EP2739643A1 - Verwendung von fmn-bindenden fluoreszenzproteinen (fbfp) als neuartige sekretionsmarker - Google Patents

Verwendung von fmn-bindenden fluoreszenzproteinen (fbfp) als neuartige sekretionsmarker

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EP2739643A1
EP2739643A1 EP12740173.5A EP12740173A EP2739643A1 EP 2739643 A1 EP2739643 A1 EP 2739643A1 EP 12740173 A EP12740173 A EP 12740173A EP 2739643 A1 EP2739643 A1 EP 2739643A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
encoded
fluorescent protein
nucleic acids
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12740173.5A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Drepper
Karl-Erich Jaeger
Janko Potzkei
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Evocatal GmbH
Original Assignee
Evocatal GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evocatal GmbH filed Critical Evocatal GmbH
Publication of EP2739643A1 publication Critical patent/EP2739643A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • FMN-binding fluorescent proteins FLFP
  • fluorescent reporters such as GFP
  • GFP In vivo fluorescent reporters, such as GFP, are widely used in many areas of basic science and biotechnology: Fluorescent proteins are used to study gene regulatory mechanisms or to monitor biotechnological processes. Fluorescence reporters can also be used to study cellular differentiation processes and localize the target protein in the cell. These can also be used to verify folding processes of heterologous proteins in bacterial expression strains.
  • the GFP and the color variants eg YFP (SEQ ID 4)
  • oxygen is essential for the autocatalytic synthesis of the fluorophore.
  • GFP and its color variants can not be used in obligate anaerobic organisms.
  • FMN-based fluorescence proteins FbFP
  • fluorescent protein means a protein that can emit fluorescence, whereby the fluorescence property can be caused by binding of a chromophore or fluorophore to certain protein regions, for example to a LOV domain, or the fluorescence property is in the peptide sequence of the protein,
  • the fluorescence is emitted after excitation of the fluorescent protein with light of a certain wavelength, usually the excitation leads to a momentary, spontaneous emission of light during the transition of an electronically excited system into a state of lower energy, whereby the emitted light As a rule, is lower in energy than the previously absorbed.
  • the Bacillus subtilis-derived gene ytvA was identified as part of complete genome sequencing and classified as an unknown protein with similarity to protein kinases.
  • spectroscopic studies suggested that YtvA might contain a chromophore in the form of a flavin mononucleotide (FMN). This assumption was confirmed in 2002 and it was possible to identify the N-terminal region of YtvA as a so-called LOV domain (Light, Oxygen, Voltage) by database searches for proteins with homologies to the plant phototropins.
  • LOV domain Light, Oxygen, Voltage
  • the phototropins are membrane-bound kinases of higher plants, which autophosphorylate upon irradiation with blue (390-500 nm) and UV light (320-390 nm).
  • the photoreceptors are responsible for the phototropism of a plant, as well as the change of location of chloroplasts and the opening of stomata.
  • Proteins with a LOV domain are usually regulated by the factors light, oxygen and voltage (Light, Oxygen, Voltage), whereby they can be coupled in bacteria to different effector domains. Furthermore, the LOV domains undergo a light-induced photocycle.
  • the 261 AS (amino acids) YtvA consists of only two domains: an N-terminal LOV and a C-terminal STAS domain.
  • the YtvA-LOV domain which has the consensus sequence NCRFLQG, has been shown to bind a FMN as a chromophore and to undergo a photocycle, such as LOV domains of the phototropins.
  • YtvA's STAS domain is believed to be the Effector domain, which is responsible for the forwarding of the registered by the LOV domain light stimulus.
  • fluorescent protein comprising a LOV domain is to be understood below a protein having a light-oxygen voltage (LOV) domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid and in addition to the exchange at least one further point mutation is present in the at least one cysteine.
  • LOV light-oxygen voltage
  • the LOV domain proteins bind the cofactors FMN, FAD or riboflavin provided by the host organism. These molecules are synthesized independently of oxygen in both prokaryotes and eukaryotes.
  • FbFP FMN-binding fluorescent reporter proteins
  • LOV Light Oxygen Voltage
  • the new fluorescent markers are very small (16-19 kDa) and bind to the chromophore flavin mononucleotide (FMN) provided by the host organism. This molecule is synthesized independently of oxygen in both prokaryotes and eukaryotes.
  • the bacterial proteins were modified by means of modern methods, the so-called directed evolution. These mutations dramatically increased the autofluorescence of the proteins, resulting in the FMN-binding fluorescent proteins.
  • the photochemical characterization of the new marker proteins revealed that the FbFPs emit blue-green fluorescence (495 nm) upon excitation with blue light (450 nm).
  • the new marker proteins could be expressed in different pro- and eukaryotic host cells and the fluorescence characteristic of FbFP could be detected in vivo.
  • Fluorescent reporter proteins which fluoresce independently of the oxygen partial pressure, are now available with the "FMN-based fluorescence protein" (FbFPs) Unlike other members of the GFP family, FbFP does not require oxygen for its formation the fluorescence.
  • FbFP Fluorescent reporter proteins, which fluoresce independently of the oxygen partial pressure, are now available with the "FMN-based fluorescence protein" (FbFPs) Unlike other members of the GFP family, FbFP does not require oxygen for its formation the fluorescence.
  • the term “capable of fluorescing” is to be understood as meaning that a fluorescent protein can be excited by light of certain wavelengths and / or that it can release the energy absorbed during the excitation again.
  • hydrolases such as lipases, proteases or carbohydrases, which serve to degrade natural substrates. This serves above all to adapt the bacterial cell to changed environmental conditions.
  • toxins or constituents of so-called “quorum-sensing systems”, which serve to detect population density, are also released from bacterial cells, distinguishing between export and secretion of proteins: the proteins to be exported remain, at least in part, within The outer membrane is secreted into the extracellular medium and the current main mechanisms of bacterial secretion are summarized below:
  • the type I or ABC secretion pathway (ATP binding cassette) was first used for secretion
  • This transport system consists of three components: the inner membrane contains the ATP binding cassette, which, in addition to its ATPase function, is also responsible for substrate specificity in the periplasmic space of the membrane fusion protein ( MFP), which has a large hydrophobic e domain is anchored in the cytoplasmic membrane and interacts with the third component, the outer membrane protein (OMP), which is located in the outer membrane.
  • MFP membrane fusion protein
  • the ABC substrates which differ from most other secreted proteins by a non-cleavable C-terminal signal peptide, are delivered in one step through the periplasm into the extracellular medium.
  • GSP general secretory pathway
  • the protein to be secreted is transported from the cytoplasm into the surrounding medium in two steps: In the first step, the preprotein is split off N-terminal signal sequence transported via the lake-way into the periplasm. From there, the protein can be transported over the outer membrane.
  • the protein binds to the "General Terminal Brandl", which consists of up to 14 different proteins, and another mechanism to get from the periplasm into the outer medium within the framework of the GSP is the so-called car transporter: after its transport into the periplasm via Sec- Secretion pathway, the ⁇ -domain of the protein located at the C-terminus forms a channel in the outer membrane consisting of several amphipathic ⁇ -sheets, through which the N-terminal ⁇ -domain of the protein can escape to the outside Gram-negative bacteria possess only a cytoplasmic membrane, most of the proteins transported via the sea-route get directly into the surrounding medium.
  • Gram-negative as well as Gram-positive organisms contain the so-called Tat-secretion pathway The seaway pathway can transport proteins across the cytoplasmic membrane Bacteria secreted or exported proteins leave the cytoplasm via the Sec translocation pathway.
  • Bacillus subtilis up to 300 different proteins can be transported from the cytoplasm; only a small part uses transport routes such as the ABC, pseudopilene or Tat transport system, and most of the exported proteins are secreted via the sea route. Most of the proteins transported have an N-terminal recognition signal, the so-called signal sequence, whose function is to direct the proteins from the site of their synthesis to the cytoplasmic membrane.
  • the typical signal sequence of a See substrate consists of three different domains. At the N-terminus is the so-called N-domain. It is thought that the positive charges (arginine or lysine) interact with negative charges of the membrane phospholipids. Following this is the hydrophobic H domain.
  • This consists of hydrophobic amino acids and can assume an a-helical structure.
  • a helix-breaking amino acid (proline or glycine) is located in the middle region of the H domain; this allows the complete membrane insertion of the H domain according to the so-called "hairpin mechanism.”
  • proline or glycine are usually found, which presumably improves cleavage by the signal peptidases
  • An important characteristic of the sea route is translocation Unfolded proteins, where the unfolded state is essential for the translocation competence of a protein.With the help of cytoplasmic chaperones, the synthesized polypetides in a unfolded conformation stabilized and are thus suitable for transport.
  • B. subtilis plays an important role in the extracellular folding catalysts, since there are a number of proteases at the membrane-cell wall interface, so that non-or incorrectly folded proteins are rapidly degraded.
