EP2606355A2 - Neue biosensoren und deren verwendung - Google Patents

Neue biosensoren und deren verwendung

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EP2606355A2
EP2606355A2 EP11743248.4A EP11743248A EP2606355A2 EP 2606355 A2 EP2606355 A2 EP 2606355A2 EP 11743248 A EP11743248 A EP 11743248A EP 2606355 A2 EP2606355 A2 EP 2606355A2
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EP
European Patent Office
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protein
fluorescence
fbfp
yfp
donor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11743248.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl Erich Jaeger
Thomas Drepper
Stephan Endres
Janko Potzkei
Achim Heck
Franco Circolone
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evocatal GmbH
Original Assignee
Evocatal GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evocatal GmbH filed Critical Evocatal GmbH
Publication of EP2606355A2 publication Critical patent/EP2606355A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • Y10T436/209163—Dissolved or trace oxygen or oxygen content of a sealed environment

Definitions

  • the present invention relates to FRET donor-acceptor pairs for use as biosensors.
  • Biosensors are generally defined as integrated measuring systems in which biological recognition structures interact with suitable analytes.
  • a physiochemical signal is generated by the biosensor, which can be converted into evaluable measured values by a transducer located in steric proximity.
  • Such biosensors are widely used in clinical diagnostics, environmental analysis, food analysis, process control, and basic science.
  • biological biosensors consist of biomacromolecules such as nucleic acids (DNA / RNA) or proteins, where proteins are very well suited as biosensors because they recognize highly diverse molecules in cells and with can bind to a high affinity.
  • biosensors With the help of such biosensors, metal ions, various sugars such as glucose, nucleic acids or certain chemicals can be detected by various interactions with the biosensor.
  • biosensors can help to monitor biological processes such as post-translational modifications, protein-protein interactions, enzyme activities, as well as detection of physical cell parameters such as the pH or concentration of certain metabolites, e.g. To analyze chloride ions in living organisms. Depending on the signals to be detected and the transducer, detection can be carried out over several paths.
  • biosensors are optically, electrically, electrochemically, thermally or magnetically detectable.
  • Another highly specific and sensitive way to efficiently detect a signal by means of a biosensor is to transmit the signal via fluorescence.
  • fluorescent reporter proteins have been developed which either (1) interact directly with the substrate or signal to be detected via a specific sensor domain, whereby the fluorescence domain fluoresces only in their presence or absence, or (2) the fluorescence properties of a fluorescence domain the Changes in cell parameters or metabolites such as fluctuating pH is directly altered.
  • zinc ions can be detected by means of a modulated eYFP (insertion of a zinc finger domain) or calcium ions can be detected by insertion of calmodulin into the permuted eYFP.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • FRET energy transfer from the donor to the acceptor
  • the efficiency of FRET depends on several factors.
  • the emission band of the donor must have a sufficiently large overlap with the absorption band of the acceptor.
  • the distance r and the orientation of the chromophores to each other play an important role.
  • r should be between 10 and 100 amps.
  • the spatial orientation of the dyes is crucial for the intensity of the energy transfer. This runs without radiation and directed and can take place only if the Gögangsdipolmomente of donor and acceptor are arranged as parallel as possible.
  • the development of FRET biosensors today makes it possible to detect or identify complex cell processes, cell parameters or protein interactions in basic research and in biotechnology much more accurately because the dependence of the fluorescence signal of two fluorescence reporters greatly increases the sensitivity of the signal recognition ,
  • Green Fluorescent Protein GFP and related fluorescent proteins are often used for single biosensors or as FRET pairs or biosensors.
  • GFP and its color variants are widely used in many areas of basic research and biotechnology: Fluorescent proteins are used to study gene regulatory mechanisms or to monitor biotechnological processes. Fluorescence reporters can also be used to study cellular differentiation processes and localize the target protein in the cell. These can also be used to verify folding processes of heterologous proteins in bacterial expression strains.
  • GFP and related proteins are used, for example, to detect a wide variety of ions in eukaryotes as well as in prokaryotes and in certain cell types, such as nerve cells.
  • the first FRET-based calcium sensor was able to detect the concentration of Ca 2+ ions in cells (Baird et al., 1999); the
  • a FRET donor-acceptor pair for use as a biosensor comprising at least two fluorescent proteins, wherein at least one fluorescent protein is stable to at least one of the parameters to be detected by the biosensor
  • Fluorescent protein is not stable to a parameter to be detected by the biosensor.
  • the term "fluorescent protein” means a protein that can emit fluorescence, whereby the fluorescence property can be caused by binding of a chromophore or fluorophore to certain protein regions, for example to a LOV domain, or the fluorescence property is in the peptide sequence of the protein,
  • the fluorescence is emitted after excitation of the fluorescent protein with light of a certain wavelength, and most of the time the excitation causes a spontaneous emission of light during the transition of an electronically excited system into a state of lower energy, whereby the emitted light As a rule, is lower in energy than the previously absorbed.
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • acceptor is understood to mean the fluorescent protein which is excited by irradiation with light and which transfers the energy to an acceptor.
  • acceptor is understood to mean the fluorescent protein which absorbs the energy of the donor which has arisen due to the light irradiation.
  • FRET donor-acceptor pair is to be understood below to mean a pair of fluorescent proteins in which the emission band of the donor has a sufficiently large overlap with the absorption band of the acceptor to allow energy transfer with subsequent fluorescence emission conceivable that the FRET donor-acceptor pair comprises other proteins besides the donor and the acceptor.
  • biosensor is to be understood below as a biological sensor comprising biomacromolecules such as nucleic acids (DNA / RNA) or proteins.
  • stable is to be understood in the following text that a fluorescent protein within the parameter range to be observed by the parameter to be detected in the Essentially not affected.
  • unstable or labile is understood to mean that a fluorescence protein within the parameter range to be observed is measurably influenced by the parameter to be detected.
  • the genetically encoded FRET-donor-acceptor pair allows a more accurate investigation of the changes of cell parameters than the previously known FRET pairs.
  • at least one fluorescent protein of the FRET pair is stable to a parameter to be detected by the biosensor, while at least one other fluorescent protein is labile to a parameter to be detected by the biosensor.
  • the at least one property e.g. the fluorescence property of the labile protein changes as the parameter to be detected changes.
  • a fluorescence protein is selected whose properties do not change in the area to be examined, and a fluorescence protein in which at least one property can be influenced by the pH in the area to be examined.
  • Chromophore properties (such as absorption and fluorescence properties)
  • the FRET donor-acceptor pair for use as a biosensor comprises exactly two fluorescent proteins.
  • the FRET donor-acceptor pair according to the invention can be used as biosensors, for example for use in diagnostics, for example for the screening of enzyme functions. This serves both the assignment of unknown enzymes to the respective enzyme classes, the identification of possible substrates and thus the elucidation of the specificity of the enzyme, as well as the finding of possible enzyme inhibitors, which are interesting as potential active ingredients.
  • FRET systems fulfill these requirements very well, not only because of the simple, direct detection of a specific signal, but also because of their broad applicability, and are therefore used more and more.
  • at least two fluorescent proteins of the FRET donor-acceptor pair carry different chromophores.
  • chromophore is understood below to mean certain groups in molecules which characteristically influence the absorption behavior of the compound.
  • the chromophore is a fluorophore, that is, an element in a molecule that causes the fluorescence property of the molecule.
  • the fluorophore is therefore the part of a fluorescent protein that absorbs and emits the incident light of a certain wavelength.
  • fluorophore is understood as meaning both a molecule which binds the fluorescent protein and certain peptide sequences within the fluorescent protein.
  • a molecule bound as a fluorophore by a fluorescent protein is flavin mononucleotide
  • the tripeptide sequence Ser65-Tyr 6 6-Gly67 of GFP is an example of peptide sequences present as a fluorophore within a fluorescent protein.
  • the functional structure of the tripeptide sequence Ser 6 5-Tyr 6 6-Gly67 is a 4- (p-hydroxy-benzylidene) -imidazolide-5-one formed by cyclization followed by oxidation of the tripeptide.
  • the chromophores are preferably selected from the group comprising:
  • Flavin adenine dinucleotide FAD
  • This embodiment has the advantage that it is ensured by the different chromophores that the at least two fluorescent proteins react differently to many parameters to be measured, and thus the change of the respective parameter can be detected.
  • At least one fluorescent protein is oxygen-independent and at least one fluorescent protein is oxygen-dependent.
  • oxygen-independent is to be understood below that a fluorescent protein for chromophore synthesis does not require oxygen, while the term “oxygen-dependent” is to be understood that a fluorescent protein for chromophore synthesis requires oxygen.
  • All fluorescence proteins of the GFP family without exception form the chromophore in a multistep autobiocatalysis. Since molecular oxygen is needed in this process, the maturation of the chromophore and thus the formation of the fluorescence signal depends directly on this environmental factor. Consequently, the applications of GFP and its derivatives as fluorescent reporter proteins are limited to aerobic systems, and the fluorescent signal of these proteins is not usable in obligate anaerobic organisms or under hypoxic conditions.
  • the FRET-donor-acceptor pair of the present invention is particularly advantageous since for the first time it offers the possibility of highly sensitive determination of different oxygen concentrations in vivo as well as in vitro with a genetically encoded FRET donor-acceptor pair. This also goes along with the fact that the FRET donor-acceptor pair according to the invention is particularly advantageous since it can also be used in anaerobic systems.
  • At least one of the at least two fluorescent proteins of the FRET-donor-acceptor pair of the invention is an LOV protein.
  • fluorescent protein comprising a LOV domain is to be understood below a protein having a light-oxygen voltage (LOV) domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid and in addition to the exchange Unlike the GFP-like fluorescent proteins, the LOV domain proteins bind the cofactors FMN, FAD or riboflavin provided by the host organism, which are synthesized independently of oxygen in both prokaryotes and eukaryotes for proteins comprising a LOV domain are the blue light receptor YtvA from B. subtilis and the sensory box protein SB2 from Pseudomonas putida.
  • LOV domain proteins bind the cofactors FMN, FAD or riboflavin provided by the host organism, which are synthesized independently of oxygen in both prokaryotes and eukaryotes for proteins comprising a LOV domain are the blue light receptor YtvA from B. subtilis and the sensory box protein SB2 from Pseudomonas putida.
  • the blue light receptor YtvA is a 261 amino acid protein that has been classified as a putative protein kinase during complete genome sequencing of B. subtilis. It plays a role as a positive regulator in the o B- mediated stress response of B. subtilis. YtvA could be identified by sequence homology comparisons with the primary structure of plant blue light receptors, the phototropins.
  • YtvA consists of an N-terminal LOV domain and a C-terminal STAS ("sulfate transporter antisigma") domain
  • the LOV domain displays a specific folding motif from a 5-stranded antiparallel ⁇ -sheet, that of ⁇ -helices laterally
  • the LOV domain contains the consensus sequence NCRFLQ known from plant phototropins, whereby the photoactive cysteine contained therein covalently binds the cofactor FMN as a chromophore during the LOV-specific photocycle, with YtvA emitting by excitation with light of wavelength 450 nm transferred to the ground state in a photoproduct that absorbs at 383 nm and has an emission maximum of 498 nm.
  • this photoproduct decomposes into a photoadduct, in which the FMN is covalently bound.
  • the LOV domain loses the property of fluorescence until the ground state is reached again.
  • Sequence homology comparisons of the LOV domain of YtvA from B. subtilis with the genome sequence of the Gram-negative rod bacterium P. putida KT2440 identified a gene coding for a putative LOV protein. This is the 151 amino acid SB2 (sensory-box 2), which consists of only one LOV domain.
  • the SB2 protein has the consensus sequence characteristic of LOV domains. Due to the discovery of the photoactive region, the photocycle of the Sensory Box2 protein was investigated.
