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Die
Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zur Detektion
und Verstärkung eines Primärsignals unter Nutzung
eines interzellulären Kommunikationssystems und deren Verwendung,
zur Anwendung beim Nachweis von Substanzen wie z. B. Phosphor, Schwefel,
Stickstoff, Hormonen, Stoffwechselintermediaten, Fermentationsprodukten,
usw..
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Bisherige
Lösungen zur Signalverstärkung haben den Nachteil,
dass Substanzen erst ab einer bestimmten Nachweisgrenze detektiert
werden können.
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Aus
US 6555 325 B1 ist
ein System zur Detektion einer funktionellen Interaktion zwischen
einer Verbindung und dem Bestandteil einer zellulären Signaltransduktionskaskade
bekannt. Die Erfindung stellt ein robustes reproduzierbares Testsystem
zum Screening und zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen
zur Verfügung, die die Aktivität eines zellulären
Rezeptors modulieren bzw. mit diesem interagieren können.
Im Speziellen sollen Substanzen identifiziert werden, die mit G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren interagieren, die pharmazeutisch eine große
Rolle spielen. Das Hefe-Pheromonsystem wird dabei genutzt, weil
es sich bei dem Hefe-Pheromonrezeptor ebenfalls um einen G-Protein-gekoppelten
Rezeptor handelt, der mit ektopisch exprimierten G-Protein-gekoppelten
Rezeptorkomponenten heterologe Rezeptoren bilden kann. So können
auch Substanzen identifiziert werden, die auf nicht-Hefe Rezeptoren
wirken. Der Nachweis einer funktionellen Interaktion führt
zur Sekretion eines Pheromons, das in Zellen des zweiten Paarungstyps,
in denen ein Markergen unter die Kontrolle eines Pheromon-responsiven
Promotors gestellt wurde, die Expression dieses Markergens anregt.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Einrichtung und ein Verfahren zur Detektion
und Verstärkung eines Primärsignals bereitzustellen,
um so die Nachweisgrenze für das zu detektierende Primärsignal
herabzusetzen.
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Erfindungsgemäß wird
die Aufgabe gelöst durch eine Einrichtung zur Detektion
und Verstärkung eines Primärsignals, die
- a) Zellen eines ersten Typs, bei denen ein
Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls
zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht,
der durch das Primärsignal reguliert wird, und
- b) Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches Gen
unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte
Signalmolekül reguliert wird,
enthält,
so dass durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes
Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls
induziert wird und das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte
Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs
verstärkt wird.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 2 sind zusätzlich
- c) Zellen eines dritten Typs enthalten, bei
denen ein Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig
ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Signalmolekül
reguliert wird, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert
wird,
so dass - – durch ein
von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal
die Sekretion des Signalmoleküls durch die erste Zelle
induziert wird,
- – durch die Sekretion des Signalmoleküls durch
die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion
des Signalmoleküls induziert und eine Vorverstärkung
des Primärsignals bewirkt wird, und
- – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte
Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs
verstärkt wird.
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Zellen
besitzen zahlreiche Kommunikationssysteme, über die sie
mit anderen Zellen Informationen austauschen können. Oft
beruhen diese Kommunikationssysteme auf der Sezernierung eines Signalmoleküls durch
eine Zelle in das umgebende Medium. Andere Zellen besitzen geeignete
Rezeptorsysteme für diese Signalmoleküle und können
diese wahrnehmen und dementsprechend auf diese reagieren.
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Solche
Kommunikationssysteme umfassen beispielsweise das Quorum sensing
von Mikroorganismen, Ammoniakpulse in Hefezellen, Pheromonsysteme,
z. B. bei der Paarung von Hefezellen, sezernierte Wachstumsfaktoren,
die innerhalb von Zellverbänden zur Kommunikation zwischen
Zellen verwendet werden, Virulenzfaktoren von Mikroorganismen, die
spezifisch an eukaryotische Rezeptoren binden oder immunmodulierende
und Zelldifferenzierungen beeinflussende Faktoren. Die bei diesen
Kommunikationssystemen sezernierten Signalmoleküle sind
in der erfindungsgemäßen Einrichtung und dem erfindungsgemäßen
Verfahren einsetzbar.
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Beim
Quorum Sensing kommunizieren beispielsweise Mikroorganismen mittels
kleiner hormonähnlicher Signalmoleküle. Dieser
Prozess spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Zelldichte,
was Bakterienpopulationen erlaubt, sich ähnlich wie mehrzellige
Organismen zu verhalten und dadurch von Vorteilen zu profitieren.
Zu den durch Quorum Sensing regulierten Verhaltensweisen gehören
unter anderem die Produktion von Antibiotika, Symbiose, Konjugation,
Virulenz, Bildung von Biofilmen sowie die Biolumineszenz einiger
Vibrio-Spezies. Die als Autoinducer bezeichneten Signalmoleküle
werden von bestimmten Bakterien mit Hilfe bestimmter Gene produziert
und in das umliegende Kulturmedium abgegeben. Bakterien besitzen
ein passendes Rezeptorsystem für diese Liganden und können
nach Erreichen einer gewissen Konzentration an Signalmolekülen
im Medium die Transkription bestimmter Gene aktivieren. Dabei gibt
es speziesspezifische Autoinducer, mit denen Bakterien innerhalb
der eigenen Bakterienspezies kommunizieren. Der sogenannte Autoinducer-2
hingegen ermöglicht die Kommunikation zwischen verschiedenen
Bakterienspezies (Interspezies-Kommunikation).
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Bei
Hefen dienen periodisch produzierte Ammoniak-Pulse als Signal zwischen
Kolonien. Dabei induziert ein Ammoniak-Puls die Ammoniak Produktion
benachbarter Kolonien. Dies wiederum beeinflusst die räumliche
Verteilung von Kolonien, da jeder Ammoniak-Puls dazu führt,
dass die Wachstumszone zwischen benachbarten Kolonien transient
gehemmt wird. Somit wachsen die Kolonien präferentiell
zu der entgegengesetzten Seite, auf der sich keine kompetierenden
Kolonien befinden.
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In
der erfindungsgemäßen Einrichtung befinden sich
die Zellen in einem flüssigen, vorzugsweise wässrigen
Medium, über das der Austausch von Signalmolekülen
zwischen den Zellen erfolgt. Die Zellen der Einrichtung liegen dabei
entweder suspendiert in Lösung oder immobilisiert auf einem
Träger vor. Die Suspension befindet sich ein einem geeigneten
Behältnis, das die messtechnische Erfassung eines von den
Zellen ausgesandten Signals gewährleistet. Der Träger
ist ebenfalls so gestaltet, dass von den Zellen ausgesandte Signale
durch ein Detektionssystem erfasst werden können.
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Die
Erfindung ist bei allen Zellen einsetzbar, die über einen
Rezeptor für ein Primärsignal verfügen. Dabei
ist es unerheblich, ob es sich um einen authentischen oder heterologen Rezeptor
handelt. Gleiches gilt für die sich ggf. anschließende
Signalkaskade sowie die Bildung der Signalmoleküle.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen
3 bis 27 angegeben.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 3 sind die Zellen des ersten,
zweiten und/oder dritten Typs Hefezellen, nach der Weiterbildung
des Patentanspruchs 4 sind die Hefezellen Saccharomyces cerevisiae
oder Schizosaccharomyces pombe Zellen.
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Das
Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls
zuständig ist, ist unter die Kontrolle eines Promotors
gestellt, der durch ein Primärsignal reguliert wird. Als
Promotor wird in der Genetik eine DNA-Sequenz bezeichnet, die die
Expression eines Gens reguliert. Promotoren im Sinne der Erfindung
sind bevorzugt diejenigen Bereiche der genomischen DNA, die spezifisch
für die Regulation der Expression eines Gens verantwortlich
sind, indem sie auf spezifische intra- oder extrazelluläre
Signale reagieren und abhängig von diesen Signalen die
Expression des unter ihrer Kontrolle liegenden Gens aktivieren oder
reprimieren.
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In
Hefen befinden sich diese regulierenden DNA-Bereiche in der Regel
auf der 5'-Seite des Startcodons des betreffenden Gens und haben
eine durchschnittliche Länge von 309 bp (Mewes
H. W. et al., (1997) Overview of the yeast genome. Nature 387, 7–65).
Solche regulierenden Bereiche können aber auch weiter als
1000 bp entfernt von der kodierenden Sequenz oder auf der 3'-Seite
der kodierenden Sequenz des betreffenden Gens oder sogar innerhalb
der transkribierten Sequenz des betreffenden Gens liegen. Setzt
man derartige Promotoren an die 5'-Seite des Startcodons eines beliebigen
Gens, bevorzugt eines Pheromon-Gens, regulieren sie die Aktivität
dieses Gens in Abhängigkeit von den oben genannten spezifischen
Primärsignalen.
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Bei
den von den Hefen erkannten Primärsignalen handelt es sich
entweder um Signale, für die die Hefezelle eigene Rezeptorsysteme
besitzt. Dabei handelt es sich beispielsweise um Signale wie den
Mangel bestimmter für die Hefezelle essentieller Nährstoffe
wie z. B. Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Eisen oder Kupfer, Kohlenstoffquellen,
essentieller Aminosäuren, Sauerstoff, oder andere Signale
wie z. B. Temperatur, DNA-Schäden, ER-Stress oder oxidativer
Stress.
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Die
Zelle des ersten Typs kann nach Weiterbildung des Patentanspruchs
5 aber auch dahingehend gentechnisch verändert sein, dass
sie ein Rezeptorsystem exprimiert, das die Zelle natürlicherweise
nicht besitzt. Die Primärsignale, die diese Rezeptorsysteme empfangen,
sind chemischer Art, beispielsweise Ionen, anorganische und organische
Verbindungen und Biomoleküle wie Proteine, Peptide, Lipide,
Zucker oder Nukleinsäuren, oder auch physikalischer Art,
beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Druck, Temperatur oder
Leitfähigkeit
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Beispielsweise
ist die Expression solche Rezeptorsysteme in Hefezellen aus dem
Stand der Technik bekannt. So können in Hefen zum Beispiel
Sensorsysteme für menschliche Hormone wie Androgene (Bovee, T.