  • An example of this is the extracytoplasmic localized lipoprotein PrsA, which shows a sequence similarity to a peptidyl prolyl c / s / frara isomerase from E. coli and thus could be regarded as a chaperone. Since some proteins also depend on the formation of disulfide bridges for their proper conformation, thiol disulfide oxidoreductases are needed in the extracellular domain.
  • subtilis are available for this purpose, the proteins BdbA, BdbB and BdbC available, so far only an extracytoplasmic protein, ComC, is known, which contains a disulfide bridge.
  • disulfide bridges are formed in the periplasmic space with the aid of the Dsb apparatus, consisting of DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, DsbE and DsbG.
  • Most of the proteins exported from the cytoplasm in E. coli use the See route for translocation. To be translocation competent, the substrates of the sea route must retain an unfolded conformation after their synthesis.
  • periplasmic triethylamine N-oxide reductase TorA a molybdenum-containing enzyme
  • this pathway was called a "twin arginine translocation" or Tat secretion pathway, which turned out to be very similar to the pathway found in thylakoid membranes. dependent on the ability to transport already folded proteins Transport pathway in the thylakoid membranes was shown in the bacterial Tat pathway that the energy required for the translocation originates solely from the PMF resulting from the proton gradient across the cytoplasmic membrane.
  • the Tat pathway substrates are directed to the translocon by means of a signal peptide at the N-terminus of the protein to be secreted.
  • the structure of the signal peptide corresponds to that of a Sec signal sequence.
  • the Tat signal peptide is subdivided into N, H, and C domains and, with 26 to 58 amino acids, is significantly longer than the average Sec signal sequence, with a large portion of the additional amino acids attributable to the N domain.
  • the N domain contains the amino acid sequence SRRXFLK, the two arginines being highly conserved. So far, only two natural Tat substrates are known that differ from this motif.
  • the remaining amino acids of the consensus motif occur at a frequency of more than 50%, where X is normally a polar amino acid.
  • X is normally a polar amino acid.
  • the Tat signal sequence alone is not sufficient to drive a protein Tat-dependent from the cytoplasm. An important factor is the folding state of the signal sequence on the signal sequence, as unfolded or misfolded proteins or proteins with missing cofactor are not exported.
  • the Tat-dependent protein should therefore, if possible, not interact with chaperones of the See system and must be able to be folded cytoplasmic. About the formed from the identified Tat components Translokon is, compared to the See way, so far little known.
  • TatA, B and C are present in the membrane in two different complex forms (TatAB and TatBC) which, in the case of translocation, assemble into the final translocon consisting of TatA, B and C, which complex is only one represents a temporary state.
  • TatAB and TatBC complex forms
  • TatA should form the water-filled pore necessary for the translocation after binding of the signal peptide to TatBC.
  • Tat substrates accumulate in the membrane and could thus lead to the observed phenotype of chain formation that occurs in Tat mutants.
  • fluorescent reporters find widespread application in basic research as well as in biotechnology.
  • a fluorescent protein as a secretion marker, wherein the fluorescent protein has a LOV domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid which covalently binds no FMN.
  • FbFPs In contrast to GFP, whose fluorophore group is formed by an autocatalytic process, FbFPs require the cofactor FMN for their fluorescence. Because this cofactor is not covalently bound and no cysteine is present in the protein, this makes the FbFPs potential bacterial Tat secretory markers. As a protein that requires a cofactor for its function, which passes from the medium to the periplasm, and be folded correctly The FbFPs are optimal proteins for the sea and Tat pathway. To test the possibility of sea and Tat-dependent secretion of FbFPs in E. coli, a sea and a Tat signal sequence were added to the EcFbFP ( SEQ ID 1) fused. The signal sequence of the See path was the PelB signal sequence, and the signal sequence of TorA was used for Tat-dependent secretion.
  • a secretion marker in the sense of the present invention is in particular a marker, which can be used for detecting a secretion of a protein, an enzyme and / or an antibody from a host organism.
  • the detection may relate to the fundamental presence of a secretion and / or its efficiency.
  • At least one cysteine is replaced by alanine in the LOV domain.
  • the LOV domain has at least one further point mutation.
  • the introduction of such a point mutation preferably leads to an improvement in the photostability and / or to a change in the fluorescence wavelength. This allows a differentiated analysis and observation of the secreted fluoresceable secretion markers.
  • suitable point mutations are for example point mutation from the group consisting of I29V, S91G, Y112F, E138G, L7P, F124L, N26Y, Y112H, I48T, H61Y, Y43F, Y112C, E12D, Q143L, A36T, Q57H, N95I, E22K, E71G, K88S, L109V and Q116L.
  • the fluorescent protein having a LOV domain a) is encoded by a nucleic acid of SEQ ID 1 or a fragment, a variant, a homologue or derivative of this sequence,
  • nucleic acid which can hybridize to one of the nucleic acids from a) under stringent conditions
  • nucleic acid which can hybridize to the complementary nucleic acid of one of the nucleic acids from a) -c) under stringent conditions
  • f) is encoded by a nucleic acid whose code has been optimized in comparison to the nucleic acids from a) -e) for a particular expression system.
  • nucleic acid is to be understood as meaning a single-stranded or double-stranded macromolecule composed of nucleotides
  • the most common nucleic acids are deoxyribonucleic acid (DNA) or complementary DNA (cDNA) and ribonucleic acid (RNA)
  • Nucleic bases are adenine, cytosine, guanine and thymine, the latter being specific for DNA
  • RNA ribonucleic acid
  • Nucleic bases are adenine, cytosine, guanine and thymine, the latter being specific for DNA
  • the same nucleobases or nucleotides are present in the RNA apart from thymine, which is replaced by uracil.
  • Artificial nucleic acids are, for example, Peptide Nucleic Acid (PNA), morpholino and Locked Nucleic Acid (LNA), as well as Glycol Nucleic Acid (GNA) and Threose Nucleic Acid (TNA). Each of these nucleic acids differs in structure from the backbone of naturally occurring nucleic acids.
  • RNA duplexes is complementary to the other, since the base pairs of the two strands are non-covalently linked by two or three hydrogen bonds, in principle - there are exceptions for thymine / uracil and the wobble complex of tRNA - there is only one complementary base for each base Therefore, it is possible to reconstruct the complementary strand of a single strand, which is essential for DNA replication, for example, the complementary strand of the DNA sequence 5 'AGTCATG 3'
  • cDNA is synthesized by means of the enzyme reverse transcriptase from RNA e.g. mRNA synthesized.
  • hybridize or hybridization is understood to mean the process in which a more or less completely complementary nucleic acid is attached to a nucleic acid by forming hydrogen bonds between the respectively complementary nucleic bases.
  • hybridize under stringent conditions is understood below to mean that the conditions of the hybridization reaction are set so that only bases which are completely complementary to one another can form hydrogen bonds, for example, the stringency can be influenced by the temperature.
  • silent mutation is to be understood as the phenomenon that a mutation in a nucleic acid section does not have any consequences, which is the case because the information content of the gene has not changed, because a number of amino acids are different Triplets of successive nucleobases - called triplets or codons - encoded.
  • fragment is intended to designate a part of a nucleic acid or an amino acid sequence which lacks some parts of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence but retains at least part of its activity, for example with regard to fluorescence properties, enzyme activity or binding to other molecules ,
  • variant is intended below to designate a nucleic acid or an amino acid sequence which, in terms of its structure and biological activity, substantially equals the structure and biological activity of a claimed nucleic acid or an amino acid sequence.
  • derivative is understood in the following to mean a related nucleic acid or amino acid sequence which has similar characteristics with respect to a target molecule as a claimed nucleic acid or amino acid sequence.
  • homolog is understood in the following to mean a nucleic acid or an amino acid sequence in the sequence of which a claimed nucleic acid or amino acid sequence has been added, deleted, substituted or modified in any other way as claimed in the claimed sequence however, it is that the homolog has substantially the same properties as a claimed nucleic acid or amino acid sequence.
  • nucleic acid is adapted to the codon usage of the organism in which it is expressed, the codon usage also being the codon usage or the codon bias describing the phenomenon that variants of the universal genetic code of different species are used with varying frequency.
  • sequence identity of at least X% is understood in the following to mean a sequence identity which has been determined by a sequence alignment (alignment) by means of a BLAST algorithm, as it is available on the homepage of the NCBI.
  • the fluorescent protein has a size between> 16 kDa and ⁇ 19 kDa.
  • the fluorescent protein has an excitation wavelength between> 430nm and ⁇ 470nm, preferably 450nm. It is further preferred that the fluorescent protein has an emission maximum between> 470 nm and ⁇ 520 nm, preferably 495 nm.
  • the fluorescent protein is expressed or coexpressed in a host cell according to a further preferred embodiment of the invention and secreted into the periplasm and / or into an extracellular medium. In the context of the invention, co-expressing comprises expression as a fusion protein and parallel expression together with further proteins. It is preferably provided that the fluorescent protein has a signal sequence at its N-terminus. As a signal sequence, the fluorescent protein which can be used as secretion marker can have, for example, a PelB or TorA signal sequence.
