EP2609204A1 - Ganzzell-biokatalysator - Google Patents

Ganzzell-biokatalysator

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Publication number
EP2609204A1
EP2609204A1 EP11749822.0A EP11749822A EP2609204A1 EP 2609204 A1 EP2609204 A1 EP 2609204A1 EP 11749822 A EP11749822 A EP 11749822A EP 2609204 A1 EP2609204 A1 EP 2609204A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
cell
redox factor
redox
regenerating
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11749822.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Joachim Jose
Ruth Maas
Eva Kranen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Original Assignee
Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG filed Critical Zyrus Beteiligungs GmbH and Co Patente I KG
Publication of EP2609204A1 publication Critical patent/EP2609204A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/03—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with oxygen as acceptor (1.6.3)
    • C12Y106/03001—NAD(P)H oxidase (1.6.3.1), i.e. NOX1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins

Definitions

  • the invention relates to a nucleic acid molecule comprising (1) a portion encoding a signal peptide, (2) a portion which omits a heterologous redox factor-regenerating polypeptide or a variant thereof, (3) optionally, a portion encoding a protease recognition site (4) a portion encoding a transmembrane linker; and (5) a portion encoding a transporter domain of an autotransporter or a variant thereof.
  • Oxidoreductases are characterized by comprising not only at least one polypeptide chain but also one or more redox-reactive groups, which may be one or more redox-reactive amino acid side chains or prosthetic groups.
  • the substrates of the oxidoreductases include metabolic products and redox factors.
  • these substrate redox factors do not act as catalysts, but participate in the reaction in stoichiometric amounts and undergo chemical reactions with other substrates.
  • redox factors are generally much more expensive than other organic substrates, the feasibility of industrial syntheses using oxidoreductases is limited because of the need to provide suitable reduced or oxidized factors. To solve this problem, scientists have proposed the use of redox factor regenerating enzymes.
  • FDH formate dehydroxygenase
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Such enzymes should be immobilized on suitable supports for several cycles of catalysis to avoid having to repeatedly purify large quantities of the polypeptides.
  • redox factor regenerating enzymes are often unstable, especially when present as immobilized enzymes.
  • the object of the present invention is to provide an agent with a redox factor-regenerating activity, wherein the source of the activity is not only readily accessible to substrate molecules, but can be easily amplified, recycled and regenerated to allow multiple catalytic steps, without it being necessary to repeatedly prepare new agent.
  • Another object of the present invention is to provide an agent which by itself or in the presence of potentially inactivating chemicals, such as inhibiting metal ions, or at acidic or basic pHs, has a redox factor regenerating activity with better properties than the original form of the corresponding Enzyme in terms of kinetics, thermal stability, shelf life and stability.
  • an object of the present invention It is to provide an agent which, in the presence of oxygen or oxygen-releasing agents or under oxidizing conditions, exhibits a stable redox factor-regenerating activity, the stability of which is better than that of the original form of the corresponding enzyme.
  • redox-factor regenerating enzymes can be expressed on the surface of an entire cell using the autotransporter system and are intrinsically surprisingly stable with respect to the presence of oxygen and various temperatures and conditions.
  • the subject invention has surprisingly found that redox factor regenerating enzymes can be incubated and remain stable for a long time in various solutions and buffers under various conditions.
  • Autodisplay is an elegant tool for presenting recombinant proteins to the bacterial surface.
  • This expression system is based on the secretory mechanism of the protein family of car transporters belonging to the type V secretion system.
  • Autotransporter proteins are synthesized as precursor proteins that fulfill all structural requirements for transport to the cell surface (Jose, 2006). They are synthesized with an N-terminal signal peptide, which is typical of the See pathway, which allows traversing the inner membrane. Once in the perip! Asma, the C-terminal part of the precursor folds into the outer membrane after truncation of the signal peptide as a porin-like structure, a so-called ⁇ -barrel.
  • the N-terminal bound passenger domain is transiently transcribed to the surface (Jose et al., 2002). There, it can be cleaved off - either autoproteolytically or by an additional protease - or can remain anchored to the cell membrane via the transporter domain. Replacement of the natural passenger with a recombinant protein results in its surface translocation. To do this, a non-natural precursor must be constructed using genetic engineering techniques a signal peptide, the recombinant passier, the ⁇ -barrel, and a linker region therebetween, which is required for unrestricted access to the surface.
  • the AIDA-I car transporter has been used successfully for efficient surface presentation of various passenger domains (Henderson et al., 2004).
  • self-association of subunits to an active enzyme was observed, for example, in the dimeric enzyme sorbitol dehydrogenase (Jose, 2002, Jose and von Schwichow, 2004).
  • auto-display technology is an expression method for certain proteins on the outer membrane surface of E. coli and other Gram-negative bacteria, the auto-display system being based on the natural secretory mechanism of auto transporter proteins (A. Banerjee et al. (2002)) ,
  • the transport of the recombinant passenger protein can be carried out simply by introducing, in reading frame, its coding sequence between the signal peptide and the translocating domain of the autodisplay vector using standard genetic engineering techniques.
  • the signal peptide may be derived from a subunit of the cholera toxin, and it may be combined with a non-natural promoter.
  • the passenger protein that is to undergo translocation through the outer membrane is expressed as a recombinant fusion protein with another protein, called an auto transporter, on the outer membrane of E. coli (AIDA-i) (Jose, 2006).
  • the C-terminal part of the car transporter protein forms a porin-like structure ( ⁇ -barrel) within the outer membrane of E. coli. This porin-like structure allows translocation of the recombinant pass protein to the outer membrane surface of E. coli (Jose, 1995, 2006, 2007).
  • a nucleic acid molecule comprising (1) a portion encoding a signal peptide, (2) a portion containing a heterologous redox factor regenerating polypeptide or a variant thereof, (3) optionally a portion encoding a protease recognition portion, (4) a portion encoding a transmembrane linker, and (5) a portion encoding a transporter domain of an autotransporter or a variant thereof ,
  • the nucleic acid molecule is operably linked to a sequence for expression regulation.
  • expression repression sequence refers to a nucleic acid sequence which can regulate the level of expression of a nucleic acid molecule, preferably downstream of the expression regulation sequence
  • the sequence for expression regulation may be, for example, a promoter.
  • the person skilled in the art is familiar with sequences suitable for expression regulation and methods for the functional connection of these sequences with a nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule is part of a recombinant plasmid.
  • the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1 or variants thereof.
  • heterologous refers to a nucleic acid constructed using genetic engineering techniques, for example, by assembling an expression regulation sequence and a sequence to be expressed that does not normally have that sequence for expression regulation subordinate, or by Use a sequence that has a point mutation with respect to the original sequence. Consequently, even if only a section of a construct is called heteroiog, it implies that the entire construct is heteroiogical.
  • the person skilled in the art is familiar with genetic engineering methods.
  • heteroiog means that the portion of the nucleic acid encoding the redox factor-regenerating polypeptide is from at least one other organism another section, such as the transporter domain or the expression regulation sequence or the transmembrane linker, has been obtained or taken.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is heterologous when recovered from Lactobacillus brevis but all other sequences were obtained from E. coli.
  • heteroiog means that the nucleic acid sequence termed heteroiogue is from an organism other than the host or intended host used to express or amplify that nucleic acid sequence.
  • the term "signal peptide” refers to a sequence of amino acids, preferably at the N-terminus of a polypeptide, which causes the polypeptide, when expressed in the cytosome of a host cell, to become one
  • the host cell is a Gram-negative bacterial cell and the signal peptide causes the resulting or final polypeptide to translocate into the peripiasma or outer membrane of the Gram-negative bacterial cell.
  • protease recognition site refers to a particular amino acid sequence motif in a polypeptide, this sequence motif of said protease is specifically recognized such that it binds and cleaves the polypeptide.
  • transmembrane linker refers to a flexible polypeptide portion useful for linking the auto-transporter domain to the redox factor-regenerating polypeptide but flexible enough to independently fold and / or transport the protein redox factor-regenerating polypeptide.
  • the term "transporter domain of an auto-transporter” refers to a domain that can be used to obtain the expression product of the nucleic acid molecule when synthesized ribosomally in the interior of the cell, preferably in bacterial cytopiasma, and to the outside Membrane of the cell, preferably translocated to the side of the outer membrane exposed to the cell environment
  • the transporter domain causes said expression product to be on the outer surface of the outer membrane
  • the transporter domain of an auto-transporter is a protein located on the outer membrane of the cell, and the NADH oxidase-encoding portion is part of or fused to a domain, loop, or other portion of the transporter domain, so that the di e NADH oxidase is presented on the surface of the cell.
  • the transporter domain of an auto-transporter is a protein of a system that can be used to present polypeptides on the surface of a cell.
  • the transporter domain is a transporter domain of the autodisplay system, also referred to as the autotransporter pathway, of the AIDA-I type Gram-negative bacterial tern.
  • variants of amino acids or nucleic acid sequences which are explicitly referred to in the present application, for example by the name or the accession number or even by the term “variant of”, or implicitly, for example by a description of the function, are included of the present invention
  • the term “variant” as used herein includes amino acid or nucleic acid sequences corresponding to 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% with the reference
  • the term "variant" with respect to an amino acid sequence includes those amino acid sequences that have a conservative amino acid exchange or multiple conservative amino acid substitutions with respect to the reference sequence.
  • the terms "variants" of an amino acid sequence or nucleic acid sequence include active portions and / or fragments of the amino acid sequence or nucleic acid sequence
  • the term “active portion” as used herein refers to an amino acid sequence or nucleic acid sequence shorter than the full length amino acid or nucleic acid sequence, but at least some of its essential biological activity, e.g. As an NADH oxidase.
  • the term "variant" of a nucleic acid includes the nucleic acids of the complementary strand that hybridize to the reference nucleic acid, preferably under stringent conditions
  • the stringency of hybridization reactions is readily determinable by one of ordinary skill in the art and is usually empirical as a function of In general, longer probes require higher temperatures for proper annealing, while shorter probes require lower temperatures
  • Hybridization generally depends on the ability of the denatured DNA to renaturate when complementary strands are present in an environment whose temperature is lower than the melting temperature of the strands, the higher the degree of homology sought between the probe and a hybridizable sequence, the higher the relative Temperature that can be applied.
  • the term "variant" of a nucleic acid or amino acid refers to a nucleic acid or amino acid having, at least to some extent, the same biological activity and / or function as the reference nucleic acid or amino acid
  • the term “variant” refers to a Nucleic acid sequence, as used herein, to another nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence that is similar to the reference amino acid sequence.
  • the term "redox factor” refers to an organic compound that is redox-reactive, ie, that can be oxidized or reduced under physiological conditions.
  • the redox factor does not comprise any redox-reactive amino acid side chains
  • the redox factor is a free redox factor, that is, it is not covalently bound to a peptide backbone or peptide.
  • the redox factor has a standard reduction potential of not more than 0.85 (ie, for high 0.6V), 0.5, 0.4, 0.2, 0, -0.1, -0.15, -0.2, -0.25, -0.3, or -0.4V up.
  • the redox factor has a standard reduction potential of -0.325 to -0.2V.
  • the redox factor has a standard reduction potential of -0.35 to -0.3.
  • the term "redox factor-regenerating polypeptide” as used herein refers to a polypeptide that catalyzes the regeneration of a redox factor.
  • the term "regenerating a redox factor” as used herein refers to the ability to to reduce an oxidized redox factor that acts as a reducing agent in its reduced form in a chemical synthesis, or the ability to oxidize a reduced redox factor, which in its oxidized form in a chemical synthesis as Oxidationsmitte! acts.
  • the term "regeneration of a redox factor” as used herein refers to the restoration of the redox state of a redox factor, preferably the state in which it could be used for a synthesis of interest, most preferably a synthesis by For example, NAD + consumed in a reaction can be regenerated by oxidizing NADH to NAD + .
  • the redox factor which is regenerated by the redox factor-regenerating polypeptide is selected from the group comprising NADH, NADPH, FADH 2l heme, metal ions, Glutathione, pyrroloquinoline quinone (PQQ), pyridoxal phosphate, thiamine pyrophosphate and ascorbate.
  • Metal ions include, but are not limited to, Fe, Cu, Zn, Ni, Co, Mn, Cr, and Mg ions.
  • each of the aforementioned redox factors has both the oxidized and reduced forms or forms of the corresponding conjugated redox couple, for example, both NADH and NAD 1 " in the case of the redox factor NADH, although only one form is expiicitly mentioned.
  • the redox factor-regenerating polypeptide comprises one or more flavin cofactors.
  • flavin cofactor refers to a redox-reactive cofactor based on the isoafoxazine ring system
  • flavin cofactor is selected from the group comprising riboflavin, flavin mononucleotide (FMN) and fiavin adenine dinucleotide (FAD), both in their oxidized and reduced forms.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is selected from the group comprising NADH oxidase, formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is selected from the group comprising the NADH oxidases from the genera Lactobacillus, T ermus, Brevibacterium and Streptococcus, preferably the NADH oxidase from Lactobacillus brevis, and variants of it.
