DE60216245T2

DE60216245T2 - Funktionelles oberflächendisplay von polypeptiden

Info

Publication number: DE60216245T2
Application number: DE60216245T
Authority: DE
Inventors: Joachim Jose; Franck Hannemann; Rita Bernhardt
Original assignee: UNIVERSITAET DES SAARLANDES WISSENS- und TECHNOLOGIETRANSFER GmbH; Universitat Des Saarlandes Wissens- und Technologietransfer GmbH; Universitaet des Saarlandes
Current assignee: Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2022-03-02
Also published as: DK1373571T3; AU2002249249A1; EP1373571A2; DE60216245D1; WO2002070645A3; US20040259151A1; WO2002070645A2; ATE346168T1; EP1373571B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Exponieren von rekombinanten funktionellen Polypeptiden enthaltend eine prosthetische Gruppe und/oder eine Mehrzahl von Untereinheiten auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wobei die Transporterdomäne eines Autotransporters verwendet wird.
Oberflächenexposition von aktiven Proteinen auf lebenden Zellen stellt mehrere Vorteile in biotechnologischen Anwendungen bereit. Wenn derartige Zellen als Ganzzell-Biokatalysatoren oder Ganzzell-Biofabriken verwendet werden, braucht ein Substrat, welches verarbeitet werden soll, eine Membranbarriere nicht zu kreuzen, sondern hat freien Zugang. Wenn es überdies mit einem Träger (der Zelle) oder einfach einer biologische Matrix verbunden ist, kann der oberflächenexponierte Biokatalysator gereinigt, stabilisiert und in industriellen Verfahren angewendet werden, wobei es besser als ein freies Molekül wie in den meisten Fällen ist. Die Verwendung einer zellulären Oberflächenexposition beim Bilden und Screenen von Peptid- oder Proteinbibliotheken zur Durchführung einer Laborevolution hat einen anderen Nutzen. Durch Selektieren der korrekten Struktur, welche auf der Oberfläche exprimiert wird, wird die korrespondierende intrinsische Markierung (Gen) ko-selektiert und kann in weiteren Studien und Anwendungen verwendet werden. Deshalb ist der Bedarf von Systemen, welche die Oberflächenexposition eines breitesten Spektrums von verschiedenen Proteinen erlauben, offensichtlich und erreicht eine immer größere Bedeutung in typischen biochemischen oder bioorganischen Anwendungsgebieten wie z. B. dem Konstruieren von Enzymen oder der Wirkstoffentdeckung.
Deshalb bringt eine Oberflächenexposition von rekombinanten Proteinen auf lebenden Zellen vielversprechende Optionen gerichtet auf zukünftige biotechnologische Anwendungen hervor, z. B. Ganzzell-Biofabriken oder maßgeschneiderte Enzyme durch Laborevolution (1). Verschiedene Systeme wurden für die Oberflächenexposition von heterologen Proteinen in Hefe (2, 3), grampositiven (4, 5) und gramnegativen Bakterien (6) angewendet. Neben anderen Systemen (7–14) ist Autoexposition ein sehr eleganter Weg zum Exprimieren eines rekombinanten Proteins auf der Oberfläche eines gramnegativen Bakteriums (15, 16). Autoexposition basiert auf dem Sekretionsmechanismus der Autotransporter-Proteinfamilie (17–19). Diese Proteine werden als Polyproteinvorläufer synthetisiert, welche strukturelle Voraussetzungen enthalten, welche für eine Sekretion hinreichend sind (20). Sie kreuzen die innere Membran, wobei sie ein typisches Signalpeptid ganz am N-Terminus verwenden. Wenn sie das Periplasma erreichen, faltet sich der C-terminale Teil des Vorläufers in die äußere Membran als eine porinähnliche Struktur, ein sogenanntes β-Fass (15, 21, 22). Durch diese Pore wird die N-terminal gebundene Passagierdomäne auf die Oberfläche transloziert. Dort könnte es abgespalten werden – entweder autoproteolytisch oder durch eine zusätzliche Protease – oder bleibt durch die Transporterdomäne mit der Zellhülle verankert (23). Ersetzen des natürlichen Passagiers durch ein rekombinantes Protein führt zu ihrer korrekten Oberflächentranslokation (15, 16, 24–27). Für diesen Zweck muß ein künstlicher Vorläufer durch Gentechnik konstruiert werden, welcher aus einem Signalpeptid, dem rekombinanten Passagier, dem β-Fass und einer dazwischenliegenden verbindenden Region besteht, welche gebraucht wird, um einen vollen Oberflächenzugang zu erzielen (21). Der AIDA-I-Autotransporter wurde auf diese Weise für eine wirksame Oberflächenexposition von verschiedenen Passagierdomänen (15, 16, 27, 28) erfolgreich verwendet. Bis heute war jedoch die Autotransporter-vermittelte Oberflächenexposition auf monomere Proteine beschränkt, welchen jegliche nicht-proteinartige Kofaktoren fehlten. Dies kann durch die Tatsache verursacht sein, dass eine Polypeptidkette, welche über den Autotransporterweg transportiert werden soll, in einer relaxierten entfalteten Konformation vorliegen muss.
Das Ferredoxin von Rinder-Nebennierenrinde, bezeichnet als Adrenodoxin (Adx), gehört zu den [2Fe-2S]-Ferredoxinen, einer Familie von kleinen sauren Eisen-Schwefel-Proteinen, welche in Bakterien, Pflanzen und Tieren gefunden werden können (29). Es spielt eine essentielle Rolle im Elektronentransport von Adrenodoxin-Reduktase (AdR) zu Cytochromen P450 der Mitochondrien, welche in die Synthese von Steroidhormonen involviert sind (1) (30). Überdies spielen Cytochrome P450 eine essentielle Rolle in der Biosynthese von Prostaglandinen oder sekundären Metaboliten von Pflanzen und Mikroorganismen, als auch in der Detoxifizierung eines weiten Bereichs von fremden Verbindungen wie Wirkstoffen oder chemischen Schadstoffen (41). Der Eisen-Schwefel-Cluster von Adx ist durch vier Schwefelatome von den Seitenketten von vier seiner fünf Cysteinreste koordiniert (31). Rinder-Adrenodoxin wird durch ein Kerngen kodiert, im Zytoplasma synthetisiert und nach Aufnahme in die Mitochondrien verarbeitet. Der Mechanismus der Eisen-Schwefel-Cluster-Aufnahme ist noch nicht klar, es kann jedoch während einer heterologen Expression in E. coli im Zytoplasma als auch im Periplasma (32) assembliert werden.
In der vorliegenden Anmeldung berichten wir über die Konstruktion eines Fusionsproteins umfassend ein Signalpeptid, ein monomeres Adx und die Transporterdomäne von AIDA-I und ihre wirksame und stabile Oberflächenexposition. Auf der Oberfläche konnte der Eisen-Schwefel-Cluster durch ein Einschrittverfahren eingeschlossen werden, was ein funktionelles Adx ergab. Wir zeigen zum ersten Mal, dass eine Autoexposition auf Proteine angewendet werden kann, welche anorganische Kofaktoren enthalten, und dass diese Proteine auf der Zelloberfläche sogar für große Liganden oder Partnerproteine wie Adrenodoxin-Reduktase oder Cytochrome P450 frei zugänglich sind. Daher konnten wir z. B. ein Ganzzell-Biokatalysatorsystem umfassend Adx, Adrenodoxin-Reduktase und P450 CYP11A1 erhalten, welches wirksam Pregnenolon aus Cholesterin synthetisierte. Hinzufügen von künstlichen Membranbestandteilen oder Detergenzien, welche früher unerläßlich waren, um funktionelle steroidale P450-Enzyme zu erhalten, war nicht notwendig. Diese Untersuchung öffnet die Tür für weitere Dimensionen in der Anwendung von Autoexposition, entweder in der evolutiven Konstruktion von katalytischen Biomolekülen oder für neue Ganzzellfabriken.
Daher ist ein erster erfindungsgemäß Aspekt ein Verfahren zur Exposition eines rekombinanten Polypeptids enthaltend eine prosthetische Gruppe auf der Oberfläche einer Wirtszelle umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Wirtszelle transformiert mit einer Nukleinsäurefusion operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz, wobei die Nukleinsäurefusion umfasst: (i) einen Anteil kodierend ein Signalpeptid, (ii) einen Anteil kodierend das rekombinante Polypeptid, welches exponiert werden soll, (iii) gegebenenfalls einen Anteil kodierend eine Proteaseerkennungsstelle, (iv) einen Anteil kodierend einen Transmembranlinker, und (v) einen Anteil kodierend die Transporterdomäne eines Autotransporters,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen die Nukleinsäurefusion exprimiert wird und das Expressionsprodukt umfassend das rekombinante Polypeptid auf der Oberfläche der Wirtszelle exponiert wird, und
(c) Inkontaktbringen des rekombinanten Polypeptids mit einer prosthetischen Gruppe unter Bedingungen, unter denen die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid verbunden wird und ein funktionelles rekombinantes Polypeptid enthaltend die prosthetische Gruppe gebildet wird.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Polypeptide zu exponieren, z. B. Enzyme, welche für die Funktion eine prosthetische Gruppe auf der Oberfläche einer Wirtszelle benötigen. Die prosthetische Gruppe kann mit dem rekombinanten Polypeptid auf der Oberfläche der Wirtszelle, auf einer Membranpräparation abgeleitet von der Wirtszelle oder nach Spaltung des rekombinanten Polypeptids von der Wirtszelle oder einer Membranpräparation davon kombiniert werden. Das Verfahren, worin die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid kombiniert wird, kann Wärmebehandlung, z. B. Wärmen, und/oder eine chemische Behandlung, z. B. Reduktion, Oxidation und/oder pH-Einstellung umfassen. Es sollte angemerkt werden, dass ebenso eine Mehrzahl von prosthetischen Gruppen, welche identisch oder verschieden sein können, mit dem rekombinanten Polypeptid kombiniert werden können.
Die prosthetische Gruppe kann aus beliebigen nicht-proteinartigen Bestandteilen ausgewählt werden, von welchen bekannt ist, dass sie als eine prosthetische Gruppe wirken. Zum Beispiel kann die prosthetische Gruppe einen anorganischen Bestandteil wie zum Beispiel ein Metall umfassen, welches als ein Metallion vorliegen kann. Zum Beispiel kann das Metall ausgewählt werden aus Schwermetallen wie zum Beispiel Kobalt, Nickel, Mangan, Kupfer und Eisen. Bevorzugte Beispiele von prosthetischen Gruppen sind [2Fe-2S]-Cluster, [4Fe-4S]-Cluster und Metallporphyrin, z. B. Hämgruppen.
Außerdem kann eine prosthetische Gruppe ausgewählt werden, welche einen organischen Bestandteil umfasst, z. B. ein Koenzym. Beispiele von derartigen prosthetischen Gruppen sind Flavin-enthaltende Gruppen, z. B. FMN oder FAD, Nikotin-enthaltende Gruppen, z. B. NAD, NADH, NADP oder NADPH, Biotin, α2-Mikroglobulin, Thiaminpyrophosphat, Koenzym A, Pyridoxalphosphat, Koenzym B12, Biocytin, Tetrahydrofolat und Liponsäure.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Exposition eines rekombinanten multimeren Polypeptids auf der Oberfläche einer Wirtszelle umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Wirtszelle transformiert mit einer Nukleinsäurefusion operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz, wobei die Nukleinsäurefusion umfasst: (i) einen Anteil kodierend ein Signalpeptid, (ii) einen Anteil kodierend wenigstens eine Untereinheit des multimeren Polypeptids, welche exponiert werden soll, (iii) gegebenenfalls einen Anteil kodierend eine Proteaseerkennungsstelle, (iv) einen Anteil kodierend einen Transmembranlinker, und (v) einen Anteil kodierend die Transporterdomäne eines Autotransporters,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen die Nukleinsäurefusion exprimiert wird und das Expressionsprodukt umfassend die Untereinheit des multimeren rekombinanten Polypeptids auf der Oberfläche der Wirtszelle exponiert wird, und
(c) Verbinden der exponierten Untereinheit mit wenigstens einer weiteren Untereinheit des multimeren rekombinanten Polypeptids und Bilden eines funktionellen multimeren rekombinanten Polypeptids auf der Oberfläche der Wirtszelle.

Das multimere rekombinante Polypeptid kann ein Homodimer sein, d. h. ein Polypeptid bestehend aus zwei identischen Untereinheiten, oder ein Homomultimer, d. h. ein Polypeptid bestehend aus drei oder mehr identischen Untereinheiten. Auf der anderen Seite kann das multimere rekombinante Polypeptid ein Heterodimer sein, d. h. ein Polypeptid bestehend aus zwei verschiedenen Untereinheiten, oder ein Heteromultimer bestehend aus drei oder mehr Untereinheiten, wobei wenigstens zwei von diesen Untereinheiten verschieden sind. Zum Beispiel umfasst das multimere Polypeptid eine Mehrzahl von Untereinheiten, welche ein "einzelnes" multimeres Polypeptid oder einen Komplex einer Mehrzahl von funktionell assoziierten Polypeptiden bilden, welche wiederum monomere und/oder multimere Polypeptide sein können. Es sollte angemerkt werden, dass wenigstens eine Untereinheit des multimeren rekombinanten Proteins wenigstens eine prosthetische Gruppe enthalten kann. Weiterhin sollte angemerkt werden, dass die Nukleinsäurefusion eine Mehrzahl von Polypeptiduntereinheiten kodieren kann, da eine Polypeptidfusion ein funktionelles multimeres Polypeptid bildet, wenn sie auf der Zelloberfläche exponiert wird.
Homodimere oder Homomultimere können durch eine spontane Assoziation von mehreren identischen Polypeptiduntereinheiten exponiert auf der Wirtszellmembran gebildet werden. Heterodimere oder Heteromultimere können durch eine spontane Assoziation von mehreren verschiedenen Polypeptiduntereinheiten exponiert auf der Wirtszellmembran gebildet werden.