  • the fluorescent protein is encoded with a LOV domain a) by a nucleic acid of SEQ ID 2 or 3 or a fragment, a variant, a homologue or derivative of one of these sequences, b) is encoded by a nucleic acid, which can hybridize to one of the nucleic acids from a) under stringent conditions,
  • c) is encoded by a nucleic acid which has at least 70% preferably 95% identity with one of the nucleic acids from a) or b),
  • d) is encoded by a nucleic acid which can hybridize to the complementary nucleic acid of one of the nucleic acids from a) -c) under stringent conditions,
  • e) is encoded by a nucleic acid having at least one silent mutation of a single nucleotide (as allowed by the degeneracy of the genetic code) compared to the nucleic acids of a) -d), or
  • f) is encoded by a nucleic acid whose code has been optimized in comparison to the nucleic acids from a) -e) for a particular expression system.
  • an antibody expressed in an organism is labeled with a fluorescent protein having a LOV domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid, preferably alanine, which does not covalently bind FMN.
  • a fluorescent protein having a LOV domain in which at least one cysteine is replaced by another amino acid, preferably alanine, which does not covalently bind FMN.
  • Folding helper such as chaperones
  • the fluorescent protein is fused with a target protein in order to detect the transport of the target protein (antibody) across the membrane by means of fluorescence microscopy or spectroscopic methods. This is of importance for the detection of, for example, antibodies or antibody fragments which must be secreted in Gram negative bacteria (such as E. coli) into the oxidizing periplasm to form the necessary disulfide bridges there.
  • Another application is detection in the context of high-throughput screening procedures.
  • the invention proposes a method for producing a secretion marker, wherein a plasmid which has a ribonucleic acid coding for a fluorescent protein, by genetic engineering methods into an organism, preferably a bacterium selected from the group consisting of Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida and Bacillus subtilis, are introduced and expressed there, the fluorescent protein
  • a) is encoded by a nucleic acid of SEQ ID 1, 2 or 3 or a fragment, a variant, a homolog or derivative of one of these sequences
  • b) is encoded by a nucleic acid which hybridize to one of the nucleic acids from a) under stringent conditions
  • c) is encoded by a nucleic acid which has at least 70% preferably 95% identity with one of the nucleic acids from a) or b),
  • d) is encoded by a nucleic acid which can hybridize to the complementary nucleic acid of one of the nucleic acids from a) -c) under stringent conditions,
  • e) is encoded by a nucleic acid having at least one silent mutation of a single nucleotide (as allowed by the degeneracy of the genetic code) compared to the nucleic acids of a) -d), or f) is encoded by a nucleic acid whose code has been optimized in comparison to the nucleic acids from a) -e) for a particular expression system.
  • At least one vector selected from the group consisting of pRhotHi-2 and pHSG575 is used as the expression vector.
  • Fig. 1 is a schematic representation of secretory reporter gene fusions
  • Fig. 1 shows a schematic representation of secretion reporter gene fusions. Both a PelB signal sequence (2) and a TorA signal sequence (3) were N-terminally fused to the reporter gene. The reporter gene fusions are under the control of the lac promoter.
  • the expression vector pRhotHi-2 has a broad host range from pBBRIMCS because of the replication origin (rep region, origin of replication) and can be used, for example, in R. capsulatus
  • the pBBRIMCS derivative contains a chloramphenicol resistance gene for selection purposes a kanamycin resistance gene (aphll.) For a possible application of the fusions in R.
  • capsulatus a mob region allows the plasmid transfer by conjugation through E.coli strain S17-1, which acts as a donor strain, into the R. capsulatus strain BIOS and B10S-T7, which uses a T7 polymerase-dependent promoter to express the reporter proteins.
  • the selected signal sequences of the sea and Tat secretion pathway pelB and torA and the respective reporter proteins were in this case cloned downstream of the T7 promoter in the expression vector pRhotHi-2 (cloning strategy see Figure 2).
  • pelB only the respective reporter proteins had to be cloned by restriction hydrolysis behind the Sec signal sequence, since this was ready in the vector pRohtHi-2.
  • the torA was amplified by PCR with specific oligonucleotide primer molecules ("primers") and provided with a Ndel at the 5 'end, and a BamHI site at the 3' end, the sequence of the The template used for the PCR reaction was the genomic DNA of the E.
  • the positive result of the cloning was confirmed by means of a restriction analysis and checked by sequencing.
  • As an expression control the respective constructs without signal sequence were used.
  • FIG. 2 shows a cloning scheme for generating the sea and Tat secretion fusions using the example of EcFbFP (SEQ ID 1).
  • the cloning strategy using the EcFbFP (SEQ ID 1) was clarified, and this was carried out in the same way with YFP (SEQ ID 4).
  • the PCR product of the reporter protein was cloned into the hydrolyzed vector pRhotHi-2 by BamHI / XhoI double restriction.
  • the PCR product of the Tat secretion signal sequence torA was preliminarily cloned into the hydrolyzed vector by Ndel / BamHI double restriction.
  • the expression of the constructs was initially under the control of the inducible Lac promoter in the vector pHSG575, which has a low copy number in E. coli.
  • the vector carries the gene for resistance to chloramphenicol so as to maintain selective pressure.
  • the expression control used was the EcFbFP (SEQ ID 1), to whose 5 'end no signal sequence was added.
  • the secretion marker constructs were cloned into the vector pHSG575.
  • the EcFbFP (SEQ ID 1), the EcFbFPsec (SEQ ID 2) and the EcFbFPtat (SEQ ID 3) gene were amplified from the respective pRhotHi-2 construct by PCR and labeled with a Sa / I interface at the 5 'end and a Psil interface at the 3' end by means of specific primers.
  • the PCR products hydrolysed with the respective restriction endonucleases were cloned into the likewise hydrolyzed vector pHSG575 and the successful cloning was checked by means of sequencing.
  • the detection of the sea and Tat-dependent secretion of the FbFP and the YFP was carried out by means of fluorescence microscopic analysis, as well as by immunological detection of protein accumulation by Western Blot.
  • the fluorescence reporter was localized optically by the fluorescence microscope (Zeiss Axioplan 2 imaging with apotome, objective Apochromat 100 oil 1.4, fluorescence filter Ex: 380/14 Em: 494/20) in vivo determined.
  • the constructs were in E. coli strain MC4100 and E.
  • the DADE strain is a TatA-E deletion mutant to prove that the Secretion marker constructs which are fused to the signal sequence of the Pelb's, are translocated exclusively via the Sec secretion pathway and do not enter the periplasm via the Tat secretion pathway.
  • the YFP (SEQ ID 4) and the YFP (SEQ ID 5) were expressed in E. coli BL21 (DE3) cells in the expression vector pRhotHi-2 in autoinduction medium and possible fluorescence detected in the fluorescence microscope for the secretion ability of the YFP ( SEQ ID 4) to be able to exclude over the sea way.
  • the Fig.4. recognizes, only in the case of the cytoplasmic YFP (SEQ ID 4) in the expression control an expected active fluorescence is present. In the case of the YFP (SEQ ID 5), as expected, no fluorescence is detected, suggesting that the YFP (SEQ ID 4) is not useful as a secretory marker because it is not in active fluorescent form in the periplasm.

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Abstract

Zur Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen, Proteinfaltungen und Proteinlokalisation sowie bei der Sekretion von Proteinen werden in der Biotechnologie und in der Grundlagenforschung in vivo Reporterproteine eingesetzt. Um Fluoreszenzreporter als Marker für Sekretionsprozesse nutzen zu können, wurden von uns erstmals FMN-bindende Fluoreszenproteine (FbFP) entwickelt. Die neuen Fluoreszenzmarker lassen sich wie GFP in verschiedenen Bakterien exprimieren. Durch die Bindung des Chromophors FMN entsteht so ein cyan-grün fluoreszierendes Protein, das sich in vivo mit allen gängigen spektroskopischen und mikroskopischen Verfahren nachweisen lässt. Im Gegensatz zu GFP kann dieses Protein überraschender Weise auch über den Sec-Weg sekretiert und im Periplasma in den fluoreszenzaktiven Zustand überführt werden.

