CN101743324A

CN101743324A - 用于探测和放大信号的装置和方法

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Publication number: CN101743324A
Application number: CN200880022353A
Authority: CN
Inventors: 凯·奥斯特曼; 沃尔夫冈·蓬佩; 格哈德·勒德尔; 安尼特·格罗斯
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2028-06-27
Also published as: DE102008030907B4; EP2167680A1; CN101743324B; DE102008030907A1; WO2009000918A1; US20110189657A1

Abstract

本发明涉及一种装置和方法，用于在利用细胞间通信系统的情况下探测和放大初级信号并涉及所述装置和方法在检测例如磷、硫、氮、荷尔蒙、代谢中间产物、发酵产物等物质中的应用。依据本发明用于探测和放大初级信号的装置包括第一类型细胞，其中，负责信号分子合成的基因处于由初级信号调节的启动子的控制下，并包括第二类型细胞，在第二类型的细胞中特异基因处于如下启动子的控制下，所述启动子由所分泌信号分子进行调节，从而通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导信号分子分泌并且初级信号借助第二类型细胞中特异基因受信号分子控制的表达而得以放大。

Description

用于探测和放大信号的装置和方法

技术领域

本发明涉及一种装置和方法，用于在利用细胞间通信系统的情况下探测和放大初级信号以及所述装置和方法的应用，用于指示例如像磷、硫、氮、荷尔蒙、代谢中间产物、发酵产物等物质。

背景技术

以往用于信号放大的解决方案的缺点是，物质只有从确定的指示极限起才能进行探测。

US 6555 325B1公开了一种系统，用于探测细胞信号转导级联的连接与组成部分之间在功能上的相互影响。该发明提供一种稳定耐用的、可重复的测试系统，用于筛选和识别具有药物作用的物质，这些物质对细胞受体的活性进行调制或者可与该受体相互影响。特别是识别出如下的物质，这些物质与G蛋白偶联的、在制药学上起重要作用的受体相互影响。在此，利用酵母费洛蒙(Pheromon)系统，这是因为酵母费洛蒙受体同样是G蛋白偶联的受体，G蛋白偶联的受体可与异位表达的G蛋白偶联的受体成分一起形成异种受体。这样也可以识别出对非酵母受体起作用的物质。对于功能上相互影响的指示导致了分泌费洛蒙，该费洛蒙在第二接合型的细胞内刺激这种标记基因的表达，在所述第二接合型的细胞内，将标记基因置于费洛蒙应答启动子的控制之下。

发明内容

本发明的任务在于，提供一种装置和方法，用于探测和放大初级信号，以便降低对于所要探测的初级信号的指示极限。

依据本发明，该任务通过一种用于探测和放大初级信号的装置得以解决，该装置包括：

a)第一类型细胞，其中，负责信号分子合成的基因处于通过初级信号调节的启动子的控制下，以及

b)第二类型细胞，其中，特异基因处于通过所分泌信号分子调节的启动子的控制下，

从而通过由第一类型细胞接收的初级信号对信号分子分泌进行诱导，并且初级信号借助第二类型细胞中特异基因受信号分子控制的表达而得以放大。

按照权利要求2的改进方案，附加地

c)包括第三类型细胞，其中，负责信号分子合成的基因处于如下启动子的控制之下，所述启动子通过由第一类型细胞分泌的信号分子来调节，

从而

-通过由第一类型细胞接收的初级信号，通过第一细胞来诱导信号分子分泌，

-通过信号分子由第一类型细胞分泌，在第三类型细胞内诱导信号分子分泌并使得初级信号预放大，以及

-初级信号借助第二类型细胞中特异基因受信号分子控制的表达而得以放大。

细胞具有很多通信系统，细胞通过这些通信系统可与其他细胞交换信息。这些通信系统通常以信号分子通过细胞分泌到周围介质内为基础。其他细胞具有适用于这些信号分子的受体系统并可以感知所述信号分子并对信号分子做出反应。

这种通信系统例如包括微生物的群体感应(Quorum sensing)、酵母细胞中的氨脉冲(Ammoniakpulse)、费洛蒙系统(例如在酵母细胞接合时分泌的生长因子，该生长因子在细胞联合体的内部用于细胞之间的通信)、微生物的病毒因子(病毒因子专门与真核受体结合)或者免疫性的和影响细胞分化的因子。在这些通信系统中分泌的信号分子可以在依据本发明的装置和依据本发明的方法中使用。

在群体感应中，例如微生物借助类似荷尔蒙的小信号分子通信。这一过程在细胞密度调节方面起到决定性作用，其可以使细菌种群类似于多细胞生物并因此具有优点。此外，属于通过群体感应来调节的方式有：生产抗生素、共生、变异、病毒，形成生物膜以及一些几种弧菌属物种的生物发光。称为自诱导物的信号分子由确定的细菌利用确定的基因来产生，并排到周围的培养基内。细菌具有对于这种配体的合适的受体系统，并在介质内的信号分子达到一定的浓度之后可以激活确定基因的转录。在此，存在种群特异性的自诱导物，利用所述自诱导物，细菌在自己的细菌种群内部进行通信。而相反地，所谓自诱导物-2实现了不同细菌种群之间的通信(种群间通信)。

在酵母情况下，使用周期性产生的氨脉冲作为菌群之间的信号。在此，氨脉冲诱导相邻菌群的氨生产。这一点又影响到菌群的空间分布，这是因为每个氨脉冲均导致暂时妨碍相邻菌群之间的生长区。因此，菌群优先向没有竞争菌群的相反侧生长。

在依据本发明的装置中，细胞处于液态的，优选为水性的介质内，通过该介质，细胞之间进行信号分子的交换。在此，该装置的细胞要么悬浮地存在于溶液内，要么固定地处于载体上。悬浮液处于适当的容器内，该容器保证在测量技术上检测到由细胞发出的信号。载体同样以如下方式构成，即细胞发出的信号可以通过探测系统检测。

本发明可以在具有初级信号受体的所有细胞中使用。在此，是正常受体还是异常受体都无关紧要。相同情况适用于需要时连接的信号级联以及信号分子的形成。

本发明具有优点的构成在权利要求3至27中予以说明。

按照权利要求3的改进方案，第一、第二和/或者第三类型的细胞为酵母细胞。按照权利要求4的改进方案，酵母细胞为酿酒酵母细胞和/或者粟酒裂殖酵母细胞。

负责信号分子合成的基因处于受初级信号调节的启动子的控制下。在遗传学中，调节基因表达的DNA序列称为启动子。本发明意义上的启动子优选是染色体组DNA的如下区，即所述区专门负责调节基因的表达，方法是：它们对细胞内信号或者细胞外信号做出反应并依赖于这些信号激活或者抑制处于该信号控制下基因的表达。

在酵母中，这些进行调节的DNA区一般处于起始密码子的5′侧并且平均长度为309bp(Mewes H.W.et al.，(1997)Overview of the yeastgenome.Nature 387，7-65)。但这些进行调节的区也可以远离编码序列1000bp以上或者处于相关基因编码序列的3′侧或者甚至处于相关基因转录的序列内。如果把这种启动子设置到任意基因(优选费洛蒙基因)的起始密码子的5′侧，那么这种启动子依赖于上述特异初级信号地调节该基因的活性。

由酵母识别出的初级信号要么是如下的信号，酵母细胞对于该信号具有自己的受体系统，在此例如是缺少酵母细胞确定的基本养分的信号，基本养分诸如是氮、硫、磷、铁或者铜、碳源、基本氨基酸、氧；要么是其他信号，例如像温度、DNA损坏、内质网应激(ER stress)或者氧化应激。

但第一类型细胞按照权利要求5的改进方案也可以进行下述基因技术上的改变，即，它们表达一种天然不具有细胞的受体系统。这些受体系统接收的初级信号是化学类型的，例如离子、无机或者有机化合物和生物分子如蛋白质、肽、脂类、糖类或者核酸，或者也是物理类型的，例如电磁辐射、压力、温度或者电导率。

酵母细胞内这种受体系统的表达例如由现有技术公知。于是，在酵母中例如表达出对于诸如雄性激素人类荷尔蒙的传感系统(Bovee，T.F.H et al.(2008)A new highly androgen specific yeast biosensor，enabling optimisation of(Q)SAR model approaches，The Journal of steroidbiochemistry and molecular biology 108：121-131)、对于诸如镉的重金属的传感系统(Park，J.-N.et al.(2007)Identification of thecadmium-inducible Hansenula polymorpha SEQ1 gene promoter bytranscriptome analysis and its application to whole-cell heavy-metalldetection systems.Applied and environmental microbiology73：5990-6000)、对于挥发性有气味的物质的传感系统(Marrakchi，M.et al.(2007)A new concept of olfactory biosensor based on interdigitatedmicrolelectrodes and immobilized yeasts expressing the human receptorOR17-40.European Biophysical Journal 36：1015-1018)以及甚至对于爆炸性物质(Sprengstoffe)的传感系统(Radhika，V.et al.(2007)Chemicalsensing of DNT by engineered olfactory yeast strain.Nature ChemicalBiology 3：325-330)。

