DE102010037001A1

DE102010037001A1 - Neue Biosensoren und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102010037001A1
Application number: DE102010037001A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: Evocatal GmbH
Current assignee: Evocatal GmbH
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2010-08-16
Publication date: 2012-02-16
Also published as: EP2606355A2; WO2012022728A2; WO2012022728A3; US20130280749A1; US8852882B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens eins nicht stabil ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft FRET-Donor-Akzeptor-Paare zur Verwendung als Biosensor.
Als Biosensoren definiert man im Allgemeinen integrierte Messsysteme, bei denen biologische Erkennungsstrukturen in Wechselwirkung mit geeigneten Analyten stehen. Hierbei wird durch den Biosensor ein physiochemisches Signal erzeugt, welches durch einen sich in sterischer Nähe befindlichen Transducer in auswertbare Messwerte umgewandelt werden kann. Solche Biosensoren finden eine breite Anwendung in der klinischen Diagnostik, der Umweltanalytik, der Lebensmittelanalytik, in der Prozesskontrolle und in der Grundlagenforschung. Im Gegensatz zu den physikalischen oder chemischen Biosensoren, welche meistens eine künstliche Komponente beinhalten, bestehen biologische Biosensoren aus Biomakromolekülen wie Nukleinsäuren (DNA/RNA) oder Proteinen, wobei Proteine sehr gut als Biosensoren geeignet sind, da sie verschiedenste Moleküle in Zellen hochspezifisch erkennen und mit einer hohen Affinität binden können.
Mit Hilfe solcher Biosensoren können Metall-Ionen, verschiedene Zucker wie zum Beispiel Glucose, Nukleinsäuren oder auch bestimmte Chemikalien durch verschiedene Interaktionen mit dem Biosensor detektiert werden. Darüber hinaus können Biosensoren dazu beitragen, biologische Vorgänge wie zum Beispiel post-translationale Modifikationen, Protein-Protein Interaktionen, Enzymaktivitäten sowie eine Detektion von physikalischen Zellparameter wie dem pH-Wert oder der Konzentration bestimmter Metabolite wie z. B. Chlorid-Ionen in lebenden Organismen zu analysieren. Abhängig von den zu detektierenden Signalen und dem Transduktor ist eine Detektion über mehrere Wege durchführbar. So sind Biosensoren optisch, elektrisch, elektrochemisch, thermisch, oder magnetisch detektierbar.
Eine weitere hoch spezifische und empfindliche Möglichkeit ein Signal effizient mittels eines Biosensors zu detektieren, ist die Übertragung des Signals über Fluoreszenz. Zu diesem Zweck wurden rekombinante Fluoreszenzreporterproteine entwickelt, die entweder (1) über eine spezifische Sensordomäne in direkter Interaktion mit dem zu ermittelnden Substrat bzw. Signal stehen, wodurch die Fluoreszenzdomäne nur bei deren An- oder Abwesenheit fluoreszieren oder (2) die Fluoreszenzeigenschaften einer Fluoreszenzdomäne durch die Veränderungen der Zellparameter oder -Metaboliten wie z. B. schwankendem pH-Wert direkt verändert wird. So lassen sich anhand eines modulierten eYFP (Insertion einer Zinkfinger-Domäne) Zink-Ionen detektieren oder durch eine Insertion von Calmodulin in das permutierte eYFP Calcium-Ionen detektieren.
Um auch geringe Schwankungen z. B. bei zellspezifischen Signalen, Metaboliten bzw. Proteinen exakt auflösen und detektieren zu können, wurden immer mehr Biosensoren entwickelt, denen ein Förster resonance energy transfer(FRET)-System zugrunde liegt.
Um das Phänomen der Fluoreszenz-Resonanz beobachten zu können, benötigt man zwei in ihren optischen Eigenschaften aufeinander abgestimmte Chromophore: Einen so genannten Donor und einen Akzeptor. Aufgabe des Donors ist die selektive Absorption des von einer Lichtquelle ausgestrahlten Lichts und dessen anschließende Wiederabstrahlung, die in der Regel zu längeren Wellenlängen hin verschoben ist. In diesem Emissionsspektrum liegt das Absorptionsmaximum des Akzeptors, so dass dieser die abgestrahlte Energie aufnehmen kann. Insgesamt beobachtet man also mit der Emission des Akzeptors einen Energietransfer vom Donor zum Akzeptor, den man als FRET bezeichnet. Die Effizienz des FRET ist von mehreren Faktoren abhängig. So muss die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen. Desweiteren spielen der Abstand r und die Orientierung der Chromophore zueinander eine wichtige Rolle. Um ein ausreichend intensives Signal zu erhalten, sollte r zwischen 10 und 100 Å liegen. Des Weiteren ist die räumliche Orientierung der Farbstoffe für die Intensität des Energie-Transfers von entscheidender Bedeutung. Dieser verläuft strahlungslos und gerichtet und kann nur dann stattfinden, wenn die Übergangsdipolmomente von Donor und Akzeptor möglichst parallel zueinander angeordnet sind. Durch die Entwicklung von FRET-Biosensoren ist man heutzutage in der Lage, komplexe Zellvorgänge, Zellparameter oder Proteininteraktionen in der Grundlagenforschung und in der Biotechnologie viel genauer zu detektieren bzw. zu identifizieren, da die Abhängigkeit des Fluoreszenzsignales von zwei Fluoreszenzreportern die Empfindlichkeit der Signalerkennung stark erhöht.
Da die Untersuchung von Reaktionswegen in lebenden Systemen sowie die Identifizierung der dabei beteiligten Moleküle sehr schwierig ist, besteht erheblicher Bedarf an der Entwicklung von Analysemethoden, die schnell und effizient Ergebnisse liefern. Gerade bei Vorgängen wie Proteinfaltung, Wechselwirkung zwischen Proteinen untereinander oder mit DNA bzw. RNA, sowie Reaktionen von Enzymen mit ihren jeweiligen Substraten, ist ein Verfahren zur abstandsabhängigen Untersuchung dieser Prozesse wünschenswert, weshalb FRET-Systemen auch als Biosensoren ein besonderes Interesse zukommt. Mit Hilfe dieser ”molekularen Werkzeuge” ist es möglich, Abstandsänderungen im nm-Bereich in Echtzeit zu verfolgen, weshalb es sich besonders für die Analyse von biochemischen Ereignissen in vitro und in vivo eignet.
Die Suche nach FRET-Biosensoren gestaltet sich allerdings sehr arbeitsaufwendig, da die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen muss. In der Regel müssen daher für jedes mögliche FRET-Paar umfangreiche Untersuchungen durchgeführt werden.
Bisher werden häufig das Green Fluorescent Protein (GFP) und mit ihm verwandte Fluoreszenzproteine für single Biosensoren oder als FRET-Paare bzw. Biosensoren verwendet.
GFP und seine Farbvarianten (z. B. YFP, yellow fluorescent protein) finden in vielen Bereichen der Grundlagenforschung und Biotechnologie eine breite Anwendung: So werden fluoreszierende Proteine zur Untersuchung von genregulatorischen Mechanismen oder zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen eingesetzt. Für die Untersuchung von zellulären Differenzierungsprozessen und zur Lokalisation des jeweiligen Zielproteins in der Zelle können ebenfalls Fluoreszenzreporter verwendet werden. Diese können auch zur Überprüfung von Faltungsprozessen heterologer Proteine in bakteriellen Expressionsstämmen dienen.
In FRET Reaktionen werden GFP bzw. verwandte Proteine beispielsweise zum Nachweis von verschiedensten Ionen in Eukaryoten als auch in Prokaryoten sowie in bestimmten Zelltypen wie etwa Nervenzellen verwendet. Mit dem ersten FRET basierenden Calciumsensor war man in der Lage, die Konzentration der Ca²⁺-Ionen in Zellen nachzuweisen (Baird et al., 1999); die Gruppe um Marco Mank konnte 2006 die Geschwindigkeit der Fluoreszenzintensitätsveränderung optimieren und dies bei den Ca²⁺-Biosensor in Nervenzellen zeigen (Mank et al., 2006).
