EP2606360A1 - Lov-domänen protein zur photosensiblen desfunktionalisierung - Google Patents

Lov-domänen protein zur photosensiblen desfunktionalisierung

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Publication number
EP2606360A1
EP2606360A1 EP11743247.6A EP11743247A EP2606360A1 EP 2606360 A1 EP2606360 A1 EP 2606360A1 EP 11743247 A EP11743247 A EP 11743247A EP 2606360 A1 EP2606360 A1 EP 2606360A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
cell
seq
photosensitive
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11743247.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karl Erich Jaeger
Thomas Drepper
Stephan Endres
Janko Potzkei
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evocatal GmbH
Original Assignee
Evocatal GmbH
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Filing date
Publication date
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Application filed by Evocatal GmbH filed Critical Evocatal GmbH
Publication of EP2606360A1 publication Critical patent/EP2606360A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to the use of a protein comprising a LOV domain for photosensitive Desfunktionalmaschine and a method for photosensitive Desfunktionalmaschine.
  • Photosensitizers are chromophores or chromophore-binding proteins that absorb light and then transfer the energy to the atoms or molecules to be reacted without radiation. This happens because the photosensitizer can not deliver its energy to the surrounding medium through light emission or emission. Particular importance has been attached to photosensitizers which generate oxygen radicals (ROS, reactive oxygen species) by irradiation with light.
  • ROS oxygen radicals
  • Protein-protein "cross-linking" occurs, which ultimately results in protein aggregation and / or the loss of enzymatic activity.
  • photosensitizers By using photosensitizers, prokaryotic and eukaryotic cells that express or ingest them can be killed by simple exposure to light. In particular, the increased intracellular production of oxygen radicals leads to defects in cellular components (protein crosslinking, protein aggregation and loss of activity), which in turn leads to cell death. In addition, the toxic effect of the photosensitizers can be improved by using the CALI
  • the photosensitizer becomes an antibody conjugated or expressed in vivo in a defined cell compartment or fused to a target protein.
  • the area of the cell to be examined is selectively irradiated by use of a laser with light which is absorbed by the photosensitizer, whereupon, for example, increased oxygen radicals (ROS) are generated. Since these radicals are rather short-lived, their toxicity radius is severely limited, which allows, for example, a targeted inactivation of the fused target protein.
  • ROS oxygen radicals
  • this technique represents a versatile molecular tool for targeted loss-of-function (Jacobson et al., 2008).
  • the current literature describes various fluorescent proteins which have a phototoxic effect on bacterial cells induced by light. These proteins are members of the class of eGFPs (Enhanced Green Fluorescent Protein) or to these homologous proteins, such as the KillerRed, a derivative of the chromoprotein an mMCP from Anthomedusae spec.
  • This fluorescence protein has a maximum of the fluorescence emission at 610 nm and the excitation maximum is at 585 nm. Studies have shown that the intensity of the phototoxicity of the KillerRed depends on the type (wavelength) of the light used.
  • killerRed In contrast to conventional photosensitizers, which must be taken up for use in living cells via an active transport mechanism or cell membrane permeabilization, genetically encoded fluorescent proteins such as the KillerRed have the advantage that they can be used non-invasively. Fluorescence proteins can also be localized by fusion with suitable signal sequences targeted in desired cell compartments or fused to any target proteins. So far, KillerRed and some derivatives of GFP are the only known genetically encoded photosensitizers that can be used both for the CALI method and exert a toxic effect on cells. Therefore, it would be of great advantage if other such photosensitizers were available.
  • the present invention thus relates to the use of a fluorescent protein comprising a LOV domain for the photosensitive defunctionalization of a molecule, wherein in the LOV domain at least one cysteine is replaced by another amino acid which covalently binds no FMN.
  • protein is to be understood as meaning macromolecules made up of amino acids, which also includes recombinant proteins and special proteins, for example antibodies and enzymes.
  • fluorescent protein comprising a LOV domain is to be understood in the following to mean a protein which has a light oxygen voltage (LOV) domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid which covalently binds no FMN ,
  • LOV light oxygen voltage
  • the at least one cysteine is replaced by alanine.
  • the LOV domain is one of SEQ ID NO. 1-4 (see Table 2).
  • photosensitive defunctionalization is to be understood below as meaning a process in which the fluorescent protein comprising a LOV domain absorbs light of a specific wavelength and then transfers this energy without radiation to a molecule to be reacted. in the sense of "effecting a targeted reaction", such as a Chromophore assisted light inactivation (CALI) and / or a phototoxic reaction.
  • CALI Chromophore assisted light inactivation
  • phototoxic reaction is to be understood in the following as meaning that the photosensitive de-functionalization damages a cell such that it ceases to grow and / or dies.
  • the term "molecule" is to be understood as meaning an element which is modified in its mode of action by the photosensitive defunctionalization, for example, the molecule is an antibody or an enzyme, in which the photosensitive defunctionalization can bring about such a structural change. If the molecule is a cellular component, eg a protease or part of a protease, the photosensitive defunctionalization can lead to defects, which in turn, for example, cause protein crosslinking or protein aggregation and an associated loss of activity. which can ultimately result in cell death.
  • a family of fluorescent proteins including LOV domains and recombinant variants of bacterial blue-light receptors of the LOV family, has recently been completely redeveloped. Unlike the GFP-like fluorescent proteins, the new fluorescent markers are very small (16-19 kDa). In order to increase the FMN-dependent fluorescence of the blue light receptors and thus to enable their use as fluorescence markers, the bacterial proteins were modified by means of modern methods, the so-called directed evolution. These mutations dramatically increased the autofluorescence of the proteins, resulting in the formation of FMN-binding fluorescent proteins (FbFPs). The photochemical characterization of the new marker proteins revealed that the FbFPs emit blue-green fluorescence (495 nm) upon excitation with blue light (450 nm).
  • the new marker proteins could be expressed in different pro- and eukaryotic host cells and the fluorescence characteristic of FbFP could be detected in vivo.
  • proteins comprising a LOV domain are the blue light receptor YtvA from B. subtilis and the sensory box protein SB2 from Pseudomonas putida.
  • the blue light receptor YtvA is a 261 amino acid protein that has been classified as a putative protein kinase during complete genome sequencing of B. subtilis. It plays a role as a positive regulator in the ⁇ -mediated stress response of B. subtilis.
  • YtvA could be identified by sequence homology comparisons with the primary structure of plant blue light receptors, the phototropins.
  • YtvA consists of an N-terminal LOV domain and a C-terminal STAS ("sulfate transporter antisigma") domain
  • the LOV domain displays a specific folding motif from a 5-stranded antiparallel ⁇ -sheet, that of ⁇ -helices laterally
  • the LOV domain contains the consensus sequence NCRFLQG known from plant phototropins (SEQ ID No.
  • SB2 Small Box 2 which contains only one LOV domain.
  • the SB2 protein has the consensus sequence characteristic of LOV domains (SEQ ID No. 7).
  • Protein-antibody-protein fusions selectively target cancer cells and kill them by light irradiation. Furthermore, process-relevant reactions in bacterial and eukaryotic host organisms (such as any biotechnological processes as well as bacteria-based cancer therapies) can be stopped by light irradiation in a short time.
  • fluorescent proteins comprising a LOV domain from the families described above for the first time allows the use of the fluorescent reporter for the targeted killing of cells by the simple irradiation with blue light.
  • the protein is used in a solution or a cell.
  • cell is to be understood below as meaning both prokaryotic and eukaryotic cells.
  • the cells need no longer necessarily be alive at the time of using a protein comprising a LOV domain for the photosensitive defunctionalization of a molecule.
  • solution is to be understood below to mean a liquid, which may be a homogeneous mixture or a suspension.
  • the use of the protein comprising a LOV domain for photosensitive de-functionalization in a solution can be done, for example, to study an interaction between proteins or the action of a protein on other proteins.
  • the protein can be used in a cell, again, for example, an interaction between proteins or the action of one protein on others could be investigated.
  • the fluorescent protein according to the invention could act directly on a target protein, so that after the photosensitive de-functionalization of this action no longer takes place.
  • the fluorescent protein according to the invention acts indirectly on the target protein, for example by binding the binding partner of the target protein. In this way, one could achieve that the binding partner of the target protein can no longer interact with the target protein after a photosensitive de-functionalization by the fluorescent protein according to the invention, since it has been changed in its structure.
  • the use of the protein comprising a LOV domain for photosensitive de-functionalization in a cell can serve to elucidate the function of certain proteins in particular cell compartments, to localize certain proteins, and / or to track cell processes.
  • a targeted inhibition of protein and cell function can be achieved by photosensitive de-functionalization.
  • the photosensitive functionalization is chromophore assisted light inactivation (CALI) and / or a phototoxic reaction.
  • CALI chromophore assisted light inactivation
  • phototoxic reaction is to be understood in the following as meaning that the photosensitive de-functionalization damages a cell such that it ceases to grow and / or dies.
  • the protein comprising a LOV domain for photosensitive de-functionalization, it is possible to selectively disrupt the growth of target cells at an arbitrary time without affecting other cells that may be present in the vicinity. For example, one could deliberately kill feeder cells when they are no longer needed.
  • the use of the CALI technique via a spatially and temporally limited light irradiation allows a spatial and temporal limitation of the photosensitive defunctionalization of a molecule, whereby a targeted inactivation of individual proteins and / or cell structures is made possible. It has already been shown that CALI can be used to influence intracellular processes in living cells. Thus, e.g. Targeted signal transduction pathways or protein interactions in living cells are manipulated.
  • YFP fluoresces rapidly after photosensitive de-functionalization
  • a protein according to the invention having a LOV domain which is photoactive at wavelengths of 380-490 nm, in which case the photosensitive defunctionalization takes place at these wavelengths.
  • exactly the cysteine at position 53 of SEQ ID no. 6 is replaced by another amino acid which does not covalently bind FMN. This leads to a phototoxic effect under the action of light. For other proteins having the same sequence, but where cysteine is present at position 53, no phototoxic effect could be detected.
  • said LOV domain is characterized in that
  • a) is encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO. 5 or a fragment, a variant, a homologue or derivative of this sequence,
  • b) is encoded by a nucleic acid which can hybridize to the nucleic acids from a) under stringent conditions
  • c) is encoded by a nucleic acid which has at least 70% preferably 95% identity with one of the nucleic acids from a) or b),
  • d) is encoded by a nucleic acid which can hybridize to the complementary nucleic acid of one of the nucleic acids from a) - c) under stringent conditions
  • e) is encoded by a nucleic acid which, compared to the nucleic acids from a) - d) at least one silent mutation of a single nucleotide (as allowed by the degeneracy of the genetic code)
  • f) is encoded by a nucleic acid whose code has been optimized in comparison to the nucleic acids from a) -e) for a particular expression system
  • h comprises an amino acid sequence having a sequence identity of at least 70%, preferably 95% with the amino acid sequences of g).