因为细胞处于液态介质内，所以所要放大的初级信号必须同样要么处于该液态介质内，要么如在几个物理参数例如像温度的情况下那样，穿过该介质传递到依据本发明的装置的细胞上。

如果第一类型细胞借助内源的或者重组的受体来识别输入的初级信号，那么直接或者间接通过中间连接的信号级联来诱导信号特异性启动子的转录，从而第一类型细胞作为对于输入的初级信号的应答而将信号分子分泌到周围。

第二类型细胞在其表面上具有由第一类型细胞分泌的信号分子的受体，以及该信号的分子内继续传输所需的、需要时借助分子生物技术来修饰(modifizieren)的信号级联。第二类型细胞可以按照权利要求6的改进方案在基因技术上进行如下改变，即，该第二类型细胞对如下信号分子的受体进行表达，该信号分子天然不具有细胞。

第二类型细胞依据本发明在基因技术上以如下方式改变，即，例如为标记蛋白质，例如像GFP(绿荧光蛋白质)编码的特异基因处于如下启动子的控制下，该启动子通过由第一类型细胞分泌的信号分子而得到调节。

如果由第一类型细胞依照特异初级信号分泌的信号分子到达第二类型的周围细胞，那么在第二类型的这些细胞内，通过由信号分子调节的启动子而对特异基因的表达和标记蛋白质或者目标蛋白质的生产进行强力诱导。

在本发明另一种实施方式中，特异基因自身又负责由第二类型细胞分泌的信号分子的合成。由此，具有优点地实现依据本发明的多个装置以放大器级联的方式连接。由第二类型细胞分泌的信号分子由依据本发明的第二装置作为初级信号而被探测并由此进一步放大。这种级联可以通过使用不同类型的信号分子任意延长。处于级联端部上典型的是具有由信号分子调节的特异基因的细胞，所述特异基因编码标记蛋白质，例如像GFP(绿色荧光蛋白质)，由此，多倍放大的初级信号就可以通过适当的探测系统检测。

酵母细胞可以既处于二倍体状态下，也处于单倍体状态下。两个单倍体酵母细胞可以在一称为接合的过程中融合成一个二倍体酵母细胞。在此，单倍体酵母细胞中可以区分为两个所谓的接合型。仅具有不同接合型的酵母细胞才可以相互接合。例如，这在面包酵母酿酒酵母中，是接合型α和a，在裂殖酵母粟酒裂殖酵母中，是接合型阳性和阴性。

单倍体酵母细胞通过所谓的费洛蒙进行通信。这是形成相应细胞的短肽，以便向其周围报告自身的接合型。这样接合型α的酿酒酵母-酵母细胞例如分泌费洛蒙α因子而接合型a的酿酒酵母-酵母细胞分泌费洛蒙a因子。

依据本发明，第一类型细胞在基因技术上以如下方式改变，即，负责信号分子合成的基因处于受所要指示的初级信号调节的启动子的控制下。在此，该基因要么自身编码信号分子，要么编码在细胞内导致信号分子合成和/或者信号分子分泌的蛋白质。按照权利要求7的改进方案，该信号分子优选为费洛蒙。

依据本发明意义上的费洛蒙除了酵母细胞内出现的天然费洛蒙外，还有同源的或者被修饰的肽或者肽类似物，或者能够与酵母细胞的费洛蒙受体结合并进行激活的其他有机化合物。

编码费洛蒙的基因可以要么是生物体基因组内所包含的天然基因，要么是合成的基因序列，所述天然基因和基因序列的表达用于产生费洛蒙或者与费洛蒙同源的肽，其能够激活酵母细胞的费洛蒙受体。

在一种优选的构成中，本发明因此由用于探测和放大初级信号的装置组成，该装置包括：

a)第一类型的单倍体细胞，其中，编码费洛蒙的基因处于由初级信号调节的启动子的控制下，以及

b)第二类型的单倍体细胞，其中，特异基因处于由所分泌的费洛蒙调节的启动子的控制下，

从而通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导费洛蒙的分泌并且初级信号借助第二类型细胞中特异基因受费洛蒙控制的表达而得以放大。

第一类型细胞按照权利要求8的改进方案是接合型α的酿酒酵母细胞或者接合型a的酿酒酵母细胞或者二倍体的酿酒酵母细胞。

按照权利要求9的改进方案，第二类型细胞是接合型α的酿酒酵母或者是接合型a的酿酒酵母细胞。

第三类型细胞按照权利要求10的改进方案是接合型α的酿酒酵母或者是接合型a的酿酒酵母细胞。

酵母细胞在其表面上具有各自相反接合型费洛蒙的受体。因此，例如接合型a的酿酒酵母细胞能够感受其周围接合型α的酿酒酵母细胞并且反过来也是一样的。

第一和/或者第三类型细胞内负责信号分子合成的基因按照权利要求11的改进方案是相应编码费洛蒙α因子的、酿酒酵母的MFα1基因或者MFα2基因，或者是编码费洛蒙a因子的、酿酒酵母的MFA1基因或者MFA2基因。

通过作为信号分子使用的费洛蒙调节的启动子按照权利要求12的改进方案是酿酒酵母的F1G1启动子。

F1G1基因的转录在单倍体酵母细胞利用各自相反接合型的费洛蒙培养之后提高直至97倍(Roberts，C.J.，et al.(2000)Signaling andcircuitry of multiple MAPK pathways revealed by a matrix of global geneexpression profiles.Science 287：873-880)。本已在酵母“双杂合筛选(Two-Hybrid Screen)”中为识别受费洛蒙调节的基因而进行识别(Erdman，S.，et al.(1998)Pheromone-regulated genes required for yeastmating differentiation.Journal of Cell Biology 140：461-483)。名称F1G1表示“因子诱导基因1(factor induced gene 1)”。这是一种整合的膜蛋白，其直接或者间接参与Ca²⁺到细胞内的吸收(Muller，E.M.etal.(2003)Fig1p facilitates Ca²⁺influx and cell fusion during mating ofSaccharomyces cerevisiae Journal of Biological Chemistry 278：38461-38469)。在将α因子加入a细胞后，可以指示出这些细胞内60分钟后蛋白质明显增加(Roberts et al.，2000)。在将各自相反的费洛蒙加入酵母细胞后的20分钟，就观察到mRNA浓度就提高了97倍以上(Roberts et al.，2000)。因此，F1G1基因的启动子可以具有优点地通过各自相反接合型的费洛蒙而被高水平调节。因此，可以迅速且灵敏地指示出费洛蒙的作用。

作为启动子优选使用如下DNA片段，该DNA片段在FIG1基因的起始密码子的5′侧包括高达1000bp，或者使用该DNA片段的亚片段，该亚片段能够依照费洛蒙的存在激活或者抑制处于该序列控制下的特异基因。

特别优选的是，在应用引物Fig1-for(序列编号1)和Fig1-rev(序列编号2)(参见表1)的情况下，通过酵母属基因组的多聚酶链式反应(PCR)扩增而获得的DNA段。

表1用于扩增FIG1启动子的引物。加粗印刷的字母对所使用的FIG1基因的启动子区进行限制。以斜体表示对用于基因重组(Klonierung)的限制性核酸内切酶Sac I或Spe I的识别序列。前六个碱基用于引物的保护。

本发明意义上的启动子同样指如下的DNA段，该DNA段相比于相应的酵母启动子具有50％以上，优选80％以上的同源性。所述段例如可以源自其他生物的，优选为其他酵母菌种的同源的基因组区。但也可以是合成产生的DNA序列，其序列与相应的酿酒酵母启动子具有50％以上的，优选80％以上的同源性，即一致性。启动子也可以是合成的DNA序列，其由上述酵母启动子的子区域以及来自酿酒酵母中的已知基础启动子组成。

基础启动子提供了对于转录子结合所需的DNA序列，而酵母启动子中的子序列则专门对进行调节的信号做出反应。这种基础启动子优选是酿酒酵母中细胞色素c基因的基础启动子，该基础启动子在细胞色素c基因起始密码子的5′侧包括300bp(Chen，J.et al.(1994)Binding ofTFIID to the yeast CYC1 TATA boxes in yeast occurs independently ofupstream activating sequences.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：11909-11913)。

