DE69918123T2

DE69918123T2 - Verfahren und reagentiensatz zur erkennung von protein-protein wechselwirkungen

Info

Publication number: DE69918123T2
Application number: DE69918123T
Authority: DE
Inventors: Ami Aronheim
Original assignee: Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences
Current assignee: Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2019-07-23
Also published as: EP1098967B1; WO2000005410A2; US6582927B2; EP1098967A2; IL128017A0; WO2000005410A3; DE69918123D1; AU4927499A; US20020137017A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Molekularbiologie und im Genaueren auf ein Verfahren zur Identifizierung von Proteinpaaren, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Begriff "Protein-Protein-Wechselwirkungen" bezieht sich auf die Fähigkeit neuer Proteinmoleküle, so aneinander zu binden, dass sie einen Komplex ausbilden. Solche Protein-Protein-Wechselwirkungen sind an einer großen Anzahl biologischer Abläufe beteiligt, einschließlich beispielsweise Signaltransduktionspfaden, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, viralen Adhäsionen und der Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen.
Viele Proteine sind in der Lage, mit einer Anzahl anderer Proteine eine Wechselwirkung einzugehen. Die Identifizierung und Charakterisierung solcher Wechselwirkungen sind in hohem Maße wichtig für das Verstehen von biologischen Mechanismen, Signaltransduktionspfaden, etc., sowie für die Charakterisierung der molekularen Basis verschiedener Erkrankungen, wie beispielsweise Funktionsstörungen, sowie bei der Planung von Therapien.
Ein Defekt in einem Protein, der dieses von der Teilnahme an einer Protein-Protein-Wechselwirkung abhält, kann, wenn es bevorzugt wird, auf eine Zelle zerstörerische Effekte besitzen.
Die Fähigkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren und zu charakterisieren, ermöglicht die Identifizierung von den Defekten in solchen Wechselwirkungen, die mit einem Erkrankungsstadium assoziiert sind. Die Identifizierung solcher Defekte stellt ein Target für potenzielle Therapien zur Heilung oder Verminderung der Erkrankung zur Verfügung. Weiterhin stellt die Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ein Mittel zum Screening von Wirkstoffen zur Verfügung, die die Wechselwirkung verändern. Solche Wirkstoffe können beispielsweise bei der Behandlung einer Erkrankung nützlich sein, die zumindest zum Teil durch eine abweichende Protein-Protein-Wechselwirkung verursacht werden.
Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden im Überblick in Allen et al., Trends Biochem. Sci., 20: 511–516, 1995 beschrieben.
Proteine, die an einer Protein-Protein-Wechselwirkung beteiligt sind, können durch die Detektion der Anwesenheit des Proteinkomplexes in einer Zelle oder in einer Körperflüssigkeit identifiziert werden, und durch Aufreinigen derjenigen Proteine mittels biochemischen Verfahren, die den Komplex bilden. Solche Isolationsverfahren sind gleichwohl extrem ausgedehnt, insbesondere, wenn das Protein auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, oder falls lediglich einige wenige Zellen das Protein exprimieren. Die Immobilisation von Proteinen auf Membranfiltern führte kürzlich zur Entwicklung von filterbasierten Testverfahren unter Verwendung von Proteinen, die aus cDNA-Molekülen translatiert wurden, die beispielsweise aus Phagen erhalten wurden. Die filterbasierten Testverfahren sind, obwohl sensitiver, gleichwohl ebenfalls zumeist sehr ausgedehnt.
US 5,776,689 beschreibt ein Proteinrekrutierungssystem, in welchem eine Protein-Protein-Wechselwirkung durch Rekrutierung eines Effektorproteins an einen spezifischen Zellbestandteil detektiert wird, wobei das Effektorprotein ein Reportermolekül aktivieren kann, vorausgesetzt, dass das Effektorprotein kein Transkriptionsfaktor ist, wobei das Proteinrekrutierungssystem nicht den Ausstoß eines Fusionsproteins umfasst, welches ein mutiertes Ras-Protein umfasst. US 5,776,689 stellt ebenfalls ein Screeningverfahren für Wirkstoffe unter Verwendung des Proteinrekrutierungssystems sowie einen Kit zur Durchführung des Proteinrekrutierungssystems zur Verfügung.
