WO2022096479A1 - Nachweis von umwelteinflüssen mittels biolumineszenz - Google Patents

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WO2022096479A1
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nucleic acid
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luxa
luxb
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PCT/EP2021/080449
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Jan Borlinghaus
Martin Gruhlke
Jana Reiter
Alan Slusarenko
Michael Eberhard Ries
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Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen
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    • C12Y114/14003—Alkanal monooxygenase FMN (1.14.14.3), i.e. bacterial-luciferase
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    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid comprising a contiguous nucleotide sequence containing: (i) a gene encoding LuxA, (ii) a gene encoding LuxB, (iii) a gene encoding LuxC, ( iv) a gene that codes for LuxD, (v) a gene that codes for LuxE, wherein each of the genes is under the control of a promoter heterologous to the respective gene, and wherein all genes including the promoter are lined up in a single nucleotide sequence .
  • the invention further relates to vectors and host cells comprising the nucleic acid. Also described are methods for producing a host cell of the invention and methods and uses for detecting an environmental impact and a corresponding kit.
  • a luciferase catalyzes the oxygen-consuming reaction of luciferin to form a luciferase-bound peroxy-luciferin intermediate, which releases its excess energy by emitting light.
  • luciferases such as the Renilla luciferase from Renilla reniformis, the firefly lu- ciferase from Photinus pyralis or the bacterial luciferases, eg from Vibrio, Photobacterium or Photorhabdus luminescens in bioanalysis has already been described (Bhaumik & Gambhir, 2002; Contag et al., 1995; Contag et al., 1998).
  • the bacterial luciferase is a heterodimer and is encoded by the genes luxA and luxB (Foran & Brown, 1988).
  • the genes luxC, luxD, and luxE code for a transferase (LuxD) and a synthethase/reductase (LuxCE), which are necessary for the synthesis of the aldehyde substrate required in the light reaction. These genes are part of the bacterial /ux operon (Close et al., 2009).
  • An inducible reporter system can be established by introducing a luciferase fused to a regulatory DNA sequence, which only induces expression of the luciferase when a specific stimulus is present. Such a system can be automated and used for high-throughput screening.
  • the inventors were unexpectedly able to show that the combination of all genes of the / ux operon on a single nucleic acid, with all genes each having their own promoter and terminator, is advantageous over the luciferase systems described in the prior art, making the technical problem has been solved.
  • the present invention therefore relates to a nucleic acid comprising a contiguous nucleotide sequence containing: (i) a gene encoding LuxA, (ii) a gene encoding LuxB, (iii) a gene encoding LuxC, (iv) a gene that codes for LuxD, (v) a gene that codes for LuxE, each of the genes being under the control of a promoter heterologous to the respective gene, and wherein all genes and promoter are lined up in a single nucleotide sequence are.
  • heterologous promoter is a eukaryotic promoter.
  • the heterologous promoters preferably mediate approximately the same level of expression.
  • Each gene can be followed by a terminator.
  • LuxA and LuxB are preferably from Photorhabdus luminescens or Vibrio harveyi, preferably P. luminescens.
  • the genes encoding LuxA (i) and LuxB (ii) are preferably present as a gene luxAB encoding the LuxA/LuxB fusion protein and where LuxA and LuxB are preferably linked by a linker.
  • the fusion protein or the gene which codes for the fusion protein is under the control of its own heterologous promoter and can thereby replace genes (i) and (ii) including their associated heterologous promoters in the nucleic acid of the invention.
  • LuxA preferably has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 1 or a functional fragment thereof.
  • LuxB preferably has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 2 or a functional fragment thereof.
  • LuxC, luxD and luxE are preferably from P. luminescens.
  • LuxC preferably has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 3 or a functional fragment thereof.
  • LuxD preferably has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 4 or a functional fragment thereof.
  • LuxE preferably has an amino acid sequence which is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 5 or a functional fragment thereof.
  • the nucleic acid preferably additionally comprises (vi) a gene which codes for an NADPH-flavin oxidoreductase.
  • the NADPH flavin oxidoreductase is preferably frp, preferably from V. harveyi, wherein the NADPH flavin oxidoreductase preferably has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5 %, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 6 or a functional fragment thereof.
  • the nucleic acid preferably does not contain an internal ribosomal entry site (IRES) and/or self-cleaving peptides, e.g., 2A peptides, between any of genes (i) to (vi).
  • IRS internal ribosomal entry site
  • self-cleaving peptides e.g., 2A peptides
  • LuxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are preferably under the control of a regulatable promoter, the promoter preferably being regulatable by an environmental stimulus (where the environmental stimulus) is preferably selected from the group consisting of drugs, drugs, hormones, environmental toxins, bioavailable Connections and physical influences.
  • an environmental stimulus is preferably selected from the group consisting of drugs, drugs, hormones, environmental toxins, bioavailable Connections and physical influences.
  • LuxC, luxD, luxE and optionally the NADPH flavin oxidoreductase can be expressed constitutively or under the control of a regulatable promoter, with the promoter of luxC preferably being the 7"EF2 promoter, the promoter of luxD preferably being the CDC79 promoter is, the promoter of luxE is preferably the E/V02 promoter and/or the promoter of the NADPH flavin oxidoreductase is preferably the PDC1 promoter In one embodiment, luxC, luxD, luxE and optionally are the NADPH flavin oxidoreductase under the control of an inducible promoter.
  • the present invention further relates to a vector, e.g., a plasmid, comprising the nucleic acid of the invention.
  • a vector e.g., a plasmid
  • the present invention further relates to a host cell comprising the nucleic acid of the invention or the vector of the invention, which host cell is preferably a eukaryotic host cell.
  • the host cell is a yeast, preferably a yeast selected from the group consisting of Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp.
  • the nucleic acid of the invention may be integrated into a chromosome of the host cell.
  • the present invention further relates to a method for producing a host cell of the invention comprising introducing the nucleic acid of the invention or the vector of the invention into a host cell.
  • the present invention further relates to a method for detecting an environmental exposure comprising: (i) contacting an environmental sample with the host cell of the invention; (ii) determining the luminescence of the host cell; wherein luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are under the control of a regulatable promoter that is regulated by the environmental stimulus and wherein a change in bioluminescence compared to a control sample is indicative of the presence of the environmental stimulus, the environmental stimulus preferably being selected from the group consisting of medicines, drugs, hormones, environmental toxins, bioavailable compounds and physical influences.
  • the present invention further relates to use of a host cell of the invention as a biosensor or in a method for detecting an environmental impact of the invention or for detecting protein-protein interactions.
  • the present invention further relates to the use of a host cell of the invention as a vitality sensor, where the reduction or loss of bioluminescence is indicative of reduced vitality of the host cell.
  • the present invention also relates to a kit comprising the nucleic acid of the invention, the vector of the invention or the host cell of the invention.
  • FIG. 1 shows the measurement of the luminescence (black) and the growth (grey) of the S. cerev/s/ae strain BY4742, which contains a nucleic acid according to the invention with the plasmid pRS426-Lux.
  • FIG. 2 shows the bioluminescence of the host cell of the invention.
  • the CSM-URA plates were photographed in daylight (A) and in total darkness (B).
  • C is a schematic representation of the invention.
  • D shows a comparison of the host cell of the invention ("prototype", upper line) with the firefly luciferase (middle line) as well as the empty vector pRS426 (lower line).
  • FIG. 3 shows a luminescence measurement of S. cerevisiae (dark line) and the ODeoo (light line) which was transformed with the plasmids pRS426-Leu2-LuxAB and pRS426-L//'a3-LuxCDE-frp.
  • Figure 4 shows the course of the luminescence at different concentrations of leucine and controls (water, LIRA and histidine).
  • FIG. 5 shows an example of a nucleic acid according to the invention based on the pRS426 plasmid (cf. also SEQ ID NO: 7).
  • Figure 6 shows an exemplary plasmid encoding firefly luciferase (SEQ ID NO: 20).
  • Figure 7 shows two exemplary plasmids encoding LuxA/B (SEQ ID NO: 22) and LuxC/D/E (SEQ ID NO: 21) on two different plasmids.
  • the group of Xu et al. reported that they had developed a bioluminescent reporter that could detect dioxins and dioxin-like substances.
  • the /ux operon and frp were placed under the control of a dioxin-sensitive promoter and the individual genes were connected to one another via different viral 2A elements in order to enable expression using a single promoter.
  • the 2A peptides are used because of their small sequence size (54 - 174 bp) (Xu et al., 2018). However, the use of these sequences also has some crucial disadvantages. Thus, the 2A peptide remains as a C-terminal extension on the upstream product, and the N-terminus of the downstream product is supplemented with the amino acid proline.
  • This C-terminal extension can result in the conformation of the protein being impaired, which can limit or even completely lose its activity (Minskaia et al., 2013).
  • the C-terminal sequence of the upstream gene can completely inhibit the cleavage of the 2A peptide. This can lead to aggregation of the proteins in the organism (Minskaia et al., 2013).
  • IRES sequences were used to bicistronically express luxE and frp and luxD and luxC.
  • LuxAB and luxCDE + frp were also cloned on their own vectors (Gupta et al., 2003).
  • IRES sequences have even greater disadvantages compared to 2A peptides. These sequences offer the ribosomes an additional binding site and recruit the ribosomes independently of those inhibited by the virus elongation factors (Pelletier & Sonenberg, 1988). However, the required binding factors differ from cell to cell.
  • the protein encoded downstream by the IRES is usually only expressed to 20% - 50% in contrast to the protein encoded upstream (Mizuguchi et al., 2000).
  • the nucleic acid of the invention differs from the prior art in that, on the one hand, all genes of the /ux operon are contained on a single nucleic acid and that each of the genes of the /ux operon is under the control of its own promoter.
  • Host cells comprising the nucleic acid of the invention can be used for a variety of different purposes, which we will discuss below.
  • FIG. 2D shows the comparison of the two plasmids pRS426-Lux, i.e. the nucleic acid according to the invention, and pRS426-FBA1::Firefly from the prior art, which have the same regulatory elements, during growth in the corresponding deficiency medium.
  • pRS426-Lux i.e. the nucleic acid according to the invention
  • pRS426-FBA1::Firefly from the prior art, which have the same regulatory elements, during growth in the corresponding deficiency medium.
  • no luciferin was added externally, while in the firefly plasmid excess luciferin had to be added.
  • the luminescence signal of the firefly luciferase decreases very rapidly as the luciferin is simply consumed.
  • the bacterial luciferase generates a constant signal that is more than twice as strong (Fig. 2D).
  • FOI is the ratio of the average luminescence signal at time t to a negative control, also referred to as the backlight.
  • Xu et al. receive a maximum value of 13.8 FOI. Calculating the FOI for the highest value obtained in this disclosure (Fig.
  • a further advantage of the bacterial Lux system according to the invention is that the substrate can be produced by the host cell itself. Working time and costs can be reduced by eliminating the need to add and purchase luciferin.
  • the present invention accordingly relates to a nucleic acid comprising a contiguous nucleotide sequence containing: (i) a gene which codes for LuxA, (ii) a gene encoding LuxB, (iii) a gene encoding LuxC, (iv) a gene encoding LuxD, (v) a gene encoding LuxE, each of said genes being under the control of a to the respective gene is heterologous promoter, and wherein all genes including promoter are lined up in a single nucleotide sequence.
  • the nucleic acid thus contains all the essential genes that enable bioluminescence.