F. H et al. (2008) A new highly androgen specific yeast biosensor,
enabling optimisation of (Q)SAR model approaches. The Journal of
steroid biochemistry and molecular biology 108: 121–131),
für Schwermetalle wie Cadmium (Park, J.-N. et al.
(2007) Identification of the cadmium-inducible Hansenula polymorpha
SEQ1 gene promoter by transcriptome analysis and its application
to whole-cell heavy-metal detection systems. Applied and environmental
microbiology 73: 5990–6000), für flüchtige
Geruchsstoffe (Marrakchi, M. et al. (2007) A new concept
of olfactory biosensor based an interdigitated microlelectrodes
and immobilized yeasts expressing the human receptor OR17-40. European
Biophysical Journal 36: 1015–1018) und sogar Sprengstoffe
(Radhika, V. et al. (2007) Chemical sensing of DNT by engineered
olfactory yeast strain. Nature Chemical Biology 3: 325–330)
exprimiert werden.
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Da
die Zellen sich in einem flüssigen Medium befinden, müssen
die zu verstärkenden Primärsignale ebenfalls entweder
in diesem flüssigen Medium sein oder, wie im Fall von einigen
physikalischen Parametern wie beispielsweise Temperatur, durch dieses
Medium hindurch auf die Zellen der erfindungsgemäßen
Einrichtung übertragen werden.
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Erkennen
die Zellen des ersten Typs mittels dieser endogenen oder rekombinanten
Rezeptoren die eingehenden Primärsignale, wird direkt oder
indirekt über zwischengeschaltete Signalkaskaden die Transkription
des Signal-spezifischen Promotors induziert, so dass die Zellen
des ersten Typs als Antwort auf das eingehende Primärsignal
das Signalmolekül in die Umgebung sezernieren.
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Die
Zellen des zweiten Typs besitzen auf ihrer Oberfläche Rezeptoren
für das von den Zellen des ersten Typs sezernierte Signalmolekül,
sowie eine für die intrazelluläre Weitergabe des
Signals notwendige, ggf. mittels molekularbiologischer Techniken
modifizierte Signalkaskade. Die Zelle des zweiten Typs kann nach Weiterbildung
des Patentanspruchs 6 auch dahingehend gentechnisch verändert
sein, dass sie einen Rezeptor für ein Signalmolekül
exprimiert, das die Zelle natürlicherweise nicht besitzt.
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Die
Zellen des zweiten Typs sind erfindungsgemäß genetisch
so verändert, dass ein spezifisches Gen, das beispielsweise
für ein Markerprotein, wie z. B. GFP (grün fluoreszierendes
Protein) kodiert, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist,
der durch das Signalmolekül, das durch die Zellen des ersten
Typs sezerniert wird, reguliert wird.
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Erreicht
das von den Zellen des ersten Typs auf das spezifische Primärsignal
hin sezernierte Signalmolekül die umliegenden Zellen des
zweiten Typs, wird in diesen Zellen des zweiten Typs die Expression
des spezifischen Gens und die Produktion des Markerproteins oder
Zielproteins durch den Signalmolekül-regulierten Promotor
stark induziert.
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In
einer anderen Ausgestaltungsform der Erfindung ist das spezifische
Gen selbst wieder für die Synthese eines Signalmoleküls
zuständig, das von der Zelle des zweiten Typs sezerniert
wird. Dadurch wird vorteilhaft ermöglicht, mehrere erfindungsgemäße
Einrichtungen in Form einer Kaskade von Verstärkern zusammenzuschalten.
Das von den Zellen des zweiten Typs sezernierte Signalmolekül
wird von einer zweiten erfindungsgemäßen Einrichtung
als Primärsignal detektiert und dadurch weiter verstärkt.
Diese Kaskade kann durch den Einsatz von verschiedenartigen Signalmolekülen
beliebig verlängert werden. Am Ende der Kaskade steht typischerweise
eine Zelle, die ein Signalmolekül-reguliertes spezifisches
Gen besitzt, das für ein Markerprotein, wie z. B. GFP (grün
fluoreszierendes Protein) kodiert, wodurch das mehrfach verstärkte
Primärsignal dann durch ein geeignetes Detektionssystem
erfasst werden kann.
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Hefezellen
können sowohl im diploiden Zustand als auch im haploiden
Zustand vorliegen. Zwei haploide Hefezellen können in einem
Vorgang, der als Paarung bezeichnet wird, zu einer einzigen diploiden
Hefezelle verschmelzen. Bei haploiden Hefezellen unterscheidet man
dabei zwei so genannte Paarungstypen. Nur Hefezellen mit unterschiedlichem
Paarungstyp können miteinander paaren. Beispielsweise sind
dies bei der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae die Paarungstypen α und
a, bei der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe die Paarungstypen
Plus und Minus.
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Haploide
Hefezellen kommunizieren über so genannte Pheromone. Dies
sind kurze Peptide, die die jeweiligen Zellen bilden, um ihrer Umgebung
den eigenen Paarungstyp mitzuteilen. So sezernieren Saccharomyces
cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α beispielsweise
das Pheromon α-Faktor und Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen
des Paarungstyps a das Pheromon a-Faktor.
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Erfindungsgemäß sind
Zellen des ersten Typs genetisch so verändert, dass ein
Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls
zuständig ist, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt
ist, der durch das nachzuweisende Primärsignal reguliert
wird. Dabei kodiert das Gen entweder selbst für das Signalmolekül oder
ein Protein, das die Synthese des Signalmoleküls in der
Zelle und/oder seine Sezernierung bewirkt. Nach der Weiterbildung
des Patentanspruchs 7 ist dieses Signalmolekül bevorzugt
ein Pheromon.
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Pheromone
im erfindungsgemäßen Sinn sind außer
den in Hefezellen vorkommenden natürlichen Pheromonen auch
homologe oder modifizierte Peptide oder Peptidanaloga, oder andere
organische Verbindungen, die in der Lage sind, an die Pheromon-Rezeptoren
von Hefezellen zu binden und zu aktivieren.
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Das
Gen, das für das Pheromon kodiert, kann entweder ein natürliches,
in dem Genom eines Organismus enthaltenes Gen sein, oder eine synthetische
Gensequenz, deren Expression zur Produktion eines Pheromons oder
eines zu einem Pheromon homologen Peptids, das in der Lage ist,
die Pheromonrezeptoren von Hefezellen zu aktivieren.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung besteht die Erfindung also aus einer
Einrichtung zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals
mit
- a) haploiden Zellen eines ersten Typs,
bei denen ein für ein Pheromon kodierendes Gen unter der
Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Primärsignal
reguliert wird, und
- b) haploiden Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches
Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte
Pheromon reguliert wird, enthält,
so dass durch
ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal
die Sekretion des Pheromons induziert wird und das Primärsignal
durch die Pheromon-kontrollierte Expression des spezifischen Gens
durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.
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Die
Zellen des ersten Typs sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
8 Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder
Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps oder diploide Saccharomyces
cerevisiae-Zellen.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 9 sind die Zellen des zweiten
Typs Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps
oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps.
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Die
Zellen des dritten Typs sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
10 Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder
Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps.
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Die
Hefezellen besitzen auf ihren Oberflächen Rezeptoren für
die Pheromone des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps. So sind
beispielsweise Saccharomyces cerevisiae-Zellen des Paarungstyps
a in der Lage, Saccharomyces cerevisiae-Zellen des Paarungstyps α in
ihrer Umgebung wahrzunehmen und umgekehrt.
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Das
Gen, welches in den Zellen des ersten und/oder dritten Typs für
die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist,
ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 11 das MFα1-
oder MFα2-Gen von Saccharomyces cerevisiae, welche jeweils
für das Pheromon α-Faktor kodieren, oder das MFA1-Gen,
oder das MFA2-Gen von Saccharomyces cerevisiae, welche für
das Pheromon a-Faktor kodieren.
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Der
Promotor, der durch das als Signalmolekül eingesetzte Pheromon
reguliert wird, ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 12
der FIG1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae.
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Die
Transkription des FIG1-Gens wird nach Inkubation haploider Hefezellen
mit Pheromonen des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps um das
bis zu 97-fache erhöht (Roberts, C. J., et al.
(2000) Signaling and circuitry of multiple MAPK pathways revealed
by a matrix of global gene expression profiles. Science 287: 873–880).
Es wurde ursprünglich in einem Hefe „Two-Hybrid
Screen" zur Identifikation von Pheromon-regulierten Genen identifiziert
(Erdmau, S., et al. (1998) Pheromone-regulated genes required
for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology 140: 461–483).
Der Name FIG1 bedeutet „factor induced gene 1". Es handelt sich
um ein integrales Membranprotein, welches direkt oder indirekt an
der Ca2+-Aufnahme in die Zelle beteiligt ist
(Muller, E. M. et al. (2003) Fig1p facilitates Ca2+ influx
and cell fusion during mating of Saccharomyces cerevisiae Journal
of Biological Chemistry 278: 38461–38469). Nach
Zugabe von α-Faktor zu a-Zellen ist in diesen eine deutliche
Zunahme des Proteins nach 60 Minuten nachweisbar (Roberts
et al., 2000). Auf Transkriptionsebene wird eine Erhöhung
der mRNA Konzentration um mehr als das 97-fache bereits 20 Minuten
nach Zugabe des jeweils entgegengesetzten Pheromons zu den Hefezellen
beobachtet (Roberts et al., 2000). Der Promotor
des FIG1-Gens ist daher vorteilhaft durch Pheromone des jeweils
entgegengesetzten Paarungstyps hochgradig regulierbar. Somit ist
die Einwirkung von Pheromonen schnell und sensitiv nachweisbar.
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Bevorzugt
wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1000 bp
5'-seitig des Startcodons des FIG1-Gens umfasst, oder ein Teilabschnitt
dieses DNA-Abschnitts, der in der Lage ist, auf die Anwesenheit
eines Pheromons hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende
spezifische Gen zu aktivieren oder zu unterdrücken.
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Besonders
bevorzugt verwendet wird der DNA-Abschnitt, den man durch PCR-Amplifikation
des Saccharomyces-Genoms unter Verwendung der Primer Fig1-for (Seq.-Nr.
1) und Fig1-rev (Seq.-Nr. 2) (siehe Tab. 1) erhält.
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Tab.
