JPH0634742B2 - 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法 - Google Patents

蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法

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JPH0634742B2
JPH0634742B2 JP59500885A JP50088584A JPH0634742B2 JP H0634742 B2 JPH0634742 B2 JP H0634742B2 JP 59500885 A JP59500885 A JP 59500885A JP 50088584 A JP50088584 A JP 50088584A JP H0634742 B2 JPH0634742 B2 JP H0634742B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えＤＮＡ技術を用いて高純度の蛋白質とポ
リペプチド生成物を製造する方法に関し、さらに詳しく
は組換えＤＮＡ技術を応用して目的とする蛋白質やポリ
ペプチドを含んだ新規なジーン（遺伝子）生成物を得る
こと、そしてこの新規な遺伝子生成物は精製が容易で、
所望の蛋白質やポリペプチドに変換することを内容とす
るものである。本発明はこのような遺伝子生成物をも目
的とするものである。
最近の組換えＤＮＡ技術、あるいは、いわゆる遺伝子工
学の技術によると、各種の生物起源から得られたＤＮＡ
断片から新らしい構造をもつた新規な組換えＤＮＡを組
み立て、これを原始核または成熟（真）核の宿主細胞に
導入してそれぞれ対応する蛋白質、ポリペプチドを生産
できるようになつているが、これらの技術のお蔭でこれ
までは天然からかなり高いコストでしか得られなかつた
数多くの蛋白質が生産できるようになつた。これらの例
としてよく知られているのはインシユリンや生長ホルモ
ンのソマトスタチンである。このようにして宿主（ホス
ト）細胞から産生される蛋白質はその細胞内にとどまつ
たままであるか、あるいは周囲の生育媒体中へと分泌さ
れてくる。前者の場合には目的とする蛋白質の抽出のた
めに細胞を破壊しなくてはならないが、後者の場合は生
育媒体から分離することが可能である。しかし、後者の
ように蛋白質が分泌されてくる場合でも、その分離源に
は色色な物質が含まれておりかなり複雑な構成となつて
いるため、効率のよい分離技術を用いても、目的とする
蛋白質の純度も収率も低くならざるをえない。
本発明は、上述のような問題の解決を目的として、組換
えＤＮＡ技術を基礎とする方法を用い、所望の蛋白質、
ポリペプチドを極めて高純度に製造するものである。本
発明ではスタフイロコツカスから得たプロテインＡが独
特な結合能をもつことを利用し、これに後述の遺伝子融
合技術をうまく結びつけて、目的を達成している。
このプロテインＡは、バクテリアの黄色ブドウ状球菌
（Staphylococcus aureus；以後S.aureusと略記する）
の細胞壁の成分として知られ、哺乳類の免疫グロブリン
と特異的な血清反応を示すという特徴を有する。しか
し、この蛋白質は普通の抗原−抗体反応とは対照的に、
ヒト免疫グロブリンのＧ型またはIgG型（ただしIgG3は
除く）のすべてのサブクラスのFc−部と結合しながらFa
b−部は遊離させて抗原やハプテンとカツプリング（結
合）させるという性質をもつている。
このような性質をもつているためにプロテインＡは定量
的−、定性的な免疫化学技術に広く用いられている。担
体と共有結合したプロテインＡは、従つてIgG分離のた
めのすぐれた免疫吸収体である。プロテインＡの正確な
構造はその由来によつて変動する。その分子量は約4200
0で、よく伸長した形状を呈している。分子のＮ末端に
は極めて相同性（均質性）の高いIgG−結合単位が４ケ
ないし５ケ存在するが、Ｇ末端にはFc結合能が欠けてい
る。以下の説明ならびに請求の範囲において用いられる
“プロテインＡ”なる用語は上記のスタフイロコツカス
蛋白質に限定されるものではなく、スタフイロコツカ
ス、例えば天然のS.aureusおよびそのミユータントによ
つて産生させるプロテインＡに類似した免疫学的、生物
学的活性をもつ巨大分子はすべて包含するものである。
同様にして、“プロテインＡの活性フラグメント”また
は“プロテインＡの活性誘導体”なる用語は、プロテイ
ンＡの他、免疫反応性の巨大分子オリゴマーまたはその
活性フラグメント、または少くとも１ケの免疫グロブリ
ンの特定領域と結合できる巨大分子のそれぞれのポリペ
プチドフラグメントまたは誘導体を包含するものであ
る。
その開示内容を本願の参照例として挙げた本出願人の国
際出願PCT/SE 83/00297（スウエーデン特許出願No.8204
810-9）には、スタフイロコツカスプロテインＡをコー
ドする遺伝子の抽出とその特性、ならびに大腸菌（Esch
erichia coli；以下E.coliと略記する）でのその発現に
ついての説明がある。このスタフイロコツカスプロテイ
ンＡの遺伝子を有するプラスミドで形質転換（トランス
ホーム）されたE.coli株はドイツ微生物収集所（Deutsc
he Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ），Gotting
en，西ドイツ）に1982年７月12日付、寄託番号ＤＳＭ24
34で寄託された。例えばこのプロテインＡ遺伝子含有プ
ラスミドを用いることにより本発明の目的に使用する遺
伝（子）材料を取得する。
以下の説明と請求の範囲で用いられる遺伝子工学に関す
る特殊用語は、当業者にはよく知られそのまま受け入れ
られるものである。しかし、その選定用語の定義につい
ては、例えば上記の国際特許出願PCT/SE 83/00297を参
照することができる。
遺伝子融合の手法は２ケまたはそれ以上の遺伝子のコー
ド・シーケンス（配列）を互いに接合させて、適当な宿
主（微生物）体中で発現させるときに融合生成物（それ
ぞれの遺伝子によつてコードされるそれぞれ別個の蛋白
質やポリペプチドが単一の分子に融合された形のもの）
を産生するような１ケの結合遺伝子を形成させる方法で
ある。このような遺伝子融合技術は重要度をまし、色々
な生物学的課題例えば蛋白質トランスポート機構、プラ
スミド・レプリケーシヨン、遺伝子発現の研究に用いら
れている。
この種の用法は、酵素β−ガラクトシダーゼをコードす
るE.coli lacＺ遺伝子について特によく研究されてきて
いる。
本発明では、プロテインＡまたはその活性ポリペプチド
フラグメントをコードする第１ＤＮＡ配列と、目的とす
る蛋白質またはポリペプチドをコードする第２ＤＮＡ配
列とを結合させて、該蛋白質またはポリペプチドおよび
プロテインＡ成分とからなる融合生成物を発現すること
のできる機能的遺伝子を形成させるために、遺伝子融合
の手法が用いられる。プロテインＡの部分がIgGとの結
合力をもつているために、得られる蛋白質またはポリペ
プチドは、適当なキヤリアーで固定化されたIgG型の免
疫グロブリンを用いたアフイニテイー（親和）クロマト
グラフイー法によつて容易にかつ効率よく抽出単離する
ことができる。このキヤリアーに結合した融合生成物は
例えば目的とする蛋白質が酵素のときはそのままで使用
することができるし、またプロテインＡの部分を包含し
た総合体としてキヤリアーから分離させることも、ある