  • the transporter domain of an autotransporter is selected from the group comprising Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1, SphB1 , AspA / NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espi, EaaA, EaaC , Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21, AgA1 protease, App, Hap, rOmpA, rmpmp, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB and variants thereof.
  • the term "transporter domain of an auto-transporter” as used herein includes a domain presenting a polypeptide other than the transporter domain, particularly a redox factor-regenerating polypeptide, on the surface of a cell when said protein has been inserted into or fused to the amino acid sequence of the transporter domain.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is fused to a transporter domain of an auto-transporter.
  • the transporter domain of the autotransporter according to the invention may be any transporter domain of an auto-transporter and is preferably capable of forming a ⁇ -barrel structure.
  • a detailed description of the ⁇ -barrel structure and preferred examples of ⁇ -barrel auto-transporters are disclosed in WO 97/35 022 and incorporated herein by reference.
  • Henderson et al. describe auto-transporter proteins with suitable auto-transporter domains (a summary can be found in Table 1 of Henderson et al., 2004). The disclosure of Henderson et al. (2004) is incorporated herein by reference.
  • the transporter domain of the autotransporter can be selected from: Ssp (P09489, S. marcescens), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens), Ssp-h2 (BAA 11383, S. marcescens), PspA (BAA 36466, P. fluorescens), PspB (BAA36467, P. fluorescens), Ssa1 (AAA80490, P. haemolytica), SphB1 (CAC44081, pertussis), AspA / NalP (AAN71715, N. meningitidis), VacA (Q48247, H.
  • aeruginosa Lip-1 (P40601, X. luminescens), McaP (AAP97134,. catarrhalis), BabA (AAC38081, py / o / 7), SabA (AAD06240, H. py / ⁇ ), AlpA (CAB05386, H. py / on), Aae (AAP21063, ⁇ . actinomycetemcomitans), NanB (AAG35309, P haemolytica) and variants of these car transporters.
  • Genbank accession numbers and species from which the autotransporter can be obtained are given in the form of a killer.
  • the transporter domain of the autotransporter is the AIDA-i protein of E. coli or a variant thereof, such as those described by Niewert et al. (2001).
  • the AIDA autotransporter system has been associated with F18 and Stx2e in pig / o-isolates from pigs diagnosed with edema and so-called post-weaning.
  • Variants of the above-described auto transporter sequences can be obtained, for example, by altering the amino acid sequence in the loop structures of the ⁇ -barrir which do not belong to the transmembrane sections.
  • the nucleic acids encoding the surface shingles can be completely deleted.
  • conservative amino acid substitutions ie, the replacement of one hydrophilic with another hydrophilic amino acid and / or the replacement of one hydrophobic with another hydrophobic amino acid, can be made.
  • a variant at amino acid level has a sequence identity of at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% with the corresponding naturally occurring sequence of the autotransporter domain, especially in the area of beta-sheet structures.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is oxygen sensitive.
  • oxygen sensitive means that the corresponding polypeptide undergoes rapid deactivation in the presence of oxygen, preferably at normal, ie, atmospheric, concentrations.
  • the redox factor-regenerating polypeptide is a soluble polypeptide.
  • the term "soluble polypeptide" as used herein refers to a polypeptide that is not bound to a membrane in its natural environment
  • the Lactobacillus brevis NADH oxidase, a cytosolic protein is a soluble polypeptide
  • the redox factor-regenerating polypeptide is a membrane-bound polypeptide, ie, a polypeptide that is covalently or non-covalently bound or attached to a cell membrane or an integral membrane protein
  • the complex IV of the respiratory chain is a membrane-bound polypeptide.
  • the object of the present invention is achieved by a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule according to an embodiment of the first aspect of the present invention.
  • the polypeptide comprises SEQ ID NO: 2 or variants thereof.
  • the object of the present invention is achieved by a cell which has on its surface a polypeptide according to the second aspect expressed or transformed using a nucleic acid molecule according to an embodiment of the first aspect of the present invention.
  • the cell or host cell is a prokaryotic cell, preferably a Gram-negative bacterial cell, most preferably an E. coli cell
  • the cell is a eukaryotic cell
  • the cell or host cell is a spore of a prokaryote.
  • the object of the present invention is achieved by a membrane fraction which can be obtained from the cell according to the third aspect of the present invention.
  • a bacterial cell comprises a series of compartments separated by hydrophobic membranes.
  • a Gram-positive bacterial cell has a plasma membrane that confines the cytosol, the interior of the cell. The plasma membrane is surrounded by a peptidoglycan layer.
  • Gram-negative bacteria have, in addition to the plasma membrane, another membrane called the outer membrane.
  • a polypeptide according to the present invention is expressed on the outside of the outer membrane of a Gram-negative bacterial cell
  • a polypeptide according to the present invention on the inside of the outer membrane of a Gram-negative Bacterial cell expressed.
  • the polypeptide of the invention is expressed on the outside of a spheroplast, which is a Gram-negative bacterial cell in which the outer membrane has been removed.
  • a spheroplast which is a Gram-negative bacterial cell in which the outer membrane has been removed.
  • the polypeptide according to the invention is expressed on the outside of a gram-positive bacterial cell.
  • the membrane fraction or the membrane preparation comprises a redox factor-regenerating polypeptide according to the first aspect of the invention, preferably in a catalytically active state.
  • the terms "membrane fraction” and “membrane preparation” as used herein preferably refer to a product that accumulates in membrane constituents, preferably constituents of the outer membrane of a Gram-negative bacterium.
  • membrane preparations One skilled in the art will be familiar with methodology and procedures that can be used to prepare membrane preparations.
  • bacterial cells can be harvested from a culture and lysed, for example by freeze-thaw cycles, sonication, resuspension in lysis buffer or the like, followed by differential centrifugation to isolate membrane fractions of the cells.
  • the membrane preparation is an outer membrane preparation, ie a preparation in which the outer membrane constituents are enriched compared to the constituents of other membranes and compartments, such as the cytosol, inner membrane and periplasm are.
  • an outer membrane preparation ie a preparation in which the outer membrane constituents are enriched compared to the constituents of other membranes and compartments, such as the cytosol, inner membrane and periplasm are.
  • One of ordinary skill in the art will be familiar with methodology and procedures that may be used to isolate or enrich the outer membrane or components thereof, such as lysozyme treatment of bacterial cells and subsequent centrifugation steps.
  • the membrane fraction may be a treated membrane fraction, ie, the content or properties of the membrane fraction have been altered, for example by purifying a protein component of the membrane fraction or by solubilizing the membrane fractions and / or incorporation of components the membrane fraction in vesicles.
  • the membrane fraction may be immobilized - for example on the surface of a vessel or column.
  • the object of the present invention is achieved by a method for regenerating a redox factor, comprising the following steps: a) providing the polypeptide according to the second aspect, the membrane preparation according to the fourth aspect or the cell according to the third aspect of the present invention and b) contacting the polypeptide according to the second aspect, the membrane preparation according to the fourth aspect or the cell according to the third aspect with at least one substrate of the redox factor-regenerating polypeptide.
  • step a) and / or step b) take place in the absence of a reducing agent and / or in an oxidative environment.
  • the object of the present invention is achieved by using the cell according to the third aspect or the membrane fraction according to the fourth aspect or the polypeptide according to the second aspect for regenerating a redox factor.
  • the object of the present invention is achieved by the use of the cell according to the third aspect, the membrane preparation according to the fourth aspect and the polypeptide according to the second aspect of the present invention for adjusting the redox environment of an aqueous solution, preferably by deoxidizing the aqueous Solution.
  • the term "adjusting the redox environment of an aqueous solution” as used herein refers to any action directly related to the redox conditions in an aqueous solution, ie, the ability of the solution to oxidize or bind a compound
  • the term "deoxygenating an aqueous solution” as used herein refers to any action that can be taken to reduce the concentration of oxygen in that solution.
  • the person skilled in the art is familiar with methods for measuring the oxygen concentration in an aqueous solution can be used, such as the use of oxygen electrodes.
  • the object of the present invention is achieved by a method of producing a cell presenting on its surface a redox factor-regenerating polypeptide, comprising: (a) introducing the nucleic acid into a cell according to an embodiment of the first aspect of the present invention and b) optionally contacting the cell with one or more redox reactive prosthetic groups.
  • the object of the present invention is achieved by a method for producing the product of a redox factor-dependent polypeptide, comprising the following steps: a) providing a redox factor-dependent enzyme and (b) contacting the redox-factor-dependent polypeptide with one or more of its substrates in the presence of the line according to the third aspect, the membrane preparation according to the fourth aspect and the polypeptide according to the second aspect of the present invention, whereby the polypeptide according to the second aspect regenerates the redox factor on which the redox factor-dependent polypeptide depends .
  • the term "redox factor-dependent polypeptide" as used herein refers to a polypeptide having a biological activity, preferably an enzyme activity, which requires a redox factor as cofactor, prosthetic group or, preferably, substrate.
  • the object of the present invention is achieved by a composition comprising the cell according to the third aspect, the membrane preparation according to the fourth aspect and the polypeptide according to the second aspect of the present invention, and a redox factor-dependent polypeptide and the redox factor.
  • the redox factor-dependent polypeptide is presented using the autotransporter system, ie, its expression is effected by a nucleic acid comprising: (1) a portion encoding a signal peptide, (2) a portion that is a preferably heterologous one redox factor-regenerating polypeptide or a variant thereof, (3) optionally one Section encoding a protease recognition site; (4) a section encoding a transmembrane linker; and (5) a section encoding a transporter domain of an autotransporter or a variant thereof.
  • Fig. 1 shows the restriction map of the plasmid pAT-NOx.
  • Figure 2 shows an SDS gel showing NADH oxidase in the outer membrane of E. coli as well as orientation by whole cell digestion.
  • M molecular weight standard; 1) E. coli UT 5600 ⁇ DE3); 2) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx, not induced; 3) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx induced; 4) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx induced, digested with proteinase K; 5) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx induced, digested with trypsin.
  • Fig. 3 shows absorbance spectra of the supernatant following an NADH oxidase assay using A) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx and ⁇ ) E. coli BL21 (DE3) paT-NOx, each after 1 h of induction ,
  • Fig. 4 shows the absorption spectra of the supernatant following an NADH oxidase assay using A) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx and B) E. coli BL21 (DE3) paT-NOx, each after 4 hours Induction.
  • Figure 5 shows the absorption spectra of the supernatant following an NADH oxidase assay using A) E. coli UT5600 (DE3) pAT-NOx and B) E, coli BL21 (DE3) paT-NOx, each after 20 h Induction.
  • Fig. 6 shows the results of the NADH oxidase assay performed on microtiter plates using E. Coli BL21 (DE3) pAT-NOx after growth in M9 medium. The figure shows the decrease in absorbance at 340 nm over time.
  • Figure 7 shows the results for the NOX whole cell biocatalyst stored at + 8 ° C for more than 7 weeks.
  • the activity test was performed with cells pre-stored [A] and cells given one week [B], two weeks [C], three weeks [D], four weeks [E], five weeks [F], six weeks [G] and seven weeks [H] had been stored.
  • Figure 8 shows the results for the NOX whole-cell biocatalyst stored at -18 ° C for more than 7 weeks.
  • the activity test was carried out with cells before storage [A] and lines lasting one week [B], two weeks [C], three weeks [D], four weeks [E], five weeks [F], six weeks [G ] and seven weeks [H] had been stored.
  • Figure 9 shows the results for the NOX whole cell biocatalyst stored at -70 ° C for more than 7 weeks.
  • the activity test was carried out with cells before storage [A] and cells that lasted one week [B], two weeks [C], three weeks [D], four weeks [E], five weeks [F], six weeks [G ] and seven weeks [H] had been stored.
  • Fig. 10 shows the determination of the number of cells in samples stored for stability tests for more than seven weeks. It is the decrease in the number of cells in samples stored at -18 ° C ( ⁇ ), as well as the decrease in the number of cells in samples stored at + 8 ° C ( ⁇ ) and in samples stored at -70 ° C (A).
  • 50 ⁇ were taken from a stored sample and used to prepare a series of dilutions. 50 ml of each of the 10 ⁇ 9 - and 10 "0 dilutions was plated on 30 mg / i kanamycin LB agar plates The plates were incubated at 37 ° C overnight, and the next day, the colonies were counted the number.. of cells / ml was calculated based on the number of co-ionizing units.
  • Figure 13 shows the regeneration of NAD + , more specifically the concentration of NADH as a function of absorbance at 340 nm over time, especially the NADH concentration during the AIDH reaction and during the AIDH reactions using E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx.
  • the NADH concentration was normalized by calculating the quotient E 3 ( , 0 / E59o relative to the number of cells: AIDH 30 mU, E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx OD 5, E. coli BL21 (DE3) OD 1, reaction started by 400 ⁇ NAD + .
  • NADH oxidase The activity of NADH oxidase was detected by a photometric assay.