  • the at least one cysteine in the LOV domain is replaced by alanine.
  • At least one of the at least two fluorescent proteins of the FRET-donor-acceptor pair according to the invention is an FbFP protein.
  • a family of proteins comprising LOV domains and recombinant variants of the bacterial blue light receptors of the LOV family has recently been completely redeveloped. Unlike the GFP-like fluorescent proteins, the new fluorescent markers are very small (16-19 kDa).
  • the bacterial proteins were modified by means of modern methods, the so-called directed evolution. The autofluorescence of the proteins was drastically increased by these mutations, as a result of which the FMN-binding fluorescent proteins (FbFPs), in particular the FbFP from P. putida KT2440 (SEQ ID No. 4) and the B. subtilis FbFps (SEQ ID No.
  • the new marker proteins could be expressed in different pro- and eukaryotic host cells and the fluorescence characteristic of FbFP could be detected in vivo.
  • the photochemical characterization of the new marker proteins revealed that the FbFPs emit a blue-green fluorescence (495 nm) after excitation with blue light (450 nm).
  • the "FMN-based fluorescence protein" (FbFPs) is therefore now available
  • Fluorescence reporter proteins that fluoresce independently of the oxygen partial pressure. Unlike GFP family members, FbFP does not require oxygen for the formation of fluorescence. Further, a FRET donor-acceptor pair is preferred for use as a biosensor comprising a fusion protein of an FbFP protein and a GFP-related protein.
  • a GFP-related protein is to be understood as meaning a protein which has a structure similar to GFP, as for example in the case of yellow fluorescence protein (YFP), cyan fluorescence protein (CFP) and enhanced green fluorescence protein (eGFP) Likewise, "YFP-related protein” refers to a protein that has a structure similar to YFP.
  • a fusion protein of a FbFP protein and a GFP-related protein can be used as a FRET pair. This was not foreseeable, since the emission band of the donor must have a sufficiently large overlap with the absorption band of the acceptor.
  • the fusion protein of an FbFP protein and a GFP-related protein has a number of advantages.
  • this FRET donor-acceptor pair can often be used both in vivo and in vitro for the quantitative determination of various parameters, such as pH, oxygen and halide ion concentration, as well as for the detection of riboflavin, FAD, FMN or for observation be used by temperature changes.
  • the fusion protein of an FbFP protein and a GFP-related protein determines the current acid substance concentration on the basis of the ratio of the two fluorescence maxima so that one can infer directly on the oxygen concentration in the cell and / or in the system.
  • the fusion protein of a FbFP protein and a GFP-related protein is thus especially for the investigation or optimization of metabolic processes or Expression studies in aerobic and anaerobic cells or systems in biotechnology can be used in cancer research as well as in basic research for the investigation of oxygen limitations in cells.
  • FbFP protein-GFP-related protein fusion protein provides an excellent tool for detecting microaerobic regions in biofilms, while providing additional mechanisms and correlations through the FRN system-independent FMN-based fluorescence protein (FbFP) in the biofilms under anaerobic conditions.
  • the preferred FRET donor-acceptor pair can also be used for the determination of the pH, since apparently the fluorescence intensity of an FbFP protein does not depend on different pH values, but the fluorescence intensity of a GFP related protein.
  • a fusion protein of an FbFP protein and a GFP-related protein surprisingly shows a much higher pH sensitivity than comparable FRET systems.
  • Variations can thus be detected much more accurately with the fusion protein of an FbFP protein and a GFP-related protein.
  • the fusion protein from FbFP protein and a GFP-related protein can be used in lifetime pH imaging in cells where, at different growth phases, the pH of the various cell compartments is also in the acidic areas of the cells in vivo, such as in lysosomes or peroxisomes.
  • the fusion protein of FbFP protein and a GFP-related protein can be used very effectively in the determination or localization of different ion concentrations such as chloride or iodide, as it has a greater FRET ratio range and thus by contrast with the established biosensors the larger dynamic range can be much more sensitive to changes in the ion concentrations to be detected.
  • the protein related to the GFP is affected by a varying halide ion concentration, which results in a different intensity of fluorescence emission, presumably due to an influence of the ions on protein folding.
  • the fusion protein is made from an FbFP protein and a GFP-related protein for use, e.g. in the field of neurobiology.
  • FbFP protein-GFP-related protein fusion protein would be as a temperature biosensor in cancer therapy. This would be in the range, since fluorescence measurements have shown that FbFPs in temperature ranges from 30 ° C to 65 ° C compared to GFP related proteins react much more sensitive to temperature.
  • FMN, FAD or riboflavin are the preferred FRET donor-acceptor pair for the detection of rivoflavin in cells and tissues.
  • a molecular riboflavin sensor is of great importance in many areas of (molecular) medicine. He can do this, for example contribute to better study of riboflavin deficiency symptoms and the resulting clinical pictures such as corneal degeneration, night blindness or other clinical pictures.
  • the GFP-related protein is YFP.
  • the YFP is the acceptor and the FbFP protein is the donor of the FRET donor-acceptor pair.
  • This preferred FRET donor-acceptor pair is based on translational fusion between the YFP and an FbFP fluorescent protein, in which the FbFP fluorescence domain is C-terminally fused to the target protein YFP.
  • the two proteins were connected by means of a linker (see Fig. 2).
  • the invention provides the use of a complex of a protein having a LOV domain and a fluorescent protein for resonance energy transfer, wherein either the donor or the acceptor of the resonance energy transfer in the anaerobic environment can fluoresce.
  • complex is to be understood as meaning that the two proteins are in spatial proximity with one another, which can be achieved in various ways, for example by covalent and non-covalent bonds, such as the biotin-streptavidin bond Milieu "should be understood in the following conditions under which comparatively little to no oxygen for reactions such as metabolic processes or catalysis is available.
  • the term "capable of fluorescing” is to be understood as meaning that a fluorescent protein can be excited by light of certain wavelengths and / or that it can release the energy absorbed during the excitation again.
  • the use of such a complex is advantageous because it allows the implementation of a Resonanzenergietransfers in anaeorben milieu or conditions with low oxygen. As already mentioned, this is not possible with complexes from the prior art, for example complexes of different proteins of the GFP protein family.
  • the donor is a protein having a LOV domain.
  • proteins with a LOV domain in the anaerobic environment can fluoresce or be excited.
  • complexes of a protein with a LOV domain as donor and a fluorescent protein as an acceptor for oxygen measurement can be used.
  • a reduction of the oxygen content causes a reduced energy transfer of the oxygen-independent protein with a LOV domain to the oxygen-dependent acceptor.
  • the acceptor is a YFP-related protein, that is, a protein comprising an amino acid sequence
  • a YFP-related protein acceptor has the advantage, in particular in connection with a protein having a LOV domain as donor, that the different structures and different chromophores ensure that the two proteins react differently to many parameters to be measured and thus the Change of the parameter can be detected by resonance energy transfer.
  • the protein becomes a LOV domain a) encoded by a nucleic acid of SEQ ID NO. 3, 5 or 7 or a fragment, a variant, a homologue or derivative of one of these sequences,
  • nucleic acid which can hybridize to one of the nucleic acids from a) under stringent conditions
  • nucleic acid which has at least 70% preferably 95% identity with one of the nucleic acids from a) or b),
  • nucleic acid which can hybridize to the complementary nucleic acid of one of the nucleic acids from a) -c) under stringent conditions
  • g an amino acid sequence according to one of SEQ ID Nos. 4, 6 or 8, or a fragment, a variant, a homologue or derivative of one of these sequences, and / or h) an amino acid sequence which has a sequence identity of at least 70% 95% with one of the amino acid sequences of g).
  • nucleic acid is to be understood as meaning a single-stranded or double-stranded macromolecule composed of nucleotides
  • the most common nucleic acids are deoxyribonucleic acid (DNA) or complementary DNA (cDNA) and ribonucleic acid (RNA)
  • Nucleic bases are adenine, cytosine, guanine and thymine, the latter being specific for DNA
  • RNA ribonucleic acid
  • Nucleic bases are adenine, cytosine, guanine and thymine, the latter being specific for DNA
  • the same nucleobases or nucleotides are present in the RNA apart from thymine, which is replaced by uracil.
  • Artificial nucleic acids are, for example, Peptide Nucleic Acid (PNA), morpholino and Locked Nucleic Acid (LNA), as well as Glycol Nucleic Acid (GNA) and Threose Nucleic Acid (TNA). Each of these nucleic acids differs in structure from the backbone of naturally occurring nucleic acids.
  • RNA duplexes is to the other complementary because the base pairs of the two strands are non-covalently linked by two or three hydrogen bonds.
  • RNA duplexes there are exceptions for thymine / uracil and the wobble complex of tRNA - there is only one complementary base for each base of a nucleic acid. Therefore, it is possible to reconstruct the complementary strand of a single strand. This is essential, for example, for DNA replication. For example, the complementary strand of the DNA sequence would be
  • the term “complementary” may also refer to cDNA.
  • cDNA is synthesized by means of the enzyme reverse transcriptase from RNA e.g. mRNA synthesized.
  • hybridizing or hybridization is understood below to mean the process in which a nucleic acid of more or less complete complementary nucleic acid is attached by forming hydrogen bonds between the respective complementary nuclein bases. is understood below that the conditions of the hybridization reaction are set so that only completely complementary bases hydrogen bonds can form.
  • the stringency can be influenced for example by the temperature.
  • silent mutation is to be understood as the phenomenon that a mutation in a nucleic acid section does not have any consequences, which is the case because the information content of the gene has not changed, because a number of amino acids are different Triplets of successive nucleobases - called triplets or codons - encoded.
  • fragment is intended in the following to designate a part of a nucleic acid or an amino acid sequence which lacks some parts of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence, but which contains at least part of its activity, for example in US Pat Regarding fluorescence properties, enzyme activity or binding to other molecules.
  • nucleic acid or an amino acid sequence which, in terms of its structure and biological activity, substantially equals the structure and biological activity of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence.
  • derivative is understood in the following to mean a related nucleic acid or amino acid sequence which has similar characteristics with respect to a target molecule as a claimed nucleic acid or amino acid sequence.
  • homologue is understood in the following to mean a nucleic acid or an amino acid sequence in the sequence of which a claimed nucleic acid or amino acid sequence has been added, deleted, substituted or modified in any other way as claimed in the claimed sequence However, it is understood that the homologue has essentially the same properties as a claimed nucleic acid or amino acid sequence.
  • optimized for a particular expression system is understood below to mean that a nucleic acid is linked to the codon usage of the organism in which it is expressed. is adjusted. Codon usage, codon usage, codon bias, describes the phenomenon that variants of the universal genetic code are used by different species at different rates.
  • sequence identity of at least X% is understood in the following to mean a sequence identity which has been determined by a sequence alignment (alignment) by means of a BLAST algorithm, as it is available on the homepage of the NCBI.
  • the donor-acceptor pair is genetically encoded and / or is present as a fusion protein and / or is expressed together as a transcription unit.
  • genetically encoded donor-acceptor pairs have the advantage that they do not have to be taken up by an active transport mechanism or permeabilization of the cell membrane in living cells.
  • genetically encoded donor-acceptor pairs can be used non-invasively.
  • Genetically encoded donor-acceptor pairs can additionally be localized in desired cell compartments by fusion with suitable signal sequences or fused to any desired target proteins.
  • detection is to be understood in the following as meaning that one of the factors oxygen, pH value, halide ions, temperature and / or flavin is actually detected, and secondly that "detection” also includes a measurement of one of the factors understand. This happens e.g. by calculating a ratio of the two fluorescence maxima of the at least two fluorescent proteins, the ratio changing if the factor to be measured changes.