来自合成的DNA序列中的启动子也可以包括同一DNA序列的多重的段。调节性DNA段的扩增具有优点地允许启动子对所要探测的信号的敏感度得以提高。

在酵母的接合过程中，转录因子Ste12p通过Ste12p与可被诱导的基因的启动子区内所谓“费洛蒙应答元件(pheromone responseelements)”(PREs)的结合来诱导费洛蒙应答基因的表达(Dolan etal.，(1989).The yeast STE12 protein binds to the DNA sequence mediatingpheromone induction.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5703-5707)。Hagen等人指出，串联式PREs足以激活两个接合型中单倍体特异基因的费洛蒙应答式表达(Hagen et al.(1991).Pheromone response elements arenecessary and sufficient for basal and pheromone-induced transcription ofthe FUSI gene of Saccharomyces cerevisiae.Mol.Cell.Biol.11：2952-2961)。PREs为带有通用序列TGAAACA的7bp长的元件(Kronstad et al.，(1987).A yeast operator overlaps an upstream activationsite.Cell 50：369-377)。

FIG1启动子中识别出对于Ste12p的三个假定结合位点(Harbisonet al.，(2004).Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome.Nature 431：99-104)。

FIG1启动子的反应时间可以通过较高数量的PREs来缩短。例如对于基因的正常活化剂区附加地或者替代地，可以利用带有FUS1调节区PREs的139bp长的片段或者PREs中容易地合成的聚簇(Hagen et al.1991)。这样具有优点地利用修饰过的FIG1启动子中的报告结构(Reporterkonstrukt)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记而获得标记基因更高的表达和对较低的费洛蒙浓度更佳的可反应性。同时达到该系统时间上更快的可反应性。

按照权利要求13的改进方案，在第二类型细胞内过表达转录活化剂Ste12p。Ste12p的过表达导致费洛蒙应答基因通过PREs扩大的表达，(Dolan und Fields(1990).Overproduction of the yeast STE12 proteinleads to constitutive transcriptional induction.Genes Dev.4：492-502)。具有优点的是，通过转录活化剂Ste12p的过表达也提高了处于依赖于费洛蒙的启动子控制下的特异基因的表达水平。

为结合各个PREs，Ste12p部分需要其他转录活化剂如Mcm1p因子(Hwang-Shum et al.，Jr(1991).Relative contributions of MCM1 andSTE12 to transcriptional activation of a-and α-specific genes fromSaccharomyces cerevisiae.Mol Gen Genet 227：197-204)。因此，按照权利要求14的改进方案，第二类型细胞内过表达Mcm1p。该因子的异源表达同样有助于提高处于依赖于费洛蒙的启动子控制下的特异基因的表达。

特异基因按照权利要求15的改进方案促成如下信息分子的形成，该信息分子与由第一类型细胞分泌的信号分子相区别。由此，可以具有优点地作为级联依次接入多个依据本发明的装置。

按照权利要求16的改进方案，特异基因编码标记蛋白质，标记蛋白质优选为荧光蛋白质，诸如GFP(绿荧光蛋白质)或者酶，诸如β-半乳糖苷酶。

借助标记蛋白质的指示系统例如GFP，可以在传感技术上对标记蛋白质的信号诱导式的形成进行检测(探测)。

本发明意义上的标记蛋白质是指如下的蛋白质，所述蛋白质的存在或活性导致可物理测量的变化。这种可物理测量的变化可以通过适用的指示系统简单和/或者快速地进行探测。优选使用这种能够被指示的标记蛋白质，而不损害细胞的完整性或活性，诸如酶，所述酶在存在底物的情况下催化显色反应，诸如β-半乳糖苷酶或者植酸酶。还优选荧光素酶作为标记蛋白质，其在存在适当底物的情况下发光。特别优选如下蛋白质作为标记蛋白质，所述蛋白质通过利用确定波长的光来激发而发出荧光。

此外，本发明包括如下蛋白酶作为标记蛋白质，该蛋白酶分解荧光蛋白质。如果酵母细胞同时在组成上表达荧光蛋白质，那么可以测得：第二类型细胞的荧光根据初级信号发生下降。优选使用除了荧光蛋白质外不对细胞内其他目标起作用的蛋白酶，以便不损害细胞的活性。特别优选使用TEV蛋白酶。相应的荧光蛋白质需要时必须借助重组的DNA技术以如下方式被改变，即所述荧光蛋白质含有对应于相应蛋白质的识别序列并且这样可以被分解。

按照权利要求17的改进方案，标记蛋白质为荧光蛋白质，其中，相应标记蛋白质的表达在信号分子分泌后通过第一类型细胞来改变，这导致了各自酵母细胞的荧光增加或者减少。优选使用荧光蛋白质GFP、YFP、CFP、BFP、RFP、DsRed、PhiYFP、JRed、emGFP(“EmeraldGreen”)、Azami-Green、Zs-Green或者AmCyanl。优选使用如下的蛋白质，所述蛋白质这样地发生改变，从而该蛋白质特别强烈地发出荧光，诸如eGFP、eYFP、TagCFP、TagGFP、TagYFP、TagRFP和TagFP365。此外，优选使用如下的荧光蛋白质，所述荧光蛋白质的氨基酸序列这样发生改变，即，所述荧光蛋白质尽可能迅速地在其形成之后开始发荧光。同样优选使用TurboGFP、TurboYFP、TurboRFP、TurboFP602、TurboFP635和dsRed-Express。

按照权利要求18的改进方案，特异基因编码作为标记蛋白质的如下荧光蛋白质，所述荧光蛋白质是绿色荧光蛋白质(例如GFP)、黄色荧光蛋白质(例如YFP)、蓝色荧光蛋白质(例如BFP)、青色荧光蛋白质(例如CFP)或者红色荧光蛋白质(例如dsRed)。

为尽可能及时监控，可以具有优点的是：相应的标记蛋白质通过附上导致蛋白质提高地“周转(Turn-over)”的序列而失稳。按照权利要求19的改进方案，所述标记蛋白质是具有受限制半衰期的荧光蛋白质。由此保证减少转录时迅速的反应时间。

这种受限制的半衰期例如可以通过改变N末端的氨基酸或者将信号序列引入由标记基因编码的蛋白质的氨基酸序列内来实现，由此，蛋白质的稳定性下降并且蛋白质的半衰期缩短。优选为由标记基因编码的蛋白质失稳而使用所谓的PEST区，该PEST区通过细胞的泛素系统导致蛋白质的迅速分解。这种PEST区从许多蛋白质中公知。优选使用酿酒酵母中G1细胞周期蛋白Cln2p的PEST区。为此，将Cln2p(序列编号4)的178羧基末端的氨基酸的进行编码的序列(序列编号3)和终止密码子附到标记基因的进行编码的序列的3′端上。

C1n2p-Pest-序列(序列编号3/4)：

GCATCCAACTTGAACATTTCGAGAAAGCTTACCATATCAACCCCATCATGCTCTTTCGAAAATTCAAATAGCACA

A S N L N I S R K L T I S T P S C S F E N S N S T

TCCATTCCTTCGCCCGCTTCCTCATCTCAAAGCCACACTCCAATGAGAAACATGAGCTCACTCTCTGATAACAGC

S I P S P A S S S Q S H T P M R N M S S L S D N S

GTTTTCAGCCGGAATATGGAACAATCATCACCAATCACTCCAAGTATGTACCAATTTGGTCAGCAGCAGTCAAAC

V F S R N M E Q S S P I T P S M Y Q F G Q Q Q S N

AGTATATGTGGTAGCACCGTTAGTGTGAATAGTCTGGTGAATACAAATAACAAACAAAGGATCTACGAACAAATC

S I C G S T V S V N S L V N T N N K Q R I Y E Q I

ACGGGTCCTAACAGCAATAACGCAACCAATGATTATATTGATTTGCTAAACCTAAATGAGTCTAACAAGGAAAAC

T G P N S N N A T N D Y I D L L N L N E S N K E N

CAAAATCCCGCAACGGCGCATTACCTCAATGGGGGCCCACCCAAGACAAGCTTCATTAACCATGGAATGTTCCCC

Q N P A T A H Y L N G G P P K T S F I N H G M F P

TCGCCAACTGGGACCATAAATAGCGGTAAATCTAGCAGTGCCTCATCTTTAATTTCTTTTGGTATGGGCAATACC

S P T G T I N S G K S S S A S S L I S F G M G N T

CAAGTAATATAG

Q V I ＊

将如下基因引入细胞内，优选引入酵母细胞内，所述基因处于信号分子特异性的启动子控制下并且编码标记蛋白质或者负责信号分子合成。在此，该基因在酵母细胞内可以处于染色体外的DNA分子上。优选为此使用酵母表达载体，其在酵母细胞分裂时稳定应答。特别优选上述的“高拷贝数(high copy number)”载体，其以大量的拷贝存在于酵母细胞内。作为选择地，也使用较少拷贝数量或者作为单个载体处于酵母内的载体，例如ARS-CEN载体或者使用酵母人工合成染色体(yeast artificial chromosomes)。