  • NADH shows two extinction maxima, namely at the wavelengths 260 nm and 340 nm, while NAD + shows only one maximum, at 260 nm. This difference can be exploited to follow the oxidation of NADH to NAD * photometrically.
  • FAD was added to the nutrient media or buffers used to allow proper folding of the enzyme as well as uptake of FAD.
  • the cells were first stored on ice for 15 minutes and then pelleted by sedimentation at 5000 rpm for 10 minutes. The sediment was washed twice in 20 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.5, 10 ⁇ FAD. The OD of the cells was then adjusted to 50 with the same buffer.
  • the test for detecting NADH oxidase activity was carried out with 1 m! Samples containing 0.1 M potassium sulfate buffer, pH 7.5, 1 mM DTT and 100 ⁇ M NADH as substrate. Cells were assayed at a final OD 578 of 1 in the test After one hour of incubation at room temperature, the cells were removed from the samples by centrifugation. The supernatant spectra were recorded at wavelengths between 200 and 400 nm.
  • coli BL21 (DE) pAT-NOx uninduced cells convert about half of the NADH offered into NAD + , while induced cells transduce all NADH present thus explain that the T7 system used for the expression of NADH oxidase is not "dense", ie that the repression of the T7 promoter is incomplete, which leads to low expression of the gene by T7 polymerase even in the uninduced state .
  • E. coli UT5600 (DE3) shows no activity in the uninduced state, however, induced cells convert only about half of the NADH.
  • the optical assay was transferred to microtiter plates to allow parallel observation of as many samples as possible.
  • NADH oxidase assay on microtiter plates The NADH oxidase assay for 96-well microtiter plates was performed in samples of 240 ⁇ per well in 0.1 M potassium phosphate buffer. The cells were used in amounts such that an OD578 of 1 was achieved in the assay. 200 ⁇ NADH was added to start the reactions. After a 0, 3, 7, 15, 30, 45, or 60-minute incubation at room temperature, the assay was monitored in a microtiter plate at 340 nm (Mithras, Berthold Technologies). In order to avoid sedimentation of the cells, the plate was shaken before the absorbance measurement. As a reference, a cell suspension of the corresponding OD in buffer was used.
  • the product tint of the NADH oxidase whole cell catalyst could be optimized to have i) higher activities, ii) increase the difference between induced and uninduced cells, and iii) only one in the nonsense controls low activity occurred.
  • the culture used to measure NADH oxidase must be in an optimal state.
  • Figure 6 shows the results of an NADH oxidase assay performed under standard conditions as described in the section "Methods".
  • the NADH oxidase assay was then performed directly in the cell suspension as described above in the microtiter plate and observed. This makes handling much easier and the data is easier to reproduce. A determination of absolute values of the enzyme activity is not possible.
  • the activity of enzymes determined by a photometric method is calculated according to Lambert-Beer's law. In order to apply this equation, the layer thickness of the cuvette or the 96-weli plate must be known. In the present experimental approach, this parameter can not be determined. Therefore, the activity of NADH oxidase was determined with a photometer, using cuvettes with a defined layer thickness of 1 cm. Consequently, the Lambert-Beer law can be applied.
  • the activity in the LB medium was determined to be 12.23 mU / ml.
  • the activity at 30 ° C in the M9 medium was slightly higher, namely 16.38 ml / ml.
  • Hummel et al. (2003) reported the activity of a readily purified enzyme at 10-15 U / mg.
  • Step Example! 3 Stability and storage stability test of the NADH oxidase whole cell catalyst
  • induced cells were stored at 8 ° C in the refrigerator or at -18 ° C or at -70 ° C in the freezer. These cells were checked weekly by triplicate with the NADH oxidase assay.
  • 20% glycerol was added to the freeze buffer.
  • the cells were diluted to OD 573 -1 in 200 ⁇ l samples with the above-mentioned buffer and then 0.2mM NADH was added to start the reaction.
  • the host strain E. coli BL21 (DE3) was similarly stored and subjected to the same type of activity assay as the whole cell biocatalyst BL21 (DE3) pAT-NOX.
  • the panels in Figure 7 show the decrease in NADH concentration in cell suspensions of different ages stored at 8 ° C.
  • the host strain E. coli BL21 (DE3) used as a control does not show any NADH activity before storage.
  • a marked decrease in the NADH concentration in the test can be detected in these host cells, the decrease being more pronounced the longer the storage takes.
  • the number of living cells has been determined parallel to the activity of the biocatalyst.
  • the results are shown in FIG.
  • the number of live cells decreases by three within the first four weeks Orders of magnitude.
  • the number of living cells remains relatively constant. This curve can be observed even at storage of the biocatalyst at -18 ° C and -70 ° C, respectively.
  • the decrease in the number of live lines during the first four weeks is only two orders of magnitude.
  • the decrease in the number of live cells does not correlate with the activity of the biocatalyst over a period of seven weeks.
  • the tents were spun down and resuspended in 160 ⁇ M potassium phosphate buffer. Again, 0.2 mM NADH was added to start the reaction and the oxidation was followed photometrically. This procedure was repeated for a total of 5 cycles.
  • the host strain E. coli BL21 (DE3) was subjected to the same test as the whole-cell biocatalyst BL21 (DE3) as a negative contrast.
  • Example 5 Regeneration of NADH to NAD + using the whole-cell biocatalyst E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx
  • AIDH aldehyde dehydrogenase
  • Figure 13 shows in the upper half of the panel the AIDH mediated NADH increase.
  • the host strain E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx had already been added to this reaction to increase the NADH concentration ⁇ as absorbance at 340 nm) with respect to the number of cells.
  • the biocatalyst E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx was added to the AIDH reaction to increase the NADH concentration ⁇ as absorbance at 340 nm) with respect to the number of cells.
  • no increase in NADH could be detected over time, because of AIDH formed NADH was continuously reoxidized to NAD + . Consequently, this system is in equilibrium.

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Abstract

Ein Nukleinsäuremolekül umfasst einen Abschnitt, der einen Signalpeptid codiert, einen Abschnitt, der ein heterologes redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid umfasst, einen optionalen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert, einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert und einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert. Das Nukleinsäuremolekül ermöglicht die Expression redoxfaktor-regenerierender Enzyme.

Description

Ganzzeil-Biokatalysator
Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremoleküi, umfassend (1) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert, (2) einen Abschnitt, der ein heterologes redoxfaktor- regenerierendes Polypeptid oder eine Variante davon unnfasst, (3) optional einen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert, (4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert und (5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert.
Ungefähr ein Viertel aller bekannten Enzyme sind Oxidoreduktasen. Für diese Enzymgruppe ist bereits ein breites Anwendungsspektrum erforscht worden, darunter die Synthese von chiralen Verbindungen wie etwa Alkoholen, Aldehyden und Aminosäuren, die Herstellung und Modifikation von Polymeren, die Herstellung von Biosensoren für verschiedenste Anwendungen und der Abbau von Schadstoffen. Oxidoreduktasen zeichnen sich dadurch aus, dass sie nicht nur mindestens eine Polypeptidkette umfassen, sondern auch eine oder mehrere redoxreaktive Gruppen, wobei es sich um eine oder mehrere redoxreaktive Aminosäure-Seitenketten oder prosthetische Gruppen handeln kann.
Die Substrate der Oxidoreduktasen schließen Stoffwechselprodukte und Redoxfaktoren ein. Im Unterschied zu prosthetischen Gruppen von Enzymen wirken diese Substrat- Redoxfaktoren nicht als Katalysatoren, sind aber in stöchiometrischen Mengen an der Reaktion beteiligt und gehen chemische Reaktionen mit anderen Substraten ein. Angesichts der Tatsache, dass Redoxfaktoren im Allgemeinen sehr viel teurer sind als andere organische Substrate, ist die Machbarkeit industrieller Synthesen unter Verwendung von Oxidoreduktasen wegen der erforderlichen Bereitstellung geeigneter reduzierter oder oxidierter Faktoren eingeschränkt. Zur Lösung dieses Problems wurde von Wissenschaftlern die Verwendung von redoxfaktor-regenerierenden Enzymen vorgeschlagen. Beispielsweise wurde die Verwendung von Formtat-Dehydroxygenase (FDH) und NADH-Oxidase oder die Verwendung von Giucose-Dehydrogenase (GDH) für die Regeneration von NADH bzw. NADPH vorgeschlagen. Solche Enzyme sollten für mehrere Katalysezyklen an geeigneten Trägern immobilisierbar sein, um zu vermeiden, dass wiederholt große Mengen der Polypeptide aufgereinigt werden müssen. Leider sind redoxfaktor-regenerierende Enzyme oftmals instabil, insbesondere dann, wenn sie als immobilisierte Enzyme vorliegen.
Sanjust ef al. (1997) immobilisierte the NADH-Oxidase von Thermus aquaticus an verschiedenen Trägern und verglich die kinetischen Eigenschaften löslicher und immobilisierter Enzyme. Es stellte sich heraus, dass das immobilisierte Enzym eine geringere Thermostabilität als das lösliche Enzym aufweist. Hummel und Riebet (2003) beschreiben die Verwendung von löslicher, gereinigter NADH-Oxidase von Lactobacillus brevis zur Regeneration von NADH-Oxidase. Sie zeigen auf, dass das Enzym zu einer raschen oxidativen Inaktivierung neigt, höchstwahrscheinlich wegen des Vorhandenseins eines Cystein-Rests, der für eine Oxidation im katalytischen Zentrum des Proteins anfällig ist. Deshalb wird die Verwendung eines Reduktionsmittels (1 mM DTT oder Mercaptoethanol) als wesentlich für die Aufrechterhaltung der Katalysefähigkeit des Enzyms beschrieben. Ahmed und Claiborne (1992) reinigten die FAD-haltige NADH-Oxidase von Streptococcus faecalis 10C1 auf und lehren, dass die Gegenwart von 2 mM DTT erforderlich ist, um die Holo-Oxidase zu stabilisieren. El- Zahab et al, (2004), überprüft durch Lee und Fing (2007), beschreiben das Immobilisieren von redoxfaktor-regenerierenden Enzymen, beispielsweise Glucose- Dehydrogenase (GDH), an einem festen Träger, im engeren Sinne an nanoporösem Kieselglas. Sie beschreiben jedoch nicht, wie solche Enzyme stabilisiert werden können.
Deshalb besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Agens mit einer redoxfaktor-regenerierenden Aktivität bereitzustellen, wobei die Quelle der Aktivität nicht nur für Substratmoleküle leicht zugänglich ist, sondern sich auf einfache Weise amplifizieren, recyceln und regenerieren lässt, um mehrere Katalyseschritte zu ermöglichen, ohne dass es erforderlich ist, wiederholt neues Agens herzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Agens bereitzustellen, das an sich oder in Gegenwart von potenziell inaktivierenden Chemikalien, wie etwa inhibierenden Metailionen, oder bei sauren oder basischen pH-Werten eine redoxfaktor- regenerierende Aktivität mit besseren Eigenschaften als die Ursprungsform des entsprechenden Enzyms im Hinblick auf Kinetik, Thermostabilität, Lagerfähigkeit und Stabilität aufweist. Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Agens bereitzustellen, das in Gegenwart von Sauerstoff oder von Sauerstoff freisetzenden Agenzien oder unter oxidierenden Bedingungen eine stabile redoxfaktor- regenerierende Aktivität zeigt, deren Stabilität besser als bei der Ursprungsform des entsprechenden Enzyms ist.
Die betreffenden Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass unter Verwendung des Autotransportersystems redoxfaktor-regenerierende Enzyme an der Oberfläche einer ganzen Zelle exprimiert werden können und an sich hinsichtlich der Gegenwart von Sauerstoff und verschiedener Temperaturen und Bedingungen überraschend stabil sind. Zudem haben die betreffenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass redoxfaktor-regenerierende Enzyme inkubiert werden können und in verschiedenen Lösungen und Puffern unter verschiedenen Bedingungen längere Zeit stabil bleiben.
Autodisplay stellt ein elegantes Werkzeug dar, um rekombinante Proteine an der Bakterienoberfläche zu präsentieren. Dieses Expressionssystem basiert auf dem Sekretionsmechanismus der Proteinfamilie der Autotransporter, die zum Typ-V- Sekretionssystem gehören.