  • nucleic acid shall be understood below to mean a single-stranded or double-stranded macromolecule composed of nucleotides
  • the most common nucleic acids are deoxyribonucleic acid (DNA) or complementary DNA (cDNA) and ribonucleic acid (RNA)
  • Nucleic bases are adenine, cytosine, guanine and thymine, the latter being specific for DNA, with the same nucleobases or nucleotides except for thymine, which is replaced by uracil.
  • Artificial nucleic acids include Peptide Nucleic Acid (PNA), Morpholino and Locked Nucleic Acid (LNA), as well as Glycol Nucleic Acid (GNA) and Threose Nucleic Acid (TNA). Each of these nucleic acids differs in the construction of the backbone of naturally occurring nucleic acids.
  • RNA duplexes is complementary to the other, since the base pairs of the two strands are non-covalently linked by two or three hydrogen bonds, in principle - there are exceptions for thymine / uracil and the wobble complex of the tRNA - there is only one complementary base for each base Therefore, it is possible to reconstruct the complementary strand of a single strand, which is essential for DNA replication, for example, the complementary strand of the DNA sequence 5 'AGTCATG 3'
  • cDNA is synthesized by means of the enzyme reverse transcriptase from RNA e.g. mRNA synthesized.
  • hybridizing or hybridization is understood below to mean the process in which a nucleic acid is attached to a more or less completely complementary nucleic acid by forming hydrogen bonds between the respective complementary nucleic bases.
  • hybridize under stringent conditions is understood below to mean that the conditions of the hybridization reaction are set so that only bases which are completely complementary to one another can form hydrogen bonds, for example, the stringency can be influenced by the temperature.
  • fragment is intended to designate a part of a nucleic acid or an amino acid sequence which lacks some parts of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence but at least a part of its activity, for example with respect to fluorescence properties, enzyme activity or binding to other molecules reserves.
  • nucleic acid or an amino acid sequence which, in terms of its structure and biological activity, substantially equals the structure and biological activity of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence.
  • the term "derivative” is understood in the following to mean a related nucleic acid or amino acid sequence which has similar characteristics with respect to a target molecule as a claimed nucleic acid or amino acid sequence
  • the term "homolog” is understood below to mean a nucleic acid or an amino acid sequence whose sequence has added, deleted, substituted or otherwise modified a claimed nucleic acid or amino acid sequence as compared to the sequence, at least one nucleotide or amino acid. However, it is a prerequisite that the homolog has essentially the same properties as a claimed nucleic acid or amino acid sequence.
  • codon usage also the codon usage or the codon bias, describes the phenomenon that variants of the universal genetic code of different species are used with varying frequency.
  • sequence identity of at least X% will be referred to below as one
  • Sequence identity understood by a sequence alignment (alignment) using a BLAST algorithm, as it is available on the homepage of NCBIs, was determined
  • cysteine is replaced by alanine as shown in SEQ ID no. 5 or SEQ ID No 6 has happened.
  • the phototoxicity of the fluorescent protein with SEQ ID no. 6, called FbFP with SEQ ID no. 6, is most likely due to the increased formation of oxygen radicals, as it could be shown for the fluorescent protein KillerRed.
  • the LOV consensus sequence after this replacement is no longer NCRFLQ (SEQ ID No. 7) but NXRFLQ.
  • the term "consensus sequence” shall be understood to mean an amino acid sequence which corresponds in the LOV domains of YtvA from B. subtilis and SB2 from P. putida, in contrast to the previously described photosensitizer KillerRed, whose chromophore is excited exclusively in green light
  • the FbFP specifically absorbs blue light with SEQ ID No. 6 and thus supplements the range of genetically coded photosensitizers.
  • the subject of the present invention is also a process for the photosensitive desfunctionalization of a target molecule comprising at least the steps:
  • target molecule is to be understood to mean an element that is modified in its mode of action by the photosensitive defunctionalization.
  • the terms molecule and target molecule thus correspond in content, but the term “target molecule” was chosen to make the claim even clearer to be able to.
  • Coupled is to be understood below as meaning that the protein for the photosensitive deacturization is brought into spatial proximity to the target molecule, so that a protein-target complex can be formed. This can be done in various ways, for example by covalent and non-complex Covalent bonds, such as biotin - streptavidin binding Depending on whether a target molecule is to be sensitized photosensitive in a cell or in solution, the vector is introduced into the cell and expressed there the protein for the photosensitive desfunctionalization or the protein for the photosensitive desfunctionalization is coupled to a target molecule if the photosensitive defunctionalization is to take place in solution.
  • a photosensitive de-functionalization can also be carried out with blue light of the wavelengths from 380 to 490 nm.
  • the method comprises the steps of:
  • recovery of the protein means all the process steps that are necessary after expression of the protein in order to be able to use the protein afterwards outside the cell, thus the extraction comprises, for example, cell disruption Secretion of the protein by the cell itself, a possible purification and a possible concentration.
  • steps are preferably carried out when the protein is to be used for photosensitive defunctionalization for coupling to a protein outside a cell.
  • the method additionally comprises the step of introducing the protein target complex into a cell prior to irradiation.
  • This process step is preferably carried out when the protein for photosensitive de-functionalization is not expressed in the cell in which it is subsequently to be used for photosensitive de-functionalization.
  • the protein for the photosensitive defunctionalization is coupled to a target molecule and the two proteins are introduced together into a cell, e.g. by means of protein transduction using a protein transduction domain.
  • the protein and the target molecule are expressible together as a transcription unit.
  • This embodiment is preferred, for example, if the function of the target molecule in the cell is to be investigated, since co-localization of the target molecule with the protein for photosensitive deacturization can ensure colocalization-for example by a fusion of the two elements.
  • the cell expressing the protein is preferably a bacterium selected from the group consisting of Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida and / or Bacillus subtilis.
  • the protein for photosensitive defunctionalization which is photoactive at wavelengths of 380-490 nm, could be detected by a vector encoding the protein encoded, introduced into a bacterial cell such as E. coli and expressed.
  • the E. coli cells are then either digested to obtain the protein for photosensitive de-functionalization, or the vector also contains a sequence that allows the release of the protein for photosensitive de-functionalization into the surrounding medium.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the oxygen radical production by the excited photosensitizer.
  • Fig. 2 shows the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID no. 6 on E. coli cells.
  • FIG. 3 shows that the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID no. 6 can be caused only by blue light.
  • FIG. 4 shows that the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID no. 6 can be caused only by blue light.
  • Fig. 5 shows the temporal resolution of the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID NO. 6 shows the schematic representation of the generated fusion protein from FbFP with SEQ ID no. 6 and YFP.
  • FIGS. 7 and 8 show a cloning strategy for generating the fusion protein from FIG. 6.
  • FIG. 9 and FIG. 10 show a cloning strategy for generating the fusion protein of FIG. 6.
  • FIG. Fig. 11 shows the CALI inactivation of YFP.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the oxygen radical production by the excited photosensitizer.
  • the absorption of one photon (hv a ) leads to the excitation of the chromophore in the lowest excited singlet state (S. From this state, the energy can either radiation-free to the surrounding medium (curved arrow), by light emission (hv f ), or by
  • the excited chromophore can fall back to the triplet state (TO, from which the energy is released by phosphorescence (hv p ) or transferred to elemental oxygen by electron transfer this process generates singlet oxygen O2) (Figure modified from Jacobson et al., 2008).
  • a culture was left in the dark (squares).
  • the displayed values represent the mean value of three different independent measurements, the error indicators the standard deviation of these measurements.
  • Fig. 5 shows the temporal resolution of the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID NO. 6. Shown is the temporal change of the colony-forming units of FbFP with SEQ ID NO. 6 - expressing culture (lines with diamonds and triangles), or the empty vector control (lines with squares and crosses) depending on the irradiation time.
  • FIG. 6 shows the schematic representation of the generated FbFP with SEQ ID no. 6-YFP fusion protein.
  • FbFP with SEQ ID no. 6 was fused to the yellow fluorescent protein YFP (SEQ ID No. 9).
  • the proteins were linked by means of a linker (SEQ ID Nos. 10 and 11) which contains a multiple cloning site (MCS) with the restriction endonuclease sites KpnI, Ndel, BamHI, SacI, SalI, HindHI, Xhol and CfrAll.
  • MCS multiple cloning site
  • the expression vector pRhotHi-2 was chosen, and the fusion protein was also provided with a His 6 tag, whereby the recombinant protein can be easily purified by affinity chromatographic methods.
  • FIG. 7 and FIG. 8 show a cloning strategy for generating the fusion protein of FIG. 6.
  • FIG. 5 The photosensitizer gene for FbFP with SEQ ID no. 6- (SEQ ID No. 5), the target gene YFP (SEQ ID No. 8) and the linker (SEQ ID No. 10 and 11) were cloned in the cloning vector pBlueScript KSII (-), which is expressed in E. coli DH5a Cells allow a blue-white selection.
  • Figures 9 and 10 show a cloning strategy for generating the fusion protein.
  • the illustrated scheme shows the final fusion of the C-terminal fusion of FbFP with SEQ ID NO. 6 with YFP (SEQ ID No. 9) by restriction digestion with the restriction endonucleases SaWXhoI and subsequent ligation in Bluescript KSII (-).
  • Fig. 11 shows the CALI inactivation of YFP.
  • YFP protein SEQ ID No. 9
  • SEQ ID No. 9 Shown is how the irradiation with blue light in the fusion protein of Fig. 6 (dark gray) leads to a rapid decrease in YFP fluorescence.
  • the YFP protein (SEQ ID No. 9) is determined by the CALI method depending on the FbFP with SEQ ID no. 6 inactivated. In contrast, the blue light irradiation has no effect on the activity of the unfused YFP protein (light gray).
  • LOV fluorescence protein FbFP with SEQ ID no. 6 can be used as a blue-induced photosensitizer.
  • the phototoxic effect of FbFP with SEQ ID no. 6 was detected using the Gram-negative bacterium E. coli DH5a.
  • the expression system used was the pRhokHi-2 vector, which was replaced by the a /? I promoter allows constitutive expression of all LOV proteins.
