JP2013537428A - ホールセル生体触媒 - Google Patents
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Abstract
Description
セリンプロテアーゼ、トリプシンまたはタンパク質キナーゼKの存在下において細菌をインキュベートすることにより、パッセンジャー、ここではNADHオキシダーゼの表面局在を検出することが可能である。トリプシンおよびプロテイナーゼKは、それらのサイズに起因してE. coliの外膜を通過することができないので、これらのプロテアーゼの存在下におけるホールセルのインキュベーションは、外膜の表面上に位置するタンパク質のみが消化される効果を有する。したがって、表面上に位置するパッセンジャーは消化されるが、膜に組み込まれたタンパク質構成要素は、酵素の攻撃に対して保護されており、したがって無傷のままである。このことは、SDS−PAGEにより確認することができる。酵素の方向は、ホールセル消化に基づいて評価した。図2は、IPTGによる発現の誘導後のE. coli株UT5600(DE3)pAT-NOxの単離された外膜、ならびにホールセル消化の後の単離された外膜を示す。IPTGによる誘導の後で、約100kDaの予想された融合タンパク質を外膜において検出することができた(トラック3)。トリプシンによるホールセルの消化は、初めはほぼ等しい強度であったOmpF/CおよびOmpAを表わすバンドと比較して、対応するバンドの強度の減少をもたらし、これにより、タンパク質が膜の外側に対して向けられていることを確認した(トラック4および5)。NADHオキシダーゼがオートディスプレイ系を用いてE. coliの表面上にディスプレイされることを示すことができた。
NADHオキシダーゼの活性を、測光アッセイにより決定した。NADHは、2つの、すなわち260nmおよび340nmの波長において消光の最大値を示すが、一方、NAD+は、260nmにおいて1つのみの最大値を示す。この違いを、NADHのNAD+への酸化の測光法によるモニタリングのために利用する。酵素の正しい折りたたみならびにFADの取り込みを可能にするために、用いた栄養培地または緩衝液にFADを添加した。
20mlのLB培地(15μg/mlのカナマイシン)に、対応する株のグリセリン培養物10μlを植菌し、37℃および毎分200回転で終夜インキュベートした。メインの培養をセッティングするため、100mlのLB培地(15μg/mlのカナマイシン、10μMのEDTA、10mMのメルカプトエタノール)に、2.5mlの終夜培養物を播種した。OD578=0.6において、50mlの培養物を、1mMのIPTGにより誘導した。NADHオキシダーゼの場合、さらに10μMのFADを添加した。培養物を、1h、4hまたは20h、30℃および毎分200回転で誘導した。培養物のもう半分は誘導せず、しかし他においては誘導した培養物と正確に同じ方法において処理した。
誘導の後で、細胞を、初めに氷上で15分間保存し、次いで、毎分5000回転で10minの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、20mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、10μMのFAD中で2回洗浄した。次いで、細胞のODを、同じ緩衝液により50に調整した。
NADHオキシダーゼ活性を検出するためのアッセイを、0.1M硫酸カリウム緩衝液(pH7.5)、1mMのDTTおよび基質として100μMのNADHを含んだ1mlの試料を用いて行った。細胞を、最終OD578=1においてアッセイに用いた。室温における1時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離により試料から取り除いた。上清のスペクトルを、200〜400nmの間の波長において記録した。
10mlのM9培地(15μg/mlのカナマイシン)に、対応する株のグリセリン培養物20μlを植菌し、37℃および毎分200回転で終夜インキュベートした。メインの培養物、160mlのM9(15μg/mlのカナマイシン)に植菌するために、終夜全培養物を用いた。7hにわたる培養物の初期増殖の後、1mMのIPTGおよび炭素源として0.2%のラクトースを培養物の半分に添加した。さらに、10μMのFADをNADHオキシダーゼのために添加した。誘導は、16hにわたり30℃および毎分200回転で行った。IPTGは、培養物のもう半分には添加しなかったが、他においてはこれらの培養物を正確に同じ方法において処理した。
誘導の後、細胞を、第1に氷上で15分間保存し、次いで毎分5000回転での10minの遠心分離による沈降物として分離した。沈降物を、20mlの0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)、10μMのFAD中で2回洗浄した。次いで、細胞を、同じ緩衝液によりOD578=10に調整した。
96ウェルのマイクロタイタープレートについてのNADHオキシダーゼアッセイを、1ウェルあたり240μlの試料において、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液中で行った。細胞を、OD578=1がアッセイにおいて達成されるような量において用いた。反応を開始させるために、200μMのNADHを添加した。0、3、7、15、30、45または60分間の室温におけるインキュベートの後で、アッセイを、マイクロタイタープレート中で340nmにおいて観察した(Mithras、Berthold Technologies)。細胞の沈降を避けるために、消光を測定する前にプレートを振盪した。緩衝液中で対応するODを有する細胞懸濁物を参照物として用いた。
NADHオキシダーゼホールセル触媒の保存能力および安定性を調査するために、誘導された細胞を、冷蔵庫中で8℃において、または冷凍庫中で−18℃または−70℃において保存した。これらの細胞を、毎週、NADHオキシダーゼアッセイにより、3つの複製における試料を用いてチェックした。