Bei gram negativen Bakterien bildete sich der Autotransporter-Weg sowohl für den Transport von Proteinen zur Zelloberfläche als auch für die Sekretion von Proteinen in den Extrazeiluiarraum heraus (Jose und Meyer, 2007). Die Autotransporter-Proteine werden als Vorläuferproteine synthetisiert, die alle strukturellen Voraussetzungen für den Transport zur Zelloberfläche erfüllen (Jose, 2006). Sie werden mit einem N- terminalen Signalpeptid synthetisiert, welches für den See-Weg typisch ist, der das Durchqueren der inneren Membran ermöglicht. Im Perip!asma angelangt, faltet sich der C-terminale Teil des Vorläufers nach Trunkation des Signalpeptids als eine porinartige Struktur, ein sogenanntes ß-Barrel, in die äußere Membran hinein. Durch diese Pore hindurch wird die N-terminai gebundene Passagierdomäne zur Oberfläche transioziert (Jose et a/,, 2002). Dort kann sie - entweder autoproteolytisch oder durch eine zusätzliche Protease - abgespaltet werden oder kann über die Transporterdomäne an der Zelihülle verankert bleiben. Ein Ersetzen des natürlichen Passagiers durch ein rekombinantes Protein führt zu dessen Oberflächentransiokation. Hierfür muss mit gentechnischen Verfahren ein nicht-natürlicher Vorläufer konstruiert werden, der aus einem Signaipeptid, dem rekombinanten Passgier, dem ß-Barrel und einer Linkerregion dazwischen, die für einen uneingeschränkten Zugang zur Oberfläche erforderlich ist, besteht. Auf diese Weise ist bereits der AIDA-I-Autotransporter mit Erfolg für eine effiziente Oberflächenpräsentation verschiedener Passagierdomänen verwendet worden (Henderson et al., 2004). Bei dem Autodisplay-System wurde eine Selbst- Assoziation von Untereinheiten an ein aktives Enzym beobachtet, beispielweise bei dem dimeren Enzym Sorbitol-Dehydrogenase (Jose, 2002; Jose und von Schwichow, 2004).
Im Besonderen ist die Autodisplay-Technologie ein Expressionsverfahren für bestimmte Proteine an der Oberfläche der äußeren Membran von E. coli und anderen gramnegativen Bakterien, wobei das Autodisplay-System auf dem natürlichen Sekretionsmechanismus der Autotransporterproteine basiert (A. Banerjee et al. (2002)). Dabei kann der Transport des rekombinanten Passagierproteins einfach durch Einbringen, im Leseraster, seiner codierenden Sequenz zwischen das Signaipeptid und die translozierende Domäne des Autodisplay-Vektors unter Verwendung von üblichen gentechnischen Verfahren erfolgen. Das Signaipeptid kann von einer Untereinheit des Cholera-Toxins gewonnen werden, und es kann mit einem nicht-natürlichen Promotor kombiniert werden. Folglich wird das Passagierprotein, das eine Translokation durch die äußere Membran erfahren soll, als rekombinantes Fusionsprotein mit einem anderen Protein, Autotransporter genannt, an der äußeren Membran von E. coli exprimiert (AIDA-i) (Jose, 2006). Der C-terminale Teil des Autotransporterproteins bildet eine porinartige Struktur (ß-Barrel) innerhalb der äußeren Membran von E. coli. Diese porinartige Struktur ermöglicht eine Translokation des rekombinanten Passierproteins an die Oberfläche der äußeren Membran von E. coli (Jose, 1995, 2006, 2007).
Das Konzept der Immobilisierung redoxcofaktor-regenerierender Polypeptide stammt aus dem Jahre 1974, als Sarborsky und Ogletree die Immobilisierung von Giucoseoxidase via Aktivierung ihrer Kohlenhydratreste beschrieben. Ebenso ist das Konzept des Autodisplay-Systems, das zuerst von Jose ei a/. (1995) beschrieben wurde, seit mehr als 15 Jahren bekannt. Dennoch wird durch den Stand der Technik, nach unseren Kenntnissen, die Verwendung des Autotransporter-Systems zum Immobilisieren redoxfaktor-regenerierender Enzyme weder gelehrt, noch vorgeschlagen. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen können den abhängigen Ansprüchen entnommen werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird, gemäß einem ersten Gesichtspunkt, der noch dazu die erste Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts ist, durch ein Nukleinsäuremolekül gelöst, umfassend (1 ) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert, (2) einen Abschnitt, der ein heterologes redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid oder eine Variante davon umfasst, (3) optional einen Abschnitt, der eine Protease- Erkennungssteile codiert, (4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert und (5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz zur Expressionsregulation funktionell verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Sequenz zur Expressionsregufation", wie hier gebraucht, auf eine Nukleinsäuresequenz, welche die Höhe der Expression eines Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise strangabwärts von der Sequenz zur Expressionsregulation, regulieren kann. Die Sequenz zur Expressionsregulation kann beispielsweise ein Promotor sein. Der Fachmann ist mit zur Expressionsregulation geeigneten Sequenzen und Verfahren zum funktionellen Verbinden dieser Sequenzen mit einem Nukleinsäuremolekül vertraut.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül Teil eines rekombinanten Plasmids. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül die SEQ !D NO: 1 oder Varianten davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „heterolog", wie hier gebraucht, auf eine Nukleinsäure, die unter Verwendung gentechnischer Verfahren konstruiert wurde, beispielsweise durch Zusammenfügen einer Sequenz zur Expressionsregulation und einer zu exprimierenden Sequenz, die normalerweise nicht dieser Sequenz zur Expressionsregulation untersteht, oder durch Verwenden einer Sequenz, die bezüglich der ursprünglichen Sequenz eine Punktmutation aufweist. Wenn auch nur ein Abschnitt eines Konstrukts als heteroiog bezeichnet wird, impliziert das folglich, dass das gesamte Konstrukt heteroiog ist. Der Fachmann ist mit gentechnischen Verfahren vertraut. In einer wetteren bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „heteroiog", wie hier gebraucht, auf eine ein Polypeptid codierende Nukleinsäure, die mit einer Sequenz zur Expressionsregulation zusammengefügt ist, und/oder eine fusionierte Sequenz, die von einem anderen Organismus als die Sequenz zur Expressionsregulation stammt und zu exprirnieren ist. in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „heteroiog", wie hier im Zusammenhang mit einem redoxfaktor-regenerierenden Polypeptid gebraucht, dass der Abschnitt der Nukleinsäure, der das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid codiert, von einem anderen Organismus ais mindestens ein weiterer Abschnitt, wie etwa die Transporterdomäne oder die Sequenz zur Expressionsregulation oder der Transmembranlinker, gewonnen oder genommen wurde. Beispielsweise ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid heteroiog, wenn es von Lactobacillus brevis gewonnen wurde, alle anderen Sequenzen jedoch von E. coli, gewonnen wurden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „heteroiog", wie hier gebraucht, dass die als heteroiog bezeichnete Nukleinsäuresequenz von einem Organismus stammt, der von dem Wirt oder vorgesehenen Wirt, der zur Expression oder Vermehrung dieser Nukleinsäuresequenz verwendet wird, verschieden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Signalpeptid", wie hier gebraucht, auf eine Sequenz von Aminosäuren, vorzugsweise am N-Terminus eines Polypeptids, die bewirkt, dass das Polypeptid, wenn es im Zytosoi einer Wirtszelle exprimiert wird, zu einem bestimmten Kompartiment der Zelle, vorzugsweise einem vom Zytosol verschiedenen Kompartiment, transloziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine gramnegative Bakterienzelle und das Signalpeptid bewirkt, dass das entstehende oder fertige Polypeptid in das Peripiasma oder die äußere Membran der gramnegativen Bakterienzelle transloziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Protease-Erkennungsstelle", wie hier gebraucht, auf ein bestimmtes Aminosäurensequenzmotiv in einem Polypeptid, wobei dieses Sequenzmotiv von besagter Protease in spezifischer Weise erkannt wird, derart, dass sie anbindet und das Polypeptid spaltet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff "Transmembranlinker", wie hier gebraucht, auf einen flexiblen Polypeptidabschnitt, der zur Verbindung der Autotransporterdomäne mit dem redoxfaktor-regenerierenden Polypeptid dient, jedoch flexibel genug ist, um ein unabhängiges Falten und/oder Transportieren des redoxfaktor-regenerierenden Polypeptids zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Transporterdomäne eines Autotransporters" auf eine Domäne, die verwendet werden kann, um das Expressionsprodukt des Nukleinsäuremoleküls zu erhalten, wenn es im Inneren der Zelle, vorzugsweise im bakteriellen Zytopiasma, ribosomal synthetisiert und zu der äußeren Membran der Zelle, vorzugsweise zu der Seite der äußeren Membran, die der Zeilumgebung ausgesetzt ist, transloziert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bewirkt die Transporterdomäne, dass sich das besagte Expressionsprodukt an der Außenfläche der äußeren Membran befindet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transporterdomäne eines Autotransporters ein Protein, dass sich an der äußeren Membran der Zelle befindet, und der eine NADH-Oxidase codierende Abschnitt ist Teil einer Domäne, Schleife oder eines anderen Teils der Transporterdomäne oder damit fusioniert, sodass die NADH-Oxidase an der Oberfläche der Zelle präsentiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Transporterdomäne eines Autotransporters ein Protein eines Systems, das verwendet werden kann, um Polypeptide an der Oberfläche einer Zeile zu präsentieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Transporterdomäne eine Transporterdomäne des Autodisplay-Systems, auch als Autotransporter-Weg bezeichnet, des AIDA-I-Typs gramnegativer Bakterienzelten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Varianten von Aminosäuren oder Nukleinsäuresequenzen, auf die in der vorliegenden Anmeldung explizit, beispielsweise durch den Namen oder die Hinterlegungsnummer oder gar durch den Begriff „Variante von", oder implizit verwiesen wird, beispielsweise durch eine Beschreibung der Funktion, im Rahmen der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff„Variante", wie hier gebraucht, Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzen, die zu 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % mit der als Referenz dienenden Aminosäure identisch sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante" im Hinblick auf eine Aminosäuresequenz solche Aminosäuresequenzen, die einen konservativen Aminosäureaustausch oder mehrere konservative Aminosäurenaustausche in Bezug auf die Referenzsequenz aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Begriffe „Varianten" einer Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz aktive Abschnitte und/oder Fragmente der Amänosäuresequenz bzw. Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „aktiver Abschnitt", wie hier gebraucht, auf eine Aminosäuresequenz oder eine Nukleinsäuresequenz, die kürzer als die Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz voller Länge ist, jedoch zumindest einen Teil ihrer wesentlichen biologischen Aktivität, z. B. als eine NADH-Oxidase, bewahrt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante" einer Nukleinsäure die Nukleinsäuren des komplementären Strangs, die - vorzugsweise unter stringenten Bedingungen - mit der Referenznukieinsäure hybridisieren. Die Stringenz von Hybridisierungsreaktionen ist von einem Durchschnittsfachmann ohne weiteres bestimmbar und ist üblicherweise eine empirische Berechnung in Abhängigkeit von der Sondenfänge, der Waschtemperatur und der Salzkonzentration. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für ein einwandfreies Annealing, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit der denaturierten DNA zur Renaturierung ab, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung vorliegen, deren Temperatur niedriger als die Schmelztemperatur der Stränge ist. Je höher der Grad der angestrebten Homologie zwischen der Sonde und einer hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die angewandt werden kann. Dadurch ergibt sich, dass höhere relative Temperaturen tendenziell die Reaktionsbedingungen stringenter machen, während niedrigere Temperaturen diese Stringenz verringern. Weitere Einzelheiten und eine Erläuterung der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen können Ausubel ei al. (1995) entnommen werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Variante" einer Nukleinsäure oder Aminosäure auf eine Nukleinsäure bzw. Aminosäure, die, zumindest bis zu einem gewissen Grade, die gleiche biologische Aktivität und/oder Funktion wie die Referenz-Nukieinsäure oder -Aminosäure hat. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Variante" einer Nukleinsäuresequenz, wie hier gebraucht, auf eine andere Nukleinsäuresequenz, welche eine der Referenz-Aminosäuresequenz gleichende Aminosäuresequenz codiert. in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Redoxfaktor", wie hier gebraucht, auf eine organische Verbindung, die redoxreaktiv ist, d. h. die unter physiologischen Bedingungen oxidiert oder reduziert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Redoxfaktor keine redoxreaktiven Aminosäure-Seitenketten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Redoxfaktor ein freier Redoxfaktor, d. h, dass er nicht kovalent an ein Peptidgerüst oder Peptid gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Redoxfaktor ein Standardreduktionspotenzial von nicht mehr als 0,85 (d. h. für hohe 0,6 V), 0,5, 0,4, 0,2, 0, -0,1 , -0,15, -0,2, -0,25, -0,3, oder -0,4 V auf. in einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Redoxfaktor ein Standardreduktionspotenzial von -0,325 bis -0,2 V auf. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Redoxfaktor ein Standardreduktionspotenzial von -0,35 bis -0,3 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „redoxfaktor- regenerierendes Polypeptid", wie hier gebraucht, auf ein Polypeptid, das die Regeneration eines Redoxfaktors katalysiert. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Regenerieren eines Redoxfaktors", wie hier gebraucht, auf die Fähigkeit, einen oxidierten Redoxfaktor zu reduzieren, der in seiner reduzierten Form bei einer chemischen Synthese als Reduktionsmittel wirkt, oder auf die Fähigkeit, einen reduzierten Redoxfaktor zu oxidieren, der in seiner oxidierten Form bei einer chemischen Synthese als Oxidationsmitte! wirkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Regenerieren eines Redoxfaktors", wie hier gebraucht, auf die Wiederherstellung des früheren Redoxzustandes eines Redoxfaktors, vorzugsweise des Zustandes, in dem er für eine Synthese von Interesse verwendet werden könnte, besonders bevorzugt eine Synthese, die durch eine Oxidoreduktase katalysiert wird, wobei der Redoxfaktor als Substrat verwendet wird. Beispielsweise kann NAD+, das bei einer Reaktion verbraucht wird, durch Oxidieren von NADH zu NAD+ regeneriert werden. In einer zweiten Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten Ausführungsform darstellt, ist der Redoxfaktor, der durch das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid regeneriert wird, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend NADH, NADPH, FADH2l Häm, Metallionen, Glutathion, Pyrrolochinolin-Chinon (PQQ), Pyridoxalphosphat, Thiaminpyrophosphat und Ascorbat. Metallionen schließen Fe-, Cu-, Zn-, Ni-, Co-, Mn-, Cr- und Mg-Ionen ein, ohne hierauf beschränkt zu sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist jeder der vorerwähnten Redoxfaktoren sowohl die oxidierte als auch die reduzierte Form oder Formen des entsprechenden konjugierten Redoxpaares auf, beispielsweise sowohl NADH als auch NAD1" im Falle des Redoxfaktors NADH, auch wenn nur eine Form expiizit erwähnt wird.