  • Fluorescent protein FbFP with SEQ ID no. 6, and its corresponding wild-type protein SB2 expressed using the pRhokHi-2 expression vector were first cloned. Therefore the genes were amplified by means of PCR using specific primers (SEQ ID Nos. 12 & 13) and at the same time at the 5 'end with the Ndel and at the 3' ends with the recognition sequences specific for the X / zoI restriction endonuclease fitted.
  • PCR products were cloned by Ndel / X / ioI double restriction digestion into the expression vector also hydrolyzed by said endonucleases.
  • the cloning success was checked by a suitable test restriction and verified by sequencing the cloned DNA fragment.
  • the Weindzelliere was determined depending on the exposure time.
  • a 5 ml LB pre-culture was inoculated with an appropriate colony from a LB solid medium plate and incubated under selection pressure at 37 ° C overnight on a rotary shaker. From this preculture, a 50 ml LB test culture (50 ⁇ g / ml
  • Kanamycin was inoculated to an oDsso of 0.05 and agitated at 37 ° C in the dark incubated.
  • a negative control served again a test culture of E. coli cells, which had been transformed with the pRhokHi-2 empty vector.
  • CFU colony forming units
  • FbFP with SEQ ID no. 6. can also be used for the CALI-mediated inactivation of fusion proteins
  • FbFP with SEQ ID no. 6. fused to the yellow fluorescent protein YFP (SEQ ID No. 9). Subsequently, it was investigated whether it is possible to control the activity of the YFP by the FbFP with SEQ ID no. 6 inactivated CALI reaction inactivate.
  • translational fusions were generated in which the photosensitizer FbFP with SEQ ID no. 6 is C-terminally fused to the target protein YFP.
  • the proteins were linked by means of a linker (SEQ ID No. 10 & 11) which contains a multiple cloning site (MCS) with the restriction endonuclease sites KpnI, Ndel, BamHI, SacI, SalI, HindHI, Xhol and CfrAll
  • MCS multiple cloning site
  • the expression vector pRhotHi-2 was also selected for expression of the fusion protein, and the fusion protein was also provided with a His 6 tag, which makes it easy to purify the recombinant protein by affinity chromatographic methods.
  • the fusion protein was then overexpressed in E. coli, purified via His 6 -tag by Ni-NTA affinity chromatography and taken up in protein buffer (10 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM NaCl, pH 8).
  • protein buffer 10 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM NaCl, pH 8.
  • YFP reporter protein specifically by FbFP with SEQ ID NO. 6.
  • the blue light irradiation in the YFP-FbFP with SEQ ID NO. 6. -Fusion to a rapid decrease in YFP fluorescence.
  • the YFP protein is determined by the CALI method depending on FbFP with SEQ ID no. 6 inactivated.
  • the blue light irradiation has no effect on the activity of the unfused YFP protein.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls sowie eine Methode zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Zielmoleküls.

Description

LOV-Domänen Protein zur photosensiblen Desfunktionalisierung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Proteins umfassend eine LOV- Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung sowie ein Verfahren zur photosensiblen Desfunktionalisierung.
Photosensibilisatoren (engl.: photosensitizer) sind Chromophore oder Chromophor-bindende Proteine, die Licht absorbieren und anschließend die Energie strahlungslos auf die zur Reaktion zu bringenden Atome oder Moleküle übertragen. Dies geschieht, da der Photosensibilisator seine Energie nicht durch Lichtemission oder emissionsfrei an das umgebende Medium abgeben kann. Besondere Bedeutung haben solche Photosensibilisatoren erlangt, die durch Bestrahlung mit Licht Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) generieren. Diese übertragen die„überschüssige" Energie des durch die Lichtbestrahlung angeregten Chromophors entweder in Form von Elektronen auf elementaren Sauerstoff, wodurch Superoxid- Anionen (02 ~) entstehen, oder das Chromophor geht in den Triplettzu stand über. Aus diesem relativ stabilen Zustand wird Energie in Form von Elektronen auf elementaren Sauerstoff übertragen, wodurch Radikale in Form von Singluett- Sauerstoff (χ02) gebildet werden (Jacobson et al., 2008). Die ROS können Seitenketten von verschiedenen Aminosäuren oxidieren, wodurch es sowohl zu intramolekularem als auch zu
Protein-Protein„cross-linking" kommt, was letztendlich eine Proteinaggregation und/oder den Verlust von enzymatischer Aktivität zur Folge hat.
Durch den Einsatz von Photosensibilisatoren können pro- und eukaryotische Zellen, die diese exprimieren bzw. diese aufgenommen haben, durch die einfache Bestrahlung mit Licht abgetötet werden. Dabei führt vornehmlich die vermehrte intrazelluläre Produktion von Sauerstoffradikalen zu Defekten an zellulären Bestandteilen (Protein-Crosslinking, Protein- Aggregation und Aktivitäts verlust), was wiederum den Zelltod zur Folge hat. Außerdem kann die toxische Wirkung der Photosensibilisatoren durch Einsatz der CALI-
Technik {chromophore-assisted light inactivation) räumlich und zeitlich begrenzt werden, wodurch eine gezielt Inaktivierung von einzelnen Proteinen und/oder Zellstrukturen ermöglicht wird. Bei dieser Technik wird der Photosensibilisator an einen Antikörper konjugiert oder in vivo in einem definierten Zellkompartiment exprimiert bzw. an ein Zielprotein fusioniert. Der zu untersuchende Bereich der Zelle wird durch Einsatz eines Lasers gezielt mit Licht bestrahlt, welches vom Photosensibilisator absorbiert wird, woraufhin beispielsweise verstärkt Sauerstoffradikale (ROS) generiert werden. Da diese Radikale eher kurzlebig sind, ist deren Toxizitätsradius stark begrenzt, wodurch z.B. eine gezielte Inaktivierung des fusionierten Zielproteins möglich ist. Somit stellt diese Technik ein vielseitig einsetzbares molekulares Werkzeug für gezielten Funktions Verlustanalysen (loss-of- function) dar (Jacobson et ah, 2008). In der aktuellen Literatur werden verschiedene Fluoreszenzproteine beschrieben, die eine durch Licht induzierte phototoxische Wirkung auf Bakterienzellen besitzen. Diese Proteine sind Vertreter der Klasse der eGFP's (enhanced green fluorescent protein) oder zu diesen homologe Proteine, wie z.B. das KillerRed, ein Derivat des Chromoproteins anm2CP aus Anthomedusae spec. Dieses Fluoreszenzprotein besitzt ein Maximum der Fluoreszenzemission bei 610 nm und das Anregungsmaximum liegt bei 585 nm. In Studien konnte nachgewiesen werden, dass die Stärke der Phototoxizität des KillerRed von der Art (Wellenlänge) des eingesetzten Lichtes abhängig ist. Dabei stellte sich heraus, dass der stärkste Abtötungseffekt durch grünes Licht (540-580 nm) erreicht werden konnte. Des Weiteren konnte ebenfalls ein toxischer Effekt des Photosensibilisators auf eukaryotische Zelllinien anhand von humanen Nierenzellen nachgewiesen werden (40-60% Abtötungsrate nach 10-minütiger Bestrahlung mit grünem Licht).
Im Gegensatz zu herkömmlichen Photosensibilisatoren, die für den Einsatz in lebenden Zellen über einen aktiven Transportmechanismus oder eine Permeabilisierung der Zellmembran aufgenommen werden müssen, haben genetisch codierten Fluoreszenzproteinen wie das KillerRed den Vorteil, dass sie nicht-invasiv verwendet werden können. Fluoreszenzproteine können zudem durch die Fusion mit geeigneten Signalsequenzen gezielt in gewünschten Zellkompartimenten lokalisiert werden oder an beliebige Zielproteine fusioniert werden. Bisher sind KillerRed sowie einige Derivate des GFPs die einzigen bekannten genetisch codierten Photosensibilisatoren, die sowohl für die CALI-Methode verwendet werden können als auch eine toxisch Wirkung auf Zellen ausüben können. Daher wäre es von großem Vorteil, wenn weitere derartige Photosensibilisatoren zur Verfügung stünden.
Es ist daher die A u f g a b e der vorliegenden Erfindung, andere genetisch codierte Photosensibilisatoren bereitzustellen, die für die photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls verwendet werden können.
Außerdem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Zielmoleküls bereitzustellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung eines Fluoreszenzproteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls, wobei in der LOV Domäne mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, die kein FMN kovalent bindet, ersetzt ist.
Unter dem Begriff „Protein" sollen im Folgenden aus Aminosäuren aufgebaute Makromoleküle verstanden werden. Unter diese Definition fallen auch rekombinante Proteine und spezielle Proteine beispielsweise Antikörper und Enzyme.
Unter dem Begriff„Fluoreszenzprotein umfassend eine LOV-Domäne" soll im Folgenden ein Protein verstanden werden, das eine Light-Oxygen-Voltage (LOV) Domäne aufweist, bei der mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, die kein FMN kovalent bindet, ersetzt ist.
Vorzugsweise ist das mindestens eine Cystein durch Alanin ersetzt.
Weiterhin wird bevorzugt, dass die LOV Domäne eine der SEQ ID NO. 1-4 (siehe Tabelle 2) aufweist.
Unter dem Begriff „photosensiblen Desfunktionalisierung" soll im Folgenden ein Vorgang verstanden werden, bei dem das Fluoreszenzprotein umfassend eine LOV-Domäne Licht bestimmter Wellenlänge absorbiert und diese Energie anschließend strahlungslos auf ein zur Reaktion zu bringenden Molekül überträgt. Dabei wird der Begriff „Desfunktionalisierung" im Sinne von „Bewirken einer gezielten Reaktion" verstanden, wie beispielsweise eine Chromophore assisted light inactivation (CALI) und/oder eine phototoxische Reaktion.
Unter dem Begriff„phototoxische Reaktion" soll im Folgenden verstanden werden, dass die photosensiblen Desfunktionalisierung eine Zelle derart schädigt, dass sie ihr Wachstum einstellt und/oder abstirbt.
Unter dem Begriff„Molekül" soll im Folgenden ein Element verstanden werden, dass durch die photosensible Desfunktionalisierung in seiner Wirkungsweise verändert wird. Beispielsweise handelt es sich bei dem Molekül um einen Antikörper oder ein Enzym. Bei diesem kann die photosensible Desfunktionalisierung eine derartige Strukturveränderung bewirken, dass er/es inaktiv wird. Falls das Molekül ein zellulärer Bestandteil ist z.B. eine Protease bzw. Teil einer Protease, kann die photosensible Desfunktionalisierung zu Defekten führen, die wiederum z.B. Protein-Crosslinking oder Protein- Aggregation und einen damit einhergehend Aktivitäts verlu st bewirken, der im Endeffekt den Zelltod zur Folge haben kann.