Die Tatsache, dass das FRET-Signal und somit auch die Fluoreszenzintensität mit einem erhöhten Abstand der FRET-Partner zueinander abnimmt, konnte zur Herstellung eines Glucose-Biosensors genutzt werden (Pickup et al. 2004).
Weiterhin ist es heute möglich, FRET Reaktionen zur lokalen Untersuchung von verschiedenen Redox-Vorgängen und physikalische Variablen in verschiedenen Kompartimenten von Zellen einzusetzten. So konnten Yano et al. 2010 mit Hilfe des Biosensors Redoxfluor physiologische und pathogene Redoxzustände in Peroxisomen und damit auch pH-Wert Änderungen detektieren und identifizieren.
Trotz dieser verschieden Einsatzmöglichkeiten gibt es auch eine Reihe von Fragestellungen, die sich noch nicht bzw. nicht mit zufriedenstellender Genauigkeit unter Verwendung der bisher bekannten FRET-Paare klären lassen.
Daher wäre es von großem Vorteil, wenn es weitere FRET-Paare geben würde, die überhaupt bzw. empfindlicher auf Veränderungen von Zellparameter oder -metaboliten wie z. B. O₂-Konzentration, Schwankungen des pH-Wertes, der Temperatur und bestimmter Ionen-Konzentrationen reagieren, als die bisher bekannten FRET-Paare.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor bereitzustellen, welches in der Lage ist, eine verbesserte Detektion von biorelevanten Parametern zu ermöglichen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar gemäß Anspruch 1 und die Verwendung eines solchen gemäß Anspruch 4, sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 9.
Es wird somit ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, bereitgestellt, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter nicht stabil ist.
Unter dem Begriff „Fluoreszenzprotein” wird ein Protein verstanden, dass Fluoreszenz emittieren kann. Dabei kann die Fluoreszenzeigenschaft durch Bindung eines Chromophors bzw. Fluorophors an bestimmte Proteinbereiche, beispielsweise an eine LOV Domäne, hervorgerufen werden, oder die Fluoreszenzeigenschaft ist in der Peptidsequenz des Proteins, wie etwa bei GFP, codiert. Die Fluoreszenz wird nach Anregnung des Fluoreszenzproteins mit Licht bestimmter Wellenlänge emittiert. Meist kommt es durch die Anregnung zu einer kurzzeitigen, spontanen Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie, wobei das emittierte Licht im Regelfall energieärmer ist als das vorher absorbierte.
Unter dem Begriff „FRET” soll im Folgenden der physikalische Prozess der Energieübertragung mittels des Förster-Resonanzenergietransfers (kurz FRET) verstanden werden. Im Rahmen des Förster-Resonanzenergietransfers wird die Energie eines angeregten Donors auf einen Akzeptor übertragen.
Unter dem Begriff „Donor” soll im Folgenden das Fluoreszenzprotein, das durch Bestrahlung mit Licht angeregt wird und die Energie an einen Akzeptor überträgt, verstanden werden.
Unter dem Begriff „Akzeptor” soll im Folgenden das Fluoreszenzprotein verstanden werden, das die Energie des Donors, die durch die Lichtbestrahlung entstanden ist, aufnimmt.
Unter dem Begriff „FRET-Donor-Akzeptor-Paar” soll im Folgenden ein Paar von Fluoreszenzproteinen verstanden werden, bei denen die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweist, um einen Energietransfer mit anschließender Fluoreszenzemission zu ermöglichen. Es ist denkbar, dass das FRET-Donor-Akzeptor-Paar außer dem Donor und dem Akzeptor weitere Proteine umfasst.
Unter dem Begriff „Biosensor” soll im Folgenden ein biologischer Sensor verstanden werden, der Biomakromolekülen wie Nukleinsäuren (DNA/RNA) oder Proteine umfasst.
Unter dem Begriff „stabil” soll im Folgenden verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein innerhalb des zu beobachtenden Parameterbereichs durch den zu detektierenden Parameter im Wesentlichen nicht beeinflusst wird. Im Gegenzug soll im Folgenden unter dem Begriff „nicht stabil” oder „labil” verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein innerhalb des zu beobachtenden Parameterbereichs durch den zu detektierenden Parameter messbar beeinflusst wird.
Überraschender Weise erlaubt das erfindungsgemäße genetisch codierte FRET-Donor-Akzeptor-Paar eine genauere Untersuchung der Veränderungen von Zellparameter als die bisher bekannten FRET-Paare.
Dies ist der Fall, da wenigstens ein Fluoreszenzprotein des FRET-Paares gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil ist, während wenigstens ein anderes Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter labil ist. Dies bedeutet, dass die mindestens eine Eigenschaft z. B. die Fluoreszenzeigenschaft des labilen Proteins sich verändert, wenn der zu detektierende Parameter sich ändert. Durch Beobachten des Fluoreszenzverhältnisses der mindestens zwei Fluoreszenzprotein kann die Veränderung gemessen werden. Soll beispielsweise der pH-Wert in einem bestimmten Bereich untersucht werden, so wird ein Fluoreszenzprotein gewählt, dessen Eigenschaften sich im zu untersuchenden Bereich nicht verändern, sowie ein Fluoreszenzprotein, bei dem sich mindestens eine Eigenschaften vom pH-Wert im zu untersuchenden Bereich beeinflussen lässt.
Bevorzugt sind die Eigenschaften, die durch zu messende Parameter beeinflusst werden können, ausgewählt aus der Gruppe umfassend

– Fluoreszenz,
– Chromophor-Bindung,
– Chromophorreifung,
– Chromophoreigenschaften (wie z. B. Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften),
– Strukturveränderung,
– Veränderung kovalenter und nicht-kovalenter Bindungen.

Vorzugsweise umfasst das FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor genau zwei Fluoreszenzproteine.
Das erfindungsgemäße FRET-Donor-Akzeptor-Paar kann als Biosensoren z. B. Verwendung in der Diagnostik finden beispielsweise zum Screening von Enzymfunktionen. Dies dient sowohl der Zuordnung von unbekannten Enzymen zu den jeweiligen Enzymklassen, der Identifizierung möglicher Substrate und somit der Aufklärung der Spezifität des Enzyms, als auch dem Auffinden möglicher Enzyminhibitoren, die als potentielle Wirkstoffe interessant sind. FRET-Systeme erfüllen sowohl auf Grund der einfachen, direkten Detektion eines spezifischen Signals, als auch durch ihre breite Anwendbarkeit diese Anforderungen sehr gut und werden deshalb in immer größerem Maß eingesetzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung tragen mindestens zwei Fluoreszenzproteine des FRET-Donor-Akzeptor-Paares unterschiedliche Chromophore.
Unter dem Begriff „Chromophor” werden im Folgenden bestimmte Gruppen in Molekülen verstanden, die das Absorptionsverhalten der Verbindung charakteristisch beeinflussen.
Vorzugsweise ist das Chromophor ein Fluorophor, also ein Element in einem Molekül, das die Fluoreszenzeigenschaft des Moleküls hervorruft. Das Fluorophor ist demnach der Teil eines Fluoreszenzproteins, der das eingestrahlte Licht bestimmter Wellenlänge absorbiert und wieder abgibt. Mithin werden unter dem Begriff Fluorophor sowohl ein Molekül, das das Fluoreszenzprotein bindet, als auch bestimmte Peptidsequenz(en) innerhalb des Fluoreszenzproteins verstanden.
Ein Beispiel für ein Molekül, das als Fluorophor von einem Fluoreszenzprotein gebunden wird ist Flavinmononukleotid, während die Tripeptidsequenz Ser₆₅-Tyr₆₆-Gly₆₇ des GFP ein Beispiel für Peptidsequenzen darstellt, die als Fluorophor innerhalb eines Fluoreszenzproteins vorliegen. Es ist zu beachten, dass die funktionelle Struktur der Tripeptidsequenz Ser₆₅-Tyr₆₆-Gly₆₇ ein 4-(p-Hydroxy-benzylidene)-imidazolid-5-one ist, das durch eine Zyklisierung mit anschließender Oxidation des Tripeptids gebildet wird.