  • Fig. 1 shows the scheme of a FRET system
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the YFP FbFP fusion protein
  • Figures 3 and 4 show a cloning strategy for generating the YFP FbFP fusion protein
  • Figures 5 and 6 show a cloning strategy for generating the YFP FbFP fusion protein
  • Fig. 7 shows the in vivo fluorescence of the YFP FbFP fusion protein
  • Fig. 8 shows the thrombin pro teaseably cleavage of the YFP FbFP fusion protein
  • 9 shows the fluorescence photometric measurement of the Na 2 S 2 O 4 reduction of the YFP
  • Fig. 10 shows the in vitro pH fluorescence measurement of the YFP FbFP fusion protein
  • Fig. 11 shows the in vitro pH stability measurement of the YFP FbFP fusion protein
  • Fig. 12 shows a fluorescence photometric measurement of the suitability of the YFP FbFP fusion protein as an ion biosensor
  • Fig. 13 shows a temperature stability test of YFP and FbFP.
  • Fig. 1 shows the scheme of a FRET system.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of the YFP FbFP fusion protein (SEQ YD No 10).
  • SEQ YD No 10 A translational fusion in which the FbFP fluorescence domain (SEQ ID No. 4) is C-terminally fused to the target protein YFP (SEQ ID No. 2) was generated in order to be able to investigate whether the combination of the two proteins is a new FRET protein. Pair is suitable.
  • the two proteins were linked by means of a linker (SEQ ID No 15 & 16).
  • Figures 3 and 4 show a cloning strategy for generating the YFP FbFP fusion protein (SEQ ID No 10).
  • the fluorescent domains FbFP and YFP were amplified by means of PCR with modified primers (SEQ ID Nos. 11-14) and new restriction sites were generated.
  • the cloning of the individual modules and the linker was carried out in the cloning vector pBlueScript KSII (-), which allows a blue-white selection in E. coli DH5a cells.
  • Figures 5 and 6 show a cloning strategy for generating the YFP-FbFP fusion (SEQ ID No 9).
  • Fig. 7 shows the in vivo fluorescence of the YFP FbFP fusion protein (SEQ ID No 10).
  • the fluorescence of the cells was detected after stimulation with ⁇ 380nm by means of a fluorescence photometer (Perkin Elmer).
  • the pictured Curves correspond to the specific fluorescence emissions of the proteins mentioned in the figure.
  • Fig. 8 shows the thrombin protease cleavage of the YFP FbFP fusion protein (SEQ ID No 10).
  • the fluorescence emission of the reduction of the biosensor YFP-FbFP (SEQ ID No. 10) with 50 mM Na 2 S 2 O 4 in protein buffer (10 mM NaH 2 PO 4 ; 10 mM NaCl; pH 8) is shown.
  • the fluorescence emission of the fusion was determined before addition of sodium dithionite (dashed line).
  • Fig. 10 shows the in vitro pH fluorescence measurement of the YFP FbFP fusion protein (SEQ ID No 10).
  • the fluorescence emission of the fusion was detected upon excitation of the purified proteins with the help of the Perkin Elmer fluorescence photometer.
  • the absorbance 380nm of the protein was adjusted to 0, 1 in the protein buffer and measured.
  • Figure 11 shows the in vitro pH stability measurement of the YFP FbFP fusion protein (SEQ ID No 10). Shown is the calculated fluorescence ratio 527 nm / 495 nm of the emission maxima YFP (SEQ ID No. 2) and FbFP (SEQ ID No. 4) of the in vitro measurement of the pH stability of the FRET fusion YFP-FbFP in a pH range of 4 to 7.
  • the fluorescence emission of the fusion was detected upon excitation of the purified protein with the help of the Perkin Elmer fluorescence photometer.
  • the absorbance5 2 7 nm of the protein was adjusted to 0.1 in the protein buffer and measured.
  • Fig. 13 shows a temperature stability test for YFP and FbFP.
  • the fluorescent proteins FbFP (SEQ ID No. 4) and YFP (SEQ ID No. 2) were individually expressed and a fluorescence spectrum was also recorded during this excitation.
  • the fluorescence of the empty plasmid pRhotHi-2 was determined, as can be seen with reference to FIG.
  • the fusion was purified via His 6 tag by affinity chromatography and incorporated into protein buffer (10 mM NaH 2 P0 4 , 1 mM NaCl, pH 8) to carry out the necessary investigations.
  • protein buffer 10 mM NaH 2 P0 4 , 1 mM NaCl, pH 8.
  • a strong decrease of the YFP fluorescence signal as a function of oxygen could be detected.
  • FIGS. 10 and 11 show that the new biosensor is outstandingly suitable for the extremely sensitive determination of the pH.
  • the graph shown in Fig. 10 shows the ratio of the fluorescence maxima of YFP and FbFP in the YFP-FbFP fusion protein (SEQ ID No. 10). It can be clearly seen that the measuring range of the new biosensor ranges from 4.0 to 7.0, which covers the entire physiological range of living organisms.
  • the YFP-FbFP fluorescence ratio drops from pH 7 to pH 4 by a factor of 2.5. This effect can be explained by a destabilizing effect of the YFP chromophore by the pH-dependent protonation of the chromophore. Additional fluorescence measurements with the individual fluorescent proteins YFP and FbFP also demonstrate this destabilizing effect of the pH on the YFP fluorescence signal, while the fluorescence emission in the case of FbFP scarcely decreases over the pH range from 8 to 4.5. Thus, these data clearly demonstrate that the YFP-FbFP fusion protein (SEQ ID No. 10) can be used for the sensitive determination of pH both in vitro and in vivo. 6. Use of the YFP-FbFP fusion protein as a halide ion biosensor
  • FbFP fluorescence emission of FbFP
  • SEQ ID No. 4 the expression vector pRhotHi2_ / fr p + His6 was transformed into the expression strain E. coli BL21 (DE), the overexpressed gene, purified, concentrated and rebuffered. The success of expression and purification were checked by SDS-PAGE (results not shown).
  • the ion concentrations tested were prepared by dissolving appropriate amounts of sodium chloride or sodium iodide in this buffer. The measurement was then carried out in a fluorescence photometer (LS 50 B, Perkin Elmer) at an excitation wavelength of 380 nm. It was found that the fluorescence emission of the FbFP is hardly affected by the ion concentrations tested, since the relative fluorescence emission as a function of the ion concentration is approximately constant in the range of about 150 units (data not shown).
  • the ratios resulting from the emission maxima at 495 (FbFP) and 527 nm (YFP) indicate that the YFP-FbFP fusion protein is also surprisingly sensitive to different halide ions - Concentrations reacts. It can be seen in the bar graph ( Figure 12) that the ratios of emission maxima of FbFP and YFP decrease with increasing concentration of both the chloride and iodide ions. In this case, the fusion reacts to the same concentrations of iodide ions more sensitive than to chloride ions, which is due to the much greater drop in the Equalization line is determined over the respective measurement series.
  • the two fluorescent proteins FbFP (SEQ ID No. 4) and YFP (SEQ ID No. 2) were overexpressed in E. coli BL21 (DE3) cells, disrupted and purified by His 6 tag affinity chromatography.
  • the proteins After conversion into the protein buffer (10 mM NaH 2 P0 4 ; 10 mM NaCl, pH 8), the proteins adjusted to an absorbance of 0.1 were incubated at the respective temperature for 5 minutes and then the fluorescence emission was determined photometrically using the Perkin Elmer photometer ,
  • the YFP protein is much more stable at high temperatures than the FbFP protein, as YFP still shows 82-75% fluorescence emission at 60-65 ° C compared to the maximum emission at 22.5 ° C , In FbFP, the fluorescence emission decreases significantly up to 27%. At 65 ° C this fluorescence protein no longer shows any fluorescence.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens eins nicht stabil ist.

Description

Neue Biosensoren und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft FRET - Donor- Akzeptor-Paare zur Verwendung als Biosensor.
Als Biosensoren definiert man im Allgemeinen integrierte Messsysteme, bei denen biologische Erkennungs strukturen in Wechselwirkung mit geeigneten Analyten stehen. Hierbei wird durch den Biosensor ein physiochemisches Signal erzeugt, welches durch einen sich in sterischer Nähe befindlichen Transducer in auswertbare Messwerte umgewandelt werden kann. Solche Biosensoren finden eine breite Anwendung in der klinischen Diagnostik, der Umweltanalytik, der Lebensmittelanalytik, in der Prozesskontrolle und in der Grundlagenforschung. Im Gegensatz zu den physikalischen oder chemischen Biosensoren, welche meistens eine künstliche Komponente beinhalten, bestehen biologische Biosensoren aus Biomakromolekülen wie Nukleinsäuren (DNA/RNA) oder Proteinen, wobei Proteine sehr gut als Biosensoren geeignet sind, da sie verschiedenste Moleküle in Zellen hochspezifisch erkennen und mit einer hohen Affinität binden können.
Mit Hilfe solcher Biosensoren können Metall-Ionen, verschiedene Zucker wie zum Beispiel Glucose, Nukleinsäuren oder auch bestimmte Chemikalien durch verschiedene Interaktionen mit dem Biosensor detektiert werden. Darüber hinaus können Biosensoren dazu beitragen, biologische Vorgänge wie zum Beispiel post-translationale Modifikationen, Protein-Protein Interaktionen, Enzymaktivitäten sowie eine Detektion von physikalischen Zellparameter wie dem pH- Wert oder der Konzentration bestimmter Metabolite wie z.B. Chlorid-Ionen in lebenden Organismen zu analysieren. Abhängig von den zu detektierenden Signalen und dem Transduktor ist eine Detektion über mehrere Wege durchführbar. So sind Biosensoren optisch, elektrisch, elektrochemisch, thermisch, oder magnetisch detektierbar.
Eine weitere hoch spezifische und empfindliche Möglichkeit ein Signal effizient mittels eines Biosensors zu detektieren, ist die Übertragung des Signals über Fluoreszenz. Zu diesem Zweck wurden rekombinante Fluoreszenzreporterproteine entwickelt, die entweder (1) über eine spezifische Sensordomäne in direkter Interaktion mit dem zu ermittelnden Substrat bzw. Signal stehen, wodurch die Fluoreszenzdomäne nur bei deren An- oder Abwesenheit fluoreszieren oder (2) die Fluoreszenzeigenschaften einer Fluoreszenzdomäne durch die Veränderungen der Zellparameter oder -Metaboliten wie z.B. schwankendem pH-Wert direkt verändert wird. So lassen sich anhand eines modulierten eYFP (Insertion einer Zinkfinger- Domäne) Zink- Ionen detektieren oder durch eine Insertion von Calmodulin in das permutierte eYFP Calcium- Ionen detektieren.