Eine Fluoreszenzproteinfamilie umfassend LOV-Domänen bzw. rekombinante Varianten bakterieller Blaulicht-Rezeptoren der LOV Familie wurde kürzlich völlig neu entwickelt. Anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine sind die neuen Fluoreszenzmarker sehr klein (16-19 kDa). Um die FMN-abhängige Fluoreszenz der Blaulichtrezeptoren zu erhöhen und somit deren Verwendung als Fluoreszenzmarker zu ermöglichen, wurden die bakteriellen Proteine mittels moderner Verfahren, der sogenannten directed evolution, verändert. Durch diese Mutationen wurde die Autofluoreszenz der Proteine drastisch erhöht wodurch die FMN- bindenden Fluoreszenzproteine (FbFPs) entstanden. Die photochemische Charakterisierung der neuen Markerproteine ergab, dass die FbFPs nach Anregung mit blauem Licht (450 nm) eine blaugrüne Fluoreszenz (495 nm) emittieren. Die neuen Markerproteine konnten in verschiedenen pro- und eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und die für FbFP charakteristische Fluoreszenz in vivo nachgewiesen werden. Beispiele für Proteine umfassend eine LOV-Domäne sind der Blaulichtrezeptor YtvA aus B. subtilis und das Sensory-Box-Protein SB2 aus Pseudomonas putida. Der Blaulichtrezeptor YtvA ist ein 261 Aminosäuren großes Protein, das im Zuge der kompletten Genomsequenzierung von B. subtilis als putative Proteinkinase klassifiziert wurde. Es spielt eine Rolle als positiver Regulator in der σ -vermittelten Stressantwort von B. subtilis. YtvA konnte über Sequenzhomologievergleiche mit der Primärstruktur pflanzlicher Blaulichtrezeptoren, den Phototropinen, identifiziert werden. YtvA besteht aus einer N- terminalen LOV-Domäne und einer C-terminalen STAS („sulfate transporter antisigma")- Domäne. Die LOV-Domäne zeigt ein spezielles Faltungsmotiv aus einem 5-strängigen antiparallelen ß-Faltblatt, das von α-Helices seitlich flankiert wird. Die LOV-Domäne enthält die aus den pflanzlichen Phototropinen bekannte Konsensussequenz NCRFLQG (SEQ ID No. 7) , wobei das darin enthaltene photoaktive Cystein den Cofaktor FMN als Chromophor während des LOV- spezifischen Photozyklus kovalent bindet. Dabei wird YtvA durch Anregung mit Licht der Wellenlänge von 450 nm aus dem Grundzustand in ein Photoprodukt überführt, welches bei 383 nm absorbiert und ein Emissionsmaximum von 498 nm aufweist. Innerhalb kurzer Zeit (ca. 1,6 μ8) zerfällt dieses Photoprodukt zu einem Photoaddukt, in dem das FMN kovalent gebunden ist. In dieser Form verliert die LOV-Domäne die Eigenschaft der Fluoreszenz, bis der Grundzustand von neuem erreicht ist.
Durch Sequenzhomologievergleiche der LOV-Domäne von YtvA aus B. subtilis mit der Genomsequenz des Gram-negativen Stäbchenbakteriums P. putida KT2440 wurde dort ein Gen identifiziert, das für ein putatives LOV-Protein codiert. Dabei handelt es sich um das 151
Aminosäuren große SB2 (Sensory-Box 2) welches nur eine LOV-Domäne beinhaltet. Das SB2-Protein weist die für LOV-Domänen charakteristische Konsensussequenz (SEQ ID No. 7) auf. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Fluoreszenzproteins ist es überraschend möglich eine gezielte Reaktion eines Moleküls durch photosensiblen Desfunktionalisierung zu bewirken.
Die Verwendung derartiger Fluoreszenzproteine ist beispielsweise auf dem Gebiet der Biotechnologie und Biomedizin denkbar. So können z.B. in der photodynamischen
Krebstherapie LOV-Domänen Protein-Antikörper-Proteinfusionen gezielt Krebszellen markieren und durch Lichtbestrahlung erfolgreich abtöten. Des Weiteren können Prozessrelevante Reaktionen in bakteriellen und eukaryotischen Wirtsorganismen (wie z.B. beliebige biotechnologische Prozesse aber auch Bakterien-basierte Krebstherapien) durch Lichtbestrahlung in kurzer Zeit gestoppt werden.
Somit wird hier unvorhergesehener Weise erstmals gezeigt, dass ein Protein, welches nicht mit GFP verwandt ist zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls verwendet werden kann.
Zudem ermöglicht die Verwendung von Fluoreszenzproteinen umfassend eine LOV-Domäne aus den oben beschriebenen Familien erstmalig den Einsatz des Fluoreszenzreporters zum gezielten Abtöten von Zellen durch die einfache Bestrahlung mit blauem Licht. Im Gegensatz zum bereits bekannten KillerRed, das durch Bestrahlung mit grünem Licht (λ = 540 -580 nm) vermehrt Sauerstoffradikale bildet wird mithin ein völlig neuer Weg zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls bereitgestellt. Folglich besteht ein weiterer Vorteil diese Fluoreszenzproteine umfassend eine LOV-Domäne darin, dass sie in Kombination mit KillerRed verwendet werden können, um so durch die Bestrahlung mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge unterschiedliche Desfunktionalisierungen hervorzurufen. Selbstverständlich ist es denkbar, dass das erfindungsgemäße Protein mehr als eine LOV- Domäne umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Protein in einer Lösung oder einer Zelle verwendet.
Unter dem Begriff „Zelle" sollen im Folgenden sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen verstanden werden. Die Zellen müssen zum Zeitpunkt der Verwendung eines Proteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls nicht mehr zwingend am Leben sein.
Unter dem Begriff „Lösung" soll im Folgenden eine Flüssigkeit verstanden werden. Dabei kann es sich um ein homogenes Gemisch oder eine Suspension handeln. So kann die Verwendung des Proteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung in einer Lösung erfolgen, beispielsweise um eine Interaktion zwischen Proteinen oder das Einwirken eines Proteins auf andere Proteine zu untersuchen. Alternativ kann das Protein in einer Zelle verwendet werden, auch hier könnte beispielsweise eine Interaktion zwischen Proteinen oder das Einwirken eines Proteins auf andere untersucht werden.
In beiden Fällen könnte zum Beispiel das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein direkt auf ein Zielprotein einwirken, so dass nach der photosensiblen Desfunktionalisierung dieses Einwirken nicht mehr stattfindet. Denkbar ist jedoch gleichermaßen, dass das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein indirekt auf das Zielprotein einwirkt, indem es beispielsweise den Bindungspartner des Zielproteins bindet. Auf diese Weise könnte man erreichen, dass der Bindungspartner des Zielproteins nach einer photosensiblen Desfunktionalisierung durch das erfindungsgemäße Fluoreszenzprotein nicht mehr mit dem Zielprotein interagieren kann, da er in seiner Struktur verändert wurde.
Es ist gleichermaßen auch denkbar, dass nicht eine Interaktion bzw. ein Einwirken zwischen zwei Proteinen untersucht wird, sondern die Interaktion bzw. ein Einwirken einer Nukleinsäure mit mindestens einem Protein oder die Interaktion bzw. ein Einwirken zwischen Nukleinsäuren.
Ferner kann die Verwendung des Proteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung in einer Zelle dazu dienen, die Funktion bestimmter Proteine in bestimmten Zellkompartimenten aufzuklären, bestimmte Proteine zu lokalisieren und/oder Zellprozesse nachzu vollziehen.
Durch Fusion des Proteins umfassend eine LOV-Domäne an ein anders Protein kann z.B. eine gezielte Inhibierung einer Protein- und Zellfunktion (z.B. eines bestimmten Stoffwechselweges) durch photosensiblen Desfunktionalisierung erfolgen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der photosensiblen Desfunktionalisierung um Chromophore assisted light inactivation (CALI) und/oder eine phototoxische Reaktion. Unter dem Begriff„phototoxische Reaktion" soll im Folgenden verstanden werden, dass die photosensiblen Desfunktionalisierung eine Zelle derart schädigt, dass sie ihr Wachstum einstellt und/oder abstirbt.
Somit ist es durch die Verwendung des Proteins umfassend eine LOV Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung möglich, das Wachstum von Zielzellen an einem frei wählbaren Zeitpunkt gezielt zu unterbrechen, ohne andere Zellen, die sich eventuell in der Nähe befinden, zu beeinflussen. Beispielsweise könnte man gezielt Feederzellen abtöten, wenn diese nicht mehr gebraucht werden. Überdies erlaubt der Einsatz der CALI-Technik über eine räumlich sowie zeitlich limitierte Lichtbestrahlung eine räumliche und zeitliche Begrenzung der photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls, wodurch eine gezielt Inaktivierung von einzelnen Proteinen und/oder Zellstrukturen ermöglicht wird. Es wurde bereits gezeigt, dass mittels CALI intrazelluläre Prozesse in lebenden Zellen beeinflussbar sind. So können z.B. gezielt Signaltransduktionswegen bzw. Proteininteraktionen in lebenden Zellen manipuliert werden.
Ein Beispiel für ein Molekül, das mittels CALI unter Verwendung des erfindungsgemäßes Protein mit einer LOV-Domäne desfunktionalisiert wurde, ist YFP, dessen Fluoreszenz nach der photosensiblen Desfunktionalisierung schnell abnimmt (siehe Fig. 11).
Bevorzugt wird ein erfindungsgemäßes Protein mit einer LOV-Domäne, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, bei dem also die photosensiblen Desfunktionalisierung bei diesen Wellenlängen erfolgt. In einer weiteren Ausführungsform ist in der LOV Domäne genau das Cystein an Position 53 von SEQ ID No. 6 durch eine andere Aminosäure, die kein FMN kovalent bindet, ersetzt. Dies führt zu einer phototoxische Wirkung unter Lichteinwirkung. Für andere Proteine, die dieselbe Sequenz aufweisen, bei welchen jedoch Cystein an Position 53 vorhanden ist, konnte keine phototoxische Wirkung nachgewiesen werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist besagte LOV-Domäne dadurch gekennzeichnet, dass sie
a) kodiert wird durch die Nukleinsäure der SEQ ID NO. 5 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)- d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde,
g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß der SEQ ID NO 6, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder ein Derivat dieser Sequenz,
h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.