Bevorzugt sind die Chromophore ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

– Flavinmononukleotid (FMN),
– Riboflavin,
– Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD),
– 4-(p-hydroxybenzylidene)-imidazolidin-5-one und dessen Derivate.

Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass durch die unterschiedlichen Chromophore sichergestellt wird, dass die mindestens zwei Fluoreszenzproteine auf viele zu messende Parameter unterschiedlich reagieren und somit die Veränderung des jeweiligen Parameters detektiert werden kann.
Genau dies ist nämlich bei der Verwendung des GFP sowie seiner Farbvarianten nicht der Fall, da alle diese Proteine aufgrund ihrer Verwandtschaft auf Veränderungen von Zellparametern in identischer oder zumindest ähnlicher Weise reagieren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffunabhängig und mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffabhängig.
Unter dem Begriff „sauerstoffunabhängig” soll im Folgenden verstanden werden, dass ein Fluoreszenzprotein zu Chromophorsynthese kein Sauerstoff benötigt, während unter dem Begriff „sauerstoffabhängig” verstanden werden soll, dass ein Fluoreszenzprotein zu Chromophorsynthese Sauerstoff benötigt.
Alle Fluoreszenzprotein der GFP-Familie bilden ohne Ausnahme das Chromophor in einer mehrstufigen Autobiokatalyse aus. Da bei diesem Prozess molekularer Sauerstoff benötigt wird, hängt die Reifung des Chromophors und somit die Ausbildung des Fluoreszenzsignals unmittelbar von diesem Umweltfaktor ab.
Folglich beschränken sich die Anwendungen von GFP und dessen Derivaten als Fluoreszenzreporterproteine auf aerobe Systeme und das Fluoreszenzsignal dieser Proteine ist in obligat anaeroben Organismen oder unter hypoxischen Bedingungen nicht einsetzbar.
Somit ist das erfindungsgemäße FRET-Donor-Akzeptor-Paar besonders vorteilhaft, da es zum ersten Mal die Möglichkeit eröffnet hochsensitiv verschiedene Sauerstoffkonzentration in vivo sowie in vitro mit einem genetisch codierte FRET-Donor-Akzeptor-Paar zu bestimmen.
Damit geht überdies einher, dass das erfindungsgemäße FRET-Donor-Akzeptor-Paar besonders vorteilhaft ist, da es auch in anaeroben Systemen verwendet werden kann.
Vorzugsweise ist mindestens eines der mindestens zwei Fluoreszenzproteine des erfindungsgemäßen FRET-Donor-Akzeptor-Paares ein LOV-Protein.
Unter dem Begriff „Fluoreszenzprotein umfassend eine LOV-Domäne” soll im Folgenden ein Protein verstanden werden, das eine Light-Oxygen-Voltage (LOV) Domäne aufweist, bei der mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und bei der zudem neben dem Austausch des mindestens einen Cysteins wenigstens eine weiter Punktmutation vorliegt. Die LOV Domänen Proteinen binden anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine die vom Wirtsorganismus bereitgestellten Cofaktoren FMN, FAD oder Riboflavin. Diese Moleküle werden sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten Sauerstoff-unabhängig synthetisiert.
Beispiele für Proteine umfassend eine LOV-Domäne sind der Blaulichtrezeptor YtvA aus B. subtilis und das Sensory-Box-Protein SB2 aus Pseudomonas putida.
Der Blaulichtrezeptor YtvA ist ein 261 Aminosäuren großes Protein, das im Zuge der kompletten Genomsequenzierung von B. subtilis als putative Proteinkinase klassifiziert wurde. Es spielt eine Rolle als positiver Regulator in der σ^B-vermittelten Stressantwort von B. subtilis. YtvA konnte über Sequenzhomologievergleiche mit der Primärstruktur pflanzlicher Blaulichtrezeptoren, den Phototropinen, identifiziert werden. YtvA besteht aus einer N-terminalen LOV-Domäne und einer C-terminalen STAS(„sulfate transporter antisigma”)-Domäne. Die LOV-Domäne zeigt ein spezielles Faltungsmotiv aus einem 5-strängigen antiparallelen β-Faltblatts, das von α-Helices seitlich flankiert wird. Die LOV-Domäne enthält die aus den pflanzlichen Phototropinen bekannte Konsensussequenz NCRFLQ, wobei das darin enthaltene photoaktive Cystein den Cofaktor FMN als Chromophor während des LOV-spezifischen Photozyklus kovalent bindet. Dabei wird YtvA durch Anregung mit Licht der Wellenlänge von 450 nm aus dem Grundzustand in ein Photoprodukt überführt, welches bei 383 nm absorbiert und ein Emissionsmaximum von 498 nm aufweist. Innerhalb kurzer Zeit (ca. 1,6 μs) zerfällt dieses Photoprodukt zu einem Photoaddukt, in dem das FMN kovalent gebunden ist. In dieser Form verliert die LOV-Domäne die Eigenschaft der Fluoreszenz bis der Grundzustand von neuem erreicht ist.
Durch Sequenzhomologievergleiche der LOV-Domäne von YtvA aus B. subtilis mit der Genomsequenz des Gram-negativen Stäbchenbakteriums P. putida KT2440 wurden dort ein Gen identifiziert, das für ein putatives LOV-Protein codieren. Dabei handelt es sich um das 151 Aminosäuren große SB2 (sensory-box 2), welches aus nur einer LOV-Domäne besteht. Das SB2-Protein weist die für LOV-Domänen charakteristische Konsensussequenz auf. Aufgrund des Auffindens der photoaktiven Region wurde der Photozyklus des Sensory-Box2-Proteins untersucht.
Vorzugsweise ist das mindestens eine Cystein in der LOV Domäne durch Alanin ersetzt.
Besonders bevorzugt wird ferner, dass es sich bei mindestens einem der mindestens zwei Fluoreszenzproteine des erfindungsgemäßen FRET-Donor-Akzeptor-Paares um ein FbFP-Protein handelt.
Eine Proteinfamilie umfassend LOV-Domänen bzw. rekombinante Varianten bakterieller Blaulicht-Rezeptoren der LOV Familie wurde kürzlich völlig neu entwickelt. Anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine sind die neuen Fluoreszenzmarker sehr klein (16–19 kDa). Um die FMN-abhängige Fluoreszenz der Blaulichtrezeptoren zu erhöhen und somit deren Verwendung als Fluoreszenzmarker zu ermöglichen, wurden die bakteriellen Proteine mittels moderner Verfahren, der sogenannten directed evolution, verändert. Durch diese Mutationen wurde die Autofluoreszenz der Proteine drastisch erhöht, wodurch die FMN-bindenden Fluoreszenzproteine (FbFP's), insbesondere das FbFP aus P. putida KT2440 (SEQ ID No 4) und die FbFps aus B. subtilis (SEQ ID No 8 bzw. SEQ ID No 6), entstanden. Die neuen Markerproteine konnten in verschiedenen pro- und eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und die für FbFP charakteristische Fluoreszenz in vivo nachgewiesen werden. Die photochemische Charakterisierung der neuen Markerproteine ergab, dass die FbFPs nach Anregung mit blauem Licht (450 nm) eine blaugrüne Fluoreszenz (495 nm) emittieren.
Mit den „FMN-based fluorescence protein” (FbFP's) liegen mithin nun Fluoreszenzreporterproteine vor, die unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck fluoreszieren. Im Gegensatz zu Vertretern der GFP-Familie benötigt FbFP keinen Sauerstoff für die Ausbildung der Fluoreszenz.
Ferner wird ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor bevorzugt, dass ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein umfasst.
Unter der Bezeichnung „einem GFP-verwandten Protein” soll ein Protein verstanden werden, das eine dem GFP ähnliche Struktur aufweist, wie es z. B. bei Yellow Fluoreszenz Protein (YFP), Cyan Fluoreszenz Protein (CFP) und enhanced Green Fluoreszenz Protein (eGFP) der Fall ist. Ebenso wird unter „YFP-verwandten Protein” ein Protein verstanden, das eine dem YFP ähnliche Struktur aufweist.
