DE102008030907B4

DE102008030907B4 - Einrichtung und Verfahren zur Detektion und Verstärkung eines Signals

Info

Publication number: DE102008030907B4
Application number: DE102008030907A
Authority: DE
Inventors: Kai Ostermann; Prof. Pompe Wolfgang; Prof. Rödel Gerhard; Annett Gross
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2012-07-26
Anticipated expiration: 2028-06-28
Also published as: DE102008030907A1; CN101743324B; EP2167680A1; WO2009000918A1; US20110189657A1; CN101743324A

Abstract

Verwendung einer Einrichtung, enthaltend a) Zellen eines ersten Typs, bei denen ein Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das Primärsignal reguliert wird, b) Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte Signalmolekül reguliert wird, so dass – durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls induziert wird und – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Einrichtung und eines Verfahren zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals unter Nutzung eines interzellulären Kommunikationssystems, zur Anwendung beim Nachweis von Substanzen wie z. B. Phosphor, Schwefel, Stickstoff, Hormonen, Stoffwechselintermediaten, Fermentationsprodukten, usw..
Bisherige Lösungen zur Signalverstärkung haben den Nachteil, dass Substanzen erst ab einer bestimmten Nachweisgrenze detektiert werden können.
Aus US 6555 325 B1 ist ein System zur Detektion einer funktionellen Interaktion zwischen einer Verbindung und dem Bestandteil einer zellulären Signaltransduktionskaskade bekannt. Die Erfindung stellt ein robustes reproduzierbares Testsystem zum Screening und zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen zur Verfügung, die die Aktivität eines zellulären Rezeptors modulieren bzw. mit diesem interagieren können. Im Speziellen sollen Substanzen identifiziert werden, die mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren interagieren, die pharmazeutisch eine große Rolle spielen. Das Hefe-Pheromonsystem wird dabei genutzt, weil es sich bei dem Hefe-Pheromonrezeptor ebenfalls um einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor handelt, der mit ektopisch exprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptorkomponenten heterologe Rezeptoren bilden kann. So können auch Substanzen identifiziert werden, die auf nicht-Hefe Rezeptoren wirken. Der Nachweis einer funktionellen Interaktion führt zur Sekretion eines Pheromons, das in Zellen des zweiten Paarungstyps, in denen ein Markergen unter die Kontrolle eines Pheromon-responsiven Promotors gestellt wurde, die Expression dieses Markergens anregt.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Einrichtung und ein Verfahren bereitzustellen und diese zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals zu verwenden, um so die Nachweisgrenze für das zu detektierende Primärsignal herabzusetzen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung einer Einrichtung zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals. Die erfindungsgemäß verwendete Einrichtung enthält:

a) Zellen eines ersten Typs, bei denen ein Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das Primärsignal reguliert wird, und
b) Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte Signalmolekül reguliert wird,

Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 2 sind zusätzlich

c) Zellen eines dritten Typs enthalten, bei denen ein Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Signalmolekül reguliert wird, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert wird,

– durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls durch die erste Zelle induziert wird,
– durch die Sekretion des Signalmoleküls durch die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion des Signalmoleküls induziert und eine Vorverstärkung des Primärsignals bewirkt wird, und
– das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.

Zellen besitzen zahlreiche Kommunikationssysteme, über die sie mit anderen Zellen Informationen austauschen können. Oft beruhen diese Kommunikationssysteme auf der Sezernierung eines Signalmoleküls durch eine Zelle in das umgebende Medium. Andere Zellen besitzen geeignete Rezeptorsysteme für diese Signalmoleküle und können diese wahrnehmen und dementsprechend auf diese reagieren.
Solche Kommunikationssysteme umfassen beispielsweise das Quorum sensing von Mikroorganismen, Ammoniakpulse in Hefezellen, Pheromonsysteme, z. B. bei der Paarung von Hefezellen, sezernierte Wachstumsfaktoren, die innerhalb von Zellverbänden zur Kommunikation zwischen Zellen verwendet werden, Virulenzfaktoren von Mikroorganismen, die spezifisch an eukaryotische Rezeptoren binden oder immunmodulierende und Zelldifferenzierungen beeinflussende Faktoren. Die bei diesen Kommunikationssystemen sezernierten Signalmoleküle sind in der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung und dem erfindungsgemäß verwendeten Verfahren einsetzbar.
Beim Quorum Sensing kommunizieren beispielsweise Mikroorganismen mittels kleiner hormonähnlicher Signalmoleküle. Dieser Prozess spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Zelldichte, was Bakterienpopulationen erlaubt, sich ähnlich wie mehrzellige Organismen zu verhalten und dadurch von Vorteilen zu profitieren. Zu den durch Quorum Sensing regulierten Verhaltensweisen gehören unter anderem die Produktion von Antibiotika, Symbiose, Konjugation, Virulenz, Bildung von Biofilmen sowie die Biolumineszenz einiger Vibrio-Spezies. Die als Autoinducer bezeichneten Signalmoleküle werden von bestimmten Bakterien mit Hilfe bestimmter Gene produziert und in das umliegende Kulturmedium abgegeben. Bakterien besitzen ein passendes Rezeptorsystem für diese Liganden und können nach Erreichen einer gewissen Konzentration an Signalmolekülen im Medium die Transkription bestimmter Gene aktivieren. Dabei gibt es speziesspezifische Autoinducer, mit denen Bakterien innerhalb der eigenen Bakterienspezies kommunizieren. Der sogenannte Autoinducer-2 hingegen ermöglicht die Kommunikation zwischen verschiedenen Bakterienspezies (Interspezies-Kommunikation).
Bei Hefen dienen periodisch produzierte Ammoniak-Pulse als Signal zwischen Kolonien. Dabei induziert ein Ammoniak-Puls die Ammoniak-Produktion benachbarter Kolonien. Dies wiederum beeinflusst die räumliche Verteilung von Kolonien, da jeder Ammoniak-Puls dazu führt, dass die Wachstumszone zwischen benachbarten Kolonien transient gehemmt wird. Somit wachsen die Kolonien präferentiell zu der entgegengesetzten Seite, auf der sich keine kompetierenden Kolonien befinden.
In der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung befinden sich die Zellen in einem flüssigen, vorzugsweise wässrigen Medium, über das der Austausch von Signalmolekülen zwischen den Zellen erfolgt. Die Zellen der Einrichtung liegen dabei entweder suspendiert in Lösung oder immobilisiert auf einem Träger vor. Die Suspension befindet sich ein einem geeigneten Behältnis, das die messtechnische Erfassung eines von den Zellen ausgesandten Signals gewährleistet. Der Träger ist ebenfalls so gestaltet, dass von den Zellen ausgesandte Signale durch ein Detektionssystem erfasst werden können.
Die Erfindung ist bei allen Zellen einsetzbar, die über einen Rezeptor für ein Primärsignal verfügen. Dabei ist es unerheblich, ob es sich um einen authentischen oder heterologen Rezeptor handelt. Gleiches gilt für die sich ggf. anschließende Signalkaskade sowie die Bildung der Signalmoleküle.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 3 bis 27 angegeben.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 3 sind die Zellen des ersten, zweiten und/oder dritten Typs Hefezellen, nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 4 sind die Hefezellen Saccharomyces cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe Zellen.
Das Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, ist unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, der durch ein Primärsignal reguliert wird. Als Promotor wird in der Genetik eine DNA-Sequenz bezeichnet, die die Expression eines Gens reguliert. Promotoren im Sinne der Erfindung sind bevorzugt diejenigen Bereiche der genomischen DNA, die spezifisch für die Regulation der Expression eines Gens verantwortlich sind, indem sie auf spezifische intra- oder extrazelluläre Signale reagieren und abhängig von diesen Signalen die Expression des unter ihrer Kontrolle liegenden Gens aktivieren oder reprimieren.
In Hefen befinden sich diese regulierenden DNA-Bereiche in der Regel auf der 5'-Seite des Startcodons des betreffenden Gens und haben eine durchschnittliche Länge von 309 bp (Mewes H. W. et al., (1997) Overview of the yeast genome. Nature 387, 7–65). Solche regulierenden Bereiche können aber auch weiter als 1000 bp entfernt von der kodierenden Sequenz oder auf der 3'-Seite der kodierenden Sequenz des betreffenden Gens oder sogar innerhalb der transkribierten Sequenz des betreffenden Gens liegen. Setzt man derartige Promotoren an die 5'-Seite des Startcodons eines beliebigen Gens, bevorzugt eines Pheromon-Gens, regulieren sie die Aktivität dieses Gens in Abhängigkeit von den oben genannten spezifischen Primärsignalen.
Bei den von den Hefen erkannten Primärsignalen handelt es sich entweder um Signale, für die die Hefezelle eigene Rezeptorsysteme besitzt. Dabei handelt es sich beispielsweise um Signale wie den Mangel bestimmter für die Hefezelle essentieller Nährstoffe wie z. B. Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Eisen oder Kupfer, Kohlenstoffquellen, essentieller Aminosäuren, Sauerstoff, oder andere Signale wie z. B. Temperatur, DNA-Schäden, ER-Stress oder oxidativer Stress.
Die Zelle des ersten Typs kann nach Weiterbildung des Patentanspruchs 5 aber auch dahingehend gentechnisch verändert sein, dass sie ein Rezeptorsystem exprimiert, das die Zelle natürlicherweise nicht besitzt. Die Primärsignale, die diese Rezeptorsysteme empfangen, sind chemischer Art, beispielsweise Ionen, anorganische und organische Verbindungen und Biomoleküle wie Proteine, Peptide, Lipide, Zucker oder Nukleinsäuren, oder auch physikalischer Art, beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Druck, Temperatur oder Leitfähigkeit
Beispielsweise ist die Expression solche Rezeptorsysteme in Hefezellen aus dem Stand der Technik bekannt. So können in Hefen zum Beispiel Sensorsysteme für menschliche Hormone wie Androgene (Bovee, T. F. H et al. (2008) A new highly androgen specific yeast biosensor, enabling optimisation of (Q)SAR model approaches. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology 108: 121–131), für Schwermetalle wie Cadmium (Park, J.-N. et al. (2007) Identification of the cadmium-inducible Hansenula polymorpha SEQ1 gene promoter by transcriptome analysis and its application to whole-cell heavy-metal detection systems. Applied and environmental microbiology 73: 5990–6000), für flüchtige Geruchsstoffe (Marrakchi, M. et al. (2007) A new concept of olfactory biosensor based on interdigitated microlelectrodes and immobilized yeasts expressing the human receptor OR17-40. European Biophysical Journal 36: 1015–1018) und sogar Sprengstoffe (Radhika, V. et al. (2007) Chemical sensing of DNT by engineered olfactory yeast strain. Nature Chemical Biology 3: 325–330) exprimiert werden.
Da die Zellen sich in einem flüssigen Medium befinden, müssen die zu verstärkenden Primärsignale ebenfalls entweder in diesem flüssigen Medium sein oder, wie im Fall von einigen physikalischen Parametern wie beispielsweise Temperatur, durch dieses Medium hindurch auf die Zellen der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung übertragen werden.
Erkennen die Zellen des ersten Typs mittels dieser endogenen oder rekombinanten Rezeptoren die eingehenden Primärsignale, wird direkt oder indirekt über zwischengeschaltete Signalkaskaden die Transkription des Signal-spezifischen Promotors induziert, so dass die Zellen des ersten Typs als Antwort auf das eingehende Primärsignal das Signalmolekül in die Umgebung sezernieren.
Die Zellen des zweiten Typs besitzen auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für das von den Zellen des ersten Typs sezernierte Signalmolekül, sowie eine für die intrazelluläre Weitergabe des Signals notwendige, ggf mittels molekularbiologischer Techniken modifizierte Signalkaskade. Die Zelle des zweiten Typs kann nach Weiterbildung des Patentanspruchs 6 auch dahingehend gentechnisch verändert sein, dass sie einen Rezeptor für ein Signalmolekül exprimiert, das die Zelle natürlicherweise nicht besitzt.
Die Zellen des zweiten Typs sind erfindungsgemäß genetisch so verändert, dass ein spezifisches Gen, das beispielsweise für ein Markerprotein, wie z. B. GFP (grün fluoreszierendes Protein) kodiert, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch das Signalmolekül, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert wird, reguliert wird.
Erreicht das von den Zellen des ersten Typs auf das spezifische Primärsignal hin sezernierte Signalmolekül die umliegenden Zellen des zweiten Typs, wird in diesen Zellen des zweiten Typs die Expression des spezifischen Gens und die Produktion des Markerproteins oder Zielproteins durch den Signalmolekül-regulierten Promotor stark induziert.
In einer anderen Ausgestaltungsform der Erfindung ist das spezifische Gen selbst wieder für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig, das von der Zelle des zweiten Typs sezerniert wird. Dadurch wird vorteilhaft ermöglicht, mehrere erfindungsgemäß verwendete Einrichtungen in Form einer Kaskade von Verstärkern zusammenzuschalten. Das von den Zellen des zweiten Typs sezernierte Signalmolekül wird von einer zweiten erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung als Primärsignal detektiert und dadurch weiter verstärkt. Diese Kaskade kann durch den Einsatz von verschiedenartigen Signalmolekülen beliebig verlängert werden. Am Ende der Kaskade steht typischerweise eine Zelle, die ein Signalmolekül-reguliertes spezifisches Gen besitzt, das für ein Markerprotein, wie z. B. GFP (grün fluoreszierendes Protein) kodiert, wodurch das mehrfach verstärkte Primärsignal dann durch ein geeignetes Detektionssystem erfasst werden kann.
Hefezellen können sowohl im diploiden Zustand als auch im haploiden Zustand vorliegen. Zwei haploide Hefezellen können in einem Vorgang, der als Paarung bezeichnet wird, zu einer einzigen diploiden Hefezelle verschmelzen. Bei haploiden Hefezellen unterscheidet man dabei zwei so genannte Paarungstypen. Nur Hefezellen mit unterschiedlichem Paarungstyp können miteinander paaren. Beispielsweise sind dies bei der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae die Paarungstypen α und a, bei der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe die Paarungstypen Plus und Minus.
Haploide Hefezellen kommunizieren über so genannte Pheromone. Dies sind kurze Peptide, die die jeweiligen Zellen bilden, um ihrer Umgebung den eigenen Paarungstyp mitzuteilen.
So sezernieren Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α beispielsweise das Pheromon α-Faktor und Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps a das Pheromon a-Faktor.
Erfindungsgemäß sind Zellen des ersten Typs genetisch so verändert, dass ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch das nachzuweisende Primärsignal reguliert wird. Dabei kodiert das Gen entweder selbst für das Signalmolekül oder ein Protein, das die Synthese des Signalmoleküls in der Zelle und/oder seine Sezernierung bewirkt. Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 7 ist dieses Signalmolekül bevorzugt ein Pheromon.
Pheromone im erfindungsgemäßen Sinn sind außer den in Hefezellen vorkommenden natürlichen Pheromonen auch homologe oder modifizierte Peptide oder Peptidanaloga, oder andere organische Verbindungen, die in der Lage sind, an die Pheromon-Rezeptoren von Hefezellen zu binden und zu aktivieren.
Das Gen, das für das Pheromon kodiert, kann entweder ein natürliches, in dem Genom eines Organismus enthaltenes Gen sein, oder eine synthetische Gensequenz, deren Expression zur Produktion eines Pheromons oder eines zu einem Pheromon homologen Peptids, das in der Lage ist, die Pheromonrezeptoren von Hefezellen zu aktivieren.
In einer bevorzugten Ausgestaltung besteht die Erfindung also aus der Verwendung einer Einrichtung zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals mit

