CN102796735B - 基于酵母dna损伤响应的生物传感器元件盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1及其构建方法，本发明还公开了用元件盒构建基于酵母DNA损伤响应的生物传感器的方法，涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的监测。将该生物传感器元件盒应用于通过基因技术改造得到的复合DNA损伤超高敏感型七基因缺失面包酵母突变株中，可提高该生物传感器元件和的敏感性。因此，与现有技术相比，本发明具有对遗传毒性致癌物检测灵敏度高、适用于环境中低剂量存在的化学遗传毒性致癌物的检测、对环境污染物的检测范围广，操作简便等优点。该生物传感器的发明可促进环境有害物质实时监测平台的建立。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境化学污染物的监测。
背景技术
面包酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好，适合作为一种模式生物应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中，面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视，一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。
遗传毒性致癌物是指能与DNA反应，引起DNA损伤而致癌的化学致癌物，可用生物化学试验或间接地应用遗传毒性试验方法来鉴定遗传毒性致癌物，包括直接致癌物和间接致癌物。
遗传毒性致癌物的检测对于环境监测及保护有重大的现实意义。构建一个检测DNA损伤的生物传感器系统，除宿主细胞外，需具备以下两个基本元件：感应元件和连接于此后的效应元件。前者利用其自身功能可对DNA损伤进行响应，并开启后者的表达，从而产生可检测出的信号。将这两个元件组合在一起的基因片段称为生物传感器元件盒。
核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase, RNR）是催化核糖核酸转变为脱氧核糖核苷酸为DNA 合成和修复提供所需dNTPs 的限速酶。核糖核苷酸还原酶 (RNR)在DNA 的复制和修复中具有重要的作用，维持着细胞的脱氧核糖核酸库存，并因此在细胞周期过程中被严格控制以确保DNA 复制的高保真。酵母细胞中所存在的RNR包含有四种亚单位（RNR1、RNR2、RNR3、RNR4），其中RNR3编码核糖核苷酸还原酶大亚基，非酶活力所必需，在细胞正常生长条件下几乎无表达，一旦机体DNA发生损伤或合成受到抑制时，可诱导其及时大量表达。研究表明酵母RNR3可为DNA损伤的紧急修复提高大量dNTPs，RNR3 转录后mRNA受DNA损伤诱导表达量可增加100多倍。这一特点使RNR3可作为制备生物传感器的感应元件。
绿色荧光蛋白（GFP）是从水母中分离出的天然生物发光蛋白，其性质稳定，无需添加任何底物及辅助因子，即在紫外或蓝光的激发下发出绿色荧光。它在细菌、真菌、植物和动物细胞中表达时都能发出荧光, 具有活体、原位、实时表达的特点。而酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）是一种密码子优化后的增强型绿色荧光蛋白，它可在酵母细胞中增强表达。对比此前广泛使用的编码B-gal半乳糖苷酶的报告基因lacZ，GFP具有直接用于活体细胞检测，并可克服利用酶作为报告基因的一系列缺点（破坏酵母细胞壁，影响酶活显色的因素复杂等），使检测手段多样、自动化等一系列优点。利用绿色荧光蛋白作为制备生物感应器的效应元件，使得环境中遗传毒性致癌物测评体系更有利地向高通量，快速，便捷的阶段发展。
利用SOE法（Gene Splicing by Overlap Extension）进行PCR基因片段拼接，即通过PCR过程中基因片段的交错延伸实现拼接。该方法是利用PCR 技术在体外进行有效的基因重组, 而且不需要内切酶消化和连接酶处理, 该技术使用简易。由于引物只需要与模板有效结合, 尤其是5’端序列不必与模板完全配对, 因此扩增引物的5’端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆。
流式细胞技术是分析细胞中的一个重要领域, 该技术为细胞学研究手段之一, 能够对细胞和细胞器及生物大分子进行高达每秒上万个细胞个体的分析, 而且一个细胞多参数分析并可分选细胞。这种以流动的方式(相对静态方式) 测量细胞与传统的用荧光镜检测细胞比较, 具有速度快,精度高, 准确性好的特点。
发明内容
本发明的目的是，提供一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒及其构建方法，其核心内容是构建生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1，并将该生物传感器元件盒转入复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中进行应用，可检测多种遗传毒性致癌物，大大提高该生物传感器对检测环境中遗传毒性化学物质的敏感性，扩大其检测应用范围，增强其检测的应用潜力。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
（一）、一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒 RNR3-yEGFP-CYC1的构建方法为：
（1）提取野生型面包酵母基因组DNA，通过特异性引物，以面包酵母基因组DNA为模板，PCR扩增得到RNR3启动子基因片段；
（2）提取质粒PUG36，通过特异性引物，以该质粒为模板，PCR扩增得到yEGFP编码区基因片段；
（3）提取质粒PUG36，通过特异性引物，以该质粒为模板，PCR扩增得到终止子CYC1基因片段；
（4）利用SOE法，通过特异性引物，以上述三个基因片段共同为模板，PCR扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒 RNR3-yEGFP-CYC1；
（二）、将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒 RNR3-yEGFP-CYC1转入复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中，应用于遗传毒性致癌物的检测：
（1）将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒 RNR3-yEGFP-CYC1转入到复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株基因组中，形成敏感的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5ΔradΔmag1Δ-RNR3-yEGFP-CYC1；
