JP2000504928A

JP2000504928A - 組み換え蛋白質のエクスポート系

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Publication number: JP2000504928A
Application number: JP09519186A
Authority: JP
Inventors: マウラーヨッヘン; ヨーゼヨアヒム; エフマイヤートーマス
Original assignee: マツクス―プランク―ゲゼルシヤフトツールフエルデルングデルヴイツセンシヤフテンエーフアウ
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2000-04-25
Also published as: DE59611241D1; ATE298799T1; KR20000064592A; US7129060B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ベクター、宿主−ベクター組み合わせ及び担体蛋白質及びパッセンジャー蛋白質からなる安定な融合蛋白質の製法に関し、この際、融合蛋白質の発現は、パッセンジャードメインを細菌細胞、殊にエセリキア・コリ細胞の表面上に露出させる。必要な場合には、このパッセンジャードメインを、プロテアーゼにより、例えば選択された宿主因子、例えばＯｍｐＴにより、媒体中に遊離させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】組み換え蛋白質のエクスポート系本発明は、ベクター、宿主−べクター組み合わせ、及び担体蛋白質とパッセンジャー蛋白質から成る安定な融合蛋白質の製法に関し、この際、融合蛋白質の発現は、細菌細胞、殊にエセリキア・コリ細胞の表面上にパッセンジャードメインを露出させる。必要ならば、このパッセンジャードメインはプロテアーゼにより、例えば選択された宿主因子、例えばＯｍｐＴにより媒体中に遊離させることができる。更に、本発明は、アミノ酸配列としてデータバンク又はファイル中に存在し、その特性に相応してオートトランスポーターと称される天然の蛋白質からの担体蛋白質又は担体蛋白質部分の使用に関する。本発明は、少なくとも１個のパッセンジャー蛋白質が結合パートナーに対する特定の親和性を有するその表面上に発現する細菌の同定及び選択の方法、並びに診断の目的でのその使用を可能にする。殊に、本発明の方法は、それを用いて、例えば抗体、ＭＨＣ−分子又は免疫系の他の成分における最大親和性を有するリガンドの測定が可能である細菌細胞の表面上でのペプチドーライブラリイの発現を可能にする。更に、本発明の方法は、重い又は軽い抗体ドメインの部分及びオートトランスポーターを組成とする融合蛋白質の生産及び細菌細胞外膜を通るその移送を可能とする。最後に、特異的な１実施形では、結合活性な組み換え抗体の目標とする分散及びエセリキア・コリの細胞表面上でのその機能的提示が可能になる。一般に、本発明の方法は、その細菌表面上でのレセプタ-又はリガンドであってよい組み換え蛋白質の発現並びに結合パートナーへの結合親和性に基づく選択を可能にし、これに伴ないクローン生成体の有効な選択が可能になる。本発明は、表面−露出蛋白質ドメインに対する親和性を示す結合パートナーの目的とする富化又は精製のために、細胞表面上の蛋白質融合を発現し、担体物質に結合して又は溶液中に存在する細菌を使用することにも関する。更に、本発明は、酵素又は他の生物学的、化学的又は工業的に重要な特性を有する蛋白質の表面発現及び、必要な場合には、周辺媒体中への目的とするその放出に関する。細菌細胞上での組み換え蛋白質の表面露出は、可能な微生物学的、分子生物学的、免疫学的又は工業的な多くで使用される方法である。この方法での組み換え蛋白質の製造により、その特性、例えば結合親和性又は酵素活性(Francisco et al.，Bio．Technology 11（1993）491-495)を得ることができ、更なる工程、例えば生産体細胞の崩壊を必要としない。自然では、限られた数の因子のみが細菌表面上で発現されるので、付加的に、細胞単独生産に比べて組み換え蛋白質の特異的な富化が与えられる。もう一つの主要な利点は、所望の組み換え蛋白質を選択すると同じ方法で、この蛋白質の生産体、細菌細胞も単離でき、これにより長時間貯蔵でき、安定に再生でき、大規模に増殖することのできるクローン性生産体が得られる。細胞表面上での組み換え蛋白質の提示のために、従来は、例外なく、かつ当然に、細胞表面蛋白質の移送又は分泌のために役立っている種々の系が使用された（Little et al.,TIBTECH 11(1993),3-5)。この場合には有意義に、当然、移送すべき蛋白質、パッセンジャーをコードするＤＮＡ−領域が、所望の組み換え蛋白質のコード性ＤＮＡ−領域により置換又は補充されたが、この際に、移送に応答する蛋白質ドメインのコード性範囲、担体蛋白質は、通常不変のまま残る。このことから、その中でパッセンジャー成分及び担体成分が直接隣接しているか、または1遺伝子中にコードされて存在する系、いわゆる１成分−系は、複数の無関係な成分を有する系(Gentschev et al, ．Behring Inst．Mitt．95(1994)57-66)に比べて、殊に安定な複製のための特性と並んで、１以上の選択マーカー、移送のために必要な蛋白質ドメイン、パッセンジャーをコードするＤＮＡ−フラグメントの挿入位置をも有すべきであるユニバーサルに使用可能なベクターの製造時に著しい利点を有することが明らかである。従来使用されていた多くの１成分−系中のトランスポーター蛋白質として、Ｅ.コリの外膜の蛋白質が使用されていた。これには、特にＬａｍＢ（Charbit et al.，Gene 70(1988) ，181-189）、ＰｈｏＥ（Agterberg et al.，Gene 59(1987)145-150)又はＯｍｐＡ(Franscisco et al.，Proc．Natl.Acad.Sci(1992),2713-2717)が属するが、それらの使用は欠点を伴う。例えば、付加的な蛋白質配列は、表面露出されたループ中にのみ組み込むことができ、これは一方で、固定すべきアミノー及びカルボキシ末端を枠に入る担体蛋白質配列の所にもたらし、他方で、限定的に取り込むべき配列の長さに作用する。ペプチドグリカン会合したリポ蛋白質（ＰＡＬ）の担体蛋白質としての使用は、外膜への移送をもたらすが、それに伴いＥ.コリの表面上の本来の蛋白質配列の提示は不可能である(Fuchs et al.，Bio．Technolo gy 9(1991),1369-1372)。大きい蛋白質の表面発現は、担体蛋白質分としてのＯｍｐＡ及びＬｐｐからの融合の使用下に可能であり、それらのカルボキシル末端の所にパッセンジャー蛋白質配列が付けられる(Franscisco et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci(1992),2713-1717)。この場合には、パッセンジャーのＮ−末端の固定が正しい折畳み又は機能を阻止しうる欠点を甘受しなければならない。更に、いわゆるオートトランスポーターを含有する蛋白質、グラム陰性細菌中に分泌された蛋白質の群が公知である。Ｊｏｓｅ等の文献（Mol.Microbiol.18 (1995),377-382)には、このようなオートトランスポーター蛋白質のいくつかの例が挙げられている。これらの蛋白質は、Ｎ−末端に付いている蛋白質ドメインのβ−折畳み板構造から構成されている孔構造を通る移送を、グラム陰性菌の外膜中で可能にする蛋白質ドメインを含有する。オートトランスポーターを含有する蛋白質は、いわゆるポリ−蛋白質−先駆分子として合成される。このような先駆蛋白質の典型的な構造は、３つに分けられている。Ｎ−末端には、宿主中に存在するＳｅｃ−移送装置の援助の下に内膜を通る移送のために応答し、その際に分離されるシグナル配列が存在する。これに引き続き、分泌すべき蛋白質ドメインが続き、外膜中に孔を形成するＣ−末端ヘルパードメインがそれに続き、これにより、Ｎ−末端に付いている分泌すべき蛋白質ドメインが表面に移送局在化される。そこで、それは、その発揮すべき機能に依存して、いまや膜アンカーとして役立つヘルパーと一緒に細菌表面に結合して残るか、又は蛋白質分解活性により分離され、その際、分泌すべき蛋白質ドメインのこれら蛋白質分解活性は、内在していてよいか又はその宿主から出る特性であってよいか又は外から目的に応じて添加された活性（例えば、トロンビン、ＩｇＡ −プロテアーゼ）であってもよい。オートトランスポーターをベースとする表現系の使用下での非相同ポリペプチド又は蛋白質の分泌は公知である。例えば、ＥＰ−Ａ０２５４０９０又はクラウザー（Klauser）等の文献（EMBO J.11(1992),2 327-2335）から、パッセンジャードメインとしてのＮ．ゴノロエアエ（gonorrho eae）非相同ポリペプチドからのＩｇＡ−プロテアーゼのヘルパードメインが、非相同細菌菌株Ｅ.コリ及びサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimuri um)中で発現できることが公知である。更に、シゲラ(Shige1la)からの蛋白質ＶｉｒＧの細胞外移送がスズキ等により記載されている(J.Biol．Chem．270(1995),30874-30880)。この蛋白質は、同様に、異種ポリペプチド、例えば、ＶｉｒＧのオートトランスポータードメインのＮ−末端に共有結合したＭａｌＥ及びＰｈｏＡを発現させることのできるＩｇＡ −プロテアーゼー類似オートトランスポーターである。更に、シマダ等の論文(J .Biochem.116(1994),327-334)には、Ｓ．