In einer dritten Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten und zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, umfasst das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid einen oder mehrere Flavin-Cofaktoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Flavin-Cofaktor", wie hier gebraucht, auf einen redoxreaktiven Cofaktor, der auf dem Isoaf!oxazinringsystem beruht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Flavin-Cofaktor ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Riboflavin, Flavin-Mononukleotid (FMN) und Fiavin-Adenin- Dinukleotid (FAD), sowohl in ihren oxidierten als auch reduzierten Formen.
In einer vierten Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis dritten Ausführungsform darstellt, ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe, umfassend NADH-Oxidase, Formiat-Dehydrogenase und Glucose-Dehydrogenase.
In einer fünften Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis vierten Ausführungsform darstellt, ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die NADH-Oxidasen von den Gattungen Lactobacillus, T ermus, Brevibacterium und Streptococcus, vorzugsweise die NADH-Oxidase von Lactobacillus brevis, und Varianten davon. in einer sechsten Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis fünften Ausführungsform darstellt, ist die Transporterdomäne eines Autotransporters ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Ssp, Ssp-h1 , Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1 , SphB1 , AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espi, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21 , AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1 , McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff„Transporterdomäne eines Autotransporters", wie hier gebraucht, eine Domäne, die ein von der Transporterdomäne verschiedenes Polypeptid, insbesondere ein redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid, an der Oberfläche einer Zelle präsentiert, wenn das besagte Protein in die Aminosäuresequenz der Transporterdomäne eingefügt oder mit dieser fusioniert worden ist.
Vorzugsweise ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid mit einer Transporterdomäne eines Autotransporters fusioniert. Die Transporterdomäne des Autotransporters gemäß der Erfindung kann eine beliebige Transporterdomäne eines Autotransporters sein und ist vorzugsweise imstande, eine ß-Barrel-Struktur zu bilden. Eine ausführliche Beschreibung der ß-Barrel-Struktur und bevorzugte Beispiele für ß- Barrel-Autotransporter sind in WO 97/35 022 offenbart und durch die Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung. Henderson ei al. (2004) beschreiben Autotransporterproteine mit geeigneten Autotransporterdomänen (eine Zusammenfassung kann der Tabelle 1 von Henderson ei al., 2004, entnommen werden). Die Offenbarung von Henderson et al. (2004) ist durch die Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung. Beispielsweise kann die Transporterdomäne des Autotransporters ausgewählt werden aus: Ssp (P09489, S. marcescens), Ssp-h1 (BAA33455, S. marcescens), Ssp-h2 (BAA11383, S. marcescens), PspA (BAA36466, P. fluorescens), PspB (BAA36467, P. fluorescens), Ssa1 (AAA80490, P. haemolytica), SphB1 (CAC44081 , ß. pertussis), AspA/NalP (AAN71715, N. meningitidis), VacA (Q48247, H. pylori), AIDA-I (Q03155, E. coli), IcsA (AAA26547, S. flexneri), MisL (AAD16954, S. enterica), TibA (AAD41751 , £ coli), Ag43 (P39180, E, coli), ShdA (AAD251 10, S. enterica), AutA (CAB89117, N. meningitidis), Tsh (I54632, £ coli), SepA (CAC05786, S. flexneri), EspC (AAC44731 , E. coli), EspP (CAA66144, £ coli), Pet (AAC26634, E. coli), Pic (AAD23953, E. coli), SigA (AAF67320, S. flexneri), Sat (AAG30168, E. coli), Vat (AAO21903, £ coli), EpeA (AAL18821 , £ coli), EatA (AA017297, £ coli), Espl (CAC39286, £ co//), EaaA (AAF63237, £ co//), EaaC (AAF63038, £ co//), Pertactin (P14283, B. pertussis), BrkA (AAA51646, ß. pertussis), Tef (AAQ82668, ß. pertussis), Vag8 (AAC31247, ß. pertussis), PmpD (084818, C. trachomatis), Pmp20 (Q9Z812, C. pneumoniae), Pmp21 (Q9Z6U5, C. pneumoniae), lgA1 protease (NP_283693, Λ/. meningitidis), App (CAC 14670, /V. meningitidis), lgA1 protease (P45386, H. influenzae), Hap (P45387, H. influenzae), rOmpA (P15921 , R. rickettsii), rOmpB (Q53047, P. rickettsii), ApeE (AAC38796, S. enterica), EstA (AAB61674, P. aeruginosa), Lip-1 (P40601 , X. luminescens), McaP (AAP97134, . catarrhalis), BabA (AAC38081 , py/o/7), SabA (AAD06240, H. py/οπ), AlpA (CAB05386, H. py/on), Aae (AAP21063, \. actinomycetemcomitans), NanB (AAG35309, P. haemolytica) und Varianten dieser Autotransporter. Für jedes der beispielhaften Autotransporterproteine sind in Kfammern Beispiele für geeignete Genbank-Hinterlegungsnummern und Spezies angegeben, von denen der Autotransporter erhalten werden kann. Vorzugsweise ist die Transporterdomäne des Autotransporters das AIDA-i-Protein von £ coli oder eine Variante davon, wie beispielsweise jene, die von Niewert ef al, (2001) beschrieben wurden. Das AIDA-Autotransportersystem wird mit F18 und Stx2e bei £ co/Ä-lsolaten von Schweinen, bei denen eine Ödemkrankheit und sogenanntes Postweaning diagnostiziert wird, in Verbindung gebracht.
Varianten der oben angegebenen Autotransportersequenzen können beispielsweise durch Verändern der Aminosäuresequenz in den Schleifenstrukturen des ß-Barreis, die nicht zu den Transmembranabschnitten gehören, erhalten werden. Optional können die für die Oberflächenschieifen codierenden Nukleinsäuren vollständig deletiert werden. Außerdem können innerhalb der amphipathischen ß-Faltblattstrukturen konservative Aminosäurenaustausche, d. h. der Austausch einer hydrophilen gegen eine andere hydrophile Aminosäure und/oder der Austausch einer hydrophoben gegen eine andere hydrophobe Aminosäure, vorgenommen werden. Vorzugsweise hat eine Variante auf Aminosäureebene eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 98 % mit der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz der Autotransporterdomäne, insbesondere im Bereich der ß-Faitblattstrukturen.
In einer siebenten Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, die auch eine Ausführungsform der ersten bis sechsten Ausführungsform darstellt, ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid sauerstoffempfindlich. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „sauerstoffempfindlich", wie hier gebraucht, dass das entsprechende Polypeptid in Gegenwart von Sauerstoff, vorzugsweise bei normalen, d. h. in der Atmosphäre vorkommenden, Konzentrationen, einer raschen Deaktivierung unterliegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „sauerstoffempfindlich", wie hier gebraucht, dass das entsprechende Polypeptid mindestens 10, 20, 30, 40, vorzugsweise 50, ganz besonders bevorzugt 80 % seiner Aktivität einbüßt, vorzugsweise im Hinblick auf sein kcat, wenn es mindestens 30 Minuten lang Sauerstoff in Konzentrationen oder unter Bedingungen wie in der Atmosphäre, sowohl in Lösungen als auch in anderen Phasen, ausgesetzt wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid ein lösliches Polypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „lösliches Polypeptid", wie hier gebraucht, auf ein Polypeptid, das in seiner natürlichen Umgebung nicht an eine Membran gebunden ist. Zum Beispiel ist die NADH-Oxidase von Lactobacillus brevis, ein zytosolisches Protein, ein lösliches Polypeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid ein membrangebundenes Polypeptid, d. h. ein Polypeptid, das kovalent oder nichtkovalent an eine Zellmembran oder ein integrales Membranprotein gebunden oder angebunden ist. Zum Beispiel ist der Komplex IV der Atmungskette ein membrangebundenes Polypeptid.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Polypeptid gelöst, das durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung codiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid die SEQ ID NO: 2 oder Varianten davon. Gemäß einem dritten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch eine Zelle gelöst, die an ihrer Oberfläche ein Polypeptid gemäß dem zweiten Gesichtspunkt exprimiert oder unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einer Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung transformiert worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „Zelle", der austauschbar gegen den Begriff „Wirtszelle" gebraucht wird, wie hier gebraucht, auf eine Zelle, die imstande ist, ein Polypeptid zu exprimieren. Eine solche Zelle kann auch als„Ganzzell- Katalysator oder -Biokatalysator" bezeichnet werden, in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zeile oder Wirtszelle eine prokaryotische Zelle, vorzugsweise eine gramnegative Bakterienzelle, ganz besonders bevorzugt eine E. coli-Ze\\e, In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist die Zelle eine eukaryotische Zelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle oder Wirtszelfe eine Spore eines Prokaryoten.
Gemäß einem vierten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch eine Membranfraktion gelöst, die von der Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann.
Eine Bakterienzelle umfasst eine Reihe von Kompartimenten, die durch hydrophobe Membranen voneinander getrennt sind. Eine grampositive Bakterienzelle weist eine Plasmamembran auf, die das Zytosol, das Innere der Zelle, begrenzt. Die Plasmamembran ist von einer Peptidoglykanschicht umgeben. Gramnegative Bakterien hingegen besitzen zusätzlich zu der Plasmamembran eine weitere Membran, die als äußere Membran bezeichnet wird. Der Begriff „Oberfläche", wie hier gebraucht, verweist vorzugsweise auf eine Schicht des Mikroorganismus, die der Umgebung ausgesetzt ist, wobei die Umgebung beispielsweise das flüssige Kulturmedium ist, das zum Züchten der Zell von Interesse verwendet wird. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung an der Außenseite der äußeren Membran einer gramnegativen Baktertenzelle exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung an der Innenseite der äußeren Membran einer gramnegativen Bakterienzelle exprimiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid an der Außenseite eines Sphäroplasten exprimiert, wobei es sich um eine gramnegative Bakterienzelle handelt, bei der die äußere Membran worden entfernt ist. Der Fachmann ist mit Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um Sphäroplasten herzustellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid an der Außenseite einer grampositiven Bakterienzelle exprimiert. So, wie die Begriffe „an der Oberfläche präsentiert" und „an der Oberfläche exprimiert" hier gebraucht werden, sind sie synonym.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Membranfraktion oder das Membranpräparat, wobei die beiden Begriffe austauschbar gebraucht werden, ein redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung, vorzugsweise in einem katalytisch aktiven Zustand. Die Begriffe „Membranfraktion" und „Membranpräparat", wie hier gebraucht, verweisen vorzugsweise auf ein Produkt, das sich in Membranbestandteilen anreichert, vorzugsweise Bestandteilen der äußeren Membran einer gramnegativen Bakterie. Der Fachmann ist mit Methodenvorschriften und Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um Membranpräparate herzustellen. Zum Beispiel können Bakterienzelien von einer Kultur geerntet und einer Lyse unterzogen werden, beispielsweise durch Gefrier- Auftau-Zyklen, Beschallung, Resuspension in Lysepuffer oder dergleichen, gefolgt von einer Differentialzentrifugation, um Membranfraktionen der Zellen zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Membranpräparat ein Präparat der äußeren Membran, d. h. ein Präparat, bei dem die Bestandteile der äußeren Membran, verglichen mit den Bestandteilen anderer Membranen und Komparttmente, wie etwa des Zytosols, der inneren Membran und des Periplasmas, angereichert sind. Der Fachmann ist mit Methodenvorschriften und Verfahren vertraut, die verwendet werden können, um die äußere Membran oder Bestandteile davon zu isolieren oder anzureichern, wie beispielsweise eine Lysozymbehandlung von Bakterienzellen und nachfolgende Zentrifugationsschritte. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Membranfraktion eine behandelte Membranfraktion sein, d. h. dass der Gehalt oder die Eigenschaften der Membranfraktion verändert worden sind, beispielsweise durch Aufreinigen eines Proteinbestandteils der Membranfraktion oder durch Solubilisieren der Membranfraktionen und/oder Aufnahme von Bestandteilen der Membranfraktion in Vesikel. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Membranfraktion immobilisiert sein - beispielsweise an der Oberfläche eines Gefäßes oder einer Säule.