  • the nucleic acid is continuous, i.e. all genes are located on a single, continuous nucleic acid. In other words, they are included along with the promoter lined up in a single nucleotide sequence.
  • this does not necessarily rule out the possibility that non-coding regions or genes that do not originate from the lux operon can be located between the individual genes.
  • this does not necessarily mean that the order of genes (i) to (vi) as described herein must be present in the order of their numbering on the nucleic acid.
  • the nucleic acid contains genes that code for the /ux operon.
  • the genes responsible for prokaryotic bioluminescence were identified by Engebrecht et al. (1983) isolated and characterized from Vibrio harveyi. These are referred to as the "lux operon" throughout this disclosure.
  • the genes contained in the /ux operon are designated luxC, luxD, luxE, luxA, and luxB.
  • the bacterial luciferase is a heterodimer formed by LuxA and LuxB (Foran and Brown, 1988).
  • LuxA and LuxB can be from Photorhabdus luminescens or Vibrio harveyi, with LuxA and LuxB preferably being from P. luminescens.
  • LuxA has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 1 or a functional fragment of it is.
  • LuxB has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 2 or a functional fragment of it is.
  • Another embodiment relates to a nucleic acid according to the present invention, wherein the genes encoding LuxA (i) and LuxB (ii) are present as a gene luxAB encoding the LuxA/LuxB fusion protein, and wherein LuxA and LuxB preferably linked by a linker.
  • LuxA and LuxB are present as a fusion protein (LuxA/LuxB fusion protein).
  • a linker e.g. a serine-threonine linker or a serine Arginine linker, preferably a serine-arginine linker.
  • the fusion protein or the gene which codes for the fusion protein is under the control of its own heterologous promoter and can thereby replace genes (i) and (ii) including their associated heterologous promoters in the nucleic acid of the invention.
  • An exemplary fusion protein of LuxA and LuxB is shown in SEQ ID NO:8.
  • the LuxA/LuxB fusion protein may be under the control of an FBA 7 promoter (eg as shown in SEQ ID NO:13).
  • the LuxA/LuxB fusion protein can also be under the control of the OS/7 promoter (eg as shown in SEQ ID NO: 19).
  • the present invention accordingly also relates to a nucleic acid comprising a contiguous nucleotide sequence containing: (i) a gene encoding a LuxA/LuxB fusion protein, (iii) a gene encoding LuxC, (iv) a A gene encoding LuxD, (v) a gene encoding LuxE, each of the genes being under the control of a promoter heterologous to the respective gene, and all of the genes including the promoter being lined up in a single nucleotide sequence.
  • the other genes of the /ux operon luxC, luxD, and luxE code for a transferase (LuxD) and a synthetase/reductase (LuxCE), which ensure that the aldehyde substrate required for the light reaction is present in sufficient quantities ( Close et al., 2009).
  • the aldehyde substrate for bacterial luciferase is also referred to as bacterial luciferin in this context.
  • the lux operon is also the basis of other bioluminescent bacteria such as Photobacterium phosphoreum (Dunlap, 2014).
  • LuxC, LuxD and LuxE are preferably from P. luminescens.
  • LuxC has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 3 or a functional fragment of it is.
  • LuxD has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 4 or a functional fragment of it is.
  • LuxE has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 5 or a functional fragment of it is.
  • a NAPDH flavin oxidoreductase can additionally be overexpressed or additionally expressed. This may be included on an additional nucleic acid or on the nucleic acid of the invention.
  • the nucleic acid of the invention (vi) comprises a gene encoding an NADPH flavin oxidoreductase.
  • the NADPH flavin Oxidoreductase frp preferably frp from Vibrio harveyi.
  • the NADPH flavin oxidoreductase has an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 6 or a functional fragment thereof.
  • a "functional fragment” in the context of the present invention means a fragment of the respective protein that has an activity of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% of the unmodified protein, i.e. the sequence mentioned in this disclosure. Determining the activity of a protein is within the skill of the artisan. For this purpose, the activity, e.g. the luminescence, between the respective reference sequence and the fragment to be tested can be compared under otherwise identical conditions.
  • Nucleic acid as used herein describes macromolecules made up of individual building blocks, the nucleotides, which contain the genetic information in all organisms. Alternating simple sugars and phosphoric acid esters form a chain, with a nucleobase attached to each sugar.
  • the nucleic acid can be DNA or RNA, with DNA being preferred. When a nucleic acid is expressed, it results in the production of the peptide or protein encoded by that gene.
  • each of the genes is under the control of a (own) promoter heterologous to the respective gene.
  • the respective heterologous promoter is preferably a eukaryotic promoter.
  • the promoters of the individual genes (i) to (v) or (i) to (vi) can be the same, but are preferably different.
  • at least one promoter is different from the other promoters used, more preferably at least two promoters are different from the other promoters, the two promoters also being different from each other, still more preferably at least three promoters are different from the other promoters, the three promoters also being different from one another, most preferably all promoters used being different from one another.
  • the term eukaryotic promoter can include synthetic promoters.
  • the term eukaryotic promoter may include the cauliflower mosaic virus 35S promoter or other viral promoters.
  • “Expression level” in this context means the amount (e.g. number) of the transcribed mRNA and/or the amount (e.g. mass) of the translated proteins. "Same” in this context may include a difference of 25% or less, 10% or less, or 5% or less.
  • PCR can be used to compare the amount of mRNA transcribed from the same gene, e.g. gfp, depending on different promoters.
  • a gene which codes for a fluorescent protein such as GFP can be placed under the control of various promoters and the respective fluorescence can be determined as a function of the promoter.
  • the bioluminescence mediated by the expression products of the nucleic acid of the invention can be used to detect a wide variety of factors, e.g., environmental influences.
  • luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are preferably under the control of a regulatable promoter.
  • regulatable can mean the induction of gene expression or the repression of gene expression with regard to an environmental influence.
  • the regulatable promoter is thus preferably regulatable by an environmental influence.
  • luxC, luxD, luxE and optionally the NADPH oxidoreductase are already expressed before the expression of the luciferase luxA/luxB.
  • luxC, luxD, luxE and optionally the NADPH flavin oxidoreductase can be constitutively expressed or under the control of a regulatable promoter.
  • luxC, luxD, luxE and optionally the NADPH flavin Oxidoreductase under the control of an inducible promoter.
  • the promoters of luxC, luxD, luxE and optionally the NADPH flavin oxidoreductase are preferably different from the (inducible) promoters of luxA and luxB.
  • the promoter of luxC is preferably the TEF2 promoter (eg as shown in SEQ ID NO: 9), the promoter of luxD is preferably the CDC79 promoter (eg as shown in SEQ ID NO: 10), the promoter of luxE is preferably the EA/02 promoter (eg as shown in SEQ ID NO: 11) and/or the NADPH flavin oxidoreductase promoter is preferably the PDCf promoter (eg as shown in SEQ ID NO: 12).
  • a "terminator” or “transcriptional terminator” can be used to refer to a section of a genetic sequence on DNA that marks the end of a gene or operon because it leads to the termination (termination) of transcription.
  • terminators are e.g. the TEF2 terminator (such as shown in SEQ ID NO: 14), the CDC79 terminator (such as shown in SEQ ID NO: 15), the EA/02 terminator (such as shown in SEQ ID NO : 16), the PDC1 terminator (e.g. as shown in SEQ ID NO: 17) or the FBA 7 terminator (e.g. as shown in SEQ ID NO: 18).
  • the nucleic acid of the invention need not contain an IRES sequence or a 2A peptide sequence.
  • the internal ribosomal entry site, or IRES for short is a specifically folded section of the secondary structure of an RNA single strand that mediates binding to ribosomes.
  • translation can be initiated independently of the 5′ cap structure, for example also from the middle of a messenger RNA (mRNA).
  • mRNA messenger RNA
  • 2A self-cleavage peptides or 2A peptides constitute a class of 18-22 amino acid peptides that can induce cleavage of a recombinant protein in a host cell.
  • 2A peptides are derived from the 2A region of foot-and-mouth disease virus.
  • the nucleic acid of the invention does not contain an IRES sequence and/or a 2A peptide sequence between any of genes (i) to (vi).
  • the present invention further relates to a vector comprising the nucleic acid of the invention.
  • a "vector” or also “plasmid” refers to a nucleic acid that is suitable as a transport vehicle for transferring a foreign nucleic acid (eg DNA) into a (living) host cell by transfection or transduction. Exemplary for this can be mentioned the pRS426 plasmid, which is described eg in (Mumberg et al., 1995) et al. is described.
  • the vector preferably contains one or more origins of replication that allow for propagation or persistence in a host cell. These can be adapted by the person skilled in the art depending on the intended host cell.
  • a vector according to the invention is shown in SEQ ID NO: 7 by way of example.
  • nucleic acid or vector of the invention Methods for producing the nucleic acid or vector of the invention are well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid or the vector can alternatively also be produced by a total synthesis.
  • the genes can be codon-optimized.
  • the present invention further also relates to a host cell comprising the nucleic acid of the invention or the vector of the invention.
  • the host cell is a eukaryotic host cell.
  • the host cell is particularly preferably a yeast, the yeast preferably being selected from the group consisting of Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe, and Blastobotrys adeninivorans (also known as Arxula adeninivorans).
  • the host cell is from Saccharomyces cerevisiae.
  • the host cell is S. cerev/s/ae strain BY4742, such as described in Brachmann et al. described in 1998.
  • the nucleic acid or vector of the invention may be integrated into a chromosome of the host cell.
  • the present invention further relates to a method for producing a host cell of the invention comprising introducing the nucleic acid of the invention or the vector of the invention into a host cell.
  • Methods for introducing nucleic acids or vectors into a host cell are well known to those skilled in the art.
  • the host cell can be transformed or transduced with the nucleic acid or vector of the invention.
  • the nucleic acid, vector or host cell of the invention can be used for a variety of purposes. One of these purposes is to demonstrate an environmental impact. In connection with the use of a regulatable promoter to control luxA and luxB or the LuxAZLuxß fusion protein, the change in bioluminescence can be observed and on the basis of this the presence or absence of the environmental influence can be concluded. The strength of the luminescence can also be used to determine the concentration (see also Example 4).
  • the present invention also relates to a method for detecting an environmental impact, comprising: (i) contacting an environmental sample with the host cell of the invention; (ii) determining the luminescence of the host cell; wherein luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are optionally under the control of a regulatable promoter that is activated or affected by the environmental stimulus and wherein an increase in bioluminescence compared to a control sample is indicative of the presence of the environmental stimulus (in the context of a inducible promoter) or wherein a reduction in bioluminescence compared to a control sample is indicative of the presence of the environmental challenge (when using a repressible promoter).
  • Such a method for detecting an environmental influence can be the basis for using the host cell as an environmental sensor.
  • no substrate for the LuxA/LuxB luciferase is extrinsically added to the host cell.
  • luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are not under the control of a regulatable but under the control of a constitutive promoter. In this case, if the environmental influence alters (enhance or weaken) the growth of the host cell, the change in bioluminescence can be used to detect the environmental influence.
  • the present invention also relates to a method for detecting an environmental exposure, comprising: (i) contacting an environmental sample with the host cell of the invention; (ii) determining the luminescence of the host cell; wherein luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are optionally under the control of a constitutive promoter, and wherein a change in bioluminescence compared to a control sample is indicative of the presence of the environmental challenge.