Description

Verwendung von FMN-bindenden Fluoreszenzproteinen (FbFP) als neuartige Sekretionsmarker
In vivo Fluoreszenzreporter, wie das GFP, finden in vielen Bereichen der Grundlagenforschung und Biotechnologie eine breite Anwendung: So werden fluoreszierende Proteine zur Untersuchung von genregulatorischen Mechanismen oder zur Überwachung von biotechnologischen Prozessen eingesetzt. Für die Untersuchung von zellulären Differenzierungsprozessen und zur Lokalisation des jeweiligen Zielproteins in der Zelle können ebenfalls Fluoreszenzreporter verwendet werden. Diese können auch zur Überprüfung von Faltungsprozessen heterologer Proteine in bakteriellen Expressionsstämmen dienen. Trotz der vielseitigen Einsatzmöglichkeiten ist die Verwendung des GFP sowie der Farbvarianten (z.B. YFP (SEQ-ID 4)) unter anaeroben Bedingungen nur eingeschränkt möglich, da für die autokatalytische Synthese des Fluorophors Sauerstoff essentiell ist. Somit kann GFP und dessen Farbvarianten in obligat anaeroben Organismen nicht eingesetzt werden. Um dennoch in anaeroben Organismen mit in vivo Fluoreszenzreportern arbeiten zu können, wurden die FMN- basierten Fluoreszenzproteine (FbFP) entwickelt. Alle Fluoreszenzproteine der GFP-Familie bilden ohne Ausnahme das Chromophor in einer mehrstufigen Autobiokatalyse aus. Da bei diesem Prozess molekularer Sauerstoff benötigt wird, hängt die Reifung des Chromophors und somit die Ausbildung des Fluoreszenzsignals unmittelbar von diesem Umweltfaktor ab. Folglich beschränken sich die Anwendungen von GFP und dessen Derivaten als Fluoreszenzreporterproteine auf aerobe Systeme und das Fluoreszenzsignal dieser Proteine ist in obligat anaeroben Organismen oder unter hypoxischen Bedingungen nicht einsetzbar. Unter dem Begriff„Fluoreszenzprotein" wird ein Protein verstanden, dass Fluoreszenz emittieren kann. Dabei kann die Fluoreszenzeigenschaft durch Bindung eines Chromophors bzw. Fluorophors an bestimmte Proteinbereiche, beispielsweise an eine LOV Domäne, hervorgerufen werden, oder die Fluoreszenzeigenschaft ist in der Peptidsequenz des Proteins, wie etwa bei GFP, codiert. Die Fluoreszenz wird nach Anregung des Fluoreszenzproteins mit Licht bestimmter Wellenlänge emittiert. Meist kommt es durch die Anregung zu einer kurzzeitigen, spontanen Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie, wobei das emittierte Licht im Regelfall energieärmer ist als das vorher absorbierte.
Das aus Bacillus subtilis stammende Gen ytvA wurde im Rahmen der kompletten Genomsequenzierung identifiziert und als unbekanntes Protein mit Ähnlichkeit zu Proteinkinasen klassifiziert. In einer durchgeführten Studie wurde aufgrund spektroskopischer Untersuchungen vermutet, dass YtvA einen Chromophor in Form eines Flavinmononukleotid (FMN) enthalten könnte. Diese Vermutung wurde 2002 bestätigt und es konnte durch Datenbankrecherche nach Proteinen mit Homologien zu den pflanzlichen Phototropinen der N-terminale Bereich von YtvA als sog. LOV-Domäne (Light, Oxygen, Voltage) identifiziert werden. Bei den Phototropinen handelt es sich um membrangebundene Kinasen höherer Pflanzen, die bei Bestrahlung mit blauem (390-500 nm) und UV- Licht (320-390 nm) autophosphorylieren. In Pflanzen sind die Photorezeptoren für den Phototropismus einer Pflanze, sowie den Ortswechsel von Chloroplasten und die Öffnung von Stomata verantwortlich. Proteine mit einer LOV-Domäne werden in der Regel durch die Faktoren Licht, Sauerstoff und Spannung (Light, Oxygen, Voltage) reguliert, wobei sie in Bakterien an verschiedene Effektordomänen gekoppelt sein können. Des Weiteren durchlaufen die LOV-Domänen einen Licht-induzierten Photozyklus. Anders als die Phototropine setzt sich das 261 AS (Aminosäuren) große YtvA aus nur zwei Domänen zusammen: einer N-terminalen LOV- und einer C-terminalen STAS-Domäne. Für die YtvA- LOV-Domäne, welche die Consensus-Sequenz NCRFLQG besitzt, konnte nachgewiesen werden, dass sie ein FMN als Chromophor bindet und einen Photozyklus durchläuft wie LOV-Domänen der Phototropine. Von der STAS-Domäne des YtvA wird vermutet, dass es sich bei ihr um die Effektor- Domäne handeln könnte, die für die Weiterleitung des durch die LOV-Domäne registrierten Lichtreizes zuständig ist.
Unter dem Begriff „Fluoreszenzprotein umfassend eine LOV-Domäne" soll im Folgenden ein Protein verstanden werden, das eine Light-Oxygen-Voltage (LOV) Domäne aufweist, bei der mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und bei der zudem neben dem Austausch des mindestens einen Cysteins wenigstens eine weiter Punktmutation vorliegt.
Die LOV Domänen Proteinen binden anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine die vom Wirtsorganismus bereitgestellten Cofaktoren FMN, FAD oder Riboflavin. Diese Moleküle werden sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten Sauerstoff-unabhängig synthetisiert.
Auf Basis bakterieller Photorezeptoren der LOV-Familie haben wir daraufhin eine neue Familie von FMN-bindenden Fluoreszenzreporterproteinen (FbFP) entwickelt. Bei den FbFPs handelt es sich um rekombinante Varianten bakterieller Blaulicht-Rezeptoren der LOV (Light-Oxygen- Voltage)-Familie. Anders als die GFP-ähnlichen Fluoreszenzproteine sind die neuen Fluoreszenzmarker sehr klein (16-19 kDa) und binden das vom Wirtsorganismus bereitgestellte Chromophor Flavin-Mononukleotid (FMN). Dieses Molekül wird sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten Sauerstoff-unabhängig synthetisiert. Um die FMN-abhängige Fluoreszenz der Blaulichtrezeptoren zu erhöhen und somit deren Verwendung als Fluoreszenzmarker zu ermöglichen, wurden die bakteriellen Proteine mittels moderner Verfahren, der sogenannten directed evolution, verändert. Durch diese Mutationen wurde die Autofluoreszenz der Proteine drastisch erhöht wodurch die FMN-bindenden Fluoreszenzproteine entstanden. Die photochemische Charakterisierung der neuen Markerproteine ergab, dass die FbFPs nach Anregung mit blauem Licht (450 nm) eine blaugrüne Fluoreszenz (495 nm) emittieren. Die neuen Markerproteine konnten in verschiedenen pro- und eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und die für FbFP charakteristische Fluoreszenz in vivo nachgewiesen werden.
Mit den „FMN-based fluorescence protein" (FbFP's) liegen mithin nun Fluoreszenzreporterproteine vor, die unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck fluoreszieren. Im Gegensatz zu Vertretern der GFP-Familie benötigt FbFP keinen Sauerstoff für die Ausbildung der Fluoreszenz. Unter dem Begriff „fluoreszieren können" soll im Folgen verstanden werden, das ein Fluoreszenzprotein durch Licht bestimmter Wellenlänger angeregt werden kann und/oder dass es die bei der Anregung aufgenommene Energie wieder abgeben kann.