在另一种实施方式中，基因连同费洛蒙特异性启动子一起整合到酵母细胞的染色体DNA中。由此，具有优点地确保：该酵母细胞的所有后代同样含有处于特异性启动子控制下的标记基因。

依据本发明的探测和放大装置的优点是，由第一类型细胞接收的初级信号通过由此诱导的信号分子分泌以及信号分子对周围的应答第二类型细胞的作用而可以放大多倍。

在此，通过有针对性影响不同细胞类型的数量比例可以进一步提高放大效果。在细胞作为细胞混合物无规则分布的情况下，在此，第一类型细胞与第二类型细胞的比例为1比20，优选1比10，特别优选1比5。在粒状相或者层状相中各细胞类型适当的结构化分布的复合结构中，最佳的浓度比附加地是细胞彼此所选的空间设置的函数。

此外，以活细胞为基础的放大和传感系统的最大优点是所利用成分的天然再生。这一点特别是在过程的“在线监控(On-LineMonitoring)”或者也在“近线监控(Near-Line Monitoring)”方法中非常有益。

例如可以利用依据本发明的生物探测和放大装置，以便

-提早探测培养基内例如像磷酸盐、硫、氮等物质的限制水平或者例如像葡萄糖的碳源的限制水平，

-更加有效地指示出细胞由于应激因素所承受的负荷，应激因素例如是辐射或者化学试剂，

-提早探测例如像确定的代谢中间产物的目标分子的出现，

-更加有效地进行用于指示水性溶液中物质的生物检验。

按照权利要求20的改进方案，在第一和/或者第二和/或者第三接合型的酵母细胞内，切断费洛蒙表达的正常调节。例如，按照权利要求21的改进方案，酿酒酵母细胞的α细胞内的天然基因MFα1和MFα2是缺失的。按照权利要求22的改进方案，接合型a的酿酒酵母细胞内的天然基因MFA1和MFA2是缺失的。因此具有优点地确保：α因子或a因子仅在所要探测的初级信号存在的情况下形成和分泌。对第二类型细胞的次级影响得到消除。

按照权利要求23的改进方案，第一和/或者第二和/或者第三接合型内的酵母细胞内，对蛋白质Fig1p进行灭活。局部高浓度的费洛蒙在酵母细胞中引起细胞死亡。通过对Fig1p进行灭活来防止这种效应(Zhang.N-N.，et al.(2006)Multiple signaling pathways regulate yeastcell death during response to mating pheromones。Mol.Biol.Cell 17：3409-3422)。由此具有优点地防止：酵母细胞由于强初级信号引起的高浓度费洛蒙而死亡并因此对于所述方法不再可供使用(Zhang etal.，2006)。

按照权利要求24的改进方案，可通过初级信号调节的启动子是氮特异性、磷酸盐特异性或者硫特异性调节的启动子。所要放大的初级信号为氮缺乏、磷酸盐缺乏或者硫缺乏。

优选作为启动子使用如下的DNA段，其在由其控制的基因的起始密码子的5′侧包括最高至1000bp，或者使用该DNA段的亚片段，该亚片段能够例如根据氮、磷或者硫的限制水平来激活或者抑制处于该序列控制下的标记基因。

按照权利要求25的改进方案，氮特异性、磷酸盐特异性或者硫特异性调节的启动子从酿酒酵母基因YIR028W、YJR152W、YAR071W、YHR136C、YFL055W和YLL057C的启动子中选取。

其转录作为对相应限制水平应答大大提高的基因的启动子具有优点地为

-氮限制水平：YIR028W和YJR152W，

-磷酸盐限制水平：YAR071W和YHR136C，

-硫限制水平：YFL055W和YLL057C。

按照权利要求26的改进方案，细胞处于多孔的有机凝胶或者无机凝胶内，按照权利要求27的改进方案，细胞处于多孔和光学透明的二氧化硅干凝胶内。

具有优点的是，细胞固定在干凝胶内。干凝胶是例如通过蒸发或者吸走而失去其液体的凝胶。凝胶是形状稳定的、可略微变形的分散系统，由至少两种成分组成，它们大多由一种长或者大分支颗粒的固体物质(例如硅酸、明胶、胶原、多糖、果胶、特定的聚合物，例如像聚丙烯酸酯和通常称为增稠剂的其他胶凝剂)和一种作为分散剂的液体(大多为水)组成。在此，固体物质在分散剂内形成空间网络。在形成干凝胶时，网络的空间布置发生变化。

无机的或者生物上惰性的有机干凝胶埋入细胞的应用，有利地允许细胞在所产生的结构稳定的同时存活，因为所述干凝胶在毒物学和生物学上是惰性的并且总体上不被细胞分解。此外，所述干凝胶具有优点地实现了保证细胞存活的养分和保湿剂贮藏。

细胞具有优点地固定在多孔和光学透明的无机或者生物上惰性的有机干凝胶内。这种干凝胶优选为由二氧化硅、烃基化二氧化硅、二氧化钛、氧化铝或者它们的混合物组成的无机干凝胶。优选无机干凝胶优选通过溶胶-凝胶工艺制造。

为此首先要么通过在水或者水溶性有机溶剂(如乙醇)中相应的硅醇盐或者金属醇盐的酸性催化或者碱性催化的水解来制造硅纳米溶胶或者其他无机纳米溶胶。优选水解在水中进行，以防止溶剂对所要埋入的细胞产生毒性影响。在通过醇盐水解制造纳米溶胶时，反应过程中形成醇类，所述醇类随后通过导过惰性气流从所获得的纳米溶胶中蒸发并通过水替代。

通过使用不同醇盐的混合物，可以有针对性地影响基质特性。溶胶-凝胶基质具有优点地在使用金属如Al、Ti、Zr不同金属氧化物的情况下，通过共水解和共凝聚进行化学改性用于制造混合氧化物或者在Si原子带有有机残余的烃氧基硅烷，用于制造有机改性的硅氧化物凝胶。

所要埋入的细胞与产生的纳米溶胶混合。凝胶形成的过程优选通过提高温度、pH值中性化、浓缩或者添加催化剂(例如像氟化物)进行。但在此，温度不应提高到＞42℃的温度，以不损害所要埋入的细胞。在向凝胶内转移时，纳米溶胶由于聚集和三维横向交联而降低其表面积/体积比例。在纳米溶胶向所谓的水凝胶转变期间，细胞固定在所形成的无机网络内。能存活细胞的固定具有优点地通过细胞：氧化物之比以及通过添加造孔剂来控制。

细胞连同所埋入的细胞占所产生的干凝胶总量的份额根据应用可以为0.1至50％重量百分数。优选使用2至25％重量百分数的份额。

通过干燥从水凝胶排出尚被包含的溶剂。由此由水凝胶形成干凝胶。所形成的干凝胶具有高孔隙度，该高孔隙度允许与周围的介质进行快速的物质交换。干燥过程使凝胶剧烈收缩，从而导致对于所埋入细胞的应激。因此优选干燥步骤非常小心和缓慢地在低于40℃的温度下实施。

随着基质含水量的降低，所埋入细胞的生理活性和存活率下降。但过高的水含量导致低机械稳定性并减少结构的可保持性。

使用酵母细胞特别具有优点，因为酵母细胞对干燥具有高抗性并在水含量非常低的情况下也不失去其存活能力。由此可以制造非常干燥的干凝胶。

本发明还包括各种添加剂的应用，如可溶性有机盐，也就是有机碳酸或者硫酸盐的金属盐，或N-杂环的开链或者环状的铵盐和四价盐以及低分子的聚阴离子或者聚阳离子，或者水溶性有机化合物如聚碳酸、尿素衍生物、碳水化合物、多元醇，如甘油、聚乙二醇和聚乙烯醇，或者起到软化剂、保湿剂和气孔形成剂作用的明胶，其阻止溶胞并明显延长所埋入细胞的存活能力。

按照权利要求28的改进方案，带有细胞的二氧化硅干凝胶处于机械稳定性提高了的基底上。为此，无机干凝胶连同细胞安放在一个基底上。在与信号探测器，优选光电探测器的连接下，由此存在功能元件，其中，依赖于由生物可供支配的分析物产生的荧光通过光电探测器转换成电信号。在继续进行中，基底按照权利要求29的改进方案具有优点地是光导纤维、玻璃珠、平坦的玻璃载体或者玻璃的诸如空心球体、棒、管的其他成型体或者是陶瓷颗粒。