Es wurde ebenfalls ein genetisches Verfahren zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen entwickelt (Fields et al., Nature, 340: 245–246, 1989). In diesem Verfahren, welches als "Two-Hybrid-Assay" bekannt ist, wird ein Protein an eine DNA-Bindungsdomäne (typischerweise aus dem Gal4-Protein) fusioniert, während ein anderes Protein an eine starke Transkriptionsaktivierungsdomäne fusioniert wird. Die Bin dung der zwei Proteine innerhalb einer Zelle erzeugt daher einen funktionellen Transkriptionsfaktor, welcher durch eine Änderung des Phänotyps der Zelle aufgrund der Expression von Genen detektiert wird, deren Transkription unter der Kontrolle von Gal4-DNA-Elementen steht. Das Two-Hybrid-System leidet gleichwohl unter verschiedenen Einschränkungen. Zuerst können offensichtlicherweise keine Proteinpaare analysiert werden, in welchen eines der Proteine eine eigene Transkriptionsaktivität besitzt. Dies schließt bona fide Transkriptionsfaktoren, wie auch Proteine, mit ein, die Domänen enthalten, welche stark mit der Transkriptionsmaschinerie wechselwirken. Eine andere Begrenzung des Two-Hybrid-Systems resultiert aus der Toxizität vieler Proteine, wie beispielsweise zu bestimmten Homöodomänenproteinen und Zellzyklusregulatoren, wenn diese im Kern exprimiert werden. Das Two-Hybrid-System erzeugt weiterhin falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse, falls eines der Proteine eine Konformationsänderung im Kern durchläuft.
Ein anderes genetisches Verfahren, das "Sos-Rekrutierunssystem" (SRS) wurde ebenfalls beschrieben (Aronheim, A., Mol. Cell. Biol., 17: 3094–3102, 1997 und US-Patent Nr. 5,776,689). Dieses Verfahren basiert auf der Beobachtung, dass die Lokalisierung des Proteins hSos (der Ras-Guaninnukleotidaustauschfaktor) an der Plasmamembran zur Aktivierung des Ras-Pfades und daher für die Lebensfähigkeit essentiell ist. Ein Hefestamm, wie beispielsweise cdc-2, der ein temperatursensitives Allel von Cdc25-2 (ein Hefehomolog von hSos) enthält, ist daher lediglich bei der zulässigen Temperatur (24°C) lebensfähig. Im SRS-System wird ein erstes Protein (Bait-Protein) an hSos fusioniert, während ein zweites Protein (das Prey-Protein) an eine Membranlokalisierungsdomäne fusioniert wird. Eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen den Bait- und Prey-Proteinen lokalisiert hSos an der Plasmamembran. Dies komplementiert die Cdc25-Mutation, welche als Zellwachstum bei der eingeschränkten Temperatur (36°C) detektiert wird. Das SRS zeigt gleichwohl ebenfalls verschiedene Einschränkungen. Zuerst führen etwa 20–30% aller Bait-Proteine, die an hSos fusioniert waren, zu einer Prey-unabhängigen Komplementierung von Cdc25, eine Tatsache, welche zu einem relativ hohen unspezifischen Hintergrundsignal ("Rauschen") führt. Eine andere Einschränkung des SRS-Systems ist, dass der Effektorteil von hSos relativ groß ist (150 Kda). Dies kompliziert daher tendenziell die Fusion an hSos von sowohl großen Bait-Proteinen wie auch von kurzen Bait-Proteinen.
Ein anderes Problem des SRS-Systems ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass durch Ras kodierte Proteine in der Lage sind, die Cdc25-Mutation zu umgehen, da die GTPase aktivierten Proteine aus Hefe (IRA-Gene) das an Ras-Proteine aus Säugetieren gebundene GTP eher ineffizient hydrolysieren, als dass sie die Ras-Proteine in ihrer aktiven GTP-gebundenen Form belassen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht von der Tatsache Gebrauch, dass Ras für seine Funktion an der Plasmamembran lokalisiert sein muss. Diese Lokalisierung findet normalerweise über die kovalente Anlagerung eines Lipidrestes an Cystein 186 statt, welches Ras an der Membran verankert. Ras enthält eine Konsensus-CAAX-Box, die am C-terminalen Ende lokalisiert ist, welche eine Farnesylierung und anschließend eine Palmitoylierung durchläuft. Ein Ras, dem die Farnesylierungsbox (CAAX) fehlt, ist nicht funktionell, da es nicht an der Membran lokalisiert werden kann. Die vorliegende Erfindung verwendet daher Zellen mit einem Ras, das so mutiert ist, dass es nicht an der Membran lokalisiert werden kann, z. B. durch Auslassen der Farnesylierungsbox oder durch eine darin vorhandene Mutation. Die Zellen sind so "geplant", dass sie zwei Fusionsproteine exprimieren, wobei ein Fusionsprotein ein erstes Protein umfasst (hier manchmal als "Bait" bezeichnet) und ein Ras-Protein, welches so mutiert ist, dass es nicht an die Plasmamembran binden kann, sowie ein anderes Fusionsprotein, welches ein zweites Protein umfasst (hier manchmal als das "Prey" bezeichnet) und eine Membranlokalisierungsdomäne. Falls das Bait das Prey bindet, wird das an das Prey fusionierte Ras an der Membran lokalisiert und kann dadurch funktionieren.