Ungefähr 20 % der von Bakterien synthetisierten Polypeptide werden ganz oder teilweise aus dem Cytoplasma heraustransportiert. Bei vielen dieser Proteine handelt es sich um Hydrolasen, wie z.B. Lipasen, Proteasen oder Carbohydrasen, die dem Abbau natürlicher Substrate dienen. Dies dient vor allem der Anpassung der Bakterienzelle an veränderte Umweltbedingungen. Es werden aber auch Toxine oder Bestandteile von sogenannten„Quorum-Sensing-Systemen", die der Wahrnehmung der Populationsdichte dienen, aus Bakterienzellen herausgeschleust. Man unterscheidet hierbei zwischen dem Export und der Sekretion von Proteinen: Die zu exportierenden Proteine verbleiben, zumindest teilweise, innerhalb der äußeren Membran, während bei der Sekretion eine Freisetzung ins extrazelluläre Medium erfolgt. Über die derzeit bekannten Hauptmechanismen bakterieller Sekretion soll im Folgenden ein kurzer Überblick gegeben werden. Der Typ I- oder ABC-Sekretionsweg (ATP-Binding Cassette) wurde erstmals für die Sekretion von Hämolysin in Escherichia coli beschrieben. Dieses Transportsystem besteht aus drei Komponenten: an der inneren Membran befindet sich die ATP-Bindungskassette, die neben ihrer ATPase-Funktion auch für die Substratspezifität zuständig ist. Im periplasmatischen Raum befindet sich das Membrane-Fusion-Protein (MFP), das über eine große hydrophobe Domäne in der Cytoplasmamembran verankert ist und mit der dritten Komponente, dem Outer- Membrane-Protein (OMP) interagiert, welches sich in der äußeren Membran befindet. Es wird vermutet, dass diese drei Komponenten zusammen eine Adhäsionsstelle zwischen innerer und äußerer Membran bilden, wodurch eine Pore entsteht. Die ABC-Substrate, die sich von den meisten anderen sekretierten Proteinen durch ein nicht-abspaltbares, C-terminales Signalpeptid unterscheiden, werden in einem Schritt durch das Periplasma in das extrazelluläre Medium befördert. Beim allgemeinen Sekretionsweg (General Secretory Pathway, GSP) der Gramnegativen Bakterien, über den die meisten sekretorischen Proteine nach außen gelangen, wird das zu sekretierende Protein in zwei Schritten aus dem Cytoplasma in das umgebende Medium befördert: Im ersten Schritt wird das Präprotein unter Abspaltung seiner N-terminalen Signalsequenz über den See-Weg ins Periplasma transportiert. Von dort aus kann das Protein über die äußere Membran transportiert werden. Das Protein bindet an dem aus bis zu 14 verschiedenen Proteinen bestehenden „Main Terminal Brandl" des Allgemeinen Sekretionsweges. Einen anderen Mechanismus, im Rahmen des GSP aus dem Periplasma ins Außenmedium zu gelangen, nutzen die sogenannten Autotransporter: Nach ihrem Transport ins Periplasma via Sec-Sekretionsweg bildet die am C-Terminus gelegene ß-Domäne des Proteins einen aus mehreren amphipathischen ß-Faltblättern bestehenden Kanal in der äußeren Membran, durch welchen die N-terminale ß-Domäne des Proteins nach außen gelangen kann. Da Grampositive Organismen im Gegensatz zu den Gram-negativen nur über eine Cytoplasma-Membran verfügen, gelangen die meisten über den See-Weg transportierten Proteine direkt ins umgebende Medium. Zusätzlich zum See-System existiert sowohl in Gram-negativen als auch in Grampositiven Organismen der sogenannte Tat-Sekretionsweg, der wie der See -Weg Proteine über die Cytoplasma-Membran transportieren kann. Der größte Teil der von Bakterien sekretierten oder exportierten Proteine verlässt das Cytoplasma über den Sec-Translokationsweg. In dem Grampositiven Modellorganismus Bacillus subtilis können bis zu 300 verschiedene Proteine aus dem Cytoplasma transportiert werden; nur ein kleiner Teil nutzt dabei Transportwege wie das ABC- , Pseudopilin- oder Tat-Transportsystem, der größte Teil der exportierten Proteine wird über den See-Weg sekretiert. Die meisten der transportierten Proteine verfügen über ein N-terminales Erkennungssignal, die sog. Signalsequenz, deren Funktion darin besteht, die Proteine vom Ort ihrer Synthese zur Cytoplasmamembran zu dirigieren. Die typische Signalsequenz eines See- Substrates besteht dabei aus drei verschiedenen Domänen. Am N-Terminus befindet sich die sog. N-Domäne. Es wird vermutet, dass die postiven Ladungen (Arginin oder Lysin) mit negativen Ladungen der Membran-Phospholipide interagieren. Daran anschließend befindet sich die hydrophobe H-Domäne. Diese besteht aus hydrophoben Aminosäuren und kann eine a-helikale Struktur einnehmen. In 60 % der Fälle liegt im mittleren Bereich der H-Domäne eine helixbrechende Aminosäure (Prolin oder Glycin); dies erlaubt die komplette Membran- Insertion der H-Domäne nach dem sog„Hairpin-Mechanismus". Am Ende dieser Domäne finden sich meistens Prolin oder Glycin, was vermutlich die Abspaltung durch die Signalpeptidasen verbessert. Ein wichtiges Charakteristikum des See-Weges ist die Translokation ungefalteter Proteine, wobei der ungefaltete Zustand essentiell ist für die Translokationskompetenz eines Proteins. Mit Hilfe cytoplasmatischer Chaperone werden die synthetisierten Polypetide in einer ungefalteten Konformation stabilisiert und sind somit zum Transport geeignet. Zur Faltung der Proteine kommt es erst nach dem Transportvorgang. Eine wichtige Bedeutung kommt bei B. subtilis den extrazellulären Faltungskatalysatoren zu, da sich an der Membran-Zellwand- Grenzfläche eine Reihe von Proteasen befinden, so dass nicht oder nicht korrekt gefaltete Proteine schnell abgebaut werden. Ein Beispiel hierfür ist das extracytoplasmatisch lokalisierte Lipoprotein PrsA, das eine Sequenzähnlichkeit zu einer Peptidyl-Prolyl-c/s/frara-Isomerase aus E. coli zeigt und somit als Chaperon betrachtet werden könnte. Da manche Proteine für ihre korrekte Konformation auch auf die Bildung von Disulfid-Brücken angewiesen sind, werden im extrazellulären Bereich Thiol-Disulfid-Oxidoreduktasen benötigt. B. subtilis stehen zu diesem Zweck die Proteine BdbA, BdbB und BdbC zur Verfügung, wobei bislang nur ein extracytoplasmatisches Protein, ComC, bekannt ist, das eine Disulfidbrücke enthält. In E. coli werden im periplasmatischen Raum Disulfidbrücken mit der Hilfe des Dsb-Apparates gebildet, bestehend aus DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, DsbE und DsbG. Der größte Teil der in E. coli aus dem Cytoplasma exportierten Proteine nutzt den See-Weg zur Translokation. Um translokationskompetent zu sein, müssen die Substrate des See-Weges nach ihrer Synthese eine ungefaltete Konformation beibehalten. Für viele extracytoplasmatischen Proteine, die für ihre Funktion einen Cofaktor benötigen, stellt dies ein Problem dar, da die Bindung eines Cofaktors häufig mit der cytoplasmatischen Faltung des Proteins einhergeht. Bereits 1996 wurde ein spezieller Transportweg für Proteine mit redoxaktiven Cofaktoren in prokaryotischen Organismen postuliert, da viele periplasmatische Enzyme, die einen Cofaktor wie z.B. Molybdän oder FeS-Komplexe enthaltende, das Consensus-Motiv S/T-R-R-X-F-L-K in ihren Signalsequenzen zeigten. Einen derartigen Sekretionsweg fand man in den Thylakoid- Membranen von Chloroplasten in Form des pH-abhängigen Transportweges. Kurz darauf wurde in E. coli nachgewiesen, dass die periplasmatische Triethylamin-N-Oxid-Reduktase TorA, ein Molybdän-enthaltendes Enzym, unabhängig vom See-System aus dem Cyto- ins Periplasma transportiert werden konnte. Aufgrund der beiden Arginine in der Signalsequenz der auf diese Art sekretierten Substrate wurde dieser Weg als „Twin Arginine- Translocation" oder Tat- Sekretionsweg bezeichnet. Wie sich herausstellte, zeigte dieser Tat- Weg eine große Ähnlichkeit zu dem in Thylakoid-Membranen gefundenen pH-abhängigen Transportweg und zeichnete sich vor allem durch die Fähigkeit aus, bereits gefaltete Proteine zu transportieren. Wie auch beim Transportweg in den Thylakoid-Membranen zeigte sich beim bakteriellen Tat- Weg, dass die für die Translokation notwendige Energie allein aus der PMF stammt, die aus dem über der Cytoplasmamembran anliegenden Protonengradienten resultiert. Zusammen mit dem Transport gefalteter Proteine und den abweichenden Signalpeptiden stellt dies einen Hauptunterschied zum See-Weg dar. Wie auch beim See-System werden die Substrate des Tat- Weges mittels eines Signalpeptids am N-Terminus des zu sekretierenden Proteins zum Translokon dirigiert. Die Struktur des Signalpeptids entspricht der einer Sec-Signalsequenz. Das Tat-Signalpeptid wird in N-, H-, und C-Domäne unterteilt und ist mit 26 bis 58 Aminosäuren deutlich länger als die durchschnittliche Sec-Signalsequenz, wobei ein großer Teil der zusätzlichen Aminosäuren auf die N-Domäne entfällt. Die N-Domäne enthält die Aminosäuresequenz S-R-R-X-F-L-K, wobei die beiden Arginine hoch konserviert sind. Bislang sind nur zwei natürliche Tat-Substrate bekannt, die von diesem Motiv abweichen. Die übrigen Aminosäuren des Consensus-Motives kommen mit einer Häufigkeit von mehr als 50 % vor, wobei es sich bei X normalerweise um eine polare Aminosäure handelt. Es sollte des Weiteren angemerkt werden, dass die Tat-Signalsequenz allein nicht ausreichen muss, um ein Protein Tat-abhängig aus dem Cytoplasma zu befördern. Ein wichtiger Faktor ist der Faltungszustand des sich an der Signalsequenz befindenden Proteins, da un- oder missgefaltete Proteine oder Proteine mit fehlendem Cofaktor nicht exportiert werden. Das Tat-abhängig zu sekretierende Protein sollte also nach Möglichkeit nicht mit Chaperonen des See-Systems interagieren und muss in der Lage sein, cytoplasmatisch gefaltet zu werden. Über das aus den identifizierten Tat- Komponenten gebildete Translokon ist, im Vergleich zum See- Weg, bisher eher wenig bekannt. Es wird postuliert, dass TatA, B und C in der Membran in zwei verschiedenen Komplex-Formen (TatAB und TatBC) vorliegen, die sich im Fall einer Translokation zum fertigen Translokon, bestehend aus TatA, B und C zusammenlagern, wobei dieser Komplex nur einen vorübergehenden Zustand darstellt. Dabei sollte dem TatBC-Komplex die Rolle des Signalpeptid-Rezeptors zukommen, während TatA nach der Bindung des Signalpeptides an TatBC die für die Translokation notwendige wassergefüllte Pore bilden sollte. Bei einem Ausfall des Tat-Systems Tat-Substrate akkumulieren in der Membran und könnten so zu dem beobachteten Phänotyp der Kettenbildung führen, der bei Tat-Mutanten auftritt. In vivo Fluoreszenzreporter finden, wie bereits erwähnt, in der Grundlagenforschung sowie in der Biotechnologie weitgefächerte Anwendung. Jedoch weisen Vertreter der GFP-Familie in Hinblick auf Sekretionsstudien einen entschiedenen Nachteil auf: Es konnte gezeigt werden, dass das fluoreszierende Protein GFP mit Hilfe des Tat-Sekretionsweges in einer aktiven Form ins Periplasma von E. coli befördert werden kann. Allerdings ist es bis jetzt nicht gelungen, die gängigen Vertreter der GFP-Familie aktiv über den See- Weg zu sekretieren, so dass sie im Periplasma eine deutliche Fluoreszenz ausbildet. Dies liegt zum einen an den reduzierenden Bedingungen, die im Periplasma vorherrschen, zum anderen bilden die Cystein-Reste bei der Faltung im Periplasma Disulfidbrücken-Bindungen aus, sodass es nicht zu einer korrekten Faltung der FPs im Periplasma kommen kann. In Folge dessen lässt sich das Protein zwar mittels Western Blot Analysen im Periplasma detektieren, es liegt allerdings nicht in einer nativen und somit fluoreszenzaktiven Konformation vor.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Fluoreszenzmarkierung im Periplasma anzugeben. Desweiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Fluoreszenzmarker anzugeben, der in aktiver Form, also in anregbarer Form, aus dem Cytoplasma eines Wirtsorganismus ausgeschleust bzw. translokiert werden kann.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung gemäß Anspruch 1, sowie das Verfahren gemäß Anspruch 14.