1 Primer zur Amplifikation des FIG1-Promotors Die fett gedruckten
Buchstaben grenzen den genutzten Promotorbereich des FIG1-Gens ein.
Kursiv sind die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen SacI
bzw. SpeI angegeben, welche für die Klonierung genutzt
werden. Die ersten sechs Basen dienen dem Schutz des Primers.
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Promotoren
im Sinne der Erfindung sind auch DNA-Abschnitte, die zu den entsprechenden
Hefe-Promotoren eine Homologie von mehr als 50%, bevorzugt mehr
als 80%, aufweisen. Diese Abschnitte können beispielsweise
aus homologen genomischen Bereichen von anderen Organismen, bevorzugt
anderen Hefestämmen, stammen. Sie können jedoch
auch synthetisch hergestellte DNA-Sequenzen sein, deren Sequenz
eine Homologie von mehr als 50%, bevorzugt mehr als 80%, Übereinstimmung
mit dem entsprechenden Saccharomyces cerevisiae Promotor aufweist.
Promotoren können auch synthetische DNA-Sequenzen sein,
die aus einem Teilbereich eines der oben genannten Hefe-Promotoren
sowie einem bekannten Basalpromotor aus Saccharomyces cerevisiae
zusammengesetzt sind.
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Der
Basalpromotor stellt die für die Anbindung der Transkriptionsmaschinerie
notwendigen DNA-Sequenzen zur Verfügung, während
die Teilsequenzen aus den Hefepromotoren spezifisch auf regulierende
Signale reagieren. Ein solcher Basalpromotor ist bevorzugt der Basalpromotor
des Cytochrom c-Gens aus Saccharomyces cerevisiae, der 300 bp 5'seitig
des Startcodons des Cytochrom c-Gens umfasst (Chen, J. et
al. (1994) Binding of TFIID to the yeast CYC1 TATA boxes in yeast
occurs independently of upstream activating sequences. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 11909–11913).
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Promotoren
aus synthetischen DNA-Sequenzen können auch mehrfache Abschnitte
einer identischen DNA-Sequenz enthalten. Diese Vervielfachung eines
regulatorischen DNA-Abschnitts erlaubt vorteilhaft eine Erhöhung
der Sensitivität des Promotors gegenüber den zu
detektierenden Signalen.
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Im
Prozess der Paarung von Hefezellen induziert der Transkriptionsfaktor
Ste12p die Expression von Pheromon-responsiven Genen durch Bindung
von Ste12p an sogenannte "Pheromon response elements" (PREs) in
der Promotorregion induzierbarer Gene (Dolan et al., (1989).
The yeast STE12 protein binds to the DNA sequence mediating pheromone
induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5703–5707.).
Hagen et al. zeigten, dass tandemartig angeordnete PREs ausreichend
sind, um die Pheromon-responsive Expression von haploid-spezifischen
Genen in beiden Paarungstypen zu aktivieren (Hagen et al.
(1991). Pheromone response elements are necessary and sufficient
for basal and pheromone-induced transcription of the FUS1 gene of Saccharomyces
cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 11: 2952–2961). PREs
sind 7 bp lange Elemente mit der Konsensus-Sequenz TGAAACA (Kronstad
et al., (1987). A yeast Operator overlaps an upstream activation
site. Cell 50: 369–377.).
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Im
FIG1 Promotor wurden drei putative Bindestellen für Ste12p
identifiziert (Harbison et al., (2004). Transcriptional
regulatory code of a eukaryotic genome. Nature 431: 99–104.).
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Die
Ansprechzeit des FIG1-Promotors kann durch eine höhere
Anzahl an PREs verkürzt werden. Beispielsweise kann zusätzlich
oder stellvertretend zum authentischen Aktivatorbereich des Gens
ein 139 bp langes Fragment mit den PREs der regulatorischen Region
von FUS1 oder ein einfaches synthetisches Cluster aus PREs genutzt
werden (Hagen et al. 1991). So wird vorteilhaft
mit einem Reporterkonstrukt aus dem modifizierten FIG1-Promotor
und einem EGFP-Marker eine höhere Expression des Markergens
und bessere Ansprechbarkeit auf geringere Pheromonkonzentrationen
erzielt. Ebenfalls wird eine zeitlich schnellere Ansprechbarkeit
des Systems erreicht.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 13 wird in den Zellen des
zweiten Typs der Transkriptionsaktivator Ste12p überexprimiert.
Die Überexpression von STE12 führt zu einer verstärkten
Expression Pheromon-responsiver Gene, vermittelt durch PREs (Dolan
und Fields, (1990). Overproduction of the yeast STE12 protein leads
to constitutive transcriptional induction. Genes Dev. 4: 492–502.).
Vorteilhaft wird durch die Überexpression des Transkriptionsaktivators
Ste12p auch das Expressionslevel des spezifischen Gens unter der Kontrolle
des Pheromon-abhängigen Promotors erhöht.
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Um
an einzelne PREs zu binden, benötigt Ste12p teilweise weitere
Transkriptionsaktivatoren wie den Faktor Mcm1p (Hwang-Shum
et al., Jr (1991). Relative contributions of MCM1 and STE12 to transcriptional adivation
of a- and a-specific genes from Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen
Genet 227: 197–204.). Nach der Weiterbildung des
Patentanspruchs 14 wird daher in den Zellen des zweiten Typs Mcm1p überexprimiert. Die
heterologe Expression dieses Faktors trägt ebenfalls zur
Erhöhung der Expression des unter der Kontrolle des Pheromon-abhängigen
Promotors stehenden spezifischen Gens bei.
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Das
spezifische Gen vermittelt nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
15 die Bildung eines Signalmoleküls, das von dem von den
Zellen des ersten Typs sezernierten Signalmolekül verschieden
ist. Dadurch können vorteilhaft mehrere erfindungsgemäße
Einrichtungen als Kaskade hintereinander geschaltet werden.
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Das
spezifische Gen kodiert nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
16 für ein Markerprotein, bevorzugt ein fluoreszierendes
Protein wie GFP (grün fluoreszierendes Protein) oder ein
Enzym wie β-Galaktosidase.
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Mittels
eines Nachweissystems für das Markerprotein, z. B. GFP,
kann die Signal-induzierte Bildung des Markerproteins sensortechnisch
erfasst werden (Detektion).
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Markerproteine
im Sinne der Erfindung sind Proteine, deren Vorhandensein bzw. Aktivität
zu einer physikalisch messbaren Änderung führt.
Diese physikalisch messbare Änderung kann durch ein geeignetes
Nachweissystem einfach und/oder schnell detektiert werden. Bevorzugt
werden solche Markerproteine verwendet, die nachgewiesen werden
können, ohne die Integrität bzw. Vitalität
der Zellen zu beeinträchtigen, wie z. B. Enzyme, die in
Anwesenheit eines Substrats eine Farbreaktion katalysieren, wie β-Galaktosidase
oder Phytase. Weiter bevorzugt werden als Markerprotein Luciferasen,
die in Anwesenheit eines geeigneten Substrats Licht aussenden. Besonders
bevorzugt werden als Markerproteine Proteine, die durch Anregung
mit Licht einer bestimmten Wellenlänge fluoreszieren.
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Weiterhin
umfasst die Erfindung als Markerproteine Proteasen, die fluoreszierende
Proteine abbauen. Exprimiert die Hefezelle gleichzeitig konstitutiv
ein fluoreszierendes Protein, wird auf das Primärsignal
hin die Abnahme der Fluoreszenz des Zellen des zweiten Typs messbar.
Bevorzugt verwendet werden Proteasen, die außer dem fluoreszierenden
Protein keine weiteren Ziele in der Zelle angreifen, um die Vitalität
der Zelle nicht zu beeinträchtigen. Besonders bevorzugt
verwendet wird die TEV-Protease. Die entsprechenden fluoreszierenden Proteine
müssen ggf. mittels rekombinanter DNA-Techniken so verändert
werden, dass sie die Erkennungssequenz für die entsprechende
Protease enthalten und so abbaubar sind.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 17 ist das Markerprotein ein
fluoreszierendes Protein, wobei die Expression des entsprechenden
Markerproteins nach Sezernierung des Signalmoleküls durch
die Zellen des ersten Typs variiert, was zu einer Zu- oder Abnahme
der Fluoreszenz der jeweiligen Hefezelle führt. Bevorzugt
verwendet werden die fluoreszierende Proteine GFP, YFP, CFP, BFP,
RFP, DsRed, PhiYFP, JRed, emGFP („Emerald Green"), Azami-Green,
Zs-Green oder AmCyan 1. Bevorzugt verwendet werden Proteine, die
so verändert wurden, dass sie besonders stark fluoreszieren
wie eGFP, eYFP, TagCFP, TagGFP, TagYFP, TagRFP und TagFP365. Weiterhin
werden bevorzugt solche fluoreszierenden Proteine verwendet, deren
Aminosäuresequenz dahingehend verändert wurde,
dass sie möglichst schnell nach ihrer Bildung beginnen
zu fluoreszieren. Bevorzugt verwendet werden ebenfalls TurboGFP,
TurboYFP, TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, und dsRed-Express.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 18 kodiert das spezifische
Gen für ein grün, (z. B. GFP), gelb (z. B. YFP),
blau (z. B. BFP), cyan (z. B. CFP) oder rot (z. B. dsRed) fluoreszierendes
Protein als Markerprotein.
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Für
ein möglichst zeitnahes Monitoring kann es vorteilhaft
sein, die entsprechenden Markerproteine durch das Anfügen
von Sequenzen, die zu einem erhöhten „Turn-over"
der Proteine führen, zu destabilisieren. Nach der Weiterbildung
des Patentanspruchs 19 ist das Markerprotein ein fluoreszierendes
Protein mit eingeschränkter Halbwertszeit. Dadurch wird
eine rasche Ansprechzeit bei einer Abnahme der Transkription gewährleistet.