Gemäß einem fünften Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zum Regenerieren eines Redoxfaktors, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen des Polypeptids gemäß dem zweiten Gesichtspunkt, des Membranpräparats gemäß dem vierten Gesichtspunkt oder der Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung und b) Inkontaktbringen des Polypeptids gemäß dem zweiten Gesichtspunkt, des Membranpräparats gemäß dem vierten Gesichtspunkt oder der Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt mit mindestens einem Substrat des redoxfaktor-regenerierenden Polypeptids. In einer bevorzugten Ausführungsform finden Schritt a) und/oder Schritt b) in Abwesenheit eines Reduktionsmittels und/oder in einer oxidativen Umgebung statt.
Gemäß einem sechsten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch eine Verwendung der Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt oder der Membranfraktion gemäß dem vierten Gesichtspunkt oder des Polypeptids gemäß dem zweiten Gesichtspunkt zum Regenerieren eines Redoxfaktors.
Gemäß einem siebenten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch die Verwendung der Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt, des Membranpräparats gemäß dem vierten Gesichtspunkt und des Polypeptids gemäß dem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung zum Einstellen der Redoxumgebung einer wässrigen Lösung, vorzugsweise durch Desoxidieren der wässrigen Lösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Einstellen der Redoxumgebung einer wässrigen Lösung", wie hier gebraucht, auf jegliche Maßnahme, die sich unmittelbar auf die Redoxbedingungen in einer wässrigen Lösung, d. h. die Fähigkeit der Lösung, eine Verbindung zu oxidieren oder zu reduzieren, auswirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verweist der Begriff „Desoxidieren einer wässrigen Lösung", wie hier gebraucht, auf jegliche Maßnahme, die ergriffen werden kann, um die Konzentration des Sauerstoffs in dieser Lösung zu verringern. Der Fachmann ist mit Verfahren vertraut, die zur Messung der Sauerstoffkonzentration in einer wässrigen Lösung Anwendung finden können, wie beispielsweise der Einsatz von Sauerstoffelektroden.
Gemäß einem achten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen einer Zeile, die an ihrer Oberfläche ein redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid präsentiert, umfassend: (a) Einringen der Nukleinsäure gemäß einer Ausführungsform des ersten Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung in eine Zelle und b) optional Inkontaktbringen der Zelle mit einer oder mehreren redoxreaktiven prosthetischen Gruppen.
Gemäß einem neunten Gesichtspunkt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen des Produkts eines redoxfaktor-ab häng igen Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines redoxfaktor- abhängigen Enzyms und (b) Inkontaktbringen des redoxfaktor-abhängigen Polypeptids mit einem oder mehreren seiner Substrate in Gegenwart der Zeile gemäß dem dritten Gesichtspunkt, des Membranpräparats gemäß dem vierten Gesichtspunkt und des Polypeptids gemäß dem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung, wodurch das Polypeptid gemäß dem zweiten Gesichtspunkt den Redoxfaktor regeneriert, von dem das redoxfaktor-abhängige Polypeptid abhängt. In einer bevorzugten Ausführungsform verweist der Begriff „redoxfaktor-abhängiges Polypeptid", wie hier gebraucht, auf ein Polypeptid, das eine biologische Aktivität, vorzugsweise eine Enzymaktivität, aufweist, die als Cofaktor, prosthetische Gruppe oder, vorzugsweise, Substrat einen Redoxfaktor benötigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch eine Zusammensetzung gelöst, umfassend die Zelle gemäß dem dritten Gesichtspunkt, das Membranpräparat gemäß dem vierten Gesichtspunkt und das Polypeptid gemäß dem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung sowie ein redoxfaktor-abhängiges Polypeptid und den Redoxfaktor. In einer Ausführungsform wird das redoxfaktor-abhängige Polypeptid unter Verwendung des Autotransportersystems präsentiert, d. h. dass seine Expression durch eine Nukleinsäure bewirkt wird, die Folgendes umfasst: (1) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert, (2) einen Abschnitt, der ein vorzugsweise heterologes redoxfaktor- regenerierendes Polypeptid oder eine Variante davon umfasst, (3) optional einen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert, (4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert und (5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert.
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus veranschaulicht durch die folgenden Figuren und nicht einschränkend zu verstehenden Beispiele, denen weitere Merkmale, Ausführungsformen Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung entnommen werden können.
Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pAT-NOx.
Fig. 2 zeigt ein SDS-Gel, das NADH-Oxidase in der äußeren Membran von E. coli sowie die Orientierung durch den Ganzzell-Verdau zeigt. M) Molekulargewichtsstandard; 1) E. coli UT 5600{DE3); 2) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx, nicht induziert; 3) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx, induziert; 4) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx, induziert, mit Proteinase K verdaut; 5) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx, induziert, mit Trypsin verdaut.
Fig. 3 zeigt Absorptionsspektren des Überstandes im Anschluss an einen NADH- Oxidase-Test unter Verwendung von A) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx und ß) E. coli BL21 (DE3) paT-NOx, jeweils nach 1 h Induktion.
Fig. 4 zeigt die Absorptionsspektren des Überstandes im Anschluss an einen NADH- Oxidase-Test unter Verwendung von A) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx und B) E. coli BL21 (DE3) paT-NOx, jeweils nach 4 h Induktion.
Fig. 5 zeigt die Absorptionsspektren des Überstandes im Anschluss an einen NADH- Oxidase-Test unter Verwendung von A) E. coli UT5600(DE3) pAT-NOx und B) E, coli BL21(DE3) paT-NOx, jeweils nach 20 h Induktion.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse des auf Mikrotiterplatten durchgeführten NADH-Oxidase- Tests unter Verwendung von E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx nach Wachstum in einem M9- Medium. Die Figur zeigt die Abnahme der Extinktion bei 340 nm im Laufe der Zeit.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse für den NOX-Ganzzell-Biokatalysator, der für mehr als 7 Wochen bei +8 °C eingelagert wurde. Der Aktivitätstest wurde durchgeführt mit Zellen vor der Einlagerung [A] und Zellen, die eine Woche [B], zwei Wochen [C], drei Wochen [D], vier Wochen [E], fünf Wochen [F], sechs Wochen [G] und sieben Wochen [H] gelagert worden waren.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse für den NOX-Ganzzell-Biokatalysator, der für mehr als 7 Wochen bei -18 °C eingelagert wurde. Der Aktivitätstest wurde durchgeführt mit Zellen vor der Einlagerung [A] und Zeilen, die eine Woche [B], zwei Wochen [C], drei Wochen [D], vier Wochen [E], fünf Wochen [F], sechs Wochen [G] und sieben Wochen [H] gelagert worden waren.
Fig. 9 zeigt die Ergebnisse für den NOX-Ganzzell-Biokatalysator, der für mehr als 7 Wochen bei -70 °C eingelagert wurde. Der Aktivitätstest wurde durchgeführt mit Zellen vor der Einlagerung [A] und Zellen, die eine Woche [B], zwei Wochen [C], drei Wochen [D], vier Wochen [E], fünf Wochen [F], sechs Wochen [G] und sieben Wochen [H] gelagert worden waren.
Fig. 10 zeigt die Bestimmung der Anzahl der Zellen in Proben, die für Stabiiitätstests für mehr als sieben Wochen eingelagert wurden. Es ist die Abnahme der Anzahl der Zellen in Proben, die bei -18 °C (■) gelagert wurden, wie auch die Abnahme der Anzahl der Zellen in Proben, die bei +8 °C (·) gelagert wurden, und Proben, die bei -70 °C (A ) gelagert wurden, zu sehen. Zur Bestimmung der Anzahl der Zellen wurden von einer eingelagerten Teilprobe 50 μΙ entnommen und zum Herstellen einer Reihe von Verdünnungen verwendet. 50 ml von jeder der 10~9- und 10" 0-Verdünnungen wurde auf 30 mg/i Kanamycin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert, und am nächsten Tag wurden die Kolonien ausgezählt. Die Anzahl der Zellen/ml wurde auf der Grundlage der Anzahl der koioniebildenden Einheiten berechnet.
Fig. 11 zeigt die Recycelbarkeit des NOX-Ganzzeil-Biokatalysators in einem Test, der in einer zyklischen Weise fünfmal wiederholt wurde.♦ = Wirisstamm E. coli BL21 (DE3), ■ ~ E. coli BL21(DE3) pAT-NOX. Im engeren Sinne ist die fotometrische Bestimmung der Abnahme der NADH-Konzentration im ersten [A], zweiten [B], dritten [C], vierten [D] und fünften [E] Zyklus gezeigt.
Fig. 12 zeigt die Regeneration von NAD* unter Verwendung des Biokataiysators E. coli BL21{DE3) pAT-NOx, im engeren Sinne die NADH-Umsetzung durch den Ganzzell- Biokatalysator E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx (■), und in dem Regenerationssystem (·). Als Kontrolle wurde E. coli BL21{DE3) pAT-NifAf (Δ) verwendet. Es wurde die Extinktion des NADH bei 340 nm verfolgt. Die Extinktion der Zellen wurde bei 590 nm verfolgt. Die Auswertung erfolgte durch Berechnen der Differenz E340 - E5g0. A1DH 60 mU, Zeilen OD 1 , Reaktion durch 200 μ NADH gestartet.
Fig. 13 zeigt die Regeneration von NAD+, im engeren Sinne die Konzentration von NADH als Funktion der Extinktion bei 340 nm über die Zeit, insbesondere die NADH- Konzentration während der AIDH-Reaktion bzw. während der AIDH-Reaktionen unter Verwendung von E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx. Die NADH-Konzentration wurde durch Berechnen des Quotienten E3(,0/E59o in Bezug auf die Anzahl der Zellen normalisiert. AIDH 30 mU, E. coli BL21 (DE3)pAT-NOx OD 5, E. coli BL21 (DE3) OD 1 , Reaktion durch 400 μΜ NAD+ gestartet.
Beispiele
Es ist möglich, die Oberflächenständigkeit eines Passagiers, in diesem Falle der NADH- Oxidase, durch inkubieren der Bakterien in Gegenwart von Serinprotease, Trypsin oder Proteinkinase K nachzuweisen. Da Trypsin und Proteinase K wegen ihrer Größe außerstande sind, die äußere Membran von E. coli zu passieren, führt die Inkubation von ganzen Zellen in Gegenwart dieser Proteasen dazu, dass nur die Proteine verdaut werden, die sich an der Oberfläche der äußeren Membran befinden. Folglich wird ein an der Oberfläche befindlicher Passagier verdaut, während in die Membran integrierte Proteinbestandteile gegen den Enzymangriff geschützt sind und deshalb unversehrt bleiben. Dies lässt sich durch SDS-PAGE bestätigen. Die Orientierung des Enzyms wurde anhand eines Ganzzellverdaus beurteilt. Fig. 2 stellt die isolierten äußeren Membranen des E. co//-Stamms UT5600(DE3) pAT-NOx nach einer Expressionsinduktion mit IPTG und auch isolierte äußere Membranen nach einem Ganzzellverdau dar. Nach der Induktion mit IPTG konnte das erwartete Fusionsprotein von ungefähr 100 kDa in der äußeren Membran nachgewiesen werden (Spur 3). Der Verdau ganzer Zellen mit Trypsin führte zu einer Abnahme der Intensität der entsprechenden Bande im Vergleich zu der OmpF/C und OmpA repräsentierenden Bande von anfangs etwa gleicher Intensität und bestätigte damit, dass das Protein zur Außenseite der Membran hin orientiert ist (Spuren 4 und 5). Es konnte nachgewiesen werden, dass NADH-Oxidase an der Oberfläche von E. coli unter Verwendung des Autodisplay-Systems präsentiert wird. Beispiel 2: Einrichten der Wachstums- und Testbedingungen zum Nachverfolgen der NADH-Oxidase-Aktivität
Die Aktivität der NADH-Oxidase wurde mit einem fotometrischen Test erfasst. NADH zeigt zwei Extinktionsmaxima, nämlich bei den Wellenlängen 260 nm und 340 nm, während NAD+ nur ein Maximum, bei 260 nm, zeigt. Dieser Unterschied kann ausgenutzt werden, um die Oxidation von NADH zu NAD* fotometrisch nachzuverfolgen. Den verwendeten Nährmedien oder Puffern wurde FAD zugesetzt, um die ordnungsgemäße Faltung des Enzyms und auch die Aufnahme von FAD zu ermöglichen.