マルセセンス（marcescens）のセリンプロテアーゼのオートトランスポータードメインの使用下における、非相同ポリペプチド、即ちＥ．コリ中のＡ.ファエカリス（faecales）からのプソイドアズリンの細胞外移送が記載されている。しかしながら、オートトランスポーター系を用いる非相同パッセンジャー蛋白質の発現を得るための技術水準に記載の方法では、著しい欠点が確認された。例えば、宿主としてのＥ．コリ中のＮ．ゴノロエアエからのＩｇＡ−プロテアーゼのトランスポーター又はヘルパードメインの使用の際に、屡々著しい和合性の問題が現れる。強すぎる発現は、細胞−溶解をもたらすか又は細菌は中程度の発現の際にも減少した成長を示し、このことは、双方の場合に、著しく減少された融合蛋白質収率をもたらし、この系の安定性の低下を証明している。従って、本発明は、多くの理由から宿主菌株としてのＥ．コリが例えばナイセリア・ゴノロエアエ（Neisseria gonorrho eae）に比べて有利であるので、殊に宿主菌株としてのＥ．コリの使用の際に、これらの欠点をもたらさない担体蛋白質を提供することの技術的課題に基づいている。一つには、組み換えＤＮＡを有するＥ．コリ菌株は既に安全度１の簡単な実験室中で培養することができる。更に、既に市販製品中のＥ．コリ菌株を用いて組み換え蛋白質が操作される。このことは、組み換えＥ．コリ菌株の取り扱い及び操作において、他の宿主菌株に比べて著しい利点であることを意味する。更に、Ｅ．コリからは既に、所望の用途に依存して宿主菌株の選択を可能にする多数の正確に特徴付けられた突然変異株が生じている。この課題は、（ａ）１個のプロモータを用いるオペラテイブ結合で融合された（ｉ）シグナルペプチド−コード性核酸断片（ｉｉ）提示すべきパッセンジャーペプチド又は／及びパッセンジャーポリペプチドをコードする核酸断片（ｉｉｉ）場合により、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸断片（ｉｖ）トランスメンブランリンカーをコードする核酸断片及び（ｖ）オートトランスポーターのトランスポータードメインをコードする核酸断片を含有する１核酸配列がその上に局在しているベクターを用いて形質転換された宿主細菌を準備し：かつ（ｂ）この宿主細菌を、融合された核酸配列の発現及び核酸断片（ｉｉ）でコードされたペプチド又はポリペプチドの提示を宿主細菌の表面で行わせる条件下に培養することにより、グラム陰性宿主細菌の表面上でペプチド及び／又はポリペプチドを提示させる方法により解決され、これは、核酸断片（ｉｉ）がトランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して非相同であり、この宿主細菌はトランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して相同であることを特徴とする。トランスポータードメインをコードする核酸断片に対して相同である宿主細菌の使用により、意外にも、技術水準に比べて明らかに改善されたペプチド又はポリペプチドの、殊に好ましくは４〜５０アミノ酸の長さを有する短い合成ペプチドの又は真核性ポリペプチドの表面提示が達成できる。本発明による方法では、１以上の和合性組み換えベクターを用いて形質転換されている宿主細菌を準備する。このようなベクターは、１個のプロモータ及び場合によっては更なるこの発現のために必要である配列とオペラチブに結合して融合された１核酸配列を有する。この融合された核酸配列は、（ｉ）シグナルペプチド−コード性断片、好ましくは、ペリプラズムまでの内膜内の通過を可能にするグラム陰性シグナルペプチドをコードする断片を有する。更に、融合された核酸配列（ｉｉ）は、提示すべきパッセンジャーペプチド又はポリペプチドをコードする断片を有する。場合によっては、断片（ｉｉｉ）の３’−側に、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸断片が存在する。好適なプロテアーゼ認識部位の例は、固有の、即ち本来宿主細胞中に存在するか又は外から導入されたプロテアーゼの認識部位である。外から導入されたプロテアーゼの例は、ＩｇＡ−プロテアーゼ（例えばＥＰ−Ａ−０２５４０９０参照）、トロンビン又はＸ因子である。固有のプロテアーゼの例は、ＯｍｐＴ、ＯｍｐＫ又はプロテアーゼＸである。この断片の３’−側には、（ｉｖ）トランスメンブランリンカーをコードする核酸断片が存在し、これは断片（ｉｉｉ）でコードされたペプチド又はポリペプチドの宿主細菌の外膜の外側上に提示させることができる。この断片の３’−側は、オートトランスポーターのトランスポータードメインをコードする核酸断片である。オートトランスポーターに関して相同であるトランスメンブランリンカードメインを使用することが特に有利である、即ちトランスメンブランリンカードメインは、核酸断片により直接、オートトランスポータードメインの５’−側でコードされる。このトランスメンブランリンカーの長さは、好ましくは３０〜１６０アミノ酸である。トランスポータードメインは、宿主細菌の外膜中でいわゆるβ−樽を形成することができる。このβ−樽は、偶数個の非平行の両親媒性のβ−折畳み板より成る。この構造は、グラム陰性菌の外膜の他の蛋白質と同様に、Ｃ−末端に芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン又はトリプトファンを有する。これに、交互に、帯電された（極性の）及び帯電されていない（疎水性の）アミノ酸、折畳み時にこの膜と一緒に１つの役割を演じる構造が続く。両親媒性のβ−折畳み板の数及び位置は、適当なコンピュータプログラムを用いて同定でき、外膜ポリン（この結晶構造は公知である）に対する類縁体(Cowan et al.，Nature 358(1992), 727-733)を用いて、樽構造のモデルの構成のために使用できる。樽構造は次のように構成するのが有利である：膜流路のための９〜１４個、殊に約１２個のアミノ酸（ＡＳ）；β−折畳み板中には外側に向かって帯電されたＡＳはないか又は最小数を示す；内側に向かって、小さいループを示すか又はループはなく、場合によっては大きい又は非常に大きいループが外側に向かって示す；β−樽は、１２、１４、１６又は１８、殊に１４個の非平行のβー折畳み板からなっている。この樽のモデルから出発して、今や外膜を通る自己移送のために必要である範囲を決めることができ、１個のシグナルペプチド及び１個のパッセンジャードメインと共に遺伝子平面上に結合させることができる。次いで、この構成の発現はパッセンジャー蛋白質を細菌表面上へ移送することを可能にし、この際、シグナルペプチドは、本来パッセンジャー又は他の蛋白質から由来していてよい。この場合に、β−樽に付加して、生じた孔を通りパッセンジャードメインを完全に表面で露出するために役立つ長さ及び配列で好適なリンカー領域が結合されることを考慮すべきである。本発明の方法の主要な１特徴は、宿主細菌がトランスポータードメインをコードする核酸断片に対して相同であること、即ち宿主細胞及びトランスポータードメインが相同のファミリー、例えばエンテロバクターから、特に相同な属、例えばエセリキア、サルモネラ又はヘリコバクターからの、特に有利には相同な種、例えばエセリキア・コリ、サルモネラ・チフィムリウムから選択されることである。宿主細菌として、サルモネラ又はＥ．コリ及び同様にサルモネラ又はＥ．コリに由来するトランスポータードメイン又はその変異体を使用するのが特に有利である。ここで、特に好適なＥ．コリ宿主菌株として、ｏｍｐＴ^-、ｄｓｂＡ^-であり、遺伝学的マーカーｆｐｔを有する菌株ＪＫ３２１（ＤＳＭ８８６０）が挙げられ、これは、Ｉｇａβ−ヘルパー蛋白質を用いて大きい蛋白質、例えば抗体のＶ_h −鎖の安定な表面発現をももたらす。従って、有利な１実施形では、本発明は、オートトランスポーター機能を発揮し、エセリキア・コリ中での組み換え蛋白質の表面露出を高い収率で可能とする担体蛋白質に関する。ここで、典型的な１例では、これは、Ｅ．コリからの「アドヘシン−インボルブド−イン−デフューズ−アドヒーレンス（ＡＩＤＡ−Ｉ）」のオートトランスポーターである(Benz und Schmidt，Infect．Immun．57(198 9)，1506-1511)。このＡＩＤＡ−Ｉ−蛋白質のトランスポータードメインは、第２図中に示されている。この特異的な配列と並んで、例えば膜流路に関与しないループ構造中でのアミノ酸配列の変更により得ることのできるその変異体も使用できる。場合によっては、表面ループをコードする核酸断片は完全に欠失されていてもよい。両親媒性β−折畳み板構造内でも、保守的なアミノ酸交換、即ち１親水性アミノ酸を他の親水性アミノ酸で交換する又は／及び１疎水性アミノ酸を他の疎水性アミノ酸で交換することもできる。１変異体は、第２図に記載のＡＩＤＡ−Ｉオートトランスポータードメインの配列に対して少なくとも８０％、殊に少なくとも９０％の相同性を、少なくともβ−折畳み板構造の範囲内に有するのが有利である。もう一つの典型的な例では、使用オートトランスポーターは、シゲラ・フレックスネリからのＳｅｐＡ−蛋白質のそれ（Benjellou-Touimi et al.，Mol．Micr obiol 17（1995）123-135）又はその変異体である。もう一つの典型的な例では、これは、シゲラ・フレックスネリからのＩｃｓＡ−蛋白質のオートトランスポーター(Goldberg et al.，J.Bacteriol．175（1993），2189-2196)又はＥ．コリからのＴｓｈ−蛋白質のオートトランスポーター（Provence et al.，Infect．I mmun 62(1994),1369-1380）である。もう一つの典型的例では、これは、ヘリコバクター・ムステラエからのＨｓｒ−蛋白質のオートトランスポーター(O'Toole et al.，Mol．Microbiol．