1 zeigt eine schematische Darstellung der Erfindung. In Feld A wird eine Zelle, die nicht in der Lage ist, ein funktionelles Ras zu exprimieren, dazu veranlasst, ein Ras zu exprimieren, welches nicht an der Membran lokalisiert werden kann (und daher nicht funktionell ist) und das an ein Bait-Protein fusioniert ist. Ein vermutliches Prey-Protein hat sich an der Plasmamembran niedergelassen. Eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen dem Prey- und den Bait-Proteinen (Feld B) lokalisiert Ras an der Plasmamembran. Dies erzeugt ein funktionelles Ras, welches als phänotypische Änderung in der Zelle detektiert wird.
Dieses Ras-Rekrutierungssystem (RRS) besitzt verschiedene Vorteile gegenüber dem SRS-System:

1. Das Ras-Protein ist verhältnismäßig klein, wodurch verschiedene der technischen Begrenzungen und praktischen Probleme überwunden werden, die sich durch die große Größe des oben beschriebenen Sos bieten.
2. Das RRS-System zeigt im Wesentlichen weniger falsch-positive Ergebnisse im Vergleich zum SRS bei Screenings aus cDNA-Expressionsbibliotheken von Säugetieren und repräsentiert daher ein effizienteres System zur Charakterisierung von miteinander wechselwirkenden Proteinen.

Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Identifizierung einer Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen einem ersten Protein und einem zweiten Protein bereit, umfassend die Schritte:

(a) Expression in einer Zelle, welche nicht in der Lage ist, ein Ras-Protein zu aktivieren;
(aa) eine erste Nukleinsäuresequenz, die ein erstes Fusionsprotein kodiert, wobei das genannte erste Fusionsprotein ein Ras-Protein umfasst, das in einer solchen Weise mutiert ist, das nicht in der Lage ist, sich an der Zellmembran zu lokalisieren, und keinen Austauschfaktor benötigt, das an das genannte erste Protein fusioniert ist; und
(ab) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die ein zweites Fusionsprotein kodiert, wobei das genannte zweite Fusionsprotein das genannte zweite Protein umfasst, das an eine Plasmamembran-Lokalisationsdomäne fusioniert ist; und
(b) Bestimmen, ob in genannter Zelle eine phänotypische Expression eines funktionellen Ras-Proteins auftritt, wobei die Anwesenheit eines funktionellen Ras-Proteins in genannter Zelle eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen genanntem ersten Protein und genanntem zweiten Protein andeutet.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung fehlt dem mutierten Ras-Protein, welches einen Teil des Fusionsproteins bildet, das durch die erste Nukleinsäuresequenz kodiert wird, eine Farnesylierungsbox.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmamembran-Lokalisierungsdomäne ein Myristoylierungssignal.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle, die nicht in der Lage ist, ein funktionelles Ras zu exprimieren, eine Hefezelle. Noch bevorzugter stammt die Zelle aus dem Hefestamm cdc25-2. Das Ras dieser Zelle ist bei der eingeschränkten Temperatur (36°C) aufgrund des Mangels an einem funktionellen Guanylnukleotidaustauschfaktor nicht funktional. Die Erzeugung eines funktionellen Ras in diesen Zellen mittels einer Wechselwirkung zwischen einem Bait-Protein und einem Prey-Protein gemäß der Erfindung wird als wachstumsunabhängig von einem funktionalen Austauschfaktor bei einer solchen eingeschränkten Temperatur bestimmt, z. B. wie etwa 33–37°C, typischerweise bei etwa 36°C.