Züchten des NOX-Biokataiysators
20 mi LB-Medium (15 μg ml Kanamycin) wurden mit 10 μΙ GJycerinkultur des entsprechenden Stamms beimpft und bei 37 °C und 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht inkubiert. Zum Ansetzen der Hauptkultur wurden 100 ml LB-Medium (15 μg ml Kanamycin, 10 μΜ EDTA, 10 mM Mercaptoethanol) mit 2,5 ml der Übernachtkultur beimpft. Bei OD578 = 0,6 wurden 50 ml der Kultur mit 1 mM IPTG induziert. Im Falle der NADH-Oxidase wurden außerdem 10 μΜ FAD zugesetzt. Die Kulturen wurden 1 h, 4 h oder 20 h lang bei 30 °C und 200 Umdrehungen pro Minute induziert. Die andere Hälfte der Kultur wurde nicht induziert, aber ansonsten genau so wie die induzierte Kultur behandelt.
Vorbereiten der Zellen für den NADH-Oxidase-Test
Im Anschluss an die Induktion wurden die Zellen zunächst 15 Minuten auf Eis gelagert und danach durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 5000 Umdrehungen pro Minute als Sediment abgeschieden. Das Sediment wurde zweimal in 20 mi 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, 10 μΜ FAD gewaschen. Die OD der Zellen wurde dann mit dem gleichen Puffer auf 50 eingestellt.
NADH-Oxidase-Tests
Der Test zum Nachweisen der NADH-Oxidase-Aktivität wurde mit 1 m!-Proben durchgeführt, die 0,1 M Kaliumsulfatpuffer, pH 7,5, 1 mM DTT und 100 μΜ NADH als Substrat enthielten. Die Zellen wurden bei einer finalen OD578 von 1 in dem Test verwendet, im Anschluss an eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen durch Zentrifugieren aus den Proben entfernt. Die Spektren der Überstände wurden bei Wellenlängen zwischen 200 und 400 nm aufgezeichnet.
Zunächst wurde bei beiden Stämmen die Expression des NADH-Oxidase-Gens 1 h lang induziert. Die UV-Spektren in Fig. 3 zeigen, dass es unmöglich war, unter diesen Bedingungen eine Enzymaktivität nachzuweisen, denn das NADH war bereits von Wirtszellen, denen das Plasmid fehlte, oxidiert worden, was zu einem Verschwinden des Extinktionsmaximums bei 340 nm führte. Das zugesetzte Enzym wird entweder von den Zellen aufgenommen oder durch von den Zeilen sekretierte Enzyme umgesetzt. Beide Effekte lassen sich mit der hohen Stoffwechselrate erklären, die die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase an den Tag legen, wie sich bei den Zellen hier zeigte.
Um die Zellen in die stationäre Wachstumsphase zu versetzen und so ihren primären Stoffwechsel zu minimieren, wurde die Expressionsinduktion zunächst auf 4 h verlängert. Es stellte sich heraus, dass das zugesetzte NADH wiederum durch die Wirtszellen oxidiert worden war (Fig. 4). Die NADH-oxidierende Aktivität von Zeilen, die pAT-Nox enthielten, übertraf jedoch die Aktivität von Wirtszellen, denen das Plasmid fehlte. Zudem konnte ein quantitativer Unterschied zwischen nicht induzierten und induzierten Zellen nachgewiesen werden.
Nach einer Verlängerung der Induktionszeit auf 20 h konnte keine NADH-Oxidation durch Wirtszellen, denen das Plasmid fehlte, mehr nachgewiesen werden, was sich darin zeigt, dass im Falle der Negativkontrolie ohne Zellen das Extinktionsmaximum des NADH nach wie vor vorhanden ist, wie in Fig. 5 gezeigt ist. Nun war es möglich, bei diesen sogenannten„ruhenden Zellen" (Zellen in der stationären Phase) die Oxidation des zugesetzten NADH durch die an der Oberfläche befindliche NADH-Oxidase zu erfassen. Etliche Unterschiede zwischen £ coli BL21 (DE3) und E. coli UT5600 (DE3) sind offensichtlich, im Falle von E, coli BL21 (DE) pAT-NOx setzen nicht induzierte Zellen ungefähr die Hälfte des angebotenen NADH in NAD+ um, während induzierte Zellen alles vorhandene NADH umsetzen. Die Aktivität der nicht induzierten Zellen lässt sich damit erklären, dass das für die Expression der NADH-Oxidase verwendete T7- System nicht„dicht" ist, d. h. dass die Repression des T7-Promotors unvollständig ist, was auch im nicht induzierten Zustand zu einer niedrigen Expression des Gens durch T7-PoIymerase führt. Im Gegensatz dazu zeigt E. coli UT5600 (DE3) keine Aktivität im nicht induzierten Zustand, jedoch setzen induzierte Zellen nur ungefähr der Hälfte des NADH um.
Diese Ergebnisse beweisen, dass die Flavoprotein-NADH-Oxidase von Lactobacillus brevis an der Oberfläche von E. coli in seiner aktiven Form und unter Verwendung des Autotransportersystems exprimiert werden kann. Der anschließende Einbau von FAD in das Apoenzym scheint ordnungsgemäß abzulaufen und erfordert lediglich die Zugabe von FAD. Alle bisherigen Messungen waren von qualitativer Art, um den Test einzurichten und um Bedingungen zu finden, die das Nachverfolgen der Aktivität des Enzyms ermöglichen.
Für ein quantitatives Nachverfolgen der Enzymaktivität durch Messen der NADH- Oxidation im Laufe der Zeit wurde der optische Test auf Mikrotiterplatten übertragen, um so viele Proben wie möglich parallel beobachten zu können.
Züchten der Zellen in Minimalmedium (M9)
10 ml M9-Medium (15 μg ml Kanamycin) wurden mit 20 μΙ Glycerinkultur des entsprechenden Stamms beimpft und bei 37 °C und 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht inkubiert. Zum Beimpfen der Hauptkultur, 160 ml M9 (15 g ml Kanamycin), wurde die gesamte Übernachtkultur verwendet. Nach einem 7-stündigen Heranwachsen der Kulturen wurden der Hälfte der Kultur 1 mM IPTG und 0,2 % Lactose, als Kohlenstoffquelle, zugesetzt. Außerdem wurden 10 μΜ FAD für die NADH- Oxidase zugesetzt. Die Induktion erfolgte über 16 h bei 30 °C und 200 Umdrehungen pro Minute. Der anderen Hälfte der Kulturen wurde kein IPTG zugesetzt, ansonsten wurden diese Kulturen genau gleich behandelt.
Vorbereiten der Zellen für Aktivitätstests
Nach der Induktion wurden die Zellen zunächst 15 Minuten auf Eis gelagert und anschließend durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 5000 Umdrehungen pro Minute als Sediment abgeschieden. Die Sedimente wurden zweimal in 20 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, 10 μΜ FAD, gewaschen. Dann wurden die Zellen mit dem gleichen Puffer auf OD578 = 10 eingestellt,
NADH-Oxidase-Test auf Mikrotiterplatten Der NADH-Oxidase-Test für 96-weil-Mikrotiierplatten wurde in Proben von 240 μΙ pro Vertiefung in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer durchgeführt. Die Zellen wurden in solchen Mengen verwendet, dass in dem Test eine OD578 von 1 erzielt wurde. Zum Starten der Reaktionen wurden 200 μΜ NADH zugegeben. Nach einer 0, 3, 7, 15, 30, 45 bzw. 60 Minuten dauernden Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Test in einer Mikrotiterplatte bei 340 nm beobachtet (Mithras, Berthold Technologies). Zwecks Vermeidung einer Sedimentation der Zellen wurde die Platte vor der Extinktionsmessung geschüttelt. Als Referenz wurde eine Zellsuspension der entsprechenden OD in Puffer verwendet.
Basierend auf einer Reihe von Versuchen konnte die Produktton des NADH-Oxidase- Ganzzell-Katalysators so optimiert werden, dass i) höhere Aktivitäten vorlagen, ii) der Unterschied zwischen induzierten und nicht induzierten Zellen vergrößert wurde und iii) bei den Nonsense-Kontrolien nur eine niedrige Aktivität auftrat. Insbesondere stellte sich heraus, dass die Kultur, die zum Messen der NADH-Oxidase verwendet wird, in einem optimalen Zustand sein muss. Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines NADH-Oxidase- Tests, der unter Standardbedingungen, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben, durchgeführt wurde.
Für diese verbesserte Enzymaktivität sind verschiedene Faktoren verantwortlich, die mit den Wachstums- und Testbedingungen im Zusammenhang stehen. Schon im Hinblick auf eine Nutzung in größerem Maßstab wurde das Wachstum der Zellen modifiziert, derart, dass anstelle des komplexen LB-Mediums definiertes M9-Medium verwendet wurde. Während der Induktion wurde Lactose als Kohlenstoffquelle zugesetzt, und die Zeilen wurden früher, bei einer OD578 von ungefähr 0,35 induziert. Eine spätere Induktion, bei üblicherweise 0,6, hat zur Folge, dass ein zu langes Wachstum im M9-Medium erforderlich ist, was zu einer spontanen Zelllyse führt, mit dem Effekt, dass sowohl die Nonsense-Kontrolien als auch die nicht induzierten Kontrollen das als Substrat zugeführte NADH oxidierten. Dies liegt sehr wahrscheinlich an Enzymen, die infolge der Zelllyse freigesetzt werden.
Der NADH-Oxidase-Test wurde nun direkt in der Zellsuspension, wie oben beschrieben, in der Mikrotiterplatte durchgeführt und beobachtet. Dies macht die Handhabung viel einfacher und die Daten lassen sich besser reproduzieren. Eine Bestimmung von Absolutwerten der Enzym aktivität ist jedoch nicht möglich. Die mit einem fotometrischen Verfahren bestimmte Aktivität von Enzymen wird nach dem Lambert-Beerschen Gesetz berechnet. Um diese Gleichung anwenden zu können, muss die Schichtdicke der Küvette bzw. der 96-weli-Platte bekannt sein. Bei dem vorliegenden Versuchsansatz kann dieser Parameter nicht bestimmt werden. Deswegen wurde die Aktivität der NADH-Oxidase mit einem Fotometer, unter Verwendung von Küvetten mit einer definierten Schichtdicke von 1 cm bestimmt. Folglich lässt sich das Lambert-Beersche Gesetz anwenden. Bei einer Temperatur von 30 °C wurde für die Aktivität im LB-Medium 12,23 mU/ml ermittelt. Die Aktivität bei 30 °C im M9-Medium war etwas höher, nämlich 16,38 mll/mi. In der Veröffentlichung von Hummel et al. (2003) wurde die Aktivität eines auf einfache Weise gereinigten Enzyms mit 10-15 U/mg angegeben.
Beispie! 3: Test der Stabilität und Lagerfähigkeit des NADH-Oxidase-Ganzzell- Katalysators
Für die Untersuchung der Lagerfähigkeit und Stabilität des NADH-Oxidase-Ganzzell- Katalysators wurden induzierte Zellen bei 8 °C im Kühlschrank oder bei -18 °C bzw. bei -70 °C in der Tiefkühltruhe gelagert. Diese Zellen wurden wöchentlich anhand von Dreifachproben mit dem NADH-Oxidase-Test überprüft.
Die für die Lagerung bestimmten Zellen wurden im Anschluss an die Induktion der Genexpression zweimal mit Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5) gewaschen, in diesem Puffer auf OD578 = 10 eingestellt, auf Teiiproben aufgeteilt und für acht Wochen bei +8 °C eingelagert. Wenn Zellen bei -18 °C bzw. -70 °C gelagert werden sollten, wurde dem Gefrierpuffer 20 % Glycerin zugesetzt. Für Aktivitätstest wurden die Zellen, in 200 μΙ-Proben, mit dem oben erwähnten Puffer zu OD573 ~ 1 verdünnt, und dann wurden 0,2 mM NADH zugegeben, um die Reaktion zu starten. Die Oxidation von NADH zu NAD wurde in Dreifach proben durch Messen der Extinktionsabnahme bei Amax = 340 nm nachverfolgt. Um die Wirkung der während der Lagerung auftretenden Zeiliyse zu berücksichtigen, wurde der Wirtsstamm E coli BL21 (DE3) in gleicher weise gelagert und der gleichen Art von Aktivitätstest wie der Ganzzell-Biokatalysator BL21 (DE3) pAT-NOX unterzogen. Die Tafeln in Fig. 7 zeigen die Abnahme der NADH-Konzentration in bei 8 °C gelagerten Zelisuspensionen verschiedenen Alters. Wie erwartet zeigt der Wirtsstamm E. coli BL21(DE3), der als Kontrolle verwendet wurde, vor der Lagerung keine NADH- Aktivttät. Allerdings kann bei diesen Wirtszellen schon nach einer einwöchigen Lagerung eine deutliche Abnahme der NADH-Konzentration bei dem Test erfasst werden, wobei diese Abnahme um so deutlicher hervortritt, je länger die Lagerung dauert. Diese mutmaßliche NADH-Oxidase-Aktivität lässt sich mit der Lyse von Baktehenzellen erklären, die bei einer Lagerung von Zeilen bei 8 °C erfahrungsgemäß relativ rasch einsetzt. Bei dieser Temperatur im Kühlschrank gelagerte Zellen zeigen bereits nach einigen Tagen eine erhöhte Viskosität in Lösung und lassen sich nicht vollständig resuspendieren. Diese erhöhte Viskosität ist auf eine Freisetzung chromosomaler DNA bei der Zelliyse zurückzuführen. Außerdem werden infolge der Lyse von den Zellen Enzyme freigesetzt, die offensichtlich das bei dem Test als Substrat verwendete NADH oxidieren. Dieser Effekt ist auch im Falle einer Lagerung des NADH-Oxidase-Ganzzell-Katalysators E. coli BL21 (DE3) pAT-NOX und eines anschließenden Aktivitätstests bei diesem zu beobachten. Wenn die Dauer der Lagerung zunimmt, wird durch die NADH-Oxidation, die durch die Lyse der Zeilen im Kühlschrank bewirkt wird, die vor der Lagerung gemessene Aktivität des Katalysators überschritten. Folglich ist es nicht empfehlenswert, den NADH-Oxidase-Ganzzell- Katalysator im Kühlschrank aufzubewahren.