在此，细胞固定在多孔和光学透明的无机干凝胶例如二氧化硅干凝胶内。掺入微生物的二氧化硅干凝胶作为层借助公知的溶胶-凝胶过程沉积在玻璃珠、光导纤维、平坦的玻璃载体或者诸如空心球体、棒、管的其他成型体或者沉积在陶瓷颗粒上，方法是将纳米溶胶-细胞混合物涂覆在所要涂层的基底上或者将基底浸入纳米溶胶-细胞混合物内并随后将纳米溶胶通过干燥和由此产生的纳米溶胶浓缩而转移到干凝胶内。这些结构由此存在的机械稳定性允许将依据本发明的装置引入测量系统，该测量系统可以直接以近线(near-line)诊断方式所要检查的反应室(发酵容器)连接。

按照权利要求30的改进方案，细胞是至少部分围成一空腔的壳层结构(Hüllenstruktur)的组成部分。也就是说，单个或者多个细胞封装在具有多孔壳层的该空腔内。纳米孔隙度具有优点地允许与周围进行物质交换。在继续进行中，壳层结构按照权利要求31的改进方案，具有优点地由具有生物水凝胶的内层及多孔且光学透明的二氧化硅干凝胶外层的主体组成，其中，这些层至少区域式地涂覆。

在此，细胞埋入壳层结构内(复式埋入)。内壳层由生物水凝胶例如藻酸盐组成，而外壳层则为多孔的干凝胶层，优选为无机的干凝胶层，特别优选为二氧化硅的干凝胶层。生物水凝胶具有优点地在利用二氧化硅溶胶涂覆的后续过程中使细胞稳定并因此提高细胞的存活概率。这种复式埋入具有优点地可以在利用纳米标绘仪(Nanoplotter)的情况下借助序列涂层进行。这种结构的机械稳定性允许将依据本发明的装置以近线(near-line)诊断的方式装入所要检查的反应室(发酵容器)内。

细胞按照权利要求31的改进方案埋入分级多孔结构的组织内，从而除了无机凝胶典型的纳米孔隙度外，该组织附加地被相互连接的间隙孔穿过，间隙孔的直径典型地在100nm至100μm之间变化并可以在周围与所埋入的细胞及其诸如酶的反应产物之间进行物质交换。

由此，第一类型细胞和第二类型细胞以及需要时第三类型细胞可以具有优点地在不同层内涂覆到基底上。通过纳米孔隙度既可以使特异性的初级信号到达处于传感器外层内的第一类型细胞，也可以使由这些细胞分泌的费洛蒙到达第二和/或者第三类型细胞，第二和/或者第三类型细胞处于第一类型细胞下面的层内，该层与信号探测器直接接触。

在三种酵母细胞类型在层内的空间布置方面，存在三种基本选择，即，呈细胞混合物地细胞分布；呈复合结构的细胞分布，其中，该复合结构由具有不同细胞分布的结构组成部分组成；或者是作为依赖于深度三种细胞类型连续变化的分梯度的层系统。

I.细胞混合物

类型1和类型2以及需要时类型3的细胞以预先考虑的用量比，为调整所追求的放大率而固定在一个固定的基质内或者可选地以统计学上无规则的分布引入水性溶液内。

这种细胞混合物的优点在于各个细胞之间信号分子交换的运输路程短以及传感材料统计学上的均一性。缺点可能来自类型1的细胞(设置在传感材料的深处)对外部初级信号的可达到性十分有限。

利用三种细胞类型在细胞混合物内实现的浓度比，能以所要求的方式调整放大率。

II.复合结构

复合结构可以选择性地由颗粒或者单层组成(单层亦参见图3)。

颗粒内各自固定一种或者两种细胞类型。通过彼此适当布置颗粒以及适当选择颗粒内细胞的混合比以及颗粒彼此的混合比，可以调整放大率：具有优点的是，为有效接收外部的初级信号，提高复合结构外部区域内含有细胞类型1的颗粒的比例。含有细胞类型1和3的颗粒用于预放大外部的初级信号。含有细胞类型1和2或者3和2的颗粒用于终端放大和转换成所要读出的物理信号、化学信号或者生化信号。

在将三种细胞类型布置在层系统中时设置有类似的方式。在这种情况下，在单个层内也埋入一种或者两种细胞类型。含有细胞类型1的层具有优点地也布置在复合结构的外部区域内，以确保外部初级信号的有效接收。含有细胞类型1和3的单个层用于预放大外部的初级信号。含有细胞类型1和2或者3和2的单个层用于终端放大和转换成所要读出的物理信号、化学信号或者生化信号。这些层能以平坦的几何形状安放在适当的载体上。但层状的同心的结构布置以及无规则弯曲载体的涂层也是本发明的主题。

III.分梯度的层

分梯度的层是细胞在层系统中不连续的分布向细胞混合物的一种过渡，方法是通过适当的涂层策略，实现外部空间的三种细胞类型(优选类型1细胞和类型3细胞)的浓度分布向读出结构(优选类型2和类型3的细胞)一定程度上连续的变化。分梯度的层将依据本发明的装置内部有效接收初级信号的优点和生物细胞间信号分子尽可能短的输送路径集于一身。

此外，使用微型绘图仪具有优点的是，第一、第二和需要时第三类型的细胞以一空间布置彼此涂覆在形状稳定的基底上，这附加地有助于该方法的放大效果(参见图2)。由此，既可以通过选择第一类型细胞相对于第二类型细胞的用量比以及需要时相对于第三类型细胞的用量比，也可以通过选择细胞的彼此设置来有针对性地影响放大。

图2和3示意地示出固定的酵母的几种布置。

按照权利要求33的改进方案，在第一和/或者第二和/或者第三类型细胞内，对Afr1p蛋白质(Alpha-Factor Receptor Regulator 1)进行灭活。

作为对费洛蒙诱导的应答，激活细胞内大范围的接合程序(“接合应答途径(mating response pathway)”)(Leberer et al.，(1997).Pheromone signaling and polarized morphogenesis in yeast.CurrentOpinion in Genetics&Development 7：59-66.)。诱导接合特异性的基因并阻滞细胞周期。随后细胞定向生长(接合突出(Projektion))朝向费洛蒙源进行，例如接合配偶(Jackson et al.(1991).S.cerevisiae αpheromone receptor activate a novel signal transduction pathway formating partner discrimination.Cell 67：389-402.；Jackson et al.(1993)Polarization of yeast cells in spatial gradients of α-mating factor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8332-8336)。

酵母细胞的这种“伸展”也称为“梨形(Shmoo)”(Mackay undManney，(1974).Mutation affecting sexual conjugation and relatedprocesses in Saccharomyces cerevisiae.I.Isolation and phenotypiccharacterization of nonmating mutants.Genetics 76：255-271)。

Afr1p(“alpha factor receptor regulator”)负责酿酒酵母接合期间“梨形(Shmoo)”突出的构成(Konopka，(1993).AFR1 acts inconjunction with the alpha-factor receptor to promote morphogenesis andadaptation.Mol Cell Biol.13：6876-6888)。Δafr1-突变体(Mutanten)不会再构成正常的接合突出。但Δafr1-突变体(Mutanten)此外相对于利用α因子的刺激却表现出正常的敏感度(Konopka，1993)。因此，可以利用AFR1基因的缺失，以防止酵母细胞通过“梨形(Shmoo)”突出从埋入基质中渗出，而不会妨碍到费洛蒙信号途径，这是因为其中蛋白质被灭活的细胞虽然还可以接收费洛蒙信号，但不再构成接合突出(发育(Ausknospung))并不能再根据对费洛蒙的探测与其他接合型的酵母细胞融合。这样具有优点地防止依据本发明方法的细胞根据特异性的初级信号和由此导致的费洛蒙的发出而不能正常生长并损害它们所埋入的基质。此外，所述细胞不能相互融合并因此对该方法无关紧要。

为了AFR1读码框的缺失，优选使用HIS⁵⁺缺失盒，其通过双重同源重组来替代基因组内的AFR1读码框。为此，HIS⁵⁺盒在5′侧和3′侧借助SFH-PCR(SFH，“短侧翼同源区(short flanking homologyregion)”)按照Wach等人的(Wach et al.(1997)Heterologous HIS3marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomycescerevisiae.Yeast 13：1065-1075)设有AFR1基因的40bp长的侧翼序列。

