 조건을 개발한다.

(3)상기(1)의 PCR Tube에 그림 2의 1)과 같이 용액상의 미부착 Primer들을 가하여주고 PCR 반응을 시켜준다.

(4) PCR Tube 표면에 부착된 Primer 중 PCR반응을 이룬 Primer는 그림 2의 2)와 같이 핵산 이중 결합을 하고 있을 것이다. 그림 2의 3)과 같이 alkali 용액을 가하여 용액상의 미부착 primer에 의하여 합성된 PCR 결과물을 제거한다.

(5)상기(4)에 그림 2의 4)와 같이 표지자가 부착된 다종다양한 Probe를 가하여 PCR Tube 바닥에 부착된 Primer에 의하여 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 시켜준다. PCR Tube를 세척하여 핵산 결합을 이루지 못한 Probe를 제거한다.

(6)상기(4)에서와 같이 PCR Tube내에서 각각의 Primer와 PCR 반응을 이룬 핵산의 유전 정보를 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룬 표지자가 부착된 Probe의 PCR Tube내에서의 위치를 분석하는 것을 통하여 판독할 수 있는 기술을 개발한다.

그림 1. DNA Primer가 부착된 Micro well plate의 Tube측면, 바닥면.

그림 2. 반응모식도.

※ 본 발명을 명확히 설명하기 위하여 HLA Typing을 활용하여 설명한다.

[실시예 1]

(1) 분석하고자 하는 사람의 혈액으로부터 핵산을 추출한다.

(2) 상기 (1)의 핵산을 Primer들이 부착된 PCR tube에 주입한다

(3) PCR Tube에 부착된 Primer와 상응하는 용액상의 미부착 Primer들과 PCR 반응 첨가물들을 상기 (2)의 Tube에 넣어 PCR 반응을 수행하여 준다.

(4)상기(3)의 PCR Tube를 alkali 용액으로 세척하여 (3)에서 가하여준 용액상의 미부착 Primer에 의해 합성된 PCR 결과물을 제거한다.

(5)상기(4)의 PCR Tube에 다종다양한 표지자가 부착된 Probe를 가하여 PCR Tube에 부착된 Primer에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있도록 하여준다. ( 이때 각 Probe들은 각각의 Primer들에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있는 내부 핵산 서열로 이루어져 있다. )

(6)상기(5)에서의 표지물질의 위치를 판독기로 분석하여 핵산의 정보를 해석한다.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 핵산은 위와 같이 HLA DR7 Primer와 PCR반응을 하였고 상응하는 Probe와 핵산 결합 반응하였으므로 HLA Type DR7로 판정된다.

[실시예 2]

(1)분석하고자 하는 사람의 혈액으로부터 핵산을 추출한다.

(2)상기(1)의 핵산을 Primer들이 부착된 PCR tube에 주입한다

(3)PCR Tube에 부착된 Primer와 상응하는 용액상의 미부착 Primer들과 PCR 반응 첨가물들을 상기 (2)의 Tube에 넣어 PCR 반응을 수행하여 준다.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 핵산은 위와 같이 HLA DR16 Primer와 PCR반응을 하였고 상응하는 Probe와 핵산 결합 반응하였으므로 HLA Type DR16으로 판정된다.

[실시예 3]

(1)분석하고자 하는 사람의 혈액으로부터 핵산을 추출한다.

(2)상기(1)의 핵산을 Primer들이 부착된 PCR tube에 주입한다

(5)상기(4)의 PCR Tube에 다종다양한 표지자가 부착된 Probe를 가하여 PCR Tube에 부착된 Primer에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있도록 하여준다.(이때 각 Probe들은 각각의 Primer들에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있는 내부 핵산 서열로 이루어져 있다. )

시험 결과 : 본 시험에 활용된 핵산은 위와 같이 HLA DR4 Primer와 PCR반응을 하였고 상응하는 Probe와 핵산 결합 반응하였으므로 HLA Type DR4로 판정된다

[실시예 4]

(1)분석하고자 하는 사람의 혈액으로부터 핵산을 추출한다.