Auf der anderen Seite kann ein multimeres rekombinantes Polypeptid durch eine Assoziation von wenigstens einer Polypeptiduntereinheit exponiert auf der Wirtszellmembran und wenigstens einer löslichen Polypeptiduntereinheit, welche zu der Wirtszellmembran hinzugefügt wird, gebildet werden. Die hinzugefügte Untereinheit kann mit der exponierten Untereinheit identisch sein oder davon verschieden sein.
Die Wirtszelle, welche im Verfahren der vorliegende Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise ein Bakterium, stärker bevorzugt ein gramnegatives Bakterium, insbesondere ein Enterobakterium wie zum Beispiel E. coli.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, insbesondere ein Wirtsbakterium, bereitgestellt, welche/welches mit wenigstens einer Nukleinsäurefusion operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz, d. h. einem Promotor, und gegebenenfalls weiteren Sequenzen, welche für eine Genexpression in der jeweiligen Wirtszelle benötigt werden, transformiert wird. Vorzugsweise ist die Nukleinsäurefusion auf einem rekombinanten Vektor angeordnet, z. B. einem Plasmidvektor. Falls eine Wirtszelle transformiert mit mehreren Nukleinsäurefusionen verwendet wird, können diese Nukleinsäurefusionen auf einem einzelnen Vektor oder auf einer Mehrzahl von kompatiblen Vektoren angeordnet sein. Die Nukleinsäurefusion umfasst (i) einen Anteil kodierend ein Signalpeptid, vorzugsweise einen Anteil kodierend ein gramnegatives Signalpeptid, welches einen Transport in das Periplasma durch die innere Zellmembran erlaubt. Weiterhin umfasst die Nukleinsäurefusion (ii) einen Anteil kodierend das rekombinante Polypeptid, welches exponiert werden soll, und (iii) gegebenenfalls einen Anteil kodierend eine Proteaseerkennungsstelle, welche eine Erkennungsstelle für eine intrinsische Protease sein kann, d. h. eine Protease, welche natürlicherweise in der Wirtszelle auftritt, oder für eine von außen hinzugefügte Protease. Zum Beispiel kann die von außen hinzugefügte Protease eine IgA-Protease (vergleiche EP-A-0 254 090), Thrombin oder Faktor X sein. Die intrinsische Protease kann z. B. aus OmpT, OmpK oder Protease X ausgewählt werden. Außerdem umfasst die Nukleinsäurefusion (iv) einen Anteil kodierend einen Transmembranlinker, welcher für die Exposition des Passagierpolypeptids (ii) auf der äußeren Oberfläche der äußeren Membran der Wirtszelle benötigt wird. Weiterhin umfasst die Nukleinsäurefusion (v) eine Transporterdomäne eines Autotransporters.
Vorzugsweise wird eine Transmembranlinkerdomäne verwendet, welche homolog in Hinblick auf den Autotransporter ist, d. h. die Transmembranlinkerdomäne wird durch einen Nukleinsäureanteil direkt 5' zu der Autotransporterdomäne kodiert. Die Länge des Transmembranlinkers beträgt vorzugsweise 30-160 Aminosäuren.
Die Länge des rekombinanten Polypeptids, welches exponiert werden soll, d. h. das Passagierpolypeptid, liegt vorzugsweise im Bereich von 5-3000 Aminosäuren, stärker bevorzugt im Bereich von 10-1500 Aminosäuren.
Die Transporterdomäne des erfindungsgemäßen Autotransporters kann eine beliebige Transporterdomäne eines Autotransporters sein und ist vorzugsweise zum Bilden einer β-Fass-Struktur fähig. Eine detaillierte Beschreibung der β-Fass-Struktur und bevorzugte Beispiele von β-Fass-Autotransportern werden in WO97/35022 offenbart, welches hierin durch Referenz eingeschlossen wird. Zum Beispiel kann die Transporterdomäne des Autotransporters aus dem AIDA-I-Protein aus E. coli, dem SepA-Protein aus Shigella flexneri, dem IcsA-Protein aus Shigella flexneri, dem Tsh-Protein aus E. coli, dem Ssp-Protein aus Serratia marcescens, dem Hsr-Protein aus Helicobacter mustelae, dem Prn-Protein aus Bordetella ssp., dem Hap-Protein aus Haemophilus influenzae, dem BrkA-Protein aus Bordetella pertussis, dem VacA-Protein aus Helicobacter pylori, dem Oberflächenprotein SpaP, rOmpB oder SIpT aus Rickettsia, der IgA-Protease aus Neisseria oder Haemophilus und Varianten davon ausgewählt sein. Stärker bevorzugt ist die Transporterdomäne des Autotransporters das AIDA-I-Protein von E. coli oder eine Variante davon, wie zum Beispiel beschrieben von Niewert U., Frey A., Voss T., Le Bouguen C., Baljer G., Franke S., Schmidt MA, "The AIDA Autotransporter System is Associated with F18 and Stx2e in Escherichia coli Isolates from Pigs Diagnosed with Edema Disease and Postweaning Diarrhea [Das AIDA-Autotransportersystem ist mit F18 und Stx2e in Escherichia-coli-Isolaten aus Schweinen assoziiert, bei welchen Ödemkrankheit und Saugferkelkrankheit diagnostiziert wurde]". Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001 Jan, 8 (1): 143–149; 9.
Varianten der oben angezeigten Autotransportersequenzen können z. B. durch Verändern der Aminosäuresequenz in den Schleifenstrukturen des β-Fasses erhalten werden, welche nicht an den Transmembran-Anteilen teilhaben. Gegebenenfalls können die Nukleinsäureanteile kodierend die Oberflächenschleifen vollständig deletiert werden. Ebenso können innerhalb des amphipathischen β-Blatts konservierte Amino-Austausche stattfinden, d. h. der Austausch einer hydrophilen durch eine andere hydrophile Aminosäure oder/und der Austausch einer hydrophoben durch eine andere hydrophobe Aminosäure. Vorzugsweise hat eine Variante eine Sequenzidentität von wenigstens 50% und insbesondere wenigstens 70% auf der Aminosäuresebene in Bezug auf die jeweilige native Sequenz der Autotransporterdomäne wenigstens im Bereich der β-Blätter.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft eine Wirtszelle, welche ein funktionelles rekombinantes Polypeptid auf ihrer Oberfläche exponiert, wobei das rekombinante Polypeptid eine prosthetische Gruppe enthält und wobei das rekombinante Polypeptid vorzugsweise durch die Transporterdomäne eines Autotransporters exponiert wird. Zum Beispiel kann das Polypeptid ausgewählt werden aus Ferredoxinen, z. B. Adrenodoxin, P450-Reduktasen, Cytochrom b5, P450-Enzymen, Flavoproteinen, z. B. Oxidoreduktasen, Dehydrogenasen oder Oxidasen, insbesondere Zuckeroxidasen, wie zum Beispiel Pyranoseoxidase (15) und beliebigen Kombinationen davon.
Noch eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine Wirtszelle, welche ein funktionelles rekombinantes Polypeptid auf ihrer Oberfläche exponiert, wobei das rekombinante Polypeptid ein multimeres Polypeptid ist, welches wenigstens zwei Polypeptiduntereinheiten enthält, und wobei wenigstens eine Untereinheit des multimeren Polypeptids vorzugsweise durch die Transporterdomäne eines Autotransporters exponiert wird.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Membranpräparation, welche von einer Wirtszelle wie oben beschrieben abgeleitet ist, wobei diese Membranpräparation ein funktionelles rekombinantes Polypeptid exponiert, wobei das Polypeptid eine prosthetische Gruppe enthält und/oder ein multimeres Polypeptid ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Wirtszellen können für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen verwendet werden, z. B. als Ganzzell-Biofabriken oder Membranpräparations-Biofabriken für chemische Syntheseverfahren, z. B. für die Synthese von organischen Substanzen ausgewählt aus Enzymsubstraten, Wirkstoffen, Hormonen, Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukten für Syntheseverfahren und chiralen Substanzen (vergleiche Roberts, Chemistry and Biology [Chemie und Biologie] 6 (1999), R269–R272).
Außerdem kann die erfindungsgemäße Zelle oder die erfindungsgemäße Membranpräparation für ein gerichtetes Evolutionsverfahren verwendet werden, z. B. für die Entwicklung von neuen Biokatalysatoren für die Anwendung in organischen Synthesen.
Dies wird in einer bestimmten Ausführungsform erzielt durch Variieren der Aminosäuresequenz eines P450-Enzyms oder eines Flavoproteins über ortsspezifische oder zufällige Mutagenese und durch Testen von variantentragenden Zellen oder Membranpräparationen oder Bibliotheken enthaltend variantentragende Zellen oder Membranpräparationen davon, wobei eine bestimmte chemische Reaktion mit Hilfe von geeigneten Screeningverfahren verwendet wird, insbesondere Hochdurchsatzscreeningverfahren (high throughput screening HTS) zur Umwandlung eines bestimmten Substrats.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Bibliotheken von Varianten, welche durch ortsspezifische oder zufällige Mutagenese von Ferredoxinen, insbesondere Adx, hergestellt wurden, in Betracht der Funktion von einzelnen Aminosäuren z. B. während Elektronentransfers untersucht.
In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen werden Bibliotheken von Varianten von P450-Enzymen oder Flavoproteinen in Betracht der Rolle von definierten Aminosäuren während bestimmter Funktionen, insbesondere katalytischen Funktionen, untersucht.
Im Allgemeinen betreffen diese bestimmten Ausführungsformen die Produktion von Varianten von Proteinen und/oder Enzymen und die Produktion von Bibliotheken mit Varianten von Proteinen und/oder Enzymen, welche eine prosthetische Gruppe oder Koenzyme etc. tragen oder Koenzyme oder Multimere etc. sind und welche in Betracht eines bestimmten Kennzeichens gescreent werden, d. h. eine oder gegebenenfalls mehrere Varianten werden selektiert, welche dieses gewünschte Kennzeichen perfekt erfüllen. Durch Selektieren der Variante wird auch die Zelle ausgewählt und trägt die Nukleinsäure, welche die Variante kodiert. Daher kann sowohl die Aminosäuresequenz als auch die strukturelle Information der Variante gleichzeitig über die Nukleinsäuresequenz bestimmt werden. Die fraglichen Kennzeichen sind insbesondere Enzyminhibition, katalytische Kennzeichen, toxinabbauende Kennzeichen, Synthesekennzeichen, therapeutische Kennzeichen etc.
Überdies kann die Wirtszelle oder die Membranpräparation als ein Testsystem für ein Screeningverfahren verwendet werden, z. B. zum Identifizieren von Modulatoren (Aktivatoren oder Inhibitoren) von exponierten Polypeptiden wie zum Beispiel P450-Enzymen oder Flavoproteinen, welche als mögliche therapeutische Mittel verwendet werden können. Das Screeningverfahren kann ebenso zum Identifizieren von Varianten von exponierten Polypeptiden, welche vorbestimmte gewünschte Kennzeichen haben, verwendet werden. Für diesen Zweck können Bibliotheken von Modulatoren und/oder Bibliotheken von exponierten Polypeptiden verwendet werden. Weiterhin können die davon abgeleiteten Wirtszellen oder Membranpräparationen als ein System zur Toxizitätsüberwachung und/oder zum Abbau toxischer Substanzen in der Umwelt, im Labor oder in biologischen Systemen, z. B. dem Menschen, dem Tier oder nicht-biologischen Systemen verwendet werden.
Ein wesentlicher Vorteil der Anwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen und Membranen ist es, eine korrekte Faltung und biologische Aktivität von Proteinen oder Proteinkomplexen zu ermöglichen, welche eine Membranumgebung benötigen, z. B. P450-Enzyme oder Flavoproteine. Daher wird eine Rekonstitution nicht mehr benötigt, wie sie früher als notwendig erachtet wurde. Hierdurch werden die Produktionsschritte eines funktionellen biokatalytischen Systems vereinfacht, und es wird eine erhöhte Stabilität des Systems per se erreicht.
Dies wird in einer bestimmten Ausführungsform durch Transportieren der Polypeptidkette von Adx auf die Oberfläche mit Hilfe eines Autotransporters, nachfolgendem Inserieren der prosthetischen Gruppe und Hinzufügen von AdR und P450-Enzymen, z. B. CYP11B1 oder CYP11A1, von außen erzielt. Daher wird ein funktioneller Komplex aus AdR, Adx und P450 (5, 9 und 14) gebildet, wobei die Membranumgebung durch die bakterielle Zelle bereitgestellt wird, so dass Hinzufügen einer künstlichen Membran oder weiteren Detergenzien oder eine Rekonstitution wie in früher verwendeten Systemen nicht notwendig ist. Wenn gewünscht, können jedoch niedrige Mengen von Detergenz zu der erfindungsgemäßen Wirtszelle und/oder Membranpräparation hinzugefügt werden. Diese funktionellen Komplexe können als Träger zu einem Ziel, z. B. Boden dienen, welcher einer Detoxifizierung bedarf, oder kann für die Synthese von Steroiden oder sekundären Metaboliten von Pflanzen oder Mikroorganismen verwendet werden. Weitere spezifische Beispiele von früher rekonstituierten Systemen, welche durch das hierin beschriebene erfindungsgemäße System ersetzt werden können, können z. B. in Katalogen der Gesellschaften BD GENTEST, BD Biosciences, 6 Henshaw Street, Woburn, Massachusetts 01801 und PanVera Corporation, 545 Science Drive, Madison, WI 53711 U. S. A gefunden werden.