  • an “environmental influence” in the context of the present disclosure means any influence that is suitable for altering the gene expression of a gene that is under the control of a regulatable promoter and/or is lethal or growth-inhibiting for the host cell.
  • This can be in terms of an analyte, a synthetic or natural compound, a bioavailable compound (such as nutrients, amino acids, nucleic acids, nitrogen, phosphorus, sulphur), a physical influence that is direct or indirect (indirect means e.g. when an analyte activates a signaling pathway, which ultimately acts on the regulatory element) can act on the regulatory element.
  • the system can be used as an indicator for environmental influences, but also for gene expression and regulation as well as for monitoring bioavailable compounds, since the bioluminescence is changed/regulated depending on the metabolism (protein synthesis, DNA synthesis) or growth.
  • environmental exposures include medications, drugs, hormones, environmental toxins, bioavailable compounds, and physical exposures.
  • Medicines can include substances and preparations that are used in humans or animals and are intended to cure, alleviate or prevent diseases or pathological symptoms, or to restore, correct or influence physiological functions. They can also serve as a basis for medical diagnoses.
  • the environmental influence can be an antibiotic.
  • “Drugs” may include the following: benzodiazepines, thienodiazepines, indole alkaloids (e.g. LSD), opioids (e.g. morphine, diacetylmorphine, methadone), arylcyclohexylamines (e.g. ketamine), phenylethylamines (e.g. amphetamines), tropane alkaloids (e.g. cocaine, scopolamine), xanthines or cannibinoids (e.g. cannabidiol, THC).
  • benzodiazepines e.g. LSD
  • opioids e.g. morphine, diacetylmorphine, methadone
  • arylcyclohexylamines e.g. ketamine
  • phenylethylamines e.g. amphetamines
  • tropane alkaloids e.g. cocaine, scopolamine
  • cannibinoids
  • “Hormones” can be endogenous or non-endogenous but hormone-like substances. Examples of this are estrogens, progestins, but also substances that develop hormone-like effects such as DDT, PCB, PBDE or phthalates.
  • Environmental toxins can be understood to mean substances or preparations which themselves or their transformation products are capable of changing the nature of the natural balance, of water, soil or air, climate, animals, plants or microorganisms in such a way that this immediately or later poses a risk to the environment can be brought about.
  • Environmental toxins can be chemical substances that are classified as "dangerous for the environment" under the GHS label.
  • Examples include dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), volatile halogenated hydrocarbons (LHKW such as dichloromethane, trichloromethane, trichloroethane), pentachlorophenol (PCP), polybrominated diphenyl ethers (PBDE), polychlorinated biphenyls (PCB), polychlorinated dibenzodioxins and dibenzofurans, polycyclics aromatic hydrocarbons (PAH such as benzo[a]pyrene), propenal, sulfur trioxide, heavy metals (e.g. arsenic, antimony, lead, cadmium, chromium, copper, nickel, thallium, mercury) or TMDD.
  • DDT dichlorodiphenyltrichloroethane
  • LHKW volatile halogenated hydrocarbons
  • PCP pentachlorophenol
  • PBDE polybrominated diphenyl ethers
  • PCB polych
  • a “bioavailable compound” can be understood as a substance or mixture of substances that can be metabolized by organisms without harming them. Examples include nutrients, nitrogen and nitrogen compounds, phosphorus and phosphorus compounds, and sulfur and sulfur compounds.
  • a "physical influence” can describe an environmental influence that can affect a host cell via parameters such as heat, cold or osmotic concentration. Another physical influence can be oxidative stress. To detect oxidative stress, the OSI 7 promoter can be used to control the expression of luxA/luxB.
  • An “environmental sample” may mean a sample obtained from the environment, ie not from an animal. Exemplary environmental samples are water samples (eg sea, lakes, running water, waste water, drinking water) or soil samples, preferably water samples.
  • Methods for measuring bioluminescence are well known to those skilled in the art. They include e.g. the use of a photometer e.g. within a (micro)plate reader. The basis of these methods is the measurement of the light emitted by the host cell.
  • the activity of the bacterial LuxA/LuxB luciferase described in this disclosure can be measured at about 490 nm.
  • the host cell of the invention can be used as a biosensor. Consequently, the invention also relates to the use of the host cell as a biosensor.
  • Biosensor in the context of the invention may refer to the use of the host cell of the invention for detecting an environmental cue, e.g. in a method for detecting an environmental cue as described herein.
  • no substrate for the LuxA/LuxB luciferase is extrinsically added to the host cell.
  • the host cell of the invention can additionally be used as a vitality sensor.
  • luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are under the control of a constitutively active promoter. This means that the luminescence of the host cell remains constant. If the vitality of the host cell decreases, e.g. due to the influence of an environmental toxin, the host cell can restrict protein production or die, causing the luminescence to decrease. That is, the level of luminescence can serve as an indicator of the vitality of the host cell. Consequently, the present invention relates to the use of the host cell of the invention as a vitality sensor, the reduction or loss of (bio)luminescence being indicative of reduced vitality of the host cell. Preferably, no substrate for the LuxA/LuxB luciferase is extrinsically added to the host cell.
  • the nucleic acid of the invention can also be used to detect protein-protein interactions.
  • a system similar to a yeast two-hybrid system (Y2H) can be used for this.
  • the substrate for the LuxA/LuxB luciferase can be produced by the genes luxC, luxD, luxE and optionally NAPDH-flavin oxidoreductase which are under the control of a constitutive promoter.
  • the luxA/luxB genes or the LuxA/LuxB fusion protein are under the control of a promoter that is activated by binding the reconstituted transcription factor in the Y2H system.
  • this is a Ga / 4 promoter used, which is activated by the reconstituted Gal4 transcription factor in the presence of protein-protein interaction.
  • a system based on luciferases is described in Massoud et al. described in 2007.
  • no substrate for the LuxA/LuxB luciferase is extrinsically added to the host cell.
  • the present invention further relates to a kit comprising the nucleic acid of the invention, the vector of the invention or the host cell of the invention.
  • the kit may also include instructions. Further components can be sample receptacles, nutrient media or means for transfecting the nucleic acid.
  • the present invention also relates to the following objects:
  • nucleic acid comprising a contiguous nucleotide sequence containing:
  • nucleic acid according to item 1 wherein the heterologous promoter is a eukaryotic promoter.
  • Nucleic acid according to one of the preceding items wherein LuxE has an amino acid sequence which is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 5 or a functional fragment thereof.
  • Nucleic acid according to one of the preceding objects wherein the nucleic acid additionally comprises (vi) a gene which codes for an NADPH flavin oxidoreductase.
  • NADPH flavin oxidoreductase preferably has an amino acid sequence at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% , at least 97.5%, at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 6 or a functional fragment thereof.
  • IRS internal ribosomal entry site
  • luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are under the control of a regulatable promoter, the promoter preferably being regulatable by an environmental influence, preferably selected from the group consisting of drugs, drugs, hormones, environmental toxins , bioavailable compounds and physical influences.
  • Nucleic acid according to any one of the preceding items, wherein luxC, luxD, luxE and optionally the NADPH flavin oxidoreductase are constitutively expressed or are under the control of a regulatable promoter, wherein the promoter of luxC is preferably the 7"EF2 promoter, the promoter of luxD preferably the CDC19- promoter, the promoter of luxE is preferably the EA/02 promoter and/or the promoter of NADPH flavin oxidoreductase is preferably the PDCf promoter.
  • a vector, eg a plasmid comprising the nucleic acid of any one of items 1 to 17.
  • a host cell comprising the nucleic acid of any one of items 1 to 17 or the vector of item 18, wherein the host cell is preferably a eukaryotic host cell.
  • Host cell according to item 19 wherein the host cell is a yeast, preferably a yeast selected from the group consisting of Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe and Blastobotrys adenini-vores, preferably Saccharomyces cerevisiae.
  • a method of making a host cell of item 19 or 20 comprising introducing the nucleic acid of any one of items 1 to 17 or the vector of item
  • determining the luminescence of the host cell optionally wherein luxA and luxB or the LuxA/LuxB fusion protein are under the control of a regulatable promoter regulated by the environmental stimulus and wherein a change in bioluminescence compared to a control sample is indicative of the presence of the environmental stimulus.
  • the environmental exposure is selected from the group consisting of drugs, drugs, hormones, environmental toxins, bioavailable compounds, and physical exposures.
  • a kit comprising the nucleic acid of any one of items 1 to 17, the vector of item 18, or the host cell of item 19 or 20. ****
  • Saccharomyces cerevisiae strain BY4742 (genotype: MATa his3A1 leu2A0 iys2A0 ura3 0) was used, which comes from the gene knockout collection of the company Euroscarf in Oberursel (Ando & Suzuki, 2005; Brachmann et al., 1998).
  • SD-URA medium for S. cerevisiae
  • Agar for solid medium
  • SD-Leu-URA Medium for S. cerevisiae
  • Yeasts were incubated on YPD agar plates overnight at 28°C for 1-2 days. Cell lawns corresponding to a 1 ⁇ l loop were added to 50 ⁇ l previously boiled and then cooled herring sperm (2 mg/ml in 10 mM TRIS-HCl, 1 mM N32EDTA, pH 8) and mixed. Then, first the DNA to be transformed and a mixture of 240 ⁇ l 50% polyethylene glycol 6000 (w/v) and 36 ⁇ l 1 M lithium acetate were added. After incubation at 30°C for 30 minutes, heat shock was performed at 42°C for 30 minutes.
  • the cells were pelleted at 3000 x g for 10 minutes at room temperature. The supernatant was discarded, the cell pellet was taken up in 100 ⁇ l of distilled and sterilized water and applied to selection medium with appropriate selection. These plates were incubated at 28°C until transformants emerged.
  • D-luciferin sodium salt (Carl Roth, Germany) was dissolved in 0.1 M Na2HPO4-citrate buffer pH 5 to a final luciferin concentration of 1 mM.
  • 100 ⁇ l of an overnight yeast culture was adjusted to a suitable starting ODeoo of approx. 1.0 or less in CSM medium.
  • 100 pl of yeast cells, 25 pl of a test solution (eg amino acid) and 25 pl of 1 mM luciferin solution were in this order for a Measurement in a well of a black 96-well microtiter plate with a transparent bottom (Microplate, 96 well, PS, F-Bottom (Chimney Well) pClear®, Black, Med. Binding; Greiner bio-one, Germany).
  • the measurements were carried out with a Tristar 2 S plate reader (Berthold, Germany) at a constant temperature of 28°C.
  • the plasmid pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, see also Fig. 5) was chemically transformed into the S. cerevisiae strain BY4742. After two days, 86 colonies could be obtained. After the colonies were isolated on CSM-Ura selection plates, the luminescence could be successfully measured (Fig. 1).
  • Figure 1 shows strain BY4742, which starts at around 3000 RLU luminescence and increases to a maximum of 5000 RLU.
  • the nucleic acid of the invention can generate bioluminescence in yeast without the addition of an external luciferase substrate.
  • Example 2 Comparison of the bacterial luciferase of the invention with the firefly luciferase
  • a luciferase was placed under the same promoter and terminator as the bacterial luciferase LuxAB (SEQ ID NO: 20) in order to have comparable conditions create.
  • the luciferase from Photinus pyralis was chosen for the comparison because it is used most frequently in bioanalysis (see Fig. 6).
  • both plasmids have the same genetic requirements, such as FBA1 promoter and terminator, the same vector backbone and were also transformed into BY4742, both plasmids could be directly compared with each other.