Wenn Zellen bei -18 °C gelagert werden, ist die Situation anders (Fig. 8). Die als Negativkontrolle verwendeten Wirtszeilen haben nach Lagerung in einer Tiefkühltruhe bei -18 °C keine Oxidation von NADH zur Folge, wohingegen der NADH-Oxidase- Ganzzell-Kataiysator auch nach 8 Wochen noch eine NADH-Oxidase-Aktivität zeigt, die - im Rahmen einer Normalverteilung - mit der anfänglichen Aktivität vergleichbar ist.
Bei einer 7 Wochen dauernden Lagerung des Gesamtzelf-Biokatalysators bei -70 °C ist keine signifikante Abnahme der Aktivität zu beobachten (Fig. 9). Eine Lyse von Wirtszeilen kann in diesem Fall auch ausgeschlossen werden. Folglich ist es empfehlenswert, den Ganzzeil-Biokatalysator bei -70 DC aufzubewahren.
Inzwischen wurde parallel zur Aktivität des Biokatalysators die Anzahl der Lebendzelien bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt. Bei einer Lagerung bei +8 °C nimmt die Anzahl der Lebendzellen innerhalb der ersten vier Wochen um drei Größenordnungen ab. Bei einer weitere drei Wochen dauernden Lagerung bleibt dann die Anzahl der Lebendzellen relativ konstant. Dieser Kurvenverlauf lässt sich auch bei einer Lagerung des Biokatalysators bei -18 °C bzw. -70 °C beobachten. Jedoch beträgt in diesem Fall die Abnahme der Anzahl der Lebendzeilen während der ersten vier Wochen nur zwei Größenordnungen. Die Abnahme der Anzahl der Lebendzellen korreliert nicht mit der Aktivität des Biokatalysators über einen Zeitraum von sieben Wochen. Während die Anzahl der Lebendzellen bei einer Lagerung bei -18 °C bzw. - 70 °C abnimmt, bleibt die Aktivität ungefähr konstant. Jedoch zeigt dieser Versuch, dass eine Lagerung in der Tiefkühltruhe (-18 °C oder -70 °C) gegenüber der Lagerung bei + 8°C im Kühlschrank zu bevorzugen ist.
Beispiel 4: Untersuchung der Recycelbarkeit des Ganzzell-Biokatalysators
Die Recycelbarkeit des Ganzzeil-Katalysators E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx wurde bezüglich einer Umsetzung von NADH über einen Zeitraum von 30 Minuten in 5 Zyklen bestimmt Für diesen Test wurden die Zellen im Anschluss an die Induktion der Genexpression zweimal mit Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5) gewaschen und in diesem Puffer zu einer finalen OD578 von 10 resuspendiert. Für die Bestimmung der Aktivität wurden Zellen in 200 μΙ-Proben mit dem oben erwähnten Puffer in der Mikrotiterplatte zu einer OD578 von 1 verdünnt, und dann wurden 0,2 mM NADH zugegeben, um die Reaktion zu starten. Die Oxidation von NADH zu NAD wurde in Dreifachproben durch Messen der Extinktionsabnahme bei lmax = 340 nm nachverfolgt. Zum Recyceln wurden die Zelten nach Abschluss der Reaktion herunterzentrifugiert und in 160 μΙ Kaliumphosphatpuffer resuspendiert. Wieder wurden 0,2 mM NADH zugegeben, um die Reaktion zu starten, und die Oxidation wurde fotometrisch nachverfolgt. Diese Prozedur wurde bei insgesamt 5 Zyklen wiederholt. Um den Einfluss der während der Behandlung möglicherweise auftretenden Zetllyse zu berücksichtigen, wurde der Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) als Negativkontrofle dem gleichen Test wie der Ganzzell-Biokatalysator BL21 (DE3) unterzogen.
Ais Kontrolle wurden Wirtszellen verwendet, denen der Biokatalysator fehlte. Wie Fig. 11 entnommen werden kann, setzen die Wirtszellen kein NADH um. Im ersten Zyklus (A) setzt der Ganzzeli-Biokatalysator fast 100 % des vorhandenen NADH innerhalb von 30 Minuten um. In den weiteren Zyklen nehmen der Umsatz und die Umsatzgeschwindigkeit ab. Im letzten Zyklus (5. Zyklus, D) werden innerhalb der Inkubationszeit 30 % weniger NADH umgesetzt. Für die Abnahme der Aktivität in nachfolgenden Zyklen könnte die Zentrifugation der Bakteriensuspension verantwortlich sein. Die Zentrifugalkraft stellt für die Zelle und insbesondere für die an ihrer Oberfläche exprimierten Moleküle eine mechanische Beanspruchung dar.
Beispiel 5: Regeneration von NADH zu NAD+ unter Verwendung des Ganzzeil- Biokatalysators E. coli BL21(DE3) pAT-NOx
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob der Ganzzell-Biokatalysator E. coli BL21 (DE3) pAT-NOx als Regenerationssystem für NAD+-reduzierende Enzyme verwendet werden kann. Dies wurde unter Verwendung eines Systems versucht, das den Ganzzell-Biokatalysator und ein NAD+-reduzierendes Enzym, Aldehyd- Dehydrogenase (AIDH), umfasst. AIDH gehört zu einer Gruppe von Enzymen, die Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäuren oxidieren und dafür NAD+ zu NADH reduzieren. Die Konzentration des NADH wurde fotometrisch nachverfolgt.
Wie Fig. 12 entnommen werden kann, nimmt erwartungsgemäß die NADH- Konzentration in der Probe, die den Gesamtzell-Biokatalysator E. coli BL21{DE3) pAT- Nox enthält, kontinuierlich ab. Im Gegensatz dazu wird ein Gleichgewicht zwischen NAD+ und NADH erreicht, wenn dem Biokatalysator das rekombinante Enzym AIDH zugesetzt wird, denn das durch die AIDH fortwährend zu NADH reduzierte NAD+ wird durch den Biokatalysator E. coli BL22(DE3) pAT-Nox regeneriert. Folglich ist dieses System im Gleichgewicht. Als sogenannte Nonsense-Kontrolle diente E. coli BL21 (DE3)-NitAf. Diese Zellen präsentieren an der Oberfläche die Nitrilase von A. faecalis, die außerstande ist, NADH zu oxidieren, wie ebenfalls Fig. 12 entnommen werden kann.
Fig. 13 zeigt in der oberen Hälfte der Tafel die durch AIDH vermittelte NADH-Zunahme. Was die Zugabe des Biokataiysators E. coli BL21(DE3) pAT-NOx zur Regeneration von NAD+ anbelangt, so war der Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) bereits zu dieser Reaktion gegeben worden, um die NADH-Konzentration {als Extinktion bei 340 nm erfasst) in Bezug auf die Anzahl der Zellen vereinheitlichen zu können. Nach Zugabe des Biokatalysators E. coli BL21(DE3) pAT-NOx zu der AIDH-Reaktion konnte keine Zunahme von NADH im Laufe der Zeit mehr erfasst werden, denn das durch AIDH gebildete NADH wurde laufend zu NAD+ reoxidiert. Folglich ist dieses System im Gleichgewicht.
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Die Merkmale der vorliegenden Erfindung, die in der Beschreibung, im Sequenzprotokoll, in den Ansprüchen und/oder in den Zeichnungen offenbart werden, können sowohl allein als auch in irgendeiner Kombination für die Realisierung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen rechtserheblich sein.

Claims

Patentansprüche
1 . Nukleinsäuremolekül, umfassend die folgenden Bestandteile:
(1) einen Abschnitt, der ein Signalpeptid codiert,
(2) einen Abschnitt, der ein heteroioges redoxfaktor-regenerierendes Polypeptid umfasst,
(3) optional einen Abschnitt, der eine Protease-Erkennungsstelle codiert,
(4) einen Abschnitt, der einen Transmembranlinker codiert, und
(5) einen Abschnitt, der eine Transporterdomäne eines Autotransporters oder einer Variante davon codiert.
2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 , wobei der Redoxfaktor, der durch das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid regeneriert wird, ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend NADH, NADPH, FADH2, Häm, Metaliionen, Glutathion, Pyrrolochinolin-Chinon, Pyridoxaiphosphat, Thiaminpyrophosphat und Ascorbat.
3. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das redoxfaktor- regenerierende Polypeptid einen oder mehrere Flavin-Cofaktoren umfasst.
4. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das redoxfaktor- regenerierende Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend NADH- Oxidase, Formiat-Dehydrogenase, Giucose-Dehydrogenase.
5. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das redoxfaktor-regenerierende Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend die NADH-Oxidasen von Lactobacitlus brevis, Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Brevibacterium sp. KU139 und Streptococcus faecalis, vorzugsweise die NADH-Oxidase von Lactobacillus brevis, und Varianten davon.
6. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Transporterdomäne eines Autotransporters ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Ssp, Ssp-h1 , Ssp-h2, PspA, PspB, Ssa1 , SphB1 , AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espl, EaaA, EaaC, Pertactin, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21 , AgA1 Protease, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1 , McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB und Varianten davon.
7. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das redoxfaktor- regenerierende Polypeptid sauerstoffempfindlich ist.
8. Polypeptid, codiert durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Zelle, die an ihrer Oberfläche ein Polypeptid nach Anspruch 8 exprimiert oder unter Verwendung eines Nukleinsäuremoieküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 transformiert worden ist.
10. Membranfraktion, erhältlich von der Zelle nach Anspruch 9.
11. Verfahren zum Regenerieren eines Redoxfaktors, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen des Polypeptids nach Anspruch 8, des Membranpräparats nach Anspruch 10 oder der Zelle nach Anspruch 9,
(b) Inkontaktbringen des Polypeptids nach Anspruch 8, des Membranpräparats nach Anspruch 10 oder der Zelle nach Anspruch 9 mit einem oder mehreren Substraten des redoxfaktor-regenerierenden Polypeptids, wobei das eine Substrat bzw. die mehreren Substrate den Redoxfaktor umfasst bzw. umfassen.
12. Verwendung der Zelle nach Anspruch 9 oder des Membranpräparats nach Anspruch 10 oder des Polypeptids nach Anspruch 8 zum Regenerieren eines Redoxfaktors.
13. Verwendung der Zelle nach Anspruch 9, des Membran-Präparats nach Anspruch 10 und des Polypeptids nach Anspruch 8 zum Einsteilen der Redoxumgebung einer wässrigen Lösung, vorzugsweise durch Desoxidieren der wässrigen Lösung.
14. Verfahren zum Herstellen einer Zeile, die an ihrer Oberfläche ein redoxfaktor- regenerierendes Polypeptid präsentiert, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in eine Zelle, (b) optional Inkontaktbringen der Zelle mit einer oder mehreren redoxreaktiven prostethischen Gruppen.
15. Verfahren zum Herstellen des Produkts eines redoxfaktor-abhängigen Enzyms, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Bereitstellen eines redoxfaktor-abhängigen Enzyms,
(b) Bereitstellen der Zelle nach Anspruch 9, des Membranpräparats nach Anspruch 10 oder des Polypeptids nach Anspruch 8 und
(c) Inkontaktbringen des redoxfaktor-abhängigen Enzyms mit einem oder mehreren seiner Substrate in Gegenwart der Zeile nach Anspruch 9, des Membranpräparats nach Anspruch 10 oder des Polypeptids nach Anspruch 8, wobei die Zelle nach Anspruch 9, das Membranpräparat nach Anspruch 10 oder das Polypeptid nach Anspruch 8 ein Polypeptid umfasst, das den Redoxfaktor regeneriert, von dem das redoxfaktor-abhängige Polypeptid abhängt.
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