其中复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株是在对氧化损伤高敏感性的五基因缺失面包酵母突变株（专利申请号：2010105941713）的基础上，敲除与DNA损伤修复有关的MAG1和RAD1基因，获得缺失yap1 cwp1 cwp2 snq2 pdr5 rad1 mag1七基因的面包酵母突变株。
（2）基于酵母DNA损伤响应的生物传感器对遗传毒性致癌物的响应，可利用流式细胞仪技术、荧光显微镜或荧光分光光度计，通过测定绿色荧光蛋白表达的变化情况从而对遗传毒性致癌物进行检测。
本发明的优点与效果：
基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1关键性优点在于，它使检测操作更简便，人为误差小，可直接观察，可以灵活使用多种检测手段，具有发展为大批量乃至高通量的遗传毒性致癌物环境实时现场监测的潜力。
与宿主为野生型酵母株相比，本发明中宿主为复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器，对各类型遗传毒性化学物质的响应敏感度均有明显提高。对于甲磺酸甲酯(MMS)在极低浓度下（25ppm）的检测灵敏度提高至35倍；对过氧化氢在0.6 mM浓度下的检测灵敏度提高至7倍；对腐草霉素（Pleomycin）在2.5μg/ml浓度下的检测灵敏度提高至10倍；宿主为野生型面包酵母的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器，不能检测到低浓度的叔丁基过氧化氢（t-BHP）及DNA损伤剂4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）引起的DNA损伤信号，而宿主为复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器均可检测到这两种致DNA氧化损伤化合物，并且有较高的检测灵敏度。因此基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1在复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因突变株中的应用可提高其检测灵敏度并扩大其检测范围，使其更有利于今后发展为对环境遗传毒性致癌物的在线实时监测平台中的核心技术。
表1、基于酵母DNA损伤响应的生物传感器与四种现有的生物传感器对五种遗传毒性致癌物检测灵敏度的比较分析，
附图说明
图1、基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1应用于不同面包酵母基因突变株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测灵敏度的比较。
图中横坐标表示DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的浓度；纵坐标表示基于酵母DNA损伤响应的生物传感器对 DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)检测所得到的相对荧光强度诱导倍数；—●—曲线表示基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1应用于宿主为野生型面包酵母中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果；—s—曲线表示于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1应用于宿主为复合DNA损伤超高敏感型面包酵母七基因缺失突变株中对DNA烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)的检测结果。
具体实施方式
一、 制备基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒的方法，该方法包含下列步骤：
1、从野生面包酵母中提取基因组DNA
1a、取野生面包酵母，接种于YPD培养液中，在30℃，200转/分钟的条件下，振荡培养16小时，得到野生面包酵母菌液；
其中：YPD培养液的配方重量百分比为：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者为水；
1ｂ、取野生面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物悬于200微升提取缓冲液中；
其中：提取缓冲液的配方为： 曲拉通X-100 2%,十二烷基磺酸钠1%, 氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔, 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔, 余者为水，pH 8.0；
1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，取上层液体；
1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；
1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为野生酵母基因组DNA；
2、扩增RNR3启动子基因片段
野生酵母基因组DNA作为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物RNR3 Pro-2: 5’TTA GAC ATT TGT GTG GGA GTA TTT GAT T 3’，利用PCR技术，扩增得到RNR3启动子基因片段（600bp）；
3、扩增yEGFP编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段
质粒PUG36（美国ATCC公司提供）作为扩增模板，通过上游引物yEGFP-1: 5’CCA CAC AAA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3’和下游引物yEGFP-2: 5’TAC ATG ACT TTG TAC AAT TCA TCC ATA C 3’，利用PCR技术，扩增得到yEGFP编码区基因片段（750bp）；
质粒PUG36作为扩增模板，通过上游引物CYC1-1: 5’TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到终止子CYC1基因片段（260bp）；
4、扩增基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段
用RNR3启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段及终止子CYC1基因片段按照摩尔比1:1:1的比例为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段；
上述PCR 的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 5分钟。