Um auch geringe Schwankungen z.B. bei zellspezifischen Signalen, Metaboliten bzw. Proteinen exakt auflösen und detektieren zu können, wurden immer mehr Biosensoren entwickelt, denen ein Förster resonance energy transfer (FRET)-System zugrunde liegt. Um das Phänomen der Fluoreszenz-Resonanz beobachten zu können, benötigt man zwei in ihren optischen Eigenschaften aufeinander abgestimmte Chromophore: Einen so genannten Donor und einen Akzeptor. Aufgabe des Donors ist die selektive Absorption des von einer Lichtquelle ausgestrahlten Lichts und dessen anschließende Wiederabstrahlung, die in der Regel zu längeren Wellenlängen hin verschoben ist. In diesem Emissionsspektrum liegt das Absorptionsmaximum des Akzeptors, so dass dieser die abgestrahlte Energie aufnehmen kann. Insgesamt beobachtet man also mit der Emission des Akzeptors einen Energietransfer vom Donor zum Akzeptor, den man als FRET bezeichnet. Die Effizienz des FRET ist von mehreren Faktoren abhängig. So muss die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen. Desweiteren spielen der Abstand r und die Orientierung der Chromophore zueinander eine wichtige Rolle. Um ein ausreichend intensives Signal zu erhalten, sollte r zwischen 10 und 100 A liegen. Des Weiteren ist die räumliche Orientierung der Farbstoffe für die Intensität des Energie- Transfers von entscheidender Bedeutung. Dieser verläuft strahlungslos und gerichtet und kann nur dann stattfinden, wenn die Übergangsdipolmomente von Donor und Akzeptor möglichst parallel zueinander angeordnet sind. Durch die Entwicklung von FRET-Biosensoren ist man heutzutage in der Lage, komplexe Zellvorgänge, Zellparameter oder Proteininteraktionen in der Grundlagenforschung und in der Biotechnologie viel genauer zu detektieren bzw. zu identifizieren, da die Abhängigkeit des Fluoreszenzsignales von zwei Fluoreszenzreportern die Empfindlichkeit der Signalerkennung stark erhöht.
Da die Untersuchung von Reaktionswegen in lebenden Systemen sowie die Identifizierung der dabei beteiligten Moleküle sehr schwierig ist, besteht erheblicher Bedarf an der Entwicklung von Analysemethoden, die schnell und effizient Ergebnisse liefern. Gerade bei Vorgängen wie Proteinfaltung, Wechselwirkung zwischen Proteinen untereinander oder mit DNA bzw. RNA, sowie Reaktionen von Enzymen mit ihren jeweiligen Substraten, ist ein Verfahren zur abstandsabhängigen Untersuchung dieser Prozesse wünschenswert, weshalb FRET-Systemen auch als Biosensoren ein besonderes Interesse zukommt. Mit Hilfe dieser "molekularen Werkzeuge" ist es möglich, Abstandsänderungen im nm-Bereich in Echtzeit zu verfolgen, weshalb es sich besonders für die Analyse von biochemischen Ereignissen in vitro und in vivo eignet.
Die Suche nach FRET-Biosensoren gestaltet sich allerdings sehr arbeitsaufwendig, da die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen muss. In der Regel müssen daher für jedes mögliche FRET-Paar umfangreiche Untersuchungen durchgeführt werden.
Bisher werden häufig das Green Fluorescent Protein (GFP) und mit ihm verwandte Fluoreszenzproteine für single Biosensoren oder als FRET-Paare bzw. Biosensoren verwendet.
GFP und seine Farbvarianten (z.B. YFP, yellow fluorescent protein) finden in vielen Bereichen der Grundlagenforschung und Biotechnologie eine breite Anwendung: So werden fluoreszierende Proteine zur Untersuchung von genregulatorischen Mechanismen oder zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen eingesetzt. Für die Untersuchung von zellulären Differenzierungsprozessen und zur Lokalisation des jeweiligen Zielproteins in der Zelle können ebenfalls Fluoreszenzreporter verwendet werden. Diese können auch zur Überprüfung von Faltungsprozessen heterologer Proteine in bakteriellen Expressions Stämmen dienen.
In FRET Reaktionen werden GFP bzw. verwandte Proteine beispielsweise zum Nachweis von verschiedensten Ionen in Eukaryoten als auch in Prokaryoten sowie in bestimmten Zelltypen wie etwa Nervenzellen verwendet. Mit dem ersten FRET basierenden Calciumsensor war man in der Lage, die Konzentration der Ca2+-Ionen in Zellen nachzuweisen (Baird et ah, 1999); die
Gruppe um Marco Mank konnte 2006 die Geschwindigkeit der Fluoreszenzintensitätsveränderung optimieren und dies bei den Ca2+-Biosensor in Nervenzellen zeigen (Mank et ah, 2006). Die Tatsache, dass das FRET-Signal und somit auch die Fluoreszenzintensität mit einem erhöhten Abstand der FRET-Partner zueinander abnimmt, konnte zur Herstellung eines Glucose-Biosensors genutzt werden (Pickup et al. 2004).
Weiterhin ist es heute möglich, FRET Reaktionen zur lokalen Untersuchung von verschiedenen Redox-Vorgängen und physikalische Variablen in verschiedenen ompartimenten von Zellen einzusetzten. So konnten Yano et al. 2010 mit Hilfe des Biosensors Redoxfluor physiologische und pathogene Redoxzustände in Peroxisomen und damit auch pH- Wert Änderungen detektieren und identifizieren.
Trotz dieser verschieden Einsatzmöglichkeiten gibt es auch eine Reihe von Fragestellungen, die sich noch nicht bzw. nicht mit zufriedenstellender Genauigkeit unter Verwendung der bisher bekannten FRET-Paare klären lassen.
Daher wäre es von großem Vorteil, wenn es weitere FRET-Paare geben würde, die überhaupt bzw. empfindlicher auf Veränderungen von Zellparameter oder -metaboliten wie z.B. 02- Konzentration, Schwankungen des pH-Wertes, der Temperatur und bestimmter Ionen- Konzentrationen reagieren, als die bisher bekannten FRET-Paare.
Es ist daher die A u f g a b e der vorliegenden Erfindung ein FRET - Donor- Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor bereitzustellen, welches in der Lage ist, eine verbesserte Detektion von biorelevanten Parametern zu ermöglichen. Gelöst wird diese Aufgabe durch ein FRET-Donor- Akzeptor-Paar gemäß Anspruch 1 und die
Verwendung eines solchen gemäß Anspruch 4, sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 9.
Es wird somit ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, bereitgestellt, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens ein
Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter nicht stabil ist. Unter dem Begriff „Fluoreszenzprotein" wird ein Protein verstanden, dass Fluoreszenz emittieren kann. Dabei kann die Fluoreszenzeigenschaft durch Bindung eines Chromophors bzw. Fluorophors an bestimmte Proteinbereiche, beispielsweise an eine LOV Domäne, hervorgerufen werden, oder die Fluoreszenzeigenschaft ist in der Peptidsequenz des Proteins, wie etwa bei GFP, codiert. Die Fluoreszenz wird nach Anregnung des Fluoreszenzproteins mit Licht bestimmter Wellenlänge emittiert. Meist kommt es durch die Anregnung zu einer kurzzeitigen, spontanen Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie, wobei das emittierte Licht im Regelfall energieärmer ist als das vorher absorbierte.
Unter dem Begriff „FRET" soll im Folgenden der physikalische Prozess der Energieübertragung mittels des Förster-Resonanzenergietransfers (kurz FRET) verstanden werden. Im Rahmen des Förster-Resonanzenergietransfers wird die Energie eines angeregten Donors auf einen Akzeptor übertragen.
Unter dem Begriff„Donor" soll im Folgenden das Fluoreszenzprotein, das durch Bestrahlung mit Licht angeregt wird und die Energie an einen Akzeptor überträgt, verstanden werden.
Unter dem Begriff„Akzeptor" soll im Folgenden das Fluoreszenzprotein verstanden werden, das die Energie des Donors, die durch die Lichtbestrahlung entstanden ist, aufnimmt.
Unter dem Begriff „FRET-Donor-Akzeptor-Paar" soll im Folgenden ein Paar von Fluoreszenzproteinen verstanden werden, bei denen die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweist, um einen Energietransfer mit anschließender Fluoreszenzemission zu ermöglichen. Es ist denkbar, dass das FRET-Donor-Akzeptor-Paar außer dem Donor und dem Akzeptor weitere Proteine umfasst.
Unter dem Begriff„Biosensor" soll im Folgenden ein biologischer Sensor verstanden werden, der Biomakromolekülen wie Nukleinsäuren (DNA/ RNA) oder Proteine umfasst.
Unter dem Begriff„stabil" soll im Folgenden verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein innerhalb des zu beobachtenden Parameterbereichs durch den zu detektierenden Parameter im Wesentlichen nicht beeinilusst wird. Im Gegenzug soll im Folgenden unter dem Begriff „nicht stabil" oder„labil" verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein innerhalb des zu beobachtenden Parameterbereichs durch den zu detektierenden Parameter messbar beeinilusst wird.
Überraschender Weise erlaubt das erfindungsgemäße genetisch codierte FRET-Donor- Akzeptor-Paar eine genauere Untersuchung der Veränderungen von Zellparameter als die bisher bekannten FRET-Paare. Dies ist der Fall, da wenigstens ein Fluoreszenzprotein des FRET-Paares gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil ist, während wenigstens ein anderes Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter labil ist. Dies bedeutet, dass die mindestens eine Eigenschaft z.B. die Fluoreszenzeigenschaft des labilen Proteins sich verändert, wenn der zu detektierende Parameter sich ändert. Durch Beobachten des Fluoreszenzverhältnisses der mindestens zwei Fluoreszenzproteine kann die Veränderung gemessen werden. Soll beispielsweise der pH-Wert in einem bestimmten Bereich untersucht werden, so wird ein Fluoreszenzprotein gewählt, dessen Eigenschaften sich im zu untersuchenden Bereich nicht verändern, sowie ein Fluoreszenzprotein, bei dem sich mindestens eine Eigenschaften vom pH-Wert im zu untersuchenden Bereich beeinflussen lässt.
Bevorzugt sind die Eigenschaften, die durch zu messende Parameter beeinflusst werden können, ausgewählt aus der Gruppe umfassend
- Fluoreszenz,
- Chromophor-Bindung,
- Chromophorreifung,
- Chromophoreigenschaften (wie z.B. Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften),
- Strukturveränderung,
- Veränderung kovalenter und nicht-kovalenter Bindungen.
Vorzugsweise umfasst das FRET-Donor- Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor genau zwei Fluoreszenzproteine. Das erfindungsgemäße FRET-Donor- Akzeptor-Paar kann als Biosensoren z.B. Verwendung in der Diagnostik finden beispielsweise zum Screening von Enzymfunktionen. Dies dient sowohl der Zuordnung von unbekannten Enzymen zu den jeweiligen Enzymklassen, der Identifizierung möglicher Substrate und somit der Aufklärung der Spezifität des Enzyms, als auch dem Auffinden möglicher Enzyminhibitoren, die als potentielle Wirkstoffe interessant sind. FRET-Systeme erfüllen sowohl auf Grund der einfachen, direkten Detektion eines spezifischen Signals, als auch durch ihre breite Anwendbarkeit diese Anforderungen sehr gut und werden deshalb in immer größerem Maß eingesetzt. In einer Ausführungsform der Erfindung tragen mindestens zwei Fluoreszenzproteine des FRET-Donor-Akzeptor-Paares unterschiedliche Chromophore.
Unter dem Begriff „Chromophor" werden im Folgenden bestimmte Gruppen in Molekülen verstanden, die das Absorptionsverhalten der Verbindung charakteristisch beeinflussen.
Vorzugsweise ist das Chromophor ein Fluorophor, also ein Element in einem Molekül, das die Fluoreszenzeigenschaft des Moleküls hervorruft. Das Fluorophor ist demnach der Teil eines Fluoreszenzproteins, der das eingestrahlte Licht bestimmter Wellenlänge absorbiert und wieder abgibt. Mithin werden unter dem Begriff Fluorophor sowohl ein Molekül, das das Fluoreszenzprotein bindet, als auch bestimmte Peptidsequenz(en) innerhalb des Fluoreszenzproteins verstanden.