a) haploiden Zellen eines ersten Typs, bei denen ein für ein Pheromon kodierendes Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Primärsignal reguliert wird, und
b) haploiden Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte Pheromon reguliert wird, enthält,

Die Zellen des ersten Typs sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 8 Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps oder diploide Saccharomyces cerevisiae-Zellen.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 9 sind die Zellen des zweiten Typs Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps.
Die Zellen des dritten Typs sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 10 Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps.
Die Hefezellen besitzen auf ihren Oberflächen Rezeptoren für die Pheromone des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps. So sind beispielsweise Saccharomyces cerevisiae-Zellen des Paarungstyps a in der Lage, Saccharomyces cerevisiae-Zellen des Paarungstyps α in ihrer Umgebung wahrzunehmen und umgekehrt.
Das Gen, welches in den Zellen des ersten und/oder dritten Typs für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 11 das MFα1- oder MFα2-Gen von Saccharomyces cerevisiae, welche jeweils für das Pheromon α-Faktor kodieren, oder das MFA1-Gen, oder das MFA2-Gen von Saccharomyces cerevisiae, welche für das Pheromon a-Faktor kodieren.
Der Promotor, der durch das als Signalmolekül eingesetzte Pheromon reguliert wird, ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 12 der FIG1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae.
Die Transkription des FIG1-Gens wird nach Inkubation haploider Hefezellen mit Pheromonen des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps um das bis zu 97-fache erhöht (Roberts, C. J., et al. (2000) Signaling and circuitry of multiple MAPK pathways revealed by a matrix of global gene expression profiles. Science 287: 873–880). Es wurde ursprünglich in einem Hefe „Two-Hybrid Screen” zur Identifikation von Pheromon-regulierten Genen identifiziert (Erdman, S., et al. (1998) Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology 140: 461–483). Der Name FIG1 bedeutet „factor induced gene 1”. Es handelt sich um ein integrales Membranprotein, welches direkt oder indirekt an der Ca2⁺-Aufnahme in die Zelle beteiligt ist (Muller, E. M. et al. (2003) Fig1p facilitates Ca2+ influx and cell fusion during mating of Saccharomyces cerevisiae Journal of Biological Chemistry 278: 38461–38469). Nach Zugabe von α-Faktor zu a-Zellen ist in diesen eine deutliche Zunahme des Proteins nach 60 Minuten nachweisbar (Roberts et al., 2000). Auf Transkriptionsebene wird eine Erhöhung der mRNA Konzentration um mehr als das 97-fache bereits 20 Minuten nach Zugabe des jeweils entgegengesetzten Pheromons zu den Hefezellen beobachtet (Roberts et al., 2000). Der Promotor des FIG1-Gens ist daher vorteilhaft durch Pheromone des jeweils entgegengesetzten Paarungstyps hochgradig regulierbar. Somit ist die Einwirkung von Pheromonen schnell und sensitiv nachweisbar.
Bevorzugt wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1000 bp 5'-seitig des Startcodons des FIG1-Gens umfasst, oder ein Teilabschnitt dieses DNA-Abschnitts, der in der Lage ist, auf die Anwesenheit eines Pheromons hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende spezifische Gen zu aktivieren oder zu unterdrücken.
Besonders bevorzugt verwendet wird der DNA-Abschnitt, den man durch PCR-Amplifikation des Saccharomyces-Genoms unter Verwendung der Primer Fig1-for (Seq.-Nr. 1) und Fig1-rev (Seq.-Nr. 2) (siehe Tab. 1) erhält.
Tab. 1 Primer zur Amplifikation des FIG1-Promotors
Die fett gedruckten Buchstaben grenzen den genutzten Promotorbereich des FIG1-Gens ein. Kursiv sind die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen SacI bzw. SpeI angegeben, welche für die Klonierung genutzt werden. Die ersten sechs Basen dienen dem Schutz des Primers.
Promotoren im Sinne der Erfindung sind auch DNA-Abschnitte, die zu den entsprechenden Hefe-Promotoren eine Homologie von mehr als 50%, bevorzugt mehr als 80%, aufweisen. Diese Abschnitte können beispielsweise aus homologen genomischen Bereichen von anderen Organismen, bevorzugt anderen Hefestämmen, stammen. Sie können jedoch auch synthetisch hergestellte DNA-Sequenzen sein, deren Sequenz eine Homologie von mehr als 50%, bevorzugt mehr als 80%, Übereinstimmung mit dem entsprechenden Saccharomyces cerevisiae Promotor aufweist. Promotoren können auch synthetische DNA-Sequenzen sein, die aus einem Teilbereich eines der oben genannten Hefe-Promotoren sowie einem bekannten Basalpromotor aus Saccharomyces cerevisiae zusammengesetzt sind.
Der Basalpromotor stellt die für die Anbindung der Transkriptionsmaschinerie notwendigen DNA-Sequenzen zur Verfügung, während die Teilsequenzen aus den Hefepromotoren spezifisch auf regulierende Signale reagieren. Ein solcher Basalpromotor ist bevorzugt der Basalpromotor des Cytochrom c-Gens aus Saccharomyces cerevisiae, der 300 bp 5'seitig des Startcodons des Cytochrom c-Gens umfasst (Chen, J. et al. (1994) Binding of TFIID to the yeast CYC1 TATA boxes in yeast occurs independently of upstream activating sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11909–11913).
Promotoren aus synthetischen DNA-Sequenzen können auch mehrfache Abschnitte einer identischen DNA-Sequenz enthalten. Diese Vervielfachung eines regulatorischen DNA-Abschnitts erlaubt vorteilhaft eine Erhöhung der Sensitivität des Promotors gegenüber den zu detektierenden Signalen.
Im Prozess der Paarung von Hefezellen induziert der Transkriptionsfaktor Ste12p die Expression von Pheromon-responsiven Genen durch Bindung von Ste12p an sogenannte ”pheromon response elements” (PREs) in der Promotorregion induzierbarer Gene (Dolan et al., (1989). The yeast STE12 protein binds to the DNA sequence mediating pheromone induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5703–5707.). Hagen et al. zeigten, dass tandemartig angeordnete PREs ausreichend sind, um die Pheromon-responsive Expression von haploid-spezifischen Genen in beiden Paarungstypen zu aktivieren (Hagen et al. (1991). Pheromone response elements are necessary and sufficient for basal and pheromone-induced transcription of the FUS1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 11: 2952–2961). PREs sind 7 bp lange Elemente mit der Konsensus-Sequenz TGAAACA (Kronstad et al., (1987). A yeast operator overlaps an upstream activation site. Cell 50: 369–377.).
Im FIG1 Promotor wurden drei putative Bindestellen für Ste12p identifiziert (Harbison et al., (2004). Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature 431: 99–104.).
Die Ansprechzeit des FIG1-Promotors kann durch eine höhere Anzahl an PREs verkürzt werden. Beispielsweise kann zusätzlich oder stellvertretend zum authentischen Aktivatorbereich des Gens ein 139 bp langes Fragment mit den PREs der regulatorischen Region von FUS1 oder ein einfaches synthetisches Cluster aus PREs genutzt werden (Hagen et al. 1991). So wird vorteilhaft mit einem Reporterkonstrukt aus dem modifizierten FIG1-Promotor und einem EGFP-Marker eine höhere Expression des Markergens und bessere Ansprechbarkeit auf geringere Pheromonkonzentrationen erzielt. Ebenfalls wird eine zeitlich schnellere Ansprechbarkeit des Systems erreicht.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 13 wird in den Zellen des zweiten Typs der Transkriptionsaktivator Ste12p überexprimiert. Die Überexpression von STE12 führt zu einer verstärkten Expression Pheromon-responsiver Gene, vermittelt durch PREs (Dolan und Fields, (1990). Overproduction of the yeast STE12 protein leads to constitutive transcriptional induction. Genes Dev. 4: 492–502.). Vorteilhaft wird durch die Überexpression des Transkriptionsaktivators Ste12p auch das Expressionslevel des spezifischen Gens unter der Kontrolle des Pheromon-abhängigen Promotors erhöht.
Um an einzelne PREs zu binden, benötigt Ste12p teilweise weitere Transkriptionsaktivatoren wie den Faktor Mcm1p (Hwang-Shum et al., Jr (1991). Relative contributions of MCM1 and STE12 to transcriptional activation of a- and α-specific genes from Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 227: 197–204.). Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 14 wird daher in den Zellen des zweiten Typs Mcm1p überexprimiert. Die heterologe Expression dieses Faktors trägt ebenfalls zur Erhöhung der Expression des unter der Kontrolle des Pheromon-abhängigen Promotors stehenden spezifischen Gens bei.
Das spezifische Gen vermittelt nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 15 die Bildung eines Signalmoleküls, das von dem von den Zellen des ersten Typs sezernierten Signalmolekül verschieden ist. Dadurch können vorteilhaft mehrere erfindungsgemäß verwendete Einrichtungen als Kaskade hintereinander geschaltet werden.
Das spezifische Gen kodiert nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 16 für ein Markerprotein, bevorzugt ein fluoreszierendes Protein wie GFP (grün fluoreszierendes Protein) oder ein Enzym wie β-Galaktosidase.
Mittels eines Nachweissystems für das Markerprotein, z. B. GFP, kann die Signal-induzierte Bildung des Markerproteins sensortechnisch erfasst werden (Detektion).
Markerproteine im Sinne der Erfindung sind Proteine, deren Vorhandensein bzw. Aktivität zu einer physikalisch messbaren Änderung führt. Diese physikalisch messbare Änderung kann durch ein geeignetes Nachweissystem einfach und/oder schnell detektiert werden. Bevorzugt werden solche Markerproteine verwendet, die nachgewiesen werden können, ohne die Integrität bzw. Vitalität der Zellen zu beeinträchtigen, wie z. B. Enzyme, die in Anwesenheit eines Substrats eine Farbreaktion katalysieren, wie β-Galaktosidase oder Phytase. Weiter bevorzugt werden als Markerprotein Luciferasen, die in Anwesenheit eines geeigneten Substrats Licht aussenden. Besonders bevorzugt werden als Markerproteine Proteine, die durch Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge fluoreszieren.
Weiterhin umfasst die Erfindung als Markerproteine Proteasen, die fluoreszierende Proteine abbauen. Exprimiert die Hefezelle gleichzeitig konstitutiv ein fluoreszierendes Protein, wird auf das Primärsignal hin die Abnahme der Fluoreszenz des Zellen des zweiten Typs messbar. Bevorzugt verwendet werden Proteasen, die außer dem fluoreszierenden Protein keine weiteren Ziele in der Zelle angreifen, um die Vitalität der Zelle nicht zu beeinträchtigen. Besonders bevorzugt verwendet wird die TEV-Protease. Die entsprechenden fluoreszierenden Proteine müssen ggf. mittels rekombinanter DNA-Techniken so verändert werden, dass sie die Erkennungssequenz für die entsprechende Protease enthalten und so abbaubar sind.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 17 ist das Markerprotein ein fluoreszierendes Protein, wobei die Expression des entsprechenden Markerproteins nach Sezernierung des Signalmoleküls durch die Zellen des ersten Typs variiert, was zu einer Zu- oder Abnahme der Fluoreszenz der jeweiligen Hefezelle führt. Bevorzugt verwendet werden die fluoreszierende Proteine GFP, YFP, CFP, BFP, RFP, DsRed, PhiYFP, JRed, emGFP („Emerald Green”), Azami-Green, Zs-Green oder AmCyan 1. Bevorzugt verwendet werden Proteine, die so verändert wurden, dass sie besonders stark fluoreszieren wie eGFP, eYFP, TagCFP, TagGFP, TagYFP, TagRFP und TagFP365. Weiterhin werden bevorzugt solche fluoreszierenden Proteine verwendet, deren Aminosäuresequenz dahingehend verändert wurde, dass sie möglichst schnell nach ihrer Bildung beginnen zu fluoreszieren. Bevorzugt verwendet werden ebenfalls TurboGFP, TurboYFP, TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, und dsRed-Express.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 18 kodiert das spezifische Gen für ein grün, (z. B. GFP), gelb (z. B. YFP), blau (z. B. BFP), cyan (z. B. CFP) oder rot (z. B. dsRed) fluoreszierendes Protein als Markerprotein.
Für ein möglichst zeitnahes Monitoring kann es vorteilhaft sein, die entsprechenden Markerproteine durch das Anfügen von Sequenzen, die zu einem erhöhten „Turn-over” der Proteine führen, zu destabilisieren. Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 19 ist das Markerprotein ein fluoreszierendes Protein mit eingeschränkter Halbwertszeit. Dadurch wird eine rasche Ansprechzeit bei einer Abnahme der Transkription gewährleistet.
Eine solche eingeschränkte Halbwertszeit kann zum Beispiel durch die Veränderung der N-terminalen Aminosäure oder das Einbringen einer Signalsequenz in die Aminosäuresequenz des vom Markergen kodierten Proteins erreicht werden, wodurch die Stabilität des Proteins gesenkt und seine Halbwertszeit verkürzt wird. Bevorzugt verwendet wird für die Destabilisierung des vom Markergen kodierten Proteins eine sogenannte PEST-Domäne, die zu einem raschen Abbau des Proteins durch das Ubiquitin-System der Zelle führt. Solche PEST-Domänen sind aus vielen Proteinen bekannt. Bevorzugt verwendet wird die PEST-Domäne des G1 Cyclins Cln2p aus Saccharomyces cerevisiae. Hierfür wird an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz des Markergens die kodierende Sequenz (Seq.-Nr. 3) der 178 carboxyterminalen Aminosäuren von Cln2p (Seq.-Nr. 4) und ein Stoppcodon angefügt.
Cln2p-Pest-Sequenz (Seq.-Nr. 3/4):
Das unter die Kontrolle eines für ein Signalmolekül spezifischen Promotors gestellte Gen, das für ein Markerprotein kodiert oder für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig ist, wird in eine Zelle, bevorzugt eine Hefezelle eingebracht. Dabei kann es in der Hefezelle auf einem extrachromosomalen DNA-Molekül vorliegen. Bevorzugt verwendet wird dazu ein Hefe-Expressionsvektor, der bei der Teilung der Hefezelle stabil repliziert wird. Besonders bevorzugt ist ein sogenannter „high copy number” Vektor, der in der Hefezelle in einer großen Anzahl an Kopien vorliegt. Alternativ werden auch Vektoren genutzt, die in geringerer Kopienzahl oder als einzelner Vektor in Hefen vorliegen, z. B. ARS-CEN-Vektoren, oder künstliche Hefechromosomen (yeast artificial chromosomes) verwendet.
In einer anderen Ausführungsform wird das Gen zusammen mit dem Pheromon-spezifischen Promotor in die chromosomale DNA der Hefezelle integriert. Dadurch wird vorteilhaft sichergestellt, dass alle Nachkommen der Hefezelle ebenfalls das Markergen unter Kontrolle des spezifischen Promotors enthalten.
Die erfindungsgemäß verwendete Detektions- und Verstärkungseinrichtung hat den Vorteil, dass ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal durch die dadurch induzierte Sekretion des Signalmoleküls und dessen Wirkung auf die umliegenden responsiven Zellen des zweiten Typs um ein Vielfaches verstärkt werden kann.
Dabei kann durch die gezielte Beeinflussung der Zahlenverhältnisse der verschiedenen Zelltypen der verstärkende Effekt weiter gesteigert werden. Bei einer regellosen Verteilung der Zellen als Zellgemisch liegen dabei die Zellen des ersten Typs gegenüber den Zellen des zweiten Typs in einem Verhältnis 1 zu 20, bevorzugt 1 zu 10, besonders bevorzugt 1 zu 5 vor. In Kompositgefügen mit einer zweckmäßigen strukturierten Verteilung der einzelnen Zelltypen in granularen oder schichtförmigen Phasen ist das optimale Konzentrationsverhältnis zusätzlich eine Funktion der gewählten räumlichen Anordnung der Zellen zueinander.
Zudem haben Verstärker- und Sensorsysteme, die auf lebenden Zellen beruhen, den großen Vorteil der natürlichen Regeneration der genutzten Komponenten. Dies ist insbesondere bei Verfahren des „On-Line Monitoring” oder auch „Near-Line Monitoring” von Prozessen hilfreich.
Die erfindungsgemäß verwendete biologische Detektions- und Verstärkungseinrichtung kann beispielsweise genutzt werden, um

– die Limitierung von Stoffen wie z. B. Phosphat, Schwefel, Stickstoff oder einer Kohlenstoffquelle wie z. B. Glucose in Kulturmedien frühzeitig zu detektieren,
– eine Belastung von Zellen durch Stressoren wie z. B. Strahlung oder chemische Agenzien effektiver nachzuweisen,
– das Auftreten von Zielmolekülen wie beispielsweise bestimmte Stoffwechselintermediate frühzeitig zu detektieren,
– Bioassays zum Nachweis von Substanzen in wässrigen Lösungen effektiver zu gestalten.