いは後述するような適当な反応剤を用いて所望の蛋白質
あるいはそのポリペプチド部のみを解裂（分断）して分
離させることも可能である。
すなわち本発明の重要な目的の一つは、目的とする蛋白
質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ鎖（ＤＮＡ−
配列）がプロテインＡまたはその活性ポリペプチドフラ
グメントをコードするＤＮＡ鎖（ＤＮＡ−配列）に有機
的に連結し、その結果、これらのＤＮＡ鎖が一緒になつ
て該蛋白質またはポリペプチドと該プロテインＡまたは
その活性ポリペプチドフラグメントからなりIgG結合性
の融合生成物をコードするような組換えＤＮＡ−クロー
ニング−ビークルまたはベクターを提供することにあ
る。宿主（ホスト）となる微生物を形質転換（トランス
ホーム）（ベクターがバクテリオフアージである場合も
含める）させて該融合生成物を産生できるようにするた
めに、このベクターには常法に従つて結合融合生成物を
コードするＤＮＡ配列に対するレプリコンやプロモータ
ーを包含させる。後述する目的のために、該結合ＤＮＡ
配列は、目的とする蛋白質とプロテインＡをそれぞれコ
ードするＤＮＡ配列の間にある適当な分断部位をコード
する配列を含めることにより、融合分子からプロテイン
Ａ部分を上記のように切り去ることのできるようにする
ことができる。本発明に係る組換えベクターとその構築
については後で詳細に説明する。
適合性の宿主微生物を該ベクターで形質転換して上記の
ような結合ＤＮＡ配列が発現できるようにし、この宿主
微生物を栄養培地で培養すると、対応するIgG−結合性
の融合蛋白質またはポリペプチドが得られる。本発明の
目的からすると、バクテリア宿主としてエシエリキア
（Escherichia）、バチルス（Bacillus）、スタフイロ
コツカス（Staphylococcus）が最も適しているが、他の
宿主、例えば酵母、かび、植物細胞培養物などもその範
囲のものとして使用する。これらの宿主はよく知られた
方法で形質転換させることができる。
宿主微生物の培養で生産される融合分子のプロテインＡ
部がIgG−結合力をもつているために、該融合分子は適
当なキヤリアーで固定されたIgGによつて細胞培養物か
ら極めて効率よく抽出される。融合生成物が周囲の媒体
に分泌されてくるときは、キヤリアーへの結合は培地か
ら直接行なうことができる。これに対して融合生成物が
細胞内部にとどまる場合には先ず細胞を破壊してから免
疫吸着を行なうようにすればよい。細胞壁の破壊は通常
の方法、例えば高圧処理、超音波処理、ホモジネーシヨ
ン（均質化）、ガラス・ビードを用いた攪拌処理などで
行なう。グラム陰性のバクテリアで見られるように生成
物が２つの細胞膜の間にあるペリプラスト（外質）域に
とり込まれる場合には、滲透圧シヨツクを用いて該生成
物を懸濁媒体中に遊離させることができる。IgGを用い
て融合生成物を抽出するに先立つて培養細胞や生育培地
を適宜処理することがあつても、それはもちろん本発明
の範囲のこととして実施するものである。
固定化工程は、通常の方法として、IgG−カツプリング
キヤリアーを適当な媒体中にスラリー化してバツチ法で
行なうか、あるいは活性化したキヤリアーのカラムを用
いて行なうことができる。クロマトグラフイー用のIgG
−カツプリングキヤリアー、例えばIgG−セフアロース
（フアーマシア（Pharmacia）ＡＢ、スウエーデン）
が市販されているので、本発明の目的にはこれらが有利
に使用できる。しかし、IgGが充分にカツプリングでき
るキヤリアー材質ならば、いずれも本目的に使用可能で
ある。この種の材質へのIgGのカツプリングと固定化は
よく知られた方法であるから、詳細な説明は不要と考え
る。
IgG−キヤリアーに結合した融合蛋白質またはポリペプ
チドを遊離または脱着（放出）させるには、従来法によ
り、例えばグリシン緩衝液（pH3.0）を用いてpHを低下
させる方法、高濃度の塩類（溶液）またはカオトロピツ
ク・イオンによる処理、あるいは可溶性のプロテインＡ
またはIgGまたはそれらのフラグメントを過剰に使用し
た競合溶離法でIgG−キヤリアー吸着体から融合蛋白質
またはポリペプチドを置換脱離させる方法などにより行
なう。これらの脱着方法の選定は、目的とする蛋白質ま
たはポリペプチドの特性にもとづいて行ない、その必要
とされる活性が失われたり、著しく減少することのない
ようにする。得られる溶離液から融合蛋白質またはポリ
ペプチドは容易に抽出されるが、所望により、さらに精
製工程例えばゲル濾過、イオン交換などに付することが
できる。
ここに得られる融合蛋白質またはポリペプチドの精製物
は、後記のごとく価値ある生成物である。従つて、本発
明の別の目的は、適合性の宿主を上記ベクターにより形
質転換し、栄養培地で培養してから、融合蛋白質または
ポリペプチドをIgG−支持キヤリアーに選択的に結合さ
せることにより宿主培養物から抽出し、所望により該キ
ヤリヤーから該融合蛋白質またはポリペプチドを遊離さ
せることを内容とする、高純度の融合蛋白質またはポリ
ペプチド生成物の製造方法、ならびにそのような融合生
成物の提供にある。
この種の融合生成物の用途として価値のあるのは、プロ
テインＡ部に融合した蛋白質が酵素の場合である。この
場合、融合生成物のIgG−結合活性を利用してIgGの結合
を介してキヤリアー材質に該酵素を固定化させる。この
ような酵素系には色々と利点がある。プロテインＡ−Ig
Gカツプリングを介して酵素がキヤリアーに結合するの
で、すべての酵素分子がまつたく同じようにしてキヤリ
アーに結合し、最も高い活性が得られる。酵素活性が許
容範囲以下のレベルまで低下したならば、例えばグリシ
ン緩衝液による処理でpHを変化させてキヤリアーから常
法により酵素を脱離させてから、活性酵素を有する融合
生成物をそれに結合させることにより酵素系の再生を容
易に行なうことができる。IgG−カツプリング・キヤリ
アーへの融合酵素の結合または吸着は適当に処理を受け
た細胞または細胞培地から直接に行なうか、または別の
IgG−カツプリング吸着剤に吸着、脱着して精製された
状態にしてから行つてもよい。
以上のような酵素の固定化はその酵素をコードするＤＮ
Ａフラグメントが入手できるなら、すでに工業的に用い
られている酵素系のみでなく、未だ市販されていない酵
素系にも適用できる。このような酵素系の例としてはア
ミノ酸アシラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ペニシリ
ン−アミダーゼ、アスパルターゼ、フマラーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリホスフアターゼなどが挙げら
れる。
融合蛋白質またはポリペプチドのIgG−結合能が好まし
いものである場合には、ＥＬＩＳＡ（酵素リンク・イミ
ユノソルベント・アツセイ）としてよくしられている免
疫−化学分析変法に用いられるプロテインＡ共役体（コ
ンジユゲート）となる。このような共役体としてよく使
用され、市販されているものの例としてはβ−ガラクト
シダーゼとアルカリホスフアターゼが挙げられる。この
種の共役体を、例えばプロテインＡをそれぞれの酵素に
化学的に結合させるという従来法に従つて調製すると、
これら二つの成分の一部のみしか相互に正しく結合しな
いので、得られる共役体混合物にはかなりの高い比率で
不活性共役体もしくは低活性の共役体が含まれることに
なる。これに対して本発明で融合遺伝子生成物の形で得