Ein Beispiel für ein Molekül, das als Fluorophor von einem Fluoreszenzprotein gebunden wird ist Flavinmononukleotid, während die Tripeptidsequenz Ser65-Tyr66-Gly67 des GFP ein Beispiel für Peptidsequenzen darstellt, die als Fluorophor innerhalb eines Fluoreszenzproteins vorliegen. Es ist zu beachten, dass die funktionelle Struktur der Tripeptidsequenz Ser65- Tyr66-Gly67 ein 4-(p-Hydroxy-benzylidene)-imidazolid-5-one ist, das durch eine Zyklisierung mit anschließender Oxidation des Tripeptids gebildet wird. Bevorzugt sind die Chromophore ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
- Flavinmononukleotid (FMN),
- Riboflavin,
- Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), - 4-(p-hydroxybenzylidene)-imidazolidin-5-one und dessen Derivate.
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass durch die unterschiedlichen Chromophore sichergestellt wird, dass die mindestens zwei Fluoreszenzproteine auf viele zu messende Parameter unterschiedlich reagieren und somit die Veränderung des jeweiligen Parameters detektiert werden kann.
Genau dies ist nämlich bei der Verwendung des GFP sowie seiner Farbvarianten nicht der Fall, da alle diese Proteine aufgrund ihrer Verwandtschaft auf Veränderungen von Zellparametern in identischer oder zumindest ähnlicher Weise reagieren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffunabhängig und mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffabhängig. Unter dem Begriff „sauerstoffunabhängig" soll im Folgenden verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein zu Chromophorsynthese kein Sauerstoff benötigt, während unter dem Begriff „sauerstoffabhängig" verstanden werden soll, dass ein Fluoreszenzprotein zu Chromophorsynthese Sauerstoff benötigt. Alle Fluoreszenzproteine der GFP-Familie bilden ohne Ausnahme das Chromophor in einer mehrstufigen Autobiokatalyse aus. Da bei diesem Prozess molekularer Sauerstoff benötigt wird, hängt die Reifung des Chromophors und somit die Ausbildung des Fluoreszenzsignals unmittelbar von diesem Umweltfaktor ab. Folglich beschränken sich die Anwendungen von GFP und dessen Derivaten als Fluoreszenzreporterproteine auf aerobe Systeme und das Fluoreszenzsignal dieser Proteine ist in obligat anaeroben Organismen oder unter hypoxischen Bedingungen nicht einsetzbar.
Somit ist das erfindungsgemäße FRET-Donor- Akzeptor-Paar besonders vorteilhaft, da es zum ersten Mal die Möglichkeit eröffnet hochsensitiv verschiedene Sauerstoffkonzentration in vivo sowie in vitro mit einem genetisch codierte FRET-Donor- Akzeptor-Paar zu bestimmen. Damit geht überdies einher, dass das erfindungsgemäße FRET-Donor-Akzeptor-Paar besonders vorteilhaft ist, da es auch in anaeroben Systemen verwendet werden kann.
Vorzugsweise ist mindestens eines der mindestens zwei Fluoreszenzproteine des erfindungsgemäßen FRET-Donor- Akzeptor-Paares ein LOV-Protein.
Unter dem Begriff„Fluoreszenzprotein umfassend eine LOV-Domäne" soll im Folgenden ein Protein verstanden werden, das eine Light-Oxygen-Voltage (LOV) Domäne aufweist, bei der mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und bei der zudem neben dem Austausch des mindestens einen Cysteins wenigstens eine weiter Punktmutation vorliegt. Die LOV Domänen Proteinen binden anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine die vom Wirtsorganismus bereitgestellten Cofaktoren FMN, FAD oder Riboflavin. Diese Moleküle werden sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten Sauerstoff-unabhängig synthetisiert. Beispiele für Proteine umfassend eine LOV-Domäne sind der Blaulichtrezeptor YtvA aus B. subtilis und das Sensory-Box-Protein SB2 aus Pseudomonas putida.
Der Blaulichtrezeptor YtvA ist ein 261 Aminosäuren großes Protein, das im Zuge der kompletten Genomsequenzierung von B. subtilis als putative Proteinkinase klassifiziert wurde. Es spielt eine Rolle als positiver Regulator in der oB-vermittelten Stressantwort von B. subtilis. YtvA konnte über Sequenzhomologievergleiche mit der Primärstruktur pflanzlicher Blaulichtrezeptoren, den Phototropinen, identifiziert werden. YtvA besteht aus einer N- terminalen LOV-Domäne und einer C-terminalen STAS („sulfate transporter antisigma")- Domäne. Die LOV-Domäne zeigt ein spezielles Faltungsmotiv aus einem 5-strängigen antiparallelen ß-Faltblatts, das von α-Helices seitlich flankiert wird. Die LOV-Domäne enthält die aus den pflanzlichen Phototropinen bekannte Konsensussequenz NCRFLQ, wobei das darin enthaltene photoaktive Cystein den Cofaktor FMN als Chromophor während des LOV- spezifischen Photozyklus kovalent bindet. Dabei wird YtvA durch Anregung mit Licht der Wellenlänge von 450 nm aus dem Grundzustand in ein Photoprodukt überführt, welches bei 383 nm absorbiert und ein Emissionsmaximum von 498 nm aufweist. Innerhalb kurzer Zeit
(ca. 1,6 μ8) zerfällt dieses Photoprodukt zu einem Photoaddukt, in dem das FMN kovalent gebunden ist. In dieser Form verliert die LOV-Domäne die Eigenschaft der Fluoreszenz bis der Grundzustand von neuem erreicht ist. Durch Sequenzhomologievergleiche der LOV-Domäne von YtvA aus B. subtilis mit der Genomsequenz des Gram-negativen Stäbchenbakteriums P. putida KT2440 wurden dort ein Gen identifiziert, das für ein putatives LOV-Protein codieren. Dabei handelt es sich um das 151 Aminosäuren große SB2 (sensory-box 2), welches aus nur einer LOV-Domäne besteht. Das SB2-Protein weist die für LOV-Domänen charakteristische Konsensussequenz auf. Aufgrund des Auffindens der photoaktiven Region wurde der Photozyklus des Sensory-Box2- Proteins untersucht. Vorzugsweise ist das mindestens eine Cystein in der LOV Domäne durch Alanin ersetzt.
Besonders bevorzugt wird ferner, dass es sich bei mindestens einem der mindestens zwei Fluoreszenzproteine des erfindungsgemäßen FRET-Donor-Akzeptor-Paares um ein FbFP- Protein handelt.
Eine Proteinfamilie umfassend LOV-Domänen bzw. rekombinante Varianten bakterieller Blaulicht-Rezeptoren der LOV Familie wurde kürzlich völlig neu entwickelt. Anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine sind die neuen Fluoreszenzmarker sehr klein (16-19 kDa). Um die FMN- abhängige Fluoreszenz der Blaulichtrezeptoren zu erhöhen und somit deren Verwendung als Fluoreszenzmarker zu ermöglichen, wurden die bakteriellen Proteine mittels moderner Verfahren, der sogenannten directed evolution, verändert. Durch diese Mutationen wurde die Autofluoreszenz der Proteine drastisch erhöht, wodurch die FMN- bindenden Fluoreszenzproteine (FbFP's), insbesondere das FbFP aus P. putida KT2440 (SEQ ID No 4) und die FbFps aus B. subtilis (SEQ ID No 8 bzw. SEQ ID No 6), entstanden. Die neuen Markerproteine konnten in verschiedenen pro- und eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und die für FbFP charakteristische Fluoreszenz in vivo nachgewiesen werden. Die photochemische Charakterisierung der neuen Markerproteine ergab, dass die FbFPs nach Anregung mit blauem Licht (450 nm) eine blau grüne Fluoreszenz (495 nm) emittieren.. Mit den „FMN-based fluorescence protein" (FbFP' s) liegen mithin nun
Fluoreszenzreporterproteine vor, die unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck fluoreszieren. Im Gegensatz zu Vertretern der GFP-Familie benötigt FbFP keinen Sauerstoff für die Ausbildung der Fluoreszenz. Ferner wird ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor bevorzugt, dass ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein umfasst. Unter der Bezeichnung„einem GFP-verwandten Protein" soll ein Protein verstanden werden, das eine dem GFP ähnliche Struktur aufweist, wie es z.B. bei Yellow Fluoreszenz Protein (YFP), Cyan Fluoreszenz Protein (CFP) und enhanced Green Fluoreszenz Protein (eGFP) der Fall ist. Ebenso wird unter„YFP-verwandten Protein" ein Protein verstanden, das eine dem YFP ähnliche Struktur aufweist.
Überraschend hat sich gezeigt, dass ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein als FRET-Paar verwendet werden kann. Dies war nicht vorauszusehen, da die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen muss.
Das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein hat eine ganze Reihe von Vorteilen. So kann dieses FRET-Donor-Akzeptor-Paar sowohl in vivo als auch in vitro vielfach für die quantitative Bestimmung verschiedenster Parameter, wie pH- Wert, Sauerstoff- und Halidionen- Konzentration, sowie zur Detektion von Riboflavin, FAD, FMN oder auch zur Beobachtung von Temperaturänderungen eingesetzt werden.
Mit diesem bevorzugten FRET-Donor-Akzeptor-Paar ist man im Gegensatz zu den etablierten GFP-basierenden Biosensoren insbesondere erstmals in der Lage, hochempfindlich verschiedene Sauerstoffkonzentration in vivo sowie in vitro zu bestimmen. Die direkte Bestimmung der 02-Konzentration wäre in der Krebstherapie aber auch in vielen Bereichen der Biotechnologie von großem Nutzen.
Wie aus Fig. 9 zu entnehmen ist, ist es möglich, mit Hilfe des Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein die aktuelle Sauer Stoffkonzentration anhand des Verhältnisses der beiden Fluoreszenzmaxima zu detektieren, so dass man direkt auf die Sauer Stoffkonzentration in der Zelle und/oder in dem System schließen kann. Das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein ist somit insbesondere für die Untersuchung bzw. Optimierung von Stoffwechselprozessen oder Expressionsstudien in aeroben und anaeroben Zellen oder Systemen in der Biotechnologie in der Krebsforschung aber auch in der Grundlagenforschung zur Untersuchung von Sauer stofflimitierungen in Zellen einsetzbar. Weiterhin wäre es denkbar, das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP- verwandten Protein zur Untersuchung von bakteriellen Biofilmen und hypoxischer Gewebe einzusetzen. Bakterien wie das human pathogene Bakterium Pseudomonas aeroginosa sind meistens organisiert in kleinen Gruppen verbunden mit biotischen und abiotischen Oberflächen, welche nicht selten Infektionen auslösen können (Biofilmbildung). In Biofilmen spielt jedoch die Sauerstoff-Limitierung für Zellen, die sich in den tieferen Schichten befinden, eine besondere Rolle. Mit dem Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein steht ein hervorragendes Werkzeug zur Verfügung, um mikroaerobe Bereiche in Biofilmen zu detektieren und gleichzeitig durch das in dem FRET-System enthaltene Sauerstoffunabhängige FMN- basierende Fluoreszenz Protein (FbFP) weitere Mechanismen und Zusammenhänge in den Biofilmen unter anaeroben Bedingungen aufzuklären.
Überraschend stellte sich überdies heraus, dass das bevorzugte FRET-Donor-Akzeptor-Paar ebenfalls für die Bestimmung des pH-Werts eingesetzt werden kann, da offenbar die Fluoreszenzintensität eines FbFP Proteins nicht von verschiedenen pH-Werten abhängt, wohl aber die Fluoreszenzintensität eines GFP-verwandten Proteins.
Zudem zeigt ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein überraschender Weise eine weit höhere pH-Sensibilität als vergleichbare FRET-Systeme.