Es wird somit die Verwendung eines Fluoreszenzproteins als Sektretionsmarker vorgeschlagen, wobei das Fluoreszenzprotein eine LOV-Domäne aufweist, bei welcher mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, ersetzt ist, die kein FMN kovalent bindet.
Im Gegensatz zum GFP, dessen fluorophore Gruppe durch einen autokatalytischen Prozess gebildet wird, benötigen FbFPs für ihre Fluoreszenz den Cofaktor FMN. Da dieser Cofaktor nicht kovalent gebunden wird und in dem Protein kein Cystein vorhanden ist macht dies die FbFPs zu potentiellen See- bzw. Tat-Sekretionsmarker für Bakterien. Als Protein, dass für seine Funktion einen Cofaktor benötigt, welcher vom Medium ins Periplasma gelangt, und korrekt gefaltet sein muss, stellen die FbFPs optimale Proteine für den See- und Tat- Weg dar. Um die Möglichkeit zur See- und Tat-abhängigen Sekretion der FbFPs in E. coli zu prüfen, wurden eine See- und eine Tat-Signalsequenz an das EcFbFP (SEQ-ID 1) fusioniert. Als Signalsequenz des See-Weges diente die PelB -Signalsequenz, zur Tat-abhängigen Sekretion wurde die Signalssequenz von TorA verwendet.
Ein Sekretionsmarker im Sinne der vorliegenden Erfindung ist dabei insbesondere eine Marker, welcher zur Detektion einer Sekretion eines Proteins, eines Enzyms und/oder eines Antikörpers aus einem Wirtsorganismus genutzt werden kann. Dabei kann die Detektion das grundsätzliche vorliegen einer Sekretion und/oder deren Effizienz betreffen.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung ist in der LOV-Domäne mindestens ein Cystein gegen Alanin ausgetauscht.
Weiter bevorzugt ist, dass die LOV-Domäne neben dem Austausch des mindestens einen Cystein wenigstens eine weitere Punktmutation aufweist. Die Einführung einer solchen Punktmutation führt bevorzugt zu einer Verbesserung der Photostabilität und/oder zur Veränderung der Fluoreszenzwellenlänge. Dies ermöglicht eine differenzierte Analyse und Beobachtung der ausgeschleusten fluoreszenzfähigen Sekretionsmarker.
Beispiele für geeignete Punktmutationen sind beispielsweise Punktmutation aus der Gruppe bestehend aus I29V, S91G, Y112F, E138G, L7P, F124L, N26Y, Y112H, I48T, H61Y, Y43F, Y112C, E12D, Q143L, A36T, Q57H, N95I, E22K, E71G, K88S, L109V und Q116L.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird das Fluoreszenzprotein mit einer LOV- Domäne a) kodiert durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 1 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, c) kodiert durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, e) kodiert durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist, oder
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
Unter dem Begriff „Nukleinsäure" soll im Folgenden ein einzel- oder doppelsträngiges Makromolekül verstanden werden, das aus Nukleotiden aufgebaut ist. Die geläufigsten Nukleinsäuren sind Desoxyribonukleinsäure (DNA) bzw. complementary DNA (cDNA) und Ribonukleinsäure (RNA). In der DNA kommen die Nukleinbasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin vor, wobei letztere spezifisch für DNA ist. In der RNA kommen bis auf Thymin, das durch Uracil ersetzt ist, dieselben Nukleinbasen bzw. Nukleotide vor. Künstliche Nukleinsäuren sind beispielsweise Peptide Nucleic Acid (PNA), Morpholino und Locked Nucleic Acid (LNA), sowie Glycol Nucleic Acid (GNA) und Threose Nucleic Acid (TNA). Jede dieser Nukleinsäuren unterscheidet sich im Aufbau des Rückgrats von natürlich vorkommenden Nukleinsäuren.
Unter dem Begriff „komplementär" soll die zu der benutzten/diskutierten Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure verstanden werden. Dies ist ein bedeutendes Konzept der Molekularbiologie, da es sich um eine wichtige Eigenschaft doppelsträngiger Nukleinsäuren wie DNA, RNA oder DNA:RNA Duplexe handelt. Der eine Strang ist zu dem anderen komplementär, da die Basenpaare der beiden Stränge nicht-kovalent über zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Im Prinzip - es gibt Ausnahmen für Thymin/Uracil und den Wobble-Komplex der tRNA - gibt es nur eine komplementäre Base für jede Base einer Nukleinsäure. Daher ist es möglich, den komplementären Strang eines einzeln vorliegenden Strangs zu rekonstruieren. Dies ist z.B. für die DNA Replikati on essentiell. Beispielsweise wäre der komplementäre Strang der DNA Sequenz 5' A G T C A T G 3'
3' T C A G T A C 5'.
Im Fall der DNA kann sich der Begriff "komplementär" auch auf cDNA beziehen. cDNA wird mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA z.B. mRNA synthetisiert.
Unter dem Begriff „hybridisieren" bzw. Hybridisierung wird im Folgenden der Vorgang verstanden, bei dem sich an eine Nukleinsäure eine mehr oder weniger vollständig komplementärer Nukleinsäure anlagert, indem Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den jeweils komplementären Nukleinbasen ausgebildet werden.
Unter dem Begriff„unter stringenten Bedingungen hybridisieren" wird im Folgenden verstanden, dass die Bedingungen der Hybridisierungsreaktion so eingestellt sind, dass nur vollständig zueinander komplementäre Basen Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Die Stringenz kann beispielsweise durch die Temperatur beeinflusst werden.
Unter dem Begriff„stille Mutation" soll im Folgenden das Phänomen verstanden werden, dass eine Mutation in einem Nukleinsäure Abschnitt keine Konsequenzen nach sich zieht. Dies ist der Fall, da der Informationsgehalt des Gens sich nicht verändert hat, weil eine Reihe von Aminosäuren durch verschiedene Dreiergruppen aufeinanderfolgender Nukleinbasen - Tripletts oder Codons genannt - kodiert werden.
Der Begriff „Fragment" soll im Folgenden einen Teil einer Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz bezeichnen, dem einige Teile einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. einer Aminosäurensequenz fehlen, der aber zumindest einen Teil seiner Aktivität z.B. in Bezug auf Fluoreszenzeigenschaften, Enzymaktivität oder Bindung zu anderen Molekülen behält.