られる共役体では、プロテインＡと酵素との間に正しい
カツプリング関係があるので、常に最高の活性が保持さ
れる。
融合蛋白質またはポリペプチドが利用できる別の場合と
しては、プロテインＡがプロテインＡ部に融合した目的
の蛋白質またはポリペプチドを不活性にしたり、あるい
はその使用において阻害的に作用しないことなどが考え
られる。この場合には、それぞれの純粋な蛋白質または
ポリペプチドに代つてこの融合生成物が使用でき、また
以下に本発明のもう一つの目的として説明する通り、プ
ロテインＡの切断は必要ないのである。
融合蛋白質のある蛋白部分またはポリペプチドは条件に
よつて切断されて、目的とする純粋な蛋白質またはポリ
ペプチドが得られる。従つて、適合性の宿主を上述のベ
クターで形質転換し、該宿主を栄養培地で培養し、この
細胞培養物から該融合蛋白質またはポリペプチドをIgG
−支持キヤリアーに選択的に結合させることにより抽出
し、該キヤリアー結合融合生成物から直接に、またはキ
ヤリアーから脱着させた後に、該融合蛋白質のプロテイ
ンＡ部から目的とする蛋白質またはポリペプチドを切断
することにより高純度の目的蛋白質またはポリペプチド
を製造する方法が本発明の一つの目的である。
融合蛋白質またはポリペプチドがこのように切断される
ために必要な条件は、それらが適当な手段によつて認識
され切断され得る特有の分断部位を保有しているという
ことである。このような分断部位は化学的方法または酵
素的方法で認識される特異的アミノ酸配列であつて、生
産される融合生成物の所望の蛋白質またはポリペプチド
とプロテインＡセクシヨンの間に存在すればよい。この
特異的アミノ酸配列は、融合生成物の目的とする蛋白質
またはポリペプチドの内部に存在してはならないし、ま
たプロテインＡ部内にもない方がよい。酵素剤の例とし
てはプロテアーゼ、例えばコラゲナーゼ〔アミノ酸鎖NH
2-Pro-X-Gly-Pro-COOH（Ｘは任意のアミノ酸残基、例え
ばロイシン残基を表わす）を認識できる〕、キモシン
（レンニン）〔Met-Phe結合を切断する〕、カリクレイ
ンＢ〔X-Phe-Arg-YにおけるArgのカルボキシル側で切断
する〕、エンテロキナーゼ〔X-(Asp)n-Lys-Y（ｎ＝２〜
４）鎖を認識し、リジンのカルボキシル側で切断す
る〕、トロンビン〔特定のアルギニル結合を切断する〕
が挙げられる。化学薬剤の例としては、臭化シアン（Ｃ
ＮＢｒ）〔Metの後方を切断する〕、ヒドロキシルアミ
ン〔Asn−Ｚ結合（Ｚはグリシン、ロイシンまたはアラ
ニンである）を切断する〕、蟻酸〔高濃度（〜７０％）
下でAsp-Pro鎖を切断する〕が挙げられる。例えばホル
モンのソマトスタチンのように目的とする蛋白質または
ポリペプチドがメチオニン鎖をまつたく含有しないとき
には、臭化シアンで選択的に切断できるメチオニン基が
分断部位となる。プロテアーゼの認識するセクシヨンは
融合蛋白質で立体的障害を受けるので、化学的分割薬剤
を用いる方が好ましい場合がある。このような分断に感
受性をもつたペプチド・ユニツトまたは残基をコードす
るＤＮＡ配列を融合蛋白質またはポリペプチドをコード
するＤＮＡ鎖中に導入する技術はよく知られているの
で、詳細な説明は省略する。目的とする蛋白質ではみら
れない特異的な切断配列がプロテインＡ分子で生ずると
きには、このアミノ酸鎖は、プロテインＡ部の活性を変
えることなく、既知の方法による特定の切断手段では認
識も切断もされない配列に変換される。
既に述べた通り、切断はIgG−カツプリングキヤリアー
に結合した融合生成物そのもの、またはそれから脱離し
たものについて行なうことができる。バツチ法は次のよ
うにして行なわれる。融合蛋白質またはポリペプチドを
結合したキヤリアー、例えばIgG−セフアロース〔フ
アーマシア（Pharmacia）ＡＢ、スウエーデン〕を適当
な媒質で洗つてから分割剤、例えばプロテアーゼまたは
臭化シアンと一緒にインキユベイトする。
プロテインＡ残基を結合保持したキヤリアーから分離す
ると、目的とする蛋白質またはポリペプチドおよび分解
剤を含んだ溶液が得られるので、その溶液から目的とす
る蛋白質またはポリペプチドを抽出し、さらに所望によ
つて常法、例えばゲル濾過、イオン交換などを利用して
精製する。
キヤリアーがカラム形式をとり、融合蛋白質またはポリ
ペプチドがプロテアーゼ認識部位を有する場合には、次
のようにして切断を行なう。融合蛋白質またはポリペプ
チドを結合保持したキヤリアーのカラムを適当な媒質で
洗滌してから、目的とする蛋白質またはポリペプチドに
対しておだやかな試剤で溶離する。この種の試剤として
は、蛋白質やポリペプチドの種類によつて決められるも
のであるが、グリシン緩衝液のようなpH低下剤やプロテ
インＡ溶液（競合溶離）が挙げられる。純粋な融合蛋白
質またはポリペプチドと分割剤とを含有した溶離液は、
固定化プロテアーゼ、例えば切断部位がコラゲナーゼ感
受性配列のときはコラゲナーゼを含有した第２カラムに
通す。カラム通過中に、融合蛋白質またはポリペプチド
は切断されて目的とする蛋白質またはポリペプチドとプ
ロテインＡ残基に分れる。得られる溶液は上記と同じか
あるいは違つたIgGカツプリングカラムに通じて溶液中
のプロテインＡ成分を吸着させると、通過液は目的とす
る蛋白質またはポリペプチドの純粋な溶液となる。脱着
剤がプロテインＡ溶液の場合には、最終段階で吸着した
プロテインＡは切断溶液中に溶出し、リサイクルされる
ので、このときの系はプロテインＡに対して再生系とな
る。
このような本発明の手段を用いることにより、ごくわず
かな工程で目的とする蛋白質またはポリペプチドが極め
て高い純度かつ高収率で容易に得られる。このように高
い純度で得られる。このように高い純度で得られる蛋白
質やポリペプチドは、兎のような動物の免疫法により抗
体を製造するのに非常に適したものである。いわゆるハ
イプリドーマ技術と結びつけてモノクローナル抗体を製
造するのも一つの応用として考えられる。
本発明によつて高純度に製造される蛋白質、ポリペプチ
ドには、例えば、酵素として各種のオキシドレダクター
ゼ、トランスフエラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イ
ソメラーゼ、リガーゼ；ホルモンとしてパラサイロイド
ホルモン、生長ホルモン、ゴナドトロピン（ＦＳＨ，黄
体形成ホルモン、コリオノゴナドトロピン、グリコプロ
テイン）、インシユリン、ＡＣＴＨ、ソマトスタチン、
プロラクチン、プラセンタルラクトジエン、メラノサイ
ト刺戟ホルモン、チロトロピン（向甲状腺性ホルモ
ン）、上皮小体ホルモン、カルシトニン、エンケフアリ
ン、アンギオテンシン、その他の蛋白質として血清蛋白
質、フイブリノーゲン、フイブロネクチン、プロトロン
ビン、トロンボプラスチン、グロブリン例えばγ−グロ
ブリン、抗体、ヘパリン、凝固因子、コンプレメント・
フアクター、プラズマ（血漿）蛋白質、オキシトシン、
アルブミン、アクチン、ミオシン、ヘモグロビン、フエ
リチン（鉄蛋白質）、チトクローム、ミオグロビン、ラ
クトグロビン、ヒストン、アビジン、チログロブリン、
インターフエロン、トランスコルチカル（皮質連結性）
キニンなどが挙げられ、さらにワクチン製造に用いられ
るペプチド抗原がある。
以上の説明から判る通り、本発明の主要部は目的とする
融合蛋白質またはポリペプチドをコードする結合遺伝子
を含み、宿主細胞を形質転換してそれを発現させ目的と
する融合生成物を生産させることのできる組換えＤＮＡ