Überdies ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine wirksame Expression von Passagierproteinen auf der Oberfläche von Wirtszellen, insbesondere E. coli oder anderen gramnegativen bakteriellen Zellen, mit bis zu 100 000 oder mehr Molekülen pro Zelle durch Verwenden eines Flüssigmediums der folgenden Zusammensetzung: 5 g/l bis 20 g/l, vorzugsweise etwa 10 g/l Trypton, 2 g/l bis 10 g/l, vorzugsweise etwa 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l bis 20 g/l, insbesondere etwa 10 g/l NaCI und der verbleibende Rest Wasser. Das Medium sollte möglichst so wenig wie möglich divalente Kationen enthalten, daher wird vorzugsweise Aqua bidest oder hochgereinigtes Wasser, z. B. Milliporewasser verwendet. Das Flüssigmedium enthält des Weiteren vorzugsweise EDTA in einer Konzentration von 2 μM bis 20 μM, insbesondere 10 μM. Überdies enthält es vorzugsweise reduzierende Reagenzien, wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol oder Dithioerythritol in einer bevorzugten Konzentration von 2 mM bis 20 mM. Die reduzierenden Reagenzien begünstigen eine nicht-gefaltete Struktur des Polypeptids während des Transports. Das Flüssigmedium kann weiterhin zusätzliche C-Quellen enthalten, vorzugsweise Glukose, z. B. in einer Menge von bis zu 10 g/l, um eine Sekretion zu begünstigen, d. h. einen Transfer des Passagiers in das umgebende Medium. Für eine Oberflächenexposition wird vorzugsweise keine zusätzliche C-Quelle hinzugefügt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäße Wirtszellen bereitgestellt, welche ein Ferredoxin, z. B. Adx oder/und AdR oder/und P450-Reduktase oder/und Cytochrom b5 oder/und P450-Enzyme oder/und eines der im folgenden beschriebenen Peptide auf ihrer Oberfläche auf eine Weise tragen, so dass wenigstens eine Polypeptidkette mit Hilfe eines Autotransporters auf die Oberfläche gebracht wird und die prosthetischen Gruppen nachher inseriert werden, wobei früher verwendete mikrosomale Systeme oder Systeme ersetzt werden, welche mit Hilfe von künstlichen oder natürlichen Membranen oder Membranteilen rekonstituiert werden.
Weitere bevorzugte Beispiele für das rekombinante Polypeptid, welches exponiert werden soll, d. h. die Passagierpolypeptide, sind Peptide oder Proteine ausgewählt aus der Gruppe von wirkstoffmetabolisierenden Enzymen, wie zum Beispiel CYP1A2, welches in die Aktivierung von aromatischen Amin-Karzinogenen, heterocyclischen Arylamin-Promutagenen abgeleitet von Nahrungspyrolysaten und Aflatoxin B1 involviert ist (Gallagher EP, Wienkers LC, Stapleton PL, Kunze KL, Eaton DL., Role of human microsomal and human complementary DNA-expressed cytochromes P4501A2 and P4503A4 in the bioactivation of aflatoxin B1 [Die Rolle von menschlichen mikrosomalen und menschlichen komplementären DNA-exprimierten Cytochromen P4501A2 und P4503A4 bei der Bioaktivierung von Aflatoxin B1]. Cancer Res. 1994, Jan 1; 54 (1 ): 101–8) oder CYP2E1, welches die Prokarzinogene N-Nitrosodimethylamin und N-Nitrosodiethylamin aktivieren kann und die Prokarzinogene Benzol, Styrol, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform metabolisiert (Yoo JS, Ishazaki H, Yang CS., Roles of cytochrome P450IIE1 in the dealkylation and denitrosation of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine in rat liver microsomes [Die Rolle von Cytochrom P450IIE1 bei der Dalkylierung und Denitrosierung von N-Nitrosodimethylamin und N-Nitrosodiethylamin in Rattenleber-Mikrosomen]. Carcinogenesis. 1990 Dez; 11 (12): 2239–43; Peter R, Bocker R, Beaune PH, Iwaskai M, Guengerich FP, Yang CS., Hydroxylation of chlorzoxazone as a specific probe for human liver cytochrome P-450IIE1 [Hydroxylierung von Chloroxazon als spezifische Sonde für menschliches Lebercytochrom P-450IIE1]. Chem. Res. Toxicol. 1990 Nov-Dez; 3 (6): 566–73). Weitere bevorzugte Passagierpeptide sind Peptide aus der Gruppe der Steroidbiosyntheseenzyme, wie zum Beispiel CYP11B1, welches in die Bildung von Cortisol und Aldosteron involviert ist (Bernhardt R., Cytochrome P450: structure, function and generation of reactive oxygen species [Cytochrom P450: Struktur, Funktion und Generation von reaktiven Sauerstoffspezies]. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1996; 127: 137–221), oder CYP19, welches in die Umwandlung von Adrostendion in 19-Hydroxyandrostendion, 19-Oxo-androstendion und Estron involviert ist (Ryan KJ., Biological aromatization of steroids [Biologische Aromatisierung von Steroiden]. J. Biol. Chem. 1959; 134: 268). Weitere Beispiele für bevorzugte Passagierpeptide sind Peptide aus der Gruppe der ein Metallion enthaltenden Enzyme, insbesondere Zn-enthaltenden Enzyme, wie zum Beispiel Zn-enthaltenden Lactamasen, Carboanhydrase und Alkoholdehydrogenase, Mg-enthaltenden Enzyme, wie zum Beispiel Hexokinase, Glukose-6-Phosphatase oder Pyruvatkinase, Ca-enthaltenden Enzyme, Fe-enthaltenden Enzyme wie zum Beispiel Cytochromoxidase, Katalase, Peroxidase oder Ni-enthaltenden Enzyme, wie zum Beispiel Urease, welche die Hydrolysierung von Harnstoff katalysiert, um Ammoniak und Kohlendioxid zu bilden, oder die Hydrolysierung von Harnstoff-ähnlichen Verbindungen katalysiert (Mobley HL, Island MD, Hausinger RP., Molecular biology of microbial ureases [Molekularbiologie von mikrobiellen Ureasen]. Microbiol. Rev. 1995 Sep; 59 (3): 451–80. Übersichtsarbeit; Soriano A, Colpas GJ, Hausinger RP., UreE stimulation of GTP-dependent urease activation in the UreD-UreF-UreG-urease apoprotein complex [UreE-Stimulierung von GTP-abhängiger Urease-Aktivierung in dem UreD-UreF-UreG-Urease-Apoproteinkomplex]. Biochemistry. 2000 Okt 10; 39 (40): 12435–40), oder Peptiden beschrieben und geliefert von BD Gentest, BD Biosciences, 6 Henshaw Street, Woburn, Massachusetts 01801 oder von PanVera Corporation, 545 Science Drive, Madison, WI 537111 U. S. A. Weitere bevorzugte ein Metallion enthaltende Enzyme sind Cu-enthaltende Enzyme, wie zum Beispiel Cytochrom-Oxidase, Mn-enthaltende Enzyme, wie zum Beispiel Arginase und Ribonukleotidreduktase, Mo-enthaltende Enzyme, wie zum Beispiel Dinitrogenase und Se-enthaltende Enzyme, wie zum Beispiel Glutathion-Peroxidase.
Weitere bevorzugte Beispiele des rekombinanten Polypeptids, welches exponiert werden soll, d. h. der Passagierpolypeptide, sind Peptide oder Proteine aus der Gruppe der Flavoproteine, z. B. Oxidoreduktasen, Dehydrogenasen oder Oxidasen, insbesondere Zuckeroxidasen, wie zum Beispiel Pyranoseoxidase. Daher werden zum Beispiel Wirtszellen bereitgestellt, welche eine Zuckeroxidase, z. B. Pyranoseoxidase, auf ihrer Oberfläche tragen, indem die Polypeptidkette der Zuckeroxidase mit Hilfe eines Autotransporters auf die Oberfläche gebracht wird und danach die prosthetische Gruppe FAD hinzugefügt wird. Vorzugsweise kann dies durch Hinzufügen von gereinigtem FAD in einer Pufferlösung zu den Wirtszellen, welche die Zuckeroxidase-Polypeptidkette exponieren, erzielt werden, wobei die Pufferlösung FAD im Überschuss, 1 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA, 17% Glycerin (v/v), 0,1 M Guanidin/HCl und 0,1 M HEPES pH 7,5 enthält. In diesem Zusammenhang sollte angemerkt werden, dass das oben beschriebene Verfahren für die Insertion der prosthetischen Gruppe ebenso auf diejenigen Flavoproteine übertragen werden kann, welche als Homotetramere, Homodimere etc. beschrieben werden. Die davon abgeleiteten Wirtszellen oder Membranpräparationen können als Systeme für die Synthese von Zuckern, Bausteinen, Feinchemikalien, Grundchemikalien und chiralen Verbindungen verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Wirtszellen und/oder Membranpräparationen bereitgestellt, welche wenigstens ein P450-Enzym auf ihrer Oberfläche auf eine Weise tragen, dass wenigstens eine Polypeptidkette mit Hilfe eines Autotransporters auf die Oberfläche gebracht wird und die prosthetischen Gruppen nachher inseriert werden, wobei früher verwendete mikrosomale Systeme oder Systeme rekonstituiert mit Hilfe von künstlichen oder natürlichen Membranen oder Membranteilen ersetzt werden. Vorzugsweise sind die P450-Enzyme Leber-P450-Enzyme, insbesondere P450 3A4, 2D6, 2C9 und 2C19. Die erfindungsgemäßen Wirtszellen und/oder Präparationen werden vorzugsweise nacheinander zum Testen der Enzyminhibition von P450-Enzymen verwendet. Zum Beispiel kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Wirtszelle und/oder Membranpräparation in einem frühen Schritt der Wirkstoffentdeckung, der sogenannten Lead-Identifizierung, herausgefunden werden, ob die neue Wirkstoff-Leadstruktur, welche getestet werden soll, möglicherweise Nebenwirkungen haben könnte oder zu der sogenannten Wirkstoff-Wirkstoffinteraktion führt.
Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die folgenden Figuren und Beispiele erläutert:
1: Adx-abhängige Reaktionen von CYP11A1 und CYP11B1. Die Elektronentransferaktivität von oberflächenexponiertem Adx wurde in rekonstituierten Systemen analysiert, welche die natürlichen endgültigen Elektronenakzeptoren CYP11A1 und CYP11B1 enthalten, welche die angezeigten chemischen Reaktionen katalysieren.
2: (A) Nukleotid- und Aminosäuresequenz von Rinder-Adrenodoxin, welchem die Mitochondrien-Zielsequenz wie in dieser Studie verwendet fehlt.
(B) Struktur des Fusionsproteins FP66. Die Umgebung der Fusionsstellen ist in Form von Sequenzen angegeben. Signalpeptidase und Trypsin-Spaltstellen werden gezeigt.
3: SDS-PAGE (A) und Westernblot-Analyse (B) von äußeren Membranpräparationen von E. coli UT5600 (Spuren 1, 2) und UT5600 pJJ004 (3, 4, 5, 6). Bedingungen und Molekulargewichtsmarker wie gezeigt. * Signale, welche Fusionsprotein-Multimeren entsprechen. C1 = Kern 1; C2 = Kern 2.
4: HPLC-Chromatogramme von CYP11A1- und CYP11EB1-abhängiger Substratumwandlung. Chromatogramme wurden aus extrahierten Proben mit E.-coli-Zellen erhalten, welche pAT-Adx04 vor Rekonstitution (A, C) und nach Rekonstitution (B, D) des Eisen- Schwefel-Clusters in oberflächenexponiertem Adrenodoxin enthielten. Die angezeigten Substanzpeaks in den CYP11A1-Reaktionen (A, B) repräsentieren 1) Cortisol (interner Standard), 2) Pregnenolon (Produkt) und 3) Cholesterin (Substrat), in CYP11B1-Reaktionen (C, D) 4) Cortisol (interner Standard), 5) Corticosteron (Produkt) und 6) Desoxycorticosteron (Substrat). Steroide wurden für A und B mit einem isokratischen Lösungsmittelsystem von Acetonitril/Isopropanol (15:1) und für B und C mit einem isokratischen Lösungsmittelsystem von 50% Acetonitril analysiert.
5: Schematische Repräsentation von Adx-Oberflächenexposition durch den Autotransporterweg in E. coli.
6: SDS-PAGE (A) und Westernblot (B) von äußeren Membranpräparationen von E. coli UT2300 (Spur 1) und E. coli UT2300 pJJ004 (Spur 2). Bevor die äußeren Membran hergestellt wurden, wurden ganze Zellen mit Trypsin verdaut (+) oder nicht (–). Westernblotten wurde mit einem Adx-spezifischen Antikörper durchgeführt.
7: Westernblot von äußeren Membranpräparationen von E. coli UT2300 pJJ004 gewachsen in verschiedenen Kulturmedien. Red. = reduzierende Bedingungen in Kulturmedium, Gluc. = 5 g/l Glukose, t. e. = Spurenelemente (trace elements) im Kulturmedium. Westernblotten wurde mit einem Adx-spezifischen Antikörper durchgeführt.
8: Westernblot von äußeren Membranpräparationen von E. coli UT2300 pJJ004 behandelt mit verschiedenen Probenpuffern vor SDS-Geltrennung. SB + : Probenpuffer enthielt Mercaptoethanol, Red – : Probenpuffer ohne Mercaptoethanol. Westernblotten wurde mit einem Adx-spezifischen Antikörper durchgeführt.
9: Schematische Repräsentation von funktionellen ADX-Dimeren auf der Oberfläche von E. coli.
10: SDS-PAGE (A) und Westernblot-Analyse von äußeren Membranpräparationen von E. coli UT5600 pJJ004. Ganze Zellen wurden entweder mit Trypsin verdaut (Spur 2) oder nicht (1), bevor die äußeren Membranen hergestellt wurden. Vor dem Anwenden auf SDS-PAGE wurden die Proben in Probenpuffer ohne 2-Mercaptoethanol gekocht. Die Größen der Molekulargewichtmarkerbanden sind gezeigt. Natürliche äußere Membranproteine OmpF/C und OmpA sind markiert. Der Adx-spezifische Antikörper, welcher zur Detektion verwendet wurde, wurde früher beschrieben (35).
11: (A) Westernblot-Analyse von Überstandsproteinen von OmpT+-E. coli UT2300. Vor dem Anwenden auf SDS-PAGE wurden die Proben mit (Spur 1) oder ohne 2-Mercaptoethanol (2) gekocht. Die Größen der Molekulargewichtsmarkerproteine sind gezeigt.