In den Hefezellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Paarungstyps ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 20 die authentische Regulation der Expression von Pheromonen ausgeschaltet. Beispielsweise sind die natürlichen Gene MFα1 und MFα2 in α-Zellen von Saccharomyces cerevisiae-Zellen nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 21 deletiert. Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 22 sind die natürlichen Gene MFA1 und MFA2 in Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps deletiert. Damit wird vorteilhaft sichergestellt, dass der α-Faktor bzw. der a-Faktor ausschließlich dann gebildet und sezerniert wird, wenn das zu detektierende Primärsignal vorhanden ist. Sekundäre Effekte auf die Zellen des zweiten Typs werden dadurch ausgeschlossen.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 23 ist in den Hefezellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Paarungstyps das Protein Fig1p inaktiviert. Hohe lokale Konzentrationen an Pheromonen lösen bei Hefezellen Zelltod aus. Durch die Inaktivierung des Fig1p wird dieser Effekt verhindert (Zhang, N.-N., et al. (2006) Multiple signaling pathways regulate yeast cell death during response to mating pheromones. Mol. Biol. Cell 17: 3409–3422). Dadurch wird vorteilhaft verhindert, dass die Hefezellen durch eine hohe Konzentration an Pheromon, die durch ein starkes Primärsignal verursacht wird, absterben und damit für das Verfahren nicht mehr zur Verfügung stehen (Zhang et al., 2006).
Der durch ein Primärsignal regulierbare Promotor ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 24 ein Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefel-spezifisch regulierter Promotor. Das zu verstärkende Primärsignal ist Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefelmangel.
Bevorzugt wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1000 bp 5'-seitig des Startcodons des von ihm kontrollierten Gens umfasst, oder ein Teilabschnitt dieses DNA-Abschnitts, der in der Lage ist, z. B. auf die Limitierung von Stickstoff, Phosphor oder Schwefel hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende Markergen zu aktivieren oder zu unterdrücken.
Der Stickstoff-, Phosphat- bzw. Schwefel-spezifisch regulierte Promotor ist nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 25 ausgewählt aus den Promotoren der Gene YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W und YLL057C von Saccharomyces cerevisiae.
Promotoren von Genen, deren Transkription als Antwort auf eine entsprechende Limitierung stark erhöht ist, sind vorteilhafterweise bei einer

– Stickstoff-Limitierung: YIR028W und YJR152W,
– Phosphat-Limitierung: YAR071W und YHR136C
– Schwefel-Limitierung: YFL055W und YLL057C.

Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 26 befinden sich die Zellen in einem porösen organischen oder anorganischen Gel, nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 27 in einem porösen und optisch transparenten Siliziumdioxid-Xerogel.
Vorteilhaft sind die Zellen in Xerogelen immobilisiert. Xerogele sind Gele, die ihre Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfen oder Absaugen verloren haben. Gele sind formbeständige, leicht deformierbare disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten, die zumeist aus einem festen Stoff mit langen oder stark verzweigten Teilchen (z. B. Kieselsäure, Gelatine, Kollagene, Polysaccharide, Pektine, spezielle Polymere, wie z. B. Polyacrylate, und andere, oft als Verdickungsmittel bezeichnete Geliermittel) und einer Flüssigkeit (meist Wasser) als Dispersionsmittel bestehen. Dabei bildet die feste Substanz im Dispersionsmittel ein räumliches Netzwerk. Bei der Entstehung von Xerogelen verändert sich die räumliche Anordnung des Netzes.
Die vorteilhafte Verwendung von anorganischen oder biologisch inerten organischen Xerogelen zur Einbettung der Zellen erlaubt vorteilhaft das Überleben der Zellen bei gleichzeitiger Stabilität der erzeugten Strukturen, denn sie sind toxikologisch und biologisch inert und werden im Allgemeinen nicht durch die Zellen abgebaut. Sie ermöglichen weiterhin vorteilhaft die Einlagerung von Nährstoffen und Feuchthaltemitteln, die das Überleben der Zellen sichern.
Die Zellen sind vorteilhaft in einem porösen und optisch transparenten anorganischen oder biologisch inerten organischen Xerogel immobilisiert. Dieses Xerogel ist bevorzugt ein anorganisches Xerogel aus Siliziumdioxid, alkyliertem Siliziumdioxid, Titandioxid, Aluminiumoxid oder deren Gemischen. Bevorzugt wird das anorganische Xerogel vorzugsweise durch einen Sol-Gel-Prozess hergestellt.
Dazu werden zunächst Silica- oder andere anorganische Nanosole entweder durch säure- oder alkalikatalysierte Hydrolyse der entsprechenden Silizium- oder Metallalkoxide in Wasser oder einem wasserlöslichem organischem Lösungsmittel (wie Ethanol) hergestellt. Bevorzugt wird die Hydrolyse in Wasser durchgeführt, um toxische Effekte des Lösungsmittels auf die einzubettenden Zellen zu verhindern. Bei der Herstellung von Nanosolen durch Alkoxidhydrolyse entstehen im Zuge der Reaktion Alkohole, die anschließend aus dem erhaltenen Nanosol durch Durchleitung eines inerten Gasstroms verdampft und durch Wasser ersetzt werden.
Durch die Verwendung von Gemischen verschiedener Alkoxide können die Matrixeigenschaften gezielt beeinflusst werden. Die Sol-Gel-Matrix erlaubt vorteilhaft die chemische Modifizierung durch Co-Hydrolyse und Co-Kondensation unter Verwendung verschiedener Metalloxide von Metallen wie Al, Ti, Zr zur Herstellung von gemischten Oxiden oder von Alkoxysilanen mit organischen Resten am Si-Atom zur Herstellung von organisch modifizierten Siliziumoxid-Gelen.
Die einzubettenden Zellen werden mit dem entstandenen Nanosol gemischt. Der Prozess der Gelbildung wird bevorzugt eingeleitet durch Erhöhung der Temperatur, Neutralisierung des pH-Werts, Aufkonzentrierung oder die Zugabe von Katalysatoren wie beispielsweise Fluoriden. Dabei sollte die Temperatur jedoch nicht auf Temperaturen > 42°C erhöht werden, um die einzubettenden Zellen nicht zu schädigen. Bei der Überführung in ein Gel verringern die Nanosole ihr Oberflächen/Volumenverhältnis durch Aggregation und dreidimensionale Quervernetzungen. Während dieser Umwandlung des Nanosols in ein sogenanntes Lyogel werden die Zellen in dem entstehenden anorganischen Netzwerk immobilisiert. Die Immobilisierung überlebensfähiger Zellen wird vorteilhaft durch das Verhältnis Zellen: Oxid und durch die Zugabe von Poren-formenden Agentien gesteuert.
Der Anteil von Zellen an der Gesamtmenge des erzeugten Xerogels einschließlich der eingebetteten Zellen kann je nach Anwendung von 0,1 bis 50% Gewichtsprozent betragen. Bevorzugt verwendet wird ein Anteil von 2 bis 25% Gewichtsprozent.
Durch Trocknung wird dem Lyogel das noch enthaltene Lösungsmittel entzogen. Dadurch bildet sich aus dem Lyogel das Xerogel. Das entstehende Xerogel weist eine hohe Porosität auf, die einen raschen Stoffaustausch mit dem umgebenden Medium erlaubt. Der Trocknungsprozess hat eine starke Schrumpfung des Gels zur Folge, der zu Stress für die eingebetteten Zellen führt. Bevorzugt wird der Trocknungsschritt daher sehr schonend und langsam bei Temperaturen von weniger als 40°C durchgeführt.
Mit sinkendem Wassergehalt der Matrix verringern sich die physiologische Aktivität und die Überlebensrate der eingebetteten Zellen. Ein zu hoher Wassergehalt führt jedoch zu niedriger mechanischer Stabilität und verringert die Haltbarkeit der Struktur.
Die Verwendung von Hefezellen ist besonders vorteilhaft, da Hefezellen eine hohe Resistenz gegen Trockenheit besitzen und auch bei sehr geringem Wassergehalt ihre Überlebensfähigkeit nicht einbüßen. Dadurch wird es möglich, sehr trockene Xerogele herzustellen.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung verschiedener Additive wie lösliche organische Salze, d. h. Metallsalze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren bzw. offenkettige oder cyclische Ammoniumsalze und Quartärsalze von N-Heterocyclen sowie niedermolekulare Polyanionen oder Polykationen, oder wasserlösliche organische Verbindungen wie Polycarbonsäuren, Harnstoff-Derivate, Kohlenhydrate, Polyole, wie Glycerin, Polyethylenglycol und Polyvinylalkohol, oder Gelatine, die als Weichmacher, Feuchthaltemittel und Porenbildner wirken, die Zelllyse hemmen und die Überlebensfähigkeit der eingebetteten Zellen beträchtlich verlängern.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 28 befindet sich das Siliziumdioxid-Xerogel mit den Zellen auf einem Substrat mit erhöhter mechanischer Stabilität. Das anorganische Xerogel ist dazu mit den Zellen auf einem Substrat aufgebracht. In Verbindung mit dem Signaldetektor, vorzugsweise einem Fotodetektor, ist damit ein Funktionselement vorhanden, wobei das in Abhängigkeit vom bioverfügbaren Analyten erzeugte Fluoreszenzlicht über den Fotodetektor in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. In Fortführung ist das Substrat vorteilhafterweise nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 29 eine Lichtleitfaser, Glasbeads, ein planarer Glasträger oder andere Formkörper aus Glas wie Hohlkugeln, Stäbe, Röhren oder keramische Granulate.
Dabei werden die Zellen in einem porösen und optisch transparenten anorganischen Xerogel, z. B. einem Siliziumdioxid-Xerogel, fixiert. Das mit den Mikroorganismen versetzte Siliziumdioxid-Xerogel wird als Schicht auf Glasbeads, einer Lichtleitfaser, planaren Glasträgern oder anderen Formkörpern wie Hohlkugeln, Stäben, Röhren oder keramischen Granulaten mittels eines bekannten Sol-Gel-Prozesses abgeschieden, indem das Nanosol-Zell-Gemisch auf das zu beschichtende Substrat aufgebracht oder das Substrat in das Nanosol-Zell-Gemisch eingetaucht wird und das Nanosol anschließend durch Trocknung und die dadurch resultierende Aufkonzentrierung des Nanosols in ein Xerogel überführt wird. Die dadurch vorhandene mechanische Stabilität dieser Strukturen erlaubt das Einbringen der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung in ein Messsystem, das unmittelbar mit dem zu untersuchenden Reaktionsraum (Fermenter) im Sinn einer near-line-Diagnostik verbunden werden kann.
Die Zellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 30 ein Bestandteil einer einen Hohlraum wenigstens teilweise umschließenden Hüllenstruktur. Das heißt, dass einzelne oder mehrere Zellen in diesem Hohlraum, der eine poröse Hülle hat, eingekapselt werden. Die Mikroporosität erlaubt vorteilhaft einen Stoffaustausch mit der Umgebung. In Fortführung besteht die Hüllenstruktur nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 31 vorteilhafterweise aus einem Grundkörper mit einer inneren Schicht aus einem biologischen Hydrogel und einer äußeren Schicht aus dem porösen und optisch transparenten Siliziumdioxid-Xerogel, wobei die Schichten wenigstens bereichsweise aufgebracht sind.
Die Zellen sind dabei in der Hüllenstruktur eingebettet (Duplex-Einbettung). Die innere Hülle besteht aus einem biologischen Hydrogel, beispielsweise Alginat, und die äußere Hülle ist eine poröse Xerogel-Schicht, bevorzugt eine anorganische Xerogel-Schicht, besonders bevorzugt eine Siliziumdioxid-Xerogel-Schicht. Das biologische Hydrogel stabilisiert vorteilhaft die Zellen bei dem nachträglichen Prozess der Beschichtung mit dem Siliziumdioxid-Sol und erhöht somit die Überlebenswahrscheinlichkeit der Zellen. Diese Duplex-Einbettung kann vorteilhafterweise mittels einer sequentiellen Beschichtung unter Nutzung eines Nanoplotters erfolgen. Die mechanische Stabilität solcher Strukturen erlaubt das Einbringen der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung in den zu untersuchenden Reaktionsraum (Fermenter) im Sinn einer near-line-Diagnostik.