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Eine
solche eingeschränkte Halbwertszeit kann zum Beispiel durch
die Veränderung der N-terminalen Aminosäure oder
das Einbringen einer Signalsequenz in die Aminosäuresequenz
des vom Markergen kodierten Proteins erreicht werden, wodurch die
Stabilität des Proteins gesenkt und seine Halbwertszeit
verkürzt wird. Bevorzugt verwendet wird für die
Destabilisierung des vom Markergen kodierten Proteins eine sogenannte
PEST Domäne, die zu einem raschen Abbau des Proteins durch
das Ubiquitin-System der Zelle führt. Solche PEST-Domänen
sind aus vielen Proteinen bekannt. Bevorzugt verwendet wird die
PEST Domäne des G1 Cyclins Cln2p aus Saccharomyces cerevisiae.
Hierfür wird an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz des
Markergens die kodierende Sequenz (Seq.-Nr. 3) der 178 carboxyterminalen
Aminosäuren von Cln2p (Seq.-Nr. 4) und ein Stoppcodon angefügt.
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Das
unter die Kontrolle eines für ein Signalmolekül
spezifischen Promotors gestellte Gen, das für ein Markerprotein
kodiert oder für die Synthese eines Signalmoleküls
zuständig ist, wird in eine Zelle, bevorzugt eine Hefezelle
eingebracht. Dabei kann es in der Hefezelle auf einem extrachromosomalen
DNA-Molekül vorliegen. Bevorzugt verwendet wird dazu ein
Hefe-Expressionsvektor, der bei der Teilung der Hefezelle stabil
repliziert wird. Besonders bevorzugt ist ein sogenannter „high
copy number" Vektor, der in der Hefezelle in einer großen
Anzahl an Kopien vorliegt. Alternativ werden auch Vektoren genutzt,
die in geringerer Kopienzahl oder als einzelner Vektor in Hefen
vorliegen, z. B. ARS-CEN-Vektoren, oder künstliche Hefechromosomen
(yeast artificial chromosomes) verwendet.
-
In
einer anderen Ausführungsform wird das Gen zusammen mit
dem Pheromon-spezifischen Promotor in die chromosomale DNA der Hefezelle
integriert. Dadurch wird vorteilhaft sichergestellt, dass alle Nachkommen
der Hefezelle ebenfalls das Markergen unter Kontrolle des spezifischen
Promotors enthalten.
-
Die
erfindungsgemäße Detektions- und Verstärkungseinrichtung
hat den Vorteil, dass ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes
Primärsignal durch die dadurch induzierte Sekretion des
Signalmoleküls und dessen Wirkung auf die umliegenden responsiven
Zellen des zweiten Typs um ein Vielfaches verstärkt werden
kann.
-
Dabei
kann durch die gezielte Beeinflussung der Zahlenverhältnisse
der verschiedenen Zelltypen der verstärkende Effekt weiter
gesteigert werden. Bei einer regellosen Verteilung der Zellen als
Zellgemisch liegen dabei die Zellen des ersten Typs gegenüber
den Zellen des zweiten Typs in einem Verhältnis 1 zu 20,
bevorzugt 1 zu 10, besonders bevorzugt 1 zu 5 vor. In Kompositgefügen
mit einer zweckmäßigen strukturierten Verteilung
der einzelnen Zelltypen in granularen oder schichtförmigen
Phasen ist das optimale Konzentrationsverhältnis zusätzlich
eine Funktion der gewählten räumlichen Anordnung
der Zellen zueinander.
-
Zudem
haben Verstärker- und Sensorsysteme, die auf lebenden Zellen
beruhen, den großen Vorteil der natürlichen Regeneration
der genutzten Komponenten. Dies ist insbesondere bei Verfahren des „On-Line Monitoring"
oder auch „Near-Line Monitoring" von Prozessen hilfreich.
-
Die
erfindungsgemäße biologische Detektions- und Verstärkungseinrichtung
kann beispielsweise genutzt werden, um
- – die
Limitierung von Stoffen wie z. B. Phosphat, Schwefel, Stickstoff
oder einer Kohlenstoffquelle wie z. B. Glucose in Kulturmedien frühzeitig
zu detektieren,
- – eine Belastung von Zellen durch Stressoren wie z.
B. Strahlung oder chemische Agenzien effektiver nachzuweisen,
- – das Auftreten von Zielmolekülen wie beispielsweise
bestimmte Stoffwechselintermediate frühzeitig zu detektieren,
- – Bioassays zum Nachweis von Substanzen in wässrigen
Lösungen effektiver zu gestalten.
-
In
den Hefezellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Paarungstyps
ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 20 die authentische
Regulation der Expression von Pheromonen ausgeschaltet. Beispielsweise
sind die natürlichen Gene MFα1 und MFα2
in α-Zellen von Saccharomyces cerevisiae-Zellen nach der
Weiterbildung des Patentanspruchs 21 deletiert. Nach der Weiterbildung
des Patentanspruchs 22 sind die natürlichen Gene MFA1 und
MFA2 in Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps deletiert. Damit
wird vorteilhaft sichergestellt, dass der α-Faktor bzw.
der a-Faktor ausschließlich dann gebildet und sezerniert
wird, wenn das zu detektierende Primärsignal vorhanden
ist. Sekundäre Effekte auf die Zellen des zweiten Typs
werden dadurch ausgeschlossen.
-
Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 23 ist in den Hefezellen des
ersten und/oder zweiten und/oder dritten Paarungstyps das Protein
Fig1p inaktiviert. Hohe lokale Konzentrationen an Pheromonen lösen
bei Hefezellen Zelltod aus. Durch die Inaktivierung des Fig1p wird
dieser Effekt verhindert (Zhang, N.-N., et al. (2006) Multiple
signaling pathways regulate yeast cell death during response to
mating pheromones. Mol. Biol. Cell 17: 3409–3422).
Dadurch wird vorteilhaft verhindert, dass die Hefezellen durch eine
hohe Konzentration an Pheromon, die durch ein starkes Primärsignal
verursacht wird, absterben und damit für das Verfahren nicht
mehr zur Verfügung stehen (Zhang et al., 2006).
-
Der
durch ein Primärsignal regulierbare Promotor ist nach der
Weiterbildung des Patentanspruchs 24 ein Stickstoff-, Phosphat-
oder Schwefel-spezifisch regulierter Promotor. Das zu verstärkende
Primärsignal ist Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefelmangel.
-
Bevorzugt
wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1000 bp
5'-seitig des Startcodons des von ihm kontrollierten Gens umfasst,
oder ein Teilabschnitt dieses DNA Abschnitts, der in der Lage ist,
z. B. auf die Limitierung von Stickstoff, Phosphor oder Schwefel
hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende Markergen zu aktivieren
oder zu unterdrücken.
-
Der
Stickstoff-, Phosphat- bzw. Schwefel-spezifisch regulierte Promotor
ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 25 ausgewählt
aus den Promotoren der Gene YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W
und YLL057C von Saccharomyces cerevisiae.
-
Promotoren
von Genen, deren Transkription als Antwort auf eine entsprechende
Limitierung stark erhöht ist, sind vorteilhafterweise bei
einer
- – Stickstoff-Limitierung: YIR028W
und YJR152W,
- – Phosphat-Limitierung: YAR071W und YHR136C
- – Schwefel-Limitierung: YFL055W und YLL057C.
-
Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 26 befinden sich die Zellen
in einem porösen organischen oder anorganischen Gel, nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 27 in einem porösen
und optisch transparenten Siliziumdioxid-Xerogel.
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Vorteilhaft
sind die Zellen in Xerogelen immobilisiert. Xerogele sind Gele,
die ihre Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfen oder
Absaugen verloren haben. Gele sind formbeständige, leicht
deformierbare disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten,
die zumeist aus einem festen Stoff mit langen oder stark verzweigten
Teilchen (z. B. Kieselsäure, Gelatine, Kollagene, Polysaccharide,
Pektine, spezielle Polymere, wie z. B. Polyacrylate, und andere,
oft als Verdickungsmittel bezeichnete Geliermittel) und einer Flüssigkeit
(meist Wasser) als Dispersionsmittel bestehen. Dabei bildet die
feste Substanz im Dispersionsmittel ein räumliches Netzwerk.
Bei der Entstehung von Xerogelen verändert sich die räumliche
Anordnung des Netzes.
-
Die
vorteilhafte Verwendung von anorganischen oder biologisch inerten
organischen Xerogelen zur Einbettung der Zellen erlaubt vorteilhaft
das Überleben der Zellen bei gleichzeitiger Stabilität
der erzeugten Strukturen, denn sie sind toxikologisch und biologisch
inert und werden im Allgemeinen nicht durch die Zellen abgebaut.
Sie ermöglichen weiterhin vorteilhaft die Einlagerung von
Nährstoffen und Feuchthaltemitteln, die das Überleben
der Zellen sichern.
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Die
Zellen sind vorteilhaft in einem porösen und optisch transparenten
anorganischen oder biologisch inerten organischen Xerogel immobilisiert.
Dieses Xerogel ist bevorzugt ein anorganisches Xerogel aus Siliziumdioxid,
alkyliertem Siliziumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid oder deren
Gemischen. Bevorzugt wird das anorganische Xerogel vorzugsweise
durch einen Sol-Gel-Prozess hergestellt.
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Dazu
werden zunächst Silica- oder andere anorganische Nanosole
entweder durch säure- oder alkalikatalysierte Hydrolyse
der entsprechenden Silizium- oder Metallalkoxide in Wasser oder
einem wasserlöslichem organischem Lösungsmittel
(wie Ethanol) hergestellt. Bevorzugt wird die Hydrolyse in Wasser
durchgeführt, um toxische Effekte des Lösungsmittels
auf die einzubettenden Zellen zu verhindern. Bei der Herstellung von
Nanosolen durch Alkoxidhydrolyse entstehen im Zuge der Reaktion
Alkohole, die anschließend aus dem erhaltenen Nanosol durch
Durchleitung eines inerten Gasstroms verdampft und durch Wasser
ersetzt werden.
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Durch
die Verwendung von Gemischen verschiedener Alkoxide können
die Matrixeigenschaften gezielt beeinflusst werden. Die Sol-Gel-Matrix
erlaubt vorteilhaft die chemische Modifizierung durch Co-Hydrolyse
und Co-Kondensation unter Verwendung verschiedener Metalloxide von
Metallen wie Al, Ti, Zr zur Herstellung von gemischten Oxiden oder
von Alkoxysilanen mit organischen Resten am Si-Atom zur Herstellung
von organisch modifizierten Siliziumoxid-Gelen.