(B) Molekulargewichtsbestimmung von freiem rekombinantem Adx. Die Größe von gereinigten Adx-Molekülen, welche nicht mit den Autotransporterdomänen verbunden waren, wurde durch die Verwendung von Größenausschlusschromatographie bestimmt. Die Proteine, welche im Plot gezeigt werden (Kreise mit grauer Füllfarbe), wurden zum Erzeugen einer Standardkurve verwendet. Das Rückhaltevolumen von Adx ist als ein Kreis mit weißer Füllfarbe gezeigt, und der extrapolierte MW ist in Klammern gegeben.
12: Freigesetztes dimeres Adx auf der Oberfläche von E. coli UT2300 pJJ004. Bevor die äußeren Membranproteine wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und einer SDS-PAGE (A) und Westernblot-Analyse (B) unterzogen wurden, wurden ganze Zellen mit Trypsin behandelt (+) oder nicht (–). Für die Probenpräparation wurde Puffer ohne 2-Mercaptoethanol verwendet. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarkerproteine ist in Kilodalton angegeben.
13: Schematische Darstellung der Ganzzell-Steroidumwandlung durch Autotransporter-vermittelte Oberflächenexposition von dimerem Adx in E. coli.
14: Aminosäuresequenz von Pyranoseoxidase von Coriolusolor, wie es in dieser Studie verwendet werden kann.
Beispiel 1
Funktionelle Oberflächenexposition eines Rinder-[2Fe-2S]-Ferredoxins durch den Autotransporterweg in E. coli.
1.1 Experimentelles Protokoll
Bakterielle Stämme, Plasmide und Kulturbedingungen
E. coli UT5600 (F^– ara14 leuB6 azi-6 lacY1 proC14 tsx-67 entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thi1, ΔompT – fepC266) wurde für die Expression von Autotransporter-Fusionsproteinen verwendet (42). E. coli TOP10 (F mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu) 7697 gal/galK rpsL (Str^R) endA1 nupG) und der Vektor pTOPO10, welcher zum Subklonieren von PCR-Produkten verwendet wurde, wurden von Invitrogen (Groningen, die Niederlande) erhalten. Plasmid pJM007 (15), welches den AIDA-I Autotransporter kodiert, und Plasmid pKKHCAdx (43), welches Rinder-Adrenodoxin kodiert, wurden an anderer Stelle beschrieben. Bakterien wurden routinemäßig bei 37°C in Luria-Bertani-Brühe (LB-Brühe) enthaltend 100 mg Ampicillin Liter^–1 wachsen gelassen. Für Adx-Expressionsstudien wurde EDTA bis zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzugefügt, und β-Mercaptoethanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM hinzugefügt.
Rekombinante DNA-Techniken
Für die Konstruktion der Adx-Autotransporterfusion wurde das Adx-Gen durch PCR von Plasmid pKKHCAdx amplifiziert, wobei die Oligonukleotidprimer JJ3 (5'-ccgctcgagggcagctcagaagataaaataacagtc-3') und JJ4 (5'-ggggtaccttctatctttgaggagttcatg-3') verwendet wurden. Das PCR-Produkt wurde in Vektor pTOPO10 inseriert und wieder mit XhoI und KpnI gespalten. Das Restriktionsfragment wurde mit pJM7 ligiert, welches mit denselben Enzymen restringiert wurde. Diese ergab eine Fusion von Adx mit dem AIDA-I-Autotransporter im Raster unter der Kontrolle des starken P_TK-Promotors (2b).
Äußere Membranpräparation
E.-coli-Zellen wurden über Nacht wachsen gelassen, und 1 ml der Übernachtkultur wurde zum Inokulieren von 20 ml LB-Medium verwendet. Zellen wurden bei 37°C unter kraftvollem Schütteln (200 rpm) für etwa 5 h kultiviert, bis eine OD₅₇₈ von 0,7 erreicht wurde. Nach Ernten und Waschen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) wurden äußere Membranen gemäß dem schnellen Isolierungsverfahren von Hantke hergestellt (44). Für eine Ganzzellprotease-Behandlung wurden E.-coli-Zellen geerntet, gewaschen und in 5 ml PBS resuspendiert. Trypsin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mg Liter^–1 hinzugefügt, und Zellen wurden für 5 min bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit PBS gestoppt, welche 10%iges fötales Kälberserum (FCS) enthielt, und äußere Membranen wurden wie oben beschrieben hergestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Analyse
Äußere Membranisolate wurden 1:2 mit 2 x Probenpuffer (100 mM Tris/HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,2% Bromphenolblau, 20% Glycerin) entweder mit (reduzierend) oder ohne 2-Mercaptoethanol (nicht-reduzierende Bedingungen) verdünnt, für 20 min gekocht und auf 12,5%igem SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden mit Coomassie-Brilliantblau mit vorgefärbten Molekulargewichtsproteinmarkern (Bio-Rad, München, Deutschland) visualisiert. Für eine Westernblot-Analyse wurden Gele auf Polyvinyliden-Difluorid-Membranen (PVDF-Membranen) elektrogeblottet, und geblottete Membranen wurden über Nacht in PBS mit 3% FCS blockiert. Für eine Immunodetektion wurden Membranen für 3 Stunden mit primären anti-Adx-Antikörpern verdünnt 1:500 in PBS mit 3% FCS inkubiert. Vor Hinzufügen des sekundären Antikörpers wurden die Immunblots dreimal mit PBS gespült. Antigen-Antikörper-Konjugate wurden durch Reaktion mit Meerrettichperoxidaseverbundenem sekundären Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) verdünnt 1:1000 in PBS visualisiert. Eine Farbreaktion wurde durch Hinzufügen einer Lösung bestehend aus 2 ml 4-Chlor-1-Naphtol (3 mg/ml Ethanol), 25 ml PBS und 10 μl H₂O₂ (30%) erzielt.
Rekonstitution des [2Fe-2S]-Zentrums in Adrenodoxin
Zellen wurden über Nacht wachsen gelassen, zweimal in PBS gewaschen und auf eine gerechnete endgültige OD₅₇₈ von 50 resuspendiert. Wiederfalten von Adrenodoxin auf der Oberfläche der E.-coli-Zellen wurde entweder nach Wärmedenaturierung bei 70°C, 60°C und 40°C gefolgt von einer langsam Temperaturrampe bis 22°C erzielt oder wurde direkt bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Eine simultane chemische Rekonstitution des Eisen-Schwefel-Clusters wurde unter strikt anaeroben Bedingungen in 50 mM Tris-Cl-Puffer (pH 7,4) durchgeführt. Die bakterielle Suspension (4 ml) wurde mit 1 mM β-Mercaptoethanol und 0,2 mM Eisen(II)-Ammoniumsulfat supplementiert und wurde langsam mit 100 ml einer Lösung enthaltend 100 mM Li₂S und 2 mM DTT titriert (45).
Proteinreinigung
Rekombinantes Adrenodoxin (Adx) und Adrenodoxin-Reduktase (AdR) wurden wie beschrieben gereinigt (32, 46). Proteinkonzentration wurde berechnet, wobei ε₄₁₄ = 9,8 (mM cm)^–1 für Adx (47) und ε₄₅₀ = 11,3 (mM cm)^–1 für AdR (48) verwendet wurde. Isolierung von CYP11A1 und CYP11B1 aus Rindernebennieren wurde gemäß Akhrem et al. (49) mit leichten Modifikationen durchgeführt.
Enzymaktivitätstests
Die biologische Elektronentransferfunktion von Adrenodoxin wurde in Adrenodoxin-abhängigen Reaktionen detektiert, welche ihre natürlichen Effektorenzyme, die Cytochrome CYP11A1 und CYP11B1, enthielten. Die Cholesterinseitenkettenspaltaktivität von Cytochrom CYP11A1 wurde in einem rekonstituierten System getestet, welches die Umwandlung von Cholesterin zu Pregnenolon katalysierte. Tests wurden bei 37°C in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 0,1 % Tween 20 durchgeführt und enthielten 100 μl E.-coli-Zellen, 0,5 μM Adrenodoxin-Reduktase, 0,4 μM CYP11A1, 400 μM Cholesterin und ein NADPH-regenerierendes System. Nach der Reaktion wurden die Steroide in ihre korrespondierenden 3-on-4-en-Formen durch das Hinzufügen von 2 Einheiten/ml Cholesterinoxidase konvertiert, extrahiert und durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Eine Substratumwandlung von Desoxycorticosteron zu Corticosteron in Cytochrom-CYP11B1-Tests wurde bei 37°C in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 0,1 % Tween 20 durchgeführt und bestand aus 100 μl E.-coli-Zellen, 0,5 μM Adrenodoxin-Reduktase, 0,2 μM CYP11B1, 400 μM Desoxycorticosteron und einem NADPH-regenerierenden System. Extrahierte Steroide wurden von einem Jasco-Umkehrphasen-HPLC-System der LC800-Serie getrennt, welches eine 3,9 × 150 mm Nova-Pak-C₁₈-Säule von Waters verwendete. Die Mengen von rekonstituiertem Adx auf der Zelloberfläche wurde durch Vergleich der Steroide, welche in zellabhängigen Reaktionen hergestellt wurden, mit Reaktionen, welche definierte Mengen von gereinigtem holo-Adx enthielten, geschätzt.
Elektronenspinresonanzmessungen
EPR-Messungen wurden auf einem Bruker ESP300E-Spektrometer bei –163°C ausgeführt. Zellproben in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,4) wurden mit Dithionit unter anaeroben Bedingungen reduziert und in flüssigem Stickstoff gefroren.
1.2 Ergebnisse
Fusionsproteinkonstruktion
Um eine Fusion im Raster mit den Gensegmenten zu erhalten, welche für eine Autoexposition gebraucht werden, wurde die kodierende Region von Rinder-Adrenodoxin (Adx) PCR-amplifiziert. Zu den verwendeten PCR-Primern wurde eine XhoI-Stelle am 5'-Ende und eine KpnI-Stelle am 3'-Ende der Adx-kodierenden Region hinzugefügt. Um jegliche Behinderung mit einer bakteriellen Oberflächentranslokation zu vermeiden, wurde ein Adx-Gen als PCR-Template verwendet, dem die Mitochondrien-zielenden Sequenzen fehlten (32). Die Aminosäure- und die Nukleotidsequenz des resultierenden PCR-Produkts, welche durch Didesoxy-Sequenzieren bestätigt wurde, ist in 2a gezeigt. Für die Konstruktion des rekombinanten Fusionsprotein-kodierendes Gens wurde Plasmid pJM7 mit XhoI und KpnI gespalten. pJM7 ist ein pBR322-abgeleitetes Plasmid mit hoher Kopienanzahl, welches die Expression eines Choleratoxin-β-AIDA-I-Fusionsproteins unter der Kontrolle des konstitutiven P_TK-Promotors ausführt (15, 23). Spaltung mit XhoI und KpnI resultiert in einer Deletion der DNA-Region, welche Choleratoxin-β (CTB) kodiert. Insertion des gespaltenen Adx-PCR-Fragments ergab Plasmid pJJ004, welches ein Fusionsprotein bestehend aus dem Signalpeptid von CTB, Adx und der AIDA-I-Autotransporterregion einschließend eine Linkerregion kodierte, von welcher bewiesen ist, dass sie für einen vollen Oberflächenzugang hinreichend ist (2b). Aufgrund des Ligationsverfahrens enthält das künstliche Konstrukt noch sieben Aminosäuren von reifem CTB. Basierend auf der vorhergesagten molekularen Masse von 65,9 kDa wurde das Fusionsprotein als FP66 bezeichnet. Der Export von FP66 wurde in E. coli untersucht.
Sondieren der Oberflächenexposition von Rinder-Adx
Die meisten der verfügbaren E.-coli-Wirtsstämme besitzen eine äußere Membranprotease (OmpT), welche die sequenzspezifische Freisetzung von oberflächenexponierten Proteinen katalysiert (33). Da der Linker, welcher in unserer Adx-AIDAβ-Fusion verwendet wurde, eine OmpT-Protease-spezifische Spaltstelle enthält, wurde es notwendig, einen OmpT-negativen Stamm für eine Adx-Oberflächenexposition zu verwenden. In früheren Studien wurde gezeigt, dass E. coli UT5600 (OmpT) geeignet ist, eine Spaltung von oberflächenexponierten Autotransporter-Fusionsproteinen zu verhindern (23, 34). Deshalb wurde pJJ004 in E. coli UT5600 transformiert, und die Expression von FP66 wurde durch SDS-PAGE und Immunblotten von äußeren Membranprotein-Präparationen überwacht. Wie in 3a gezeigt konnte FP66 durch Coomassie-Brilliantblau-Färbung von äußeren Membranproteinen leicht detektiert werden. Die Expression war fast auf demselben Niveau wie die Expression der natürlichen äußeren Membranproteine OmpA und OmpF/C. Weder Wachstumsrate noch optische Dichte, welche in der stationären Phase von E. coli UT5600 gewachsen in Flüssigmedium erreicht wurde, war durch die Expression von FP66 vermindert (nicht gezeigt). Die elektrophoretische Beweglichkeit des Adx-AIDAβ-Fusionsproteins war in perfekter Übereinstimmung mit der vorhergesagten molekularen Masse von 65,9 kDa. Schließlich wurde die Identität von FP66 durch Westernblot-Analyse bestätigt, wobei ein Adx-spezifischer polyklonaler Kaninchenantikörper verwendet wurde (35) (3b). Die Anwendung von nicht-reduzierenden Bedingungen führte zu schwachen Banden bei Molekulargewichten, welche den Multimeren des Fusionsproteins entsprachen.