Die Zellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 31 in ein Gefüge mit einer hierarchischen Porenstruktur eingebettet, so dass neben der für anorganische Gele typischen Nanoporosität das Gefüge zusätzlich von miteinander verbundenen Mesoporen durchzogen wird, deren Durchmesser typischerweise zwischen 100 nm bis 100 μm variiert und die einen Stoffaustausch zwischen der Umgebung und den eingebetteten Zellen sowie deren Reaktionsprodukte wie den Enzymen ermöglichen.
Dadurch können vorteilhaft die Zellen des ersten Typs und die Zellen des zweiten Typs sowie ggf. Zellen des drittens Typs in verschiedenen Schichten auf das Substrat aufgebracht werden. Durch die Nanoporosität können sowohl die spezifischen Primärsignale an die Zellen des ersten Typs gelangen, die sich in der äußeren Schicht des Sensors befinden, als auch die von diesen Zellen sezernierten Pheromone an die Zellen des zweiten und/oder dritten Typs gelangen, die sich in der darunter befindlichen Schicht befinden, die direkten Kontakt zum Signaldetektor hat.
Hinsichtlich der räumlichen Anordnung der drei Hefezelltypen in Schichten gibt es drei grundsätzliche Optionen der Verteilung der Zellen in einem Zellgemisch, in einem Kompositgefüge, das aus verschiedenen Gefügebausteine mit unterschiedlichen Zellverteilungen besteht, oder als ein gradiertes Schichtsystem mit einer tiefenabhängigen kontinuierlichen Änderung der Konzentrationsverteilung der drei Zelltypen.
I. Zellgemisch
Zellen vom Typ 1 und Typ 2 sowie gegebenenfalls Typ 3 werden in einem vorbedachten Mengenverhältnis zum Einstellen des angestrebten Verstärkungsgrades in einer festen Matrix immobilisiert oder alternativ in eine wässrigen Lösung in einer statistisch regellosen Verteilung eingebracht.
Vorteile dieser Zellgemische bestehen in den kurzen Transportwegen zum Austausch der Signalmoleküle zwischen den einzelnen Zellen sowie der statistischen Homogenität des Sensormaterials. Ein Nachteil kann sich aus der nur begrenzten Zugänglichkeit der Typ 1-Zellen (die in der Tiefe des Sensormaterials angeordnet sind) für das externe Primärsignal ergeben.
Mit den im Zellgemisch realisierten Konzentrationsverhältnissen der drei Zelltypen kann der Verstärkungsgrad in gewünschter Weise eingestellt werden.
II. Kompositgefüge
Das Kompositgefüge kann wahlweise aus Granulaten oder Einzelschichten aufgebaut werden. (zu den Einzelschichten siehe auch 3)
In den Granulaten sind ein oder zwei Zelltypen jeweils immobilisiert. Durch eine geeignete Anordnung der Granulate zueinander sowie ein geeignet gewähltes Mischungsverhältnis der Zellen in den Granulaten sowie der Granulate zueinander kann der Verstärkungsgrad eingestellt werden: Vorteilhafterweise wird der Anteil von Granulaten mit dem Zelltyp 1 im Außenbereich des Kompositgefüges für einen effektiven Empfang des externen Primärsignals erhöht. Die Granulate mit den Zelltypen 1 und 3 dienen einer Vorverstärkung des externen Primärsignals. Granulate mit den Zelltypen 1 und 2 oder 3 und 2 dienen der Endverstärkung und Wandlung in das auszulesende physikalische, chemische oder biochemische Signal.
Ein analoges Vorgehen ist bei der Anordnung der drei Zelltypen in Schichtsystemen vorgesehen. In einzelnen Schicht werden hierbei wiederum ein oder zwei Zelltypen eingebettet. Schichten mit dem Zelltyp 1 werden vorteilhafterweise wiederum im Außenbereich des Kompositgefüges angeordnet, um einen effektiven Empfang des externen Primärsignals zu sichern. Einzelschichten mit den Zelltypen 1 und 3 dienen einer Vorverstärkung des externen Primärsignals. Einzelschichten mit den Zelltypen 1 und 2 oder 3 und 2 dienen der Endverstärkung und Wandlung in das auszulesende physikalische, chemische oder biochemische Signal. Die Schichten können in planarer Geometrie auf einem geeigneten Träger aufgebracht werden. Es sind aber auch schichtförmige konzentrische Gefügeanordungen sowie die Beschichtung von regellos gekrümmten Trägern Gegenstand der Erfindung.
III. Gradierte Schichten
Gradierte Schichten stellen einen Übergang von den diskreten Zellverteilungen in den Schichtsystemen zu den Zellgemischen dar, indem durch eine geeignete Beschichtungsstrategie eine quasi kontinuierliche Änderung der Konzentrationsverteilung der drei Zelltypen vom Außenraum (vorzugsweise Typ 1- und Typ 3-Zellen) zum Bereich der Auslesestruktur (vorzugsweise Zellen vom Typ 2 und Typ 3) verwirklicht wird. Eine gradierte Schicht vereint den Vorteil eines effektiven Empfangs des externen Primärsignals mit möglichen kurzen Transportwegen für die biologischen interzellulären Signalmoleküle innerhalb der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung.
Außerdem ermöglicht der Einsatz eines Nanoplotters vorteilhaft, die Zellen des ersten, des zweiten und ggf. des dritten Typs in einer räumlichen Anordnung zueinander auf dem formstabilen Substrat aufzubringen, was den verstärkenden Effekt des Verfahrens zusätzlich unterstützt (siehe 2). Dadurch kann sowohl durch die Wahl des Mengenverhältnisses von Zellen des ersten Typs zu Zellen des zweiten Typs sowie ggf. zu Zellen des dritten Typs als auch durch die Wahl der Anordnung der Zellen zu einander die Verstärkung gezielt beeinflusst werden.
Einige Anordnungen der immobilisierten Hefen sind in den 2 und 3 schematisch dargestellt.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 33 ist in den Zellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Typs das Afr1p-Protein (Alpha-Factor Receptor Regulator 1) inaktiviert.
Als Antwort auf die Pheromoninduktion wird ein umfangreiches Paarungsprogramm („mating response pathway”) in den Zellen aktiviert (Leberer et al., (1997). Pheromone signaling and polarized morphogenesis in yeast. Current Opinion in Genetics & Development 7: 59–66.). Paarungsspezifische Gene werden induziert und der Zellzyklus arretiert. Anschließend erfolgt ein gerichtetes Wachstum (Paarungsprojektion) der Zellen zur Quelle des Pheromons, z. B. dem Paarungspartner (Jackson et al. (1991). S. cerevisiae α pheromone receptors activate a novel signal transduction pathway for mating partner discrimination. Cell 67: 389–402.; Jackson et al. (1993) Polarization of yeast cells in spatial gradients of α-mating factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8332–8336).
Dieses ”Ausstrecken” der Hefezellen wird auch als ”Shmoo” bezeichnet (Mackay und Manney, (1974). Mutation affecting sexual conjugation and related processes in Saccharomyces cerevisiae. I. Isolation and phenotypic characterization of nonmating mutants. Genetics 76: 255–271.).
Afr1p („alpha factor receptor regulator”) ist für die Ausbildung von ”Shmoo”-Projektionen während der Paarung von Saccharomyces cerevisiae verantwortlich (Konopka, (1993). AFR1 acts in conjunction with the alpha factor receptor to promote morphogenesis and adaptation. Mol Cell Biol. 13: 6876–6888.). Δafr1-Mutanten können keine normalen Paarungsprojektionen mehr ausbilden. Im Übrigen zeigen Δafr1-Mutanten jedoch eine normale Sensitivität gegenüber einer Stimulation mit α-Faktor (Konopka, 1993). Folglich kann die Deletion des AFR1-Gens genutzt werden, um ein Ausbrechen der Hefezellen aus der Einbettungsmatrix durch ”Shmoo”-Projektionen zu verhindern, ohne den Pheromon-Signalweg zu beeinträchtigen, denn Zellen, in denen dieses Protein inaktiviert ist, können zwar noch Pheromonsignale empfangen, bilden jedoch keine Paarungsprojektionen (Ausknospung) mehr aus und können auf die Detektion von Pheromon hin nicht mehr mit Hefezellen des anderen Paarungstyps verschmelzen. Dies verhindert vorteilhaft, dass die Zellen des erfindungsgemäß verwendeten Verfahrens auf ein spezifisches Primärsignal und die dadurch bewirkte Ausschüttung von Pheromon hin nicht auswachsen und eine Matrix, in welche sie eingebettet sind, beschädigen. Außerdem können sie nicht miteinander verschmelzen und somit für das Verfahren unbrauchbar werden.
Für die Deletion des AFR1-Leserahmens wird bevorzugt eine HIS5⁺-Deletionskassette genutzt, welche durch doppelte homologe Rekombination den AFR1-Leserahmen im Genom ersetzt. Die HIS5⁺-Kassette wird dazu 5'- und 3'-seitig mittels SFH-PCR (SFH, ”short flanking homology region”) nach Wach et al. (Wach et al. (1997) Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13: 1065–1075) mit 40 bp langen flankierenden Sequenzen des AFR1-Gens versehen.