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Die
einzubettenden Zellen werden mit dem entstandenen Nanosol gemischt.
Der Prozess der Gelbildung wird bevorzugt eingeleitet durch Erhöhung
der Temperatur, Neutralisierung des pH-Werts, Aufkonzentrierung
oder die Zugabe von Katalysatoren wie beispielsweise Fluoriden.
Dabei sollte die Temperatur jedoch nicht auf Temperaturen > 42°C erhöht
werden, um die einzubettenden Zellen nicht zu schädigen.
Bei der Überführung in ein Gel verringern die
Nanosole ihr Oberflächen/Volumenverhältnis durch
Aggregation und dreidimensionale Quervernetzungen. Während
dieser Umwandlung des Nanosols in ein sogenanntes Lyogel werden
die Zellen in dem entstehenden anorganischen Netzwerk immobilisiert.
Die Immobilisierung überlebensfähiger Zellen wird
vorteilhaft durch das Verhältnis Zellen:Oxid und durch
die Zugabe von Poren-formenden Agentien gesteuert.
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Der
Anteil von Zellen an der Gesamtmenge des erzeugten Xerogels einschließlich
der eingebetteten Zellen kann je nach Anwendung von 0,1 bis 50%
Gewichtsprozent betragen. Bevorzugt verwendet wird ein Anteil von
2 bis 25% Gewichtsprozent.
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Durch
Trocknung wird dem Lyogel das noch enthaltene Lösungsmittel
entzogen. Dadurch bildet sich aus dem Lyogel das Xerogel. Das entstehende
Xerogel weist eine hohe Porosität auf, die einen raschen
Stoffaustausch mit dem umgebenden Medium erlaubt. Der Trocknungsprozess
hat eine starke Schrumpfung des Gels zur Folge, der zu Stress für
die eingebetteten Zellen führt. Bevorzugt wird der Trocknungsschritt
daher sehr schonend und langsam bei Temperaturen von weniger als
40°C durchgeführt.
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Mit
sinkendem Wassergehalt der Matrix verringern sich die physiologische
Aktivität und die Überlebensrate der eingebetteten
Zellen. Ein zu hoher Wassergehalt Führt jedoch zu niedriger
mechanischer Stabilität und verringert die Haltbarkeit
der Struktur.
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Die
Verwendung von Hefezellen ist besonders vorteilhaft, da Hefezellen
eine hohe Resistenz gegen Trockenheit besitzen und auch bei sehr
geringem Wassergehalt ihre Überlebensfähigkeit
nicht einbüßen. Dadurch wird es möglich,
sehr trockene Xerogele herzustellen.
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Die
Erfindung umfasst auch die Verwendung verschiedener Additive wie
lösliche organische Salze, d. h. Metallsalze organischer
Carbon- oder Sulfonsäuren bzw. offenkettige oder cyclische
Ammoniumsalze und Quartärsalze von N-Heterocyclen sowie
niedermolekulare Polyanionen oder Polykationen, oder wasserlösliche
organische Verbindungen wie Polycarbonsäuren, Harnstoff-Derivate,
Kohlenhydrate, Polyole, wie Glycerin, Polyethylenglycol und Polyvinylalkohol,
oder Gelatine, die als Weichmacher, Feuchthaltemittel und Porenbildner
wirken, die Zelllyse hemmen und die Überlebensfähigkeit
der eingebetteten Zellen beträchtlich verlängern.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 28 befindet sich das Siliziumdioxid-Xerogel
mit den Zellen auf einem Substrat mit erhöhter mechanischer
Stabilität. Das anorganische Xerogel ist dazu mit den Zellen auf
einem Substrat aufgebracht. In Verbindung mit dem Signaldetektor,
vorzugsweise einem Fotodetektor, ist damit ein Funktionselement
vorhanden, wobei das in Abhängigkeit vom bioverfügbaren
Analyten erzeugte Fluoreszenzlicht über den Fotodetektor
in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. In Fortführung
ist das Substrat vorteilhafterweise nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
29 eine Lichtleitfaser, Glasbeads, ein planarer Glasträger
oder andere Formkörper aus Glas wie Hohlkugeln, Stäbe,
Röhren oder keramische Granulate.
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Dabei
werden die Zellen in einem porösen und optisch transparenten
anorganischen Xerogel, z. B. einem Siliziumdioxid-Xerogel, fixiert.
Das mit den Mikroorganismen versetzte Siliziumdioxid-Xerogel wird
als Schicht auf Glasbeads, einer Lichtleitfaser, Planaren Glasträgern
oder anderen Formkörpern wie Hohlkugeln, Stäben,
Röhren oder keramischen Granulaten mittels eines bekannten
Sol-Gel-Prozesses abgeschieden, indem das Nanosol-Zell-Gemisch auf
das zu beschichtende Substrat aufgebracht oder das Substrat in das
Nanosol-Zell-Gemisch eingetaucht wird und das Nanosol anschließend
durch Trocknung und die dadurch resultierende Aufkonzentrierung
des Nanosols in ein Xerogel überführt wird. Die
dadurch vorhandene mechanische Stabilität dieser Strukturen
erlaubt das Einbringen der erfindungsgemäßen Einrichtung
in ein Messsystem, das unmittelbar mit dem zu untersuchenden Reaktionsraum
(Fermenter) im Sinn einer near-line-Diagnostik verbunden werden
kann.
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Die
Zellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 30 ein Bestandteil
einer einen Hohlraum wenigstens teilweise umschließenden
Hüllenstruktur. Das heißt, dass einzelne oder
mehrere Zellen in diesem Hohlraum, der eine poröse Hülle
hat, eingekapselt werden. Die Mikroporosität erlaubt vorteilhaft
einen Stoffaustausch mit der Umgebung. In Fortführung besteht
die Hüllenstruktur nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
31 vorteilhafterweise aus einem Grundkörper mit einer inneren
Schicht aus einem biologischen Hydrogel und einer äußeren
Schicht aus dem porösen und optisch transparenten Siliziumdioxid-Xerogel,
wobei die Schichten wenigstens bereichsweise aufgebracht sind.
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Die
Zellen sind dabei in der Hüllenstruktur eingebettet (Duplex-Einbettung).
Die innere Hülle besteht aus einem biologischen Hydrogel,
beispielsweise Alginat, und die äußere Hülle
ist eine poröse Xerogel-Schicht, bevorzugt eine anorganische
Xerogel-Schicht, besonders bevorzugt eine Siliziumdioxid-Xerogel-Schicht.
Das biologische Hydrogel stabilisiert vorteilhaft die Zellen bei
dem nachträglichen Prozess der Beschichtung mit dem Siliziumdioxid-Sol
und erhöht somit die Überlebenswahrscheinlichkeit
der Zellen. Diese Duplex-Einbettung kann vorteilhafterweise mittels
einer sequentiellen Beschichtung unter Nutzung eines Nanoplotters
erfolgen. Die mechanische Stabilität solcher Strukturen
erlaubt das Einbringen der erfindungsgemäßen Einrichtung
in den zu untersuchenden Reaktionsraum (Fermenter) im Sinn einer
near-line-Diagnostik.
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Die
Zellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 31 in ein
Gefüge mit einer hierarchischen Porenstruktur eingebettet,
so dass neben der für anorganische Gele typischen Nanoporosität
das Gefüge zusätzlich von miteinander verbundenen
Mesoporen durchzogen wird, deren Durchmesser typischerweise zwischen
100 nm bis 100 um variiert und die einen Stoffaustausch zwischen
der Umgebung und den eingebetteten Zellen sowie deren Reaktionsprodukte
wie den Enzymen ermöglichen.
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Dadurch
können vorteilhaft die Zellen des ersten Typs und die Zellen
des zweiten Typs sowie ggf. Zellen des drittens Typs in verschiedenen
Schichten auf das Substrat aufgebracht werden. Durch die Nanoporosität
können sowohl die spezifischen Primärsignale an
die Zellen des ersten Typs gelangen, die sich in der äußeren
Schicht des Sensors befinden, als auch die von diesen Zellen sezernierten
Pheromone an die Zellen des zweiten und/oder dritten Typs gelangen,
die sich in der darunter befindlichen Schicht befinden, die direkten Kontakt
zum Signaldetektor hat.
-
Hinsichtlich
der räumlichen Anordnung der drei Hefezelltypen in Schichten
gibt es drei grundsätzliche Optionen der Verteilung der
Zellen in einem Zellgemisch, in einem Kompositgefüge, das
aus verschiedenen Gefügebausteine mit unterschiedlichen
Zellverteilungen besteht, oder als ein gradiertes Schichtsystem
mit einer tiefenabhängigen kontinuierlichen Änderung
der Konzentrationsverteilung der drei Zelltypen.
-
I. Zellgemisch
-
Zellen
vom Typ 1 und Typ 2 sowie gegebenenfalls Typ 3 werden in einem vorbedachten
Mengenverhältnis zum Einstellen des angestrebten Verstärkungsgrades
in einer festen Matrix immobilisiert oder alternativ in eine wässrigen
Lösung in einer statistisch regellosen Verteilung eingebracht.
-
Vorteile
dieser Zellgemische bestehen in den kurzen Transportwegen zum Austausch
der Signalmoleküle zwischen den einzelnen Zellen sowie
der statistischen Homogenität des Sensormaterials. Ein
Nachteil kann sich aus der nur begrenzten Zugänglichkeit
der Typ 1-Zellen (die in der Tiefe des Sensormaterials angeordnet
sind) für das externe Primärsignal ergeben.
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Mit
den im Zellgemisch realisierten Konzentrationsverhältnissen
der drei Zelltypen kann der Verstärkungsgrad in gewünschter
Weise eingestellt werden.
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II. Kompositgefüge
-
Das
Kompositgefüge kann wahlweise aus Granulaten oder Einzelschichten
aufgebaut werden. (zu den Einzelschichten siehe auch 3)
-
In
den Granulaten sind ein oder zwei Zelltypen jeweils immobilisiert.
Durch eine geeignete Anordnung der Granulate zueinander sowie ein
geeignet gewähltes Mischungsverhältnis der Zellen
in den Granulaten sowie der Granulate zueinander kann der Verstärkungsgrad
eingestellt werden: Vorteilhafterweise wird der Anteil von Granulaten
mit dem Zelltyp 1 im Außenbereich des Kompositgefüges
für einen effektiven Empfang des externen Primärsignals
erhöht. Die Granulate mit den Zelltypen 1 und 3 dienen
einer Vorverstärkung des externen Primärsignals.