  • the experiment was carried out twice, each time with three technical replicas. The cultures were grown overnight at 28°C and were each diluted with 50 ⁇ l of fresh medium (YPD medium). In the prototype produced (nucleic acid of the invention, SEQ ID NO: 7), water was added instead of 50 ⁇ l of the luciferin solution (2 mM final concentration).
  • the nucleic acid of the invention (“prototype”) shows an initial luminescence of about 100,000 RLU and slowly increases to 130,000 RLU after 5.4 h.
  • the F/ref/y luciferase starts at only 52,475 RLU and falls to 19,143 RLU after just 1.7 hours.
  • the CSM-URA panels were exposed to daylight (Fig. 2A) and to full Darkness (Fig. 2B) recorded by a commercially available photo camera. The light generated by the yeasts could also be seen with the naked eye.
  • nucleic acid of the present invention is far superior to the conventional firefly luciferase.
  • a plasmid was cloned which constitutively expresses the luciferase.
  • the luminescence of the plasmid pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7), which combines luciferin and luciferase synthesis on a single plasmid (FIG. 5), with a system based on the two plasmids pRS426-Leu2-FBA1 ::LuxAB (SEQ ID NO: 22) and pRS426-L/RA3-LuxCDE-frp (SEQ ID NO: 21, Fig. 7).
  • the luminescence could be measured. 100 ⁇ l of the yeast culture and 50 ⁇ l of fresh nutrient medium were placed in a measuring well (Fig. 3).
  • the inventors were therefore able to find, completely surprisingly, that splitting into two plasmids has no positive effect on the luminescence, but on the contrary that the expression of the /ux operon of a nucleic acid according to the invention is advantageous.
  • luciferase system of the invention As a biosensor. This is to be shown as an example using the detection of the leucine concentration in a leucine-deficient medium.
  • the yeast strain BY4742 used by the inventors has some auxotrophies, including a leucine auxotrophy, which makes this strain appear useful for leucine detection.
  • the strain was grown overnight in CSM-URA medium. Since the vector pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, see also Fig. 5) contains an L/RA3 marker, normal growth is possible for these yeast cells.
  • the cells were centrifuged off and taken up in CSM-Leu-URA medium, ie in a medium without leucine. Consequently, these cells could not due to the lack of the amino acid leucine grow. After an incubation time of 5 h, a defined amount of leucine was added and the luminescence was then measured (Figure 4).
  • the nucleic acid according to the invention can thus be used with the aid of a host cell (according to the invention) to detect and quantify environmental influences such as leucine.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für luxA kodiert, (ii) ein Gen, das für luxB kodiert, (iii) ein Gen, das für luxC kodiert, (iv) ein Gen, das für luxD kodiert, (v) ein Gen, das für luxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Vektoren und Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure. Ferner beschrieben sind Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung sowie Verfahren und Verwendungen zum Nachweis eines Umwelteinflusses sowie ein entsprechendes Kit.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Vektoren und Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure. Ferner beschrieben sind Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung sowie Verfahren und Verwendungen zum Nachweis eines Umwelteinflusses sowie ein entsprechendes Kit.
HINTERGRUND
Obwohl sich die Biolumineszenz mehrmals parallel entwickelt hat, ist die grundlegende Lichtreaktion bei allen Organismen gleich. Eine Luciferase katalysiert die Reaktion von Luciferin unter Sauerstoffverbrauch zu einem Luciferase-gebundenen Peroxy-Luciferin-Zwi- schenprodukt, welches seine überschüssige Energie durch Lichtemission freisetzt. Die Nutzung von Luciferasen wie der Renilla-Luciferase aus Renilla reniformis, der Firefly-Lu- ciferase aus Photinus pyralis oder der bakteriellen Luciferasen, z.B. aus Vibrio, Photobacterium oder Photorhabdus luminescens in der Bioanalytik wurde bereits beschrieben (Bhaumik & Gambhir, 2002; Contag et al., 1995; Contag et al., 1998).
Die bakterielle Luciferase ist ein Heterodimer und wird durch die Gene luxA und luxB codiert (Foran & Brown, 1988). Die Gene luxC, luxD, und luxE codieren für eine Transferase (LuxD) und für eine Synthethase/Reduktase (LuxCE), die für die Synthese des in der Lichtreaktion benötigten Aldehyd-Substrats notwendig sind. Diese Gene sind Teil des bakteriellen /ux-Operons (Close et al., 2009).
Die unterschiedliche genetische Organisation bakterieller Gene im Vergleich zu eukaryoti- schen Genen erschwert jedoch den direkten Gentransfer von Bakterien auf Pilze oder anderen Eukaryoten. Im Stand der Technik sind mehrere Ansätze zur Expression des bakteriellen Systems in der Hefe beschrieben (Gupta et al., 2003; Xu et al., 2018). Für die Expression des bakteriellen Lux-Systems in Eukaryoten wurde bisher die prokaryotische Operon-Struktur mit Hilfe bestimmter Gen-verknüpfender Sequenzen nachgeahmt.. Nur so konnten alle Gene unter Verwendung nur eines Promotors und eines Terminators reguliert werden. In beiden Veröffentlichungen werden die Gene des /ux-Operons, in einer Genkassette hintereinander angeordnet, wobei die codierenden Gensequenzen durch IRES (internal ribosomal entry sites) oder 2A-Sequenzen miteinander verbunden sind.
Das größte und breiteste Anwendungspotential von Biolumineszenz besteht momentan auf dem Gebiet der Biosensoren. Durch Einführung einer mit einer regulatorischen DNA- Sequenz fusionierten Luciferase, welche nur bei Anwesenheit eines bestimmten Stimulus die Expression der Luciferase induziert, kann ein induzierbares Reportersystem etabliert werden. Ein solches System kann automatisiert werden und für High-Throughput-Scree- nings verwendet werden.
Die mit IRES (abnehmende Expression der Gene nach jeder IRES-Sequenz) oder 2A-Se- quenzen (Verbleib der 2A-Sequenz C-terminal der Schnittstelle und eines Prolins N-termi- nal der Schnittstelle) verbundenen Nachteile machen die aus dem Stand der Technik bekannten Luciferase-Systeme hierfür jedoch weniger effizient. Ziel der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines verbesserten Luciferase-Systems, das zur Verwendung als Biosensor geeignet ist. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder konnten unerwartet zeigen, dass die Kombination aller Gene des /ux-Operons auf einer einzigen Nukleinsäure, wobei alle Gene jeweils einen eigenen Promoter und Terminator besitzen, vorteilhaft gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Luci- ferase-Systemen ist, wodurch das technische Problem gelöst wurde.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
Vorzugsweise ist der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor. Vorzugsweise vermitteln die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke. Auf jedes Gen kann ein Terminator folgen.
LuxA und LuxB sind vorzugsweise von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens. In der Nukleinsäure der Erfindung liegen die Gene, die für LuxA (i) und LuxB (ii) kodieren, vorzugsweise als ein Gen luxAB vor, welches das LuxA/LuxB-Fusionsprotein kodiert und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind. Das Fusionsprotein bzw. das Gen, das für das für das Fusionsprotein kodiert, ist unter der Kontrolle eines eigenen heterologen Promoters und kann dadurch Gene (i) und (ii) inklusive deren zugehörigen heterologen Promotoren in der Nukleinsäure der Erfindung ersetzen. LuxA hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxB hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
LuxC, luxD und luxE sind vorzugsweise von P. luminescens. LuxC hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxD hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxE hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
Die Nukleinsäure umfasst vorzugsweise zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH- Flavin-Oxidoreduktase kodiert. Die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase ist vorzugsweise frp, vorzugsweise von V. harveyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
Die Nukleinsäure enthält vorzugsweise keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi).
LuxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein sind vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, (wobei der Umwelteinfluss) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen.
LuxC, luxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase können konstitutiv expri- miert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sein, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der 7"EF2-Promotor ist, der Promotor von luxD vorzugsweise der CDC79-Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der E/V02-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDC1- Promotor ist. In einer Ausführungsform sind luxC, luxD, luxE und optional die NADPH- Flavin-Oxidoreduktase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Vektor, z.B. ein Plasmid, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure der Erfindung oder den Vektor der Erfindung, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszelle ist. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adeninivorans (auch bekannt als Arxula adeninivorans), vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist. Die Nukleinsäure der Erfindung kann in ein Chromosom der Wirtszelle integriert sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung umfassend das Einbringen der Nukleinsäure der Erfindung oder des Vektors der Erfindung in eine Wirtszelle.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist, wobei der Umwelteinfluss vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Verwendung einer Wirtszelle der Erfindung als Biosensor oder in einem Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses der Erfindung oder zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung einer Wirtszelle der Erfindung als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Kit umfassend die Nukleinsäure der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung.
ABBILDUNGEN
Abbildung 1 zeigt die Messung der Lumineszenz (schwarz) und des Wachstums (grau) des S. cerev/s/ae-Stamms BY4742, der mit dem Plasmid pRS426-Lux eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Abbildung 2 zeigt die Biolumineszenz der Wirtszelle der Erfindung. Die CSM-URA-Platten wurden bei Tageslicht (A) und bei völliger Dunkelheit (B) fotografiert. (C) ist eine schematische Darstellung der Erfindung. (D) zeigt einen Vergleich der Wirtszelle der Erfindung („Prototyp“, obere Linie) mit der Firefly-Luciferase (mittlere Linie) sowie dem Leervektor pRS426 (untere Linie). Abbildung 3 zeigt eine Lumineszenz-Messung von S. cerevisiae (dunkle Linie) sowie die ODeoo (helle Linie), welche mit den Plasmiden pRS426-Leu2-LuxAB und pRS426-L//'a3- LuxCDE-frp transformiert wurde.
Abbildung 4 zeigt den Verlauf der Lumineszenz bei verschiedenen Konzentrationen von Leucin bzw. Kontrollen (Wasser, LIRA und Histidin).
Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure basierend auf dem pRS426-Plasmid (vgl. auch SEQ ID NO: 7).
Abbildung 6 zeigt ein beispielhaftes Plasmid, das für die Firefly-Luciferase kodiert (SEQ ID NO: 20).
Abbildung 7 zeigt zwei beispielhafte Plasmide, die LuxA/B (SEQ ID NO: 22) und LuxC/D/E (SEQ ID NO: 21) auf zwei verschiedenen Plasmiden kodieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
2018 berichtete die Arbeitsgruppe von Xu et al., dass sie einen biolumineszenten Reporter entwickelt habe, welcher Dioxine und dioxinähnliche Stoffe detektieren könne. Hierfür wurde das /ux-Operon und frp unter Kontrolle eines Dioxin-sensitiven Promotors gestellt und die einzelnen Gene via verschiedener viraler 2A-Elemente miteinander verbunden, um die Expression mittels eines einzigen Promotors zu ermöglichen. Die 2A-Peptide werden aufgrund ihrer geringen Sequenzgröße (54 - 174 bp) (Xu et al., 2018) verwendet. Allerdings bringt die Nutzung dieser Sequenzen auch einige entscheidende Nachteile mit sich. So bleibt das 2A Peptid als C-terminale Erweiterung an dem Produkt, welches upstream liegt, und der N-Terminus des downstream Produkts wird um die Aminosäure Prolin ergänzt. Diese C-terminale Erweiterung kann dazu führen, dass die Konformation des Proteins beeinträchtigt wird und so die Aktivität eingeschränkt ist bzw. ganz verloren gehen kann (Minskaia et al., 2013). Zudem kann in bestimmten Fällen die C-terminale Sequenz des upstream liegenden Gens das Schneiden des 2A Peptids vollständig inhibieren. Dies kann zur Aggregation der Proteine im Organismus führen (Minskaia et al., 2013).