Diese höhere pH-Sensibilität, die mit einem größeren Auflösungsvermögen in Abhängigkeit des pH-Wertes einhergeht, ist vorteilhaft gegenüber anderen pH-Biosensoren, da sich das Fluoreszenzverhältnis von FbFP und YFP in einem Bereich von 0,5 bis 5 bewegt. Dem gegenüber bewegt sich das entsprechende Fluoreszenzverhältnis bei anderen Biosensoren in diesem Anwendungsbereich nur in Bereichen von 1 bis 2 (Yano et al. 2010). pH- Wert
Schwankungen können mit dem Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP- verwandten Protein mithin sehr viel genauer detektiert werden. Beispielsweise kann das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein bei lifetime pH-Imaging in Zellen seinen Einsatz finden, wo man bei verschiedenen Wachstumsphasen den pH-Wert der verschiedenen Zellkompartimente auch im aciden Bereichen der Zellen in vivo wie zum Beispiel in Lysosomen oder Peroxisomen bestimmen kann.
Ferner kann das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein bei der Bestimmung bzw. Lokalisierung von verschiedenen Ionenkonzentrationen wie Chlorid oder Iodid sehr effektiv eingesetzt werden, da es im Gegensatz zu den etablierten Biosensoren einen größeren FRET-Ratio Bereich besitzt und so durch den größeren Dynamikumfang viel empfindlicher auf Änderungen der zu detektierenden Ionenkonzentrationen reagieren kann. Vor allem das mit dem GFP verwandte Protein wird durch eine variierende Halid- Ionenkonzentration, die zu einer unterschiedlichen Intensität der Fluoreszenzemission führt beeinflusst, wobei diese vermutlich auf einen Einfluss der Ionen auf die Proteinfaltung zurückzuführen ist. Somit eignet sich das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein zur Verwendung z.B. im Bereich der Neurobiologie.
Ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet des Fusionsproteins aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein wäre der Einsatz als Temperatur-Biosensor in der Krebstherapie. Dies läge im Bereich des Möglichen, da sich bei Fluoreszenzmessungen gezeigt hat, dass FbFPs in Temperaturbereichen ab 30°C bis 65°C gegenüber mit dem GFP verwandten Proteinen wesentlich temperaturempfindlicher reagieren.
Diesen Temperaturstabilitätsunterschied der einzelnen Proteine kann man sich in dem FRET- System zunutze machen. Es sind unterschiedliche Fluoreszenzemissionsverhältnisse bei den geeigneten Temperaturen z. B. von 30°C bis 60°C messbar, so dass man so von den unterschiedlichen Fluoreszenzemissionsverhältnissen direkt auf die Temperatur schließen kann. Überdies kann wegen der Abhängigkeit des FbFP-Fluoreszenzsignals von den Cofaktoren
FMN, FAD oder Riboflavin das bevorzugten FRET-Donor- Akzeptor-Paar zur Detektion von Rivoflavin in Zellen und Geweben eingesetzt werden. Ein molekularer Riboflavin-Sensor ist in vielen Bereichen der (molekularen) Medizin von großer Bedeutung. Er kann z.B. dazu beitragen, Riboflavin-Mangelerscheinungen und daraus resultierende Krankheitsbilder wie z.B. Hornhautdegenerationen, Nachtblindheit oder weiteren Krankheitsbildern besser untersuchen zu können. Vorzugweise ist das dem GFP verwandte Protein YFP.
Besonders bevorzugt ist das YFP der Akzeptor und das FbFP Protein der Donor des FRET- Donor- Akzeptor-Paares . Dieses bevorzugte FRET-Donor- Akzeptor-Paar basiert auf einer Translationsfusion zwischen dem YFP und einem FbFP Fluoreszenzprotein, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne C- terminal an das Zielprotein YFP fusioniert ist. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers verbunden (vgl. Fig. 2). Ferner wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Komplexes aus einem Protein mit einer LOV-Domäne und einem Fluoreszenzprotein zum Resonanzenergietransfer bereitgestellt, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor des Resonanzenergietransfers im anaeroben Milieu fluoreszieren kann. Unter dem Begriff„Komplex" soll im Folgenden verstanden werden, dass die beiden Proteine sich in räumliche Nähe zueinander befinden. Dies kann auf verschiedene Arten geschehen beispielsweise durch kovalente und nicht-kovalente Bindungen, wie die Biotin-Streptavidin Bindung. Unter dem Begriff„anaerobes Milieu" sollen im Folgenden Bedingungen verstanden werden unter denen vergleichsweise wenig bis gar kein Sauerstoff für Reaktionen beispielsweise Stoffwechselprozesse oder Katalysen zur Verfügung steht.
Unter dem Begriff „fluoreszieren können" soll im Folgen verstanden werden, das ein Fluoreszenzprotein durch Licht bestimmter Wellenlänger angeregt werden kann und/oder dass es die bei der Anregung aufgenommene Energie wieder abgeben kann. Die Verwendung eines derartigen Komplexes ist vorteilhaft, da sie die Durchführung eines Resonanzenergietransfers auch in anaeorben Milieu bzw. bei Bedingungen mit geringem Sauerstoff ermöglicht. Wie bereits erwähnt ist dies mit Komplexen aus dem Stand der Technik z.B. Komplexen aus unterschiedlichen Proteinen der GFP Proteinfamilie nicht möglich.
In einer Ausführungsform dieser Verwendung ist der Donor ein Protein mit einer LOV- Domäne. Dies ist vorteilhaft, da Proteine mit einer LOV-Domäne im anaeroben Milieu fluoreszieren bzw. angeregt werden können. Dadurch können Komplexe aus einem Protein mit einer LOV- Domäne als Donor und einem Fluoreszenzprotein als Akzeptor zur Sauerstoffmessung eingesetzt werden. Hierbei bewirkt eine Reduktion des Sauerstoffgehalts eine verminderte Energieübertragung des sauerstoffunabhängigen Proteins mit einer LOV-Domäne auf den sauerstoffabhängigen Akzeptor. Dies führt zu einer Abnahme des Fluoreszenzsignals des Akzeptors, wenn der Sauerstoffgehalt abnimmt. Somit ist es erstmals möglich, Sauerstoff über das relative Verhältnis der Signale des Donors und des Akzeptors zu bestimmen.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Verwendung ist der Akzeptor ein YFP verwandtes Protein, also ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst
a) gemäß der SEQ ID NO 2 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus (a) aufweist.
Ein dem YFP-verwandtes Protein als Akzeptor hat insbesondere in Verbindung mit einem Protein mit einer LOV-Domäne als Donor den Vorteil, dass durch die unterschiedlichen Strukturen und unterschiedlichen Chromophore sichergestellt wird, dass die beiden Proteine auf viele zu messende Parameter unterschiedlich reagieren und somit die Veränderung des Parameters mittels Resonanzenergietransfers detektiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Verwendung wird das Protein mit einer LOV- Domäne a) kodiert durch eine Nukleinsäure der SEQ ID NO. 3, 5 oder 7 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen,
b) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, e) kodiert durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)- e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde,
g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß einer der SEQ ID No 4, 6 oder 8, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, und/oder h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.
Unter dem Begriff „Nukleinsäure" soll im Folgenden ein einzel- oder doppelsträngiges Makromolekül verstanden werden, das aus Nukleotiden aufgebaut ist. Die geläufigsten Nukleinsäuren sind Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. complementary DNA (cDNA) und Ribonukleinsäure (RNA). In der DNA kommen die Nukleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin vor, wobei letztere spezifisch für DNA ist. In der RNA kommen bis auf Thymin, das durch Uracil ersetzt ist, dieselben Nukleinbasen bzw. Nukleotide vor. Künstliche Nukleinsäuren sind beispielsweise Peptide Nucleic Acid (PNA), Morpholino und Locked Nucleic Acid (LNA), sowie Glycol Nucleic Acid (GNA) und Threose Nucleic Acid (TNA). Jede dieser Nukleinsäuren unterscheidet sich im Aufbau des Rückgrats von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren.
Unter dem Begriff „komplementär" soll die zu der benutzten/diskutierten Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure verstanden werden. Dies ist ein bedeutendes Konzept der Molekularbiologie, da es sich um eine wichtige Eigenschaft doppelsträngiger Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder DNA:RNA Duplexe handelt. Der eine Strang ist zu dem anderen komplementär, da die Basenpaare der beiden Stränge nicht-kovalent über zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Im Prinzip - es gibt Ausnahmen für Thymin/Uracil und den Wobble-Komplex der tRNA - gibt es nur eine komplementäre Base für jede Base einer Nukleinsäure. Daher ist es möglich, den komplementären Strang eines einzeln vorliegenden Strangs zu rekonstruieren. Dies ist z.B. für die DNA Replikation essentiell. Beispielsweise wäre der komplementäre Strang der DNA Sequenz
5' A G T C A T G 3'
3' T C A G T A C 5'.
Im Fall der DNA kann sich der Begriff "komplementär" auch auf cDNA beziehen. cDNA wird mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA z.B. mRNA synthetisiert. Unter dem Begriff „hybridisieren" bzw. Hybridisierung wird im Folgenden der Vorgang verstanden, bei dem sich an eine Nukleinsäure eine mehr oder weniger vollständig komplementärer Nukleinsäure anlagert, indem Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den jeweils komplementären Nukleinbasen ausgebildet werden. Unter dem Begriff „unter stringenten Bedingungen hybridisieren" wird im Folgenden verstanden, dass die Bedingungen der Hybridisierung sreaktion so eingestellt sind, dass nur vollständig zueinander komplementäre Basen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Die Stringenz kann beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst werden. Unter dem Begriff „stille Mutation" soll im Folgenden das Phänomen verstanden werden, dass eine Mutation in einem Nukleinsäure Abschnitt keine Konsequenzen nach sich zieht. Dies ist der Fall, da der Informationsgehalt des Gens sich nicht verändert hat, weil eine Reihe von Aminosäuren durch verschiedene Dreiergruppen aufeinanderfolgender Nukleinbasen - Tripletts oder Codons genannt - kodiert werden.
Der Begriff „Fragment" soll im Folgenden einen Teil einer Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz bezeichnen, dem einige Teile einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz fehlen, der aber zumindest einen Teil seiner Aktivität z.B. in Bezug auf Fluoreszenzeigenschaften, Enzymaktivität oder Bindung zu anderen Molekülen behält.
Der Begriff "Variante" soll im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz bezeichnen, die in ihrer Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen der Struktur und biologischen Aktivität einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz gleicht.
Unter dem Begriff „Derivat" wird im Folgenden eine verwandte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verstanden, die in Bezug auf ein Zielmolekül gleichartige Charakteristika hat wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „Homolog" wird im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz verstanden, in deren Sequenz im Vergleich zu der Sequenz eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz mindestens ein Nukleotid bzw. eine Aminosäure hinzugefügt, gelöscht, substituiert oder auf andere Weise modifiziert wurde. Vorraussetzung ist allerdings, dass das Homolog im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweist wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz. Unter dem Begriff „für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert" soll im Folgenden verstanden werden, dass eine Nukleinsäure an den Codongebrauch des Organismus, in dem sie exprimiert wird, angepasst wird. Der Codongebrauch auch die Codon Usage bzw. der Codon Bias, beschreibt das Phänomen, dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden.
Unter dem Begriff „Sequenzidentität von mindestens X%" wird im Folgenden eine Sequenzidentität verstanden, die durch ein Sequenzabgleich (Alignment) mittels eines BLAST Algorithmus, wie er auf der Homepage des NCBIs zur Verfügung steht, bestimmt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Verwendung wird das Donor- Akzeptor-Paar genetisch codiert und/oder liegt als Fusionsprotein vor und/oder wird zusammen als Transkriptionseinheit exprimiert. Im Gegensatz zu nicht genetisch codierten Donor- Akzeptor-Paaren haben genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare den Vorteil, dass sie nicht über einen aktiven Transportmechanismus oder eine Permeabilisierung der Zellmembran in lebenden Zellen aufgenommen werden müssen. Somit können genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare nicht-invasiv verwendet werden.
Genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare können zudem durch die Fusion mit geeigneten Signalsequenzen gezielt in gewünschten Zellkompartimente lokalisiert werden oder an beliebige Zielproteine fusioniert werden.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Detektion von Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin unter Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor- Paares gemäß einem der Ansprüche 1-3 bereitgestellt, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin stabil ist.
Unter dem Begriff„Detektion" soll im Folgenden zum einen verstanden werden, dass einer der Faktoren Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin überhaupt festgestellt wird. Zum anderen ist unter„Detektion" aber auch eine Messung eines der Faktoren zu verstehen. Dies geschieht z.B. anhand der Berechnung eines Verhältnisses der beiden Fluoreszenzmaxima der mindestes zwei Fluoreszenzproteine, wobei sich das Verhältnis verändert falls der zu messende Faktor sich verändert. Wie bereits erwähnt ermöglicht das erfindungsgemäße Donor-Akzeptor-Paar bzw. dessen
Verwendung zum ersten Mal ein Verfahren zur Messung von Sauerstoff in biologischen Systemen mittels Fluoreszenzproteinen und verbessert die Detektion der Faktoren pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin ganz entscheidend. In einer Ausführungsform des Verfahrens findet die Detektion mittels Fluoreszenz-
Resonanzenergietransfer nach Anregung mit Licht der Wellenlänge zwischen 370nm und 450 nm statt. Dies ist insbesondere der Fall falls ein FbFP- Protein als Donor fungiert, denn diese werden durch Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 450 nm, insbesondere durch Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 390 nm angeregt. Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch die Abbildungen und Ausführungsbeispiele veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Abbildungen und Ausführungsbeispiele nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
Fig. 1 zeigt das Schema eines FRET-Systems;
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des YFP FbFP-Fusionsproteins; Fig. 3 und Fig. 4 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP- Fusionsproteins;
Fig. 5 und Fig. 6 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP- Fusionsproteins;
Fig. 7 zeigt die in vivo Fluoreszenz des YFP FbFP-Fusionsproteins;
Fig. 8 zeigt die Thrombin Pro teaseab Spaltung des YFP FbFP-Fusionsproteins; Fig. 9 zeigt die Fluoreszenzphotometrische Messung der Na2S204 -Reduktion des YFP-
Chromophors;
Fig. 10 zeigt die in vitro pH-Fluoreszenzmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins; Fig. 11 zeigt die in vitro pH-Stabilitätsmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
Fig. 12 zeigt eine fluoreszenzphotometrische Messung zur Eignung des YFP FbFP- Fusionsproteins als Ionen-Biosensor; Fig. 13 zeigt einen Temperaturstabilitätstest des YFP und FbFP. Fig. 1 zeigt das Schema eines FRET-Systems.
Der Donor absorbiert das von einer Lichtquelle ausgestrahlte Licht und strahlt es anschließende bei einer längeren Wellenlänge wieder ab. In diesem Emissionsspektrum liegt das Absorptionsmaximum des Akzeptors, so dass er die abgestrahlte Energie aufnehmen kann. Insgesamt beobachtet man also mit der Emission des Akzeptors einen Energietransfer vom Donor zum Akzeptor, den man als FRET bezeichnet. Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ YD No 10). Eine Translationsfusion, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne (SEQ ID No. 4) C-terminal an das Zielprotein YFP (SEQ ID No 2) fusioniert ist, wurde generiert, um untersuchen zu können ob sich die Kombination der beiden Proteine als neues FRET-Paar eignet. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers (SEQ ID No 15 & 16) verbunden.
Fig. 3 und Fig. 4 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP- Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Die Fluoreszendomänen FbFP und YFP wurden mittels PCR mit modifizierten Primern (SEQ ID No. 11 - 14) amplifiziert und neue Restriktions schnittsteilen generiert. Die Klonierung der einzelnen Module und des Linkers (SEQ ID No 15 & 16) erfolgte in dem Klonierungsvektor pBlueScript KSII(-), welcher in E. coli DH5a-Zellen eine Blau-Weiß-Selektion erlaubt.
Fig. 5 und Fig. 6 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung der YFP-FbFP-Fusion (SEQ ID No 9).
Das dargestellte Schema zeigt die endgültige Fusionierung des FbFP (SEQ ID No 3) mit YFP
(SEQ ID No 1) durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen SalVXhol und anschließender Ligation im Bluescript KSII(-).
Fig. 7 zeigt die in vivo Fluoreszenz des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist die in vivo Fluoreszenz des YFP-FbFP Biosensors, der einzelnen
Fluoreszenzproteine, sowie des Leerplasmids pRhotHi-2 nach einer T7 Überexpression in E.coli BL21(DE3)-Zellen. Detektiert wurde die Fluoreszenz der Zellen nach Anregung mit ^380nm mittels eines Fluoreszenzphotometers (Perkin Elmer). Die abgebildeten Kurvenverläufe entsprechen den spezifischen Fluoreszenzemissionen, der in der Figur genannten Proteine.
Fig. 8 zeigt die Thrombin Proteaseabspaltung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist die Fluoreszenzmessung der in vz'/ro-FRET-Fusions Spaltung (YFPNlFbFP) mittels der Thrombin-Protease in dem Proteinpuffer. Zusätzlich dargestellt ist die Kontrolle der Fusion ohne Zugabe von Protease. Es wurde gereinigtes Protein der Fusion YFP-FbFP verwendet, welches mittels His6-Tag affinitätschromatographisch gereinigt wurde. Die Fluoreszenzemission wurde mittels Fluoreszenzphotometer (Perkin Elmer) bei Anregung bei detektiert, wobei eine YFP_FbFP Absorbtion.38onm von 0.1 verwendet wurde, die Thrombin-Protease wurde mit einer Konzentration von 1 u/μΐ eingesetzt.
Fig. 9 zeigt die Fluoreszenzphotometrische Messung der Na2S204 -Reduktion des YFP- Chromophors.
Dargestellt ist die Fluoreszenzemission der Reduktion des Biosensors YFP-FbFP (SEQ ID No 10) mit 50mM Na2S204 in Proteinpuffer (lOmM NaH2P04; lOmM NaCl; pH 8).. Die Fluoreszenzemission wurde mittels Fluoreszenzphotometer (Perkin Elmer) bei Anregung bei λ=380ηιη detektiert, wobei eine YFP_FbFP Absorbtion.380nm von 0.1 verwendet wurde. Zusätzlich wurde die Fluoreszenzemission der Fusion vor Versetzen mit Natriumdithionit bestimmt (gestrichelte Linie).
Fig. 10 zeigt die in vitro pH-Fluoreszenzmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527nm/495nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vi'iro-Messung der pH-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP (SEQ TD No 10) in einem pH-Wertbereich von 4.5 bis 11. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung der aufgereinigten Proteine mit mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion380nm des Proteins wurde auf 0, 1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
Fig. 11 zeigt die in vitro pH-Stabilitätsmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10). Dargestellt ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527nm/495nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vitro-Messung der pH-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP in einem pH- Wertbereich von 4 bis 7. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung des aufgereinigten Proteins mit mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion527nm des Proteins wurde auf 0,1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
Fig. 12 zeigt eine fluoreszenzphotometrische Messung zur Eignung des YFP FbFP- Fusionsproteins (SEQ ID No 10) als Ionen-Biosensor.
Dargestellt als Säulen ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527nm/495nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vitro-Messung der Halidionen-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP (SEQ ID No. 10) bei schrittweise erhöhten Iodid- und Chloridionenkonzentrationen von 0 bis 400mM. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung der aufgereinigten Proteine mit mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion527nm des Proteins wurde auf 0,1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
Fig. 13 zeigt einen Temperaturstabilitätstest für YFP und FbFP.
Dargestellt ist die Fluoreszenzemission in Prozent des YFP's (SEQ ID No. 2) und des FbFP's (SEQ ID No. 4) in Abhängigkeit von der Temperatur um die Eignung des YFP-FbFP-
Fusionsproteins als Temperatur-Biosensors zu untersuchen.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE 1. Konstruktion der Biosensoren
Um untersuchen zu können, ob sich das FMN-basierte Fluoreszenzreporterprotein FbFP (SEQ ID No. 4) für den Einsatz als neuer Biosensor eignet, wurde eine Translationsfusion (SEQ ID No. 9) generiert, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne (SEQ ID No 4) C-terminal an das Zielprotein YFP (SEQ ID No. 2) fusioniert ist. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers (SEQ ID No 15 und 16) verbunden, welcher eine„multiple cloning site" (MCS) mit den Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Kpnl, Ndel, BamHl, Sacl, Sali, Hindlll, Xhol und C 2I enthält. Zur Expression des YFP-FbFP-Fusionsproteins wurde ebenfalls der Expressionsvektor pRhotHi-2 gewählt. Das Fusionsprotein wurde zudem mit einem His6-tag versehen, wodurch das rekombinante Protein mittels affinitätschromatographischer Verfahren einfach aufgereinigt werden kann. Alle Klonierungs schritte wurden in dem Klonierungsvektor pBluescript KSII(-) durchgeführt. 2. Charakteriserung des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10)
Um zeigen zu können, dass mit dem YFP-FbFP-Fusionsprotein ein funktionelles FRET- System erzeugt werden konnte, wurde zunächst eine in vivo Charakterisierung des Fusionsproteins in dem Gram-negativen Bakterium E. coli durchgeführt. Hierzu wurde das Plasmid pRhotHi-2_YFP_FbFP in den E. co/i'-Stamm BL21DE3 mittels IPTG-Zugabe überexprimiert.
Die Fluoreszenzemission wurde bei einer Anregung mit blauem Licht (λ= 380nm) im Fluoreszenzphotometer detektiert und aufgezeichnet. Als Kontrolle wurden zusätzlich die Fluoreszenzproteine FbFP (SEQ ID No. 4) und YFP (SEQ ID No. 2) einzeln exprimiert und ebenfalls ein Fluoreszenzspektrum bei dieser Anregung aufgenommen. Als Negativkontrolle wurde die Fluoreszenz des Leerplasmides pRhotHi-2 bestimmt, wie anhand der Fig. 7 zu erkennen ist.
Vergleicht man die Emissionsmaxima von FbFP und YFP im YFP-FbFP-Fusionsprotein mit den Maxima der jeweiligen unfusionierten Fluoreszenzproteinen, ist überraschender Weise ein signifikanter Unterschied zu erkennen, welcher durch den strahlungsfreien Übertrag der Energie von FbFP zum YFP zustande kommt. Hierbei zeigt sich nach spezifischer Anregung des FbFP-Chromophors eine niedrige Fluoreszenzemission des FbFP (Emissionsmaximum bei 495nm) und eine signifikante Fluoreszenzemission des YFP (Emissionsmaximum bei 527nm).