11(1994),349-361)、ボルデテラ・ｓｓｐからのＰｒｎ−蛋白質のオートトランスポーター(Charles et al.，Proc．Natl．Acad．Sci USA 86(1989),3554-3558;Li et al.，J．Gen．Microbiol．138(1992)，1697-17 05)、セラテイア・マルセッセンスからのＳｓｐ−蛋白質のオートトランスポーター(例えば、Yanagida et al.，J．Bacteriol.166(1986)，937-944又はGen bank-Accessionnr.X 59719,D78380)、ヘモフィルス・インフルエンザエからのＨａｐ−蛋白質のオートトランスポーター(StGemeet al.，Mol．Microbiol．14(19 94),217-233)、ボルデテラ・ペルトウシスからのＢｒｋＡ−蛋白質のオートトランスポーター(Fernandez und Weiss，Infect．Immunol．62(1994)，4727-4738) 、ヘリコバクター・ピロリからのＶａｃＡ−蛋白質のオートトランスポーター(S chmitt und Haas，Mol．Microbiol．12(1994)，307-319)又はリケッチアからの種々の蛋白質のオートトランスポーター（例えば１９０ＫＤａ細胞表面抗原、 Genank-Accessionnr.M31227;Spap、Carl et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87(1990),8237-8241;ｒＯｍｐＢ、Gilmore et al.,Mol．Microbiol．5(1991),23 61-2370 及びＳｌｐＴ，Hahn et al.，Gene133(1993),129-133）又は前記のように定義されたその変異体である。先に記載のオートトランスポーターのＤＮＡ−配列及びこれから誘導されたアミノ酸配列を第７図〜第２４図に記載する。細菌表面蛋白質中の又は分泌された細菌性蛋白質中の更なるオートトランスポータードメインは、データバンク中に存在する蛋白質配列、データバンクで入手可能なＤＮＡ−配列をベースとする蛋白質配列又は配列分析により直接又は間接的にＤＮＡ−配列を介して特定された蛋白質配列から誘導することができる。相応してコードする領域（遺伝子）は、グラム陰性菌、殊にＥ．コリ中でのパッセンジャー蛋白質の有効な表面発現を可能とするベクター又は融合蛋白質遺伝子の製造のために使用することができる。本発明において、表面提示又は−露出とは、融合蛋白質又はパッセンジャードメインが細菌外膜の媒体に向いている側上に局在していることを意味する。表面露出されたパッセンジャー蛋白質は、無傷のグラム陰性菌中で自由に結合パートナーに受け入れられる。従って、有利な１実施形で、本発明は、ペプチドの表面提示又はもう一つの実施形ではグラム陰性菌、殊にＥ．コリ中でのペプチドライブラリイの表面提示を可能にし、抗体又は他のレセプターに対する親和性の測定のため又はエピトープマッピングのためのその使用を可能にする。エピトープマッピングとは、抗体又は他のレセプターへの最大親和性を有するペプチドが生産菌株上で表面露出して同定されることを意味する。この場合に、ペプチドライブラリイの発現のための、従来使用されていたファージ系(Makowski，Gene 128(1993),5-11)に比べた本発明の決定的な利点が明白になる。本発明による細菌系中では、所望の特性を有する１ペプチドの同定と同時に、クローン生産体の選択を行う。これは、直接増殖することができ、ファージ系におけるような感染（ファージ増加）及び選択（ファージ選択）のコストのかかるサイクルを必要とすることなく、所望のペプチドの大量生産のために使用することができる。正しいペプチドを表面露出発現する菌株の増殖と同時に、その配列分析がペプチドの明白な同定及び特徴付けを簡単かつ確立された技術を用いて可能とする、相応してコードする遺伝子の増幅を行う。これらの本発明による利点は、本発明で表面露出発現される全てのパッセンジャードメイン、即ちペプチド及びポリペプチド上で現れる。従って、本発明により製造されたペプチドライブラリイは、特に有利なＡＩＤＡオートトランスポーターからの変異体中のオートトランスポーター及びグラム陰性菌、有利にＥ．コリ中で表面露出して生産されるペプチドから成る融合蛋白質を含有する。種々に発現されたペプチドの高い分散は、典型的な例では縮重された合成オリゴヌクレオチドのクローニングにより、シグナルペプチドとオートトランスポーターに関するコード性領域の間に生じる。もう一つの有利な実施形では、本発明は、抗原としての作用をする蛋白質又は蛋白質フラグメントのグラム陰性菌、特にＥ．コリの表面上での発現を可能とする。このような融合蛋白質の構築は、本発明によれば、パッセンジャーとしてのビブリオ・コレラエのトキシンのβ−サブユニット（ＣｔｘＢ）及び担体蛋白質としてのＡＩＤＡオートトランスポーターの使用下に行った。使用される結合パートナーに対する表面露出された抗原ドメインの易入性は、ＣｔｘＢに特異的な抗血清を用いる標識付けにより本発明により証明された。この場合に、組み換えられ、Ｅ．コリ宿主菌株の外膜中に貯蔵された融合蛋白質が、総細胞蛋白質の５％まで達することができることが明らかであり、このことは、他の系に比べた著しく改善された作用効果を意味する。従って、ここに記載の方法は、グラム陰性菌の表面上での抗原作用をする蛋白質又は蛋白質フラグメントの安定な生産及び提示を可能にし、有利な実施形でのその生ワクチンとしてのその使用、経口ワクチン接種又は血清又は抗体バンクのスクリーニングのために使用することを可能にする。表面露出発現された抗原作用をする蛋白質を有する細菌細胞、例えば弱毒化されたサルモネラ菌株(Schorr et al.，Vaccine9(1991),675-681)の使用は、生ワクチン接種の際に抗原の細胞内細菌発現に比べて有利であることが立証された。一般に、有利な１実施形で、本発明は、その主成分中のペプチド又は蛋白質がグラム陰性菌、殊にＥ．コリの表面上に存在する全てのパッセンジャーの表面発現を可能にする。もう一つの有利な実施形では、ＡＩＤＡ蛋白質、ＡＩＤＡオートトランスポーターのＣ−末端ドメインが、グラム陰性菌の表面上での、免疫系の組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体ドメインの提示のための膜アンカーとして役立つ。組み換え抗体フラグメントの表面発現は、その迅速な修飾をも、その抗原−結合特性の評価及び検査をも可能にする。従って、機能性抗体フラグメントの可能な完全なライブラリイを表面露出して生産すること及び特定の所望結合特性又は親和性を試験することまでを可能にする。従来使用されていたファージ系に比べた本発明の利点は、変形、即ち同じ宿主組織中で遺伝子操作及び蛋白質の生産を行うことができることにある。この場合に、この遺伝子操作は、一つの目的とする操作（場所特異的突然変異）であるか、又は縮重されたオリゴヌクレオチドの使用下でのパッセンジャーとしての抗体−コードするフラグメント及び担体蛋白質としてのオートトランスポーターからの無傷の融合の合成のための偶然の操作であり得る。同様に、この遺伝子操作はインビボ−突然変異の形で行うことができ、ここでは、融合蛋白質に関する遺伝子を含有する細菌に、エネルギーの高い照射線（例えばＵＶ）を当てるか又は化学的突然変異剤を作用させることができる。正しい結合特性を有する分子の本発明による選択は、生産細菌細胞の選択により行う。このことから、本発明による方法は、免疫系の自然の戦略の変形及び後続の選択よりなるその戦略において、免疫原分子の結合特性の可能な最善の適合に依ることが明らかになる。グラム陰性菌、殊にＥ．コリの表面上での、通常はグリコシル化されない抗体の機能性抗原−結合性部分の発現のために、種々の発明性のある処置法が考えられる。軽い鎖（ＶＬ）及び重い鎖（ＶＨ）とそれぞれ１個のオートトランスポータードメイン（これらは相互に無関係に異なる和合性のベクターと共に、又は異なるプロモーターの制御下に１宿主細胞中の同じベクター上に発現させられる）との別々の融合により、２個の１価のフラグメントを一緒に提示させることができる。その表面上には、双方の表面露出されて存在する抗体ドメインが一緒に集合して機能性Ｆｖ−フラグメントになり、この際、相互作用の安定性は、化学的に誘導されたジスルファイド橋形成又は他の性質の化学的架橋結合により促進されうる。本発明のもう一つの処置法では、担体蛋白質としてのオートトランスポーターを含有し、パッセンジャーとして１抗体の抗原−結合性ドメインの軽い鎖（ＶＬ）及び重い鎖（ＶＨ）が短いリンカーペプチド（これは機能性Ｆｖ−フラグメントへの双方の鎖の正しい集合を可能とする）（例えば［Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ］₃）を介して結合している融合蛋白質を製造する。このような単一鎖（ｓｃ）Ｆｖ−フラグメントの構築の際には、軽い鎖のＮ−末端と重い鎖のＣ−末端との結合も、重い鎖のＮ−末端と軽い鎖のＣ−末端との結合と同様に可能である(Pluckthum Immun．Rev．130(1992),151-188)。記載の処置法を用いて、完全なＦａｂ−フラグメントの生産も可能である。もう一つの有利な実施形で、本発明は、場合により、定義の貯蔵されたペプチドを有するＥ．コリ中のＭＨＣ−群ＩＩ分子の表面露出発現を可能とする。この場合に、二つの戦略が考えられる。一つの変形では、２個の異なる融合蛋白質（これらは双方とも１個のオートトランスポーターを担体蛋白質として含有する）を、１宿主細胞中で異なるプロモータの制御下で別々の和合性ベクター上に又は１ベクター上に発現させる。パッセンジャー蛋白質としては、一方では所望のＭＨＣ−群ＩＩサブタイプのα−鎖が、かつ他方ではこのサブタイプのβ−鎖が役立ち、これらのＮ−末端には１リンカーを介して所望のペプチドが付いていてよい(Kozono et al.