α因子通过酿酒酵母的特异蛋白酶Bar1p裂解并因此灭活。Bar1p被分泌并对酵母细胞的正确接合来说是必要的。其中Bar1p被灭活的MATa细胞相对于α因子表现出明显提高的敏感度。为提高放大系统的敏感度和反应时间，按照权利要求34的改进方案，使用如下细胞，在所述细胞中，Bar1p蛋白质被灭活或相应基因是缺失的(Ballensiefen Wand Schmitt H.D.(1997)Periplasmic Barl protease of Saccharomycescerevisiae is active before reaching its extracellular destination.Eur JBiochem 247(1)：142-7；Chan R.K.and Otte C.A.(1982)Physiologicalcharacterization of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1arrest by a factor and alpha factor pheromones.Mol Cell Biol 2(1)：21-9；Barkai N，et al.(1998)Protease helps yeast find mating partners.Nature396(6710)：422-3；Sprague G.F.Jr and Herskowitz I.(1981)Control ofyeast cell type by the mating type locus.I.Identification and control ofexpression of the a-specific gene BAR1.J Mol Biol 153(2)：305-21)。

按照权利要求35的改进方案，作为酵母细胞使用如下的细胞，所述细胞在基因方面发生改变，使其生长可以得到有针对性的控制。这一点具有优点地允许：使制造依据本发明的装置所需数量的酵母细胞用量在所谓的许可条件下使用并在将酵母细胞埋入基质后，使酵母细胞通过调整限制条件阻止继续分裂。由此具有优点地避免由于细胞在基质内部的营养性生长而施加的压力，该压力既有损于装置的可保持性，也对所固定的细胞施加应激和对细胞生命力产生不利影响。

优选使用如下的酵母细胞，在所述酵母细胞中，影响细胞周期的基因的活性可以有针对性控制。特别优选如下的酵母细胞，在所述酵母细胞中，CDC28基因的活性可以有针对性控制。CDC28基因为酵母细胞进行分裂所需。如果该基因不存在，那么酵母细胞虽然可以存活，但不继续分裂。

基因活性的控制例如通过所谓的打开的Tet系统进行。在此，内源的CDC28基因缺失的酵母细胞(所谓的Δcdc28-细胞)利用DNA结构转化，使其包含处于tet应答启动子控制下的CDC28基因的编码序列。该结构同时包含基本启动子控制下反义四环素控制的转激活剂(rtTA)的编码序列。

这种在基因上改变的酵母细胞始终表达反义四环素控制的转激活剂。这种转激活剂只能在四环素抗生素例如像多西环素存在的情况下与tet应答的启动子结合并抑制处于tet应答启动子控制下的基因的表达。为使用这些细胞，为培养基添加四环素抗生素并由此创造许可条件。在将酵母细胞埋入干凝胶时或之后，洗除四环素抗生素并由此产生对于酵母的限制条件。反义四环素控制的转激活剂不再能激活CDC28基因的表达。因此，酵母细胞不能再继续分裂。

按照权利要求36的改进方案，作为酵母细胞使用细胞周期(cdc：细胞分裂周期(cell division cycle))酵母-突变体，该突变体在许可温度下正常生长和在限制温度下调节生长。因此公知酿酒酵母中CDC28基因的多种温度敏感(ts)的等位基因。例如识别六种不同的ts等位基因，这些ts等位基因允许酵母在23℃时正常生长，但在37℃时阻止生长(

and Reed，1986)。此外公知的还有这种温度敏感的突变，在突变时，许可的温度高于限制的温度。人们称其为冷敏感(coldsensitive，cs)突变。

具有优点的是，通过在许可温度下使用这种突变体首先可以产生所需的生物量，而酵母细胞则在限制温度下对生长进行调节。如果将这种突变体用于依据本发明的装置，那么在温度敏感的突变体中，细胞在25℃下可以具有优点地一直达到所要求的生物量并然后被埋入。在例如37℃的限制温度下(该温度对大肠杆菌(Escherichia coli)的发酵是理想的)酵母不再生长，尽管这些细胞生理上是活性的(

A.and Reed，S.I.Sequence analysis of temperature-sensitive mutations in theSaccharomyces cerevisiae gene CDC28.Mol.Cell.Biol.(1986)6：4099-4103)。优选应用携带温度敏感的等位基因cdc28-4、cdc28-6、cdc28-9、cdc28-13、cdc28-16、cdc28-17、cdc28-18和cdc28-19的酵母。

对于酵母应在例如像室温的低温下使用的应用情况，使用冷敏感的突变体，这种突变体在高温下培养并且在埋入后保持在低温下并且于是不再具有分裂活性。

按照权利要求37，细胞与至少一个电磁射线源和至少一个光电探测器以如下方式耦合，使电磁射线照到细胞上并且通过光电探测器测量荧光。

按照权利要求38的改进方案，光电探测器为具有光敏电阻、光敏二极管或者光敏晶体管的固体影像传感器并且该固体影像传感器与数据处理系统接在一起。

固体影像传感器是一种作为光电接收器的光电子半导体组件平面的和矩阵式的布置。细胞的颜色及其强度可以转换成相当的电信号，从而可以在数据处理系统中进行处理。

按照权利要求39的改进方案，细胞至少处于透明测量单元(Messzelle)内的表面上。此外，该测量单元具有用于输入和排出介质的装置。

按照权利要求40的改进方案，所述测量单元与加热装置耦合。

电磁射线源和光电探测器按照权利要求41的改进方案以如下方式设置，使由粒子发出的电磁射线投射(abbilden)到光电接收器上。

按照权利要求42的改进方案，信号探测器是光电探测器。光电探测器是具有光敏电阻、光敏二极管或者光敏晶体管的固体影像传感器，其中，该光电探测器与数据处理系统接在一起。固体影像传感器是作为光电接收器的光电子半导体组件的平面的和矩阵式的布置。酵母细胞的颜色及其强度可以转换成相当的电信号，从而可以在数据处理系统中进行处理。

按照权利要求43的改进方案，在电磁射线源后面和/或者光电探测器前面的光路中，设置有至少一个形成射线的光学装置或者至少一个影响射线的光学装置或者设置有它们的组合。由此酵母细胞的光线可以聚焦到光电探测器上，从而也对于弱光变化给出可靠评估。

按照权利要求44的改进方案，酵母细胞与光学辐射源以如下方式耦合，使得辐射到达酵母细胞上和酵母细胞发出荧光。辐射源优选提供作为可见光的电磁射线以及作为红外线或者紫外线内相邻的波长范围的光的电磁射线。电磁辐射源优选发射限定波长的光。辐射源的波长根据荧光蛋白质的激发光谱来确定。

此外，本发明的组成部分还包括一种按权利要求48所述的、用于在利用细胞情况下探测和放大初级信号的方法，即如下的方法，其中，

a)第一类型细胞内，负责信号分子合成的基因处于通过初级信号调节的启动子的控制下，

b)第二类型细胞内，特异基因处于由所分泌的信号分子调节的启动子控制下，

从而

-通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导信号分子分泌，以及

按照权利要求49的改进方案，附加

c)利用第三类型细胞，在第三类型细胞中，负责信号分子合成的基因处于如下启动子的控制下，所述启动子通过由第一类型细胞分泌的信号分子来调节，

从而

-通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导第一细胞中信号分子分泌，

-通过信号分子由第一类型细胞分泌，而在第三类型细胞内诱导信号分子分泌，以及

用在依据本发明的方法中的组成部分的特殊构成方案依据如按权利要求3至44所述依据本发明的装置的特征特殊构成方案的方式来实施。因此，按照权利要求50的改进方案，该方法在使用具有权利要求3至44之一中至少一个特征的、至少一个装置的情况下实施。

附图说明

下面借助附图和实施例对本发明进行详细说明。在此：

图1示出依据实施例1的接合型α和接合型a基因技术上改变的酿酒酵母酵母细胞的示意图；

图2示出用于借助酵母的费洛蒙系统放大信号的装置。

确定细胞量的固定利用纳米标绘仪进行。

根据确定的初级信号(例如介质内养分的限额)产生酵母费洛蒙α因子的第一类型细胞在表面上(例如载玻片)被第二类型细胞同心包围(A-C)。第二类型细胞内，将编码GFP(绿色荧光的蛋白质)的标记基因置于可费洛蒙诱导的启动子，优选为FIG1启动子的控制下(A-C)。在酵母费洛蒙的诱导情况下，导致标记基因的表达并因此导致第二类型细胞的荧光(B-C)。费洛蒙的表达依赖于限制水平。因此在限制水平低时第二类型细胞直接在第一类型细胞的周围显现荧光(B)，限制水平高时比较远的细胞也显现荧光(C)；