Um zu klären, ob die Passagierdomäne von FP66 auf der Oberfläche zugänglich war und nicht auf das Periplasma gerichtet waren, wurden intakte Zellen von E. coli UT5600 pJJ004 einem Proteaseverdau mit Trypsin unterzogen. Äußere Membranen wurden danach aus diesen Zellen hergestellt und durch SDS-PAGE und Westernblotten analysiert. In früheren Studien wurde gezeigt, dass eine Membran, welche den AIDA-I-Autotransporter einbettet, zu einem Trypsin-resistenten Kern von 37,1 kDa (15) führt. Dieser Kern wird durch eine Trypsin-Spaltstelle verursacht, welche in der Linkerregion gefunden wurde (2b). Vorhergesagte Trypsin-Spaltstellen, welche näher am C-Terminus des Transporters angeordnet sind, werden durch die Membrantopologie vor einem Trypsinzugang geschützt. Wie durch SDS-PAGE und nachfolgendes Färben mit Coomassie-Blau gesehen wurde, führte externes Hinzufügen von Trypsin zum Verschwinden des Fusionsproteins mit voller Größe und erzeugte zwei Produkte mit niedrigerem Molekulargewicht (3a). Eines von ihnen entspricht dem 37,1-kDa-Trypsin-resistenten Autotransporterkern. Das zweite Verdauprodukt (Kern 2) hat ein größeres Molekulargewicht von um 45 kDa. Deshalb muß es das Ergebnis einer Trypsinspaltung innerhalb der Adx-Passagierdomäne sein. Falten nach dem Verarbeiten könnte einen Trypsinzugang zur Linkerregion behindern und deshalb einen weiteren Abbau verhindern. Rinder-Adx ist bekannt dafür, dass es mehrere Konsensus-Trypsinspaltstellen enthält. Offensichtlich gab es in unseren Experimenten einen Vorzug für die Trypsinspaltung einer abweichenden Sequenz, da neben dem 45-kDa-Kern 2 kein anderes prominentes Verdauprodukt detektierbar war.
Elektronentransferfunktion von Rinder-Adx exponiert auf der bakteriellen Oberfläche Da die früheren Ergebnisse eindeutig gezeigt haben, dass Rinder-Adrenodoxin (Adx) zur bakteriellen Oberfläche durch den Autotransporterweg transportiert wird, war es der nächste Schritt, zu untersuchen, ob das exponierte Biomolekül aktiv ist. Die Aktivität wurde mit der CYP11A1-abhängigen Umwandlung von Cholesterin zu Pregnenolon und mit der CYP11B1-abhängigen Umwandlung von Desoxycorticosteron zu Corticosteron gemessen (1). Beide Tests, welche die nativen Elektronenakzeptoren von Adx und ganze Zellen von E. coli UT5600 pJJ004 enthielten, zeigten keine Substratumwandlung (4). Dies betont, dass ein selbstassembliertes holo-Adx, welches den redoxaktiven [2Fe-2S]-Cluster enthielt, nach Expression und Transport zur Zelloberfläche nicht gebildet wurde. Die Abwesenheit des Eisen-Schwefel-Clusters wurde durch EPR-Messungen mit ganzen Zellen bestätigt (nicht gezeigt). Dieser Befund passt in das Konzept des Autotransporter-Sekretionsmechanismus', welcher früher publiziert wurde (17, 21). Demnach können Proteine über den Autotransporterweg nur transportiert werden, so lange sie eine relaxierte entfaltete Konformation aufrechterhalten. Das E.-coli-Ferredoxin, welches ein strukturelles Homolog von Adrenodoxin ist, erhält den [2Fe-S]-Cluster im Zytoplasma (36). Wir konnten jedoch keinerlei Adx-Autotransporter-Fusionsproteine in der zytoplasmatischen Fraktion von rekombinanten E.-coli-Zellen detektieren. Dies könnte anzeigen, dass ein Signalpeptidziel eine Clusteraufnahme verhindert oder dass eine Clusteraufnahme und ein Transportabbruch zu einem schnellen proteolytischen Abbau im Zytoplasma führt. Ebenso war ein periplasmatisches Zwischenprodukt nicht detektierbar.
Da die Expression von apo-Adx auf der E.-coli-Oberfläche sehr wirksam war, schien es der Mühe wert zu sein, die Post-Transportintegration des [2Fe-2S]-Clusters in oberflächenexponiertem Adx durch chemische Rekonstitution zu beurteilen (37). Deshalb wurden ganze Zellen von E. coli UT5600 pJJ004 bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, um optimale Bedingungen für das Entfalten von Adx-Molekülen exponiert auf der Oberfläche zu verifizieren. Nacheinander wurden Eisen(II) und Thiole unter anaeroben Bedingungen entweder in einer Stickstoff- oder in einer Argon-Atmosphäre hinzugefügt. Die folgende extrem langsame Verdünnung der bakteriellen Suspension durch Li₂S führte zu niedrigen gesamten Sulfidkonzentrationen und vermied einen Niederschlag von Eisensulfiden (38). Überdies erlaubt es das erfolgreiche Wiederfalten des Adx-Peptids um einen [2Fe-2S]-Cluster. Dies wurde durch eine signifikante Produktbildung in beiden Cytochrom-P450-Tests angezeigt, wenn ganze Zellen nach dem Rekonstitutionsverfahren hinzugefügt wurden (4). Da Kontrollen negativ waren und kein zusätzliches Adx hinzugefügt wurde, muß dies eindeutig durch eine Elektronentransferfunktion von oberflächenexponiertem Adx (4) verursacht worden sein, was eine erfolgreiche chemische Rekonstitution bedeutet. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass Adx, welches auf der E.-coli-Oberfläche durch den Autotransporterweg exponiert wird, biologisch aktiv ist und Elektronen zu den P450-Enzymen CYP11A1 und CYP11B1 transferieren kann. Die Anzahl von aktiven Adx-Molekülen nach Rekonstitution auf der Oberfläche von E. coli konnte durch die Verwendung der spezifischen Substratumwandlungsrate im CYP11A1-Test geschätzt werden. Für diesen Zweck wurde der Enzymtest ohne E.-coli-Zellen, aber mit verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem holo-Adx durchgeführt. Dies ermöglichte es, eine Kalibrierungskurve aufzunehmen, welche eine Substratumwandlung in Abhängigkeit von den Adx-Molekülen im Test beschreibt. Die Kalibrierungskurve wurde zum Schätzen der erkennbaren Anzahl von aktiven Adx-Molekülen von E. coli UT5600 pJJ004 unter Testbedingungen verwendet. Wie in Tabelle 1 gesehen werden kann, wurde die Rekonstitution des [2Fe-2S]-Clusters bei allen Temperaturbedingungen erfolgreich angewendet. Niedrigere Temperaturen von 22 und 40°C schienen begünstigt worden zu sein, während eine Wärmedenaturierung bei 60°C oder 70°C vor den Wiederfaltungsexperimenten zu signifikant verminderten Mengen von assembliertem holo-Adx führte. Überdies vermindern Denaturierungsbedingungen von 70°C dramatisch die Anzahl von lebensfähigen bakteriellen Zellen. Eine erkennbare Anzahl von 1,8 × 10⁵ funktionellen Adx-Molekülen pro Zelle zeigte optimale Bedingungen für das Wiederfalten des Peptids um das [2Fe-2S]-Zentrum bei 22°C an. Eine vorhergehende Wärmedenaturierung von oberflächenexponiertem apo-Adx war offensichtlich für eine erfolgreiche Clusteraufnahme nicht notwendig.
1.3 Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde Rinder-Adrenodoxin auf der E.-coli-Zelloberfläche durch den Autotransporterweg exprimiert. Die Expressionsrate war in derselben Größenordnung wie die Expression von natürlichen äußeren Membranproteinen OmpF/C oder OmpA, ohne die äußere Membranintegrität zu stören oder das Zellwachstum zu reduzieren (3a). Adx-Passagiermoleküle, welche durch den Autotransporter zur Zelloberfläche transportiert wurden, enthielten anfänglich keinen Eisen-Schwefel-Cluster. Dies passt in das Konzept des Autotransporter-Sekretionsmechanismus' (15, 17, 20). Derzufolge bildet der C-Terminus von diesen sekretierten Proteinen eine porinähnliche Struktur, ein sogenanntes β-Fass, in der äußeren Membran, und Proteine mit stabilen und ausgedehnten dreidimensionalen Strukturen können dieses Tor nicht passieren. Eine Aufnahme des [2Fe-2S]-Clusters in apo-Adx führt zur Bildung einer stabilen Struktur (29) und ist deshalb nicht mit einer Oberflächentranslokation kompatibel. Apo-Adx, welches auf der E.-coli-Zelloberfläche exprimiert wird, konnte mit dem [2Fe-2S]-Cluster durch ein Einschritt-Rekonstitutionsverfahren unter anaeroben Bedingungen supplementiert werden. Es wurde bewiesen, dass anaerobe Bedingungen in einer Argon-Atmosphäre am besten waren (nicht gezeigt). Rekonstitution führte zu lebensfähigen Zellen, welche biologisch aktives Adx auf der Oberfläche exprimierten. Ganze Zellen, welche Adx exprimierten, konnten wirksam zum Transfer von Elektronen von Adrenodoxin-Reduktase zu den P450-Enzymen CYP11A1 und CYP11B1 verwendet werden (4). Eine Aktivität konnte durch Bestimmen von einer Adx-abhängigen Produktbildung von entweder Pregnenolon oder Corticosteron leicht durch HPLC quantifiziert werden. Durch Kalibrieren einer Adx-Aktivität durch gereinigtes holo-Adx im Substratbildungstest konnte die erkennbare Anzahl von aktiven Adx-Molekülen auf mehr als 100,000 Moleküle/Zelle bestimmt werden. Die hohe Kopienanzahl von rekombinanten äußeren Membranproteinen ist auf demselben Niveau, wie es für ein natürliches äußeres Membranprotein OmpA von E. coli berichtet wurde (39). Eine hohe Expression von rekombinantem und chemisch rekonstituiertem aktivem Adx hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von E. coli. Rekonstitution bei einer höheren Temperatur, um ein leichteres Entfalten der Apo-Adx-Peptidkette zu erzielen, führte nicht zu einer besseren [2Fe-2S]-Clusteraufnahme. Überdies verminderten höhere Temperaturen die Anzahl von lebensfähigen Zellen signifikant. Das beste Verhältnis von aktiven Adx-Molekülen exprimiert auf der Oberfläche und lebensfähigen E.-coli-Zellen wurde bei Raumtemperaturbedingungen erhalten (Tabelle 1). Dies zeigt, dass apo-Adx, welches auf der Oberfläche exponiert wird, eine Struktur bildet, welche für eine wirksame [2Fe-2S]-Clusterannahme sogar bei nicht-denaturierenden Bedingungen gut geeignet ist.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Autotransporterweg für die Oberflächenexposition von Proteinen verwendet werden kann, welche eine anorganische prosthetische Gruppe enthalten. Die katalytische Aktivität des rekonstituierten Adx zeigt an, dass es auf der Zelloberfläche frei zugänglich ist, sogar für Moleküle so groß wie AdR oder P450-Enzyme, da ein direkter Kontakt zwischen Adx und AdR beziehungsweise P450 stattfinden muß, um zu Elektronentransfer zu führen (40) (5). Die Expression von mehr als 100,000 aktiven Molekülen pro Zelle ohne Stören der Zelllebensfähigkeit ist nach unserer Kenntnis einzigartig für bakterielle Oberflächenexpositionssysteme, welche bisher angewendet wurden. Es ermöglicht die Bereitstellung einer hohen Adx-Aktivität durch ganze Zellen als Träger oder Protektoren. Dies bietet vielversprechende Optionen für weitere Anwendungen. Auf der einen Seite kann die Rolle von unterschiedlichen Aminosäuren im Elektronentransfer durch Adx oder bei der Interaktion mit seinen Redoxpartnern entweder durch zufällige oder durch rationale Variation des Proteins studiert werden, ohne dass eine Reinigung des mutierten Enzyms notwendig wird. Auf der anderen Seite ist das hier entwickelte System – wirksame Oberflächentranslokation eines entfalteten apo-Proteins und chemische Rekonstitution der prosthetischen Gruppe – ebenso auf Proteine anwendbar, welche FAD, FMN oder Hämgruppen enthalten. Insbesondere Häm-enthaltende P450-Enzyme sind wichtig, da sie in die Synthesen einer großen Vielzahl von wertvollen Produkten involviert sind, aber ebenso in den Abbau von zahlreichen toxischen Verbindungen (41). Mit der Absicht zur Verwendung enzymbeschichteter Zellen für diese Anwendungen könnte eine Autotransporter-vermittelte Oberflächenexposition von z. B. P450-Enzymen eine neue Dimension in der Entwickelung von Ganzzellfabriken eröffnen.
Beispiel 2
Dimerbildung von Adx-Molekülen auf der Oberfläche von E. coli Die SDS-PAGE-Ergebnisse zeigten, dass die Passagierdomäne von FP66 auf der bakteriellen Oberfläche angeordnet ist. Dies konnte durch Westernblotten gestützt werden. Adx wurde nur in der äußeren Membran von unverdauten E.-coli-Zellen detektiert, während Verdau mit Trypsin einen Abbau der immunreaktiven Domäne im Adx-Autotransporter-Fusionsprotein verursachte. Dies zeigte eine Oberflächenzugänglichkeit des N-Terminus' von FP66. Von diesen Standpunkt aus interessierte es zu sehen, ob das oberflächenexponierte Adx in den Überstand freigesetzt werden könnte. Für diesen Zweck wurde Plasmid pJJ004 in E. coli UT2300 vermehrt (42). E. coli UT2300 ist ein isogener Stamm von E. coli UT5600, mit der Ausnahme, dass es die äußere Membranprotease OmpT exprimiert. In früheren Studien wurde gezeigt, dass OmpT Autotransporter-Fusionsproteine auf der bakteriellen Oberfläche spaltet, was zur Freisetzung eines intakten Passagiers führte (15, 23, 34). In unser Experimenten konnten wir jedoch keinerlei Adx in den Überständen von E. coli UT2300 detektieren, welche das Fusionsprotein exprimierten. Um das Schicksal des Passagiers in diesen Stamm aufzuklären, wurden äußere Membranen hergestellt und einer SDS-PAGE und einer nachfolgenden Westernblot-Analyse unterzogen. Durch dieses Mittel stellte es sich heraus, dass OmpT zum Spalten des Adx-Autotransporter-Fusionsproteins nicht ganz in der Lage war. Es war immer noch eine wesentliche Menge von Fusionsprotein mit voller Größe in der äußeren Membran von E. coli UT2300 pJJ004 detektierbar (6), obwohl in einem schwächeren Umfang als in E. coli UT5600. Überdies erschien eine zusätzliche Bande, welche einem Protein mit einer erkennbaren molekularen Masse von etwa 33 kDa entsprach, welche durch das Adx-spezifische Antiserum erkannt wurde. Dies kann durch die Bildung von Dimeren durch den Adx-Passagieranteil der Fusionsproteine erklärt werden, welche vom Autotransporter durch OmpT-Spaltung freigesetzt werden, aber noch mit der äußeren Membran assoziiert bleiben. Das leicht erhöhte erkennbare Molekulargewicht (33 kDa) in Vergleich zum Molekulargewicht von nativen Adx-Dimeren (28 Kda) scheint durch einen Teil der Linkerregion verursacht worden zu sein, welche mit dem Adx-Passagier durch die OmpT-Verarbeitung verbunden blieben (1). Kürzlich hat die Bestimmung der Kristallstruktur gezeigt, dass funktionelles Adx ein Dimer ist (50). Dies wurde früher durch den Mechanismus des P450-abhängigen Elektronentransfers vorgeschlagen, aber es wird gegenwärtig noch diskutiert, ob funktionelles Adx ein Dimer oder ein Monomer ist (31, 37).