（構造）またはベクターを提供することにある。
本発明はベクターがいかなる方法で得られたものであろ
うとも、すなわち使用する制限酵素による切断、連結
（リゲート）、形質転換、よく知られたスクリーニング
法、さらには適当なベクター材料、宿主微生物につい
て、色々つくり方を変えて得られるすべてのベクターを
包含するものである。目的とする蛋白質またはポリペプ
チドをコードするＤＮＡ鎖を適当なベクターに挿入して
から、次いでプロテインＡをコードするＤＮＡ鎖を挿入
してもよいし、それを逆にしてもよい。さらにこれらの
二つのＤＮＡ鎖を同時にベクターに導入してもよい。そ
れぞれのＤＮＡ鎖を１部分づつベクターに挿入すること
も可能である。この二つのＤＮＡ鎖は、結合遺伝子の
５′−末端か先端（スタート）にプロテインＡをコード
する鎖または目的とする蛋白質またはポリペプチドをコ
ードする鎖を配列するようにして調製する。正しいリー
デイング・フレームを維持（そのための適当な制限部位
を保持しつつ）しながら上記のような挿入、連結操作を
行なう技術それ自体はよく知られた技術である。
プロテインＡもしくはその活性ポリペプチドをコードす
るためのＤＮＡ鎖のオリジンの構造はどのようなもので
も、それから対応する遺伝子あるいはＤＮＡセグメント
が（例えばプロテインＡ遺伝子含有プラスミドのよう
に）得られるものならばよい。適当なオリジンとして
は、例えば本出願人の国際特許出願PCT/SE 83/00297
（スウエーデン特許願No.8204810-9）に記載されている
プロテインＡ遺伝子含有プラスミドpSPA1,pSPA3,pSPA5
のいずれかを使用すればよい。遺伝子に近接した適当な
制限部位をそれに対応した適当な制限酵素で切断するこ
とにより、これらのベクターからプロテインＡ遺伝子の
全体もしくはその適当部分を切りとることができる。融
合生成物をコードする結合遺伝子に包含させなければな
らないプロテインＡ遺伝子の範囲については、融合生成
物にIgG−結合能を付与できる範囲でなければならな
い。すなわちプロテインＡ分子の中のIgG−結合部分を
コードする遺伝子セグメントの少くとも主要部が必要で
あることを示している。しかし、以下に述べる実験の部
からみても明らかなごとく、場合によつてはこの分子の
非IgG−結合部分をコードする遺伝子セグメントの少く
とも一部分を包含させる方が好ましいことがある。分子
のこの部分は融合生成物のIgG−活性部分と目的とする
蛋白質部分の間のスペーサーとしての役目をするもので
ある。
目的とする蛋白質あるいはポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ鎖のオリジンは原始核細胞、成熟核細胞のいずれで
もよく、やはり対応する遺伝子または遺伝子セグメント
が得られる構造のものならどのようなものでもよい。そ
のような遺伝子や遺伝子セグメントを含むプラスミドが
オリジンとして適している。このようなプラスミドにつ
いて、目的とする活性をもつた蛋白質またはポリペプチ
ドの対応部分を充分にコードできる遺伝子部分を切りと
るには、その遺伝子に近接した位置にうまく存在する制
限部位に対応した制限酵素を用いて切断するようにす
る。
本発明の組換えベクターのベクター部分のオリジンとし
てはプラスミドが用いられるがビールスやフアージなど
でもよい。このベクターの選定は形質転換される宿主微
生物によつて適宜行なわれる。既に述べた通り、後者の
宿主微生物としてはバクテリア、かび、植物、藻類が挙
げられる。しかし最も好ましいのはバクテリアで、形質
転換に感受性の高いのはE.coli、サルモネラ(Salmone-l
la)のようなEnterobacteriaceae（腸内細菌）、Bacillu
s subtilisのようなBacillaceae（バチルス科細菌）、
ニユーモコツカス(Pneumococcus)ストレプトコツカス(S
treptococcus)、スタフイロコツカス(Staphylococcu
s)、ミクロコツカス(Micrococcus)、ヘモフイラス(Hemo
philus)などである。
本発明の組換えＤＮＡベクターの構築にあたつては、先
ず、プロテインＡまたはその活性ポリペプチドフラグメ
ントをコードする機能的ＤＮＡ配列と、このプロテイン
Ａをコードする遺伝子の末端もしくはその近傍に少くと
も一ケの特異的制限部位を有する表現体(expression)も
しくは融合ベクターをつくるようにする。このような融
合ベクターの構築には、前述の通りプロテインＡをコー
ドする遺伝子の全部もしくは必要充分なる部分を含む適
当なベクター、例えばプラスミドベクターの調製が必要
である。次に特異的制限部位（サイト）、好ましくはい
くつかの制限部位（サイト）をもつたマルチリンカーを
プロテインＡ遺伝子のIgG−結合領域の後方でストツプ
コドンの前方の位置に挿入する。この挿入操作は後に述
べる実験の部から明らかな通り、複数のステツプ、プラ
スミドによつて行なわれる。このようにして得られた融
合ベクターは次に、目的とする蛋白質もしくはポリペプ
チドをコードするＤＮＡ鎖への挿入に使用される。この
融合ベクターも本発明の対象の一つである。
目的とする蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ鎖を融合ベクターに挿入するには、プラスミドの一部
分として供給するのがよい。融合ベクターを一つの特異
的制限部位で切つたとき得られる切断部に相補末端を付
与できるような適当な制限部位が遺伝子に存在しないと
きは、常法によつてそのような部位を挿入する。これら
は、中間にストツプ・コドンがないときはできるだけ上
流の離れたところに、すなわち遺伝子の５′−末端に近
いところまたはスタート・コドンの前に挿入するように
する。融合ベクターと、所望の遺伝子を含むプラスミド
を適当な制限部位で解裂切断し、混合物をリゲートすれ
ば結合遺伝子を含んだ組換えベクターが得られる。目的
とする蛋白質をコードする遺伝子を切りとり、それをプ
ラスミドに挿入するのが好ましいが、プラスミドを遺伝
子のスタート部分だけで切断し、二つのプラスミドを結
合してもよい。これらの方法はあくまで一つの例にすぎ
ず、これには多くの変法が可能である。
融合蛋白質またはポリペプチド（それらからプロテイン
Ａ部分を切りとることができる）をコードする組換えベ
クターをつくるために、プロテアーゼまたはペプチド切
断化学薬剤によつて認識されるオリゴペプチドをコード
する合成鎖を二つの融合遺伝子または遺伝子セグメント
の間に挿入してもよい。この挿入も常法によつて行なう
ことができる。その場合、融合蛋白質またはポリペプチ
ドは（しかし少くとも目的とする蛋白質はのぞく）プロ
テアーゼや化学薬剤で切断されるような別のペプチド鎖
を含まないことが条件であることはもちろんである。
バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)やスタフイ
ロコツカス種のようなグラム陽性バクテリアを組換えベ
クターで形質転換する場合には、プロテインＡ遺伝子の
対照(control)領域（プロモーターとリボゾーム結合
鎖）を利用するとよい。E.coliのようなグラム陰性バク
テリアについては、例えばE.coliフアージラムダのよう
なオリジンから得た対照領域を挿入するのがよい。
プロテインＡ遺伝子の対照領域がグラム陽性バクテリア
中でよく作用することの他に、単一膜を有するこれらの
宿主は、別の観点、すなわちプロテインＡ遺伝子のシグ