30分間の期間にわたる5サイクルにおけるNADHの変換に関するホールセル触媒E. coli BL21(DE3)pAT-NOxのリサイクル性を決定した。このアッセイについて、遺伝子発現の誘導の後で、細胞をリン酸カリウム緩衝液(0.1M、pH7.5)で2回洗浄し、この緩衝液中で最終OD578=10に調整した。活性を決定するために、200μlの試料中の細胞を、マイクロタイタープレート中で前述の緩衝液でOD578=1まで希釈し、次いで、0.2mMのNADHを添加して反応を開始させた。NADHのNADへの酸化を、3つの複製における試料において、λmax=340nmにおける消光の減少を測定することによりモニタリングした。リサイクルのために、反応の完了後に細胞を遠心分離により落とし沈殿させ、160μ1のリン酸カリウム緩衝液中で再懸濁した。再度、0.2mMのNADHを添加して反応を開始させ、酸化を測光法によりモニタリングした。この手順を全5サイクルにわたり繰り返した。処理の間に起こり得る細胞溶解の影響を考慮するために、陰性対照として宿主株E. coli BL21(DE3)を、ホールセル生体触媒BL21(DE3)と同じアッセイに供した。
この試験は、ホールセル生体触媒E. coli BL21(DE3)pAT-NOxをNAD+還元酵素のための再生系として用いることができるか否かを調査するために行った。これは、ホールセル生体触媒およびNAD+還元酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)を含む系を用いて試験した。ALDHは、アルデヒドを対応するカルボン酸へと酸化し、したがってNAD+をNADHへと還元する酵素の群に属する。NADHの濃度を測光法によりモニタリングした。
先行技術の多様な文書に対する引用がなされる場合、これらの文書は、それらの全体において、参照により本明細書の部分を形成する。引用された先行技術の文書についての完全な書誌の詳細を、以下に示す:
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Claims (15)
- 以下の構成要素:
(1)シグナルペプチドをコードするセグメント、
(2)異種性の酸化還元因子再生ポリペプチドを含むセグメント、
(3)随意に、プロテアーゼ認識部位をコードするセグメント、
(4)膜貫通リンカーをコードするセグメント、および
(5)オートトランスポーターまたはそのバリアントのトランスポータードメインをコードするセグメント
を含む、核酸分子。 - 酸化還元因子再生ポリペプチドにより再生される酸化還元因子が、NADH、NADPH、FADH2、ヘム、金属イオン、グルタチオン、ピロロキノリン−キノン、リン酸ピリドキサール、チアミンピロリン酸およびアスコルベートを含む群より選択される、請求項1に記載の核酸分子。
- 酸化還元因子再生ポリペプチドが、1または2以上のフラビン補助因子を含む、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 酸化還元因子再生ポリペプチドが、NADHオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼを含む群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 酸化還元因子を再生するポリペプチドが、Lactobacillus brevis、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus、Brevibacterium sp. KU139およびStreptococcus faecalisのNADHオキシダーゼ、好ましくはLactobacillus brevisのNADHオキシダーゼ、およびそのバリアントを含む群より選択される、請求項4に記載の核酸分子。
- オートトランスポーターのトランスポータードメインが、Ssp、Ssp-h1、Ssp-h2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspA/NalP、VacA、AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanBおよびそのバリアントを含む群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 酸化還元因子再生ポリペプチドが酸素感受性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
- 請求項8に記載のポリペプチドを、その表面上に発現するか、または、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて形質転換された、細胞。
- 請求項9に記載の細胞から得られる膜画分。
- 酸化還元因子を再生する方法であって、以下の工程:
(a)請求項8に記載のポリペプチド、請求項10に記載の膜調製品または請求項9に記載の細胞を提供すること、
(b)請求項8に記載のポリペプチド、請求項10に記載の膜調製品または請求項9に記載の細胞を、酸化還元因子を再生するポリペプチドの1または2以上の基質と接触させること、
ここで、1つの基質または幾つかの基質は、酸化還元因子を含む、
を含む、前記方法。 - 酸化還元因子の再生のための、請求項9に記載の細胞の、または請求項10に記載の膜調製品の、または請求項8に記載のポリペプチドの、使用。
- 好ましくは水溶液を脱酸素することによる、該水溶液の酸化還元環境の調整のための、請求項9に記載の細胞の、または請求項10に記載の膜調製品の、または請求項8に記載のポリペプチドの使用。
- その表面上に酸化還元因子再生ポリペプチドをディスプレイする細胞を生産するための方法であって、以下の工程:
(a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入すること、
(b)随意に、前記細胞を、1または2以上の酸化還元反応性補欠分子族と接触させること
を含む、前記方法。 - 酸化還元因子依存的酵素の産物を生産する方法であって、以下の工程:
(a)酸化還元因子依存的酵素を提供すること、
(b)請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドを提供すること、および
(c)請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドの存在下において、酸化還元因子依存的酵素をその基質の1または2以上と接触させること、
ここで、請求項9に記載の細胞、請求項10に記載の膜調製品または請求項8に記載のポリペプチドは、酸化還元因子依存的ポリペプチドが依存する酸化還元因子を再生するポリペプチドを含む、
を含む、前記方法。
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