Es ist noch nicht klar, warum die Adx-Dimere, welche von der Transporterdomäne abgespalten wurden, an die äußere Membran assoziiert blieben und nicht in den Überstand freigesetzt wurden. Es wurde früher gezeigt, dass Adx nicht nur Dimere bildet, sondern ebenso Tetramere bildet. Aufgrund dieser Sichtweise könnte es möglich sein, dass Adx-Dimere, welche durch OmpT freigesetzt wurden, Hybrid-Tetramere mit Adx-Molekülen bilden, welche noch mit der Oberfläche durch die Autotransporterdomäne verbunden sind. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass gewisse Mengen von Adx in den Überstand freigesetzt wurden, aber unter der Detektionsgrenze blieben. An diesem Punkt scheint es sich zu lohnen zu betonen, dass eine unvollständige Verarbeitung von Autotransporterproteinen durch OmpT nicht alltäglich ist. Es könnte tatsächlich ein Ergebnis eines reduzierten Proteasezugangs aufgrund eines Faltungseinflusses des Adx-Passagiers oder sogar aufgrund einer Adx-Dimer- oder Multimerbildung sein. Durch Supplementierung des Wachstumsmediums mit Metallionen oder anderen Verbindungen erhielten wir ebenso keine vollständige Spaltung der Adx-Autotransporterfusion durch OmpT (7). Die Hypothese von einer Multimerbildung wird durch Ergebnisse gestützt, welche mit ompT-negativem FP66-exprimierenden E. coli UT5600 analysiert durch Westernblotten erhalten wurden. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen erschienen Multimere des Fusionsproteins mit voller Größe, was anzeigt, dass die Interaktion zwischen Adx-Passagiermolekülen stark genug ist, um mehrere Transporterdomänen zusammenzuhalten (8). Eine Proteinbande mit einem erkennbaren Molekulargewicht korrespondierend zu einem Tetramer von freien Adx-Molekülen konnte jedoch nicht ermittelt werden. Es war eine Proteinbande des korrekten Molekulargewichtsbereichs in äußeren Membranpräparationen von E. coli UT2300 vorhanden, welches die Adx-Autotransporterfusion exprimierte. Aber diese Bande erschien ebenso in UT5600, welches die Adx-Autotransporterfusion exprimierte. Deshalb kann es nicht ausgeschlossen werden, dass dies durch unvollständiges Entfalten des β-Fasses verursacht wird (21), was zu einer erhöhten elektrophoretischen Beweglichkeit oder zu irgend einer unspezifischen Kreuzreaktivität führt. Externes Hinzufügen von Trypsin führte sowohl zum vollständigen Verschwinden des Fusionsproteins mit voller Größe als auch des putativen Adx-Dimers (6), was die Oberflächenlokalisation von beiden Formen des Proteins unterstreicht.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Passagierproteine exponiert auf der Oberfläche von E. coli (oder eines beliebigen anderen gram-negativen Bakteriums) durch den Autotransporterweg funktionelle Dimere oder Multimere bilden können. Die Affinität der Passagierdomänen kann zum Steuern der Assoziation von mehreren Transporterdomänen ausreichend sein. Aufgrund ihrer amphiphatischen β-Fass-Struktur erscheint es vernünftig, dass der Transporter sich in der Horizontale der Membran frei bewegen kann. Die hier präsentierten Daten sind die ersten experimentellen Beweise. Dies öffnet die Tür zur Anwendung von Autoexposition auf Enzyme oder andere Proteine, welche funktionelle Dimere oder Multimere sind, selbst wenn ihre Untereinheiten heterogen sind. In diesem Fall können die heterogenen Monomere individuell als Fusionen mit den Autotransporterdomänen simultan in einer Zelle exprimiert werden. Die Affinität der Untereinheiten wird ihre Assoziation auf die Oberfläche steuern und wird nicht durch eine beschränkte Beweglichkeit des membranverankerten β-Fasses gestört (9).
An diesem Punkt scheint es sich zu lohnen zu erwähnen, dass das einfache Hinzufügen von Adr und P450 CYP11B1 oder CYP11A1 zu Zellen, welche Adx mit der prosthetischen Gruppe exponieren, zu einer enzymatischen Aktivität führt. Es war nicht notwendig, eine künstliche Membran oder Detergenzien hinzuzufügen, wie es früher notwendig war, wenn freies Adx anstatt von Adx exponiert auf der E.-coli-Zelloberfläche verwendet wurde. Dies zeigt, dass die Membranumgebung, welche durch P450-Enzyme wie CYP11B1 oder CYP11A1 gebraucht wird, um in eine aktive Konformation zu falten, durch die bakterielle Oberfläche bereitgestellt wird.
Die Assoziation von freien Adx-Dimeren an die äußere Membran kann ebenso durch eine permanente Tendenz von monomeren Adx erklärt werden, Dimere zu bilden, und von dimeren Adx-Molekülen, in Monomere gespalten zu werden. Als Konsequenz könnten OmpT-freigesetzte Adx-Monomere Dimere mit Adx-Molekülen bilden, welche in der Membran durch den Autotransporteranteil verankert sind. Eine mögliche Dimerbildung von Adx-Autotransporter-Fusionsproteinen aufgrund einer Interaktion der Passagierdomäne behindert eine OmpT-Spaltung. Monomerisierung des Adx-Autotransporter-Fusionsproteins erlaubt OmpT-Spaltung, was wieder zu freien Adx-Monomeren führt, welche Dimere entweder mit freigesetzten oder membranverankerten Adx-Moleküle bilden können. Die permanente und schnelle Transformation von Monomeren zu Dimeren und umgekehrt könnte zu einer größeren Tendenz von freigesetzten Adx-Molekülen führen, mit der äußeren Membran assoziiert zu bleiben. In diesen Fall könnten entweder Dimere oder Monomere auf der Oberfläche gefunden werden. Tatsächlich konnten wir in einigen der Experimente immunreaktive Proteinbanden in der Größe von monomerem Adx durch den Adx-spezifischen Antikörper detektieren (7).
Beispiel 3
Zelluläre Oberflächenexposition von dimerem Adx und Ganzzell-P450-vermittelte Steroidsynthese auf E. coli
3.1 Experimentelles Protokoll
Plasmide, bakterielle Stämme und Bedingungen
Die Konstruktion von Plasmid pJJ004, welches eine Fusion von Rinder-Adx und den AIDA-I-Autotransportergenen ist, wurde in Beispiel 1 beschrieben. Plasmid pJJ004 wurde in E.-coli-Stämmen UT5600 (F^– ara14 leuB6 azi-6 lacYI proC14 tsx-67 entA403 trpE38 rfbDI rpsLI09 xyl-5 mt1-I thi1, ΔompT – fepC266) und UT2300 (F^– ara14 leuB6 azi-6 lacYI proC14 tsx-67 entA403 trpE38 rfbDI rpsLI09 xyl-5 mtl-I thil) vermehrt (42). E. coli UT2300 setzt oberflächenexponierte Passagierproteine frei, während E. coli UT5600 nicht fähig ist, die äußere Membranprotease T (OmpT) zu bilden, was zur Oberflächenexposition von Passagierproteinen führt, welche durch den Autotransporterweg transloziert werden (15). Zellen wurden routinemäßig bei 37°C in Luria-Bertani-Brühe (LB-Brühe) enthaltend 100 mg I^–1 Ampicillin, 10 μM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol wachsen gelassen. Für OmpT-Expressionsstudien wurde bis zu 5% Glukose hinzugefügt, und um eine wirklich niedrige Metallionensupplementierung zu erzielen, wurde, wenn angezeigt, Wachstumsmedium mit Leitungswasser hergestellt.
Isolierung von äußeren Membran- und Überstandsproteinen
E.-coli-Zellen wurden über Nacht in LB-Medium wachsen gelassen, und 1 ml wurde zum Inokulieren einer 20 ml Kultur verwendet. Es wurde bei 37°C unter kräftigem Schütteln (200 rpm) kultiviert, bis eine OD₅₇₈ von 0,7 erreicht wurde (Mitt-log-Phase). Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und nach Waschen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) wurden äußere Membranen gemäß dem schnellen Isolierungsverfahren von Hantke (44) hergestellt. Für eine Ganzzellprotease-Behandlung wurden E.-coli-Zellen geerntet, gewaschen und in 5 ml PBS resuspendiert. Trypsin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mg I^–1 hinzugefügt, und die Zellen wurden für 5 min bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen in PBS gestoppt, welche 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, und äußere Membranen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Für eine Präparation der Überstandsproteine wurde eine 20-ml-Kultur von E. coli UT2300 pJJ004 mit 1 ml einer über-Nacht-Kultur inokuliert und bis zur Mitt-log-Phase wachsen gelassen. Zellen wurden geerntet, einmal gewaschen und in 4 ml 10 mM Tris/HCl pH 8,0 für 5 min resuspendiert. Nach Zentrifugation wurden 20 μl 100 mM PMSF-Lösung in Ethanol hinzugefügt, und der vollständige Überstand wurde auf Zentrifugations-Konzentrationssäulen (Viva Science, Lincoln, UK) aufgebracht. Zentrifugation wurde bei 4000 rpm für 20 min durchgeführt, was ein endgültiges Volumens von 40 μl ergab. Das identische Volumen von 2 x Probenpuffer wurde hinzugefügt, und Überstandsproteine wurden durch SDS-PAGE analysiert.
SDS-PAGE und Westernblot-Analyse
SDS-PAGE und Westernblot-Analyse wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Rekonstitution des Eisen-Schwefel-Clusters
Eine chemische Rekonstitution des Eisen-Schwefel-Clusters und Wiederfalten von Adx auf der Oberfläche von E.-coli-Zellen wurde unter strikt anaeroben Bedingungen in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) bei Umgebungstemperatur wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die bakterielle Suspension mit einem gerechneten endgültigen OD₅₇₈ von 50 (4 ml) wurde mit 1 mM β-Mercaptoethanol und 0,2 mM Eisen(II)-Ammoniumsulfat supplementiert und wurde langsam mit 100 ml einer Lösung enthaltend 100 mM Li₂S und 2 mM Dithiothreitol titriert (38). Zellen wurden schließlich zweimal in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen und als Ganzzellaktivitätstests verwendet.
Proteinreinigung
Rekombinantes AdR und CYP11A1 wurde wie beschrieben gereinigt (58). Die Proteinkonzentration wurde berechnet, wobei ε₄₅₀ = 11,3 (mM cm)^–1 für AdR verwendet wurde. Die Konzentration von CYP11A1 wurde durch CO-Differenzspektren von reduzierten Hämoproteinen geschätzt, wobei ε₄₅₀ = 91 (mM cm)^–1 verwendet wurde. Bakterien für die Expression von freien Adx, nicht fusioniert mit den Autotransporterdomänen, wurden wie früher berichtet wachsen gelassen, und rekombinantes Adrenodoxin wurde wie beschrieben gereinigt (32, 46).
Ganzzzellaktivitätstest
Die Adx-abhängige Cholesterinseitenkettenspaltaktivität von Cytochrom CYP11A1 wurde in einem assemblierten System getestet, welches die Umwandlung von Cholesterin zu Pregnenolon katalysiert (68, 67). Tests wurden für 30 min bei 37°C in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,4) durchgeführt und enthielten 100 μl E.-coli-Zellen, 0,5 μM Adrenodoxin-Reduktase, 0,4 μM CYP11A1, 400 μM Cholesterin, 60 μM NADPH und ein NADPH-regenerierendes System. Nach der Seitenketten-Spaltungsreaktion wurden die Steroide durch das Hinzufügen von 2 Einheiten/ml Cholesterinoxidase in ihre korrespondierenden 3-on-4-en-Formen konvertiert und mit Chloroform extrahiert.
HPLC
Extrahierte Steroide wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Jasco LC800-System) analysiert, welches eine 3,9 × 150 mm Nova-Pak-C₁₈-Säule von Waters mit einem isokratischen Lösungsmittelsystem von Acetonitril/Isopropanol (15:1) verwendete.
Größenausschlusschromatographie
Eine Größenausschlusschromatographie wurde auf einem FPLC-System (Pharmacia Biotech) durchgeführt, welches eine Superdex-75-HiLoad-Säule mit einer Flussrate von 45 cm/h verwendete. Der Puffer war 50 mM Kaliumphosphat pH 7,4, welcher 150 mM NaCl enthielt. Als Kalibrierungsstandards wurden die folgenden Proteine verwendet: Aprotinin (6,5 kDa), Cytochrom C (12,4 kDa), Chymotrypsinogen A (25,0 kDa), Ei-Albumin (43,0 kDa) beziehungsweise BSA (68,0 kDa).