Überraschend hat sich gezeigt, dass ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein als FRET-Paar verwendet werden kann. Dies war nicht vorauszusehen, da die Emissionsbande des Donors eine ausreichend große Überlappung mit der Absorptionsbande des Akzeptors aufweisen muss.
Das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein hat eine ganze Reihe von Vorteilen. So kann dieses FRET-Donor-Akzeptor-Paar sowohl in vivo als auch in vitro vielfach für die quantitative Bestimmung verschiedenster Parameter, wie pH-Wert, Sauerstoff- und Halidionen-Konzentration, sowie zur Detektion von Riboflavin, FAD, FMN oder auch zur Beobachtung von Temperaturänderungen eingesetzt werden.
Mit diesem bevorzugten FRET-Donor-Akzeptor-Paar ist man im Gegensatz zu den etablierten GFP-basierenden Biosensoren insbesondere erstmals in der Lage, hochempfindlich verschiedene Sauerstoffkonzentration in vivo sowie in vitro zu bestimmen. Die direkte Bestimmung der O₂-Konzentration wäre in der Krebstherapie aber auch in vielen Bereichen der Biotechnologie von großem Nutzen.
Wie aus 9 zu entnehmen ist, ist es möglich, mit Hilfe des Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein die aktuelle Sauerstoffkonzentration anhand des Verhältnisses der beiden Fluoreszenzmaxima λ = 527 nm/495 nm zu detektieren, so dass man direkt auf die Sauerstoffkonzentration in der Zelle und/oder in dem System schließen kann. Das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein ist somit insbesondere für die Untersuchung bzw. Optimierung von Stoffwechselprozessen oder Expressionsstudien in aeroben und anaeroben Zellen oder Systemen in der Biotechnologie in der Krebsforschung aber auch in der Grundlagenforschung zur Untersuchung von Sauerstofflimitierungen in Zellen einsetzbar.
Weiterhin wäre es denkbar, das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein zur Untersuchung von bakteriellen Biofilmen und hypoxischer Gewebe einzusetzen. Bakterien wie das human pathogene Bakterium Pseudomonas aeroginosa sind meistens organisiert in kleinen Gruppen verbunden mit biotischen und abiotischen Oberflächen, welche nicht selten Infektionen auslösen können (Biofilmbildung). In Biofilmen spielt jedoch die Sauerstoff-Limitierung für Zellen, die sich in den tieferen Schichten befinden, eine besondere Rolle. Mit dem Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein steht ein hervorragendes Werkzeug zur Verfügung, um mikroaerobe Bereiche in Biofilmen zu detektieren und gleichzeitig durch das in dem FRET-System enthaltene Sauerstoffunabhängige FMN-basierende Fluoreszenz Protein (FbFP) weitere Mechanismen und Zusammenhänge in den Biofilmen unter anaeroben Bedingungen aufzuklären.
Überraschend stellte sich überdies heraus, dass das bevorzugte FRET-Donor-Akzeptor-Paar ebenfalls für die Bestimmung des pH-Werts eingesetzt werden kann, da offenbar die Fluoreszenzintensität eines FbFP Proteins nicht von verschiedenen pH-Werten abhängt, wohl aber die Fluoreszenzintensität eines GFP-verwandten Proteins.
Zudem zeigt ein Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein überraschender Weise eine weit höhere pH-Sensibilität als vergleichbare FRET-Systeme.
Diese höhere pH-Sensibilität, die mit einem größeren Auflösungsvermögen in Abhängigkeit des pH-Wertes einhergeht, ist vorteilhaft gegenüber anderen pH-Biosensoren, da sich das Fluoreszenzverhältnis von FbFP und YFP in einem Bereich von 0,5 bis 5 bewegt. Dem gegenüber bewegt sich das entsprechende Fluoreszenzverhältnis bei anderen Biosensoren in diesem Anwendungsbereich nur in Bereichen von 1 bis 2 (Yano et al. 2010). pH-Wert Schwankungen können mit dem Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein mithin sehr viel genauer detektiert werden.
Beispielsweise kann das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein bei lifetime pH-Imaging in Zellen seinen Einsatz finden, wo man bei verschiedenen Wachstumsphasen den pH-Wert der verschiedenen Zellkompartimente auch im aciden Bereichen der Zellen in vivo wie zum Beispiel in Lysosomen oder Peroxisomen bestimmen kann.
Ferner kann das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein bei der Bestimmung bzw. Lokalisierung von verschiedenen Ionenkonzentrationen wie Chlorid oder Iodid sehr effektiv eingesetzt werden, da es im Gegensatz zu den etablierten Biosensoren einen größeren FRET-Ratio Bereich besitzt und so durch den größeren Dynamikumfang viel empfindlicher auf Änderungen der zu detektierenden Ionenkonzentrationen reagieren kann. Vor allem das mit dem GFP verwandte Protein wird durch eine variierende Halid-Ionenkonzentration, die zu einer unterschiedlichen Intensität der Fluoreszenzemission führt beeinflusst, wobei diese vermutlich auf einen Einfluss der Ionen auf die Proteinfaltung zurückzuführen ist. Somit eignet sich das Fusionsprotein aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein zur Verwendung z. B. im Bereich der Neurobiologie.
Ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet des Fusionsproteins aus einem FbFP Protein und einem GFP-verwandten Protein wäre der Einsatz als Temperatur-Biosensor in der Krebstherapie. Dies läge im Bereich des Möglichen, da sich bei Fluoreszenzmessungen gezeigt hat, dass FbFPs in Temperaturbereichen ab 30°C bis 65°C gegenüber mit dem GFP verwandten Proteinen wesentlich temperaturempfindlicher reagieren.
Diesen Temperaturstabilitätsunterschied der einzelnen Proteine kann man sich in dem FRET-System zunutze machen. Es sind unterschiedliche Fluoreszenzemissionsverhältnisse bei den geeigneten Temperaturen z. B. von 30°C bis 60°C messbar, so dass man so von den unterschiedlichen Fluoreszenzemissionsverhältnissen direkt auf die Temperatur schließen kann.
Überdies kann wegen der Abhängigkeit des FbFP-Fluoreszenzsignals von den Cofaktoren FMN, FAD oder Riboflavin das bevorzugten FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Detektion von Rivoflavin in Zellen und Geweben eingesetzt werden. Ein molekularer Riboflavin-Sensor ist in vielen Bereichen der (molekularen) Medizin von großer Bedeutung. Er kann z. B. dazu beitragen, Riboflavin-Mangelerscheinungen und daraus resultierende Krankheitsbilder wie z. B. Hornhautdegenerationen, Nachtblindheit oder weiteren Krankheitsbildern besser untersuchen zu können.
Vorzugweise ist das dem GFP verwandte Protein YFP.
Besonders bevorzugt ist das YFP der Akzeptor und das FbFP Protein der Donor des FRET-Donor-Akzeptor-Paares.
Dieses bevorzugte FRET-Donor-Akzeptor-Paar basiert auf einer Translationsfusion zwischen dem YFP und einem FbFP Fluoreszenzprotein, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne C-terminal an das Zielprotein YFP fusioniert ist. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers verbunden (vgl. 2).
Ferner wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Komplexes aus einem Protein mit einer LOV-Domäne und einem Fluoreszenzprotein zum Resonanzenergietransfer bereitgestellt, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor des Resonanzenergietransfers im anaeroben Milieu fluoreszieren kann.
Unter dem Begriff „Komplex” soll im Folgenden verstanden werden, dass die beiden Proteine sich in räumliche Nähe zueinander befinden. Dies kann auf verschiedene Arten geschehen beispielsweise durch kovalente und nicht-kovalente Bindungen, wie die Biotin-Streptavidin Bindung.
Unter dem Begriff „anaerobes Milieu” sollen im Folgenden Bedingungen verstanden werden unter denen vergleichsweise wenig bis gar kein Sauerstoff für Reaktionen beispielsweise Stoffwechselprozesse oder Katalysen zur Verfügung steht.
Unter dem Begriff „fluoreszieren können” soll im Folgen verstanden werden, das ein Fluoreszenzprotein durch Licht bestimmter Wellenlänger angeregt werden kann und/oder dass es die bei der Anregung aufgenommene Energie wieder abgeben kann.