，Nature 369(1994)151-154)。第２の変法では、ペプチド、β−鎖及びα−鎖より成るパッセンジャー蛋白質をオートトランスポーターと融合させる。この細菌表面上に、α−及びβ−鎖が集合して機能性ＭＨＣ−分子になり、この際、このペプチドがまさしくこの結合穴内に蓄積する。このコンプレックスの安定性は、化学的に誘導されたジサルファイド橋形成により支持されうる。融合蛋白質をコードするＤＮＡ−フラグメントの製造時に、貯蔵されたペプチドの変形は、場所特異的な突然変異及び／又は縮重されたオリゴヌクレオチドプライマーの使用より、同様にエネルギーの高い照射線及び／又は化学的突然変異の使用下でのインビボー突然変異によるり可能である。ここでも、本発明による方法の利点がなお明白である。結合パートナーの変形、最適特性を有する分子の発現、選択、配列分析及び安定な生産が１宿主菌株中で行なうことができる。これにより、例えば既に公知の良好な結合特性を有するリガンドの変異体の迅速な特徴付け、及びこれに伴うリガンドー又はレセプター至適化も可能である。もう一つの有利な実施形では、本発明は、免疫遅延型レセプター、例えばＣＤ１、Ｆｃ−レセプター又はＭＨＣ−クラスＩ分子及びそれらの目的とする変形の表面発現を可能とする。もう一つの有利な実施形で、本発明は、Ｔ−細胞レセプター又はその部分の、かつ他の表面抗原性の真核細胞又は免疫系の細胞の表面発現を可能とする。もう一つの有利な実施形で、表面発現された蛋白質フラグメント又はペプチドは、適当なセルライン又はプライマーセル、例えばマクロファージによる細菌の収容に引き続いて、クラスＩ又はＩＩのＭＨＣ−分子中に貯蔵されたペプチドとして提示され、特定のＴ−細胞の刺激のために役立つことのできるＴ−エピトープである。特に有利な１実施形では、本発明の方法は、結合パートナーに対する親和性を有するペプチド又はポリペプチド、リガンド、レセプター、抗原、トキシン結合性蛋白質、酵素活性を有する蛋白質、核酸結合性蛋白質、ィンヒビター、キレーター特性を有する蛋白質、抗体又は抗体の抗原結合性ドメインの変形を可能とする。本発明では、「結合パートナー」なる概念に、元素、分子、化学結合又は高分子が入ると理解されるが、この際、結合パートナー及び／又はそれらは、融合蛋白質を発現する細菌細胞を自由に溶解して、マトリックスに結合して又は生物学的膜と会合して存在する。本発明で、「抗原結合性ドメイン」なる概念は、少なくとも、１抗原の特異的結合のために充分である抗体分子の範囲を意味する。もう一つの有利な実施形で、本発明は、表面露出されたパッセンジャーペプチド又は−ポリペプチド又はその部分の化学的、物理的又は／及び酵素的修飾を可能とし、その際、この修飾は、共有的修飾、非共有的修飾、グリコシル化、ホスホリル化又は蛋白質分解であってよい。表面露出されたペプチドの変異ポピュレーシヨンを製造し、それぞれ所望の特性を有するペプチド又はポリペプチドを有する細菌の同定のための本発明の方法は、次の工程を包含する：（１）フレーム内での１つのオートトランスポーター及び１つのシグナルペプチドのトランスポータードメインのコード性配列を有する所望のパッセンジャーのコード性配列のクローニングにより、少なくとも１ベクター中に１以上の融合遺伝子を製造する、この際、個々の部分フラグメントはＰＣＲを介して増幅させるか又は他のＤＮＡの制限消化から由来することができる；（２）突然変異による、例えば場所特異的な突然変異、縮重されたオリゴヌクレオチドプライマーのＰＣＲでの使用、化学的突然変異又はエネルギーの高い照射線の使用によるこのパッセンジャーの変形；（３）宿主細菌中へのこの又はこれらのベクターの取り込み；（４）融合蛋白質又は複数の融合蛋白質をその表面に安定して提示する宿主細菌中での融合遺伝子又は複数の融合遺伝子の発現；（５）安定に表面露出提示されたパッセンジャー又は複数のパッセンジャーを生産させるための、例えば培養液中又は寒天プレート上でのこの細菌の培養；（６）場合による、所望の特性を有するパッセンジャー又は複数のパッセンジャーをその表面上に有する細菌の選択；及び（７）場合による、至適特性を有するパッセンジャーの結合パートナーの特徴付け。この場合に、本発明により、表面露出されペプチド又はポリペプチドの特性を段階的に所望の結合特性に適合させるか又は第１の工程で結合パートナーを１特性に関して至適化し、第２の工程で１以上の他の特性に関して至適化するために、この方法を数回実施することができる。しかしながら、本発明によれば、所望の用途に応じて、この方法の工程の個々の１部分のみを相互に連結することもでき、典型的な１例では、工程（１）、（３）、（４）及び（５）であるが、他の全てを組み合わせも可能である。この方法の有利な１実施形では、融合蛋白質は、担体蛋白質として、融合蛋白質を分泌することのできるＡＩＤＡ蛋白質のオートトランスポータードメイン又はその変異体を含有する。この方法のもう一つの有利な実施形では、融合蛋白質が担体蛋白質として、ＳｅｐＡオートトランスポーター又はその一部分、又はＩｃｓＡオートトランスポーター又はその一部分、又はＴｓｈオートトランスポーター又はその一部分、又はＳｓｐオートトランスポーター又はその一部分、又はＨａｐオートトランスポーター又はその一部分、又はＰｒｎオートトランスポーター又はその一部分、又はＨｓｒオートトランスポーター又はその一部分、ＢｒｋＡオートトランスポーター又はその一部分、又はＶａｃＡオートトランスポーター又はその一部分又はリケッチアオートトランスポーター又はその一部分を含有し、それぞれは融合蛋白質の分泌を可能にする。本発明により、１細胞中でその表面上に集合して機能性ユニットになる種々の融合蛋白質を製造することにより、マルチマーの蛋白質を発現させることができる。宿主生物として使用可能な細菌の僅かな世代時間は、変形及び選択の永久的サイクルを可能とし、これはパッセンジャー蛋白質の又はオートトランスポーターの所定の特性への進化性適合を可能とする。この場合の典型的１例は、パッセンジャー蛋白質と結合パートナーとの間の結合親和性である。安定に露出された融合蛋白質を有する細菌の単離は、この方法の有利な１実施形では、固定化された又は／及び標識された結合パートナー、例えばマトリックス−固定された結合パートナーへの、蛍光標識された結合パートナー、磁気粒子標識された結合パートナー又は発色団標識された結合パートナーへの結合により行う。もう一つの有利な実施形では、この結合パートナーを、それが第２工程で修飾のための特異的な結合パートナーにより検出することができるように修飾されている。本発明のもう一つの目的は、安定に発現された融合蛋白質又はその一部分又は安定にその表面上に発現された融合蛋白質を有する細菌の製造及び治療の目的又は診断の目的のための、有害物質増加又は除去の際、トキシンの失活化の際、原料物質流通の際、食料品製造又は−加工の際、洗剤製造の際、所望の真核又は原核細胞の標識付けの際のその使用である。本発明によれば、抗体又は抗体フラグメントが表面発現性細菌上で安定であり、典型的な例ではトランスポータードメインとしてのＡＩＤＡオートトランスポーターの使用下に、それの生産のために使用することができ、この際、この抗体又は抗体フラグメントは引き続き、場合によっては精製の後に、診断又は治療の目的に使用することができる。このような抗体又は抗体フラグメントを用いて、例えば特定の表面マーカー（典型的な例として、ここでは腫瘍抗原が挙げられる）を有する細胞を特異的に特徴付ける又は選択することも可能である。もう一つの典型的な例では、標識付けられた表面マーカーはレセプターであり、この際、標識付けは１又は複数のレセプター特性のブロッキングにより行われ、これにより、レセプターにより開始されたか又は仲介されたシグナル形質導入の及びそれに伴う細胞機能の目的とする抑制が可能である。図面の説明第１図：ＡＩＤＡ−Ｉ蛋白質のＣ−末端３００アミノ酸の疎水性グラム陰性菌の外膜中のオートトランスポーターに典型的な孔が、両親媒性の β−折畳み板構造により、すなわちβ−折畳み板構造及び交互の疎水性及び親水性のアミノ酸を有するドメインから形成される。このことは、アミノ酸の特定のアルゴリズムを用いて関係付けられたアミノ酸の相対的疎水性値をアミノ酸の位置に対してプロットすることにより可視化することができる。フォーゲル(Vogel )及びイェーニッヒ(Jaenig)のアルゴリズム（J.Mol.Biol.190(1986)191-199）を用いた。矢印は、可能な膜流路を示しており、この際、左向きの矢印は、膜流路が内部から外部に向かって進み、右向きの矢印は外部から内部への膜流路を示していることを意味する。Ｓｐはエミニ(Emini)等(J.Virol.55(1985),836-839)により計算されたアミノ酸の相対的表面確率を意味する。第２図：ＡＩＤＡ−Ｉ蛋白質からのオートトランスポーターのモデルその位置に対するアミノ酸の相対的疎水性のプロット（第１図）から出発して、非平行な両親媒性のβ−折畳み板により形成された樽構造をモデルとして図示することができる。ここに図示されている切り放された樽構造は、その膜中で、最初と最後の非平行の膜流路の相互作用により閉鎖される。菱形中に記載されているアミノ酸が、膜範囲内に存在し、この際、太線で縁取られたものは相対的に疎水性であり、樽の外側に向かって、即ち膜に向かって配向されており、細い線で縁取られたものは相対的に親水性であり、その側鎖で孔の内側を指している。円内に記載されているアミノ酸は、膜の外でループを形成している。このモデルの位置１のアラニンは、ＡＩＤＡ−Ｉの完全配列中で番号１０１４を有し、この完全配列中の末端のフェニルアラニンは、番号１２８６を有する（Benz und Schmidt，Mol Microbiol 11(1992),1539-1546)。