Unter dem Begriff „Nukleinsäure" soll im Folgenden ein einzel- oder doppelsträngiges Makromolekül verstanden werden, dass aus Nukleotiden aufgebaut ist. Die geläufigsten Nukleinsäuren sind Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. complementary DNA (cDNA) und Ribonukleinsäure (RNA). In der DNA kommen die Nukleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin vor, wobei letztere spezifisch für DNA ist. In der RNA kommen bis auf Thymin, das durch Uracil ersetzt ist, dieselben Nukleinbasen bzw. Nukleotide vor.
Künstliche Nukleinsäuren sind beispielsweise Peptide Nucleic Acid (PNA), Morpholino und Locked Nucleic Acid (LNA), sowie Glycol Nucleic Acid (GNA) und Threose Nucleic Acid (TNA). Jede dieser Nukleinsäuren unterscheidet sich im Aufbau des Rückgrats von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren.
Unter dem Begriff „komplementär" soll die zu der benutzten/diskutierten Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure verstanden werden. Dies ist ein bedeutendes Konzept der Molekularbiologie, da es sich um eine wichtige Eigenschaft doppelsträngiger Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder DNA:RNA Duplexe handelt. Der eine Strang ist zu dem anderen komplementär, da die Basenpaare der beiden Stränge nicht-covalent über zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Im Prinzip - es gibt Ausnahmen für Thymin/Uracil und den Wobble-Komplex der tRNA - gibt es nur eine komplementäre Base für jede Base einer Nukleinsäure. Daher ist es möglich den komplementären Strang eines einzeln vorliegenden Strangs zu rekonstruieren. Dies ist z.B. für die DNA Replikation essentiell. Beispielsweise wäre der komplementäre Strang der DNA Sequenz 5' A G T C A T G 3'
3' T C A G T A C 5'
Im Fall der DNA kann sich der Begriff "komplementär" auch auf cDNA beziehen. cDNA wird mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA z.B. mRNA synthetisiert.
Unter dem Begriff „hybridisieren" bzw. Hybridisierung wird im Folgenden der Vorgang verstanden, bei dem sich an eine Nukleinsäure an eine mehr oder weniger vollständig komplementärer Nukleinsäure anlagert, indem Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den jeweils komplementären Nukleinbasen ausgebildet werden.
Unter dem Begriff „unter stringenten Bedingungen hybridisieren" wird im Folgenden verstanden, dass die Bedingungen der Hybridisierungsreaktion so eingestellt sind, dass nur vollständig zueinander komplementäre Basen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Die Stringenz kann beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst werden.
Unter dem Begriff „stille Mutation" soll im Folgenden das Phänomen verstanden werden, dass eine Mutation in einem Nukleinsäure-Abschnitt keine Konsequenzen nach sich zieht. Dies ist der Fall da der Informationsgehalt des Gens sich nicht verändert hat, weil eine Reihe von Aminosäuren durch verschiedene Dreiergruppen aufeinanderfolgender Nukleinbasen - Tripletts oder Codons genannt - kodiert werden. Der Begriff „Fragment" soll im Folgenden ein Teil einer Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz bezeichnen, dem einige Teile einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz fehlen, der aber zumindest einen Teil seiner Aktivität z.B. in Bezug auf Fluoreszenzeigenschaften, Enzymaktivität, oder Bindung zu anderen Molekülen behält.
Der Begriff "Variante" soll im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz bezeichnen, die in ihrer Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen der Struktur und biologischen Aktivität einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz gleicht.
Unter dem Begriff „Derivat" wird im Folgenden eine verwandte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verstanden, die in Bezug auf ein Zielmolekül gleichartige Charakteristika hat wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz. Unter dem Begriff „Homolog" wird im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz verstanden, in deren Sequenz im Vergleich zu der Sequenz eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz mindestens ein Nukleotid bzw. eine Aminosäure hinzugefügt, gelöscht, substituiert oder auf andere Weise modifiziert wurde. Vorraussetzung ist allerdings, dass das Homolog im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweist wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert" soll im Folgenden verstanden werden, dass eine cDNA an den Codongebrauch des Organismus, in dem sie exprimiert wird, angepasst wird. Der Codongebrauch auch die Codon Usage bzw. der Codon Bias, beschreibt das Phänomen, dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden. Unter dem Begriff„Sequenzidentität von mindestens X%" wird im Folgenden eine
Sequenzidentität verstanden, die durch ein Sequenzabgleich (Alignment) mittels eines BLAST Algorithmus, wie er auf der Homepage des NCBIs zur Verfügung steht, bestimmt wurde
In dieser Ausführungsform ist das Cystein durch Alanin ersetzt wie es in SEQ ID No. 5 bzw. SEQ ID No 6 geschehen ist.
Die Phototoxizität des Fluoreszenzproteins mit SEQ ID No. 6, genannt FbFP mit SEQ ID No. 6, beruht höchstwahrscheinlich auf der vermehrten Bildung von Sauerstoffradikalen, so wie es für das fluoreszente Protein KillerRed gezeigt werden konnte.
Die LOV-Konsensussequenz lautet nach diesem Austausch demgemäß nicht mehr NCRFLQ (SEQ ID No. 7) sondern NXRFLQ.
Unter dem Begriff „Konsensussequenz" soll im Folgenden eine Aminosäuresequenz verstanden werden, die in den LOV-Domänen von YtvA aus B. subtilis und SB2 aus P. putida übereinstimmt. Im Gegensatz zu dem bislang beschriebenen Photosensibilisator KillerRed, dessen Chromophor ausschließlich bei grünem Licht angeregt werden kann, absorbiert das FbFP mit SEQ ID No. 6 spezifisch Blaulicht und ergänzt somit die Palette genetisch codierter Photosensibilisatoren. Durch die Entwicklung von dem FbFP mit SEQ ID No. 6 sind nun erstmalig kombinierte Anwendungen mit KillerRed möglich, die gezielt phototoxische Prozesse mit zwei Lichtfarben erlauben.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Zielmoleküls umfassend mindestens die Schritte:
Einbringen eines Vektors, der für ein Protein kodiert, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, in eine Zelle, in der sich das Zielmolekül befindet, und
Expression des Proteins in dieser Zelle oder Kopplung eines Proteins, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, an ein Zielmolekül Bestrahlung der Zelle oder des Protein-Zielmolekül Komplexes mit Licht der Wellenlängen von 380 - 490 nm.
Unter dem Begriff „Zielmolekül" soll im Folgenden ein Element verstanden werden, dass durch die photosensiblen Desfunktionalisierung in seiner Wirkungsweise verändert wird. Die Begriffe Molekül und Zielmolekühl stimmen demnach inhaltlich überein, aber der Begriff „Zielmolekül" wurde gewählt, um den Anspruch noch klarer fassen zu können.
Unter dem Begriff„Kopplung" soll im Folgenden verstanden werden, dass das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung in räumliche Nähe zum Zielmolekül gebracht wird, so dass sich ein Protein-Zielmolekül Komplex ausbilden kann. Dies kann auf verschiedene Arten geschehen beispielsweise durch kovalente und nicht-kovalente Bindungen, wie die Biotin - Streptavidin Bindung. Je nachdem, ob ein Zielmolekül in einer Zelle oder in Lösung photosensibel desfunktionalisiert werden soll, wird der Vektor in die Zelle eingebracht und dort das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung exprimiert oder das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung wird an ein Zielmolekül gekoppelt, wenn die photosensiblen Desfunktionalisierung in Lösung stattfindet soll.
Überraschend wird hier gezeigt, dass eine photosensible Desfunktionalisierung auch mit blauem Licht der Wellenlängen von 380 - 490 nm durchgeführt werden kann.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren vor Koppelung des Proteins an das Zielmolekül die Schritte:
- Einbringen eines Vektor, der für das Protein, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, kodiert, in eine Zelle,
- Exprimieren des Proteins in der Zelle
- Gewinnung des Proteins.
Unter dem Begriff „Gewinnung" des Proteins werden alle Verfahrenschritte verstanden, die nach Expression des Proteins notwendig sind, um das Protein hinterher außerhalb der Zelle verwenden zu können. Daher umfasst die Gewinnung beispielsweise den Zellaufschluss, die Sezernierung des Proteins durch die Zelle selbst, eine eventuelle Aufreinigung sowie eine eventuelle Aufkonzentration.
Diese Verfahrensschritte werden vorzugweise dann ausgeführt, wenn das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung zur Kopplung an ein Protein außerhalb einer Zelle verwendet werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Methode zusätzlich den Schritt, dass der Protein-Zielmolekül Komplex vor dem Bestrahlen in eine Zelle eingebracht wird.
Dieser Verfahrensschritt wird vorzugweise dann ausgeführt, wenn das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung nicht in der Zelle, in der es hinterher zur photosensiblen Desfunktionalisierung verwendet werden soll, exprimiert wird.
So ist es beispielsweise auch denkbar, dass das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung an ein Zielmolekül gekoppelt wird und die beiden Proteine zusammen in eine Zelle eingebracht werden z.B. mittels Protein Transduktion unter Verwendung einer Protein transduction domain.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens sind das Protein und das Zielmolekül zusammen als Transkriptionseinheit exprimierbar.
Bevorzugt wird diese Ausführungsform z.B., falls die Funktion des Zielmoleküls in der Zelle untersucht werden soll, da durch die gemeinsame Expression des Zielmoleküls mit dem Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung eine Kolokalisation - beispielsweise durch eine Fusion der beiden Elemente - gewährleistet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle, die das Protein exprimiert, vorzugsweise um ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida und/oder Bacillus subtilis.
Zum Beispiel könnte das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, mittels eines Vektor, der für das Protein kodiert, in eine Bakterienzelle z.B. E.coli eingebracht und exprimiert werden. Sodann werden die E.coli Zellen entweder aufgeschlossen, um das Protein für die photosensiblen Desfunktionalisierung zu erhalten, oder der Vektor enthält auch eine Sequenz, die die Abgabe des Proteins für die photosensiblen Desfunktionalisierung in das umgebende Medium erlaubt.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden durch die Abbildungen und Ausführungsbeispiele veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Abbildungen und Ausführungsbeispiele nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Sauerstoffradikalproduktion durch den angeregten Photosensibilisator. Fig. 2 zeigt die phototoxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6 auf E. coli Zellen.