Ein weiteres aus dem Stand der Technik bekanntes Beispiel der Expression des lux-Ope- rons in S. cerevisiae war ebenfalls auf die Verwendung viraler Elemente angewiesen. In dieser Arbeit wurden IRES Sequenzen benutzt, um luxE und frp und luxD und luxC bicistro- nisch zu exprimieren. LuxAB und luxCDE + frp wurden zudem auf jeweils eigenen Vektoren kloniert (Gupta et al., 2003). IRES Sequenzen haben allerdings gegenüber 2A Peptiden noch größere Nachteile. Diese Sequenzen bieten den Ribosomen eine zusätzliche Bindestelle an und rekrutieren die Ribosomen unabhängig von den durch die Viren inhibierten Elongationsfaktoren (Pelletier & Sonenberg, 1988). Allerdings unterscheiden sich die benötigten Bindungsfaktoren von Zelle zu Zelle. Zudem wird das von der IRES downstream kodierte Protein meist nur zu 20 % - 50 % exprimiert im Gegensatz zum upstream kodierten Protein (Mizuguchi et al., 2000).
Die damit verbundenen Nachteile verhindern daher eine breite Einsetzbarkeit und Verlässlichkeit in der Verwendung von eukaryotischen Zellen als Biosensoren. Die von den Erfindern gefundene Lösung vermeidet die Verwendung viraler Faktoren. Die Nukleinsäure der Erfindung unterscheidet sich vom Stand der Technik dadurch, dass zum einen alle Gene des /ux-Operons auf einer einzigen Nukleinsäure umfasst sind und dass jedes der Gene des /ux-Operons unter der Kontrolle eines eigenen Promotors ist. Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure der Erfindung können für eine Vielzahl verschiedener Zwecke eingesetzt werden, die wir im Folgenden erläutern werden.
Wie die Erfinder zeigen konnten, ist das von ihnen verwendete System einem auf zwei Nukleinsäuren aufgeteilten System sowie der Firefly-Luciferase überraschenderweise deutlich überlegen (siehe Beispiel 3, Abbildung 2). Abbilddung 2D zeigt den Vergleich der beiden Plasmide pRS426-Lux, d.h. die erfindungsgemäße Nukleinsäure, und pRS426- FBA1 ::Firefly aus dem Stand der Technik, die über dieselben regulatorischen Elementen verfügen, während des Wachstums in entsprechendem Mangelmedium. Bei pRS426-Lux wurde kein Luciferin extern hinzugegeben, während dem Firefly-Plasmid Luciferin im Überschuss hinzugegeben werden musste. Es ist zu sehen, dass das Lumineszenz-Signal der Firefly-Luciferase sehr schnell abnimmt, da das Luciferin schlicht verbraucht wird. Die bakterielle Luciferase hingegen erzeugt ein konstantes Signal, das zudem mehr als doppelt so stark ist (Abb. 2D). Dies erlaubt auch einen Vergleich mit Xu et al., die die Lumineszenz- Intensität in „Fold of induction“ (FOI) angeben. FOI ist das Verhältnis des durchschnittlichen Lumineszenzsignals zum Zeitpunkt t zu einer Negativ-Kontrolle, welches auch als Hintergrundleuchten bezeichnet wird. Xu et al. erhalten einen maximalen Wert von 13,8 FOI. Berechnet man den FOI für den in dieser Offenbarung höchsten erhaltenen Wert (Abb. 2D), würde man eine Induktion von 738 FOI erhalten (130.000 RLU Signal gegen 176 RLU Hintergrundleuchten). Das würde ein mehr als 50fach stärkeres Lichtsignal bedeuten als bei Xu et al, was die deutliche Überlegenheit des erfindungsgemäßen Systems unterstreicht. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen bakteriellen Lux-Systems ist zudem, dass das Substrat von der Wirtszelle selbst produziert werden kann. Dadurch, dass die Zugabe und der Zukauf von Luciferin entfällt, können Arbeitszeit und Kosten verringert werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich dementsprechend auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
Die Nukleinsäure enthält also alle essenziellen Gene, die eine Biolumineszenz ermöglichen. Dabei ist die Nukleinsäure fortlaufend, d.h. alle Gene befinden sich auf einer einzigen, fortlaufenden Nukleinsäure. In anderen Worten, sie sind samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht umfasst. Dies schließt jedoch nicht zwangsläufig aus, dass sich zwischen den einzelnen Genen nicht nicht-kodierende Bereiche oder Gene, die nicht aus dem Lux-Operon stammen, befinden können. Auch bedeutet dies nicht zwangsläufig, dass die Reihenfolge der Gene (i) bis (vi) wie hierin beschrieben in der Reihenfolge ihrer Nummerierung auf der Nukleinsäure vorhanden sein muss.
Wie bereits erläutert, enthält die Nukleinsäure Gene, die für das /ux-Operon kodieren. Die Gene, die für die prokaryotische Biolumineszenz verantwortlich sind, wurden von Enge- brecht et al. (1983) aus Vibrio harveyi isoliert und charakterisiert. Diese werden innerhalb dieser Offenbarung als „lux-Operon“ bezeichnet. Die im /ux-Operon enthaltenen Gene werden als luxC, luxD, luxE, luxA, und luxB bezeichnet.
Die bakterielle Luciferase ist ein Heterodimer, welches von LuxA und LuxB gebildet wird (Foran and Brown, 1988). LuxA und LuxB können hierbei von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi sein, wobei LuxA und LuxB vorzugsweise von P. luminescens sind. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxA eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxB eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
Eine weitere Ausführungsform bezieht sich auf eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Gene, die für LuxA (i) und LuxB (ii) kodieren, als ein Gen luxAB vorliegen, welches das LuxA/LuxB-Fusionsprotein kodiert, und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind.
Das bedeutet, dass gemäß dieser besonderen Ausführungsform LuxA und LuxB als ein Fusionsprotein vorliegen (LuxA/LuxB-Fusionsprotein). Innerhalb des Fusionsproteins können LuxA und LuxB durch einen Linker, z.B. einen Serin-Threonin-Linker oder einen Serin- Arginin-Linker, vorzugsweise einen Serin-Arginin-Linker, verknüpft sein. Das Fusionsprotein bzw. das Gen, das für das für das Fusionsprotein kodiert, ist unter der Kontrolle eines eigenen heterologen Promoters und kann dadurch Gene (i) und (ii) inklusive deren zugehörigen heterologen Promotoren in der Nukleinsäure der Erfindung ersetzen. Ein beispielhaftes Fusionsprotein von LuxA und LuxB ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Das LuxA/LuxB- Fusionsprotein kann unter der Kontrolle eines FBA 7-Promotors sein (wie z.B. in SEQ ID NO: 13 gezeigt). Alternativ kann das LuxA/LuxB-Fusionsprotein auch unter der Kontrolle des OS/7-Promotors sein (wie z.B. in SEQ ID NO: 19 gezeigt). Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung dementsprechend auch auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für ein LuxA/LuxB-Fusionsprotein kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
Die übrigen Gene des /ux-Operons luxC, luxD, und luxE codieren für eine Transferase (LuxD) und für eine Synth etase/Reduktase (LuxCE), welche dafür sorgen, dass das für die Lichtreaktion benötigte Aldehyd-Substrat in ausreichender Menge vorliegt (Close et al., 2009). Das Aldehyd-Substrat für die bakterielle Luciferase wird in diesem Zusammenhang auch als bakterielles Luciferin bezeichnet. Das Lux-Operon ist auch Basis anderer biolu- mineszierender Bakterien wie z.B. von Photobacterium phosphoreum (Dunlap, 2014). LuxC, LuxD und LuxE sind vorzugsweise von P. luminescens. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxC eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxD eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxE eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
Zur Unterstützung der Luciferinsynthese im Kontext der Erfindung kann zusätzlich eine NAPDH-Flavin-Oxidoreduktase überexprimiert oder zusätzlich exprimiert werden. Diese kann auf einer zusätzlichen Nukleinsäure oder auf der Nukleinsäure der Erfindung umfasst sein. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure der Erfindung (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert. Vorzugsweise ist die NADPH-Flavin- Oxidoreduktase frp, vorzugsweise frp von Vibrio harveyi. In einer besonderen Ausführungsform hat die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
Ein „funktionsfähiges Fragment“ im Kontext der vorliegenden Erfindung meint ein Fragment des jeweiligen Proteins, das eine Aktivität von mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% des unmodifizierten Proteins, d.h. der in dieser Offenbarung genannten Sequenz hat. Die Bestimmung der Aktivität eines Proteins liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns. Hierfür kann die Aktivität, z.B. die Lumineszenz, zwischen der jeweiligen Referenzsequenz und dem zu testenden Fragment unter ansonsten gleichen Bedingungen verglichen werden.
Sequenzidentität kann durch jede bekannte Methode bestimmt werden, jedoch sind für die Bestimmung des Grades der Identität von Sequenzen Computerprogramme nützlich. Vielfältige Sequenzabgleiche und %-Identität Kalkulationen können mit Hilfe von Standard BLAST Parametern durchgeführt werden (Verwendung von Sequenzen aller verfügbaren Organismen, Matrix BLOSUM 62, gap costs: existence 11 , extensionl). Alternativ kann das Program Align Plus 4, Version 4.10 (Sei Ed Central Clone Manager Professional Suite) mit folgenden Parametern genutzt werden: DNA comparison: Global comparison, Standard Linear Scoring Matrix, Mismatch Penalty = 2, Open Gap Penalty = 4, Extend Gap Penalty = 1 / Amino Acid Comparison: Global Comparison, BLOSUM 62 Scoring Matrix.
„Nukleinsäure“ wie hierin genutzt beschreibt aus einzelnen Bausteinen, den Nukleotiden, aufgebaute Makromoleküle, die bei allen Organismen die genetische Information enthalten. Abwechselnde Einfachzucker und Phosphorsäureester bilden eine Kette, wobei an jedem Zucker eine Nukleinbase hängt. Die Nukleinsäure kann aus DNA oder RNA bestehen, wobei DNA bevorzugt wird. Wenn eine Nukleinsäure exprimiert wird, führt dies zur Produktion des Peptids bzw. Proteins, das durch das jeweilige Gen kodiert wird.
In der Nukleinsäure der Erfindung ist jedes der Gene unter der Kontrolle eines (eigenen) zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors. Der jeweilige heterologe Promotor ist vorzugsweise ein eukaryotischer Promotor. Die Promotoren der einzelnen Gene (i) bis (v) oder (i) bis (vi) können gleich sein, sind vorzugsweise jedoch unterschiedlich. Vorzugsweise ist zumindest ein Promotor im Vergleich zu den anderen verwendeten Promotoren unterschiedlich, mehr bevorzugt sind zumindest zwei Promotoren zu den anderen Promotoren unterschiedlich, wobei auch die zwei Promotoren zueinander unterschiedlich sind, noch mehr bevorzugt sind zumindest drei Promotoren zu den anderen Promotoren unterschiedlich, wobei auch die drei Promotoren zueinander unterschiedlich sind, am meisten bevorzugt sind alle verwendeten Promotoren zueinander unterschiedlich. Der Begriff eukaryoti- scher Promoter kann synthetische Promotoren umfassen. Der Begriff eukaryotischer Promotor kann den 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus oder andere virale Promotoren umfassen.