Die Verwendung eines derartigen Komplexes ist vorteilhaft, da sie die Durchführung eines Resonanzenergietransfers auch in anaeorben Milieu bzw. bei Bedingungen mit geringem Sauerstoff ermöglicht. Wie bereits erwähnt ist dies mit Komplexen aus dem Stand der Technik z. B. Komplexen aus unterschiedlichen Proteinen der GFP Proteinfamilie nicht möglich.
In einer Ausführungsform dieser Verwendung ist der Donor ein Protein mit einer LOV-Domäne.
Dies ist vorteilhaft, da Proteine mit einer LOV-Domäne im anaeroben Milieu fluoreszieren bzw. angeregt werden können. Dadurch können Komplexe aus einem Protein mit einer LOV-Domäne als Donor und einem Fluoreszenzprotein als Akzeptor zur Sauerstoffmessung eingesetzt werden. Hierbei bewirkt eine Reduktion des Sauerstoffgehalts eine verminderte Energieübertragung des sauerstoffunabhängigen Proteins mit einer LOV-Domäne auf den sauerstoffabhängigen Akzeptor. Dies führt zu einer Abnahme des Fluoreszenzsignals des Akzeptors, wenn der Sauerstoffgehalt abnimmt. Somit ist es erstmals möglich, Sauerstoff über das relative Verhältnis der Signale des Donors und des Akzeptors zu bestimmen.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Verwendung ist der Akzeptor ein YFP verwandtes Protein, also ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst

a) gemäß der SEQ ID NO 2 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus (a) aufweist.

Ein dem YFP-verwandtes Protein als Akzeptor hat insbesondere in Verbindung mit einem Protein mit einer LOV-Domäne als Donor den Vorteil, dass durch die unterschiedlichen Strukturen und unterschiedlichen Chromophore sichergestellt wird, dass die beiden Proteine auf viele zu messende Parameter unterschiedlich reagieren und somit die Veränderung des Parameters mittels Resonanzenergietransfers detektiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Verwendung wird das Protein mit einer LOV-Domäne

a) kodiert durch eine Nukleinsäure der SEQ ID NO. 3, 5 oder 7 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen,
b) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a)–c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)–d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)–e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde,
g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß einer der SEQ ID No 4, 6 oder 8, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, und/oder
h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.

Unter dem Begriff „Nukleinsäure” soll im Folgenden ein einzel- oder doppelsträngiges Makromolekül verstanden werden, das aus Nukleotiden aufgebaut ist. Die geläufigsten Nukleinsäuren sind Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. complementary DNA (cDNA) und Ribonukleinsäure (RNA). In der DNA kommen die Nukleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin vor, wobei letztere spezifisch für DNA ist. In der RNA kommen bis auf Thymin, das durch Uracil ersetzt ist, dieselben Nukleinbasen bzw. Nukleotide vor. Künstliche Nukleinsäuren sind beispielsweise Peptide Nucleic Acid (PNA), Morpholino und Locked Nucleic Acid (LNA), sowie Glycol Nucleic Acid (GNA) und Threose Nucleic Acid (TNA). Jede dieser Nukleinsäuren unterscheidet sich im Aufbau des Rückgrats von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren.
Unter dem Begriff „komplementär” soll die zu der benutzten/diskutierten Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure verstanden werden. Dies ist ein bedeutendes Konzept der Molekularbiologie, da es sich um eine wichtige Eigenschaft doppelsträngiger Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder DNA:RNA Duplexe handelt. Der eine Strang ist zu dem anderen komplementär, da die Basenpaare der beiden Stränge nicht-kovalent über zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Im Prinzip – es gibt Ausnahmen für Thymin/Uracil und den Wobble-Komplex der tRNA – gibt es nur eine komplementäre Base für jede Base einer Nukleinsäure. Daher ist es möglich, den komplementären Strang eines einzeln vorliegenden Strangs zu rekonstruieren. Dies ist z. B. für die DNA Replikation essentiell. Beispielsweise wäre der komplementäre Strang der DNA Sequenz
Im Fall der DNA kann sich der Begriff ”komplementär” auch auf cDNA beziehen. cDNA wird mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA z. B. mRNA synthetisiert.
Unter dem Begriff „hybridisieren” bzw. Hybridisierung wird im Folgenden der Vorgang verstanden, bei dem sich an eine Nukleinsäure eine mehr oder weniger vollständig komplementärer Nukleinsäure anlagert, indem Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den jeweils komplementären Nukleinbasen ausgebildet werden.
Unter dem Begriff „unter stringenten Bedingungen hybridisieren” wird im Folgenden verstanden, dass die Bedingungen der Hybridisierungsreaktion so eingestellt sind, dass nur vollständig zueinander komplementäre Basen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Die Stringenz kann beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst werden.
Unter dem Begriff „stille Mutation” soll im Folgenden das Phänomen verstanden werden, dass eine Mutation in einem Nukleinsäure Abschnitt keine Konsequenzen nach sich zieht. Dies ist der Fall, da der Informationsgehalt des Gens sich nicht verändert hat, weil eine Reihe von Aminosäuren durch verschiedene Dreiergruppen aufeinanderfolgender Nukleinbasen – Tripletts oder Codons genannt – kodiert werden.
Der Begriff „Fragment” soll im Folgenden einen Teil einer Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz bezeichnen, dem einige Teile einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz fehlen, der aber zumindest einen Teil seiner Aktivität z. B. in Bezug auf Fluoreszenzeigenschaften, Enzymaktivität oder Bindung zu anderen Molekülen behält.
Der Begriff ”Variante” soll im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz bezeichnen, die in ihrer Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen der Struktur und biologischen Aktivität einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz gleicht.
Unter dem Begriff „Derivat” wird im Folgenden eine verwandte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verstanden, die in Bezug auf ein Zielmolekül gleichartige Charakteristika hat wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „Homolog” wird im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz verstanden, in deren Sequenz im Vergleich zu der Sequenz eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz mindestens ein Nukleotid bzw. eine Aminosäure hinzugefügt, gelöscht, substituiert oder auf andere Weise modifiziert wurde. Vorraussetzung ist allerdings, dass das Homolog im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweist wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert” soll im Folgenden verstanden werden, dass eine Nukleinsäure an den Codongebrauch des Organismus, in dem sie exprimiert wird, angepasst wird. Der Codongebrauch auch die Codon Usage bzw. der Codon Bias, beschreibt das Phänomen, dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden.
Unter dem Begriff „Sequenzidentität von mindestens X%” wird im Folgenden eine Sequenzidentität verstanden, die durch ein Sequenzabgleich (Alignment) mittels eines BLAST Algorithmus, wie er auf der Homepage des NCBIs zur Verfügung steht, bestimmt wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Verwendung wird das Donor-Akzeptor-Paar genetisch codiert und/oder liegt als Fusionsprotein vor und/oder wird zusammen als Transkriptionseinheit exprimiert.
Im Gegensatz zu nicht genetisch codierten Donor-Akzeptor-Paaren haben genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare den Vorteil, dass sie nicht über einen aktiven Transportmechanismus oder eine Permeabilisierung der Zellmembran in lebenden Zellen aufgenommen werden müssen. Somit können genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare nicht-invasiv verwendet werden.
Genetisch codierte Donor-Akzeptor-Paare können zudem durch die Fusion mit geeigneten Signalsequenzen gezielt in gewünschten Zellkompartimente lokalisiert werden oder an beliebige Zielproteine fusioniert werden.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Detektion von Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin unter Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor-Paares gemäß einem der Ansprüche 1–3 bereitgestellt, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin stabil ist.
Unter dem Begriff „Detektion” soll im Folgenden zum einen verstanden werden, dass einer der Faktoren Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin überhaupt festgestellt wird. Zum anderen ist unter „Detektion” aber auch eine Messung eines der Faktoren zu verstehen. Dies geschieht z. B. anhand der Berechnung eines Verhältnisses der beiden Fluoreszenzmaxima der mindestes zwei Fluoreszenzproteine, wobei sich das Verhältnis verändert falls der zu messende Faktor sich verändert.