(2)상기 (1)의 핵산을 Primer들이 부착된 PCR tube에 주입한다

(5)상기(4)의 PCR Tube에 다종다양한 표지자가 부착된 Probe를 가하여 PCR Tube에 부착된 Primer에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있도록 하여준다.( 이때 각 Probe들은 각각의 Primer들에 의해 합성된 PCR 결과물과 핵산 결합 반응을 이룰 수 있는 내부 핵산 서열로 이루어져 있다. )

(6) 상기 (5)에서의 표지물질의 위치를 판독기로 분석하여 핵산의 정보를 해석한다.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 핵산은 위와 같이 HLA DR9 Primer와 반응을 하였고 상응하는 Probe와 핵산 결합 반응하였으므로 HLA Type DR9로 판정된다.

[비교예 1]

본 발명의 기법과 기존의 Membrane 사용 시험법( SSO 응용기법 )과의 비교.

(1)핵산결합반응을 시켜보고자 하는 여러 종류의 DNA Probe를 Membrane에 부착하여 고정 시켜준다.

그림 6. 각 HLA Type에 대하여 특이적인 DNA Probe가 부착된 Membrane.

(2) 위의 그림 6.과 같이 DNA Probe가 부착, 고정된 Membrane을 결합반응 용액에 넣어 활성화시켜준다.

(3) PCR등의 방법을 통해 방사선 동위원소나 이와 유사하게 사용되는 표식인자( DIG, Biotin )를 부착한 핵산을 준비한다.

(4) 상기 (3)에서 준비된 핵산을 열변성을 시켜주어 핵산간의 특이결합이 이루어질 수 있도록 준비하여 주입하여 준다.

(5) 1시간 정도 반응을 시켜준 후 세척 용액을 사용하여 결합반응을 이루지 못한 상기(3)의 표식된 핵산을 제거하여 준다.

(6) 상기 (5)에서 세척된 Membrane을 핵산을 표식된 방법에 따라 각기 다른 판독 방법을 사용하여 판독한다.

(가)동위원소표식법 : 세척된 Membrane를 차광된 암실에서 X-ray film에 부착하고 이를 영하 70℃에 16시간 이상 보관하였다가 X-ray film을 떼어내어 이를 현상하여 시험 결과를 판독한다.

(나)DIG, Biotin 표식법 : 이두가지 물질은 핵산표식에 사용되는 대표적인물질이며 이들과 특이적으로 결합하는 항체나 단백질에 발색 또는 형광 효소를 부착하여 상기(6)의 세척된 Membrane에 가하여 핵산에 부착된 DIG, Biotin에 결합 시켜주고 여기에 발색 시약 등을 주입하여 반응시켜주고 이를 판독한다.

비교 결과 : 상기의 Membrane 기법은 과정의 복잡함에의 하여 동시 시험 가능하며 시료의 수량이 제한된다. 이에 반하여 본 발명의 기법은 핵산 추출 이후 각 핵산별로 각각을 한 개의 PCR Tube내에서 반응 시켜주고 결과를 분석하기에 다수의 핵산을 동시에 분석할 수 있다.

[비교예 2]

본 발명의 기법과 기존의 SSP 시험법과의 비교.

(1) HLA Type을 분석하고자 하는 핵산을 분리한 뒤 이를 각각의 핵산 서열 특이 Primer와 각각 반응을 시켜준다.

(2) 상기 (1)에서 PCR 반응을 이룬 각각의 PCR 결과물들을 전기영동 하여 PCR 결과를 해석하여 대상 핵산의 HLA Type을 분석하는 기법.

비교 결과:

(1)본 기법은 HLA 분석에 사용되는 많은 종류의 Primer들을 각각 대상 핵산과 PCR 반응을 시켜 주어야 하기에 PCR 반응이 Primer의 종류 수 와 같이 이루어진다, 예를 들어 만일 40종의 Primer가 사용된다면 40개의 각각의 PCR 반응이 수행되어야 한다.