Der Begriff "Variante" soll im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz bezeichnen, die in ihrer Struktur und biologischen Aktivität im Wesentlichen der Struktur und biologischen Aktivität einer beanspruchten Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz gleicht. Unter dem Begriff „Derivat" wird im Folgenden eine verwandte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verstanden, die in Bezug auf ein Zielmolekül gleichartige Charakteristika hat wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „Homolog" wird im Folgenden eine Nukleinsäure bzw. eine Aminosäurensequenz verstanden, in deren Sequenz im Vergleich zu der Sequenz eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz mindestens ein Nukleotid bzw. eine Aminosäure hinzugefügt, gelöscht, substituiert oder auf andere Weise modifiziert wurde. Vorraussetzung ist allerdings, dass das Homolog im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften aufweist wie eine beanspruchte Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz.
Unter dem Begriff „für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert" soll im Folgenden verstanden werden, dass eine Nukleinsäure an den Codongebrauch des Organismus, in dem sie exprimiert wird, angepasst wird. Der Codongebrauch auch die Codon Usage bzw. der Codon Bias, beschreibt das Phänomen, dass Varianten des universellen genetischen Codes von verschiedenen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden.
Unter dem Begriff „Sequenzidentität von mindestens X%" wird im Folgenden eine Sequenzidentität verstanden, die durch ein Sequenzabgleich (Alignment) mittels eines BLAST Algorithmus, wie er auf der Homepage des NCBIs zur Verfügung steht, bestimmt wurde.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung das Fluoreszenzprotein eine Größe zwischen >16kDa und <19kDa auf.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist das Fluoreszenzprotein eine Anregungswellenlänge zwischen >430nm und <470nm, vorzugsweise 450nm auf. Dabei ist es weiter bevorzugt, dass das Fluoreszenzprotein ein Emissionsmaximum zwischen >470nm und <520nm, vorzugsweise 495nm aufweist. Das Fluoreszenzprotein wird gemäß einer weiter bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung in einer Wirtszelle exprimiert oder co-exprimiert und in das Periplasma und/oder in ein extrazelluläres Medium sekretiert wird. Dabei umfasst das Coexprimieren im Sinne der Erfindung die Expression als Fusionsprotein sowie die parallele Expression zusammen mit weiteren Proteinen. Dabei ist es bevorzugt vorgesehen, dass das Fluoreszenzprotein an seinem N- Terminus eine Signalsequenz aufweist. Als Signalsequenz kann das als Sekretionsmarker einsetzbare Fluoreszenzprotein beispielsweise eine PelB- oder TorA-Signalsequenz aufweisen.
Insbesondere ist es dabei bevorzugt, dass das Fluoreszenzprotein mit einer LOV-Domäne a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 2 oder 3 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist, oder
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
In einer bevorzugten Anwendung der Verwendung wird ein in einem Organismus exprimierter Antikörper mit einem Fluoreszenzprotein markiert wird, welches eine LOV-Domäne aufweist, bei welcher mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise Alanin, ersetzt ist, die kein FMN kovalent bindet. Dies erlaubt die Überprüfung, ob durch die Anwendung von Faltungshelfer, wie beispielsweise Chaperonen, eine Ausschleusung eines Antikörpers in z.B. das Periplasma in einer gewünschten Weise erfolgt. Hierzu kann es vorgesehen sein, dass das Fluoreszenzprotein mit einem Zielprotein fusioniert wird, um den Transport des Zielproteins (Antikörper) über die Membran mittels fluoreszenzmikroskopischer oder -spektroskopischer Methoden zu detektieren. Dies ist von Bedeutung für die Detektion beispielsweise von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die in Gram negativen Bakterien (wie z.B. E. coli) in das oxidierende Periplasma sekretiert werden müssen, um dort die notwendigen Disulfidbrücken auszubilden. Eine weitere Anwendung ist die Detektion im Rahmen von Hochdurchsatz-Screening Verfahren.
Desweiteren wird mit der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Sekretionsmarkers vorgeschlagen, wobei ein Plasmid, welches eine für ein Fluoreszenzprotein kodierende Ribonucleinsäure aufweist, mittels gentechnischer Methoden in einen Organismus, vorzugsweise ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida und Bacillus subtilis, eingebracht und dort exprimiert wird, wobei das Fluoreszenzprotein
a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 1, 2 oder 3 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist, oder f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
Dabei ist es in einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens vorgesehen, dass als Expressionsvektor wenigstens ein Vektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pRhotHi-2 und pHSG575 genutzt wird.
Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Figuren und der jeweiligen Beschreibung näher erläutert. Dabei zeigt
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Sekretionsreportergenfusionen;
Fig. 2 ein Klonierungsschema zur Erstellung der See-, und Tat-Sekretionsfusionen am Beispiel von EcFbFP;
Fig. 3 eine Lokalisationsstudie mittels Fluoreszenzmikroskop; und
Fig. 4 eine weitere Lokalisationsstudie mittels Fluoreszenzmikroskop.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Sekretionsreportergenfusionen. An dem Reportergen wurde sowohl eine PelB Signalsequenz (2) als auch eine TorA Signalsequenz (3) N- terminal fusioniert. Die Reportergenfusionen stehen unter der Kontrolle des Lac-Promotors.
Um die Sekretionsfähigkeit des Fluoreszenzreporterproteins im Vergleich zu YFP (SEQ-ID 4) zu testen, sollten diese zunächst in den Expressionsvektor pRhotHi-2 und anschließend in den Expressionsvektor pHSG575 kloniert werden. Der Expressionsvektor pRhotHi-2 besitzt ein weites Wirtsspektrum wegen des Replikationsurspungs (rep-Region,„broad host ränge origin of replication") aus pBBRIMCS und kann z.B. in R. capsulatus verwendet werden. Das pBBRIMCS-Derivat enthält zu Selektionszwecken ein Chloramphenicol-Resistenzgen und ein Kanamycin-Resistenzgen (aphll). Für eine mögliche Anwendung der Fusionen in R. capsulatus ermöglicht eine mob-Region den Plasmidtransfer mittels Konjugation über den E.coli-Stamm S17-1, welcher als Donorstamm fungiert, in den R.capsulatus-Stamm BIOS und B10S-T7. Zur Expression der Reporterproteine verwendet dieses einen T7-Polymerase-abhängigen Promotor. Die ausgewählten Signalsequenzen des See- und Tat-Sekretionsweges pelB und torA und die jeweiligen Reporterproteine wurden hierbei stromabwärts von dem T7-Promotor in den Expressionsvektor pRhotHi-2 kloniert (Klonierungsstrategie siehe Fig.2). Im Falle des pelB mussten nur noch die jeweiligen Reporterproteine mittels Restriktionshydrolyse hinter die Sec- Signalsequenz kloniert werden, da sich diese bereit in dem Vektor pRohtHi-2 befand.
Zur Synthese des Expressionsplasmids mit der Tat-Sekretionssequenz wurde das torA mittels PCR mit spezifischen Oligonukleotidstartermolekülen („Primer") amplifiziert und mit einer Ndel- am 5 '-Ende, und einer BamHI-Schnittstelle am 3 '-Ende versehen, wobei die Sequenz der Ndel-Schnittstelle gleichzeitig für das Startkodon AUG kodiert. Als Matrize für die PCR- Reaktion diente hierbei die genomische DNA des E.coli kl2-Stammes. Das Fluoreszenzreportergen YFP (SEQ-ID 4) wurden ebenfalls mittels PCR amplifiziert, und zusätzlich die Schnittstellen BamHI und Xhol mittels spezifischen Primern eingefügt. Das Stopkodon wurde in beiden Fällen eliminiert, da sich im Plasmid pRhotHi-2 stromabwärts von den Fusionen eine Sequenz befindet, die für einen His-Tag codiert, mit dem die exprimierten Proteine in späteren Versuchen eventuell aufgereinigt werden könnten. Durch einen BamHI/XhoI-Doppel verdau wurden die See- bzw. Tat-Fusionen in dem hydrolysierten Vektor pRhotHi-2 kloniert und anschließend in den Bakterienstamm E.coli DH5a transformiert.
Das positive Ergebnis der Klonierung wurde mittels einer Restiktionsanalyse bestätigt und per Sequenzierung überprüft. Als Expressionskontrolle wurden die jeweiligen Konstrukte ohne Signalsequenz verwendet.
Fig. 2 zeigt ein Klonierungsschema zur Erstellung der See-, und Tat-Sekretionsfusionen am Beispiel von EcFbFP (SEQ-ID 1). Verdeutlich wurde hier die Klonierungsstrategie anhand des EcFbFP (SEQ-ID 1), durchgeführt wurde diese gleichermaßen mit YFP (SEQ-ID 4). Im Falle der See-Fusion wurde das PCR-Produkt des Reporterproteins mittels BamHI/XhoI Doppelrestriktion in den hydrolysierten Vektor pRhotHi-2 kloniert. Zusätzlich zu der Klonierung der Tat-Fusion, welche analog zu der See-Fusion kloniert wurde, wurde vorab das PCR-Produkt der Tat- Sekretionssignalsequenz torA mittels Ndel/BamHI Doppelrestiktion in den hydrolysieren Vektor kloniert. Die Expression der Konstrukte erfolgte zunächst unter der Kontrolle des induzierbaren Lac- Promotors im Vektor pHSG575, der eine geringe Kopienzahl in E. coli aufweist. Somit sollte sichergestellt werden, dass die Sekretion des jeweiligen Reporterprotein nicht durch eine zu starke Überexpression beeinträchtig wird, was zur Inclusion body Bildung führen würde. Zusätzlich trägt der Vektor das Gen für eine Resistenz gegenüber Chloramphenicol, um so einen Selektionsdruck aufrecht zu erhalten. Als Expressionskontrolle diente das EcFbFP (SEQ-ID 1), an dessen 5 '-Ende keine Signalsequenz angefügt wurde.