3.2 Ergebnisse
Fusionsproteinexpression
Die wirksame Oberflächenexposition von Rinder-Adrenodoxin in Escherichia coli durch den Autotransporterweg kann durch die Konstruktion eines künstlichen Gens erleichtert werden. Dieses Gen kodiert ein Fusionsprotein bestehend aus Adx, einem Signalpeptid und der Translokationseinheit des Adhäsins, welches an der diffusen Adhäsion beteiligt ist (Adhesin involved in diffuse adhesion, AIDA-I), einem natürlichen Autotransporterprotein von E. coli (51) (2B). Die Translokationseinheit enthält das C-terminale β-Fass und eine Linkerregion, welche für eine vollständige Oberflächenexposition der Passagierdomäne notwendig ist (15). Um Adx-Moleküle zu erhalten, welche innerhalb der äußeren Membran durch das transportierende β-Fass verankert sind, was zu einer Oberflächenexposition führt, musste das künstliche Gen in einer Mutante der äußeren Membranprotease T (ompT) von E. coli exprimiert werden. OmpT spaltet Proteine in der Zellhülle von E. coli (42), und die Linkerregion von AIDA-I enthält eine Konsensus-Spaltstelle (R/V) (15). In derartigen Zellen konnte das Fusionsprotein mit voller Größe (FP66) leicht durch Coomassiefärbung von SDS-Polyacrylamidgelen detektiert werden, wenn äußere Membranpräparationen verwendet wurden (10). Neben der Tatsache, dass es die korrekte Größe hatte und nicht in der Kontrolle ohne Plasmid erschien, konnte das Fusionsprotein ebenso durch Markieren mit einem Adx-spezifischen Antikörper in Westernblot-Experimenten identifiziert werden (10B).
Neben FP66 konnten zwei Proteinbanden mit größerem erkennbaren Molekulargewicht in Westernblots detektiert werden (10B Spur 1). Obwohl die Bestimmung des Molekulargewichts für derartige große Proteine in unseren Gelen zur Ungenauigkeit neigt, schienen sie in einem adäquaten Bereich zu liegen, um Multimere des Fusionsproteins mit voller Größe zu sein. Eine Proteinbande wanderte ganz nahe am Molekulargewicht eines Dimers. Ob die zweite Proteinbande eigentlich ein Trimer oder ein Tetramer von FP66 gewesen sein könnte, kann an dieser Stelle nicht unterschieden werden. Beide Proteinbanden wurden jedoch durch den Adx-spezifischen Antikörper markiert, was anzeigt, dass sie die Adx-Passagierdomäne enthielten.
Oberflächenexposition und Dimerbildung von Fusionsproteinen Um zu sehen, ob diese Proteine auf der Oberfläche von E. coli zugänglich waren, wurde Trypsin zu intakten Zellen hinzugefügt, bevor äußere Membranen hergestellt wurden. Da die äußere Membran für Trypsin nicht permeabel ist, zeigt ein Abbau eine Oberflächenexposition an. Wie in 10 gesehen werden kann (Spur 2, A und B) ist das Adx-enthaltende Fusionsprotein mit voller Größe als auch die möglichen Multimerbanden verschwunden. Dies schien durch einen vollständigen Abbau der Adx-Passagiergruppe verursacht worden zu sein, da von Rinder-Adx bekannt ist, dass es zwanzig Trypsin-Konsensusspaltstellen enthält. Die Verarbeitungsprodukte, welche gegenüber einem weiteren Trypsinverdau resistent sind, konnten bei der angewendeten Polyacrylamidkonzentration nicht von OmpF/C getrennt werden. Deshalb führten sie nur zu einer intensiveren Coomassiefärbung von dieser Bande (10A, Spur 2).
Zusammengefasst fanden wir neben dem monomeren Fusionsprotein FP66 zwei zusätzliche Proteine in der äußeren Membranprobenpräparation von E. coli UT5600 pJJ004. Sie sind in einem adäquaten Bereich für Multimere. Beide enthalten die Adx-Domäne und wurden durch Trypsin zu den identischen Produkten wie das monomere FP66 verarbeitet, was anzeigt, dass sie eine identische Translokationseinheit enthalten. Zusätzliche Proteinbanden erschienen als solche nicht, wenn andere Passagierdomänen als Adx mit derselben Translokationseinheit angewendet wurden (15), dies war ein Hinweis, dass wir es mit einer Adx-gesteuerten Dimerisierung oder Multimerisierung eines β-Fasses, welches ein Fusionsprotein enthält, zu tun haben könnten.
Dimeres Adx auf der Oberfläche
Um diese Hypothese zu verifizieren, wurde Plasmid pJJ004 kodierend FP66 in E.-coli-Stamm UT2300 exprimiert. Dieser Stamm ist zu E. coli UT5600 isogen mit der Ausnahme, dass es fähig ist, eine aktive äußere Membranprotease T (OmpT⁺) zu bilden (1). Dies führt zum Freisetzen von Passagierdomänen, welche durch den Autotransporterweg auf die Oberfläche (15) und durch Spaltung innerhalb der Linkerregion in den Überstand (2B) transloziert werden. In Überständen von E. coli UT2300 pJJ004 konnten wir ein Protein detektieren, welches durch den Adx-spezifischen Antikörper markiert wurde (11). Für diesen Zweck wurden Zellen bis zur exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen, geerntet und in Tris/HCl-Puffer für 5 min resuspendiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand konzentriert und einer SDS-PAGE und nachfolgendem Westernblotten unterzogen. Durch dieses Verfahren wurde eine einzelne Proteinbande detektierbar, welche ein erkennbares Molekulargewicht von um 32 kDa hatte, was in der Größe mit Dimeren des Adx-Passagierproteins korrespondierte. Dieses zeigte, dass Adx durch OmpT von der Translokationseinheit als ein Dimer freigesetzt wurde. Die gesamte Menge von freien Adx-Molekülen im Überstand erschien jedoch im Vergleich zur großen Menge von Fusionsprotein in OmpT⁺-E. coli UT5600 ganz niedrig zu sein (10). Deshalb wurden äußere Membranpräparationen von OmpT^–-UT2300 ebenso nach dem Schicksal von Passagier-Adx und dem Fusionsprotein FP66 mit voller Größe analysiert. Wie in 12 gesehen werden kann, wurde eine Verarbeitung von FP66 durch OmpT ziemlich beschränkt. Die Mehrzahl von Fusionsproteinen verblieb in ihrer anfänglichen Größe innerhalb der äußeren Membran. Dies konnte erklären, warum wir nur geringe Mengen von freigesetztem Passagier-Adx im Überstand gefunden haben. Des Weiteren wurde ein Protein mit der äußeren Membran gemeinsam gereinigt, welches eine identische Größe mit den Adx-Dimeren des Überstands hatte und welches durch den Adx-spezifischen Antikörper markiert wurde. Dieses bedeutet, dass OmpT auf der einen Seite FP66 nur schwach verarbeitet hat, und auf der anderen Seite, dass die Mehrzahl von freigesetzten Adx-Passagierdomänen aus mehreren Gründe mit der äußeren Membran assoziiert blieb. Um zu sehen, ob beide Proteine tatsächlich auf der Oberfläche exponiert wurden, wurde Trypsin zu UT2300-pJJ004-Zellen hinzugefügt, bevor äußere Membranen hergestellt wurden. Dies führte zum Abbau von beiden Proteinen, was ihre Oberflächenzugänglichkeit anzeigt (12 und 12B, Spur 2).
Um herauszufinden, ob eine OmpT-Verarbeitung von FP66 und die Freisetzung von Passagier-Adx verbessert werden könnte, wurden Wachstumsbedingungen für E. coli UT2300 pJJ004 variiert. In 13 werden äußere Membranpräparationen von Zellen gezeigt, welche unter verschiedenen Bedingungen gewachsen waren. Expression von FP66 war am besten, wenn Zellen in Anwesenheit von 2-Mercaptoethanol, Glukose und Spurenelementen gewachsen waren. Die OmpT-Aktivität wurde jedoch im wesentlichen nicht verändert. Das Verhältnis von verarbeitetem zu unverarbeitetem FP66 blieb fast konstant. Möglicherweise waren aufgrund der besseren Expression von FP66 in Zellen von Spur 4 ebenso Monomere von Adx detektierbar. In Spur 3 zeigte eine schwache Bande das Monomer ebenfalls, aber es lag fast unter der Detektionsgrenze. Zusammengefasst ist der Versuch zum Verbessern des Überstandsgehalts von Passagier-Adx durch Verändern der Wachstumsbedingungen fehlgeschlagen. OmpT-Aktivität wurde durch diese Strategie nicht stimuliert, und als Konsequenz erhöhte sich die Anzahl von Adx-Molekülen im Überstand im wesentlichen nicht (nicht gezeigt). Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass einige monomere Adx-Moleküle ebenfalls im Überstand gewesen sein könnten. Wenn das Verhältnis Dimer/Monomer im Überstand wie in 13 dargestellt identisch ist (Spur 4), dann waren die Monomere am wahrscheinlichsten unter der Detektionsgrenze.
Um herauszufinden, ob freies Adx, welches nicht mit den Autotransporterdomänen verbunden ist, ebenso Dimere bilden kann, wurde Rinder-Adx nach rekombinanter Expression in E. coli gereinigt und einer Größenausschlusschromatographie unterzogen. Wie in 11 B gesehen werden kann, lag das erkennbare Molekulargewicht von freien Adx bestimmt durch dieses Verfahren (24 kDa) ganz nahe am gerechneten Molekulargewicht eines dimeren Moleküls (28,8 kDa), was anzeigt, dass freies Adx tatsächlich ebenso Dimere bildet.
Rekonstitution des Eisen-Schwefel-Clusters hat keinen Einfluss auf Adx-Dimerbildung auf der bakteriellen Oberfläche
In Beispiel 1 zeigten wir, dass der Eisen-Schwefel-Cluster wirksam in apo-Adx eingeschlossen werden kann, welches auf der E.-coli-Oberfläche exponiert wird.
Adx, welchem der 2[Fe-S]-Cluster fehlt, ist biologisch nicht aktiv. Aufgrund des Autotransporter-Sekretionsmechanismus' kann Adx jedoch nur in einem entfalteten Zustand als apo-Adx ohne prosthetische Gruppe auf die Oberfläche transportiert werden. Die Aufnahme eines Eisen-Schwefel-Clusters erschien unter anaeroben Bedingungen am besten zu sein, wenn Li₂S zu Adx-exprimierenden Zellen in einem Eisen(II)-Ammoniumsulfatpuffer bei Raumtemperatur tropfenweise hinzugefügt wurde. Durch dieses Verfahren wurden Eisen-Schwefel-Cluster gebildet und sofort in apo-Adx eingeschlossen, welches auf der bakteriellen Oberfläche exponiert wurde. Die Zellen überlebten dieses Verfahren und konnten nachher unter aeroben Bedingungen ohne Verlust von Aktivität gehandhabt werden. E. coli UT5600 pJJ004 als auch E. coli UT2300 pJJ004 wurden auf diese Weise behandelt, und äußere Membranen wurden hergestellt und durch SDS-PAGE und Westernblotten analysiert. Die Ergebnisse waren identisch mit denjenigen, welche vor einer chemischen Rekonstitution erhalten wurden (10, 12). In E. coli UT5600 pJJ004 waren Multimere des Fusionsproteins mit der vollen Größe detektierbar, und in E. coli UT2300 pJJ004 blieb die Mehrzahl von Adx, welche von der Transportereinheit freigesetzt wurden, als Dimere mit der Oberfläche assoziiert (nicht gezeigt). Dies zeigt an, dass eine Dimerbildung keine speziale Eigenschaft von apo-Adx ist, welchem der Eisen-Schwefel-Cluster fehlt, und dass eine Aufnahme des Eisen-Schwefel-Clusters eine Dimerbildung nicht beeinflusst.
Ganzzell-Steroidsynthese
Zu ganzen Zellen von E. coli UT5600 pJJ004, welche dimeres holo-Adx exprimieren, wurden gereinigte Adrenodoxin-Reduktase (AdR) und CYP11A1 ohne Detergenzien hinzugefügt, um herauszufinden, welche minimale Anzahl von Bestandteilen eine Steroidumwandlung erlauben würde. CYP11A1, das seitenkettenspaltende Enzym, wandelt Cholesterin zu Pregnenolon um (69). Deshalb wurde Cholesterin als Substrat bereitgestellt, und um hinreichende Reduktionsäquivalente während der gesamten Reaktion aufrechtzuerhalten, wurde zusätzlich ein NADPH-regenerierendes System basierend auf Glukose-6-Phosphatdehydrogenase bereitgestellt. Eine HPLC-Analyse der Reaktion zeigte eine signifikante Pregnenolonbildung. Durch Integration des Produktpeaks wurde die Aktivität als 0,21 nm/h/nmol CYP11A1 berechnet, welche in derselben Größenordnung ist, wie es in detergenzbasierten Steroidumwandlungstests bestimmt wurde. Dies zeigt an, dass ganze Zellen, welche funktionelles Adx auf der Oberfläche exprimieren, eine hinreichende Umwelt für ein P450-Enzym (CYP11A1) bereitstellen, damit es aktiv ist. Hinzufügen von Detergenzien wie früher (68) oder sogar eine Konstitution von Membranvesikeln (63) scheint nicht notwendig zu sein. Da ein Kontakt von AdR, Adx und CYP11A1 benötigt wird, um einen Elektronentransfer zu erhalten (40), können exponierte Adx-Moleküle ihre Reaktionspartner zur bakteriellen Oberfläche steuern, was eine leicht zu handhabende Ganzzell-Steroidsynthese-Nanofabrik ergibt (14). Dieser grundsätzliche Ansatz, welcher hier für CYP11A1 angewendet wird, könnte auf viele andere P450-Enzyme übertragen werden, um eine große Vielfalt von organischen Molekülen zu synthetisieren (Tabelle 1).