二、用基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段构建基于酵母DNA损伤响应的生物传感器，该构建方法包含下列步骤：
（1）、在五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母（专利申请号为2010105941713）的基础上，再敲除与DNA损伤修复有关的MAG1和RAD1基因，获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，步骤如下：
1a、将质粒 
mag1:: hisG -URA3-hisG（参考文献：Jin Chen, et al.（1990）Saccharomyces cerevisiae 3-methyladenine DNA glycosylase has homology to the AlkA glycosylase of E.co1i and is induced in response to DNA alkylation damage. The EMBO Journal， vol.9，pp. 4569-4575）用限制性内切酶EcoRⅠ和BgalⅡ进行酶切，得到敲除组件mag1
::hisG -URA3-hisG；
1b、将敲除组件用醋酸锂转化方法转入对氧化损伤高敏感性的面包酵母中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株；
1c、 将质粒
rad1::Blast（来源于Dr. E. Perkins NIESH, NC, USA）用限制性内切酶SalI进行酶切，得到敲除组件rad1
::hisG -URA3-hisG，将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，该突变株即为缺失yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ七个基因的面包酵母；
（2）将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体（美国Thermo公司提供）上,利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切进行连接，得到克隆pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1；
（3）、将克隆pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1用BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切，得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1片段，再克隆到pM4366载体中（参考文献：W.P. Voth. et al. (2001) Yeast vectors for integration at the HO locus. Nucleic Acids Res. Vol. 29, E59-9.）,用Not1内切酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO，；
（4）、将 HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO 片段转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中，筛选得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ-RNR3-yEGFP-CYC1，上述转入与筛选方法包含下列步骤：
4a、将复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株接种到1毫升YPD培养液，30℃，200转/分钟振荡条件下，培养16小时；
4b、再加入YPD培养液2毫升, 30℃，200转/分钟,培养4小时；
4c、取1毫升复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株菌液，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
4d、将沉淀物悬于100毫摩/升的400微升醋酸锂中，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
4e、将沉淀物悬于100毫摩/升的100微升醋酸锂中；
4f、将2.0毫克/毫升的鲑鱼精单链DNA 1微升煮沸5分钟,冰浴后与片段 HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO 0.1～1微克一起加入到步骤3e的醋酸锂中，室温放置5分钟；
4g、再加入280微升浓度为50%的聚乙二醇4000；
4h、振荡至混匀，30℃静置45分钟；
4i、加入39微升二甲基亚砜，42℃热激5分钟；
4j、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，并将沉淀物悬于200微升无菌水中；
4k、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，悬于100微升无菌水中，然后再涂于SD-Ura营养缺陷型培养基平板，30℃培养箱中培养3天，生长出单菌落，该单菌落即基于酵母DNA损伤响应的生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5ΔradΔmag1Δ-RNR3-yEGFP-CYC1；
其中SD-Ura选择性平板的配方为：酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17 %,硫酸铵0.5%，葡萄糖2%,腺嘌呤0.2%,色氨酸1%,组氨酸1%,亮氨酸1%,赖氨酸1%，琼脂粉2%，余者为水；
三、基于酵母DNA损伤响应的生物传感器用于检测遗传毒性致癌物的方法，该方法包含下列步骤：
1、将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母株接种于YPD培养液中，30℃，200转/分钟下振荡培养16小时；
2、将过夜培养的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母株菌液用新鲜的YPD选择性培养液稀释到细胞密度OD600为0.1；
3、取1毫升稀释后的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母株菌液,加入DNA损伤烷化剂甲基磺酸甲酯（MMS），培养8小时；
4、取200微升基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母株菌液，4000转/分钟 离心2分钟，弃上清，取沉淀物；加入200微升0.1M PBS溶液，悬浮沉淀物；再次4000转/分钟 离心2分钟，弃上清，取沉淀物；加入500微升0.1M PBS溶液，悬浮沉淀物；