Wie bereits erwähnt ermöglicht das erfindungsgemäße Donor-Akzeptor-Paar bzw. dessen Verwendung zum ersten Mal ein Verfahren zur Messung von Sauerstoff in biologischen Systemen mittels Fluoreszenzproteinen und verbessert die Detektion der Faktoren pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin ganz entscheidend.
In einer Ausführungsform des Verfahrens findet die Detektion mittels Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer nach Anregung mit Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 450 nm statt.
Dies ist insbesondere der Fall falls ein FbFP-Protein als Donor fungiert, denn diese werden durch Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 450 nm, insbesondere durch Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 390 nm angeregt.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch die Abbildungen und Ausführungsbeispiele veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Abbildungen und Ausführungsbeispiele nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
1 zeigt das Schema eines FRET-Systems;
2 zeigt eine schematische Darstellung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
3 und 4 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
5 und 6 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
7 zeigt die in vivo Fluoreszenz des YFP FbFP-Fusionsproteins;
8 zeigt die Thrombin Proteaseabspaltung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
9 zeigt die Fluoreszenzphotometrische Messung der Na₂S₂O₄-Reduktion des YFP-Chromophors;
10 zeigt die in vitro pH-Fluoreszenzmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
11 zeigt die in vitro pH-Stabilitätsmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins;
12 zeigt eine fluoreszenzphotometrische Messung zur Eignung des YFP FbFP-Fusionsproteins als Ionen-Biosensor;
13 zeigt einen Temperaturstabilitätstest des YFP und FbFP.
1 zeigt das Schema eines FRET-Systems.
Der Donor absorbiert das von einer Lichtquelle ausgestrahlte Licht und strahlt es anschließende bei einer längeren Wellenlänge wieder ab. In diesem Emissionsspektrum liegt das Absorptionsmaximum des Akzeptors, so dass er die abgestrahlte Energie aufnehmen kann. Insgesamt beobachtet man also mit der Emission des Akzeptors einen Energietransfer vom Donor zum Akzeptor, den man als FRET bezeichnet.
2 zeigt eine schematische Darstellung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10). Eine Translationsfusion, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne (SEQ ID No. 4) C-terminal an das Zielprotein YFP (SEQ ID No 2) fusioniert ist, wurde generiert, um untersuchen zu können ob sich die Kombination der beiden Proteine als neues FRET-Paar eignet. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers (SEQ ID No 15 & 16) verbunden.
3 und 4 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Die Fluoreszendomänen FbFP und YFP wurden mittels PCR mit modifizierten Primern (SEQ ID No. 11–14) amplifiziert und neue Restriktionsschnittstellen generiert. Die Klonierung der einzelnen Module und des Linkers (SEQ ID No 15 & 16) erfolgte in dem Klonierungsvektor pBlueScript KSII(–), welcher in E. coli DH5α-Zellen eine Blau-Weiß-Selektion erlaubt.
5 und 6 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung der YFP-FbFP-Fusion (SEQ ID No 9).
Das dargestellte Schema zeigt die endgültige Fusionierung des FbFP (SEQ ID No 3) mit YFP (SEQ ID No 1) durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen SalI/XhoI und anschließender Ligation im Bluescript KSII(–).
7 zeigt die in vivo Fluoreszenz des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist die in vivo Fluoreszenz des YFP-FbFP Biosensors, der einzelnen Fluoreszenzproteine, sowie des Leerplasmids pRhotHi-2 nach einer T₇ Überexpression in E. coli BL21(DE3)-Zellen. Detektiert wurde die Fluoreszenz der Zellen nach Anregung mit λ = 380 nm mittels eines Fluoreszenzphotometers (Perkin Elmer). Die abgebildeten Kurvenverläufe entsprechen den spezifischen Fluoreszenzemissionen, der in der Figur genannten Proteine.
8 zeigt die Thrombin Proteaseabspaltung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist die Fluoreszenzmessung der in vitro-FRET-Fusionsspaltung (YFP↓FbFP) mittels der Thrombin-Protease in dem Proteinpuffer. Zusätzlich dargestellt ist die Kontrolle der Fusion ohne Zugabe von Protease. Es wurde gereinigtes Protein der Fusion YFP-FbFP verwendet, welches mittels His₆-Tag affinitätschromatographisch gereinigt wurde. Die Fluoreszenzemission wurde mittels Fluoreszenzphotometer (Perkin Elmer) bei Anregung bei λ = 380 nm detektiert, wobei eine YFP_FbFP Absorbtion._380nm von 0.1 verwendet wurde, die Thrombin-Protease wurde mit einer Konzentration von 1 u/μl eingesetzt.
9 zeigt die Fluoreszenzphotometrische Messung der Na₂S₂O₄-Reduktion des YFP-Chromophors.
Dargestellt ist die Fluoreszenzemission der Reduktion des Biosensors YFP-FbFP (SEQ ID No 10) mit 50 mM Na₂S₂O₄ in Proteinpuffer (10 mM NaH₂PO₄; 10 mM NaCl; pH 8). Die Fluoreszenzemission wurde mittels Fluoreszenzphotometer (Perkin Elmer) bei Anregung bei λ = 380 nm detektiert, wobei eine YFP_FbFP Absorbtion._380nm von 0.1 verwendet wurde. Zusätzlich wurde die Fluoreszenzemission der Fusion vor Versetzen mit Natriumdithionit bestimmt (gestrichelte Linie).
10 zeigt die in vitro pH-Fluoreszenzmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527 nm/495 nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vitro-Messung der pH-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP (SEQ ID No 10) in einem pH-Wertbereich von 4.5 bis 11. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung der aufgereinigten Proteine mit λ = 380 mn mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion_380nm des Proteins wurde auf 0,1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
11 zeigt die in vitro pH-Stabilitätsmessung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10).
Dargestellt ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527 nm/495 nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vitro-Messung der pH-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP in einem pH-Wertbereich von 4 bis 7. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung des aufgereinigten Proteins mit λ = 380 mn mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion_527nm des Proteins wurde auf 0,1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
12 zeigt eine fluoreszenzphotometrische Messung zur Eignung des YFP FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No 10) als Ionen-Biosensor.
Dargestellt als Säulen ist das errechnete Fluoreszenzverhältnis 527 nm/495 nm der Emissionsmaxima YFP (SEQ ID No. 2) und FbFP (SEQ ID No. 4) der in vitro-Messung der Halidionen-Stabilität der FRET-Fusion YFP-FbFP (SEQ ID No. 10) bei schrittweise erhöhten Iodid- und Chloridionenkonzentrationen von 0 bis 400 mM. Detektiert wurde die Fluoreszenzemission der Fusion bei Anregung der aufgereinigten Proteine mit λ = 380 mn mit Hilfe des Perkin Elmer Fluoreszenzphotometers. Die Absorbtion_527nm des Proteins wurde auf 0,1 im Proteinpuffer eingestellt und gemessen.
13 zeigt einen Temperaturstabilitätstest für YFP und FbFP.
Dargestellt ist die Fluoreszenzemission in Prozent des YFP's (SEQ ID No. 2) und des FbFP's (SEQ ID No. 4) in Abhängigkeit von der Temperatur um die Eignung des YFP-FbFP-Fusionsproteins als Temperatur-Biosensors zu untersuchen.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
1. Konstruktion der Biosensoren
Um untersuchen zu können, ob sich das FMN-basierte Fluoreszenzreporterprotein FbFP (SEQ ID No. 4) für den Einsatz als neuer Biosensor eignet, wurde eine Translationsfusion (SEQ ID No. 9) generiert, bei der die FbFP-Fluoreszenzdomäne (SEQ ID No 4) C-terminal an das Zielprotein YFP (SEQ ID No. 2) fusioniert ist. Die beiden Proteine wurden dabei mittels eines Linkers (SEQ ID No 15 und 16) verbunden, welcher eine „multiple cloning site” (MCS) mit den Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen KpnI, NdeI, BamHI, SacI, SalI, HindIII, XhoI und Cfr42I enthält. Zur Expression des YFP-FbFP-Fusionsproteins wurde ebenfalls der Expressionsvektor pRhotHi-2 gewählt. Das Fusionsprotein wurde zudem mit einem His₆-tag versehen, wodurch das rekombinante Protein mittels affinitätschromatographischer Verfahren einfach aufgereinigt werden kann. Alle Klonierungsschritte wurden in dem Klonierungsvektor pBluescript KSII(–) durchgeführt.