第３ａ図：ｐＪＭ７、ＣｔｘＢの表面発現のためのベクターの製造ｐＪＭ７は、コレラトキシンＢ及びＡＩＤＡ−リンカー／β−樽−領域からの遺伝子融合（ＦＰ５９）を含有する。この遺伝子融合は、人工プロモータＰＴＫ (Klauser et al.，EMBO J.(1990)1991-1999)のコントロール下に、１ベクター中に高いコピー数で本質的に発現される。ｃｔｘＢ−遺伝子を、プラスミドｐＴＫ１からのオリゴヌクレオチドＥＦ１６及びＪＭ６(Klauser et al.，EMBO J．9(1 990)1991-1999)と共にＰＣＲにより増幅させた。β−樽及びＡＩＤＡ−Ｉからのリンカー領域からなるオートトランスポーターを、Ｅ．コリＥＰＥＣ２７８７のプラスミド−ＤＮＡ−調製物からのオリゴヌクレオチドＪＭ１及びＪＭ７(Ben z und Schmidt,Infect.Immun.57(1989),1506-1511)と一緒の増幅により増幅させた。オリゴヌクレオチドＪＭ１は、その５’−突出部にＢｇｌＩＩ−認識配列を有し、オリゴヌクレオチドＪＭ６及びＪＭ７は、それぞれ１個のＫｐｎＩ−認識配列を有する。ベクターＤＮＡ（ｐＢＡ）をＣｌａＩ及びＢａｍＨＩを用いて加水分解させ、双方のＰＣＲ−生成物を、その増幅に引き続き、ＣｌａＩ及びＫｐｎＩ（ＥＦ１６／ＪＭ６−フラグメント）又はＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ（ＪＭ７／ＪＭ１−フラグメント）を用いて後切断した。こうして生成された３個のフラグメントをリゲーシヨンで凝集させた。第３ｂ図：ｐＪＭ２２、ペプチドの表面発現のためのベクターの製造ｐＪＭ２２は、３個のドメインよりなる融合蛋白質ＦＰ５０を生産する。Ｎ− 末端に、ＣｔｘＭ−シグナル配列が存在し、これは、生じる融合蛋白質を細胞膜を経る（Ｓｅｃ−介在）エキスポートのために作用する。これに引き続き、パッセンジャードメイン、この場合にはペプチド、エピトープＰＥＹＦＫが続く。ＡＩＤＡ−β−樽／リンカー領域、オートトランスポーター（これはＮ−末端をシグナルペプチドの周りで短縮されたパッセンジャードメインをＥ．コリの表面上に搬送する）を有する融合蛋白質は、Ｃ−末端で終端している。ｐＪＭ２２の構築のために、差し当たりｐＪＭ７のＤＮＡをＸｈｏＩで加水分解し、ｐＪＭ７のベクター分をＰＣＲによりオリゴヌクレオチドＪＭ７及びＪＭ２０と共に増幅させた。この場合に、ｃｔｘＢ−遺伝子はそのシグナル配列以外で欠失された。オリゴヌクレオチドＪＭ２０は、その５’−突出部中にＫｐｎＩ−切断配列に加えて、アミノ酸ＰＥＹＦＫをコードする５個のコドンを含有した。このアミノ酸順プである。ＰＣＲ−生成物をＫｐｎＩを用いて加水分解させ、引き続きそれ自体リゲートさせた。第４図：発現証明及びプロテアーゼ敏感度Ｅ．コリ中の融合蛋白質ＦＰ５９（ｐＪＭ７から）及びＦＰ５０（ｐＪＭ２２から）の極めて安定な発現に基づき、これらは、クマシーブリリアントブルーで染色された完全細胞リゼート中で容易に同定できる。プロテアーゼ易入性は、蛋白質の局在化の測定のための慣用の手段である。細胞特有の蛋白質が細菌の外側上に提示されるか又はこの細菌の外膜がプロテアーゼに関して通過性にされる際にのみ、細胞特有の蛋白質への易入性が期待される。この通過性を排除するために、プロテアーゼ−敏感性マーカーを使用することができ、それは自然にはペリプラズム中に存在することが公知である。これが使用されたプロテアーゼにより作用されない場合にのみ、外膜の無傷性が保証される。Ｅ．コリＵＴ５６００又はＪＫ３２１の細胞を、一晩ＬＢ−寒天（アンピシリン５０ｍｇ／ｌ）上で培養させ、ＰＢＳ中に懸濁させた。この細胞懸濁液をＯＤ５７８＝４.０に調節した。細胞懸濁液０.５ｍｌからの細胞をテーブル遠心分離器中で１分間沈殿させ、プロテアーゼ０．１ｇ／ｍｌを有するＰＢＳ２００μ ｌ中に再懸濁させた。このバッチを３７℃で２０分間恒温保持し、０℃までの冷却、１分間の沈殿及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ−試料緩衝液４０μｌ中へのペレットの再懸濁及び直ちの１５分間の煮沸により停止させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後のウエスタン−ブロット（４ｂ及び４ｃ）により又はクマシーブリリアントブルーでの染色（４ａ）により評価を行った。プロテアーゼがペリプラズムへの易入性を有することを排除するために、パッセンジャー蛋白質ドメインに対して特異的である抗血清のみならず、自然には非易入性でペリプラズム中に存在し、従って、外から添加されたプロテアーゼ、例えばトリプシンによっては作用されないはずであるＯｍｐＡ（４ｃ）のＣ−末端部分に対して特異的な抗血清も使用した。第４ａ図：プロテアーゼ敏感性の証明及び発現の定量のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続くクマシーブリリアントブルーでの染色。Ｅ．コリＪＫ３２１及びＥ．コリＵＴ５６００の完全細胞リゼートを塗布した。レーン１ＪＫ３２１ｐＪＭ７Ｃ＊レーン２ＪＫ３２１ｐＪＭ７Ｔ＊＊レーン３ＪＫ３２１ｐＪＭ７ −＊＊＊レーン４分子量マーカー（９４、６７、４３、３０、２０及び１４ｋＤａ）レーン５ＪＫ３２１ｐＪＭ２２Ｃレーン６ＪＫ３２１ｐＪＭ２２Ｔレーン７ＪＫ３２１ｐＪＭ２２ − レーン８ＪＫ３２１ｐＴＫ６１Ｃレーン９ＪＫ３２１ｐＴＫ６１Ｔレーン１０ＪＫ３２１ｐＴＫ６１ − レーン１１ＵＴ５６００ｐＪＭ７Ｃレーン１２ＵＴ５６００ｐＪＭ７Ｔレーン１３ＵＴ５６００ｐＪＭ７ − レーン１４分子量マーカー（９４、６７、４３、３０、２０及び１４ｋＤａ）レーン１５ＵＴ５６００ｐＪＭ２２Ｃレーン１６ＵＴ５６００ｐＪＭ２２Ｔレーン１７ＵＴ５６００ｐＪＭ２２ − レーン１８ＵＴ５６００ｐＴＫ６１Ｃレーン１９ＵＴ５６００ｐＴＫ６１Ｔレーン２０ＵＴ５６００ｐＴＫ６１ − Ｃ＊細胞をキモトリプシンで消化したＴ＊＊細胞をトリプシンで消化した＊＊＊本来の細胞第４ｂ図：発現及びプロテアーゼ敏感性を証明するためのウエスタン−ブロットＥＰ．コリＪＫ３２１及びＥ．コリＵＴ５６００の完全細胞リゼートを塗布した。電気泳動の後にゲルからの半乾燥法の後の蛋白質をニトロセルロース膜上に移した。引き続き、フィルターをブロック溶液（Ｔｗｅｅｎ２００．５％及びＮａＣｌ０．５Ｍを含有するＰＢＳ）で１０分間ブロックし、第１の抗血清、ＡＫ５５（ウサギ−抗−コレラトキシンＢ）を１：２００でブロック溶液中に希釈して添加した。エピトープＰＥＹＦＫの証明のために、ハイブリドーマ− 上澄て添加した。フィルターを一次抗体と一緒に１時間恒温保持し、引き続き３回洗浄し、プロテインＡ−アルカリ性−ホスファターゼーコンジュゲート（１：５００ブロック溶液中）と共に３０分間恒温保持した。このフィルターをＮＢＴ／ＢＣＩＰ−染色溶液で呈色させた。レーン１ＪＫ３２１ｐＪＭ７Ｃ＊レーン２ＪＫ３２１ｐＪＭ７Ｔ＊＊レーン３ＪＫ３２１ｐＪＭ７ −＊＊＊レーン４分子量マーカー（１０６、８０、５０、３２、２７及び１８ｋＤａ）レーン５ＪＫ３２１ｐＪＭ２２Ｃレーン６ＪＫ３２１ｐＪＭ２２Ｔレーン７ＪＫ３２１ｐＪＭ２２ − レーン８ＪＫ３２１ｐＴＫ６１Ｃレーン９ＪＫ３２１ｐＴＫ６１Ｔレーン１０ＪＫ３２１ｐＴＫ６１ − レーン１１ＵＴ５６００ｐＪＭ７Ｃレーン１２ＵＴ５６００ｐＪＭ７Ｔレーン１３ＵＴ５６００ｐＪＭ７ − レーン１４分子量マーカー（１０６、８０、５０）３２、２７及び１８ｋＤａ）レーン１５ＵＴ５６００ｐＪＭ２２Ｃレーン１６ＵＴ５６００ｐＪＭ２２Ｔレーン１７ＵＴ５６００ｐＪＭ２２ − レーン１８ＵＴ５６００ｐＴＫ６１Ｃレーン１９ＵＴ５６００ｐＴＫ６１Ｔレーン２０ＵＴ５６００ｐＴＫ６１ − Ｃ＊細胞をキモトリプシンで消化したＴ＊＊細胞をトリプシンで消化した −＊＊＊本来の細胞第４ｃ図：ウエスタン−ブロット−分析による外膜の無傷性の証明Ｅ．コリＪＫ３２１及びＥ．コリＵＴ５６００の完全細胞リゼートを塗布した。電気泳動の後にゲルからの半乾燥法の後の蛋白質をニトロセルロース膜上に移した。引き続き、このフィルターをブロック溶液（Ｔｗｅｅｎ２００.５％及びＮａＣｌ０.５Ｍを含有するＰＢＳ）で１０分間ブロックし、第１の抗血清、Ｋ５６（ウサギ抗−ＯｍｐＡ）を１：１０００でブロック溶液中に希釈して添加した。このフィルターを１次抗血清と一緒に１時間恒温保持し、引き続き３回洗浄し、プロテインＡアルカリ性−ホスファターゼ−コンジュゲート（ブロック溶液中１：５００）と一緒に３０分間恒温保持した。このフィルターをＮＢＴ／ＢＣＩＰ−染色溶液で呈色させた。ＯｍｐＡは、Ｃ−末端ペリプラズム分を有するＥ．コリの外膜蛋白質である。このペリプラズム分は、トリプシン敏感である。トリプシンがぺリプラズムへの易入性を有する場合には、成熟ＯｍｐＡ（３５ｋＤａ）により約１０〜１１ｋＤａの大きい部分が消化される。即ち、消化は、ウエスタンブロットでのＯｍｐＡ−バンドの３５ｋＤａから２５ｋＤａへの転換も生じさせるであろう（Klauser et al.，EMB0 J.9（1990）1991-1999)が、組み換え蛋白質の移送のためのＡＩＤＡ−Ｉオートトランスポーターの使用の際には明らかにこの場合ではない。レーン１ＪＫ３２１ｐＴＫ１Ｔ＊レーン２ＪＫ３２１ｐＪＭ７Ｔレーン３ＪＫ３２１ｐＪＭ２２Ｔレーン４ＪＫ３２１ｐＴＫ６１Ｔレーン５分子量マーカー（１０６、８０、５０、３２、２７及び１８ｋＤａ）レーン６ＪＫ３２１ｐＴＫ１ −＊＊レーン７ＪＫ３２１ｐＪＭ７ − レーン８ＪＫ３２１ｐＪＭ２２ − レーン９ＪＫ３２１ｐＴＫ６１ − レーン１０なしレーン１１ＵＴ５６００ｐＴＫ１Ｔ＊レーン１２ＵＴ５６００ｐＪＭ７Ｔレーン１３ＵＴ５６００ｐＪＭ２２Ｔレーン１４ＵＴ５６００ｐＴＫ６１Ｔレーン１５分子量マーカー（１０６、８０、５０、３２、２７及び１８ｋＤａ）レーン１６ＵＴ５６００ｐＴＫ１ −＊＊レーン１７ＵＴ５６００ｐＪＭ７ − レーン１８ＵＴ５６００ｐＪＭ２２ − レーン１９ＵＴ５６００ｐＴＫ６１ − Ｔ＊細胞はトリプシンで消化＊＊本来の細胞第５図：免疫蛍光完全な非浸透性細胞の免疫蛍光は、露出された決定子の細胞表面上での証明の慣用の方法である。