ナル配列によつてコードされるシグナル・ペプチドが融
合蛋白質やポリペプチドを周囲媒体中に分泌させるよう
にするということからみても有効である。E.coliのよう
なグラム陰性バクテリアでは、融合生成物が二つの細胞
膜の間にとり込まれる。生成物が分泌してくることは、
生成物の回収のために細胞を破壊する必要がなく、生成
物が分離しやすく、媒体から融合蛋白質またはポリペプ
チドが直接吸着できることになり有利である。
遺伝子ＤＮＡ技術でE.coli中で産生された外来蛋白質は
酵素的に蛋白分解作用を受けやすいことが知られてい
る。この種の分解作用は温度感受性のレプレツサー（高
温で非活性になる）を使用することで最小に抑えること
ができる。これによつて、培養中でこの遺伝子がスイツ
チオフされており、細胞回収の直前でスイツチオンされ
るようにすることができる。このような温度感受性のレ
プレツサーをコードするＤＮＡ鎖は常法によつて本発明
の組換えベクターに挿入する。
次に、本発明を添付図面を参照しつつ、さらに詳細にし
かし非限定的に説明する。これから示す特許およびその
他の文献における開示は本願の引例としてここに使用す
る。
添付図面において、 第１図はプロテインＡをコードするプラスミドＤＮＡ
（pSPA1）の環状制限地図を示す図である。地図の大き
さは１２分角のEco RI制限部位（ベクターpBR322内の制
限位置）をスタートとしてキロベースで表現されてい
る。図中にはEco RI,Eco RV,Hind III,Pst IおよびBam
HIの各制限部位を示した。ベクターと挿入されたＤＮＡ
との接合点は矢印で示した。
第２Ａ図は各種の領域をもつプロテインＡコード遺伝子
を示す図である。太線はベクターpBR322のＤＮＡを示
す。Ｓはシグナル配列を、Ａ−Ｄは予め同定されたIgG
−結合領域を、ＥはＡ−Ｄに殆んど相同の領域を、Ｘは
IgG結合能を欠いたプロテインＡのＣ−末端部を示して
いる。
第２Ｂ図は、第２Ａ図に対応したＤＮＡ−鎖の詳細な制
限地図であり、Taq I,Hind III,Eco RV,Pst I,Bcl I,Sa
u 3Aの制限部位を示している。その大きさは第１図で示
したEco RI制限部位をスタートとしてキロベースで表現
されている。ベクターpBR322と挿入されたＤＮＡフラグ
メントとの間の接合点は矢印をもつて示した。ベクター
鎖にあるTaqＩ（２ケ）とSau３Ａ（１ケ）の制限部位は
省略した。
第３Ａ図はSau３Ａ制限部位（第２Ｂ図、1.8kbの位置）
とPst制限部位（図２Ｂ、2.1kbの位置）の附近における
塩基配列を示す。この塩基配列から推論されたアミノ酸
配列も同時に示してある（アミノ酸の略号はＩＵＰＡＣ
アミノ酸略号によつた；J.Biol.Chem.24,527および2491
（1966））。
第４図はプロテインＡ遺伝子の全部または一部を含んだ
プラスミドの構築を示す図であり、制限部位のいくつか
を表示した。囲いは構造遺伝子を矢印はオリエンテーシ
ヨン（配向）（スタート・コドンからストツプ・コドン
に向つて）を示している。レプリケーシヨン・オリジン
をOriで示した。ＡＭＰとＴＥＴはそれぞれアンピシリ
ン耐性、テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子であ
る。ＰＲＯＴ ＡはプロテインＡをコードする遺伝子、
LacZ′はβ−ガラクトシダーゼのＮ−末端（Ruther eta
l,Nucl.Acids Res.9,4087-4098(1981）をコードする遺
伝子である。
第５Ａ及び５Ｂ図は、２つの融合ベクタープラスミドの
地図を示す。略号は第４図と同じ意味を表わしている。
Ｍ１３マルチリンカーは２つのプラスミドでそれぞれ違
つた位置で、プロテインＡコード遺伝子に挿入されてい
る。それぞれのプラスミド地図の上方にはヌクレオチツ
ド鎖とこの領域における誘導アミノ酸配列を示した。第
５Ａ図は、プラスミドｐＳＰＡ１１を、第５Ｂ図はプラ
スミドｐＳＰＡ１２を示す。
第６Ａ及び６Ｂ図は、相互に融合したプロテインＡをコ
ードする遺伝子とβ−ガラクトシダーゼをコードする遺
伝子とを含有する２つのプラスミドを示す。第４図と同
じ略号を使用。ＬＡＣＺはβ−ガラクトシダーゼをコー
ドする遺伝子全体（５′−末端の数ケのヌクレオチツド
は除いて）を示す。第６Ａ図はプラスミドｐＳＰＡ１３
を、第６Ｂ図はプラスミドｐＳＰＡ１４を示す。
第７図（ＣとＤ）は、第６Ａ及び６Ｂ図におけるプラス
ミドの融合したプロテインＡ遺伝子とβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子を示す。図ＡとＢはそれぞれ第２Ａ図及び第
２Ｂ図の制限地図に対応したプロテインＡ遺伝子とその
配列を示す。大きさはTaqＩ部位をスタートとしてベー
ス対で表現。（ヌクレオチツド355と1572における２つ
のBcl部位はSau ３Ａ部位でもある） 第８図は、プラスミドｐＳＰＡ１３の融合点（第６Ａ
図）附近のヌクレオチツド鎖を示す。制限部位とそれに
対応した誘導アミノ酸配列を表示した。鎖の各部分のオ
リジンも示した。第８Ｂ図は、プラスミドｐＳＰＡ１４
の融合点（第６Ｂ図）附近におけるヌクレオチツド鎖を
示す。
第９図は、合成オリゴヌクレオチツドのヌクレオチツド
鎖と突然変異（ムタゲネシス）発生点での対応のフアー
ジmp9/1ＧＦ−１の配列を示している。“＊”印は非相
補性の塩基対を示す。突然変異後の推論アミノ酸配列も
同時に示した。
第１０図は、ＩＦＧ−１とプロテインＡ遺伝子を含むシ
ヤトル・ベクターの構築を示す図であり、制限部位のい
くつかを示した。囲いは構造遺伝子を、矢印はオリエン
テーシヨン（スタート・コドンからストツプ・コドンに
向つての）を示す。レプリケーシヨン・オリジンはＯＲ
Ｉ−Ｅ（E.coli）とＯＲＩ−Ｓ（S.aureus）で表わし
た。ＡＭＰ，ＴＥＴ，ＣＭＬはそれぞれアンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性、クロラムフエニコール耐性
を表わす。ＰＲＯＴ ＡはプロテインＡをコードする遺
伝子を、ＩＧＦ−１は修正ヒトインシユリン様生長フア
クター（１型）をコードする遺伝子を表わす。
第１１図は、プラスミドｐＵＮ201において融合したプ
ロテインＡ遺伝子とＩＧＦ−１との遺伝子融合のヌクレ
オチツドとそれより誘導されたアミノ酸配列を示す。成
熟プロテインＡをコードするＤＮＡ−鎖（シグナルペプ
チドをコードする領域を欠如）のみを示した。蟻酸処理
で起ると考えられるアミノ酸の切断点（Asp-Pro）に下
線を付した。Eco RIとHind IIIの切断部位を示したが、
この部位は合成ＩＦＧ−１（修正）遺伝子終点を表わ
す。
第１２図は、プラスミドｐＵＮ202のプロテインＡ遺伝
子の３′−末端附近のヌクレオチツド鎖とそれに対応し
て推論したアミノ酸配列を示す。
第１３Ａ図は、２つのＤＮＡストランドで複数のオリゴ
マーに分けられたＩＧＦ−１とフランキング配列を示し
ている。この配列はスタート・コドン（ブロツクＡ２の
ＡＴＧ）、ストツプ・コドン（ブロツクＡ１７のＴＡ
Ｇ）、Eco RIの認識配列（ブロツクＡ１）とHind III
（ブロツクＡ１７）をもつ。
第１３Ｂ図は、ＩＧＦ−１遺伝子のリゲーシヨンパター
ンを示す。
以下の実施例における出発材料、緩衝液、細胞培地、方
法手順は、以下のとおりである。
出発材料 バクテリア宿主 実施例にはE.coliの４株を使用；ＨＢ101〔Boyerら，J.