Granulate mit den Zelltypen 1 und 2 oder 3 und 2 dienen der Endverstärkung
und Wandlung in das auszulesende physikalische, chemische oder biochemische
Signal.
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Ein
analoges Vorgehen ist bei der Anordnung der drei Zelltypen in Schichtsystemen
vorgesehen. In einzelnen Schicht werden hierbei wiederum ein oder
zwei Zelltypen eingebettet. Schichten mit dem Zelltyp 1 werden vorteilhafterweise
wiederum im Außenbereich des Kompositgefüges angeordnet,
um einen effektiven Empfang des externen Primärsignals
zu sichern. Einzelschichten mit den Zelltypen 1 und 3 dienen einer
Vorverstärkung des externen Primärsignals. Einzelschichten
mit den Zelltypen 1 und 2 oder 3 und 2 dienen der Endverstärkung
und Wandlung in das auszulesende physikalische, chemische oder biochemische
Signal. Die Schichten können in planarer Geometrie auf einem
geeigneten Träger aufgebracht werden. Es sind aber auch schichtförmige
konzentrische Gefügeanordungen sowie die Beschichtung von
regellos gekrümmten Trägern Gegenstand der Erfindung.
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III. Gradierte Schichten
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Gradierte
Schichten stellen einen Übergang von den diskreten Zellverteilungen
in den Schichtsystemen zu den Zellgemischen dar, indem durch eine
geeignete Beschichtungsstrategie eine quasi kontinuierliche Änderung
der Konzentrationsverteilung der drei Zelltypen vom Außenraum
(vorzugsweise Typ 1- und Typ 3-Zellen) zum Bereich der Auslesestruktur
(vorzugsweise Zellen vom Typ 2 und Typ 3) verwirklicht wird. Eine gradierte
Schicht vereint den Vorteil eines effektiven Empfangs des externen
Primärsignals mit möglichen kurzen Transportwegen
für die biologischen interzellulären Signalmoleküle
innerhalb der erfindungsgemäßen Einrichtung.
-
Außerdem
ermöglicht der Einsatz eines Nanoplotters vorteilhaft,
die Zellen des ersten, des zweiten und ggf. des dritten Typs in
einer räumlichen Anordnung zueinander auf dem formstabilen
Substrat aufzubringen, was den verstärkenden Effekt des
Verfahrens zusätzlich unterstützt (siehe 2).
Dadurch kann sowohl durch die Wahl des Mengenverhältnisses
von Zellen des ersten Typs zu Zellen des zweiten Typs sowie ggf.
zu Zellen des dritten Typs als auch durch die Wahl der Anordnung
der Zellen zu einander die Verstärkung gezielt beeinflusst
werden.
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Einige
Anordnungen der immobilisierten Hefen sind in den 2 und 3 schematisch
dargestellt.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 33 ist in den Zellen des ersten
und/oder zweiten und/oder dritten Typs das Afr1p-Protein (Alpha-Factor
Receptor Regulator 1) inaktiviert.
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Als
Antwort auf die Pheromoninduktion wird ein umfangreiches Paarungsprogramm
(„mating response pathway") in den Zellen aktiviert (Leberer
et al., (1997). Pheromone signaling and polarized morphogenesis
in yeast. Current Opinion in Genetics & Development 7: 59–66.).
Paarungsspezifische Gene werden induziert und der Zellzyklus arretiert.
Anschließend erfolgt ein gerichtetes Wachstum (Paarungsprojektion)
der Zellen zur Quelle des Pheromons, z. B. dem Paarungspartner (Jackson
et al. (1991). S. cerevisiae a pheromone receptors activate a novel
signal transduction pathway for mating Partner discrimination Cell
67: 389–402.; Jackson et al. (1993) Polarization
of yeast cells in spatial gradients ofa-mating factor. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 8332–8336).
-
Dieses
"Ausstrecken" der Hefezellen wird auch als "Shmoo" bezeichnet (Mackay
und Manney, (1974). Mutation affecting sexual conjugation and related
processes in Saccharomyces cerevisiae. I. Isolation and phenotypic
characterization of nonmating mutants. Genetics 76: 255–271.).
-
Afr1p
(„alpha factor receptor regulator") ist für die
Ausbildung von "Shmoo"-Projektionen während der Paarung
von Saccharomyces cerevisiae verantwortlich (Konopka, (1993).
AFR1 acts in conjunction with the alpha-factor receptor to promote
morphogenesis and adaptation. Mol Cell Biol. 13: 6876–6888.). Δafr1-Mutanten
können keine normalen Paarungsprojektionen mehr ausbilden.
Im Übrigen zeigen Δafr1-Mutanten jedoch eine normale
Sensitivität gegenüber einer Stimulation mit α-Faktor
(Konopka, 1993). Folglich kann die Deletion des
AFR1-Gens genutzt werden, um ein Ausbrechen der Hefezellen aus der
Einbettungsmatrix durch "Shmoo"-Projektionen zu verhindern, ohne
den Pheromon-Signalweg zu beeinträchtigen, denn Zellen,
in denen dieses Protein inaktiviert ist, können zwar noch
Pheromonsignale empfangen, bilden jedoch keine Paarungsprojektionen
(Ausknospung) mehr aus und können auf die Detektion von
Pheromon hin nicht mehr mit Hefezellen des anderen Paarungstyps
verschmelzen. Dies verhindert vorteilhaft, dass die Zellen des erfindungsgemäßen
Verfahrens auf ein spezifisches Primärsignal und die dadurch
bewirkte Ausschüttung von Pheromon hin nicht auswachsen
und eine Matrix, in welche sie eingebettet sind, beschädigen.
Außerdem können sie nicht miteinander verschmelzen
und somit für das Verfahren unbrauchbar werden.
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Für
die Deletion des AFR1-Leserahmens wird bevorzugt eine HIS5+-Deletionskassette genutzt, welche durch
doppelte homologe Rekombination den AFR1-Leserahmen im Genom ersetzt.
Die HIS5+-Kassette wird dazu 5'- und 3'-seitig
mittels SFH-PCR (SFH, "short flanking homology region") nach Wach
et al. (Wach et al. (1997) Heterologous HIS3 marker and
GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.
Yeast 13: 1065–1075) mit 40 bp langen flankierenden
Sequenzen des AFR1-Gens versehen.
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Der α-Faktor
wird durch die spezifische Protease Bar1p von Saccharomyces cerevisiae
gespalten und damit inaktiviert. Bar1p wird sezerniert und ist für
eine korrekte Paarung der Hefezellen notwendig. MATa-Zellen, bei
denen Bar1p inaktiviert ist, zeigen eine deutlich erhöhte
Sensitivität gegenüber dem α-Faktor.
Um die Sensitivität und Ansprechzeit des Verstärkersystems
zu erhöhen, werden nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
34 Zellen eingesetzt, bei denen das Bar1-Protein inaktiviert bzw.
das entsprechende Gen deletiert wurde (Ballensiefen W and
Schmitt H. D. (1997) Periplasmic Bar1 protease of Saccharomyces
cerevisiae is active before reaching its extracellular destination.
Eur J Biochem 247(1): 142–7; Chan R. K.
and Otte C. A. (1982) Physiological characterization of Saccharomyces
cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and alpha
factor pheromones. Mol Cell Biol 2(1): 21–9; Barkai
N, et al. (1998) Protease helps yeast find mating Partners. Nature
396(6710): 422–3; Sprague G. F. Jr and
Herskowitz I. (1981) Control of yeast cell type by the mating type
locus. I. Identification and control of expression of the a-specific
gene BAR1. J Mol Biol 153(2): 305–21).
-
Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 35 werden als Hefezellen solche
Zellen eingesetzt, die genetisch dergestalt verändert wurden,
dass ihr Wachstum gezielt gesteuert werden kann. Dies erlaubt vorteilhaft,
die für die Herstellung der erfindungsgemäßen
Einrichtung benötigte Menge an Hefezellen unter sogenannten
permissiven Bedingungen heranzuziehen und nach der Einbettung der
Hefezellen in eine Matrix die Hefezellen durch die Einstellung von
restriktiven Bedingungen daran zu hindern, sich weiter zu teilen.
Dadurch wird der durch das vegetative Wachstum der Zellen innerhalb
der Matrix ausgeübte Druck vorteilhaft vermieden, der sowohl
die Haltbarkeit der Einrichtungen beeinträchtigt als auch
Stress auf die immobilisierten Zellen ausübt und deren
Vitalität negativ beeinflusst.
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Bevorzugt
eignen sich Hefezellen, bei denen die Aktivität eines Gens,
welches auf den Zellzyklus einwirkt, gezielt gesteuert werden kann.
Besonders bevorzugt werden Hefezellen, bei denen die Aktivität
des CDC28-Gens gezielt gesteuert werden kann. Das CDC28-Gen wird
von der Hefezelle benötigt, um sich teilen zu können.
Ist das Gen nicht vorhanden, kann die Hefezelle zwar überleben,
aber sich nicht weiter teilen.
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Die
Steuerung der Genaktivität erfolgt beispielsweise durch
das sogenannte Tet on-System. Dabei wird eine Hefezelle, in der
das endogene CDC28-Gen deletiert ist (eine sogenannte Δcdc28-Zelle),
mit einem DNA-Konstrukt transformiert, dass die kodierende Sequenz
des CDC28-Gens unter der Kontrolle eines tet-responsiven Promotors
enthält. Gleichzeitig enthält das Konstrukt die
kodierende Sequenz des reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivators
(rtTA) unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors.
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Solche
genetisch veränderten Hefezellen exprimieren ständig
den reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator. Dieser kann
nur in Gegenwart eines Tetracyclin-Antibiotikums wie beispielsweise
Doxycyclin an den tet-responsiven Promotor binden und die Expression
des unter der Kontrolle des tet-responsiven Promotors stehenden
Gens unterdrücken. Um die Zellen heranzuziehen, setzt man
dem Nährmedium ein Tetracyclin-Antibiotikum zu und stellt
somit permissive Bedingungen her. Bei bzw. nach der Einbettung der
Hefezellen in das Xerogel wäscht man das Tetracyclin-Antibiotikum
aus und schafft dadurch restriktive Bedingungen für die
Hefe. Der reverse Tetracyclin-kontrollierte Transaktivator kann
nicht mehr die Expression des CDC28-Gens aktivieren. Die Hefezellen
können sich also nicht mehr weiter teilen.