Das Verfahren der Erfindung ist beim Screening von Genbibliotheken auf bestimmte Expressionsprodukte nützlich, die mit einem spezifischen Protein wechselwirken. Wie bereits oben ausgeführt, kann die Bestimmung einer Protein-Protein-Wechselwirkung in hohem Maße für die Entwicklung von Wirkstoffen wichtig sein. Weiterhin kann die Bestimmung einer solchen Wechselwirkung als diagnostischer Trend dienen. Beispielsweise kann ein spezifisches Wechselwirkungsmuster eines Proteins mit einem anderen als Indikation für ein normales oder ein mutiertes Protein dienen.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich ebenfalls zur Anwendung in High-Throughput-Screeningverfahren. Die Zellen können automatisch mit DNA-Konstrukten, z. B. Plasmiden, unter solchen Bedingungen ergänzt werden, bei denen solche Konstrukte von den Zellen internalisiert und anschließend automatisch mit einer Ras-Phänotyp-expression gescreent werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein System zur Verwendung bei der Bestimmung der Frage bereit, ob ein erstes Protein in der Lage ist, an ein zweites Protein zu binden, umfassend:

(a) eine Zellkultur, die nicht in der Lage ist, ein Ras-Protein zu aktivieren;
(b) einen ersten Nukleinsäurevektor, um darin eine DNA-Sequenz einzufügen, die ein erstes Fusionsprotein kodiert, welches ein Ras-Protein, das so mutiert ist, dass es nicht in der Lage ist, sich an der Zellmembran zu lokalisieren, und einen Austauschfaktor benötigt, sowie genanntes erstes Protein umfasst;
(c) einen zweiten Nukleinsäurevektor, welcher der gleiche ist oder anders sein kann als der erste Nukleinsäurevektor, um darin eine DNA-Sequenz einzufügen, die ein zweites Fusionsprotein kodiert, welches das genannte zweite Protein umfasst, und eine Plasmamembran-Lokalisationsdomäne;
(d) Reagenzien und Vorrichtungen zur Transfektion der Zellen mit der genannten ersten und zweiten Nukleinsäure;
(e) eine Kontrollvorrichtung zur Kontrolle der phänotypischen Ras-Expression in den genannten Zellen.

Die Lokalisierung eines Ras aus Säugetieren, das an ein Bait von Interesse an der Plasmamembran fusioniert ist, durch eine Protein-Protein-Wechselwirkung in einer Temperatur sensitiven Mutante, wie beispielsweise cdc25-2, ermöglicht Wachstum bei 36°C. Die Ras-Lokalisierung kann ebenfalls einen temperatursensitiven mutierten Hefestamm komplementieren, der in Bezug auf seinen Austauschfaktor defizient ist. Gleichwohl komplementiert hSos den cdc25-mutierten Stamm aus Hefe lediglich, wenn er in der Membran exprimiert wird, jedoch macht dies Ras^ts nicht im mutierten Ras^ts-Stamm aus Hefe, welcher in Bezug auf sein Ras defizient ist. Dies eliminiert die Isolierung von Ras-Austauschfaktoren aus Säugetieren in einem Bibliothekscreening.
Wie durch die Erfindung zur Verfügung gestellt, können Expressionsvektoren aus Säugetieren, die Regionen umfassen, die für wechselwirkende Proteinpartner kodieren, die in Hefe-RRS-System verwendet werden, mit einem Reportergen co-transfiziert werden, wie beispielsweise eine Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), oder einem Luciferasegen unter der Kontrolle von entweder AP-1-responsiven Elementen oder Ras responsiven Elementen. Kultivierte Säugetierzellen, die diese Plasmide exprimieren, ermöglichen es, dass eine Protein-Protein-Wechselwirkung, von der bekannt ist, dass sie in Hefe auftritt, quantitativ in Säugetierzellen durch Kontrolle der enzymatischen Aktivität des Reportergens im Anschluss an die Protein-Protein-Wechselwirkung und durch Rekrutierung des aktivierten Ras an die Plasmamembran detektiert werden kann. Die Verwendung von Reportergenen in Säugetierzellen ermöglicht einen direkten Nachweis einer Protein-Protein-Wechselwirkung, die anfänglich in Hefe identifiziert wurde, sowie eine verbesserte Beurteilung der Effektivität von Wirkstoffen direkt in Säugetierzellen.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Positivkontrolle für Proteine bereit, für die in einem wie oben beschriebenen Bibliotheksscreening kein Proteinpartner detektiert wurde. In Zellen, die kein funktionelles Ras exprimieren, wird ein Fusionsprotein exprimiert, das ein an zwei Bait-Proteine fusioniertes funktionelles Ras umfasst. Das erste Bait ("das Tester-Bait") ist ein Protein, welches keine bekannten Proteinpartner besitzt, während das zweite Bait ("das Kontroll-Bait") ein Protein ist, welches einen bekannten Proteinpartner besitzt. Es wird die Fähigkeit des Restes des Kontroll-Baits bestimmt, an sein bekanntes Prey zu binden. Eine zwischen dem Rest des Kontroll-Baits und seinem Prey auftretende Protein-Protein-Reaktion zeigt, dass das Gen für den Fusionsrest auf einem adäquaten Niveau exprimiert wird, dass der Rest des Fusionsproteins funktional ist, und dass der Ras-Pfad intakt ist. Dies würde einen genetischen Nachweis dafür liefern, dass ein Screening mit dem Tester-Bait potenziell möglich und lohnenswert ist.