Mol.Biol.41,459-472(1969)に記載〕；ＸＡＣlac〔Mill
erら，J.Mol.Biol.,109,275〜301(1977)〕；RRI del M
15〔Langeyら，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,72,1254-1257
(1975)〕；ＪＭ８３〔VieraおよびMessig,Gene19,259-2
68(1982)〕．その他S.aureusＳＡ113〔Iordanescuら，
J.Gen.Microbiol.96,277-281(1976)〕も使用。これらの
菌株はスウエーデン国ウプサラの生体医学センター、微
生物学部（Department of Microbiology（Ｎ），Biomed
ical Centre,Uppsala,Sweden）で入手できる。
クローニング・ビークル 実施例で使用したクローニング・ビークルは次の通りで
ある。
(1)pBR322〔Bolivarらがつくり報告，Gene2,95-113(197
7)〕， (2)pUR222〔Rutherがつくり報告，Nucl.Acids Res.,9,4
087-4098(1981)〕， (3)PTR262〔Roberts,T.M.らがつくり報告，Gene12,123-
127(1980)〕， (4)pUC8〔VieraおよびMessigがつくり報告，Gene19,259
-268(1982)〕， (5)pHV14〔Ehrlich,S.D.がつくり報告，Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA70,3240-3244(1978)〕， (6)pSKS104とpSKS106〔Casadaban,M.J.,Martines-Aria
s,A.,Shapiro,F.,およびChou,J.がつくり報告，Methods
in Enzymology,100,P.293-308(1983)〕， (7)スタフイロコツカスのプロテインＡをコードする遺
伝子を含んだプラスミドpSPA1,pSPA3,pSPA5,pSPA16〔国
際特許出願PCT/SE83/00297（スウエーデン特許出願No.8
204810-9)を参照〕 プラスミドｐＳＰＡ１を含むE.coli259株、プラスミドp
SPA16を含むS.xylosusＫＬ117株の培養体はドイツ微生
物収集所（Deutsch Sammlung von Mikroorganismen（Ｄ
ＳＭ）、ゲツチンゲン、西ドイツ）に寄託（前者は1982
年７月１２日に寄託番号ＤＳＭ2434、後者は1983年８月
１５日に寄託番号ＤＳＭ2706をもつて）された。
(8)フアージ・ベクターＭ１３mp８およびmp９ＲＦＩＤ
ＮＡ〔New England Biolabs,Beverly,MA,USAより供給
（カタログNo.408,409）〕。
緩衝液と培地 トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（“ＴＥ”）： 0.001Ｍ ＥＤＴＡおよび0.01Ｍ Tris(pH7.8） コーテイング緩衝液（カーボネートバイカーボネート−
pH9.6）： 1.59ｇNa2CO3.2.93ｇNaHCO3および0.2ｇNaN3；蒸溜水に
て１にする。
ＰＢＳ ＴＷＥＥＮ（リン酸バツフアー食塩水＋0.05％
ＴＷＥＥＮ）： 8.0ｇNaCl,0.2ｇKH2PO4,2.9ｇNa2HPO4・12H2O,0.2ｇKCl,
0.2ml TWEEN20,および0.2ｇNaN3；蒸溜水にて１に
する（pH＝7.4） ジエタノールアミン緩衝液10％： 97mlジエタノールアミン、800ml蒸溜水、0.2ｇNaN3およ
び100mg MgCl2・6H2O；1MHclにてpHを9.8に調整、蒸溜水
にて１にする。
ルリアーブイヨン（“LB”）： １０ｇDifcoトリプトン、５ｇDifco酵母抽出物、0.5ｇN
acl、2ml1M NaOH；1M NaOHでpHを7.0に調整、オートクレ
ーブにかけてから２０％グルコース１０mlを添加。
ＬＡ−培地： ルリアーブイヨンに１％Difcoアガーを追加 ＴＥＢ 緩衝液： 0.09M Tris−ボレート、0.09Mホウ酸および0.002M EDT
A. ＯＮＰＧ 緩衝液： 0.1Mリン酸カリウム緩衝液に２ｍＭのＯ−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシツド(ONPG,Sigma製品No.N-112
7),pH=7.3 0.1Ｍ２−メルカプトエタノールと１ｍＭ M
gCl2を含有。
Xgal−培地： ＬＡ−培地に４０mg/の５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシツド（Ｘgal）を追
加。
ＡＸＩ： ＬＡ−培地に５０mg/のアンピシリン、４０mg/の５
−プロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシツド(Xgal)と0.1ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシツド(IPTG)を追加。
方法手順 手法によつては実施例の中でくり返して行なわれるもの
もある。特にことわらないかぎり、これらの手法は毎回
次に述べる通りに行なわれる。
トランスフオーメーシヨン（形質転換） プラスミドＤＮＡを用いてのE.coliＫ１２の形質転換は
モリソン，D.A.,によつて報告〔Methods in Enzymolog
y,Academic Press68,326〜331(1979)〕された方法に従
つて正確に行つた。形質転換された細胞は適当な抗生物
質を含有した（すなわち３５μｇ／mlのアンピシリンま
たは２５μｇ／mlのクロラムフエニコール）ＬＡプレー
トに単一コロニーを植菌し、常法に従つて選別した。
プラスミドの抽出 スケールの大きいプラスミドの調製法としては、Tanak
a，ＴおよびWeisburn,B.,の報告〔J.Bacteriol.121,354
〜362(1975)〕の方法に正確に準投した。多数のプラス
ミドのコロニーはBirnboim,H.CとDoly,J.,の報告〔Nuc
l.Acids Res.7,1513-1523(1979)〕した通りに“ミニ・
アルカリ法”によつて数えた。
ゲル溶離 ＤＮＡフラグメントはMaxam他の報告〔P.N.A.S.74,560-
564(1977)〕に従つてポリアクリルアミドまたはアガロ
ース・ゲル・ピースから溶離した。
ＤＮＡ鎖の決定 ＤＮＡフラグメントの５′−末端をラベルし、そのＤＮ
Ａ鎖配列はMaxam他の報告（上記）に従つて決定した。
エンドヌクレアーゼによるＤＮＡフラグメントの５′−
末端はT4−ポリヌクレオチツド・キナーゼ（Boehringe
r,Mannheim,西ドイツ）を用いて（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ
（New England Nuclear，ＵＳＡ；2700Ci/mmol）でラベ
ルした。
制限酵素によるＤＮＡの消化（ダイジエスチオン） “New England Biolabs”，Beverly MA,ＵＳＡの販売す
る通常の制限酵素を用いてＤＮＡを切断した。制限酵素
は通常の濃度，温度でＤＮＡに加え、緩衝液はNew Engl
and Biolarの推しようするものに従つた。
ＤＮＡフラグメントの連結（リゲイシヨン） ＤＮＡフラグメントの連結はすべて“New England Biol
abs”，Beverly MA,USAの販売するＴ4ＤＮＡリガーゼを
用い、同販売者のすすめる緩衝液中で１４℃、一夜かけ
て行なつた。
アガロースゲル電気泳動 Hellingらの報告〔J.Vir.14,1235-1244(1974)〕に従が
い0.7％アガロースゲル電気泳動でプラスミド切断フラ
グメント、スーパーコイル（超らせん）プラスミド、長
さ1000〜10000ヌクレオチツドのＤＮＡフラグメントの
分離を行なつた。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動 Maxamらの報告〔P.N.A.S.74,560-564(1977)〕に従つて
８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で長さ100〜4000
ヌクレオチツドのＤＮＡフラグメントの分離を行なつ
た。
プロテインＡの検出用の細胞溶解物の調製 ３５μｇ／mlのアンピシリンを加えたルリアーブイヨン
（ＬＢ）50ml中，３７℃でE.coliクローンを一夜増殖さ
せた。遠心分離後、細胞をTris-EDTA(0.05M.pH8.5,0.05
M)5mlに再懸濁し、遠心分離した。この細胞を同じ緩衝
液５mlに再懸濁しこれにリゾチームを加え、その濃度を
２mg/mlとした。３７℃で１時間経過後、溶解物をSorva
ll SS-34ローターを用い15000rpmで１５分間遠心分離し
た。上澄液を集めてプロテインＡの検定を行なつた。
E.coliクローンからのプロテインＡの検出、定量 生成したプロテインＡの検定と定量にはELISAテスト
（酵素−リンク イミユノソルベント アツセイ）を用
いた。ネツト・チヤージ（中性）がなく、その壁部がヒ
トIgG(Kabi,スウエーデン）で被覆された特殊なミクロ
タイター・プレート（Titertek,Amstelstad,オランダ）
を用いた。試料を加えてプロテインＡをIgG−分子のFc
−部分に結合させる。プロテインＡに連結したアルカリ
ホスフアターダを加えることにより残存する遊離Fc−部
位を滴定する。壁部を洗滌してから、アルカリホスフア
ターゼ用の基質としてＰ−ニトロフエニル−ホスフエー
トを加える。
検定 コーテイング緩衝液に500μｇ／mlの濃度に調製したヒ
トIgG(Kabi，スウエーデン）の溶液50μをミクロタイ
タープレートのウエルに充填し、そのプレートを室温下
で一時間インキユベートした。そのウエルをＰＢＳ＋0.