Da die Gene des /ux-Operons in Bakterien gleichmäßig exprimiert werden, kann versucht werden, dies durch gleich starke Promotoren in Eukaryoten nachzubilden. Jedoch ist dies nicht essenziell für die Ausführbarkeit der Erfindung. Die heterologen Promotoren vermitteln daher vorzugsweise die gleiche Expressionsstärke. „Expressionsstärke“ meint in diesem Kontext die Menge (z.B. Anzahl) der transkribierten mRNA und/oder die Menge (z.B. Masse) der translatierten Proteine. „Gleich“ kann in diesem Kontext eine Abweichung von 25% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger beinhalten. Verfahren zur Bestimmung der Menge von mRNA und Proteinen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und zum Beispiel in Sun et al. (2012), Biotechnology and Bioengineering 2012, 109:2082- 2092, beschrieben. Zum Beispiel kann mittels quantitativer PCR die transkribierte Menge an mRNA des gleichen Gens, z.B. gfp, in Abhängigkeit verschiedener Promotoren miteinander verglichen werden. Alternativ oder zusätzlich kann ein Gen, das für ein fluoreszierenden Protein wie GFP kodiert, unter die Kontrolle verschiedener Promotoren gestellt werden und die jeweilige Fluoreszenz in Abhängigkeit des Promotors bestimmt werden.
Die Biolumineszenz, die durch die Expressionsprodukte der Nukleinsäure der Erfindung vermittelt wird, kann zum Nachweis verschiedenster Faktoren, z.B. Umwelteinflüssen, genutzt werden. Hierfür sind luxA und luxB bzw. das LuxA/LuxB-Fusionsprotein vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors. „Regulierbar“ kann in diesen Kontext die Induktion der Genexpression oder die Repression der Genexpression im Hinblick auf einen Umwelteinfluss bedeuten. Der regulierbare Promotor ist somit vorzugsweise durch einen Umwelteinfluss regulierbar.
Im Kontext der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn luxC, luxD, luxE und optional die NADPH- Oxidoreduktase bereits vor der Expression der Luciferase luxA/luxB exprimiert werden. Dies hat den Vorteil, dass bereits das Substrat Luciferin in der Wirtszelle zur Verfügung stehen kann, bevor die Expression der Luciferase LuxA/LuxB gestartet wird. Dies kann eine schnellere Verfügbarkeit der Biolumineszenz ermöglichen, da nicht zusätzlich erst die Proteine, die das Substrat der Luciferase produzieren, exprimiert werden müssen. Dementsprechend können luxC, luxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sein. In einer Ausführungsform sind luxC, luxD, luxE und optional die NADPH-Flavin- Oxidoreduktase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Im Falle eines regulierbaren oder induzierbaren Promotors sind die Promotoren von luxC, luxD, luxE und optional der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise unterschiedlich zu den (induzierbaren) Promotoren von luxA und luxB. Der Promotor von luxC ist vorzugsweise der TEF2- Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt), der Promotor von luxD ist vorzugsweise der CDC79-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt), der Promotor von luxE ist vorzugsweise der EA/02-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 11 gezeigt) und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase ist vorzugsweise der PDCf-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 12 gezeigt).
Auf jedes der Gene (i) bis (v) oder (i) bis (vi) kann ein Terminator folgen. Ein „Terminator“ oder „Transkriptionsterminator“ kann ein Abschnitt einer genetischen Sequenz auf der DNA bezeichnet werden, der das Ende eines Gens oder Operons markiert, da er zur Beendigung (Termination) der Transkription führt. Beispiele für Terminatoren sind z.B. der TEF2- Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 14 gezeigt), der CDC79-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 15 gezeigt), der EA/02-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 16 gezeigt), der PDC1- Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 17 gezeigt) oder der FBA 7-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 18 gezeigt).
Wie bereits erläutert, ist es ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäure der Erfindung keine IRES-Sequenz oder 2A-Peptidsequenz enthalten muss. Als interne ribosomale Eintrittsstelle (engl. internal ribosomal entry site), abgekürzt IRES, wird in der Zellbiologie ein spezifisch gefalteter Abschnitt der Sekundärstruktur eines RNA- Einzelstrangs bezeichnet, der die Bindung an Ribosomen vermittelt. Damit kann bei der Synthese von Proteinen in Eukaryoten die Translation unabhängig von der 5'-Cap-Struktur initiiert werden, beispielsweise auch von der Mitte einer messenger-RNA (mRNA) aus. IRES wurden bisher in der RNA von Viren gefunden sowie in der mRNA für einige Gene von Zellen beschrieben. 2A-selbstschneidende Peptide oder2A-Peptide bilden eine Klasse von 18-22 Aminosäuren langen Peptiden, die das Spalten eines rekombinanten Proteins in einer Wirtszelle induzieren können. 2A-Peptide sind z.B. von der 2A-Region des Maul- und Klauenseuche- Virus abgeleitet. In einer Ausführungsform enthält die Nukleinsäure der Erfindung keine IRES-Sequenz und/oder keine 2A-Peptidsequenz zwischen einem der Gene (i) bis (vi).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Vektor, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst. Ein „Vektor“ oder auch „Plasmid“ bezeichnet eine Nukleinsäure, die als ein Transportvehikel zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine (lebende) Wirtszelle durch Transfektion oder Transduktion geeignet ist. Beispielhaft hierfür kann das pRS426-Plasmid genannt werden, das z.B. in (Mumberg et al., 1995) et al. beschrieben ist. Der Vektor enthält vorzugsweise einen oder mehrere Replikationsursprünge, die die Vermehrung oder Persistenz in einer Wirtszelle ermöglichen. Diese können durch den Fachmann je nach vorgesehener Wirtszelle angepasst werden. Ein erfindungsgemäßer Vektor ist beispielhaft in SEQ ID NO: 7 dargestellt.
Verfahren zum Herstellen der Nukleinsäure oder des Vektors der Erfindung sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Neben der Klonierung der einzelnen Gene in eine Nukleinsäure oder einen Vektor kann die Nukleinsäure bzw. der Vektor alternativ auch durch eine Totalsynthese hergestellt werden. Die Gene können je nach Wirtszelle Codon-optimiert sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auch auf eine Wirtszelle, die die Nukleinsäure der Erfindung oder den Vektor der Erfindung umfasst. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Besonders bevorzugt ist die Wirtszelle eine Hefe, wobei die Hefe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe, und Blastobotrys adeninivorans (auch bekannt als Arxula adeninivorans). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle von Saccharomyces cerevisiae. In einer besonderen Ausführungsform ist die Wirtszelle S. cerev/s/ae-Stamm BY4742, wie z.B. in Brachmann et al. 1998 beschrieben. Die Nukleinsäure oder der Vektor der Erfindung können in ein Chromosom der Wirtszelle integriert sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung umfassend das Einbringen der Nukleinsäure der Erfindung oder des Vektors der Erfindung in eine Wirtszelle. Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren o- der Vektoren in eine Wirtszelle sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Zum Beispiel kann die Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder dem Vektor der Erfindung transformiert oder transduziert werden.
Die Nukleinsäure, der Vektor oder die Wirtszelle der Erfindung können zu vielfältigen Zwecken eingesetzt werden. Einer dieser Zwecke ist der Nachweis eines Umwelteinflusses. Im Zusammenhang mit der Verwendung eines regulierbaren Promotors zur Kontrolle von luxA und luxB oder des LuxAZLuxß-Fusionsproteins kann die Veränderung der Biolumineszenz beobachtet und anhand dessen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Umwelteinflusses geschlossen werden. Die Stärke der Lumineszenz kann auch zur Konzentrationsbestimmung genutzt werden (siehe auch Beispiel 4). Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss aktiviert oder beeinflusst wird und wobei ein Anstieg der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist (im Kontext eines induzierbaren Promotors) oder wobei eine Verringerung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist (bei Verwendung eines reprimierbaren Promotors). Ein solches Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses kann Grundlage für die Verwendung der Wirtszelle als Umweltsensor sein. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben. In einer Ausführungsform sind luxA und luxB oder das LuxA/LuxB- Fusionsprotein nicht unter der Kontrolle eines regulierbaren sondern unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors. In diesem Fall kann, wenn der Umwelteinfluss das Wachstum der Wirtszelle verändert (stärken oder schwächen) die Veränderung der Biolumineszenz zum Nachweis des Umwelteinflusses genutzt werden. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein optional unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors sind, und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist.
Ein „Umwelteinfluss“ im Kontext der vorliegenden Offenbarung meint jeden Einfluss, der geeignet ist, die Genexpression eines unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors stehenden Gens zu verändern, und/oder tödlich oder wachstumshemmend für die Wirtszelle ist. Dies kann im Sinne eines Analyten, einer synthetischen oder natürlichen Verbindung, bioverfügbaren Verbindung (wie Nährstoffe, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Stickstoff, Phosphor, Schwefel), eines physikalischen Einflusses, der direkt oder indirekt (indirekt bedeutet z.B., wenn ein Analyt einen Signalweg aktiviert, der letztlich auf das regulative Element wirkt) auf das regulative Element einwirken kann, verstanden werden. Dadurch kann das System als ein Indikator für Umwelteinflüsse, aber auch für Genexpression und Regulation sowie für Monitoring von bioverfügbaren Verbindungen eingesetzt werden, da die Biolumineszenz in Abhängigkeit des Stoffwechsels (Proteinsynthese, DNA-Synthese) bzw. des Wachstums verändert/reguliert wird. Beispiele für Umwelteinflüsse umfassen Medikamente, Drogen, Hormone, Umweltgifte, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüsse. „Medikamente“ können Stoffe und Zubereitungen umfassen, die bei Mensch oder Tier angewendet werden und zur Heilung, zur Linderung oder zur Verhütung von Erkrankungen oder krankhafter Beschwerden, oder zur Wiederherstellung, Korrektur oder Beeinflussung von physiologischen Funktionen bestimmt sind. Auch können sie als Grundlage für medizinische Diagnosen dienen. Der Umwelteinfluss kann ein Antibiotikum sein.
„Drogen“ können folgendes umfassen: Benzodiazepine, Thienodiazepine, Indolalkaloide (z.B. LSD), Opioide (z.B. Morphin, Diacetylmorphin, Methadon), Arylcyclohexylamine (z.B. Ketamin), Phenylethylamine (z.B. Amphetamine), Tropan-Alkaloide (z.B. Kokain, Skopolamin), Xanthine oder Cannibinoide (z.B. Cannabidiol, THC) sein.
„Hormone“ können körpereigene oder nicht-körpereigene, aber hormonähnliche Substanzen sein. Beispiele hierfür sind Östrogene, Gestagene, aber auch Stoffe die hormonähnliche Wirkungen entfalten wie z.B. DDT, PCB, PBDE oder Phthalate.