Die Fusion eines Tester-Baits und eines Kontroll-Baits zu einem einzelnen Ras-Molekül kann zur Kartierung der in eine Wechselwirkung zwischen dem Tester-Bait und seinem Prey verwickelten Aminosäuren verwendet werden. Das Tester-Bait wird einer Zufallsmutagenese unterworfen und „in frame" mit dem Kontroll-Bait fusioniert. Die DNA des Tester-Baits wird „in frame" mit der von Ras und dem Kontroll-Bait insertiert und exprimiert, beispielsweise in cdc25-2-Zellen eines Paarungstyps. Die Zellen werden anschließend mit Zellen des entgegengesetzten Paarungstyps gepaart, die entweder das Prey des Tester-Baits oder das Kontroll-Bait exprimieren. Zellen, die in der Lage sind, zwar mit dem Kontroll-Bait, jedoch nicht mit dem Tester-Bait-Prey zu wachsen, deuten die Integration einer Mutation an, die die Bindung des Tester-Bait-Preys beeinträchtigt, und welche keine Rasterverschiebung oder Unsinnsmutation zur Ursache hat.
In ähnlicher Weise kann diese Ausführungsform ebenfalls zum Screening von Wirkstoffen auf deren Fähigkeit hin verwendet werden, eine Wechselwirkung zwischen einem Tester-Bait und seinem Prey zu inhibieren, während es eine Wechselwirkung zwischen dem Kontroll-Bait und seinem Prey nicht inhibiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Um die Erfindung zu verstehen und zu sehen, wie diese in der Praxis durchgeführt wird, wird nur eine bevorzugte Ausführungsform lediglich anhand von nicht begrenzenden Beispielen mit Bezug zu den beigefügten Figuren beschrieben, wobei:
1 ein schematisches Diagramm des RRS-Systems zeigt;
2 zeigt die Komplementierung der cdc25-2-Mutation durch Protein-Protein-Wechselwirkungen. A. – p110-p85-Wechselwirkung. B. – Jun-fos-Wechselwirkung. C. – Grb2-hSos-C.
3 zeigt die Komplementierung der cdc25-2-Mutation durch 5'Sos-Pak-Bait in einer Prey-unabhängigen Art und Weise.
4 zeigt die Wechselwirkung der regulatorischen Domäne von Pak65 (Pak) mit bekannten Proteinpartnern unter Verwendung des RRS-Systems. A. – Pak65-Wechselwirkung mit verschiedenen SH3-enthaltenden Proteinen; B. – Pak65-Wechselwirkung mit RacI-Mutanten.
5 zeigt die Isolation einer neuen Proteinwechselwirkung unter Verwendung der regulatorischen Domäne von Pak65 als Bait und dem RRS-System.
BEISPIELE
MATERIAL UND METHODEN
Plasmide und Konstrukte
Konstruktion von Ras-Plasmid: Es wurden Ras-spezfische Oligonukleotide entwickelt, um ein Ras-Fragment zu erzeugen, das zu den Aminosäuren 2–185 korrespondiert. Das Ras-DNA-Fragment wurde entwickelt, um 5'-AAG CTT CCC GGG ACC ATG, um HindIII SmaI NcoI-Restriktionsschnittstellen bereitzustellen, um N-terminale Fusion zu ermöglichen, und entweder 5'-TGG ATC CTC oder 5'GGA ATT CTC, um entweder eine BamHI- oder EcoRI-Restriktionsschnittstelle bereitzustellen, um eine C-terminale Fusion zu ermöglichen.
ADNS-Expressionvektoren: p110-RasΔF-Wt., p110-Ras(61)ΔF kodieren für p110β-Aminosäuren 31 bis 150, die entweder an Wildtyp-Ras oder aktiviertes Ras(L61) fusioniert sind, dem seine CAAX-Box fehlt. JZ-RasΔF-Wt., JZ-Ras(61)ΔF kodieren für die Aminosäuren 249–331 der c-Jun DNA-Bindingsdomäne, die wie oben beschrieben an Ras fusioniert ist. Sos-C-Ras(61)ΔF kodiert für die Aminosäuren 1066–1333 der C-terminalen Region von hSoc, welche an aktiviertes Ras(L61) fusioniert ist, dem seine CAAX-Box fehlt. PAK65, Aminosäuren 3–215, wurde an Ras(61)ΔF fusioniert. Die DNA-Fragmente von p110, JZ, Sos-C und PAK65 wurden an Ras(L61)ΔF in HindIII-SmaI fusioniert. JDP2-cDNA wurde an Ras an seine C-terminale Domäne unter Anwendung eines EcoRI-XhoI-Verdaus fusioniert und durch Ligation von drei Fragmenten in ADNS HindIII-SalI zur Erzeugung von ADNS-Ras(61)ΔF-JDP2 ligiert.