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Nach
der Weiterbildung des Anspruchs 36 werden als Hefezellen Zellzyklus-(cdc;
cell division cycle)-Hefe-Mutanten eingesetzt, welche bei permissiver
Temperatur normal wachsen und bei restriktiver Temperatur das Wachstum
einstellen. So sind mehrere temperatursensitive (ts) Allele des
CDC28-Gens aus Saccharomyces cerevisiae bekannt. Es wurden z. B.
sechs verschiedene ts-Allele identifiziert, welche ein normales Wachstum
der Hefen bei 23°C erlauben, jedoch das Wachstum bei 37°C
verhindern (Lörincz and Reed, 1986). Weiterhin sind auch
solche temperatursensitiven Mutationen bekannt, bei denen die permissive
Temperatur höher ist als die restriktive Temperatur. Diese
bezeichnet man als kältesensitive (cold sensitive, cs)
Mutationen.
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Vorteilhaft
kann durch die Nutzung solcher Mutanten bei permissiver Temperatur
zunächst die benötigte Biomasse erzeugt werden,
während die Hefezellen das Wachstum bei restriktiver Temperatur
einstellen. Werden solche Mutanten für die erfindungsgemäße
Einrichtung eingesetzt, so können bei thermosensitiven Mutanten
die Zellen vorteilhaft bis zum Erreichen der gewünschten
Biomasse bei ca. 25°C angezogen und dann eingebettet werden.
Bei restriktiver Temperatur von z. B. 37°C – einer
Temperatur wie sie für Fermentation von Escherichia coli
ideal ist – erfolgt kein Wachstum der Hefen mehr, obwohl
die Zellen physiologisch aktiv sind. (Lörincz,
A. and Reed, S. I. Sequence analysis of temperature-sensitive mutations
in the Saccharomyces cerevisiae gene CDC28. Mol. Cell. Biol. (1986)
6: 4099–4103). Bevorzugt verwendet werden Hefen,
die die temperatursensitiven Allele cdc28-4, cdc28-6, cdc28-9, cdc28-13,
cdc28-16, cdc28-17, cdc28-18 und cdc28-19 tragen.
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Für
Anwendungen, bei denen die Hefen in niedrigeren Temperaturen wie
beispielsweise Raumtemperatur eingesetzt werden sollen, werden kältesensitive
Mutanten eingesetzt, die bei hohen Temperaturen herangezogen werden
und nach der Einbettung bei niedriger Temperatur gehalten werden
und so keine Teilungsaktivität mehr aufweisen.
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Nach
Patentanspruch 37 sind die Zellen mit wenigstens einer Quelle für
elektromagnetische Strahlen und mindestens einem Fotodetektor so
gekoppelt, dass elektromagnetische Strahlen auf die Hefezellen fallen und
die Fluoreszenz über den Fotodetektor gemessen wird.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 38 ist der Fotodetektor ein
Festkörperbildsensor mit Fotowiderständen, Fotodioden
oder Fototransistoren und der Festkörperbildsensor ist
mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet.
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Ein
Festkörperbildsensor ist eine flächenhafte und
matrixförmige Anordnung optoelektronischer Halbleiterbauelemente
als lichtelektrische Empfänger. Die Farbe der Zellen und
deren Intensität sind in äquivalente elektrische
Signale wandelbar, so dass eine Verarbeitung im Datenverarbeitungssystem
stattfinden kann.
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Die
Zellen befinden sich nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
39 wenigstens auf einer Oberfläche in einer transparenten
Messzelle. Diese besitzt darüber hinaus Einrichtungen zum
Zuführen und Abführen des Mediums.
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Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 40 ist die Messzelle mit einer
Heizeinrichtung gekoppelt.
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Eine
Quelle für elektromagnetische Strahlen und ein Fotodetektor
sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 41 so angeordnet,
dass von den Partikeln ausgehende elektromagnetische Strahlen auf
den Fotoempfänger abgebildet werden.
-
Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 42 ist der Signaldetektor
ein Fotodetektor. Der Fotodetektor ist ein Festkörperbildsensor
mit Fotowiderständen, Fotodioden oder Fototransistoren,
wobei dieser mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet
ist. Ein Festkörperbildsensor ist eine flächenhafte
und matrixförmige Anordnung optoelektronischer Halbleiterbauelemente
als lichtelektrische Empfänger. Die Farbe und deren Intensität
der Hefezellen sind in äquivalente elektrische Signale
wandelbar, so dass eine Verarbeitung im Datenverarbeitungssystem
stattfinden kann.
-
Im
Strahlengang nach der Quelle für elektromagnetische Strahlen
und/oder vor dem Fotodetektor befindet sich nach der Weiterbildung
des Patentanspruchs 43 wenigstens eine strahlformende oder mindestens eine
strahlbeeinflussende optische Vorrichtung oder wenigstens eine Kombination
davon. Dadurch können die Lichtstrahlen der Hefezellen
auf den Fotodetektor fokussiert werden, so dass eine sichere Auswertung
auch lichtschwacher Änderungen gegeben ist.
-
Die
Hefezellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 44 mit
einer optischen Strahlungsquelle so gekoppelt, dass die Strahlung
auf die Hefezellen gelangt und die Hefezellen fluoreszieren. Die
Strahlungsquelle liefert vorzugsweise elektromagnetische Strahlen
als Licht im Sichtbaren und den angrenzenden Wellenlängenbereichen
im Infraroten oder Ultravioletten. Vorzugsweise ist das eine elektromagnetische
Strahlungsquelle, die Licht mit einer definierten Wellenlänge
aussendet. Die Wellenlänge der Strahlungsquelle richtet
sich nach dem Anregungsspektrum der fluoreszierenden Proteine.
-
Bestandteil
der Erfindung ist weiterhin auch ein Verfahren gemäß Patentanspruch
48 zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals
unter Nutzung von Zellen, nämlich einem Verfahren, wobei
- a) in Zellen eines ersten Typs ein Gen, welches
für die Synthese des Signalmoleküls zuständig
ist, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch
das Primärsignal reguliert wird,
- b) in Zellen eines zweiten Typs ein spezifisches Gen unter die
Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch das sezernierte
Signalmolekül reguliert wird,
so dass - – durch ein von einer Zelle des ersten
Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmolekül induziert
wird und
- – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte
Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs
verstärkt wird.
-
Nach
der Weiterbildung des Patentanspruchs 49 werden zusätzlich
- c) Zellen eines dritten Typs genutzt, bei denen
ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls
zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht,
der durch ein Signalmolekül reguliert wird, das durch die
Zellen des ersten Typs sezerniert wird,
so dass - – durch ein von einer Zelle des ersten
Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls in
der ersten Zelle induziert wird,
- – durch die Sekretion des Signalmoleküls durch
die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion
des Signalmoleküls induziert wird, und
- – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte
Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs
verstärkt wird.
-
Besondere
Ausgestaltungen der in dem erfindungsgemäßen Verfahren
genutzten Bestandteile werden sinngemäß wie die
besonderen Ausgestaltungen der Merkmale der erfindungsgemäßen
Einrichtung gemäß den Ansprüchen 3 bis
44 durchgeführt. Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs
50 wird daher das Verfahren unter Nutzung wenigstens einer Einrichtung
mit mindestens einem Merkmal aus einem der Ansprüche 3
bis 44 durchgeführt.
-
Anhand
folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung
näher erläutert.
-
Dabei
zeigen
-
1:
Schematische Darstellung gentechnisch veränderter Saccharomyces
cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α und des Paarungstyps
a gemäß Ausführungsbeispiel 1
-
2:
Vorrichtung zur Signalverstärkung mittels des Pheromonsystems
von Hefe.
-
Die
Immobilisierung definierter Zellmengen erfolgt mit Hilfe eines Nanoplotters.
-
Zellen
des ersten Typs, welche auf ein bestimmtes Primärsignal
hin (z. B. Limitationen von Nährstoffen im Medium) das
Hefepheromon α-Faktor produzieren, sind auf einer Oberfläche
(z. B. einem Glas-Objektträger) von Zellen des zweiten
Typs konzentrisch umgeben (A–C). In den Zellen des zweiten
Typs ist ein Markergen, z. B. für das GFP (grün
fluoreszierendes Protein) kodierend, unter die Kontrolle eine Pheromon-induzierbaren Promotors,
vorzugsweise des FIG1-Promotors, gestellt (A–C). Bei Induktion
des Hefepheromons kommt es zur Expression des Markergens und somit
zur Fluoreszenz der Zellen des zweiten Typs (B–C). Die
Expression des Pheromons ist abhängig von der Höhe
der Limitierung. Demzufolge zeigen bei geringer Limitierung die
Zellen des zweiten Typs in unmittelbarer Umgebung der Zelle des
ersten Typs (B), bei starker Limitierung auch weiter entfernte Zellen
eher eine Fluoreszenz (C).
-
3:
Schematischer Schichtaufbau mit verschiedener Dichte von Sensorzellen
-
Zellen
des zweiten Typs, welche als Antwort auf von der Zelle des ersten
Typs gebildeten α-Faktor ein auslesbares Signal generieren
(„Aktivierte responsive Zelle"), sind auf einer Sensoroberfläche
immobilisiert (A, C). Bei einem höheren Anteil von Zellen
des ersten Typs führt die Ausschüttung von Pheromon
zu einem stärkeren Signal (B) als bei einem geringeren
Anteil an Zellen des ersten Typs. (D). Solche Schichtsysteme lassen sich
auch in einem pyramidalen Aufbau kombinieren.
-
4:
Schematische Darstellung einer zusätzlichen Signalverstärkung
gemäß Ausführungsbeispiel 3
-
Ausführungsbeispiel 1: Signalverstärkung
unter Nutzung des Pheromonsystems von Hefe
-
Saccharomyces
cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α erkennen als Zellen
des ersten Typs mittels eines Rezeptors ein eingehendes Primärsignal.