05％Tween２０（本アツセイの洗滌はすべてこれを用
いた）で３回洗滌してから、被検溶解物５０μを添加
した。定量分析の場合は溶解物のＰＢＳ＋0.05％Tween
２０による（２倍）段階稀釈法を採用した。ＰＢＳ＋
0.1％Tween２０の１０μを加えて室温下で一時間イ
ンキユベートした。ウエルを再び３回洗滌してからプロ
テインＡ−アルカリホスフアターゼ共役体（Immunochem
istry,Pergamon Press 1969,vol.6pp.43-52に従つて調
製）５０μを加えた。室温下で一時間インキユベート
したらウエルを再び３回洗滌してからアルカリホスフア
ターゼ基質（Sigma104＝Ｐ−ニトロ−フエニルホスフエ
ート，１mg/ml)100μを添加。この酵素反応は３０分
後に３ＭNaOH10μを加えて中断させた。肉眼で結果を
判定した。(+)の結果すなわちプロテインＡが存在する
ときは反応混合物は無色となる。その理由は遊離したIg
GのFc部位が共役体（コンジユゲート）と結合しないか
らである。(-)の結果すなわちプロテインＡが存在しな
いときは黄色となる（結合共役体のアルカリホスフアタ
ーゼの活性による）。プロテインＡの定量分析では、試
料と平行して濃度既知の標準プロテインＡ液を用い（２
倍）段階稀釈法を採用して行なつた。
β−ガラクトシダーゼ アツセイ 機能的lacＺ遺伝子を含有した組換え体をXgal培地に植
菌して数えた。細胞から遊離したβ−ガラクトシダーゼ
活性は、Miller,J.Hの報告〔Experiment in Molecular
Genetics,Cold Spring Harber,New York；Cold Spring
Harber Laboratory,1972〕に従つて基質としてＯ−ニト
ロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシツド（ONPG,Sigma Pro
duct No.N-1127）を用い比色法で検定した（しかし次の
通りの修正を加えた。）。検定は＋８℃で行ない、その
活性は405nmで測定した。活性の一単位は405nmの吸収値
の変化（１分当り）を示す。IgG−セフアロースにカ
ップリングした融合蛋白質のβ−ガラクトシダーゼ活性
は８℃で測定（沈降を防ぐためにチユーブを回転させな
がら）した。
フアージＭ１３クローニングおよび配列決定 Ｍ１３のクローニング、精製、配列決定はすべて提供者
（New England Biolabs,Beverly,MA.,USA,カタログNo.4
08,409）から得た指示書／プロトコルの記載に従つて行
なつた。
実施例１ ＩプロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列の分析 遺伝子もしくは遺伝子の部分間で融合をさせるために、
先ず、融合させる２つの遺伝子または遺伝子の一部分の
融合点の近傍におけるＤＮＡ配列、それより誘導される
アミノ酸配列を知ることが望ましい。これに関する知見
が得られればリンケージをどのようにデザインして２つ
の遺伝子間または遺伝子部分間での正確なリーデイング
フレームをつくるべきか、かつまた機能的ハイブリツド
蛋白質の表現形質を示すかを予測することが可能とな
る。
出願人のスウエーデン特許出願No.8204810-9（その開示
内容を引例として挿入する）にはスタフイロコツカスの
プロテインＡをコードする構造遺伝子全体を含む３つの
プラスミド、すなわちプラスミドpSPA1,pSPA3,pSPA5に
ついて記載している。しかし、プロテインＡ遺伝子の
５′−末端のＤＮＡ配列（添付図面の第２Ａ図の領域S,
E,DとＡの一部）しか開示されていない。従つて、遺伝
子の３′−末端のＤＮＡ配列についてもつと詳細な情報
を得るためにプロテインＡ遺伝子全体の配列を先に決定
した。前記実施手順で述べた通りにして配列決定操作を
行なつたが、その際ＤＮＡ源としては精製したプラスミ
ドｐＳＰＡ３（３種のプロテインＡ遺伝子含有プラスミ
ドのうちで最も小さいので、配列決定には一番やさし
い）を使用した。第３図に示したＤＮＡ鎖（配列）は第
２Ｂ図のプロテインＡ遺伝子の制限地図において1.8kb
の位置にあたるSau３Ａ制限部位と2.1kbの位置にあたる
PstＩ制限部位の近傍から得たＤＮＡ配列とそれから推
測したアミノ酸配列である。この２つの制限部位に特に
関心がもたれる理由を次に説明する。
ここで得られたＤＮＡ配列にもとずいて、この二種の遺
伝子融合ベクターをつくるためＭ１３マルチリンカー
（いくつかの制限酵素に対して制限部位を有するオリゴ
ヌクレオチツド）を、第３Ａ図に示したヌクレオチツド
1096のSau３Ａ部位と第３Ｂ図に示したヌクレオチツド1
541のPstＩ部位に挿入することにした。これらの部位は
プロテインＡがS.aureusの細胞壁にあるペプチドグルカ
ンに結合するとき、それに関与して包含されると考えら
れているプロテインＡ遺伝子のＸ領域（第２Ａ図）の反
復配列部の前後に位置する。この融合ベクターを用いる
手段により、融合遺伝子を発現させて得られる融合蛋白
質にこれらがどのように影響するかを知ることができ
た。これら２ケの遺伝子融合ベクターの構築につき以下
説明する。
II融合ベクターフラスミドｐＳＰＡ１１の構築（第５Ａ
図） 次の工程Ａ−ＥはＸ領域をもたないプロテインＡ遺伝子
と1098に位置するSau３Ａ部位（図７）に特異的EcoＲＩ
部位を挿入保有するプラスミドの構築に関するものであ
る。
Ａ．ｐＳＰＡ１から得たプロテインＡ遺伝子の５′−末
端をプラスミドｐＴＲ262にサブクローニングすること
によるプラスミドｐＳＰＡ２の取得（第４図） プラスミドｐＳＰＡ１（第１図参照）の１μｇとプラス
ミドｐＴＲ262の１μｇとを制限酵素Hind IIIとPstＩで
切断し、混和し、Ｔ4−リガーゼで処理してE.coliＨＢ1
01を形質転換した。分断、連結（リゲーシヨン）、形質
転換の方法は前記“実施例での手法”の項で述べた通り
に行なつた。
プラスミドｐＴＲ262はラムダ・レプレツサー遺伝子を
もち、これが発現するとテトラサイクリン耐性の遺伝子
を非活性にする。このラムダ・レプレツサー遺伝子はHi
nd III部位を有しており、ここにＤＮＡ鎖が挿入される
とラムダ・レプレツサーが非活性となり、その結果、テ
トラサイクリン耐性遺伝子が活性化される。このように
ｐＴＲ262フラスミドはテトラサイクリン耐性組換え体
を積極的に選別する。
このようにして組換え体を含むコロニーはテトラサイク
リン耐性として選別した。これらの組換え体２０ケのう
ち１ケは、先に述べた実施例の手法の項でのＥＬＩＳＡ
法を用いてプロテインＡ陽性であることを見出した。制
限分析の結果、それは第１図と第２Ｂ図で示したｐＳＰ
Ａ１制限地図の0.0〜2.1kbに相応したフラグメントから
得た2.1kbプロテインＡ遺伝子を挿入保持したベクター
プラスミドｐＴＲ262を含有していることが判つた。こ
のプラスミドをｐＳＰＡ２と命名し、第４図にその略図
を示した。それはプロテインＡ遺伝子フラグメントの
３′−末端に特異的PstＩ制限部位を有しており、次の
工程Ｅで使用される。
Ｂ．プロテインＡ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメント
の調製 100μｇのプラスミドｐＳＰＡ５（プロテインＡ遺伝子
をもつたプラスミドベクターｐＨＶ１４；前記“出発材
料”の項参照）を制限酵素Eco ＲＶを用い３７℃，１