3. Nähere Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften des YFP-FbFP-Fusionsproteins
Um die Fluoreszenzeigenschaften des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) näher zu untersuchen, wurde die Fusion über einen His6-tag mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und in Proteinpuffer (lOmM NaH2P04, lOMm NaCl, pH 8) aufgenommen um die nötigen Untersuchungen durchführen zu können. Um nachweisen zu können, dass die Fluoreszenz des FRET- Akzeptors YFP (SEQ ID No. 2) auf den Energietransfer vom FRET- Donor FbFP (SEQ ID No. 4) nach spezifischer Anregung des Donor-Chromophors zurückzuführen ist, wurden die beiden Fluoreszenzdomänen des YFP-FbFP-Fusionsproteins durch die Thrombin Protease wieder voneinander getrennt. Da sich in der Linkerregion des YFP-FbFP-Fusionsproteins eine Proteaseschnittstelle befindet, würde die räumliche Trennung der Fluoreszenzdomänen mittels der Thrombin Protease eine verminderte Fluoreszenzemission des YFP und eine erhöhte Fluoreszenzemission des FbFP zur Folge haben. Dies sollte geschehen, da im Falle der proteolytischen Trennung der maximale Försterradius von 100 A überschritten und so die Energie des FRET-Donors FbFP nach spezifischer Anregung (λ=380ηιη) nicht mehr direkt auf den FRET- Akzeptor YFP übertragen wird, sondern das FbFP das Licht bei in Form von Fluoreszenz emittiert. Wie in dem entsprechenden Experiment gezeigt werden konnte (Fig. 8), führt die proteolytische Trennung der FbFP- von der YFP-Fluoreszenzdomäne zu dem erwarteten Ergebnis. Der vollständige Proteaseverdau des YFP-FbFP-Fusionsproteins wurde anschließend mittels SDS-PAGE, bei der die Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt wurden, bestätigt. Es war klar zu erkennen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein nach dem proteolytischen Verdau nicht mehr als Fusionsprotein (~ 45 kDa) vorliegt, sondern nur noch die beiden getrennten Fluoreszenzproteine FbFP (- 17 kDa) und YFP (~ 27 kDa) detektierbar sind. Als Referenz wurden die jeweiligen unfusionierten Fluoreszenzproteine aufgetragen um den Effekt der Proteasespaltung verifizieren zu können. 4. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als 02-Biosensor
Um zu überprüfen, ob das erzeugte YFP-FbFP-Fusionsprotein (SEQ ID No. 10) als ein neuartiger 02-Biosensor eingesetzt werden kann, wurde durch Zugabe von Natriumdithionit das YFP-Chromophor reduziert, wodurch die Fluoreszenz dieser Domäne vollständig inhibiert wurde. Gleichzeitig bindet das Reduktionsmittel den gelösten Sauerstoff vollständig, sodass die Reoxidation des Chromophors stark verzögert wird. In Fig. 9 ist das Fluoreszenzspektrum des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) vor und nach der Reduktion mit Natriumdithionit bei spezifischer Anregung des FbFP-Chromophors dargestellt. Das Fluoreszenz spektrum lässt erkennen, dass vor der Reduktion des YFP- Chromophors die spezifische YFP-Fluoreszenzemission bei λ= 527nm im YFP-FbFP- Fusionsprotein deutlich detektierbar ist. Weiterhin ist zu erkennen das die FbFP-
Fluoreszenzemission im YFP-FbFP-Fusionsprotein bei =495nm nach Zugabe von Natriumdithionit erhöht ist, was auf die verminderte Energieübertragung des Donors auf den YFP-Rezeptor zurückzuführen ist. Anhand dieses Versuches konnte eine starke Abnahme des YFP-Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von Sauerstoff nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass es überraschender Weise mit dem neuartigen YFP-FbFP-Fusionsprotein erstmals möglich ist, Sauerstoff über das relative Verhältnis der Signale beider Fluoreszenzdomänen zu bestimmen.
5. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als pH-Biosensor
Um die Abhängigkeit der Fluoreszenz des Biosensors vom pH- Werts charakterisieren zu können, wurden die Gene YFP (SEQ ID No. 1), FbFP (SEQ ID No. 3) und YFP- FbFP (SEQ ID No. 9) im pRhotHi-2 in E.coli BL21(DE3) Zellen IPTG-induziert überexprimiert, aufgeschlossen und affinitäts-chromatographisch mittels His6-Tag aufgereinigt. Die Fluoreszenzintensitätsänderung gegenüber verschiedenen pH- Werten wurde unter Zuhilfenahme eines pH-Uni versalpuff er s in vitro näher charakterisiert. Hierzu konnten die verschiedenen Fluoreszenzintensitäten bei den pH-Werten 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 10, 11 und 12 des YFP-FbFP-Fusionsproteins und den jeweiligen einzelnen Fluoreszenzreporterproteine unter der UV-Lampe und im Fluoreszenzphotometer detektiert werden. Aus den Figuren 10 und 11 geht hervor, dass sich der neue Biosensor hervorragend zur äußerst empfindlichen Bestimmung des pH-Werts eignet. Das in Fig. 10 dargestellte Diagramm zeigt das Verhältnis der Fluoreszenzmaxima von YFP und FbFP im YFP-FbFP- Fusionsprotein (SEQ ID No. 10). Man erkennt deutlich, dass sich der Messbereich des neuen Biosensors von 4,0 bis 7,0 erstreckt, was den gesamten physiologischen Bereich lebender Organismen abdeckt. Dabei sinkt das YFP-FbFP-Fluoreszenzverhältnis von pH 7 bis pH 4 um einen Faktor von 2,5. Dieser Effekt lässt sich mit einer destabilisierenden Wirkung des YFP- Chromophors durch die pH-abhänige Protonierung des Chromophors erklären. Zusätzliche Fluoreszenzmessungen mit den einzelnen Fluoreszenzproteinen YFP und FbFP belegen ebenfalls diese destabilisierende Wirkung des pH-Wertes auf das YFP-Fluoreszenzsignal, während sich die Fluoreszenzemission bei dem FbFP über den pH-Bereich von 8 bis 4,5 kaum verringert. Diese Daten belegen somit eindeutig, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein (SEQ ID No. 10) für die empfindliche Bestimmung des pH-Werts sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden kann. 6. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als Halidionen-Biosensor
Ob die Fluoreszenzemission von FbFP (SEQ ID No. 4) ebenfalls durch die Ionenkonzentration beeinflusst wird, wurde anhand von gereinigtem FbFP untersucht. Dazu wurde der Expressionsvektor pRhotHi2_/fr p+His6 in den Expressionsstamm E. coli BL21(DE) transformiert, das Gen überexprimiert, gereinigt, konzentriert und umgepuffert. Der Erfolg der Expression und der Reinigung wurden mittels SDS-PAGE überprüft (Ergebnisse nicht gezeigt). Zur Bestimmung der Fluoreszenzemission des FbFP in Abhängigkeit zur Ionenkonzentration, wurde eine Proteinmenge entsprechend einer Absorption (λ = 450 nm) von 0,1 in einem Milliliter pH-Universalpuffer gelöst. Der Proteinpuffer wurde zuvor auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die getesteten Ionenkonzentrationen wurden durch lösen entsprechender Mengen Natriumchlorids bzw. Natriumiodids in diesem Puffer hergestellt. Die Messung erfolgte anschließend in einem Fluoreszenzphotometer (LS 50 B, Perkin Elmer) bei einer Anregungs weilenlänge von 380 nm. Dabei zeigte sich, dass die Fluoreszenzemission des FbFP durch die getesteten Ionenkonzentrationen kaum beeinflusst wird, da die relative Fluoreszenzemission in Abhängigkeit der Ionenkonzentration annähernd konstant im Bereich von ca. 150 Einheiten liegt (Daten nicht gezeigt).
Durch die Konstanz der Fluoreszenzemission des FbFP über den hier getesteten Ionenkonzentrationsbereich und gleichzeitiger Sensitivität des FRET-Partners YFP (SEQ ID No. 2) auf genau diese Bedingungen, ist eine Grundvoraussetzung für den Einsatz dieses Systems als Biosensor erfüllt, da es je nach Ionenkonzentration zu einem bestimmten Verhältnis der beiden Emissionsmaxima von FbFP und YFP kommt. Um dies in vitro zu überprüfen, wurde die Fluoreszenzemission des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) in Abhängigkeit von verschiedenen Ionenkonzentrationen fluoreszenzphotometrisch gemessen. Die Charakterisierung des YFP-FbFP-Fusionsproteins erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm. Die sich aus den Emissionsmaxima bei 495 (FbFP) und 527 nm (YFP) ergebenden Verhältnisse zeigen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein überraschender Weise ebenfalls empfindlich auf unterschiedliche Halidionen- Konzentrationen reagiert. Im Säulendiagramm (Fig. 12) ist erkennbar, dass die Verhältnisse der Emissionsmaxima von FbFP und YFP mit steigender Konzentration, sowohl der Chloridais auch der lodidionen, sinken. Dabei reagiert die Fusion auf gleiche Konzentrationen von lodidionen empfindlicher als auf Chloridionen, was anhand des deutlich stärkeren Abfalls der Ausgleichsgeraden über die jeweilige Messreihe bestimmt wird. Dieser beträgt dabei für die Messung der verschiedenen Iodidionenkonzentrationen 0,6302 und im Fall der Chloridionenkonzentrationen lediglich 0,4512. Die Verringerung des Fluoreszenzverhältnisses der beiden Fluoreszenzdomänen rührt dabei von der lonensensitivität des YFP her, da hier gezeigt wurde, dass die Emission des FbFP über den getesteten Konzentrationsbereich nahezu konstant ist. Die hier gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein empfindlich auf unterschiedliche Iodid- und Chloridionenkonzentrationen reagiert, wobei eine höhere Ionenkonzentration zu einer Verminderung der Ratio (λ 527/495) der Emissionsmaxima führt.
7. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als Temperatur-Biosensor
Hierzu wurden die beiden Fluoreszenzproteine FbFP (SEQ ID No. 4) und YFP (SEQ ID No. 2) in E.coli BL21(DE3)-Zellen überexprimiert, aufgeschlossen und mittels His6-Tag affinitätschromatographisch aufgereinigt. Nach Überführung durch Umpufferung in den Proteinpuffer (lOmM NaH2P04; lOmM NaCl; pH 8) wurden die auf eine Absorption von 0,1 eingestellten Proteine bei der jeweiligen Temperatur 5 min inkubiert und dann die Fluoreszenzemission photometrisch mit Hilfe des Perkin Elmer Photometers bestimmt. Wie in Fig. 13 dargestellt, ist das YFP-Protein bei hohen Temperaturen wesentlich stabiler als das FbFP-Protein, da YFP noch bei 60 bis 65 °C 82 bis 75% Fluoreszenzemission zeigt, verglichen mit der maximalen Emission bei 22,5 °C. Bei FbFP nimmt die Fluoreszenzemission signifikant auf bis zu 27% ab. Bei 65°C zeigt dieses Fluoreszenzprotein keinerlei Fluoreszenz mehr.
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Claims

ANSPRÜCHE
1. FRET-Donor- Akzeptor- Paar zur Verwendung als Biosensor, umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter nicht stabil ist.
2. FRET-Donor- Akzeptor- Paar gemäß Anspruch 1, wobei mindestens zwei Fluoreszenzproteine unterschiedliche Chromophore tragen.
3. FRET-Donor- Akzeptor- Paar gemäß einem der Ansprüche 1-2, wobei mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffunabhängig und mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffabhängig ist.
4. Verwendung eines Komplexes aus einem Protein mit einer LOV-Domäne und einem Fluoreszenzprotein zum Resonanzenergietransfer, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor des Resonanzenergietransfers im anaeroben Milieu fluoreszieren kann
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Donor ein Protein mit einer LOV Domäne ist.
6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4-5, wobei der Akzeptor ein YFP verwandtes Protein ist, also ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst
a) gemäß der SEQ ID No 2, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus (a) aufweist.
7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4-6, wobei das Protein mit einer LOV- Domäne
a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID No 3, 5 oder 7 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressions System optimiert wurde,
g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß einer der SEQ ID No 4, 6 oder 8, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, und/oder
h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.
8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4-7, wobei das Donor-Akzeptor-Paar genetisch codiert ist und/oder als Fusionsprotein vorliegt und/oder zusammen als Transkriptionseinheit exprimiert wird.
9. Verfahren zur Detektion von Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin unter Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor-Paares gemäß einem der Ansprüche 1-3.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Detektion mittels Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer nach Anregung mit Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 450 nm stattfindet.
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