Hierzu wurden die Sekretionsmarkerkonstrukte in den Vektor pHSG575 kloniert. Zur Synthese des Expressionsplasmids mit den jeweiligen Sekretionsmarkerkonstrukten wurde das EcFbFP (SEQ-ID 1), das EcFbFPsec (SEQ-ID 2) und das EcFbFPtat (SEQ-ID 3) Gen aus dem jeweiligen pRhotHi-2 Konstruktes mittels PCR amplifiziert und mit einer Sa/I-Schnittstelle am 5 '-Ende und einer Psil-Schnittstelle am 3 '-Ende mittels spezifischen Primern versehen. Die mit den jeweiligen Restriktionsendonukleasen hydrolysieren PCR-Produkte wurden in den ebenfalls hydrolysierten Vektor pHSG575 kloniert und die erfolgreiche Klonierung mittels Sequenzierung überprüft.
Der Nachweis der See- und Tat-abhängigen Sekretion des FbFPs und des YFP's (SEQ-ID 4) erfolgte mittels fluoreszenzmikroskopischer Analyse, sowie mittels immunologischem Nachweis der Proteinakkumulation durch Western Blot.
Um die Sekretion der FbFPs in den periplasmatischen Raum nachweisen zu können, wurde die Lokalisation der Fluoreszenzreporter optisch durch das Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan 2 imaging mit Apotome, Objektiv Apochromat 100 oil 1.4; Fluoreszenzfilter Ex: 380/14 Em: 494/20) in vivo ermittelt. Hierzu wurden die Konstrukte im E.coli Stamm MC4100 und im E.coli Stamm DADE in Autoinduktionsmedium (5 g/1 glycerol, 12 g/1 tryptone, 24 g/1 yeast extract, 2.32 g/1 KH2P04, 12.5 g/1 K2HPO4 (pH 7.2), lactose 2 g/1, glucose 0.5 g/1) und dem Antibiotikum Chloramphenicol über Nacht angezogen, wodurch eine automatische Induktion der gezielten Genexpression erreicht wird, sobald die vorhandene Glucose verstoffwechselt ist und der Lac- Promoter nicht mehr inhibiert, sondern durch die Lactose induziert wird. Bei dem DADE-Stamm handelt es sich um eine TatA-E Deletionsmutante, um nachweisen zu können, das die Sekretionsmarkerkonstrukte welche mit der Signalsequenz des Pelb's fusioniert sind, ausschließlich über den Sec-Sekretionsweg transloziert werden und nicht über den Tat- Sekretionsweg zusätzlich ins Periplasma gelangen.
Fig. 3 zeigt eine Lokalisationsstudie mittels Fluoreszenzmikroskop. Dargestellt sind Fluoreszenzaufnahmen der jeweiligen Sekretionskonstrukte von EcFbFP (SEQ-ID 1) einschließlich der Expressionskontrolle (LOV) in E.coli MC 4100 und DADE Zellen. Untersucht wurden jeweils 3μ1 Zellkultur bei einer o.D.580=l,5. (100 fache Vergrößerung).
Man erkennt in Fig. 3 deutliche Unterschiede in der Lokalisation des EcFbFP (SEQ-ID 1) gegenüber den FbFP mit See- bzw. Tat-Signalsequenz. Während die FbFPs ohne Signalsequenz gleichmäßig im Cytoplasma der E.co/z-Zelle verteilt vorliegen, lassen sich die FbFPs mit der Sec- und Tat Signalsequenz nur in dem äußeren Ring der jeweiligen Zellen nachweisen. Weiterhin zu erkennen ist, dass die EcFbFPtat (SEQ-ID 3) Proteine in der DADE-Mutante nicht ins Periplasma gelangen, während die Sekretionsmarkerproteine in den Wildtypzellen MC 4100 sehr wohl transloziert werden. Dies deutet auf eine sec/tat vermittelte Lokalisation des EcFbFPs (SEQ-ID 1) im Periplasma hin. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Fluoreszenzreporter der FbFP- Familie erstmals die Untersuchung von sekretorischen Prozessen des See- und Tat- Wegs in Bakterien ermöglichen.
Als Kontrolle wurde das YFP (SEQ-ID 4) und das YFP (SEQ-ID 5) in E.coli BL21(DE3)-Zellen im Expressionsvektor pRhotHi-2 in Autoinduktionsmedium exprimiert und mögliche Fluoreszenzen im Fluoreszenzmikroskop detektiert um die Sekretionsfähigkeit des YFP (SEQ-ID 4) über dem See-Weg ausschließen zu können.Wie man anhand der Fig.4. erkennt, liegt nur im Fall des cytoplasmatischen YFP's (SEQ-ID 4) in der Expressionskontrolle eine erwartete aktive Fluoreszenz vor. Im Falle des YFP (SEQ-ID 5) ist wie erwartet keine Fluoreszenz zu erkennen, was darauf schließen lässt das sich das YFP (SEQ-ID 4) nicht als Sekretionsmarker eignet, da es nicht in aktiver fluoreszierender Form im Periplasma vorliegt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Fluoreszenzproteins als Sektretionsmarker, wobei das
Fluoreszenzprotein eine LOV-Domäne aufweist, bei welcher mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure, ersetzt ist, die kein FMN kovalent bindet.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , wobei in der LOV-Domäne mindestens ein Cystein gegen Alanin ausgetauscht ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die LOV-Domäne neben dem Austausch des mindestens einen Cystein wenigstens eine weitere Punktmutation aufweist.
4. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein mit einer LOV-Domäne a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 1 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat dieser Sequenz,
b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist,
d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
5. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein eine Größe zwischen >16kDa und <19kDa aufweist.
6. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein eine Anregungswellenlänge zwischen >430nm und <470nm, vorzugsweise 450nm aufweist.
7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein ein Emissionsmaximum zwischen >470nm und <520nm, vorzugsweise 495nm aufweist.
8. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein in einer Wirtszelle exprimiert oder co-exprimiert und in das Periplasma und/oder in ein extrazelluläres Medium sekretiert wird.
9. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzprotein an seinem N-Terminus eine Signalsequenz aufweist.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Fluoreszenzprotein als Signalsequenz eine PelB- oder TorA-Signalsequenz aufweist.
11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Fluoreszenzprotein mit einer LOV-Domäne a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 2 oder 3 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen, b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist, d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
12. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein in einem Organismus exprimierter Antikörper mit einem Fluoreszenzprotein markiert wird, welches eine LOV-Domäne aufweist, bei welcher mindestens ein Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, die kein FMN kovalent bindet.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei eine Beobachtung der Sektretion oder Lokalisation des Antikörpers in das Persiplasma eines Organismus oder den extrazellulären Raum mittels der Anregung des Fluoreszenzproteins durch Licht mit einer Wellenlänge zwischen >430nm und <470nm, vorzugsweise 450nm erfolgt.
14. Verfahren zur Herstellung eines Sekretionsmarkers, wobei ein Plasmid, welches eine für ein Fluoreszenzprotein kodierende Ribonucleinsäure aufweist mittels gentechnischer Methoden in einen Organismus, vorzugsweise ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Rhodobacter capsulatus, Pseudomonas putida und Bacillus subtilis, eingebracht und dort exprimiert wird, wobei das Fluoreszenzprotein
a) kodiert wird durch eine Nukleinsäure der SEQ ID 1, 2 oder 3 oder ein Fragment, eine Variante, ein Homolog oder Derivat einer dieser Sequenzen,
b) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu einer der Nukleinsäuren aus a) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
c) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die wenigsten 70% bevorzugt 95% Identität mit einer der Nukleinsäuren aus a) oder b) aufweist, d) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die zu der komplementären Nukleinsäure einer der Nukleinsäuren aus a) - c) unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann,
e) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu den Nukleinsäuren aus a)-d) wenigstens eine stille Mutation eines einzelnen Nukleotids (wie es die Degeneration des genetischen Codes erlaubt) aufweist,
f) kodiert wird durch eine Nukleinsäure, deren Code im Vergleich den Nukleinsäuren aus a)-e) für ein bestimmtes Expressionssystem optimiert wurde.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei als Expressionsvektor wenigstens ein Vektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pRhotHi-2 und pHSG575 genutzt wird.
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