この場合に決定子の検出のために使用される抗体は、無傷の外膜を通って到達するためには大きすぎる。ペリプラズム又は細胞に発現した決定子の背景活性の差別化又は査定のために、対照として公知のペリプラズム又は細胞に発現した抗原に対する抗体を利用する。プラスミドｐＢＡ、ｐＴＫ１、ｐＴＫ６１、ｐＪＭ７又はｐＪＭ２２の一つを含有するＥ．コリＵＴ５６００をＬＢ−寒天（アンピシリン５０ｍｇ／ｌ）上で一晩培養させ、ＰＢＳ中に５７８ｎｍで０．１の光学密度になるまで懸濁させた。この細胞懸濁液５００μｌを、２４穴−マイクロ滴定プレート中に置かれたカバーグラスに重層させた。細胞をプレート遠心機中で５分間このカバーグラス上に沈殿させた。上澄みの４５０μｌを取り除き、ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）２．５％を有するＰＢＳで置換し、これにより２０分間固定させた。上澄みを完全に取り除き、ＰＢＳ５００μｌで３回洗浄した。非特異的結合位置を、ＦＣＳ１％を含有するＰＢＳ３００μｌと一緒に５分間の恒温保持によりでブロックした。このブロック溶液を完全に取り除き、カバーグラスをその凹中に中心をとり、ウサギ血清ＡＫ５５の１：１００希釈液１５μｌで覆い（コレラトキシンＢに対して展開）、湿った室内、室温で１時間恒温保持した。引き続き、ＰＢＳ各５００μｌで３回洗浄し、ＰＢＳ／ＦＣＳ３５０μｌで５分間ブロックし、羊 −抗−ウサギ−テキサスレッド−コンジュゲートの１：１００希釈液１５μｌと共に３０分間恒温保持した。引き続く３回洗浄の後に、載物プレート上にカバーグラスを載せ、包埋媒体と一緒に埋め込んだ。免疫蛍光の結果を顕微鏡で評価し、同じ長さの露光時間で写真に記録した。ａ）Ｅ．コリＵＴ５６００ｐＢＡ（挿入なしのクローニングベクターのみを含有する、利用菌株の負対照として）ｂ）Ｅ．コリＵＴ５６００ｐＴＫ１（ペリプラズム中に露出されるコレラトキシンＢを生産する。この構築はペリプラズムに発現されたコレラトキシンＢの背景活性の測定のために役立つ）。ｃ）Ｅ．コリＵＴ５６００ｐＪＭ７（Ｅ．コリの表面上に提示されるＡＩＤＡ及びコレラトキシンＢからの融合蛋白質であるＦＰ５９を発現させる）。ｄ）Ｅ．コリＵＴ５６００ｐＪＭ２２（ＡＩＤＡとエピトープＰＥＹＦＫとからの融合蛋白質であるＦＰ５０を発現させる。この構築を用いて、ＦＰ５９及びＦＰ５０のＡＩＤＡ−分がこの実験で利用されたＡＫ５５と交叉反応を有しないことが示される）。ｅ）Ｅ．コリＵＴ５６００ｐＴＫ６１（Ｅ．コリの表面上に提示されるコレラトキシンＢとＩｇａ−βとからの融合蛋白質を生産する(Klauser et al.，ENB O J.9(1990)1991-1999)。ＡＩＤＡ−構造ＦＰ５９との比較のために役立つ）。第６図：使用オリゴヌクレオチドのＤＮＡ−配列第７図〜第２４図細菌性オートトランスポーターのＤＮＡ−配列（非コード性ストランド）及びこれらから誘導されたアミノ酸配列。第７図：膜中に集積された部分のエセリキア・コリからのＡＩＤＡ−Ｉのオートトランスポーター(Benz und Schmidt,Mol．Microbiol．6(1992)，1539-1546)の表示。第８図：膜中に集積された部分のボルデテラ・ペルトウシスからのＢｒｋＡのオートトランスポーター(Fernandez und Weiss,Infect Immun．62(1994),4727-4738)の表示。第９図：膜中に集積された部分のヘモフィルス・インフルエンザからのＨａｐのオートトランスポーター(StGeme et al.，Mol.Microbiol．14(1994),217-233)の表示。第１０図：膜中に集積された部分のヘリコバクター・ムステラエからのＨｓｒのオートトランスポーター(O'Toole et al.，Mol.Microbiol．11(1994),349-361)の表示。第１１図：膜中に集積された部分のシゲラ・フレクスネリからのＩｃｓＡのオートトランスポーター(Goldberg et al.，J.Bacteriol 175(1993),2189-2196)の表示。第１２図：膜中に集積された部分のボルデテラ・ペルトウシスからのＰｒｎ（外膜蛋白質ｐ９６）のオートトランスポーター(Charles et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3554-3558)の表示。第１３図：膜中に集積された部分のボルデテラ・パラペルトウシスからのＰｒｎ（ｐ７０，ペルタクチン）のオートトランスポーター(Li et al.，J.Gen.Microbiol．138 (1992),1697-1705)の表示。第１４図：膜内に集積された部分のリケッチア・リケッチイからの１９０ｋＤａ細胞表面抗原のオートトランスポーター(Anderson et al.，非公開,Genbank-Accessionnr .31227)の表示。第１５図：膜中に集積された部分のリケッチア・プロワゼキイからのＳｐａＰのオートトランスポーター(Carl etal.，Proc．Natl．Acad.Sci.USA 87(1990),8237-8241) の表示。第１６図：膜中に集積された部分のリケッチア・リケッチイの１２０キロダルトン外膜蛋白質（ｒＯｍｐＢ）からのオートトランスポーター(Gilmore et al.，Mol.Micro biol．5(1991)，2361-2370)の表示。第１７図：膜中に集積された部分のリケッチア・チフィからのＳｌｐＴのオートトランスポーター(Hahn et al.，Gene 133(1993),129-133)の表示。第１８図：膜中に集積された部分のシゲリア・フレックスネリからのＳｅｐＡのオートトランスポーター(Benjellou -Touimi et al.，Mol．Microbiol 17(1995),123-13 5)の表示。第１９図：膜中に集積された部分のセラテイア・マルセッセンスＲＨ１からのＳｓｐのオートトランスポーター(Rho,非公開,Genbank-Accessionnr.X59719)の表示。第２０図：膜中に集積された部分のＳ．マルセッセンスＩＦＯ−３０４６、クローンｐＳＰ１１のＳｓｐのオートトランスポーター(Yanagida et al.，J.Bacteriol.16 6(1986),937-944)の表示。第２１図：膜中に集積された部分のセタリア・マルセッセンス、菌株ＩＦＯ３０４６からのＳｓｐ−ｈ１のオートトランスポーター(Onishi und Horinouchi,非公開,Genb ank-Accessionnr.D78380)の表示。第２２図：膜中に集積された部分のセタリア・マルセッセンス、菌株ＩＦＯ３０４６からのＳｓｐ−ｈ２のオートトランスポーター(Ohnishi u nd Horinouchi，unveroeffentlicht，Genbank-Accessionnr.D78380)の表示。第２３図：膜中に集積された部分のエセリキア・コリからのＴｓｈのオートトランスポーター(Provence et al.，1994，Infect.Immun．62(1994),1369-1380)の表示。第２４図：膜中に集積された部分のヘリコバクター・ピロリからのＶａｃＡのオートトランスポーター(Schmidt und Haas,Mol.Microbiol．12(1994),307-319)の表示。ＶａｃＡからヘリコバクター・ピロリにおいて少なくとも３種の他の形が公知であるが、これらは記載の範囲内では実質的に異なっていない。実施例例１エセリキア・コリの表面蛋白質中のオートトランスポーターの同定及び局在化所望の用途に適する、即ちパッセンジャー蛋白質及び使用すべき宿主菌株に適合するオートトランスポーターを見つけるために、使用される蛋白質のＣ−末端アミノ酸配列の分析を実施することが必要である。この場合、これは、既に表面因子として同定された１蛋白質であるが、不明な機能を有する蛋白質のデータバンクにファイルされたアミノ酸並列、１データバンクにファイルされたＤＮＡ−ＤＮＡ−配列から誘導された１蛋白質のアミノ酸配列又は一つの遺伝子の配列分析に引き続き誘導された１蛋白質のアミノ酸配列であってよい。この蛋白質のＮ−末端は、内膜を介しての移送を可能にするために一つのシグナルペプチド配列を含有すべきであり、Ｃ−末端には、この膜内に集積された部分が芳香族アミノ酸フェニルアラニン又はトリプトファンで開始すべきであり、交互に極性（又は帯電された）及び疎水性（又は芳香族）アミノ酸が引き続く。パッセンジャードメインは、少ないシステインを含有すべきであり、ジスルファイド橋を殆ど含有してはならない、それというのも、これらは形成された孔を通るパッセンジャーの移送をブロックすることが明らかであるからである。疎水性プロットは、外膜孔を構成する両親媒性のβ−折畳み板構造の偶数を示すべきである。両親媒性のβ−折畳み板構造は、約１２個のアミノ酸長を有し、帯電性アミノ酸の最小１個が膜側に向いて含有すべきであり、この際、膜流路を結合するループがペリプラズムに向かって僅かなアミノ酸を含有すべきである。外側（媒体）に向かって著しく多いアミノ酸が存在していてよい。このことから、疎水性プロット中で、膜流路の最初及び最後の膜流路を除いて、非平行な対で膜流路の集合が起こり、これらは非平行な相互の集合により孔の樽構造を完成する。この基準の満足から出発して、今や、オートトランスポーターのモデルを作成することができ、これを用いて移送に必要なアミノ酸の位置及び範囲を決定することができる。