Der α-Faktor wird durch die spezifische Protease Bar1p von Saccharomyces cerevisiae gespalten und damit inaktiviert. Bar1p wird sezerniert und ist für eine korrekte Paarung der Hefezellen notwendig. MATa-Zellen, bei denen Bar1p inaktiviert ist, zeigen eine deutlich erhöhte Sensitivität gegenüber dem α-Faktor. Um die Sensitivität und Ansprechzeit des Verstärkersystems zu erhöhen, werden nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 34 Zellen eingesetzt, bei denen das Bar1-Protein inaktiviert bzw. das entsprechende Gen deletiert wurde (Ballensiefen W and Schmitt H. D. (1997) Periplasmic Bar1 protease of Saccharomyces cerevisiae is active before reaching its extracellular destination. Eur J Biochem 247 (1): 142–7; Chan R. K. and Otte C. A. (1982) Physiological characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and alpha factor pheromones. Mol Cell Biol 2 (1): 21–9; Barkai N, et al. (1998) Protease helps yeast find mating partners. Nature 396 (6710): 422–3; Sprague G. F. Jr and Herskowitz I. (1981) Control of yeast cell type by the mating type locus. I. Identification and control of expression of the a-specific gene BAR1. J Mol Biol 153 (2): 305–21).
Nach einer Weiterbildung der Erfindung werden als Hefezellen solche Zellen eingesetzt, die genetisch dergestalt verändert wurden, dass ihr Wachstum gezielt gesteuert werden kann. Dies erlaubt vorteilhaft, die für die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung benötigte Menge an Hefezellen unter sogenannten permissiven Bedingungen heranzuziehen und nach der Einbettung der Hefezellen in eine Matrix die Hefezellen durch die Einstellung von restriktiven Bedingungen daran zu hindern, sich weiter zu teilen. Dadurch wird der durch das vegetative Wachstum der Zellen innerhalb der Matrix ausgeübte Druck vorteilhaft vermieden, der sowohl die Haltbarkeit der Einrichtungen beeinträchtigt als auch Stress auf die immobilisierten Zellen ausübt und deren Vitalität negativ beeinflusst.
Bevorzugt eignen sich Hefezellen, bei denen die Aktivität eines Gens, welches auf den Zellzyklus einwirkt, gezielt gesteuert werden kann. Besonders bevorzugt werden Hefezellen, bei denen die Aktivität des CDC28-Gens gezielt gesteuert werden kann. Das CDC28-Gen wird von der Hefezelle benötigt, um sich teilen zu können. Ist das Gen nicht vorhanden, kann die Hefezelle zwar überleben, aber sich nicht weiter teilen.
Die Steuerung der Genaktivität erfolgt beispielsweise durch das sogenannte Tet on-System. Dabei wird eine Hefezelle, in der das endogene CDC28-Gen deletiert ist (eine sogenannte Δcdc28-Zelle), mit einem DNA-Konstrukt transformiert, dass die kodierende Sequenz des CDC28-Gens unter der Kontrolle eines tet-responsiven Promotors enthält. Gleichzeitig enthält das Konstrukt die kodierende Sequenz des reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivators (rtTA) unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors.
Solche genetisch veränderten Hefezellen exprimieren ständig den reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator. Dieser kann nur in Gegenwart eines Tetracyclin-Antibiotikums wie beispielsweise Doxycyclin an den tet-responsiven Promotor binden und die Expression des unter der Kontrolle des tet-responsiven Promotors stehenden Gens unterdrücken. Um die Zellen heranzuziehen, setzt man dem Nährmedium ein Tetracyclin-Antibiotikum zu und stellt somit permissive Bedingungen her. Bei bzw. nach der Einbettung der Hefezellen in das Xerogel wäscht man das Tetracyclin-Antibiotikum aus und schafft dadurch restriktive Bedingungen für die Hefe. Der reverse Tetracyclin-kontrollierte Transaktivator kann nicht mehr die Expression des CDC28-Gens aktivieren. Die Hefezellen können sich also nicht mehr weiter teilen.
Nach der Weiterbildung des Anspruchs 36 werden als Hefezellen Zellzyklus-(cdc; cell division cycle)-Hefe-Mutanten eingesetzt, welche bei permissiver Temperatur normal wachsen und bei restriktiver Temperatur das Wachstum einstellen. So sind mehrere temperatursensitive (ts) Allele des CDC28-Gens aus Saccharomyces cerevisiae bekannt. Es wurden z. B. sechs verschiedene ts-Allele identifiziert, welche ein normales Wachstum der Hefen bei 23°C erlauben, jedoch das Wachstum bei 37°C verhindern (Lörincz and Reed, 1986). Weiterhin sind auch solche temperatursensitiven Mutationen bekannt, bei denen die permissive Temperatur höher ist als die restriktive Temperatur. Diese bezeichnet man als kältesensitive (cold sensitive, cs) Mutationen.
Vorteilhaft kann durch die Nutzung solcher Mutanten bei permissiver Temperatur zunächst die benötigte Biomasse erzeugt werden, während die Hefezellen das Wachstum bei restriktiver Temperatur einstellen. Werden solche Mutanten für die erfindungsgemäß verwendete Einrichtung eingesetzt, so können bei thermosensitiven Mutanten die Zellen vorteilhaft bis zum Erreichen der gewünschten Biomasse bei ca. 25°C angezogen und dann eingebettet werden. Bei restriktiver Temperatur von z. B. 37°C – einer Temperatur wie sie für Fermentation von Escherichia coli ideal ist – erfolgt kein Wachstum der Hefen mehr, obwohl die Zellen physiologisch aktiv sind. (Lörincz, A. and Reed, S. I. Sequence analysis of temperature-sensitive mutations in the Saccharomyces cerevisiae gene CDC28. Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 4099–4103). Bevorzugt verwendet werden Hefen, die die temperatursensitiven Allele cdc28-4, cdc28-6, cdc28-9, cdc28-13, cdc28-16, cdc28-17, cdc28-18 und cdc28-19 tragen.
Für Anwendungen, bei denen die Hefen in niedrigeren Temperaturen wie beispielsweise Raumtemperatur eingesetzt werden sollen, werden kältesensitive Mutanten eingesetzt, die bei hohen Temperaturen herangezogen werden und nach der Einbettung bei niedriger Temperatur gehalten werden und so keine Teilungsaktivität mehr aufweisen.
Nach Patentanspruch 37 sind die Zellen mit wenigstens einer Quelle für elektromagnetische Strahlen und mindestens einem Fotodetektor so gekoppelt, dass elektromagnetische Strahlen auf die Hefezellen fallen und die Fluoreszenz über den Fotodetektor gemessen wird.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 38 ist der Fotodetektor ein Festkörperbildsensor mit Fotowiderständen, Fotodioden oder Fototransistoren und der Festkörperbildsensor ist mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet.
Ein Festkörperbildsensor ist eine flächenhafte und matrixförmige Anordnung optoelektronischer Halbleiterbauelemente als lichtelektrische Empfänger. Die Farbe der Zellen und deren Intensität sind in äquivalente elektrische Signale wandelbar, so dass eine Verarbeitung im Datenverarbeitungssystem stattfinden kann.
Die Zellen befinden sich nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 39 wenigstens auf einer Oberfläche in einer transparenten Messzelle. Diese besitzt darüber hinaus Einrichtungen zum Zuführen und Abführen des Mediums.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 40 ist die Messzelle mit einer Heizeinrichtung gekoppelt.
Eine Quelle für elektromagnetische Strahlen und ein Fotodetektor sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 41 so angeordnet, dass von den Partikeln ausgehende elektromagnetische Strahlen auf den Fotoempfänger abgebildet werden.
Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 42 ist der Signaldetektor ein Fotodetektor. Der Fotodetektor ist ein Festkörperbildsensor mit Fotowiderständen, Fotodioden oder Fototransistoren, wobei dieser mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet ist. Ein Festkörperbildsensor ist eine flächenhafte und matrixförmige Anordnung optoelektronischer Halbleiterbauelemente als lichtelektrische Empfänger. Die Farbe und deren Intensität der Hefezellen sind in äquivalente elektrische Signale wandelbar, so dass eine Verarbeitung im Datenverarbeitungssystem stattfinden kann.
Im Strahlengang nach der Quelle für elektromagnetische Strahlen und/oder vor dem Fotodetektor befindet sich nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 43 wenigstens eine strahlformende oder mindestens eine strahlbeeinflussende optische Vorrichtung oder wenigstens eine Kombination davon. Dadurch können die Lichtstrahlen der Hefezellen auf den Fotodetektor fokussiert werden, so dass eine sichere Auswertung auch lichtschwacher Änderungen gegeben ist.
Die Hefezellen sind nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 44 mit einer optischen Strahlungsquelle so gekoppelt, dass die Strahlung auf die Hefezellen gelangt und die Hefezellen fluoreszieren. Die Strahlungsquelle liefert vorzugsweise elektromagnetische Strahlen als Licht im Sichtbaren und den angrenzenden Wellenlängenbereichen im Infraroten oder Ultravioletten. Vorzugsweise ist das eine elektromagnetische Strahlungsquelle, die Licht mit einer definierten Wellenlänge aussendet. Die Wellenlänge der Strahlungsquelle richtet sich nach dem Anregungsspektrum der fluoreszierenden Proteine.
Bestandteil der Erfindung ist weiterhin auch die Verwendung eines Verfahren gemäß Patentanspruch 48 zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals unter Nutzung von Zellen, nämlich eines Verfahrens, wobei