3.3. Diskussion
Aus der vorliegenden Untersuchung können zwei wichtige Beobachtungen abgeleitet werden. Zuerst zeigt sie, dass ein rekombinantes Passagierprotein, Rinder-Adrenodoxin (Adx), welches durch die AIDA-I-Autotransportereinheit transloziert wird, Dimere auf der Oberfläche bilden kann. Eine kürzliche Kristallstrukturanalyse zeigte, dass Rinder-Adx ein Dimer ist (50). Funktionelle Betrachtungen über den Elektronentransfer von einem Enzym (AdR) über Adx zu einem anderen (P450) implizierte, dass ein Adx-Molekül in direktem Kontakt mit AdR und ein zweites mit P450 ist, welche dazwischen eine Adx-Adx-Schnittstelle haben. Deshalb erscheint es plausibel, dass die natürliche Affinität von Adx-Passagiermonomeren das β-Fass, welches Fusionsproteine enthält, FP66 auf einen Kontakt richtet. Da bestimmt wurde, dass die Anzahl von Adx-Molekülen exponiert auf der Oberfläche mehr als 10⁵ betrug (siehe Beispiel 1), kann angenommen werden, dass sie nahe genug zusammenkommen. Weil sie frei beweglich sein sollten, können die β-Fässer innerhalb der äußeren Membran keinen großen Widerstand gegen diese Affinität von Passagieren leisten. Nach unser Kenntnis ist dies der erste Bericht von der funktionellen Passagier-gesteuerten Dimerisierung eines Proteins auf der Oberfläche von E. coli.
Es lohnt sich zu betonen, dass Adx-Moleküle zunächst als Monomere von monomeren Genen exprimiert werden. Eine Dimerisierung ist auf sich selbst gerichtet und braucht keinerlei Verbindung zwischen Adx-Monomeren durch ein Linkerpeptid, wie es für sogenannte Einzelkettenantikörper angewendet wird (55). Deshalb kann die Autotransporter-vermittelte Oberflächenexposition von einzelnen Polypeptiden, welche auf der Oberfläche dimerisieren oder multimerisieren können, neue Dimensionen auf dem Gebiet von Biotechnologieanwendungen wie z. B. der Antikörpertechnologie anbieten.
An dieser Stelle kann nicht ausgeschlossen werden, dass es ebenso eine β-Fassgesteuerte Multimerisierung von FP66 sein könnte. Das Autotransporter-β-Fass ist strukturell mit dem β-Fass der sogenannten Porine verwandt, Kanäle für kleine hydrophile Moleküle innerhalb der äußeren Membran. Es wurde gezeigt, dass die Porine wie OmpF Trimere bilden, und es wird angenommen, dass Monomere thermodynamisch instabil sind (65). Da wir niemals eine Multimerisierung von Fusionsproteinen oder freigesetzten Passagierdomänen beobachtet haben, welche einer SDS-PAGE widerstand, wenn ein anderes Passagierprotein als Adx exprimiert wurde, muß die stabile Interaktion in unser Experimenten von Adx selbst verursacht worden sein. Ein gemischtes Szenario, in welchem z. B. das Autotransporter-β-Fass eine Annäherung der Passagierdomänen unterstützt, um schließlich stabile Dimere durch Selbst-Inkontaktbringen zu bilden, könnte erdenklich sein. Aber bis heute gibt es keinen experimentellen Beweis.
Rinder-Adx enthält fünf Cysteine, von welchen vier in die Eisen-Schwefel-Cluster-Bindung involviert sind. Theoretisch könnte das fünfte Cystein für eine Disulfidbindung verfügbar sein. Nach den Kristalldaten (50) kann dies jedoch ausgeschlossen werden. Der Autotransporter, welcher in dieser Adx-Autotransporterfusion verwendet wurde, enthielt überhaupt keine Cysteine (15). Deshalb ist es in unseren Experimenten sehr unwahrscheinlich, dass eine Dimerisierung das Ergebnis einer Disulfidbindung ist. Dies bedeutet, dass eine Dimerbildung durch eine Interaktion oder Bindung verursacht wird, welche ausreichend stabil ist, um 20 min Kochen zu widerstehen und durch das Hinzufügen von β-Mercaptoethanol aufgelöst wird, welche aber keine Disulfidbindung ist. Eine offensichtliche Erklärung könnte sein, dass β-Mercaptoethanol mit dem fünften Cystein reagiert hat, was eine Konformationsänderung verursacht hat, welche die starke Interaktion zwischen den beiden Partnern des Dimers abschwächt. Jedenfalls könnte dies anzeigen, dass im Allgemeinen starke Interaktionen zwischen Proteindomänen vorhanden sein können, welche durch Behandlung mit β-Mercaptoethanol aufgelöst werden können, welche aber keine Disulfidbindungen sind.
Stabile Proteindimere unter Bedingungen von einer SDS-Gelelektrophorese mit reduzierenden Mitteln wurden für Glycophorin A (66) und γ-Glutamyltranspeptidase beschrieben (59). In Glycophorin A spielt ein Methioninrest für eine Dimerisierung durch hydrophobe Interaktionen eine wichtige Rolle. Für γ-Glutamyltranspeptidase wurden starke ionische und/oder hydrophobe Interaktionen diskutiert, während in beiden Fällen Disulfidbindungen nicht involviert zu sein scheinen.
Durch Größenausschlusschromatographie konnten wir verifizieren, dass ebenso freies Adx fähig ist, Dimere zu bilden. Dies zeigt an, dass eine Dimerisierung kein spezielles Merkmal von Adx-Autotransporter-Fusionsproteinen ist, scheint aber für die Funktion von Adx im Allgemeinen relevant zu sein.
Die zweite wichtige Beobachtung von unser Untersuchung ist, dass ganze Zellen, welche funktionelle Adx-Moleküle auf der Oberfläche exprimieren, eine hinreichende Umwelt für P450-Enzyme bereitstellen, welche natürlicherweise membranassoziiert sind, um zu funktionieren. Das Hinzufügen von Detergenzien oder die Rekonstitution von Membranvesikeln ist nicht notwendig. Dies bietet wesentliche Verbesserungen im Zugriff auf die biotechnologischen Möglichkeiten von P450-Enzymen. E.-coli-Zellen, welche Adx auf die Oberfläche exprimieren, könnten mit P450 und AdR geliefert werden und dann als ein Ganzzellträger dienen, um z. B. auf Boden zu zielen, welcher eine Detoxifizierung benötigt. Zellen, welche entsprechend hergestellt werden, können in einen Fermenter für die Synthese von Steroiden oder sekundären Metaboliten von Pflanzen oder Mikroorganismen verwendet werden. Eine Laborevolution könnte ebenso vereinfacht werden, da die Zellen leicht durch Zentrifugation geerntet werden können und – wenn gebraucht – in getrennten Reaktionskammern verteilt werden können.
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Tabelle 1. Substrate von Adx-abhängigen Cytochrom-P-450-katalysierten Reaktionen. Tabelle 2

^a) Systematische Abkürzung gemäß (Nelson et al. 1996)

SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Exposition eines rekombinanten Polypeptids enthaltend eine prosthetische Gruppe auf der Oberfläche einer Wirtszelle umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle transformiert mit einer Nukleinsäurefusion operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz, wobei die Nukleinsäurefusion umfasst: (i) einen Anteil kodierend ein Signalpeptid, (ii) einen Anteil kodierend das rekombinante Polypeptid, welches exponiert werden soll, (iii) gegebenenfalls einen Anteil kodierend eine Proteaseerkennungsstelle, (iv) einen Anteil kodierend einen Transmembranlinker, und (v) einen Anteil kodierend die Transporterdomäne eines Autotransporters, (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen die Nukleinsäurefusion exprimiert wird und das Expressionsprodukt umfassend das rekombinante Polypeptid auf der Oberfläche der Wirtszelle exponiert wird, und (c) Inkontaktbringen des rekombinanten Polypeptids mit einer prosthetischen Gruppe unter Bedingungen, unter denen die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid verbunden wird und ein funktionelles rekombinantes Polypeptid enthaltend die prosthetische Gruppe gebildet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die prosthetische Gruppe einen anorganischen Bestandteil umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die prosthetische Gruppe eine metallenthaltende Gruppe ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Metall aus Kobalt, Nickel, Mangan, Kupfer und Eisen ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die prosthetische Gruppe ausgewählt wird aus [2Fe-2S]-Clustern, [4Fe-4S]-Clustern und Metallporphyrin, z. B. Hämgruppen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die prosthetische Gruppe einen organischen Bestandteil umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die prosthetische Gruppe ausgewählt wird aus flavinenthaltenden Gruppen, z. B. FMN oder FAD, nicotinenthaltenden Gruppen, z. B. NAD, NADH, NADP oder NADPH, Biotin, α2-Microglobulin, Thiaminpyrophosphat, Coenzym A, Pyridoxalphosphat, Coenzym B12, Biocytin, Tetrahydrofolat und Liponsäure.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid auf der Oberfläche der Wirtszelle verbunden wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid auf einer Membranpräparation stammend aus der Wirtszelle verbunden wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei die prosthetische Gruppe mit dem rekombinanten Polypeptid nach Spaltung des rekombinanten Polypeptids von der Wirtszelle oder von einer Membranpräparation davon verbunden wird.
Verfahren zur Exposition eines rekombinanten multimeren Polypeptids auf der Oberfläche einer Wirtszelle umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Wirtszelle transformiert mit einer Nukleinsäurefusion operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz, wobei die Nukleinsäurefusion umfasst: (i) einen Anteil kodierend ein Signalpeptid, (ii) einen Anteil kodierend eine Untereinheit des multimeren Polypeptids, welche exponiert werden soll, (iii) gegebenenfalls einen Anteil kodierend eine Proteaseerkennungsstelle, (iv) einen Anteil kodierend einen Transmembranlinker, und (v) einen Anteil kodierend die Transporterdomäne eines Autotransporters, (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen die Nukleinsäurefusion exprimiert wird und das Expressionsprodukt umfassend die Untereinheit des multimeren rekombinanten Polypeptids auf der Oberfläche der Wirtszelle exponiert wird, und (c) Verbinden der exponierten Untereinheit mit wenigstens einer weiteren Untereinheit des multimeren rekombinanten Polypeptids und Bilden eines funktionellen multimeren rekombinanten Polypeptids auf der Oberfläche der Wirtszelle.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das multimere rekombinante Polypeptid ein Homodimer oder ein Homomultimer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das multimere rekombinante Polypeptid ein Heterodimer oder ein Heteromultimer ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11–13, wobei wenigstens eine Untereinheit des multimeren rekombinanten Proteins eine prosthetische Gruppe enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11–14, wobei ein Homodimer oder ein Homomultimer durch eine Assoziation von mehreren Polypeptiduntereinheiten exponiert auf der Wirtszellmembran gebildet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11–15, wobei ein Heterodimer oder ein Heteromultimer durch eine Assoziation von mehreren verschiedenen Polypeptiduntereinheiten exponiert auf der Wirtszellmembran gebildet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11–14, wobei ein multimeres rekombinantes Polypeptid gebildet wird durch eine Assoziation von wenigstens einer Polypeptiduntereinheit exponiert auf der Wirtszellmembran und wenigstens einer löslichen Polypeptiduntereinheit hinzugefügt zu der Wirtszellmembran.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die hinzugefügte Untereinheit von der exponierten Untereinheit verschieden ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle ein Bakterium ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Bakterium ein gramnegatives Bakterium ist, insbesondere ein Enterobakterium, z. B. E. coli.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transporterdomäne des Autotransporters eine β-Fassstruktur bildet.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Transporterdomäne des Autotransporters ausgewählt wird aus dem AIDA-I-Protein aus E. coli, dem SepA-Protein aus Shigella flexneri, dem IcsA-Protein aus Shigella flexneri, dem Tsh-Protein aus E. coli, dem Ssp-Protein aus Serratia marcescens, dem Hsr-Protein aus Helicobacter mustelae, dem Prn-Protein aus Bordetella ssp., dem Hap-Protein aus Haemophilus influenzae, dem BrkA-Protein aus Bordetella pertussis, dem VacA-Protein aus Helicobacter pylori, dem Oberflächenprotein SpaP, rOmpB oder SIpT aus Rickettsia, der IgA-Protease aus Neisseria oder Haemophilus und Varianten davon.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Transporterdomäne des Autotransporters das AIDA-I-Protein aus E. coli oder eine Variante davon ist.
Wirtszelle exponierend ein funktionelles rekombinantes Polypeptid auf der Oberfläche, wobei das rekombinante Polypeptid eine prosthetische Gruppe enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24, wobei das rekombinante Polypeptid durch die Transporterdomäne eines Autotransporters exponiert wird.
Wirtszelle gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei das Polypeptid ausgewählt wird aus Ferredoxinen, P450-Reductasen, Cytochrom b5, P450-Enzymen, Flavoproteinen und beliebigen Kombinationen davon.
Wirtszelle exponierend ein funktionelles rekombinantes Polypeptid auf der Oberfläche, wobei das rekombinante Polypeptid ein multimeres Polypeptid ist, welches wenigstens zwei Polypeptiduntereinheiten enthält.
Wirtszelle gemäß Anspruch 27, wobei wenigstens eine Untereinheit des multimeren Polypeptids durch die Transporterdomäne eines Autotransporters exponiert wird.
Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 24–28, welche eine bakterielle Wirtszelle, insbesondere eine gramnegative bakterielle Wirtszelle ist.
Membranpräparation, welche aus einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 stammt.
Verwendung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 oder einer Membranpräparation gemäß Anspruch 30 für ein chemisches Syntheseverfahren.
Verwendung gemäß Anspruch 31 zur Synthese von organischen Substanzen ausgewählt aus Enzymsubstraten, Wirkstoffen, Hormonen, Ausgangsmaterialien und Zwischenprodukten für Syntheseverfahren und chiralen Substanzen.
Verwendung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 oder einer Membranpräparation gemäß Anspruch 30 für ein gerichtetes Evolutionsverfahren.
Verwendung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 oder einer Membranpräparation gemäß Anspruch 30 als ein Testsystem für ein Screeningverfahren, z. B. zur Identifizierung von Modulatoren von P450-Enzymen.
Verwendung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 oder einer Membranpräparation gemäß Anspruch 30 als ein System zur Toxizitätsüberwachung.
Verwendung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 24–29 oder einer Membranpräparation gemäß Anspruch 30 als ein System zum Abbau toxischer Substanzen.