孔のために必要であるアミノ酸に加えて、なおβ−樽構造のペリプラズムに配置されたＮ−末端から孔を通って表面に進むいわゆるリンカー領域も、この融合蛋白質中への機能性オートトランスポーターを保証するはずであり、これにより全てのパッセンジャードメインの表面露出が完全に確保される。本発明の第一の目的は、Ｅ．コリ中に組み換え蛋白質の至適表面露出のための系を準備することであった。従って、Ｅ．コリの天然の表面蛋白質中のオートトランスポーターが所望された。その配列がデータバンクから入手可能であるアドヘシンＡＩＤＡ−Ｉ（Adhesin Involved in Diffuse Adherence，Benz und Schmidt Infect.Immun．57(1989)1506-1511）を選択した。本発明により、４９アミノ酸のＮ−末端の１シグナル配列が明らかになり、Ｃ−末端では、本発明の有利な条件はアミノ酸順序ＦＳＹＫＩ（フェニルアラニン−セリン−トリプシン−リジン−イソロイシン）により満たされた。移送されたドメインは、システインを含有せず、疎水性プロット（第１図）により、１４の非平行な両親媒性β −折畳み板構造が予測された。これにより、孔の形成のためには、少なくとも、全アミノ酸配列（Benz und Schmidt,Mol．Microbiol.6(1992)1539-1546）の位置１０１４のアラニンから位置１２８６のフェニルアラニンまでのアミノ酸が必要である（第２図）。リンカー領域として、アラニン１０１４のＮ−末端に引き続く付加的なアミノ酸を選択した。このように選択された機能性オートトランスポーター領域は、今やＰＣＲを用いて相応するＥ．コリＥＰＥＣ２７８７のＤＮＡから単離することができ、融合蛋白質の構築のために使用することができる。例２パッセンジャー蛋白質としての抗原性決定子を有する表面露出された融合蛋白質の構築ＡＩＤＡ−Ｉはオートトランスポーターであり、任意のパッセンジャー及びＥ．コリ−特有オートトランスポーター（即ちＡＩＤＡ−β）からの遺伝子融合が、同じパッセンジャーと非相同オートトランスポーター（例えばＩｇａ−β）との遺伝子融合よりもＥ．コリに対して良好に和合性であるはずであるという仮定から出発して、ＡＩＤＡ−βとパッセンジャー蛋白質の遺伝子との間の遺伝子融合を行った。パッセンジャーの移送を確保するために、ＡＩＤＡ−βのみならず β−樽のＮ−末端に存在する結合領域（リンカー）もクローニングさせた。パッセンジャーとして、ＣｔｘＢを選択し、ｐＴＫ１からの相応する遺伝子（ Klauser et al.,EMBO J.9(1990),1991-1999）を、オリゴヌクレオチドＥＦ１６及びＪＭ６と共にＰＣＲにより増幅させた。ＡＩＤＡ−Ｉは、プラスミド−コードしてＥ．コリＥＰＥＣ２７８７（Benz und Schmidt,Infect.Immun.57(1 989),1506-1511）中に存在するので、リンカー領域を有するＡＩＤＡ−Ｉオートトランスポーターを、同様にＥ．コリＥＰＥＣ２７８７のプラスミド調製物からのオリゴヌクレオチドＪＭ１及びＪＭ７と共にＰＣＲにより増幅させた。双方のＰＣＲ−生成物を、オリゴヌクレオチド中にその認識配列を含有する制限酵素を用いて消化させた。こうして生じた二つのフラグメントを、相応して予備消化された１クローニングベクター（ｐＢＡ）中で高いコピー数でクローニングさせた。こうして、５’−末端（アミノ酸１−１１３をコードする）のｃｔｘＢからなる遺伝子融合の前に人工の本質的プロモータを有する構造（PTK;Klauser et al.,EMB0 J.9(1990)1991-1999）が生じ、ＡＩＤＡ−Ｉリンカー（融合蛋白質のアミノ酸１１６−２７９をコードする）及び３’−末端にＡＩＤＡ−Ｉオートトランスポータ−（融合蛋白質のアミノ酸２８０−５６３をコードする）が続く（第３図ａ）。生じた遺伝子融合をＦＰ５９と称した。従来存在する系Ｉｇａ−βと比べて、Ｉｇａ−βにおける注目すべきリーゼの傾向なしに得られた実質的に強力な発現は、明白に、完全細胞リゼートの比較電気泳動により証明することができた（第４ａ図）。ＦＰ５９の表面露出の証明は、種々の方法で実施された。ＦＰ５９のプロテアーゼ親和性は、蛋白質−ゲル中でのトリプシン又はキモトリプシンの添加（第３ａ図）に引き続く分子量の低下により明らかである。それぞれ約３３−３５ｋＤａ分子量を有するプロテアーゼー抵抗性フラグメントが生じた（第３ａ図）。このプロテアーゼー抵抗性フラグメントは、パッセンジャー蛋白質の免疫原性分を含有しない。このことは、抗−コレラトキシンＢ血清の使用下での完全細胞−リゼートのウエスタン−ブロット−分析により、プロテアーゼ消化及び非消化のＦＰ５９−発現性Ｅ．コリの比較により示すことができた（第４ｂ図及び第４ａ図と第４ｂ図との比較）。膜保護されたトリプシン消化生成物のＮ−末端配列決定により、ＡＩＤＡ−オートトランスポーターにおける膜リンカー領域が５５アミノ酸の長さを有することが判明した。プロテアーゼ消化を用いて、ＦＰ５９−表現性Ｅ．コリの外膜の無傷性も示すことができた（第４ｃ図）。このために、完全細胞−リゼートを、トリプシンでのこの消化に引き続き、抗−ＯｍｐＡ−血清を用いる免疫ブロットにより展開させた。非消化細胞もトリプシン消化された細胞も、無傷の外膜を有する細胞に関して予期されたような無傷のＯｍｐＡを示した。免疫蛍光法を用いても、ＦＰ５９の表面露出及び強力な発現を示すことができた（第５図）。蛍光標識された抗体の結合により、無傷な外膜における細菌細胞上の抗原の表面露出が証明できた。このことは、強力な蛍光によるＦＰ５９発現性Ｅ．コリ−細胞を示した。負対照として使用された、ペリプラズム発現されたコレラトキシンＢＮ表面露出されたＦＰ５０（第３ｂ図）及び非組み換えクローニングベクターを有するＥ．コリ細胞は明白に負であった。ペリプラズム性コレラトキシンＢは、抗体のペリプラズムの非易入性を示し（第５ｂ図）、ＥＰ５０との免疫蛍光の負の結果により、使用抗血清（パッセンジャー蛋白質に対する）とＦＰ５９のＡＩＤＡ−抗原との交叉反応性は排除できた（第５ｄ図）。非組み換えクローニングベクターを用いる免疫蛍光法は、測定法に内在する背景染色（第５ａ図）のための尺度であった。更に、ＦＰ５９の表現とＢ６１、ｐＴＫ６１により生産された表面提示されたコレラトキシンＢ− Ｉｇａ−β−融合蛋白質との比較が可能であり（第５ｃ図及第５ｅ図）、この際、同様に本発明による系の明白な利点が証明できた。例３表面提示されたペプチド融合の構築ープとして機能するペプチドが、その表面上に露出され、証明された。このペプチドのクローニングのために、ペプチドライブラリーの発生及び表面露出のために極めて好適であるＰＣＲ−に依る戦略を利用した。この場合に、ｃｔｘＢのエクスポートシグナル（塩基１〜８１）、ペプチドをコードする短かい配列（塩基８２〜９６）及びＡＩＤＡ−リンカー／ＡＩＤＡ−β−領域（塩基１０３〜１４５０）からの３重遺伝子融合が形成される。ｐＪＭ７（第３ａ図）をＸｈｏＩで線状化させ、オリゴヌクレオチドＪｍ７及びＪＭ２０（第６図）を用いるＰＣＲのためのマトリックスとして利用した（第３ｂ図）。二つのオリゴヌクレオチドはそれらの５’−末端に１つのＫｐｎＩ−認識配列を有した。ＪＭ７を、ＰＣＲでのその使用時にＡＩＤＡ−リンカー／ＡＩＤＡ− β−ドメインが増幅されるように選択した。ＪＭ２０を、ＰＣＲ−生成物中にｃｔｘＢ中に含有されるサイトプラズマ膜を介するＳｅｃ−依存性膜移送のためのシグナル配列及びそれに引き続く６個のコドンを共に含有する様に選択した。更に、ＪＭ２０は、その５’−位置のマトリックスに対して非相補的な延長部の中５個のコドンを含有した。このコドンの上流に、ＫｐｎＩ−認識配列が存在した。ＰＣＲの後に、生じる生成物をＫｐｎＩで加水分解し、それ自体リゲートさせ、引き続きＥ．コリ中で形質転換させた。正しい遺伝子融合の同定は、コロニー免疫ブロットを用いて行った（図面なし）。発現及び表面露出の証明は、例２に記載の方法と同様に、プロテアーゼ消化のウエスタン−ブロット−分析及びゲル中での蛋白質染色の分析（第４ａ、ｂ、ｃ図）により実施した。全般的なペプチドライブラリイの発生は、ここに記載のクローニング戦略の僅かな変更により行わせることが可能である。ＪＭ２０に関して記載のこのオリゴヌクレオチドの種々異なる機能範囲の分配は、この線状エピトープをコードする範囲を、オリゴヌクレオチド合成時に故意に縮重が行われる範囲で交換するように変更すべきである。縮重とは、この機能範囲の全ての位置での特定の塩基の代わりに、単一の、複数の又は全ての塩基が４個までの異なる塩基からの塩基混合物により置換されることを意味する。これにより、各々のコドンは、１個のアミノ酸の代わりに２０個までの異なるアミノ酸をコードすることができ、これにより、所定の長さの一つのペプチド中のアミノ酸の考えうる全ての組合せに関して理論的に可能であるコード性配列の一つのプールが生じる。所望の特性を有するペプチドを有する細胞は、今や、例えば１マトリックスに固定化されて付いて存在し、蛍光標識されているか又は磁気球にカップリンクされている結合パートナーへの表面露出ペプチドの結合により仲介し、単離し、持続的生産及び特徴付けのために使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】 1. （ａ）１個のプロモータを用いるオペラテイブ結合で融合された（ｉ）シグナルペプチドーコード性核酸断片、（ii）提示すべきパッセンジャーペプチド又は／及びパッセンジャーポリペプチドをコードする核酸断片、（iii）場合により、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸断片、（iv）トランスメンブランリンカーをコードする核酸断片及び（ｖ）オートトランスポーターのトランスポータードメインをコードする核酸断片を含有する１核酸配列がその上に局在しているベクターを用いて形質転換された宿主細菌を準備し、かつ（ｂ）この宿主細菌を、融合された核酸配列の発現及び核酸断片(ii)によりコードされたペプチド又はポリペプチドの提示をこの宿主細菌の表面上で行わせる条件下に培養することにより、グラム陰性宿主細菌の表面上にペプチド又は／及びポリペプチドを提示させる方法において、核酸断片（ii）は、トランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して非相同であり、かつこの宿主細菌はトランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して相同であることを特徴とする、グラム陰性宿主細菌の表面上にペプチド又は／及びポリペプチドを提示させる方法。 