Yes2-Expressionsvektoren: Yes-M, Yes-M-p85, Yes-M-Fos liegen wie beschrieben vor, Yes-M-Grb2 und Yes-M*-Grb2 kodieren für Grb2 voller Länge, das entweder an eine Myristoylierungssequenz (M) oder an eine in Bezug auf die Myristoylierung defekte Sequenz fusioniert sind. Yes-M-PLCγ2 korrespondiert zu den Aminosäuren 405–1252 von PLCγ2, das an Yes-M fusioniert ist. Yes-M-p85(SH3) korrespondiert zu den Aminosäuren 2–84 von p85. Yes-M-GAP(SH3) korrespondiert zu den Aminosäuren 262–345 von GAP aus Säugetieren.
Die unterschiedlichen Rac1-Plasmide wurden in pYes2-Expressionsplasmid (Invitrogene Inc.) eingebaut.
Hefewachstum und Manipulationen
Es wurden konventionelle Hefetransfektions- und Manipulierungsprotokolle verwendet. Die Zellen wurden entweder auf Glucolseminimalmedium ausplattiert, das die relevanten Aminosäuren, 2% Glucose, 0,5% NH₄SO₄, 017% Hefeextrakt und 4% Agar oder Galactose Glucose enthält. YPD-Medium enthält: 1% Hefeextrakt, 2% Bactopepton, 2% Glucose. Ein Replikaplattierungsverfahren wurde mit selbsthergestellten wegwerfbarem Samt für Replikaplattierung durchgeführt.
Bibliothekscreening
Das Screening der Bibliothek wurde schrittweise durchgeführt. Zuerst wurde das Bait in cdc25-2-Zellen zusammen mit Yes(trp)-mGAP-Expressionsplasmid co-transfiziert. Die Transformanten wurden bei 24°C auf Glucoseminimalmedium selektiert, dem die Aminosäuren Leucin und Tryptophan fehlen. Anschließend wurden 3 ml Kultur in Flüssigkeit bei 24°C über Nacht kultiviert und verwendet, um 200 ml Medium für weitere 12 Stunden zu inokulieren. Die Zellen wurden pelletiert und in 200 ml YPD-Medium für 3–5 Stunden bei 24°C resuspendiert und anschließend direkt für eine Transfektion mit 20–40 μg Bibliotheksplasmid-DNA transfiziert. die Zellen wurden auf etwa zwanzig 10 cm-Platten ausplattiert, was zu 5000–10000 Transformanten/Platte führte.
Beispiel 1 Verwendung von RRS, um eine Wechselwirkung zwischen zytoplasmischen Proteinpaaren zu detektieren
Die Wechselwirkung zwischen zwei zytoplasmischen Proteinen, den Untereinheiten p110 und p85 der Phosphatidylinositol-3-phosphatkinase, wurde unter Verwendung des RRS-Systems (2A) getestet. Die p85-interagierende Domäne von 110 wurde entweder an aktiviertes oder zytoplasmisches Wildtyp-Ras p110-Ras(61)ΔF aus Säugetieren und p110RasβF-Wt.fusioniert. Die Plasmide wurden in verschiedenen Kombinationen entweder mit dem leeren Yes2 Expressionsvektor oder einem Plasmid ko-, das für myristoyliertes p85 kodiert (Yes-M oder Yes-M-p85), in Cdc25-2-Hefezellen transfiziert und bei 24°C auf Glucoseminimalmedium kultiviert, welches mit den geeigneten Aminosäuren und Basen ergänzt wurde. Es wurden vier unabhängige Transformanten bei 24°C kultiviert (linkes Feld), eine Replikaplattierung auf Galactoseminimalplatten durchgeführt, die in geeigneter Form ergänzt wurden, und bei 36°C (rechtes Feld) kultiviert. Die verwendeten Konstrukte werden im Abschnitt Material und Methoden beschrieben. Lediglich Transformanten, die sowohl das p110-Ras-Fusionsprotein und membranverankertes p85 exprimieren, waren in der Lage, bei 36°C zu wachsen. Es wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet, wenn p110 entweder an Wildtyp oder an das aktivierte zytoplasmische Ras fusioniert war.