其中0.1M PBS溶液配方为：称取8克氯化钠，0.2克氯化钾，3.68克十二合磷酸一氢钠，0.24克磷酸二氢钾，溶于双蒸水中，用氢氧化钠调节pH值为7.4，定容至1升；
5、加入1毫克每毫升的溴化丙啶（PI）溶液3微升，混匀，置于冰上，黑暗保存直至使用流式细胞仪进行检测；
6、用流式细胞仪对样品进行检测， 同时设定FITC及PE两激光通道；
7、用Flow Jo流式数据分析软件输出分析数据，数据中的Mean值即检测样品的平均荧光强度数值；
8、按照步骤1至步骤7的方法测定未经甲基磺酸甲酯（MMS）处理的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母溶液平均荧光强度数值，作为空白对照；
9、当经甲基磺酸甲酯（MMS）处理的基于酵母DNA损伤响应的生物传感器酵母溶液平均荧光强度数值与空白对照的平均荧光强度数值之比大于2时表明基于酵母DNA损伤响应的生物传感器检测出DNA损伤信号。
Claims (1)
1.一种基于酵母DNA损伤响应的生物传感器的构建方法，其特征在于，该构建方法包含下列步骤：
a、敲除五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中的MAG1和RAD1基因，上述五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母为敲除了yap1、cwp1、cwp2、snq2和pdr5的面包酵母，获得复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，步骤如下：
a1、将质粒 
mag1:: hisG -URA3-hisG用限制性内切酶EcoRⅠ和BgalⅡ进行酶切，得到敲除组件mag1 
::hisG -URA3-hisG；
a2、将敲除组件用醋酸锂转化方法转入上述五基因缺失的对氧化损伤高敏感性的面包酵母中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到六基因缺失的面包酵母突变株；
a3、 将质粒rad1::Blast用限制性内切酶SalI进行酶切，得到敲除组件rad1 
::hisG -URA3-hisG，将敲除组件用醋酸锂转化方法转入六基因缺失的面包酵母突变株中，发生同源重组，通过SD-Ura选择性平板筛选得到复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株，该突变株即为缺失yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ七个基因的面包酵母；
b、将基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段克隆到pBluescipt载体上,利用PstI内切酶和EcoR1内切酶酶切进行连接，得到克隆子pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1，其中RNR3-yEGFP-CYC1基因片段的构建按如下步骤：
（1）从野生面包酵母中提取基因组DNA
1a、取野生面包酵母，接种于YPD培养液中，在30℃，200转/分钟的条件下，振荡培养16小时，得到野生面包酵母菌液；
其中：YPD培养液的配方重量百分比为：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，余者为水；
1ｂ、取野生面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物悬于200微升提取缓冲液中；
其中：提取缓冲液的配方为： 曲拉通X-100 2%,十二烷基磺酸钠1%, 氯化钠0.1摩尔,乙二胺四乙酸1毫摩尔, 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔, 余者为水，pH 8.0；
1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，取上层液体；
1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；
1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为野生酵母基因组DNA；
（2）扩增RNR3启动子基因片段
用野生酵母基因组DNA作为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物RNR3 Pro-2: 5’TTA GAC ATT TGT GTG GGA GTA TTT GAT T 3’，利用PCR技术，扩增得到RNR3启动子基因片段；
（3）扩增yEGFP编码区基因片段以及终止子CYC1基因片段
质粒PUG36作为扩增模板，通过上游引物yEGFP-1: 5’CCA CAC AAA TGT CTA AAG GTG AAG AAT T 3’和下游引物yEGFP-2: 5’TAC ATG ACT TTG TAC AAT TCA TCC ATA C 3’，利用PCR技术，扩增得到yEGFP编码区基因片段；
质粒PUG36作为扩增模板，通过上游引物CYC1-1: 5’TGT ACA AAG TCA TGT AAT TAG TTA TGT C 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到终止子CYC1基因片段；
（4）扩增基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段用RNR3启动子基因片段、yEGFP编码区基因片段及终止子CYC1基因片段按照摩尔比1:1:1的比例为扩增模板，通过上游引物RNR3 Pro-1: 5’AA CTG CAG CAA GCA CAT AAA AAA TCA G 3’和下游引物CYC1-2: 5’TCCG GAA TTC GGT ACC GGC CGC AAA TTA AAG 3’，利用PCR技术，扩增得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器元件盒RNR3-yEGFP-CYC1基因片段；
上述PCR 的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 5分钟；
c、将克隆pBluescipt-RNR3-yEGFP-CYC1用BamH1内切酶和EcoR1内切酶进行酶切，得到两端酶切位点为BamH1和EcoR1的基因片段，再克隆到pM4366载体中,用Not1内切酶切下片段HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO；
d、将 HO-hisG-URA3-hisG-RNR3-yEGFP-CYC1-HO 片段用醋酸锂转化方法转入复合DNA损伤超敏感型面包酵母七基因缺失突变株中，通过SD-Ura选择性平板筛选得到基于酵母DNA损伤响应的生物传感器yap1Δcwp1Δcwp2Δsnq2Δpdr5Δrad1Δmag1Δ-RNR3-yEGFP-CYC1酵母株。
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