a) in Zellen eines ersten Typs ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch das Primärsignal reguliert wird,
b) in Zellen eines zweiten Typs ein spezifisches Gen unter die Kontrolle eines Promotors gestellt ist, der durch das sezernierte Signalmolekül reguliert wird,

– durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmolekül induziert wird und
– das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.

Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 49 werden zusätzlich

c) Zellen eines dritten Typs genutzt, bei denen ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Signalmolekül reguliert wird, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert wird,

– durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls in der ersten Zelle induziert wird,
– durch die Sekretion des Signalmoleküls durch die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion des Signalmoleküls induziert wird, und
– das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.

Besondere Ausgestaltungen der in dem erfindungsgemäß verwendeten Verfahren genutzten Bestandteile werden sinngemäß wie die besonderen Ausgestaltungen der Merkmale der erfindungsgemäß verwendeten Einrichtung gemäß den Ansprüchen 3 bis 44 durchgeführt. Nach der Weiterbildung des Patentanspruchs 50 wird daher das Verfahren unter Nutzung wenigstens einer Einrichtung mit mindestens einem Merkmal aus einem der Ansprüche 3 bis 44 durchgeführt.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert.
Dabei zeigen
1: Schematische Darstellung gentechnisch veränderter Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α und des Paarungstyps a gemäß Ausführungsbeispiel 1
2: Vorrichtung zur Signalverstärkung mittels des Pheromonsystems von Hefe.
Die Immobilisierung definierter Zellmengen erfolgt mit Hilfe eines Nanoplotters.
Zellen des ersten Typs, welche auf ein bestimmtes Primärsignal hin (z. B. Limitationen von Nährstoffen im Medium) das Hefepheromon α-Faktor produzieren, sind auf einer Oberfläche (z. B. einem Glas-Objektträger) von Zellen des zweiten Typs konzentrisch umgeben (A-C). In den Zellen des zweiten Typs ist ein Markergen, z. B. für das GFP (grün fluoreszierendes Protein) kodierend, unter die Kontrolle eine Pheromon-induzierbaren Promotors, vorzugsweise des FIG1-Promotors, gestellt (A-C). Bei Induktion des Hefepheromons kommt es zur Expression des Markergens und somit zur Fluoreszenz der Zellen des zweiten Typs (B-C). Die Expression des Pheromons ist abhängig von der Höhe der Limitierung. Demzufolge zeigen bei geringer Limitierung die Zellen des zweiten Typs in unmittelbarer Umgebung der Zelle des ersten Typs (B), bei starker Limitierung auch weiter entfernte Zellen eher eine Fluoreszenz (C).
3: Schematischer Schichtaufbau mit verschiedener Dichte von Sensorzellen
Zellen des zweiten Typs, welche als Antwort auf von der Zelle des ersten Typs gebildeten α-Faktor ein auslesbares Signal generieren („Aktivierte responsive Zelle”), sind auf einer Sensoroberfläche immobilisiert (A, C). Bei einem höheren Anteil von Zellen des ersten Typs führt die Ausschüttung von Pheromon zu einem stärkeren Signal (B) als bei einem geringeren Anteil an Zellen des ersten Typs. (D). Solche Schichtsysteme lassen sich auch in einem pyramidalen Aufbau kombinieren.
4: Schematische Darstellung einer zusätzlichen Signalverstärkung gemäß Ausführungsbeispiel 3
Ausführungsbeispiel 1: Signalverstärkung unter Nutzung des Pheromonsystems von Hefe
Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α erkennen als Zellen des ersten Typs mittels eines Rezeptors ein eingehendes Primärsignal. Rezeptoren induzieren direkt oder über zwischengeschaltete Signalkaskaden die Transkription des Promotors. Unter die Kontrolle des Promotors ist der für den α-Faktor kodierende MFα1 Leserahmen kloniert, so dass die Hefezelle des Paarungstyps α als Antwort auf ein eingehendes Primärsignal das Pheromon α-Faktor in die Umgebung sezerniert.
Die Herstellung einer solchen Hefezelle des ersten Typs ist im Folgenden beispielhaft für die Anwendung zum Monitoring von bioverfügbarem Phosphor beschrieben. Die Hefezellen des ersten Typs (Sensorzellen) reagiert hierbei auf sensitiv auf eine Limitierung von Phosphor. Das Gen YAR071W wird bei einer Phosphorlimitierung spezifisch sehr viel stärker transkribiert (Boer et al., (2003). The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278: 3265–3274.). Die 1000 Basenpaare umfassende, stromaufwärtsliegende Region des heraufregulierten Gens YAR071W wird mittels der spezifischen Primer Seq.-Nr. 5 und Seq.-Nr. 6 aus Tab. 2 in einer PCR aus genomischer DNA von Saccharomyces cerevisiae amplifiziert. Durch die Primer wird die Sequenz um eine 5'-seitige Erkennungssequenz für SacI und 3'-seitig um eine Erkennungssequenz für SpeI erweitert. Mittels dieser Erkennungssequenzen erfolgt ein gerichteter Einbau in den „high copy-number”-Vektor p426, folgend p426YAR071W genannt. Im zweiten Schritt wird der Leserahmen des MFα1-Gens in das Plasmid p426YAR071W kloniert. Dazu wird die Sequenz des MFα1-Leserahmens mit den Primern Seq.-Nr. 7 und Seq.-Nr. 8 (siehe Tab. 2) aus genomischer DNA von Saccharomyces cerevisiae amplifiziert, welche das Fragment 5'-seitig um eine SpeI- und 3'-seitig um eine SalI-Schnittstelle erweitern. Danach erfolgt die Klonierung des Fragments mit den genannten Restriktionsschnittstellen in den Vektor p426YAR071W, folgend p426YAR071W-MFalpha1 genannt. Die korrekte Sequenz der klonierten Fragmente wird mittels DNA-Sequenzanalyse überprüft und bestätigt. Der Vektor p426 enthält einen Uraa-Marker aus Saccharomyces cerevisiae zur Selektion in ura-auxotrophen Stämmen. Das entstandene Konstrukt p426YAR071W-MFalpha1 wird z. B. in den Hefestamm BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0, ura3Δ0) transformiert und positive Transformanden selektiert. Bei Phosphorlimitierung wird in Sensorzellen, die mit dem Plasmid p426YAR071W-MFalpha1 ausgestattet sind, spezifisch die Expression von α-Faktor induziert.
Tab. 2: Primer für die Herstellung des Sensor-Plasmids p426YAR071W-MFalpha1.
Zur genomischen Zielsequenz homologe Bereiche sind dick markiert, Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen sind unterstrichen.
Die authentisch für den α-Faktor kodierenden Gene MFα1 und MFα2 sind im gleichen Stamm deletiert. Damit ist sichergestellt, dass der α-Faktor ausschließlich dann gebildet und sezerniert wird, wenn das zu detektierende Primärsignal vorhanden ist.
Für die Deletion der Leserahmen von MFα1 und MFα2, z. B. im α-Hefestamm BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0, ura3Δ0), werden die Markerkassetten natMX6 bzw. hphMX6 verwendet, welche Resistenzen gegen die Antibiotika Nourseothricin bzw. Hygromycin B vermitteln. Die natMX6-Kassette wird in einer SFH-PCR mittels der Primer Seq.-Nr. 9 und Seq.-Nr. 10 aus Tab. 3 amplifiziert. Die 5'-Bereiche der Primer (je 50 Basen) sind homolog zu den flankierenden Sequenzen des MFα1-Leserahmens im Genom von Saccharomyces cerevisiae. Die 3'-Bereiche der Primer (20 bp) sind homolog zu den Enden der natMX6-Kassette. Als DNA-Template für die SFH-PCR dient das Plasmid pFA6a-natMX6. Anschließend werden Hefezellen mit dem SFH-Fragment transformiert. Transformanden, bei denen das Fragment über doppelt homologe Rekombination stabil in das Genom integriert ist, werden auf Nourseothricin-haltigem Medium selektiert und die korrekte Integration der Deletionskassette mittels diagnostischer PCR bestätigt. Danach erfolgt die Deletion des Leserahmens von MFα2 im erzeugten Δmfα1-Hefestamm. Hierzu wird analog zur ersten Deletion ein SFH-Fragment mit den Primern Seq.-Nr. 11 und Seq.-Nr. 12 (siehe Tab. 3) und der hphMX6-Kassette (DNA-Template pFA6a-hphMX6) amplifiziert und in Δmfα1-Hefezellen transformiert. Die 5'-seitigen Bereiche der Primer sind homolog zu den flankierenden Sequenzen des MFα2-Leserahmens im Genom von Saccharomyces cerevisiae. Die Selektion positiver Transformanden erfolgt auf Hygromycin B-haltigem Medium und die korrekte Integration der Hygromycin-Resistenzkassette im Δmfα1-Δmfα2-Hefestamm wird mittels diagnostischer PCR überprüft.
Tab. 3: Primer für die Deletion der Leserahmen von MFα1 und MFα2 von Saccharomyces cerevisiae.
Die unmarkierte Primersequenz kennzeichnet Bereiche, die homolog zur genomischen DNA von Saccharomyces cerevisiae sind. Zur Deletionskassette homologe Bereiche sind fett markiert.
Die im gleichen Ansatz als Zellen des zweiten Typs vorliegenden Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps a sind dahingehend modifiziert, dass sie den für das EGFP kodierenden Leserahmen unter der Kontrolle des FIG1-Promotors beinhalten.
Dazu wurden 1000 bp 5'-seitig des offenen Leserahmens von FIG1 unter Verwendung der Primer Fig1-for (Seq.-Nr. 1) und Fig1-rev (Seq.-Nr. 2) (siehe Tab. 1) PCR-amplifiziert, aufgereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen SacI und SpeI geschnitten und in den S. cerevisiae Vektor p426 kloniert. Der so entstandene Vektor (p426FIG1) wurde mit den Enzymen SalI und EcoRI geschnitten.
Der für EGFP kodierende Leserahmen wurde mittels der Primer EGFPEcofor (Seq.-Nr 13) und EGFPSalrev (Seq.-Nr 14) PCR amplifiziert und das 744 bp große Fragment mit den Enzymen SalI und EcoRI geschnitten, aufgereinigt und zur Ligation in den Vektor p426FIG1 genutzt.
Tab. 4 Primer für die Amplifikation des offenen Leserahmens von EGFP
Die fett gedruckten Buchstaben grenzen den kodierenden Leserahmen des EGFP-Gens ein Kursiv sind die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen EcoRI bzw. SalI angegeben, welche für die Klonierung in den Vektor p426FIG1 genutzt werden. Die ersten sechs Basen dienen dem Schutz des Primers.
Die DNA-Sequenz des klonierten Leserahmens wurde durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Damit stand der Vektor p426FIG1-EGFP für die Transformation von Hefezellen zur Verfügung. Die Transformation des fertigen Vektors in Hefezellen des Paarungstyps a erfolgte wie oben für die Hefezellen des Paarungstyps α beschrieben.
Die für den a-Faktor kodierenden Gene (MFA1 und MFA2) sind deletiert, um sekundäre Effekte auf die α-Zellen auszuschließen. Die Deletion erfolgte analog zu dem für die Gene MFα1 und MFα2 beschriebenen Verfahren.
Erreicht nach Induktion des spezifisch regulierten Promotors der dann gebildete und sezernierte α-Faktor umliegende Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps a, wird in diesen Zellen die Transkription des für GFP kodierenden Leserahmens mittels des FIG1-Promotors stark induziert. Dies resultiert in einer grünen Fluoreszenz der Hefezellen, welche sensortechnisch ausgelesen wird. Die Intensität der grünen Fluoreszenz kann proportional zur Zahl der die α-Zelle umgebenden a-Zellen erhöht werden.
Ausführungsbeispiel 2: Zusätzliche Signalverstärkung
Die genetische Modifikation von Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps α als Zellen des ersten Typs erfolgt wie in Ausführungsbeispiel 1.
Als Zellen des zweiten Typs sind Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen des Paarungstyps a wie in Ausführungsbeispiel 1 verändert.
Als Zellen des dritten Typs sind Zellen des Paarungstyps a dahingehend modifiziert, dass sie als weiterer Verstärker wirken. Dazu ist ein Leserahmen, welcher für das Pheromon α-Faktor kodiert, unter die Kontrolle des FIG1-Promotors gesetzt.
Dazu wurde der FIG1-Promotor PCR-amplifiziert und in den Hefevektor p426 kloniert wie unter Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Anschließend wurde das Gen MFα1 in denselben Vektor 3'-seitig des FIG1-Promotors inseriert.
Erreicht der primär durch Wirkung eines Signalmoleküls sezernierte α-Faktor die umliegenden a-Zellen (Zellen des dritten Typs), kommt es in diesen Zellen durch die Induktion des FIG1-Promotors zur Bildung weiterer α-Faktor-Moleküle, d. h. zu einer weiteren Verstärkung (4). Das Ausmaß der Verstärkung kann durch die Wahl des Verhältnisses von Zellen des α- und a-Paarungstyps festgelegt werden (1).
SEQUENCE LISTING