Als „Umweltgifte“ können Stoffe oder Zubereitungen verstanden werden, die selbst oder deren Umwandlungsprodukte geeignet sind, die Beschaffenheit des Naturhaushaltes, von Wasser, Boden oder Luft, Klima, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen derart zu verändern, dass dadurch sofort oder später Gefahren für die Umwelt herbeigeführt werden können. Umweltgifte können chemische Stoffe sein, die im Rahmen der GHS-Kennzeichnung als „umweltgefährlich“ eingestuft sind. Beispiele hierfür sind unter anderem Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), leichtflüchtige halogenierte Kohlenwasserstoffe (LHKW wie z. B. Dichlormethan, Trichlormethan, Trichlorethan), Pentachlorphenol (PCP), Polybromierte Diphenylether (PBDE), Polychlorierte Biphenyle (PCB), Polychlorierte Dibenzodioxine und Dibenzofurane, Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK wie z. B. Benzo[a]py- ren), Propenal, Schwefeltrioxid, Schwermetalle (z.B. Arsen, Antimon, Blei, Cadmium, Chrom, Kupfer, Nickel, Thallium, Quecksilber) oder TMDD.
Eine „bioverfügbare Verbindung“ kann als ein Stoff oder ein Stoffgemisch verstanden werden, der von Organismen verstoffwechselt werden kann, ohne diesen dabei zu schaden. Beispiele umfassen Nährstoffe, Stickstoff und Stickstoffverbindungen, Phosphor und Phosphorverbindungen und Schwefel und Schwefelverbindungen.
Ein „physikalischer Einfluss“ kann einen Umwelteinfluss bezeichnen, der über Parameter wie Hitze, Kälte oder osmotische Konzentration auf eine Wirtszelle einwirken kann. Ein weiterer physikalischer Einfluss kann oxidativer Stress sein. Zum Nachweis von oxidativem Stress kann der OSI 7-Promotor zur Kontrolle der Expression von luxA/luxB eingesetzt werden. Eine „Umweltprobe“ kann eine Probe bezeichnen, die aus der Umwelt, d.h. z.B. nicht von einem Tier gewonnen wurde. Beispielhafte Umweltproben sind Gewässerproben (z.B. Meer, Seen, Fließgewässer, Abwasser, Trinkwasser) oder Bodenproben, vorzugsweise Gewässerproben.
Verfahren zur Messung der Biolumineszenz sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Sie umfassen z.B. die Verwendung eines Photometers z.B. innerhalb eines (Mikro-)Plattenle- sers. Grundlage dieser Verfahren ist die Messung des durch die Wirtszelle emittierten Lichts. Die Aktivität der in dieser Offenbarung beschriebenen bakteriellen LuxA/LuxB-Luci- ferase kann bei etwa 490 nm gemessen werden.
Wie hierin erwähnt, kann die Wirtszelle der Erfindung als Biosensor verwendet werden. Folglich bezieht sich die Erfindung auch auf die Verwendung der Wirtszelle als Biosensor. „Biosensor“ kann sich im Kontext der Erfindung auf die Verwendung der Wirtszelle der Erfindung zum Nachweis eines Umwelteinflusses beziehen, z.B. in einem Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses wie hierin beschrieben. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
Die Wirtszelle der Erfindung kann zusätzlich als Vitalitätssensor verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform sind luxA und luxB bzw. das LuxA/LuxB-Fusionspro- tein unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promoters. D.h. die Lumineszenz der Wirtszelle bleibt konstant. Wenn nun die Vitalität der Wirtszelle sinkt, z.B. durch den Einfluss eines Umweltgiftes, kann die Wirtszelle die Proteinproduktion einschränken oder sterben, wodurch die Lumineszenz sinkt. D.h., das Maß der Lumineszenz kann als Indikator für die Vitalität der Wirtszelle dienen. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der Wirtszelle der Erfindung als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der (Bio-)Lumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
Die Nukleinsäure der Erfindung kann auch zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktio- nen verwendet werden. Hierfür kann ein System ähnlich eines Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (engl. yeast two-hybrid system, Y2H) verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase durch die unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors stehenden Gene luxC, luxD, luxE und optional NAPDH- Flavin-Oxidoreduktase produziert werden. Gleichzeitig sind die luxA/luxB-Gene bzw. das LuxA/LuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Promotors, der durch die Bindung des rekonstituierten Transkriptionsfaktors im Y2H-System aktiviert wird. Häufig wird hierfür ein Ga/4-Promotor verwendet, der vom rekonstituierten Gal4-Transkriptionsfaktor bei vorhandener Protein-Protein-Interaktion aktiviert wird. Ein auf Luciferasen beruhendes System ist in Massoud et al. 2007 beschrieben. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Kit umfassend die Nukleinsäure der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung. Das Kit kann zusätzlich eine Anleitung umfassen. Weitere Bestandteile können Probenaufnahmebehälter, Nährmedien oder Mittel zur Transfektion der Nukleinsäure sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf folgende Gegenstände:
1 . Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend:
(i) ein Gen, das für LuxA kodiert,
(ii) ein Gen, das für LuxB kodiert,
(iii) ein Gen, das für LuxC kodiert,
(iv) ein Gen, das für LuxD kodiert,
(v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
2. Nukleinsäure nach Gegenstand 1 , wobei der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor ist.
3. Nukleinsäure nach Gegenstand 1 oder 2, wobei die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke vermitteln.
4. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei auf jedes Gen ein Terminator folgt.
5. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxA und LuxB von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens sind.
6. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die Gene, die für LuxA (i) und LuxB (ii) kodieren, als ein Gen luxAB vorliegen, welches das LuxA/LuxB-Fu- sionsprotein kodiert, und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind.
7. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxA eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxB eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxC, LuxD und LuxE von P. luminescens sind. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxC eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxD eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxE eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die Nukleinsäure zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert, umfasst. Nukleinsäure nach Gegenstand 13, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase frp ist, vorzugsweise von V. harveyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die Nukleinsäure keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi) enthält. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei luxC, luxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der 7"EF2-Promotor ist, der Promotor von luxD vorzugsweise der CDC19- Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der EA/02-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDCf-Promotor ist. Vektor, z.B. ein Plasmid, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17. Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17 oder den Vektor nach Gegenstand 18, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryoti- sche Wirtszelle ist. Wirtszelle nach Gegenstand 19, wobei die Wirtszelle eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pasto- ris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adenini- vorans, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist. Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20 umfassend das Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17 oder des Vektors nach Gegenstand 18 in eine Wirtszelle. Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend:
(i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20;
(ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist. Verfahren nach Gegenstand 22, wobei der Umwelteinfluss ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen. Verwendung einer Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20 als Biosensor, in einem Verfahren nach Gegenstand 22 oder 23 oder zum Nachweis von Protein-Protein- Interaktionen. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Gegenstände 19 oder 20 als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist. Kit umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17, den Vektor nach Gegenstand 18 oder die Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20. ****
Wir weisen darauf hin, dass die hier verwendeten Singularformen „ein“/„eine“, und „der“/„die“/„das“ Pluralverweise enthalten, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes angibt. So schließt z.B. der Verweis auf "ein Reagenz" ein oder mehrere solcher verschiedenen Reagenzien ein, und der Verweis auf "das Verfahren" schließt den Verweis auf gleichwertige Schritte und Verfahren ein, die dem Fachmann bekannt sind und die die hier beschriebenen Verfahren modifizieren oder ersetzen könnten.
Sofern nicht anders angegeben, ist der Begriff "mindestens" vor einer Reihe von Elementen so zu verstehen, dass er sich auf jedes Element in der Reihe bezieht. Der Fachmann kann viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung erkennen oder durch routinemäßiges Experimentieren finden können. Solche Äquivalente sollen von der vorliegenden Erfindung erfasst werden.
Der Begriff „und/oder“ enthält die Bedeutungen von „und“, „oder“ und „alle oder jedwede andere Kombination der Elemente, die durch diesen Begriff verbunden werden“.
Der Begriff “weniger” oder umgekehrt “mehr als” enthält nicht die konkret genannte Nummer. Zum Beispiel bedeutet „weniger als 20“ weniger als die angegebene Zahl. Ebenso bedeutet „mehr als“ oder „größer als“ die angegebene Zahl, z.B. „mehr als 80%“ bedeutet mehr als oder größer als die angegebene Zahl von 80%.
In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird, sofern sich aus dem Kontext nichts anderes ergibt, das Wort "umfassen" und Variationen wie "umfasst" und "umfassend" so verstanden, dass es die Einbeziehung einer angegebenen ganzen Zahl oder Schritten oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten bedeutet, nicht aber den Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder eines Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten. Wenn hier der Begriff "umfasst" verwendet wird, kann er durch den Begriff "enthält" oder "einschließt" oder manchmal, wenn er hier verwendet wird, durch den Begriff "hat" ersetzt werden. Wenn hierin "bestehend aus" verwendet wird, schließt "bestehend aus" jedes Element, jeden Schritt oder jede Zutat aus, die nicht angegeben sind.
Der Begriff "einschließlich" bedeutet "einschließlich, aber nicht beschränkt auf. Die Begriffe "einschließlich" und "einschließlich, aber nicht beschränkt auf werden austauschbar verwendet.
Es sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf die spezielle Methodik, die Protokolle, das Material, die Reagenzien und die Substanzen usw., die hier beschrieben werden, beschränkt ist und als solche variieren kann. Die hier verwendete Terminologie dient nur der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen und soll den Umfang der vorliegenden Erfindung, der allein durch die Ansprüche definiert wird, nicht einschränken.
Alle im gesamten Text dieser Beschreibung zitierten Veröffentlichungen (einschließlich aller Patente, Patentanmeldungen, wissenschaftlichen Veröffentlichungen, Anleitungen usw.), egal ob vorher oder nachher genannt, werden hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit einbezogen. Nichts hierin ist als Eingeständnis zu verstehen, dass die Erfindung nicht aufgrund einer früheren Erfindung zu einer solchen vorzeitigen Offenbarung berechtigt ist. In dem Maße, in dem das durch Verweis aufgenommene Offenbarung dieser Beschreibung widerspricht oder mit ihr unvereinbar ist, ersetzt die Beschreibung jegliche derartige Offenbarung.
Die folgenden Beispiele, die nur zur Veranschaulichung angeführt werden, sollen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile beitragen. Die Beispiele sollen den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Hefe und Bakterienlinien
In dieser Arbeit wurde der Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4742 (Genotyp: MATa his3A1 leu2A0 iys2A0 ura3 0) verwendet, welche aus der Gen-Knockout Kollektion der Firma Euroscarf in Oberursel stammt (Ando & Suzuki, 2005; Brachmann et al., 1998).