Fig. 3 zeigt, dass der phototoxische Effekt von FbFP mit SEQ ID No. 6 ausschließlich durch Blaulicht hervorgerufen werden kann. Fig. 4 zeigt, dass der phototoxische Effekt von FbFP mit SEQ ID No. 6 ausschließlich durch Blaulicht hervorgerufen werden kann.
Fig. 5 zeigt die zeitliche Auflösung der phototoxischen Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6. Fig. 6 zeigt die schematische Darstellung des erzeugten Fusionsproteins aus FbFP mit SEQ ID No. 6 und YFP.
Fig. 7 und Fig. 8 zeigen eine Klonierungs Strategie zur Erzeugung des Fusionsproteins aus Fig. 6.
Fig. 9 und Fig. 10 zeigen eine Klonierungsstrategie zur Erzeugung des Fusionsproteins aus Fig. 6. Fig. 11 zeigt die CALI-Inaktivierung von YFP.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Sauerstoffradikalproduktion durch den angeregten Photosensibilisator. Die Absorption eins Photons (hva) führt zur Anregung des Chromophors in den niedrigsten angeregten Singluett-Zu stand (S . Aus diesem Zustand kann die Energie entweder strahlungsfrei an das umgebende Medium (geschwungener Pfeil), durch Lichtemission (hvf), oder durch Elektronentransfer auf elementaren Sauerstoff übertragen werden, wodurch ein Superoxid-Anion entsteht. Außerdem kann das angeregte Chromophor in den Triplett-Zustand (TO zurückfallen, aus dem die Energie durch Phosphoreszenz (hvp) frei wird oder durch Elektronentransfer auf elementaren Sauerstoff übertragen wird. Bei diesem Prozess wird Singluett-Sauerstoff O2) generiert. (Abbildung modifiziert aus Jacobson et al. 2008).
Fig. 2 zeigt die phototoxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6 (PpFbFP) auf E. coli Zellen. Dargestellt ist die o.D.580 der FbFP mit SEQ ID No. 6 -exprimierenden E. coli DH5a-Kulturen 24 Stunden nach der Inokulation, wobei die Kulturen 2 Stunden nach Beimpfung für eine Dauer von 2 Vi Stunden mit Blaulicht bestrahlt (λ = 460 nm) wurden. Die Messwerte entsprechen dem Mittelwert von drei unterschiedlichen, unabhängigen Messungen, die Fehlerindikatoren den Standardabweichungen dieser Messungen.
Fig. 3 zeigt, dass der phototoxische Effekt von FbFP mit SEQ ID No. 6 ausschließlich durch Blaulicht hervorgerufen werden kann. Dargestellt ist die optische Dichte (bei 580 nm) der FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimierenden, transformierten E. coli DH5a-Stämme in Abhängigkeit der Zeit. Die Kulturen wurden mit einer Zellmenge entsprechend eine o.D.580 = 0,05 beimpft und bei 37°C auf einem Brutschüttler im Dunkeln inkubiert. 90 Minuten nach Inokulation wurden die Kulturen entweder direkter Blaulichtbestrahlung (λ = 460 nm, Dreiecksymbole) oder direkter Rotlichtbestrahlung (λ = 856 nm, Rauten) für eine Dauer von 2 Stunden ausgesetzt. Zur Kontrolle wurde eine Kultur im Dunkeln belassen (Quadrate). Die dargestellten Werte repräsentieren jeweils den Mittelwert aus drei unterschiedlichen, unabhängigen Messungen, die Fehlerindikatoren die Standardabweichung dieser Messungen.
Fig. 4 zeigt, dass der phototoxische Effekt von FbFP mit SEQ ID No. 6 ausschließlich durch Blaulicht hervorgerufen werden kann. Dargestellt ist die optische Dichte (bei 580 nm) der mit dem pRhokHi-2 Leervektor transformierten E. coli DH5a-Stämme in Abhängigkeit der Zeit. Die Kulturen wurden mit einer Zellmenge entsprechend eine o.D.580 = 0,05 beimpft und bei 37°C auf einem Brutschüttler im Dunkeln inkubiert. 90 Minuten nach Inokulation wurden die Kulturen entweder direkter Blaulichtbestrahlung (λ = 460 nm, Dreiecksymbole) oder direkter Rotlichtbestrahlung (λ = 856 nm, Rauten) für eine Dauer von 2 Stunden ausgesetzt. Zur Kontrolle wurde eine Kultur im Dunkeln belassen (Quadrate). Die dargestellten Werte repräsentieren jeweils den Mittelwert aus drei unterschiedlichen, unabhängigen Messungen, die Fehlerindikatoren die Standardabweichung dieser Messungen. Fig. 5 zeigt die zeitliche Auflösung der phototoxischen Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6. Dargestellt ist die zeitliche Veränderung der Koloniebildenden Einheiten der FbFP mit SEQ ID No. 6 - exprimierenden Kultur (Linien mit Rauten und Dreiecken), bzw. der Leervektorkontrolle (Linien mit Quadraten und Kreuzen) in Abhängigkeit zur Bestrahlungsdauer. Die Ermittlung der relativen Werte erfolgte durch Zellprobenentnahme (o.D.580 = 0,1) zu den angegebenen Zeitpunkten, wonach diese in unterschiedlichen Verdünnungen auf LB-Festmedium ausplattiert wurden. Die Anzahl der herangewachsenen Kolonien wurde bestimmt wobei der jeweilige Verdünnungsfaktor herausgerechnet wurde. Anschließend wurde das Verhältnis der jeweiligen Probe zu deren entsprechender Ursprungsprobe (0 Minuten) gebildet. Die dargestellten Messwerte entsprechen der Mittelung von drei unabhängigen Messungen.
Fig 6. zeigt die schematische Darstellung des erzeugten FbFP mit SEQ ID No. 6-YFP- Fusionsproteins.
FbFP mit SEQ ID No. 6 (PpFbFP) wurde an das gelbfluoreszierende Protein YFP (SEQ ID No. 9) fusioniert. Die Proteine wurden mittels eines Linkers (SEQ ID No. 10 und 11) verbunden, welcher eine „multiple cloning site" (MCS) mit den Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Kpnl, Ndel, BamHI, Sacl, Sali, HindHI, Xhol und CfrAll enthält. Zur Expression des Fusionsproteins wurde der Expressionsvektor pRhotHi-2 gewählt. Das Fusionsprotein wurde zudem mit einem His6-tag versehen, wodurch das rekombinante Protein mittels affinitätschromatographischer Verfahren einfach aufgereinigt werden kann.
Fig. 7 und Fig. 8 zeigen eine Klonierung Strategie zur Erzeugung des Fusionsproteins aus Fig. 6. Das Photosensibilisatorgen für FbFP mit SEQ ID No. 6- (SEQ ID No. 5), das Zielgen YFP (SEQ ID No. 8) und der Linker (SEQ ID No. 10 und 11) wurden in dem Klonierungsvektor pBlueScript KSII(-) kloniert, welcher in E. coli DH5a-Zellen eine Blau-Weiß-Selektion erlaubt.
Fig. 9 und Fig. 10 zeigen eine Klonierungstrategie zur Erzeugung des Fusionsproteins.
Das dargestellte Schema zeigt die endgültige Fusionierung der C-terminalen Fusion des FbFP mit SEQ ID No. 6 mit YFP (SEQ ID No. 9) durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen SaWXhoI und anschließender Ligation im Bluescript KSII(-).
Fig. 11 zeigt die CALI-Inaktivierung von YFP.
Dargestellt ist wie die Bestrahlung mit blauem Licht bei dem Fusionsprotein aus Fig. 6 (dunkelgrau) zu einer schnellen Abnahme der YFP-Fluoreszenz führt. Das YFP-Protein (SEQ ID No. 9) wird dabei durch die CALI-Methode abhängig vom FbFP mit SEQ ID No. 6 inaktiviert. Im Gegensatz dazu hat die Blaulichtbestrahlung keinen Effekt auf die Aktivität des nicht- fusionierten YFP-Proteins (hellgrau).
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE Im Folgenden werden die Ergebnisse dargestellt die zeigen, dass überraschender Weise das
LOV-Fluoreszenzprotein FbFP mit SEQ ID No. 6 als Blaulich-induzierter Photosensibilisator eingesetzt werden kann. Die phototoxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6 wurde mithilfe des Gram-negativen Bakterium E. coli DH5a nachgewiesen. Als Expressions System wurde der pRhokHi-2 Vektor eingesetzt, der durch den a/? I-Promotor eine konstitutive Expression aller LOV-Proteine ermöglicht.
1. Einfluss von Blaulichtbestrahlung auf das Wachstum E. co/z-Kulturen, die FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimieren.
Um den phototoxischen Einfluss von Blaulichtbestrahlung auf wachsende E. co/z-Kulturen, die FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimieren, nachzuweisen, wurden zunächst das LOV-
Fluoreszenzprotein FbFP mit SEQ ID No. 6, sowie dessen korrespondierendes Wildtypprotein SB2 unter Verwendung des pRhokHi-2 Expressions vektors exprimiert. Dazu wurden die Expressionskonstrukte pRhokHi-2_PpFbFP und pRhokHi-2_SB2 zunächst kloniert. Dafür wurden die Gene mit Hilfe spezifischer Primer (SEQ ID No. 12 & 13) mittels PCR amplifiziert und gleichzeitig am 5 '-Ende mit den für die Ndel-, sowie am 3 '-Ende mit den für die X/zoI-Restriktionsendonuklease spezifischen Erkennungssequenzen ausgestattet. Anschließend wurden die PCR-Produkte durch einen Ndel/X/ioI-Doppelrestriktionsverdau in den ebenfalls durch die genannten Endonukleasen hydrolysierten Expressionsvektor kloniert. Der Klonierungserfolg wurde durch eine geeignete Testrestriktion überprüft und mittels Sequenzierung des Monierten DNA-Fragments verifiziert.