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung einer Einrichtung, enthaltend a) Zellen eines ersten Typs, bei denen ein Gen, welches für die Synthese eines Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das Primärsignal reguliert wird, b) Zellen eines zweiten Typs, bei denen ein spezifisches Gen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das sezernierte Signalmolekül reguliert wird, so dass – durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls induziert wird und – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich c) Zellen eines dritten Typs enthalten sind, bei denen ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch das Signalmolekül reguliert wird, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert wird, so dass – durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls in der ersten Zelle induziert wird, – durch die Sekretion des Signalmoleküls durch die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion des Signalmoleküls induziert und eine Vorverstärkung des Primärsignals bewirkt wird, und – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des ersten, zweiten und/oder dritten Typs Hefezellen sind.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen Saccharomyces cerevisiae und/oder Schizosaccharomyces pombe Zellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle des ersten Typs gentechnisch verändert ist, so dass sie ein für das Primärsignal spezifisches Rezeptorsystem exprimiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle des zweiten Typs gentechnisch verändert ist, so dass sie ein für das Signalmolekül spezifisches Rezeptorsystem exprimiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Signalmolekül ein Pheromon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des ersten Typs Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps, Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps oder diploide Saccharomyces cerevisiae-Zellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des zweiten Typs Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen des dritten Typs Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps oder Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Pheromon kodierende Gen in den Zellen des ersten und/oder dritten Typs das MFα1-Gen, das MFα2-Gen, das MFA1-Gen oder das MFA2-Gen von Saccharomyces cerevisiae ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor, der durch das Pheromon reguliert wird, der FIG1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des zweiten Typs der Transkriptionsaktivator Ste12p überexprimiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des zweiten Typs der Transkriptionsaktivator Mcm1p überexprimiert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Gen für die Bildung eines Signalmoleküls zuständig ist, das von dem von den Zellen des ersten Typs sezernierten Signalmolekül verschieden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Gen für ein Markerprotein kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Gen für ein fluoreszierendes Protein kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Gen für ein grün (GFP), gelb (YFP), blau (BFP), cyan (CFP) oder rot (dsRed) fluoreszierendes Protein kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Gen für ein fluoreszierendes Protein mit eingeschränkter Halbwertszeit kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des ersten und/oder des zweiten und/oder des dritten Typs die authentische Regulation der Expression von Pheromonen ausgeschaltet ist.
Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die natürlichen Gene MFα1 und MFα2 in Saccharomyces cerevisiae-Zellen des α-Paarungstyps deletiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die natürlichen Gene MFa1 und MFa2 in Saccharomyces cerevisiae-Zellen des a-Paarungstyps deletiert sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Typs das Protein Fig1p inaktiviert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der durch ein Primärsignal regulierbare Promotor ein Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefel-spezifisch regulierter Promotor ist.
Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefel-spezifisch regulierte Promotor ausgewählt ist aus den Promotoren der Gene YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W und YLL057C von Saccharomyces cerevisiae.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Zellen in einem porösen organischen oder anorganischen Gel befinden.
Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Zellen in einem porösen und optisch transparenten Siliziumdioxid-Xerogel befinden.
Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Siliziumdioxid-Xerogel mit den Zellen auf einem Substrat mit erhöhter mechanischer Stabilität befindet.
Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat wenigstens eine Lichtleitfaser, ein planarer Glasträger, Glasbeads, oder ein anderer Formkörper aus Glas wie Hohlkugeln, Stäbe, Röhren oder ein keramisches Granulat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen ein Bestandteil einer einen Hohlraum wenigstens teilweise umschließenden Hüllenstruktur sind.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Hüllenstruktur aus einem Grundkörper mit einer inneren Schicht aus einem biologischen Hydrogel und einer äußeren Schicht aus einem porösen anorganischen Gel besteht, wobei die Schichten wenigstens bereichsweise aufgebracht sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in ein Gefüge mit einer hierarchischen Porenstruktur eingebettet sind, so dass neben der für anorganische Gele typischen Nanoporosität das Gefüge zusätzlich von miteinander verbundenen Mesoporen durchzogen wird, deren Durchmesser typischerweise zwischen 100 nm bis 100 μm variiert und die einen Stoffaustausch zwischen der Umgebung und den eingebetteten Zellen sowie deren Reaktionsprodukte wie den Enzymen ermöglichen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Typs das Protein Afr1p inaktiviert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass in den Zellen des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Typs das Protein Bar1p inaktiviert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefezellen Zellzyklus-(cdc; cell division cycle)-Mutanten eingesetzt werden, welche bei permissiven Bedingungen normal wachsen und bei restriktiven Bedingungen das Wachstum einstellen.
Verwendung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefezellen temperatursensitive Zellzyklus-(cdc; cell division cycle)-Mutanten eingesetzt werden, welche bei permissiver Temperatur normal wachsen und bei restriktiver Temperatur das Wachstum einstellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit wenigstens einer Quelle für elektromagnetische Strahlen und mindestens einem Fotodetektor so gekoppelt sind, dass elektromagnetische Strahlen auf die Zellen fallen und die Fluoreszenz über den Fotodetektor gemessen wird.
Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Fotodetektor ein Festkörperbildsensor mit Fotowiderständen, Fotodioden oder Fototransistoren ist und dass der Festkörperbildsensor mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Zellen wenigstens auf einer Oberfläche in einer transparenten Messzelle befinden und dass die Messzelle Einrichtungen zum Zuführen und Abführen eines Mediums besitzt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Messzelle mit einer Heizeinrichtung gekoppelt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass eine Quelle für elektromagnetische Strahlen und ein Fotodetektor so angeordnet sind, dass von den Partikeln ausgehende elektromagnetische Strahlen auf den Fotoempfänger abgebildet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass der Signaldetektor ein Festkörperbildsensor als Fotodetektor ist, der mit einem Datenverarbeitungssystem zusammengeschaltet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 41 oder 42, dadurch gekennzeichnet, dass sich im Strahlengang nach der Quelle für elektromagnetische Strahlen und/oder vor dem Fotodetektor wenigstens eine strahlformende oder mindestens eine strahlbeeinflussende optische Vorrichtung oder eine Kombination davon befindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 41 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer optischen Strahlungsquelle so gekoppelt sind, dass die Strahlung auf die Hefezellen gelangt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 44 zur Detektion der Limitierung von Nährstoffen in Kulturmedien.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 44 zum Nachweis der Belastung von Zellen durch Stressoren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 44 zum Nachweis von Substanzen in wässrigen Lösungen.
Verwendung eines Verfahrens, wobei a) in Zellen eines ersten Typs ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der durch das Primärsignal reguliert wird, b) in Zellen eines zweiten Typs ein spezifisches Gen unter der Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der durch das sezernierte Signalmolekül reguliert wird, so dass – durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmolekül induziert wird und – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird, zur Detektion und Verstärkung eines Primärsignals.
Verwendung gemäß Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass c) Zellen eines dritten Typs genutzt werden, bei denen ein Gen, welches für die Synthese des Signalmoleküls zuständig ist, unter der Kontrolle eines Promotors steht, der durch ein Signalmolekül reguliert wird, das durch die Zellen des ersten Typs sezerniert wird, so dass – durch ein von einer Zelle des ersten Typs aufgenommenes Primärsignal die Sekretion des Signalmoleküls in der ersten Zelle induziert wird, – durch die Sekretion des Signalmoleküls durch die Zellen des ersten Typs in den Zellen des dritten Typs die Sekretion des Signalmoleküls induziert wird, und – das Primärsignal durch die Signalmolekül-kontrollierte Expression des spezifischen Gens durch die Zellen des zweiten Typs verstärkt wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren unter Nutzung wenigstens einer Einrichtung mit mindestens einem Merkmal wie in einem der Ansprüche 3 bis 44 definiert, durchgeführt wird.