Rezeptoren induzieren direkt oder über zwischengeschaltete
Signalkaskaden die Transkription des Promotors. Unter die Kontrolle
des Promotors ist der für den α-Faktor kodierende
MFα1 Leserahmen kloniert, so dass die Hefezelle des Paarungstyps α als
Antwort auf ein eingehendes Primärsignal das Pheromon α-Faktor
in die Umgebung sezerniert.
-
Die
Herstellung einer solchen Hefezelle des ersten Typs ist im Folgenden
beispielhaft für die Anwendung zum Monitoring von bioverfügbarem
Phosphor beschrieben. Die Hefezellen des ersten Typs (Sensorzellen)
reagiert hierbei auf sensitiv auf eine Limitierung von Phosphor.
Das Gen YAR071W wird bei einer Phosphorlimitierung spezifisch sehr
viel stärker transkribiert (Boer et al., (2003).
The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae
grown an glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen,
phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278: 3265–3274.).
Die 1000 Basenpaare umfassende, stromaufwärtsliegende Region
des heraufregulierten Gens YAR071W wird mittels der spezifischen
Primer Seq.-Nr. 5 und Seq.-Nr. 6 aus Tab. 2 in einer PCR aus genomischer
DNA von Saccharomyces cerevisiae amplifiziert. Durch die Primer
wird die Sequenz um eine 5'-seitige Erkennungssequenz für
SacI und 3'-seitig um eine Erkennungssequenz für SpeI erweitert.
Mittels dieser Erkennungssequenzen erfolgt ein gerichteter Einbau
in den „high copy-number"-Vektor p426, folgend p426YAR071W
genannt. Im zweiten Schritt wird der Leserahmen des MFα1-Gens
in das Plasmid p426YAR071W kloniert. Dazu wird die Sequenz des MFα1-Leserahmens
mit den Primer Seq.-Nr. 7 und Seq.-Nr. 8 (siehe Tab. 2) aus genomischer
DNA von Saccharomyces cerevisiae amplifiziert, welche das Fragment
5'-seitig um eine SpeI- und 3'-seitig um eine SalI-Schnittstelle
erweitern. Danach erfolgt die Klonierung des Fragments mit den genannten
Restriktionsschnittstellen in den Vektor p426YAR071W, folgend p426YAR071W-MFalpha1
genannt. Die korrekte Sequenz der klonierten Fragmente wird mittels
DNA Sequenzanalyse überprüft und bestätigt.
Der Vektor p426 enthält einen Ura3-Marker aus Saccharomyces
cerevisiae zur Selektion in ura-auxotrophen Stämmen. Das
entstandene Konstrukt p426YAR071W-MFalpha1 wird z. B. in den Hefestamm
BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0,
ura3Δ0) transformiert und positive Transformanden selektiert.
Bei Phosphorlimitierung wird in Sensorzellen, die mit dem Plasmid
p426YAR071W-MFalpha1 ausgestattet sind, spezifisch die Expression
von α-Faktor induziert.
-
Tab.
2: Primer für die Herstellung des Sensor-Plasmids p426YAR071W-MFalpha1.
Zur genomischen Zielsequenz homologe Bereiche sind dick markiert,
Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen sind
unterstrichen.
-
Die
authentisch für den α-Faktor kodierenden Gene
MFα1 und MFα2 sind im gleichen Stamm deletiert. Damit
ist sichergestellt, dass der α-Faktor ausschließlich
dann gebildet und sezerniert wird, wenn das zu detektierende Primärsignal
vorhanden ist.
-
Für
die Deletion der Leserahmen von MFα1 und MFα2,
z. B. im α-Hefestamm BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0,
lys2Δ0, ura3Δ0), werden die Markerkassetten natMX6
bzw. hphMX6 verwendet, welche Resistenzen gegen die Antibiotika
Nourseothricin bzw. Hygromycin B vermitteln. Die natMX6-Kassette
wird in einer SFH-PCR mittels der Primer Seq.-Nr. 9 und Seq.-Nr.
10 aus Tab. 3 amplifiziert. Die 5'-Bereiche der Primer (je 50 Basen)
sind homolog zu den flankierenden Sequenzen des MFα1-Leserahmens
im Genom von Saccharomyces cerevisiae. Die 3'-Bereiche der Primer
(20 bp) sind homolog zu den Enden der natMX6-Kassette. Als DNA-Template
für die SFH-PCR dient das Plasmid pFA6a-natMX6. Anschließend
werden Hefezellen mit dem SFH-Fragment transformiert. Transformanden,
bei denen das Fragment über doppelt homologe Rekombination
stabil in das Genom integriert ist, werden auf Nourseothricin-haltigem
Medium selektiert und die korrekte Integration der Deletionskassette
mittels diagnostischer PCR bestätigt. Danach erfolgt die
Deletion des Leserahmens von MFα2 im erzeugten Δmfα1-Hefestamm.
Hierzu wird analog zur ersten Deletion ein SFH-Fragment mit den
Primer Seq.-Nr. 11 und Seq.-Nr. 12 (siehe Tab. 3) und der hphMX6-Kassette
(DNA-Template pFA6a-hphMX6) amplifiziert und in Δmfα1-Hefezellen
transformiert. Die 5'-seitigen Bereiche der Primer sind homolog
zu den flankierenden Sequenzen des MFα2-Leserahmens im
Genom von Saccharomyces cerevisiae. Die Selektion positiver Transformanden
erfolgt auf Hygromycin B-haltigem Medium und die korrekte Integration
der Hygromycin-Resistenzkassette im Δmfα1-Δmfα2-Hefestamm
wird mittels diagnostischer PCR überprüft.
-
Tab.
3: Primer für die Deletion der Leserahmen von MFα1
und MFα2 von Saccharomyces cerevisiae. Die unmarkierte
Primersequenz kennzeichnet Bereiche, die homolog zur genomischen
DNA von Saccharomyces cerevisiae sind. Zur Deletionskassette homologe
Bereiche sind fett markiert.
-
-
Die
im gleichen Ansatz als Zellen des zweiten Typs vorliegenden Saccharomyces
cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps a sind dahingehend modifiziert,
dass sie den für das EGFP kodierenden Leserahmen unter
der Kontrolle des FIG1-Promotors beinhalten.
-
Dazu
wurden 1000 bp 5'-seitig des offenen Leserahmens von FIG1 unter
Verwendung der Primer Fig1-for (Seq.-Nr. 1) und Fig1-rev (Seq.-Nr.
2) (siehe Tab. 1) PCR-amplifiziert, aufgereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen
SacI und SpeI geschnitten und in den S. cerevisiae Vektor p426 kloniert.
Der so entstandene Vektor (p426FIG1) wurde mit den Enzymen SalI
und EcoRI geschnitten.
-
Der
für EGFP kodierende Leserahmen wurde mittels der Primer
EGFPEcofor (Seq.-Nr 13) und EGFPSalrev (Seq.-Nr 14) PCR amplifiziert
und das 744 bp große Fragment mit den Enzymen SalI und
EcoRI geschnitten, aufgereinigt und zur Ligation in den Vektor p426FIG1
genutzt.
-
Tab.
4 Primer für die Amplifikation des offenen Leserahmens
von EGFP Die fett gedruckten Buchstaben grenzen den kodierenden
Leserahmen des EGFP-Gens ein. Kursiv sind die Erkennungssequenzen
der Restriktionsendonukleasen EcoRI bzw. SalI angegeben, welche
für die Klonierung in den Vektor p426FIG1 genutzt werden.
Die ersten sechs Basen dienen dem Schutz des Primers.
-
Die
DNA-Sequenz des klonierten Leserahmens wurde durch DNA-Sequenzanalyse
verifiziert. Damit stand der Vektor p426FIG1-EGFP für die
Transformation von Hefezellen zur Verfügung. Die Transformation des
fertigen Vektors in Hefezellen des Paarungstyps a erfolgte wie oben
für die Hefezellen des Paarungstyps α beschrieben.
-
Die
für den a-Faktor kodierenden Gene (MFA1 und MFA2) sind
deletiert, um sekundäre Effekte auf die α-Zellen
auszuschließen. Die Deletion erfolgte analog zu dem für
die Gene MFα1 und MFα2 beschriebenen Verfahren.
-
Erreicht
nach Induktion des spezifisch regulierten Promotors der dann gebildete
und sezernierte α-Faktor umliegende Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen
des Paarungstyps a, wird in diesen Zellen die Transkription des
für GFP kodierenden Leserahmens mittels des FIG1-Promotors
stark induziert. Dies resultiert in einer grünen Fluoreszenz
der Hefezellen, welche sensortechnisch ausgelesen wird. Die Intensität
der grünen Fluoreszenz kann proportional zur Zahl der die α-Zelle
umgebenden a-Zellen erhöht werden.
-
Ausführungsbeispiel 2: Zusätzliche
Signalverstärkung
-
Die
genetische Modifikation von Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen
des Paarungstyps α als Zellen des ersten Typs erfolgt wie
in Ausführungsbeispiel 1.
-
Als
Zellen des zweiten Typs sind Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen
des Paarungstyps a wie in Ausführungsbeispiel 1 verändert.
-
Als
Zellen des dritten Typs sind Zellen des Paarungstyps a dahingehend
modifiziert, dass sie als weiterer Verstärker wirken. Dazu
ist ein Leserahmen, welcher für das Pheromon α-Faktor
kodiert, unter die Kontrolle des FIG1-Promotors gesetzt.
-
Dazu
wurde der FIG1-Promotor PCR-amplifiziert und in den Hefevektor p426
kloniert wie unter Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Anschließend
wurde das Gen MFα1 in denselben Vektor 3'-seitig des FIG1-Promotors
inseriert.
-
Erreicht
der primär durch Wirkung eines Signalmoleküls
sezernierte α-Faktor die umliegenden a-Zellen (Zellen des
dritten Typs), kommt es in diesen Zellen durch die Induktion des
FIG1-Promotors zur Bildung weiterer α-Faktor-Moleküle,
d. h. zu einer weiteren Verstärkung (4).
Das Ausmaß der Verstärkung kann durch die Wahl
des Verhältnisses von Zellen des α- und a-Paarungstyps
festgelegt werden (1).
-
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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