Um die selektive Blaulicht- abhängigen Phototoxizität des FbFP mit SEQ ID No. 6 zunächst grundsätzlich zu demonstrieren, wurden die erzeugten Expressionskonstrukte sowie der pRhokHi-2 Leervektor (Negativkontrolle) in den Bakterienstamm E. coli DH5a transformiert und auf LB-Agarplatten unter Selektionsdruck vermehrt. Von den gewachsenen Kulturen wurde eine Kolonie in eine 5 ml LB -Vollmediumkultur überführt, und diese unter Selektionsdruck üN bei 37 °C unter Agitation inkubiert. Aus diesen Vorkulturen wurden anschließend 50 ml LB -Vollmediumkulturen auf eine o.D.580 = 0,05 beimpft und diese unter Selektionsdruck auf einem Brutschüttler bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach 2-stündiger Inkubation wurden die Kulturen direkter Blaulichtbestrahlung (λ = 460 nm) ausgesetzt, welche nach einer Bestrahlungsdauer von 2 Vi Stunden wieder ausgeschaltet wurde. Die phototoxische Wirkung der LOV-Proteine wurde anschließend anhand der erreichten Zelldichte in den Batch- Kulturen nach 24h Kultivierungsdauer bestimmt.
Bei Betrachtung der ermittelten Zelldichten fällt auf, dass die Expression von SB2 unter Blaulichtbestrahlung keinen negativen Wachstumseffekt auf die E. co/z-Kulturen hat, da sich die Zelldichten des entsprechenden Stammes und die der Negativkontrolle gleichen. Überraschender Weise ist jedoch eine deutlich niedrigere Zelldichte bei den Kulturen erkennbar, die das Fluoreszenzprotein FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimieren. Bis auf die diese Kultur, die lediglich auf eine o.D.sso von ca. 1,3 heranwächst, liegt die Zelldichte aller anderen Kulturen zum gleichen Zeitpunkt zwischen 2,6 und 2,8. FbFP mit SEQ ID No. 6 hat also unter Belichtung eine generelle wachstumshemmende bzw. wachstumsverzögernde Wirkung auf E. co/z'-Zellen.
2. Einfluss von Bestrahlung mit Licht verscheidener Wellenlängen auf das Wachstum von E. co/z-Kulturen, FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimieren. Um eine genauere Aussage bezüglich der lichtabhängigen phototoxischen Wirkung des FbFP mit SEQ ID No. 6 treffen zu können, wurde das Protein in einem ähnlich angelegten Wachstums versuch erneut untersucht. Dabei sollte gezeigt werden, dass die phototoxische Wirkung des FbFP mit SEQ ID No. 6 ausschließlich durch Licht, welches durch das Chromophor FMN absorbiert werden kann, hervorgerufen wird. Dazu wurden die entsprechenden E. co/z-Kulturen zusätzlich auch mit Rotlicht (λ = 856 nm) bestrahlt. Als Negativkontrolle wurde genau wie im vorangegangenen Versuch eine mit dem pRhokHi-2 Leervektor transformierte E. co/z-Kultur genutzt.
Von den FbFP mit SEQ ID No. 6 -exprimierenden Stämmen wurde jeweils eine Kolonie in eine 5 ml LB- Vollmedium- Vorkultur überführt und diese unter Selektionsdruck bei 37 °C üN auf einen Rotations Schüttler bebrütet. Daraufhin wurden aus diesen Vorkulturen 50 ml LB- Testkulturen, denen 50 μg/ml Kanamycin zugegeben wurde, auf eine Zellzahl einer o.D.sso von 0,05 entsprechend beimpft, und anschließend bei 37°C im Dunkeln auf einem Brutschüttler inkubiert. Diesmal wurden die Kulturen bereits 90 Minuten nach Inokulation der Lichtbestrahlung für eine Zeitspanne von 2 Stunden ausgesetzt. Durch den Beginn der Bestrahlung zu einem früheren Zeitpunkt sollte ein möglicher Selbstbeschattungseffekt der Zellen in den Kulturen minimiert werden. Der Wachstumsverlauf der Kulturen wurde nun in regelmäßigen Abständen durch photometrische Trübungsmessung verfolgt.
Die Wachstumskurven der FbFP mit SEQ ID No. 6 -exprimierenden Kulturen bestätigen die Ergebnisse des vorangegangenen Versuches. Auch in diesem Versuch konnte ein
Blaulichteinfluss auf das Zellwachstum festgestellt werden. So ist ein „Abknicken" der Wachstumskurve etwa eine halbe Stunde nach Beginn der Blaulicht-Illumination erkennbar. Dieser Effekt ist bei den Kulturen, die unter Rotlichtbestrahlung bzw. im Dunkeln gewachsen sind, nicht erkennbar. Somit wird deutlich, dass der negative Wachstumseinfluss spezifisch durch Blaulicht induziert wird. Außerdem erreichten die im Dunkeln sowie die unter Rotlicht gewachsenen Kulturen nach 450 Minuten eine Zelldichte, die einer o.D.sso von ca. 2 entsprach, und damit mehr als doppelt so hoch lag, wie die Zelldichte der unter Blaulichtbestrahlung gewachsenen Kulturen. 3. Nachweis der phototoxischen Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6.
Um nachweisen zu können, dass es sich bei der Wachstumsinhibierung, die durch FbFP mit SEQ ID No. 6 vermittelt unter Blaulicht-Bestrahlung wird, tatsächlich um einen phototoxischen und nicht um einen bakteriostatischen Effekt handelt, wurde während des fortschreitenden Wachstums, jeweils unmittelbar vor Beginn der Blaulichtbestrahlung und nach einer Illuminationsdauer von 90 Minuten die Lebendzellzahl der jeweiligen Kulturen bestimmt. Dazu wurden aus den Kulturen Proben entsprechend einer o.D.sso von 0,1 entnommen. Anschließend wurden mehrere Verdünnungen (1:5000, 1:50.000; 1:75.000 und 1: 100.000) auf LB-Festmedium ausplattiert und unter Selektionsdruck bei 37 °C über Nacht inkubiert. Danach wurde die Anzahl der auf diesen Platten gewachsenen Kolonien bestimmt und das sich daraus ergebende Verhältnis der lebenden Zellen nach 90-minütiger Bestrahlung berechnet. Die dabei bestimmten Werte sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 : Verhältnis der Lebendzellzahl der E. coli DH5a- Kulturen nach 90-minütiger Blaulichtbestrahlung (λ = 460 nm) zur Lebendzellzahl unmittelbar vor der Blaulicht-Bestrahlung
Die Bestimmung der Lebendzellzahlen zeigen eindeutig, dass die Bestrahlung mit blauem Licht, das spezifisch vom Chromophor der LOV-Proteine absorbiert wird, FbFP mit SEQ ID No. 6 eine phototoxische Wirkung für die E. co/z-Zellen entfaltet. Die phototoxische Wirkung konnte jedoch weder bei den SB2-exprimierenden E. co/z-Kulturen noch bei der Leervektorkontrolle beobachtet werden.
Zudem wurde deutlich, dass eine Beleuchtung der E. coli Kulturen, die statt des FbFP mit SEQ ID No. 6. -Expressionsvektors lediglich den Leervektor tragen, durch Blau- oder Rotlicht keine Wachstumsinhibierung hervorgerufen werden kann. Genauso verhält es sich für SB2- exprimierende Stämme, deren Wachstumskurven ebenfalls unabhängig der Lichtexposition nahezu deckungsgleich verlaufen, 4. Zeitliche Abhängigkeit der toxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6.
Um die Blaulicht-abhängige toxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6 zeitlich besser auflösen zu können, wurde die Lebendzellzahl in Abhängigkeit der Belichtungsdauer bestimmt. Dazu wurde eine 5 ml LB -Vorkultur mit einer entsprechenden Kolonie von einer LB -Festmediumplatte beimpft und unter Selektionsdruck bei 37 °C über Nacht auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurde eine 50 ml LB-Testkultur (50 μg/ml
Kanamycin) auf eine o.D.sso von 0,05 inokuliert und bei 37 °C im Dunkeln unter Agitation bebrütet. Als Negativkontrolle diente erneut eine Testkultur aus E. co/z-Zellen, die mit dem pRhokHi-2 Leervektor transformiert worden waren. Analog zu den vorangegangenen Versuchen wurden die Testkulturen 2 Stunden nach Inokulation einer direkten Blaulichtbestrahlung (λ = 460 nm) ausgesetzt, wobei den Kulturen in regelmäßigen Abständen Zellproben (o.D.sso = 0,1) entnommen wurden. Verdünnungen der Zellproben mit den Faktoren 1:5.000, 1:50.000, 1:75.000 und 1: 100.000 wurden jeweils auf LB- Festmediumplatten ausgestrichen und unter Selektionsdruck über Nacht bei 37 °C angezogen. Anschließend wurden die Kolonien-Bildenden-Einheiten (CFU) durch Auszählung der Platten bestimmt und deren Anzahl auf die jeweilige CFU-Zahl vor der Bestrahlung bezogen.
Aus diesen Kurvenverläufe ist erkennbar, dass die Lebendzellzahl der in Dunkelheit belassenen FbFP mit SEQ ID No. 6 - exprimierenden E. co/z'-Kultur, und den beiden Leervektorkontrollen unabhängig von den Belichtungsbedingungen nahezu konstant bleibt. Im Gegensatz dazu ist eine deutliche Abnahme der Lebendzellzahl Kultur, die FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimierenm, bei andauernder Blaulichtbestrahlung festzustellen. Bereits nach 10- minütiger Bestrahlung ist die Lebendzellzahl um die Hälfte reduziert; nach 30 min. Bestrahlungsdauer sind nahezu alle Zellen der Kultur abgetötet.
5. Erneuter Nachweis der phototoxischen Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6.
Um den nachgewiesenen phototoxischen Effekt von Blaulicht auf E. co/z-Zellen, die FbFP mit SEQ ID No. 6 exprimieren, und einen damit verbundenen möglichen Einsatz von FbFP mit
SEQ ID No. 6. als Photosensibilisator nochmals zu verdeutlichen, wurden aus den über Nacht gewachsenen Vorkulturen des E. coli (pRhokHi-2_PpFbFP) Stammes, sowie der Leervektorkontrolle eine Probe auf LB-Festmedium (50 μg/ml Kanamycin) ausgestrichen, und unter Blaulichtbestrahlung bzw. im Dunkeln bei 37 °C über Nacht inkubiert. Die Ergebnisse demonstrieren noch einmal eindrucksvoll die phototoxische Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6.. So wird das Wachstum der Leervektorkontrolle durch die Bestrahlung mit blauem Licht nicht beeinflusst. Dem entgegen wächst der FbFP mit SEQ ID No. 6.- Expressionsstamm unter Blaulicht nicht, wobei das Wachstum in Dunkelheit unbeeinflusst ist. Um nochmals zu überprüfen, ob der toxische Effekt bakterizid oder bakteriostatischer Art ist, wurde eine der verwendeten Platten anschließend für eine weitere Nacht bei 37 °C im
Dunkeln inkubiert. Da sich aber an der Anzahl sowie der Verteilung der Kolonien nichts änderte, lässt dies abermals die Schlussfolgerung zu, dass es sich um einen bakteriziden Effekt handelt. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen eindeutig, dass FbFP mit SEQ ID No. 6 einen phototoxischen Effekt auf E. co/z-Zellen ausübt, der spezifisch durch Blaulicht induziert wird.