(2)상기 (1)에서 이루어진 PCR 결과물들을 각각 40회의 전기영동을 하여 HLA Type을 분석한다

(3)상기 와 같은 실험 특성상 다양한 종류의 많은 핵산 시료의 실험에는 부적합한 기법이다. 이에 반하여 본 발명 기법은 하나의 핵산에 한 개의 PCR 반응만을 수행하며 이를 Probe와의 결합 반응을 이루게 하고 이를 판독기로 분석하기에 짧은 시간에 많은 핵산 시료를 분석할 수 있다.

[비교예 3]

본 발명의 기법과 기존의 DNA Chip을 사용한 시험법( SSO 응용기법 )과의 비교.

(1) 핵산결합반응을 시켜보고자 하는 여러 종류의 DNA Probe를 위치별로 HLA type에 준하여 Glass Plate 표면에 부착하여 고정 시켜준다.

그림 6. 각 HLA Type에 대하여 특이적인 DNA Probe가 부착된 Glass Plate.

(2) 위의 그림 6.과 같이 DNA Probe가 부착, 고정된 Glass Plate에 PCR등의 방법을 통해 얻어진 시험대상 핵산을 열변성 시켜준 뒤 이를 도포 하여 준다. 이때 시험대상 핵산은 PCR 과정에 의하여 표지자가 부착되어있게 된다.

(3) 1-2분 정도 반응을 시켜준 후 세척 용액을 사용하여 결합반응을 이루지 못한 핵산을 제거하여 준다.

(4) 세척된 Glass Plate는 laser scanner등의 판독기를 사용하여 표지자의위치를 판독한다.

(5) 판독이 이루어진 이후 Glass Plate는 다음 시험 대상 시료의 처리를 위하여 가열과 세척 등의 방법에 의하여 부착된 핵산을 세척, 제거한다.

비교 결과 :

(1) DNA Chip의 경우 핵산 결합 시험의 회수가 반복되어질수록 부착된 DNA Probe의 양이 감소하여 1개의 Glass Plate가 분석에 활용될 수 있는 시료의 수량이 5-10개로 제한된다. 이러한 이유로 다량의 핵산 시료가 분석 되어야할 경우에는 Glass Plate를 교체하여 주어야 한다.

(2) 기존의 DNA Chip 기법은 위와 같은 방법과 순서로 시험이 진행되기에 각각의 핵산 시료를 PCR시켜준 뒤 이를 각각 위와 같이 분석하여야 하기에 많은 검체 분석의 경우 매우 오랜 시간이 소요된다.

(3) 본 발명의 기법은 PCR Tube에 DNA Primer들을 동일하게 부착, 고정하여 사용하기에 짧은 시간에 다수의 시료를 분석할 수 있다.

Claims

(가)다양한 종류의 특이 DNA Primer를 한 개의 PCR Tube안에 각각 위치적으로 명확히 구분되어지도록 부착하고,

(나) 상기 (가)단계의 여러 종류의 Primer가 부착된 한 개의 PCR Tube안에 시험하고자 하는 핵산을 넣어주고,

(다) PCR Tube에 부착된 Primer와 상응하여 PCR 반응을 수행할 수 있는 용액상의 미부착 Primer와 반응 첨가물을 주입하여 PCR 반응을 시켜주고,

(라)상기(다)단계에서 반응이 이루어진 PCR Tube를 alkali 용액으로 세척하여 상기(다)에서 주입된 용액상의 미부착 Primer에 의해 합성된 PCR 결과물을 제거시켜주고,

(마)상기(라)의 PCR Tube에 PCR 결과물과 핵산 결합을 이룰 수 있는 표지자가 부착된 Probe를 가하여 핵산 결합을 이루게 하여주고,

(바)상기(마)에서 주입하여 PCR 결과물과 결합된 표지자가 부착된 Probe의 위치를 분석하여 핵산의 정보를 확인하는실험기법.