Beispiel 2 Verwendung von RRS zur Detektion einer Wechselwirkung zwischen nuklearen Proteinpaaren
Unter Verwendung von RRS (2B) wurde die Wechselwirkung von zwei nuklearen Proteinen c-Jun und c-Fos getestet. Die DNA-Bindingsdomäne von c-Jun wurde entweder an aktiviertes oder an zytoplasmisches Wildtyp-Ras aus Säugetier (JZ-Ras(61)ΔF und JZ-RasΔF-Wt.) fusioniert. Diese Plasmide wurden mit ihrem leeren Yes2-Expressionsvektor oder einem Plasmid, das myristoyliertes c-Fos (Yes-M oder Yes-M-Fos) kodiert, in cdc25-2-Hefezellen kotransfiziert und bei 24°C kultiviert (2B, linkes Feld). Die Transformanten wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit getestet, bei der restriktiven Temperatur von 36°C zu wachsen (2B, rechtes Feld). Es waren lediglich Transformanten in der Lage, bei der restriktiven Temperatur zu wachsen, die sowohl das c-Jun-Ras-Fusionsprotein wie auch das membranverankerte c-Fos exprimierten.
Beispiel 3 Verwendung von RRS zur Detektion einer Wechselwirkung zwischen der C-terminalen Domäne von hSos und Crb2
Die Wechselwirkung der C-terminalen Region von hSos (enthaltend die Prolin-reiche Region) mit dem Adapterprotein Grb2 wurde getestet (2C). Die C-terminale Domäne von hSos wurde an zytoplasmisches aktiviertes Ras aus Säugetieren fusioniert (Soc-C-Ras(61)ΔF). Dieses Plasmid wurde entweder mit dem leeren Vektor (Yes-M), dem membranverankerten Grb2 (Yes-M-Grb2) oder dem zytoplasmischen Grb2 (Yes-M*-Grb2) in cdc25-2-Hefezellen ko-transfiziert und bei 24°C auf geeignetem Medium kulti viert (2C, rechtes Feld). Die Transformanten wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit getestet, bei 36°C zu wachsen. Es waren lediglich Transformanten in der Lage, bei 36°C zu wachsen (2C, rechtes Feld), die sowohl das Soc-C-terminale Fusionsprotein und das membranverankerte Grb2 exprimieren. RRS ist daher dem SRS-System bei der Identifizierung von Soc-C-terminal wechselwirkenden Proteinen überlegen, da diese Domäne der Sos-Funktion eine inhibitorische Aktivität vermittelt.
Beispiel 4 Pak65
Eines der mit dem SRS-Systems assoziierten Proteine ist, wie oben beschrieben, die Prey-unabhängige Aktivität von hSos, das an einige Proteine fusioniert ist. Ein solches Protein ist die p21 aktivierte Kinase Pak65. Pak65 aktiviert Rac und Cdc42 durch Binding von diesen in einer GTP-abhängigen Weise. Ungeachtet von bemerkenswerten Anstrengungen ist nur wenig Information bezüglich der Rolle von Pak65 bei der Signaltransduktion erhältlich. Die regulatorische Domäne von Pak65 enthält zwei Proteinmodule, von denen bekannt ist, dass sie Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln: eine Prolin-reiche Region, die SH3-enthaltende Proteine bindet, und eine Cdc42/Rac-wechselwirkende Bindungsdomäne (CRIB), die in einer kleinen Anzahl an Proteinen gefunden wird, welche die kleinen GTPase-Proteine aus der Rho-Familie binden. Um Einblick in die Pak65-Funktion zu erhalten, wurden Proteine unter Verwendung des SRS-Systems gescreent (3), die an die regulatorische Domäne von Pak65 binden. Die regulatorische Domäne von Pak65 wurde mit 5'Sos fusioniert und in cdc25-2-Hefezellen exprimiert. Transformanten, die 5'Sos-Pak exprimieren, zeigen selbst in der Abwesenheit eines Proteinpartners ein effizientes Wachstum (3). Dies macht das SRS-System in Bezug ein Screening mit dem Pak65-Bait ineffektiv. Gleichwohl waren cdc25-2-Hefetransformanten, die die regulatorische Domäne von Pak65 exprimieren, die an das zytoplasmische aktivierte Ras fusioniert war (Pak-Ras(61)ΔF), nicht in der Lage, bei diesen 36°C zu wachsen (4A, rechtes Feld) und das Pak65-Bait konnte daher zur weiteren Analyse verwendet werden.