图3示出不同密度传感细胞的示意层结构

作为对由第一类型细胞形成的α因子应答的第二类型细胞产生可读信号(“激活的应答细胞”)固定在传感表面上(A、C)。第一类型细胞份额较高时，费洛蒙的发出导致比第一类型细胞份额较小时(D)更强的信号(B)。这种层系统也能以金字塔状结构组合；

图4示出依据实施例3的附加信号放大的示意图。

具体实施方式

实施例1：在使用酵母费洛蒙系统下的信号放大

接合型α的酿酒酵母酵母细胞作为第一类型细胞借助受体对输入的初级信号进行识别。受体直接或者通过中间连接的信号级联诱导启动子的转录。在启动子的控制下，编码α因子的MFα1克隆读码框，从而接合型α的酵母细胞作为对输入的初级信号的应答将费洛蒙α因子分泌到周围。

下面，第一类型这种酵母细胞的制造举例对用于监控可供支配的生物磷的应用进行说明。第一类型的酵母细胞(传感细胞)在这种情况下敏感地对磷的限制水平做出反应。基因YAR071W在磷限制水平时，被较强地转录(Boer et al.，(2003).The genome-wide transcriptionalresponses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in acrobicchemosstat cultures limited for carbon，nitrogen，phosphorus or sulfur.J.Biol.Chem.278：3265-3274)。上调基因YAR071W的包括1000个碱基对的、处于上游的区域借助表2中序列编号5和序列编号6的特异引物在酿酒酵母基因组DNA中的PCR内进行扩增。通过引物，该序列扩展了Sac I的5′侧识别序列和在3′侧扩展了Spe I的识别序列。借助这些识别序列，定向装入下面称为p426YAR071W的“高拷贝数(highcopy-number)”载体p426内。在第二步骤中，将MFα1基因的读码框克隆到质粒p426YAR071W内。为此，MFα1读码框的序列利用酿酒酵母基因组DNA中序列编号7和序列编号8(参见表2)的引物扩增，该引物将片段在5′侧扩增了Spe I酶切位点并且在3′侧扩增了Sac I酶切位点。然后，将该片段利用所谓的限制性酶切位点克隆到下面称为p426YAR071W-MFa1pha1的载体p426YAR071W内。克隆片段的正确序列借助DNA序列分析进行检验和证实。载体p426包括用于在ura-营养缺陷型(auxotrophen)菌株中选择的、来自酿酒酵母的Ura3标记。产生的结构p426YAR071W-MFa1pha1例如转化酵母菌株BY4742(MATα、his3Δ1、len2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0)并选择阳性转化体(Transformanden)。在磷限制水平时，在带有质粒p426YAR071W-MFa1pha1的传感细胞中，特异性诱导α因子的表达。

表2：用于制造传感质粒p426YAR071W-MFa1pha1的引物。基因组目标序列同源区域加粗标出。限制性核酸内切酶的识别序列被下画线。

相同菌株中正常编码α因子的基因MFα1和MFα1是缺失的。因此，确保α因子仅在所要探测的初级信号存在的情况下形成和分泌。

为了例如在酵母菌株BY4742(MATα、his3Δ1、len2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0)中缺失MFα1和MFα1的读码框，使用natMX6或hphMX6标记盒，该标记盒对抗生素诺尔斯菌素(Nourseothricin)或匀霉素(Hygromycin)B具有抗性。natMX6盒在SFH-PCR内借助表3中序列编号9和序列编号10的引物扩增。引物的5′区(各50个碱基)与酿酒酵母基因组内MFα1读码框的侧翼序列同源。引物的3′区(20bp)与natMX6盒的末端同源。作为SFH-PCR的DNA模板使用质粒pFA6a-natMX6。随后利用SFH-PCR片段转化酵母细胞。所述片段通过加倍同源的重组而稳定地整合到基因组中的转化体根据含有诺尔斯菌素的介质来选择并借助诊断PCR来证实缺失盒正确的整合。然后，在所产生的Δmfα1-酵母菌株内进行MFα2读码框的缺失。为此，与第一缺失类似地，SFH片段利用序列编号11和序列编号12的引物(参见表3)和hphMX6盒(DNA模板pFA6a-hphNX6)扩增并转化Δmfα1-酵母细胞。引物的5′侧区与酿酒酵母基因组内MFα2读码框的侧翼序列同源。阳性转化体的选择根据含有匀霉素B的培养基进行选择并借助诊断PCR检验Δmfα1-Δmfα2酵母菌株内匀霉素抗性盒(Resistenzkassette)正确的整合。

表3：为了酿酒酵母MFα1和MFα2读码框缺失的引物。无标记引物序列表示与酿酒酵母基因组DNA同源的区域。与缺失盒同源的区域加粗表示。

作为第二类型细胞处于相同配方内的接合型a的酿酒酵母酵母细胞如下修饰，使其含有处于FIG1启动子控制下编码EGFP的读码框。

为此在使用引物Fig1-for(序列编号1)和Fig1-rev(序列编号2)(参见表1)的情况下FIG1开放的读码框的1000bp 5′侧进行PCR扩增、纯化，利用限制性核酸内切酶SacI和SpeI切割并克隆到酿酒酵母载体p426内。这样产生的载体(p426FIG1)被酶SαlI和EcoRI切割。

编码EGFP的读码框借助引物EGFPEcofor(序列编号13)和EGFPSalrev(序列编号14)进行PCR扩增并利用酶SαlI和EcoRI切割出744bp大的片段，进行纯化，并且连接到载体p426FIG1内。

表4：EGFP开放读码框扩增的引物。加粗印刷的字母限制EGFP基因的编码读码框。斜体表示限制性核酸内切酶EcoRI或SalI的识别序列，该识别序列用于克隆到载体p426FIG1内。头六个碱基用于保护引物。

克隆读码框的DNA序列通过DNA序列分析验证。因此，载体p426FIG1-EGFP可供酵母细胞的转化使用。制备的载体转化接合型a的酵母细胞如上面对于接合型α的酵母细胞所述情况那样进行。

编码a因子的基因(MFA1和MFA2)是缺失的，以便消除对α细胞的次级作用。缺失与对于基因MFα1和MFα2所介绍的方法类似地进行。

如果在诱导特异性调节的启动子后，然后所形成和分泌的α因子达到周围的接合型a的酿酒酵母酵母细胞，那么在这些细胞内借助FIG1启动子强力诱导编码GFP的读码框转录。这一点在可利用传感技术读出的酵母细胞的绿色荧光中产生。绿色荧光的强度可与包围α细胞的细胞数量成正比地提高。

实施例2：附加的信号放大

作为第一类型细胞，接合型α酿酒酵母酵母细胞基因上的修饰如实施例1所述地进行。

作为第二类型细胞，接合型a酿酒酵母酵母细胞如实施例1所述地改变。

作为第三类型细胞，接合型a的细胞进行如下修饰，使其作为另外的放大器起作用。为此，将编码费洛蒙α因子的读码框置于FIG1启动子的控制下。

为此FIG1启动子进行PCR扩增并如实施例1中所介绍的那样克隆到酵母载体p426内。随后将基因MFα1插入FIG1启动子的3′侧的同一载体内。

如果初级通过信号分子的作用分泌的α因子达到周围的a细胞(第三类型细胞)，那么在这些细胞内通过FIG1启动子的诱导形成其他α因子分子，也就是进一步放大(图4)。放大的程度可以通过选择α接合型细胞和a接合型细胞的比例进行确定(图1)。

Claims

1.用于探测和放大初级信号的装置，所述装置包括

a)第一类型细胞，在所述第一类型细胞中，负责信号分子合成的基因处于由初级信号调节的启动子的控制下，

b)第二类型细胞，在所述第二类型细胞中，特异基因处于由所分泌的信号分子调节的启动子的控制下，

从而

-通过第一类型细胞接收的初级信号来诱导信号分子的分泌，以及

-所述初级信号借助所述第二类型细胞中所述特异基因受信号分子控制的表达而得以放大。

2.按权利要求1所述的装置，其特征在于，还

c)包括第三类型细胞，在所述第三类型细胞中，负责信号分子合成的基因处于如下启动子的控制下，所述启动子通过由所述第一类型细胞分泌的信号分子得以调节，

从而

-通过由所述第一类型细胞接收的初级信号来诱导所述第一细胞中信号分子的分泌，

-通过信号分子由第一类型细胞分泌，而在第三类型细胞内诱导信号分子分泌并使所述初级信号预放大，以及

-所述初级信号借助所述第二类型细胞中所述特异基因受信号分子控制的表达而通过得以放大。

3.按权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述第一类型的细胞、第二类型的细胞和/或者第三类型的细胞是酵母细胞。