Verwendete Medien
YPD (für S. cerevisiae)
Komponenten Endkonzentration
Pepton 20 g/L
D-Glucose 20 g/L
Hefeextrakt 10 g/L
Agar (für Festmedium) 15 g/L
SD-URA-Medium (für S. cerevisiae)
Komponenten Endkonzentration
D-Glucose 20 g/L
Ammoniumsulfat 5 g/L
Yeast Nitrogen Base 1 ,7 g/L
CSM -URA 0,77 g/L
Agar (für Festmedium) 15 g/L
SD-Leu-Medium (für S. cerevisiae)
Komponenten Endkonzentration
D-Glucose 20 g/L
Ammoniumsulfat 5 g/L
Yeast Nitrogen Base 1 ,7 g/L
CSM -Leu 0,69 g/L
Agar (für Festmedium) 15 g/L SD-Leu-URA Medium (für S. cerevisiae)
Komponenten Endkonzentration
D-Glucose 20 g/L
Ammoniumsulfat 5 g/L
Yeast Nitrogen Base 1 ,7 g/L
CSM -Leu -URA 0,67 g/L
Agar (für Festmedium) 15 g/L
Plasmide
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Transformation von Hefen
Die Transformation basiert auf dem Protokoll von Gietz and Woods (2002) und auf Jansen et al. (2005) mit einigen eigenen Abänderungen: Hefen wurden auf YPD-Agarplatten über Nacht 1-2 Tage bei 28°C inkubiert. Zellrasen entsprechend einer 1 -pl Impföse wurden in 50 pl zuvor aufgekochtem und anschließend abgekühltem Heringsperma (2mg/ml in 10 mM TRIS-HCI, 1 mM N32EDTA, pH 8) gegeben und vermischt. Anschließend wurden zunächst die zu transformierende DNA - und ein Gemisch aus 240 pl 50% Polyethylenglycol 6000 (Gewicht/Volumen) und 36 pl 1 M Lithiumacetat hinzugegeben. Nach einer Inkubation bei 30°C für 30 Minuten wurde ein Hitzeschock bei 42°C für 30 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen bei 3000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 100 pl destilliertem und sterilisiertem Wasser aufgenommen und auf Selektionsmedium mit entsprechender Selektion ausgebracht. Diese Platten wurden bei 28°C inkubiert, bis Transformanten auftraten.
Messung der Lumineszenz
D-Luciferin Natriumsalz (Carl Roth, Deutschland) wurde in 0,1 M Na2HPO4-Citrat Puffer pH 5 zu einer finalen Luciferin-Konzentration von 1 mM gelöst. 100 pl einer Übernacht-Hefekultur wurde je nach experimenteller Fragestellung auf eine geeignete Start-ODeoo von ca.1 ,0 oder weniger in CSM-Medium eingestellt. 100 pl Hefezellen, 25 pl einer Testlösung (z.B. Aminosäure) und 25 pl 1 mM Luciferinlösung wurden in dieser Reihenfolge für eine Messung in eine Vertiefung einer schwarzen 96-well Mikrotiterplatte mit durchsichtigem Boden (Microplate, 96 well, PS, F-Bottom (Chimney Well) pClear®, Black, Med. Binding; Greiner bio-one, Deutschland) gegeben. Die Messungen wurden mit einem Tristar2S Platereader (Berthold, Deutschland) bei einer konstanten Temperatur von 28°C durchgeführt.
Beispiel 1 : Transformation des Plasmids pRS426-Lux in BY4742 und Wachstumsund Lumineszenz-Vergleich-Messung
Das Plasmid pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, siehe auch Abb. 5) wurde in den S. cerevisiae- Stamm BY4742 chemisch transformiert. Nach zwei Tagen konnten 86 Kolonien erhalten werden. Nachdem die Kolonien auf CSM-Ura-Selektionsplatten vereinzelt wurden, konnte die Lumineszenz erfolgreich gemessen werden (Abb. 1). In Abbildung 1 ist der Stamm BY4742 zu sehen, der bei einer Lumineszenz von etwa 3000 RLU startet, die bis auf maximal 5000 RLU ansteigt. Die Nukleinsäure der Erfindung kann also Biolumineszenz in Hefen ohne Zugabe von externem Luciferase-Substrat erzeugen.
Beispiel 2: Vergleich der bakteriellen Luciferase der Erfindung mit der Firefly-Luci- ferase
Um das erzeugte erfindungsgemäße Konstrukt pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7) in Bezug auf Wachstumsverhalten und Lumineszenz zu vergleichen, wurde eine Luciferase unter denselben Promotor und Terminator wie die bakterielle Luciferase LuxAB gestellt (SEQ ID NO: 20), um vergleichbare Bedingungen zu schaffen. Für den Vergleich wurde die Luciferase von Photinus pyralis gewählt, da diese am häufigsten in der Bioanalytik Anwendung findet (siehe Abb. 6).
Nachdem beide Plasmide über dieselben genetischen Voraussetzungen verfügen, wie FBA1 Promotor und Terminator, dasselbe Vektorrückgrat und auch in BY4742 transformiert wurden, konnten beide Plasmide direkt miteinander verglichen werden. Das Experiment wurde zweimal mit jeweils drei technischen Replikaten durchgeführt. Die Kulturen wurden über Nacht bei 28 °C kultiviert und wurden jeweils mit 50 pl frischem Medium (YPD- Medium) verdünnt. Bei dem hergestellten Prototyp (Nukleinsäure der Erfindung, SEQ ID NO: 7) wurde Wasser statt 50 pl der Luciferin-Lösung (2 mM Endkonzentration) hinzugegeben.
Die Nukleinsäure der Erfindung („Prototyp“) zeigt eine anfängliche Lumineszenz von etwa 100.000 RLU und steigt langsam auf 130.000 RLU nach 5,4 h an. Im Gegensatz dazu startet die F/ref/y-Luciferase bei nur 52.475 RLU und sinkt bereits nach 1 ,7 h auf 19.143 RLU. Nach 5,4 h kann nur noch eine geringe Lumineszenz von 6893 gemessen werden (siehe Abb. 2D). Die CSM-URA Platten wurden bei Tageslicht (Abb. 2A) und bei völliger Dunkelheit (Abb. 2B) von einer handelsüblichen Fotokamera aufgenommen. Auch mit bloßem Auge konnte das erzeugte Licht der Hefen wahrgenommen werden.
Anhand dieser Daten wird deutlich, dass die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung der herkömmlichen Firefly-Luciferase weit überlegen ist.
Beispiel 3: Konstruktion eines Biosensors auf Basis von Lux-Biolumineszenz-Plas- miden
Es wurde ein Plasmid kloniert, welches die Luciferase konstitutiv exprimiert. So sollte die Lumineszenz des Plasmids pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7), welches Luciferin- und Luci- ferase-Synthese auf einem einzigen Plasmid vereint (Abb. 5), mit einem System basierend auf den zwei Plasmiden pRS426- Leu2-FBA1::LuxAB (SEQ ID NO: 22) und pRS426-L/RA3- LuxCDE-frp verglichen werden (SEQ ID NO: 21 , Abb. 7). Nachdem die transformierten Hefen über Nacht gewachsen waren, konnte die Lumineszenz gemessen werden. Es wurden 100 pl der Hefekultur und 50 pl frisches Nährmedium in eine Messvertiefung gegeben (Abb. 3).
Entgegen der Erwartungen zeigte sich überraschend, dass das Aufteilen der Luciferin- und Luciferase-Synthese auf zwei Plasmide keine höhere Lumineszenz mit sich bringt. Im Gegenteil - hier wurde eine deutlich geringere Lumineszenz gemessen wurden (Abb. 3) im Gegensatz zur erfindungsgemäßen Nukleinsäure pRS426-Lux. Im System basierend auf zwei Plasmiden erreichte die Lumineszenz nach 5,3 h den Höhepunkt von nur 1948 RLU.
Die Erfinder konnten also völlig überraschend feststellen, dass das Aufteilen auf zwei Plasmide keinen positiven Effekt auf die Lumineszenz hat, sondern im Gegenteil, dass die erfindungsgemäße Expression des /ux-Operons von einer Nukleinsäure vorteilhaft ist.
Beispiel 4: Nachweis von Leucin mittels des erfindungsgemäßen Systems
Es gibt viele Möglichkeiten das Luciferase-System der Erfindung als Biosensor einzusetzen. Beispielhaft soll dies anhand des Nachweises der Leucin-Konzentration in einem Leucin-Mangelmedium gezeigt werden.
Der von den Erfindern verwendete Hefestamm BY4742 hat einige Auxotrophien, u.a. auch eine Leucin-Auxotrophie, die diesen Stamm für den Leucin-Nachweis als nützlich erscheinen lässt. Hierfür wurde der Stamm über Nacht in CSM-URA Medium angezogen. Da der Vektor pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, siehe auch Abb. 5) einen L/RA3-Marker enthält, ist für diese Hefezellen normales Wachstum möglich. Am nächsten Tag wurden die Zellen abzentrifugiert und in CSM-Leu-URA Medium, d.h. in ein Medium ohne Leucin, aufgenommen. Folglich konnten diese Zellen aufgrund von Fehlen der Aminosäure Leucin nicht wachsen. Nach 5 h Inkubationszeit wurde eine definierte Menge Leucin hinzugegeben und die Lumineszenz im Anschluss gemessen (Abbildung 4). Es konnte aber beobachtet werden, dass ab einer Leucin-Konzentration >49 mg/L die Organismen wachsen und das Lichtsignal zunimmt unabhängig von der Konzentration. Gibt man allerdings weniger als 20 mg/L Leucin hinzu wirkt diese Menge limitierend auf den Zellstoffwechsel, und damit auf die maximal mögliche Biolumineszenz. Durch den Verbrauch des vorhandenen Leucins wird dieses immer mehr limitiert, wodurch der Zellstoffwechsel und damit die Biolumineszenz über die Zeit abnehmen (Abb. 4). Der Zusammenhang zwischen vorhandenem Leucin und gemessener Biolumineszenz verhält sich in einem bestimmten Konzentrationsbereich konzentrationsabhängig, sodass die Leucin-Konzentration mit der Biolumineszenz korreliert und gemessen werden kann.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann also unter Zuhilfenahme einer (erfindungsgemäßen) Wirtszelle dazu eingesetzt werden, Umwelteinflüsse wie z.B. Leucin nachzuweisen und zu quantifizieren.
REFERENZEN
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Claims

- 29 -
Ansprüche Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend:
(i) ein Gen, das für LuxA kodiert,
(ii) ein Gen, das für LuxB kodiert,
(iii) ein Gen, das für LuxC kodiert,
(iv) ein Gen, das für LuxD kodiert,
(v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind. Nukleinsäure nach Anspruch 1 ,
(i) wobei der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor ist;
(ii) wobei die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke vermitteln;
(iii) wobei auf jedes Gen ein Terminator folgt; und/oder
(iv) wobei die Nukleinsäure keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi) enthält. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei LuxA und LuxB von Pho- torhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens sind, vorzugsweise
(i) wobei LuxA eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist; und/oder
(ii) LuxB eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Gene, die für LuxA (i) und LuxB (ii) kodieren, als ein Gen luxAB vorliegen, welches das LuxA/LuxB-Fu- sionsprotein kodiert und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind. - 30 - Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei LuxC, LuxD und LuxE von P. luminescens sind, vorzugsweise
(i) wobei LuxC eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist;
(ii) wobei LuxD eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist; und/oder
(iii) wobei LuxE eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem dervorherigen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert, umfasst, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise frp ist, vorzugsweise von V. har- veyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen. Nukleinsäure nach einem dervorherigen Ansprüche, wobei luxC, luxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der 7"EF2-Promotor ist, der Promotor von luxD vorzugsweise der CDC19- Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der E/V02-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDCf-Promotor ist. Vektor, z.B. ein Plasmid, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8. Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder den Vektor nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszelle ist, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces ce- revisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida bo- idinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adenini- vorans, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist. Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle nach Anspruch 10 umfassend das Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des Vektors nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle. Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend:
(i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle nach Anspruch 10;
(ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das LuxA/LuxB-Fusionsprotein optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist, wobei der Umwelteinfluss vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen. Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 10 als Biosensor, in einem Verfahren nach Anspruch 12 oder zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist. Kit umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8, den Vektor nach Anspruch 9 oder die Wirtszelle nach Anspruch 10.
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