6. Verwendung von FbFP mit SEQ ID No. 6. zur chromophore-assisted light inactivation (CALI) von Zielproteinen
Um zu überprüfen, ob der Blaulicht-Photosensibilisator FbFP mit SEQ ID No. 6. auch für die CALI-vermittelte Inaktivierung von Fusionsproteinen eingesetzt werden kann, wurde FbFP mit SEQ ID No. 6. an das gelbfluoreszierende Protein YFP (SEQ ID No. 9) fusioniert. Daraufhin wurde untersucht, ob es möglich ist, die Aktivität des YFP durch die FbFP mit SEQ ID No. 6 vermittelte CALI-Reaktion zu inaktivieren.
Hierzu wurden Translationsfusionen generiert, bei denen der Photosensibilisator FbFP mit SEQ ID No. 6 C-terminal an das Zielprotein YFP fusioniert ist. Die Proteine wurden dabei mittels eines Linkers (SEQ ID No. 10 & 11) verbunden, welcher eine„multiple cloning site" (MCS) mit den Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Kpnl, Ndel, BamHI, Sacl, Sali, HindHI, Xhol und CfrAll enthält. Zur Expression des Fusionsproteines wurde ebenfalls der Expressionsvektor pRhotHi-2 gewählt. Das Fusionsprotein wurde zudem mit einem His6- tag versehen, wodurch das rekombinante Protein mittels affinitätschromatographischer Verfahren einfach aufgereinigt werden kann.
Alle Klonierungs schritte wurden in dem Klonierungs vektor pBluescript KSII(-) durchgeführt. Die Klonierungstrategie ist in Fig. 9, Fig. 10 und Fig. 11 schematisch dargestellt. Die jeweiligen rekombinanten Gene wurden nach erfolgreicher Sequenzierung per Restriktionsverdau komplett aus dem Vektor ausgeschnitten und in den Expressions vektor pRhotHi-2 umkloniert.
Das Fusionsprotein wurde anschließend in E. coli überexprimiert, über den His6-tag mittels Ni-NTA- Affinitätschromatographie aufgereinigt und in Proteinpuffer (lOmM NaH2P04, lOMm NaCl, pH 8) aufgenommen. Um zu überprüfen, ob das YFP-Reporterprotein spezifisch durch FbFP mit SEQ ID No. 6. mittels CALI inaktiviert werden kann, wurde sowohl das Fusionsprotein als auch das unfusionierten YFP-Protein in einem Zeitraum von 60 min mit blauem Licht (λ =488nm) bestrahlt und anschließend die YFP- spezifische Fluoreszenz als Maß der Zielprotein- Aktivität bestimmt.
Wie in Fig. 11 dargestellt ist, führt die Bestrahlung mit blauem Licht bei der YFP- FbFP mit SEQ ID No. 6. -Fusion zu einer schnellen Abnahme der YFP-Fluoreszenz. Das YFP-Protein wird dabei durch die CALI-Methode abhängig von FbFP mit SEQ ID No. 6 inaktiviert. Im Gegensatz dazu hat die Blaulichtbestrahlung keinen Effekt auf die Aktivität des nicht- fusionierten YFP-Proteins. Somit kann eindeutig gezeigt werden, dass die Abnahme der YFP- Fluoreszenz im Falle des Fusionsproteins ausschließlich auf die Licht-inaktivierende Wirkung von FbFP mit SEQ ID No. 6 zurückzuführen ist. Eine erneute Messung der YFP-Fluoreszenz nach 24 h Inkubation der jeweiligen mit Blaulicht bestrahlten Proben hat weiterhin ergeben, dass die beobachtete FbFP mit SEQ ID No. 6 -vermittelte Inaktivierung von YFP irreversibel ist, da keine Regeneration der Fluoreszenz detektiert werden konnte. Somit kann der neue Photosensibilisator FbFP mit SEQ ID No. 6 nicht nur zur Abtötung einzelner Zellen, sondern auch zur gezielten Inaktivierung beliebiger Zielproteine innerhalb und außerhalb von Zellen eingesetzt werden.
Tabelle 2
SEQ ID No Name Sequenz
1 LOV Domäne aus MASFQSFGIP GQLEVIKKAL DHVRVGVVIT DPALEDNPIV
Bacillus subtilis YVNQGFVQMT GYETEEILGK NARFLQGKHT DPAEVDNIRT
ALQNKEPVTV QIQNYKKDGT MFWNELNIDP ME IEDKTYFV GIQNDITKQK EYEKLLEDSL TEITALSTPI VPIRNGISAL PLVGNLTEER FNS IVCTLTN ILSTSKDDYL I IDLSGLAQV NEQTADQIFK LSHLLKLTGT ELI ITGIKPE LAMKMNKLDA NFSSLKTYSN VKDAVKVLPI M
LOV Domäne aus MASFQSFGIP GQLEVIKKAL DHVRVGVVIT DPALEDNPIV Bacillus subtilis YVNQGFVQMT GYETEEILGK NARFLQGKHT DPAEVDNIRT
ALQNKEPVTV QIQNYKKDGT MFWNELNIDP ME IEDKTYFV GIQNDITKQK EYEKLLE
LOV Domäne aus MINAQLLQSM VDASNDGIVV AEKEGDDTIL IYVNAAFEYL
Pseudomonas TGYSRDEILY QDARFLQGDD RDQLGRARIR KAMAEGRPCR
putida EVLRNYRKDG SAFWNELSIT PVKSDFDQRT YFIGIQKDVS
RQVELERELA ELRARPKPDE RA
LOV Domäne aus MINAKLLQLM VEHSNDGIVV AEQEGNESIL IYVNPAFERL
Pseudomonas TGYCADDILY QDARFLQGED HDQPGIAIIR EAIREGRPCC
putida QVLRNYRKDG SLFWNELSIT PVHNEADQLT YYIGIQRDVT
AQVFAEERVR ELEAEVAELR RQQGQAKH
FbFP atgatcaacg caaaactcct gcaactgatg gtcgaacatt Nukleotidsequenz ccaacgatgg catcgttgtc gccgagcagg aaggcaatga
gagcatcctt atctacgtca acccggcctt cgagcgcctg accggctact gcgccgacga tattctctat caggacgccc gttttcttca gggcgaggat cacgaccagc cgggcatcgc aattatccgc gaggcgatcc gcgaaggccg cccctgctgc caggtgctgc gcaactaccg caaagacggc agcctgttct ggaacgagtt gtccatcaca ccggtgcaca acgaggcgga ccagctgacc tactacatcg gcatccagcg cgatgtcaca gcgcaagtat tcgccgagga aagggttcgc gagctggagg ctgaagtggc ggaactgcgc cggcagcagg gccaggccaa gcactga
FbFP AA Sequenz MINAKLLQLM VEHSNDGIVV AEQEGNESIL IYVNPAFERL
TGYCADDILY QDARFLQGED HDQPGIAIIR EAIREGRPCC QVLRNYRKDG SLFWNELSIT PVHNEADQLT YYIGIQRDVT AQVFAEERVR ELEAEVAELR RQQGQAKH
LOV- NCRFLQ
Konsensussequenz
YFP Nukleotid- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC Sequenz CTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTG
TCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACC CTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTAC CCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC GAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGC AACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGC AACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAC GTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAAC TTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCC GACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTG CTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAA GACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG ACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
YFP Peptid- MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTL Sequenz KFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMP
EGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDG NILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLA DHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGITLGMDELYK
Upper Primer ggtacccata tgggatccga gctcgcgggc ctggtgccgc Linker gcggcagcgg
Down Primer ccgcggctcg agaagcttgt cgacggcgcc gctgccgcgc Linker ggcaccaggc
SB2+NdeI-up atcgcgcata tgatcaacgc aaaactc
SB2+XhoI-down cgtctcgagt cagtgcttgg cctggc
LITERATUR
Jacobson, K., Rajfur, Z., Vitriol, E. & Hahn, K. (2008). Chromophore-assisted laser inactivation in cell biology. Trends Cell Biol 18: 443-450.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Verwendung eines Fluoreszenzproteins umfassend eine LOV-Domäne zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Moleküls, wobei in der LOV Domäne mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, die kein FMN kovalent bindet, ersetzt ist.
2. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1, in einer Lösung oder einer Zelle.
3. Verwendung eines Proteins nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei es sich bei der photosensiblen Desfunktionalisierung um Chromophore assisted light inactivation (CALI) und/oder eine phototoxische Reaktion handelt.
4. Verwendung eines Proteins nach einem der vorherigen Ansprüche wobei besagte LOV-Domäne
a) kodiert wird durch die Nukleinsäure der SEQ ID NO. 5 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde, g) eine Aminosäuresequenz umfasst gemäß der SEQ ID NO 6, oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder ein Derivat dieser Sequenz, h) eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, bevorzugt 95% mit der Aminosäuresequenzen aus g) aufweist.
Verfahren zur photosensiblen Desfunktionalisierung eines Zielmoleküls umfassend mindestens die Schritte:
- Einbringen eines Vektors, der für ein Protein kodiert, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, in eine Zelle, in der sich das Zielmolekül befindet, und Expression des Proteins in dieser Zelle oder Kopplung eines Proteins, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, an ein Zielmolekül
- Bestrahlung der Zelle oder des Protein-Zielmolekül Komplexes mit Licht der Wellenlängen von 380 - 490 nm.
Verfahren gemäß Anspruch 5 zusätzlich umfassend vor Koppelung des Proteins an das Zielmolekül die Schritte:
- Einbringen eines Vektor, der für das Protein, das bei Wellenlängen von 380 - 490 nm photoaktiv ist, kodiert, in eine Zelle,
- Exprimieren des Proteins in der Zelle
- Gewinnung des Proteins.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5-6, zusätzlich umfassend den Schritt, dass der Protein-Zielmolekül Komplex vor dem Bestrahlen in eine Zelle eingebracht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5-7, wobei das Protein und das Zielmolekül zusammen als Transkriptionseinheit exprimierbar sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5-8, wobei es sich bei der Zelle, die das Protein exprimiert, vorzugsweise um ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida und/oder Bacillus subtilis handelt.
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