4.按权利要求3所述的装置，其特征在于，所述酵母细胞是酿酒酵母(Schizosaccharomyces cerevisiae)细胞和/或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞。

5.按权利要求1至4任一项所述的装置，其特征在于，将所述第一类型细胞利用基因技术进行改变，从而所述第一类型的细胞表达对应初级信号特异性的受体系统。

6.按权利要求1至5任一项所述的装置，其特征在于，将所述第二类型细胞利用基因技术进行改变，从而所述第二类型细胞表达对应信号分子特异性的受体系统。

7.按权利要求1至6任一项所述的装置，其特征在于，信号分子是费洛蒙。

8.按权利要求1至7任一项所述的装置，其特征在于，所述第一类型细胞是α-接合型的酿酒酵母细胞、a-接合型的酿酒酵母细胞或者二倍体的酿酒酵母细胞。

9.按权利要求1至8之任一项所述的装置，其特征在于，所述第二类型细胞是α-接合型的酿酒酵母或者a-接合型的酿酒酵母细胞。

10.按权利要求2至9任一项所述的装置，其特征在于，所述第三类型细胞是a-接合型的酿酒酵母或者α-接合型的酿酒酵母细胞。

11.按权利要求2至10任一项所述的装置，其特征在于，在所述第一类型细胞和所述第三类型细胞中编码所述费洛蒙的基因是酿酒酵母的MFα1基因、MFα2基因、MFA1基因或者MFA2基因。

12.按权利要求7至11任一项所述的装置，其特征在于，由所述费洛蒙调节的启动子是酿酒酵母的F1G1启动子。

13.按权利要求7至12任一项所述的装置，其特征在于，在所述第二类型细胞内，过表达转录活化剂Ste12p。

14.按权利要求7至13任一项所述的装置，其特征在于，在所述第二类型细胞内，过表达转录活化剂Mcm1p。

15.按权利要求1至14任一项所述的装置，其特征在于，所述特异基因负责如下信号分子的形成，信号分子与由所述第一类型细胞分泌的信号分子相区别。

16.按权利要求1至15任一项所述的装置，其特征在于，所述特异基因编码标记蛋白质。

17.按权利要求1至16任一项所述的装置，其特征在于，所述特异基因编码荧光蛋白质。

18.按权利要求1至17任一项所述的装置，其特征在于，所述特异基因编码绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)、青色荧光蛋白质(CFP)或者红色荧光蛋白质(dsRed)。

19.按权利要求1至18任一项所述的装置，其特征在于，所述特异基因编码具有受限制的半衰期的荧光蛋白质。

20.按权利要求7至19任一项所述的装置，其特征在于，在所述第一类型细胞和/或者所述第二类型细胞和/或者所述第三类型细胞中，阻断费洛蒙表达的正常调节。

21.按权利要求20所述的装置，其特征在于，α-接合型的酿酒酵母内的天然基因MFα1和MFα2是缺失的。

22.按权利要求20或21任一项所述的装置，其特征在于，a-接合型的酿酒酵母内的天然基因MFa1和MFa2是缺失的。

23.按权利要求7至22任一项所述的装置，其特征在于，在所述第一类型细胞和/或者所述第二类型细胞和/或者所述第三类型细胞内对蛋白质Fig1p进行灭活。

24.按权利要求1至23任一项所述的装置，其特征在于，能由初级信号调节的所述启动子是氮特异性调节的启动子、磷酸盐特异性调节的启动子或者硫特异性调节的启动子。

25.按权利要求24所述的装置，其特征在于，所述氮、磷酸盐或者硫特异性调节的启动子选自酿酒酵母的基因YIR028W、YJR152W、YAR071W、YHR136C、YFL055W和YLL057C的启动子。

26.按权利要求1至25任一项所述的装置，其特征在于，所述细胞处于多孔的有机凝胶或者无机凝胶内。

27.按权利要求26所述的装置，其特征在于，所述细胞处于多孔和光学透明的二氧化硅干凝胶内。

28.按权利要求27所述的装置，其特征在于，带有所述细胞的所述二氧化硅干凝胶处于机械稳定性提高了的的基底上。

29.按权利要求28所述的装置，其特征在于，所述基底为光导纤维、平面的玻璃载体、玻璃珠或玻璃的诸如空心球体、棒、管的其他成型体中至少一个，或者为陶瓷颗粒。

30.按权利要求1至29任一项所述的装置，其特征在于，所述细胞是至少部分地围成一空腔的壳层结构的组成部分。

31.按权利要求30所述的装置，其特征在于，所述壳层结构由具有生物水凝胶内层和多孔无机凝胶外层的主体组成，其中，所述这些层至少区域式地涂覆。

32.按权利要求1至31之一所述的装置，其特征在于，将所述细胞埋入具备分级多孔结构的组织内，从而除了对于无机凝胶典型的纳米孔隙度外，所述组织还被相互连接的间隙孔穿过，所述间隙孔的直径典型地在100nm至100μm之间变动并且在周围与所埋入的所述细胞以及所述细胞的诸如酶的反应物之间实现物质交换。

33.按权利要求3至32任一项所述的装置，其特征在于，在所述第一类型细胞和/或者所述第二类型细胞和/或者所述第三类型细胞内，对蛋白质Afr1p进行灭活。

34.按权利要求7至33任一项所述的装置，其特征在于，在所述第一类型细胞和/或者所述第二类型细胞和/或者所述第三类型细胞内，对蛋白质Bar1p进行灭活。

35.按权利要求3至34任一项所述的装置，其特征在于，使用细胞周期(cdc：细胞分裂周期)突变体作为酵母细胞，所述细胞周期突变体在许可条件下正常生长并且在限制条件下对生长进行调节。

36.按权利要求35所述的装置，其特征在于，使用温度敏感性的细胞周期(cdc：细胞分裂周期)突变体作为酵母细胞，所述细胞周期突变体在许可温度下正常生长并且在限制温度下对生长进行调节。

37.按权利要求1至36任一项所述的装置，其特征在于，所述细胞与至少一个电磁射线源和至少一个光电探测器以如下方式耦合，即，电磁射线照到细胞上并且通过光电探测器来检测荧光。

38.按权利要求37所述的装置，其特征在于，所述光电探测器是具有光敏电阻、光敏二极管或者光敏晶体管的固体影像传感器，并且所述固体影像传感器与数据处理系统接在一起。

39.按权利要求1至38任一项所述的装置，其特征在于，所述细胞至少处于透明的测量单元内的表面上，并且所述测量单元具有用于输入和排出介质的装置。

40.按权利要求1至39之一所述的装置，其特征在于，所述测量单元与加热装置耦合。

41.按权利要求1至40之一所述的装置，其特征在于，电磁射线源和光电探测器以如下方式设置，即，由粒子发出的电磁射线投射到光电接收器上。

42.按权利要求1至41之一所述的装置，其特征在于，所述信号探测器是作为光电探测器的固体影像传感器，所述固体影像传感器与数据处理系统接在一起。

43.按权利要求41或42所述的装置，其特征在于，至少一个形成射线的或者至少一个影响射线的光学装置或者所述光学装置的组合件位于电磁射线源之后和/或者光电探测器之前的光路中。

44.按权利要求41至43任一项所述的装置，其特征在于，所述细胞与光学辐射源以如下方式耦合，即，辐射到达所述酵母细胞上。

45.按权利要求1至44任一项所述的装置在探测培养基中养分的限制水平中的应用。

46.按权利要求1至44任一项所述的装置在指示细胞所承受应激物导致的负荷中的应用。

47.按权利要求1至44之一所述的装置在指示水性溶液中的物质中的应用。

48.用于探测和放大初级信号的方法，其中，

a)在第一类型细胞内，负责信号分子合成的基因处于由所述信号调节的启动子的控制下，

b)在第二类型细胞内，特异基因处于由所分泌的信号分子调节的启动子控制下，

从而

-通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导信号分子的分泌，以及

-所述初级信号借助所述第二类型细胞中所述特异基因受信号分子控制的表达而得以放大或者转换。

49.按权利要求48所述的方法，其特征在于，

c)利用第三类型细胞，在所述第三类型细胞中，负责信号分子合成的基因处于如下启动子的控制之下，所述启动子通过由所述第一类型细胞分泌的信号分子得以调节，

从而

-通过由第一类型细胞接收的初级信号来诱导所述第一细胞中信号分子的分泌，

-通过信号分子由所述第一类型细胞分泌而在所述第三类型细胞内诱导信号分子分泌，以及

50.按权利要求48或49所述的方法，其特征在于，所述方法在利用具有权利要求3至44任一项中至少一个特征的、至少一个装置情况下实施。