2. Charakteriserung des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10)
Um zeigen zu können, dass mit dem YFP-FbFP-Fusionsprotein ein funktionelles FRET-System erzeugt werden konnte, wurde zunächst eine in vivo Charakterisierung des Fusionsproteins in dem Gram-negativen Bakterium E. coli durchgeführt. Hierzu wurde das Plasmid pRhotHi-2_YFP_FbFP in den E. coli-Stamm BL21DE3 mittels IPTG-Zugabe überexprimiert.
Die Fluoreszenzemission wurde bei einer Anregung mit blauem Licht (λ = 380 nm) im Fluoreszenzphotometer detektiert und aufgezeichnet. Als Kontrolle wurden zusätzlich die Fluoreszenzproteine FbFP (SEQ ID No. 4) und YFP (SEQ ID No. 2) einzeln exprimiert und ebenfalls ein Fluoreszenzspektrum bei dieser Anregung aufgenommen. Als Negativkontrolle wurde die Fluoreszenz des Leerplasmides pRhotHi-2 bestimmt, wie anhand der 7 zu erkennen ist.
Vergleicht man die Emissionsmaxima von FbFP und YFP im YFP-FbFP-Fusionsprotein mit den Maxima der jeweiligen unfusionierten Fluoreszenzproteinen, ist überraschender Weise ein signifikanter Unterschied zu erkennen, welcher durch den strahlungsfreien Übertrag der Energie von FbFP zum YFP zustande kommt. Hierbei zeigt sich nach spezifischer Anregung des FbFP-Chromophors eine niedrige Fluoreszenzemission des FbFP (Emissionsmaximum bei 495 nm) und eine signifikante Fluoreszenzemission des YFP (Emissionsmaximum bei 527 nm).
3. Nähere Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften des YFP-FbFP-Fusionsproteins
Um die Fluoreszenzeigenschaften des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) näher zu untersuchen, wurde die Fusion über einen His₆-tag mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und in Proteinpuffer (10 mM NaH₂PO₄, 10 Mm NaCl, pH 8) aufgenommen um die nötigen Untersuchungen durchführen zu können. Um nachweisen zu können, dass die Fluoreszenz des FRET-Akzeptors YFP (SEQ ID No. 2) auf den Energietransfer vom FRET-Donor FbFP (SEQ ID No. 4) nach spezifischer Anregung des Donor-Chromophors zurückzuführen ist, wurden die beiden Fluoreszenzdomänen des YFP-FbFP-Fusionsproteins durch die Thrombin Protease wieder voneinander getrennt. Da sich in der Linkerregion des YFP-FbFP-Fusionsproteins eine Proteaseschnittstelle befindet, würde die räumliche Trennung der Fluoreszenzdomänen mittels der Thrombin Protease eine verminderte Fluoreszenzemission des YFP (λ = 527 nm) und eine erhöhte Fluoreszenzemission des FbFP (λ = 495 nm) zur Folge haben. Dies sollte geschehen, da im Falle der proteolytischen Trennung der maximale Försterradius von 100 Å überschritten und so die Energie des FRET-Donors FbFP nach spezifischer Anregung (λ = 380 nm) nicht mehr direkt auf den FRET-Akzeptor YFP übertragen wird, sondern das FbFP das Licht bei λ = 495 nm in Form von Fluoreszenz emittiert. Wie in dem entsprechenden Experiment gezeigt werden konnte (8), führt die proteolytische Trennung der FbFP- von der YFP-Fluoreszenzdomäne zu dem erwarteten Ergebnis. Der vollständige Proteaseverdau des YFP-FbFP-Fusionsproteins wurde anschließend mittels SDS-PAGE, bei der die Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt wurden, bestätigt. Es war klar zu erkennen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein nach dem proteolytischen Verdau nicht mehr als Fusionsprotein (~45 kDa) vorliegt, sondern nur noch die beiden getrennten Fluoreszenzproteine FbFP (~17 kDa) und YFP (~27 kDa) detektierbar sind. Als Referenz wurden die jeweiligen unfusionierten Fluoreszenzproteine aufgetragen um den Effekt der Proteasespaltung verifizieren zu können.
4. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als O₂-Biosensor
Um zu überprüfen, ob das erzeugte YFP-FbFP-Fusionsprotein (SEQ ID No. 10) als ein neuartiger O₂-Biosensor eingesetzt werden kann, wurde durch Zugabe von Natriumdithionit das YFP-Chromophor reduziert, wodurch die Fluoreszenz dieser Domäne vollständig inhibiert wurde. Gleichzeitig bindet das Reduktionsmittel den gelösten Sauerstoff vollständig, sodass die Reoxidation des Chromophors stark verzögert wird. In 9 ist das Fluoreszenzspektrum des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) vor und nach der Reduktion mit Natriumdithionit bei spezifischer Anregung des FbFP-Chromophors dargestellt. Das Fluoreszenzspektrum lässt erkennen, dass vor der Reduktion des YFP-Chromophors die spezifische YFP-Fluoreszenzemission bei λ = 527 nm im YFP-FbFP-Fusionsprotein deutlich detektierbar ist. Weiterhin ist zu erkennen das die FbFP-Fluoreszenzemission im YFP-FbFP-Fusionsprotein bei λ = 495 nm nach Zugabe von Natriumdithionit erhöht ist, was auf die verminderte Energieübertragung des Donors auf den YFP-Rezeptor zurückzuführen ist. Anhand dieses Versuches konnte eine starke Abnahme des YFP-Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von Sauerstoff nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass es überraschender Weise mit dem neuartigen YFP-FbFP-Fusionsprotein erstmals möglich ist, Sauerstoff über das relative Verhältnis der Signale beider Fluoreszenzdomänen zu bestimmen.
5. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als pH-Biosensor
Um die Abhängigkeit der Fluoreszenz des Biosensors vom pH-Werts charakterisieren zu können, wurden die Gene YFP (SEQ ID No. 1), FbFP (SEQ ID No. 3) und YFP-FbFP (SEQ ID No. 9) im pRhotHi-2 in E. coli BL21(DE3) Zellen IPTG-induziert überexprimiert, aufgeschlossen und affinitäts-chromatographisch mittels His₆-Tag aufgereinigt. Die Fluoreszenzintensitätsänderung gegenüber verschiedenen pH-Werten wurde unter Zuhilfenahme eines pH-Universalpuffers in vitro näher charakterisiert. Hierzu konnten die verschiedenen Fluoreszenzintensitäten bei den pH-Werten 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 10, 11 und 12 des YFP-FbFP-Fusionsproteins und den jeweiligen einzelnen Fluoreszenzreporterproteine unter der UV-Lampe und im Fluoreszenzphotometer detektiert werden. Aus den 10 und 11 geht hervor, dass sich der neue Biosensor hervorragend zur äußerst empfindlichen Bestimmung des pH-Werts eignet. Das in 10 dargestellte Diagramm zeigt das Verhältnis der Fluoreszenzmaxima von YFP und FbFP im YFP-FbFP-Fusionsprotein (SEQ ID No. 10). Man erkennt deutlich, dass sich der Messbereich des neuen Biosensors von 4,0 bis 7,0 erstreckt, was den gesamten physiologischen Bereich lebender Organismen abdeckt. Dabei sinkt das YFP-FbFP-Fluoreszenzverhältnis von pH 7 bis pH 4 um einen Faktor von 2,5. Dieser Effekt lässt sich mit einer destabilisierenden Wirkung des YFP-Chromophors durch die pH-abhänige Protonierung des Chromophors erklären. Zusätzliche Fluoreszenzmessungen mit den einzelnen Fluoreszenzproteinen YFP und FbFP belegen ebenfalls diese destabilisierende Wirkung des pH-Wertes auf das YFP-Fluoreszenzsignal, während sich die Fluoreszenzemission bei dem FbFP über den pH-Bereich von 8 bis 4,5 kaum verringert. Diese Daten belegen somit eindeutig, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein (SEQ ID No. 10) für die empfindliche Bestimmung des pH-Werts sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden kann.
6. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als Halidionen-Biosensor
Ob die Fluoreszenzemission von FbFP (SEQ ID No. 4) ebenfalls durch die Ionenkonzentration beeinflusst wird, wurde anhand von gereinigtem FbFP untersucht. Dazu wurde der Expressionsvektor pRhotHi2_fbfp+His₆ in den Expressionsstamm E. coli BL21(DE) transformiert, das Gen überexprimiert, gereinigt, konzentriert und umgepuffert. Der Erfolg der Expression und der Reinigung wurden mittels SDS-PAGE überprüft (Ergebnisse nicht gezeigt). Zur Bestimmung der Fluoreszenzemission des FbFP in Abhängigkeit zur Ionenkonzentration, wurde eine Proteinmenge entsprechend einer Absorption (λ = 450 nm) von 0,1 in einem Milliliter pH-Universalpuffer gelöst. Der Proteinpuffer wurde zuvor auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die getesteten Ionenkonzentrationen wurden durch lösen entsprechender Mengen Natriumchlorids bzw. Natriumiodids in diesem Puffer hergestellt. Die Messung erfolgte anschließend in einem Fluoreszenzphotometer (LS 50 B, Perkin Elmer) bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm. Dabei zeigte sich, dass die Fluoreszenzemission des FbFP durch die getesteten Ionenkonzentrationen kaum beeinflusst wird, da die relative Fluoreszenzemission in Abhängigkeit der Ionenkonzentration annähernd konstant im Bereich von ca. 150 Einheiten liegt (Daten nicht gezeigt).
Durch die Konstanz der Fluoreszenzemission des FbFP über den hier getesteten Ionenkonzentrationsbereich und gleichzeitiger Sensitivität des FRET-Partners YFP (SEQ ID No. 2) auf genau diese Bedingungen, ist eine Grundvoraussetzung für den Einsatz dieses Systems als Biosensor erfüllt, da es je nach Ionenkonzentration zu einem bestimmten Verhältnis der beiden Emissionsmaxima von FbFP und YFP kommt. Um dies in vitro zu überprüfen, wurde die Fluoreszenzemission des YFP-FbFP-Fusionsproteins (SEQ ID No. 10) in Abhängigkeit von verschiedenen Ionenkonzentrationen fluoreszenzphotometrisch gemessen. Die Charakterisierung des YFP-FbFP-Fusionsproteins erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm. Die sich aus den Emissionsmaxima bei 495 (FbFP) und 527 nm (YFP) ergebenden Verhältnisse zeigen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein überraschender Weise ebenfalls empfindlich auf unterschiedliche Halidionen-Konzentrationen reagiert. Im Säulendiagramm (12) ist erkennbar, dass die Verhältnisse der Emissionsmaxima von FbFP und YFP mit steigender Konzentration, sowohl der Chlorid- als auch der Iodidionen, sinken. Dabei reagiert die Fusion auf gleiche Konzentrationen von Iodidionen empfindlicher als auf Chloridionen, was anhand des deutlich stärkeren Abfalls der Ausgleichsgeraden über die jeweilige Messreihe bestimmt wird. Dieser beträgt dabei für die Messung der verschiedenen Iodidionenkonzentrationen 0,6302 und im Fall der Chloridionenkonzentrationen lediglich 0,4512. Die Verringerung des Fluoreszenzverhältnisses der beiden Fluoreszenzdomänen rührt dabei von der Ionensensitivität des YFP her, da hier gezeigt wurde, dass die Emission des FbFP über den getesteten Konzentrationsbereich nahezu konstant ist. Die hier gezeigten Ergebnisse verdeutlichen, dass das YFP-FbFP-Fusionsprotein empfindlich auf unterschiedliche Iodid- und Chloridionenkonzentrationen reagiert, wobei eine höhere Ionenkonzentration zu einer Verminderung der Ratio (λ 527/495) der Emissionsmaxima führt.
7. Einsatz des YFP-FbFP-Fusionsproteins als Temperatur-Biosensor
Hierzu wurden die beiden Fluoreszenzproteine FbFP (SEQ ID No. 4) und YFP (SEQ ID No. 2) in E. coli BL21(DE3)-Zellen überexprimiert, aufgeschlossen und mittels His₆-Tag affinitätschromatographisch aufgereinigt. Nach Überführung durch Umpufferung in den Proteinpuffer (10 mM NaH₂PO₄; 10 mM NaCl; pH 8) wurden die auf eine Absorption von 0,1 eingestellten Proteine bei der jeweiligen Temperatur 5 min inkubiert und dann die Fluoreszenzemission photometrisch mit Hilfe des Perkin Elmer Photometers bestimmt. Wie in 13 dargestellt, ist das YFP-Protein bei hohen Temperaturen wesentlich stabiler als das FbFP-Protein, da YFP noch bei 60 bis 65°C 82 bis 75% Fluoreszenzemission zeigt, verglichen mit der maximalen Emission bei 22,5°C. Bei FbFP nimmt die Fluoreszenzemission signifikant auf bis zu 27% ab. Bei 65°C zeigt dieses Fluoreszenzprotein keinerlei Fluoreszenz mehr.
LITERATUR

BAIRD, G. S., ZACHARIAS, D. A. and TSIEN, R. Y. (1999). Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11241–11246.
MANK, M., REIFF, D. F., HEIM, N., FRIEDRICH, M. W., BORST, A. and GRIESBECK, O. (2006). A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J 90, 1790–1796.
PICKUP, J. C., HUSSAIN, F., EVANS, N. D., ROLINSKI, O. J. and BIRCH, D. J. (2005). Fluorescence-based glucose sensors. Biosens Bioelectron 20, 2555–2565.
YANO, T., OKU, M., AKEYAMA, N., ITOYAMA, A., YURIMOTO, H., KUGE, S., FUJIKI, Y. and SAKAI, Y. (2010). A Novel Fluorescent Sensor Protein for Visualization of Redox States in the Cytoplasm and in Peroxisomes. Mol Cell Biol

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Baird et al., 1999 [0011]
Mank et al., 2006 [0011]
Pickup et al. 2004 [0012]
Yano et al. 2010 [0013]
Yano et al. 2010 [0062]

Claims

FRET-Donor-Akzeptor-Paar zur Verwendung als Biosensor, umfassend mindestens zwei Fluoreszenzproteine, wobei wenigstens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter stabil und mindestens ein Fluoreszenzprotein gegenüber einem durch den Biosensor zur detektierenden Parameter nicht stabil ist.
FRET-Donor-Akzeptor-Paar gemäß Anspruch 1, wobei mindestens zwei Fluoreszenzproteine unterschiedliche Chromophore tragen.
FRET-Donor-Akzeptor-Paar gemäß einem der Ansprüche 1–2, wobei mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffunabhängig und mindestens ein Fluoreszenzprotein sauerstoffabhängig ist.
Verwendung eines Komplexes aus einem Protein mit einer LOV-Domäne und einem Fluoreszenzprotein zum Resonanzenergietransfer, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor des Resonanzenergietransfers im anaeroben Milieu fluoreszieren kann
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Donor ein Protein mit einer LOV Domäne ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4–5, wobei der Akzeptor ein YFP verwandtes Protein ist, also ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst a) gemäß der SEQ ID No 2, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz, b) die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus (a) aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4–6, wobei das Protein mit einer LOV-Domäne a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID No 3, 5 oder 7 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist, d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a)–c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)–d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist, f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)–e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde, g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß einer der SEQ ID No 4, 6 oder 8, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, und/oder h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit einer der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4–7, wobei das Donor-Akzeptor-Paar genetisch codiert ist und/oder als Fusionsprotein vorliegt und/oder zusammen als Transkriptionseinheit exprimiert wird.
Verfahren zur Detektion von Sauerstoff, pH-Wert, Halidionen, Temperatur und/oder Flavin unter Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor-Paares gemäß einem der Ansprüche 1–3.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Detektion mittels Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer nach Anregung mit Licht der Wellenlänge zwischen 370 nm und 450 nm stattfindet.