Beispiel 5 Verwendung von RRS zur Isolierung von neuen Proteinwechselwirkungen
Die regulatorische Domäne von Pak65 wurde als Bait verwendet, um eine cDNA-Expressionsbibliothek aus der Hypophyse einer Ratte zu screenen, die an eine Membranlokalisierungssequenz fusioniert war. Die Expression des cDNA-Insertplasmids der Bibliothek steht unter der Kontrolle des GAL1-Promotors. Es wurden etwa 500000 unabhängige Transformanten auf ihre Wechselwirkung mit Pak-Ras(61)Δ F in der Anwesenheit eines Plasmids gescreent, das für GAP aus Säugetieren kodiert. Es wurden fünf Klone isoliert, die lediglich dann ein effizientes Zellwachstum bei 36°C zeigten, wenn sie unter Galactose-induzierenden Bedingungen kultiviert wurden. Die aus diesen Hefeklonen abgeleiteten Plasmide wurden entweder mit dem ursprünglichen Pak65-Bait (Pk-Ras(61)ΔF) oder einem irrelevanten Bait (Ras(61)ΔF-JDP2) kotransfiziert. DNA-Plasmide aus vier unabhängigen Klonen, die Proteine kodieren, welche eine spezifische Wechselwirkung mit dem Pak65-Bait zeigen, führten zu einem effizienten Wachstum bei 36°C, zeigten jedoch kein Wachstum, wenn sie mit dem irrelevanten Bait bei 36°C (5) exprimiert wurden. Lediglich eine Plasmid-DNA erzeugte bei 36°C mit sowohl den spezifischen und nicht-spezifischen Baits effizientes Wachstum. Eine Sequenzanalyse dieses Klons identifizierte diesen als ein Sos-Homolog, von welchem erwartet werden würde, dass er Ras aus Hefe aktiviert und das Erfordernis der Translokation von Ras aus Säugetieren umgeht.

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen einem ersten und einem zweiten Protein, umfassend die Schritte: (a) Expression in einer Zelle, die nicht in der Lage ist ein Ras-Protein zu aktivieren; (aa) eine erste Nukleinsäuresequenz, die ein erstes Fusionsprotein kodiert, wobei das genannte erste Fusionsprotein ein Ras-Protein umfasst, das in einer solchen Weise mutiert ist, dass es nicht in der Lage ist, sich an der Zellmembran zu lokalisieren, und keinen Austauschfaktor benötigt, das an das genannte erste Protein fusioniert ist; und (bb) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die ein zweites Fusionsprotein kodiert, wobei das genannte zweite Fusionsprotein das genannte zweite Protein umfasst, das an eine Plasmamembran-Lokalisationsdomäne fusioniert ist; und (b) Bestimmen, ob in genannter Zelle eine phänotypische Expression eines funktionellen Ras-Proteins auftritt, wobei die Anwesenheit eines funktionellen Ras-Proteins in genannter Zelle eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen genanntem ersten Protein und genanntem zweiten Protein andeutet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dem mutierten Ras-Protein, das vom Fusionsprotein mit umfasst ist und durch die genannte erste Nukleinsäuresequenz kodiert wird, eine Farnesylierungsbox fehlt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die genannte Zelle eine Hefezelle ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die genannte Hefezelle eine Zelle aus Saccharomyces cerevisiae cdc25-2 ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Anwesenheit eines funktionellen Ras Proteins in genannter Zelle durch Zellwachstum bei 33–37°C detektiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Plasmamembran-Lokalisationsdomäne ein Myristoylierungssignal ist.
Ein System für die Verwendung bei der Bestimmung ob ein erstes Protein in der Lage ist an ein zweites Protein zu binden, umfassend: (a) Eine Zellkultur, die nicht in der Lage ist, ein Ras-Protein zu aktivieren; (b) Einen ersten Nukleinsäurevektor, um dann eine DNA-Sequenz einzufügen, die ein erstes Fusionsprotein kodiert, welches ein Ras-Protein, das so mutiert ist, dass es nicht in der Lage ist, sich an der Zellmembran zu lokalisieren, und keinen Austauschfaktor benötigt, sowie genanntes erstes Protein umfasst; (c) Einen zweiten Nukleinsäurevektor, welcher der gleiche ist oder anders sein kann als der erste Nukleinsäurevektor, um darin eine DNA-Sequenz einzufügen, die ein zweites Fusionsprotein kodiert, welches das genannte zweite Protein umfasst, und eine Plasmamembran-Lokalisationsdomäne; (d) Reagenzien und Vorrichtungen zur Transfektion der Zellen mit der genannten ersten und zweiten Nukleinsäure; (e) Eine Kontrollvorrichtung zur Kontrolle der phänotypischen Ras-Expression in den genannten Zellen.