2. 使用オートトランスポーターを、エンテロバクテリオツエの属から誘導し、エンテロバクテリオツエの属の宿主細菌中で使用する、請求項１に記載の方法。 3. Ｅ．コリからのＡＩＤＡ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体を使用する、請求項１又は２に記載の方法。 4. シゲラ・フレックスネリからのＳｅｐＡ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体を使用する、請求項１又は２に記載の方法。 5. シゲラ・フレックスネリからのＩｃｓＡ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体を使用する、請求項１又は２に記載の方法。 6. Ｅ．コリからのＴｓｈ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体を使用する、請求項２に記載の方法。 7. セルラチン・マルセッセンスからのＳｅｐ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体を使用する、請求項２に記載の方法。 8. ヘリコバクター・ムステラエからのＨｓｒ−蛋白質の、ボルデテラ・ｓｓｐからのＰｒｎ−蛋白質の、ヘモフィルス・インフルエンザエからのＨａｐ−蛋白質の、ボルデテラ・ペルトウシスからのＢｒｋＡ−蛋白質の、ヘリコバクター・ピロリからのＶａｃＡ− 蛋白質の又はリケッチア蛋白質１９０ｋＤａ細胞表面蛋白質、ＳｐａＰ、ｒＯｍｐＢ又はＳ１ｐＴの一つのトランスポータードメインを使用する、請求項１に記載の方法。 9. １種以上のペプチド、殊に４〜５０アミノ酸長を有するペプチドを提示させる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 10．１種以上の真核性ポリペプチドを提示させる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 11．パッセンジャーポリペプチドは、抗体又は抗体の抗原結合性ドメインであり、この際、抗原結合性ドメインは、少なくとも、抗原の特異的結合のために充分である抗体分子の範囲を示す、請求項１０に記載の方法。 12．パッセンジャーポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα−鎖である、請求項１０に記載の方法。 13．パッセンジャーポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子のβ−鎖である、請求項１０に記載の方法。 14．パッセンジャーポリペプチドは、ペプチドとして機能性ＭＨＣ分子の結合穴中に蓄積することのできるＮ−末端アミノ酸を付けて有するＭＨＣクラスＩＩ分子のβ−鎖である、請求項１３に記載の方法。 15．変異パッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドのライブラリイを得、宿主細胞中で発現させ、かつその表面上に提示させる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。 16．変異パッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドを、パッセンジャーポリペプチドの一定の関係で提示させる、請求項１５に記載の方法。 17．宿主細菌細胞が、それぞれ１個のトランスポータードメインと関連して、種々のパッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドを提示させる、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。 18．種々のパッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドと関連している種々のトランスポータードメインを使用する、請求項１７に記載の方法。 19．更に、変異ペプチド又はポリペプチドのライブラリイから個々のパッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドを選択する工程を含有する、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。 20．表面露出されたペプチド又はポリペプチドの変異ポピュレーシヨンを製造し、かつ、それぞれ所望の特性を有するペプチド又はポリペプチドを有する細菌を同定する方法において、この方法は次の工程：（１）フレーム内での１つのオートトランスポーター及び１つのシグナルペプチドのトランスポータードメインのコード性配列を有する所望のパッセンジャーのコード性配列のクローニングにより、少なくとも１ベクター中に１又は複数の融合遺伝子を製造し、（２）このパッセンジャーペプチド又は−ポリペプチドを突然変異により変異させ、（３）１又は複数のベクターを、１又は複数のパッセンジャーを安定にその表面に提示させることのできる宿主細菌中に取り込み、（４）１又は複数の融合遺伝子を宿主細菌中に発現させ、（５）この細菌を培養して１又は複数の安定な表面露出提示されたパッセンジャーを生産させ、（６）場合により、所望の特性を有する１又は複数のパッセンジャーをその表面上に有する細菌を選択し、かつ（７）場合により、至適特性を有するパッセンジャーの結合パートナーを特徴付けるを包含することを特徴とする、表面露出されたペプチド又はポリペプチドの変異ポピュレーシヨンを製造し、かつ、それぞれ所望の特性を有するペプチド又はポリペプチドを有する細菌を同定する方法。 21．この方法の個々の工程は省略することができる、請求項２０に記載の方法。 22．この方法を数回実施することができる、請求項２０に記載の方法。 23．オートトランスポーターＡＩＤＡ−Ｉ又はその変異体を使用する、請求項２０に記載の方法。 24．融合蛋白質中に含有されるパッセンジャー蛋白質は、結合パートナーに対する親和性を有するペプチド又はポリペプチド、リガンド、レセプター、抗原、トキシン結合性蛋白質、酵素活性を有する蛋白質、核酸結合性蛋白質、インヒビター、キレーター特性を有する蛋白質、抗体又は抗体の抗原結合性ドメインである、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法。 25．固定化された叉は／及び標識された結合パートナーへの結合により、所望の結合親和性を有するパッセンジャーを表面露出提示する細菌の同定を行う、請求項２０から２４のいずれか１項に記載の方法。 26．結合パートナーは、第２の工程で修飾のために特異的な結合パートナーの一つにより検出することができるように修飾されている、請求項２０に記載の方法。 27．パッセンジャー蛋白質又はその一部分を細菌表面上で、化学的又は酵素的に修飾させる、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。 28．修飾は、非共有的修飾である、請求項２７に記載の方法。 29．修飾は共有的修飾である、請求項２７に記載の方法。 30．修飾はグリコシル化である、請求項２９に記載の方法。 31．修飾は、ホスホリル化である、請求項２９に記載の方法。 32．修飾は蛋白質分解である、請求項２７に記載の方法。 33．パッセンジャー蛋白質又はその一部分を、内部の又は外部から導入されたプロテアーゼにより、選択的にその細菌表面から遊離させる、請求項２７に記載の方法。 34．パッセンジャー蛋白質又はその一部分を、宿主細胞の内部プロテアーゼ、殊にＯｍｐＴ−プロテアーゼ、ＯｍｐＫ−プロテアーゼ又はプロテアーゼＸにより遊離させる、請求項３３に記載の方法。 35．パッセンジャー蛋白質又はその一部分を、外部から導入されたプロテアーゼ、殊にＩｇＡ−プロテアーゼ、トロンビン又は因子Ｘにより遊離させる、請求項２３に記載の方法。 36．ベクターの上に、１個のプロモーターを用いるオペラテイブ結合で融合された（ｉ）シグナルペプチド−コード性核酸断片、（ii）提示すべきパッセンジャーペプチド又は／及びパッセンジャーポリペプチドをコードする核酸断片、（iii）場合により、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸断片、（iv）トランスメンブランリンカーをコードする核酸断片及び（ｖ）オートトランスポーターのトランスポータードメインをコードする核酸断片を含有する核酸配列が局在していて、この際、核酸断片（ｉｉ）がトランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して非相同である、組み換えベクター。 37．請求項３６に記載のべクターを用いて形質転換されている、組み換えグラム陰性宿主細菌。 38．トランスポータードメイン（ｖ）をコードする核酸断片に対して相同である、請求項３７に記載の宿主細菌。 39．Ｅ．コリ細胞である、請求項３８に記載の宿主細菌。 40．核酸断片（ｖ）は、ＡＩＤＡ−蛋白質のトランスポータードメイン又はその変異体をコードする、請求項３７から３９のいずれか１項に記載の宿主細菌。