時間処理して切断した。このようにして産生された２ケ
のＤＮＡフラグメントは、すなわち第２Ｂ図の0.2kbと
2.3kbの間に位置するプロテインＡ遺伝子（2.1kb）を有
する挿入されたＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＨ
Ｖ１４（7.2kb）である。この消化物(digest)を加熱し
て非活性化し、エタノールで沈でんさせ、100μのＴ
Ｅにとかし、１０〜３０％蔗糖グラデイエント／ＴＥ緩
衝液を用いて沈降させた。ベツクマンＳＷ40ローター
（５℃，35000rpm,２０時間）を使用した。グラデイエ
ントは0.5mlづつのフラクシヨンに分け、各フラクシヨ
ンはアガロースゲル電気泳動で分析した。2.1kbフラグ
メントを含むフラクシヨンをプールし、２倍容積のエタ
ノールで沈でんさせ、ＴＥ緩衝液に溶かした。
第２Ａ及びＢ図から明らかな通り、このフラクシヨンは
プロテインＡ遺伝子全体に加えて、プラスミドｐＢＲ32
2から得たE.coli配列とスタフイロコツカス遺伝子残留
物を含有している。
Ｃ．プロテインＡ遺伝子の一部を含むＤＮＡフラグメン
トの調製 前記工程Ｂから得た2.1kbフラグメント（精製）５μｇ
を制限酵素Sau３Ａを３７℃で１時間作用させて切断し
た。この消化物を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＴＥＢ緩衝液）にかけ、約600ベース対のＤＮＡフラ
グメントを切り出した。このフラグメントは第２Ｂ図の
1.15kbと1.8kbの位置の間にある遺伝子部分に相当する
ものである。このＤＮＡをＴＥ＋0.3M Naclの５ml中３
７℃で一夜溶離した。300μの沈降ＤＥ−５２（Whatm
an，英国）（５mlＴＥで平衡化）をつめたカラムに溶離
物を通した。ＴＥ＋0.3M Naclの0.5mlで洗つてから0.5m
lＴＥ＋0.6M Naclで２回溶離してＤＮＡを溶出した。Ｄ
ＮＡフラグメント含有溶離液をＴＥ１容積量で稀釈し、
エタノールで沈でんさせ次いでＴＥ緩衝液に溶かした。
ここに得られるプロテインＡ遺伝子フラグメント（精
製）にはSau３Ａ制限部位と中間Hind III部位に対応し
た粘着末端が存在する。
Ｄ．ベクタープラスミドｐＵＲ222の調製 プラスミドｐＵＲ222は市販されているベクターで、そ
れには酵素β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子
（lac Ｚ）が含まれている。この遺伝子にはいくつか
の制限部位例えばPstＩ，BamＨ１，EcoＲＩをもつたマ
ルチリンカーが含まれている。酵素アツセイによつてβ
−ガラクトシダーゼは容易に検出できるので、これらの
制限部位の一つにＤＮＡフラグメントを挿入保持する組
換え体は適当な宿主菌株を用いて簡単に数えることがで
きる。よく使われるのはXgalプレート（Xgalは呈色基
質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシツドで、β−ガラクトシダーゼで分断され
ると青色のインドリル誘導体を遊離する）で、その際、
β−ガラクトシダーゼ陰性組換え体は白色のコロニーと
なり、これに対して挿入のないプラスミドを含むコロニ
ーは青−緑となる。
β−ガラクトシダーゼコード遺伝子中のプラスミドｐＵ
Ｒ222を分断して、工程ＣのプロテインＡフラグメント
の粘着末端に相補性の粘着末端をつくり、それをプラス
ミドに挿入するために、BamＨＩ制限部位を使用した。
“Boehringer-Mannheim，西ドイツ”から供給されたｐ
ＵＲ222１μｇを制限酵素BamＨＩで３７℃、１時間処理
して消化し、次いで６５℃、１０分間かけて酵素を非活
性にした。次の工程ＥでプロテインＡフラグメントと連
結（リゲート）するためにこの分断調製品を使用した。
Ｅ．ｐＳＰＡ２とｐＴＲ262含むハイブリツト・プラス
ミドｐＳＰＡ１０の構築 工程Ｄで説明したBamＨＩで消化したｐＵＲ222の200n
g、工程Ｂで説明した溶出プロテインＡフラグメント200
μｇを混合し、全量２０μとして１４℃で一夜連結し
た。６５℃で１０分間かけて酵素を失活させ、エタノー
ルで沈でんさせてからＴＥ緩衝液に溶かした。β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子にプロテインＡを挿入保持する組換
えプラスミドを含有するＤＮＡ混合物全体をHind III用
の緩衝液中で制限酵素Hind IIIとPstＩを作用（３７
℃，１時間）させて切断した。この操作で組換えプラス
ミドはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（PstＩ）とプロテ
インＡ遺伝子（Hind III）のところで分断し、２つのフ
ラグメント、すなわち第２Ｂ図の1.15kb位のSau３Ａ部
位からHind III部位に至るプロテインＡ遺伝子フラグメ
ントに結合した小さなβ−ガラクトシダーゼＤＮＡ配列
からなる小フラグメントと、第２Ｂ図のHind III部位か
ら1.8kb位のSau３Ａ部位に至るプロテインＡ遺伝子フラ
グメントに結合した大部分のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を含む残りの組換えプラスミドからなる大フラグメン
トを生成する。第４図から判る通り、このβ−ガラクト
シダーゼ・フラグメントはプロテインＡフラグメントと
の融合点（BamＨＩ部位）に近接したEcoＲＩ制限部位を
有する。
前記工程Ａから得たプラスミド200ngを上記と同様にし
て制限酵素Hind IIIとPst Iで切断して（第４図参
照）、このプラスミドを３つのフラグメントに分ける。
すなわち、Tet−遺伝子とプロテインＡ遺伝子の５′−
末端の間に位置するHind III部位からプロテインＡ遺伝
子の中にあるHind III部位に至るフラグメント、後者の
Hind III部位からプロテインＡ遺伝子の３′−末端のPs
tＩ部位に至るプロテインＡ遺伝子フラグメント、およ
び残りのプラスミドからなるｐＴＲ262オリジンの大き
なフラグメントである。
このようにして得られた２つの消化物を６５℃、１０分
間で非活性にし、混合し、エタノールで沈でんさせた。
このＤＮＡを連結緩衝液にとかしてＴ4−リガーゼで処
理した。目的とする組換えプラスミドはｐＵＲ222組換
え体の分断で得られ、プロテインＡ遺伝子内のHind III
部位とPstＩ部位の間のｐＳＰＡ２に挿入された上記の
大フラグメントを含み、またプロテインＡ遺伝子の５′
−末端を含有しており、その一部はｐＳＰＡ２から誘導
され他の部分はｐＵＲ222組換え体に由来しているもの
である。また、このプラスミドはアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性でＸgalプレート上では次に述べる
通り青色を呈する。
次にこのリゲート（連結）したＤＮＡ混合物を使用して
E.coliＲＲＴdelＭ１５を形質転換した。上述の方法で
分断（クリーベイジ）、連結（リゲーシヨン）および形
質転換を行なつた。組換え体をアンピシリン、テトラサ
イクリンを含有するＸgalプレート上にまいた。ここに
出現するコロニーの一つは明るい青色を呈する。そのプ
ラスミドについて制限分析を行なつた。このプラスミド
はｐＳＰＡ１０（第４図）と命名され、それはプラスミ
ドｐＵＲ222、プラスミドｐＴＲ262の一部、ならびにプ
ラスミドｐＳＰＡ１に由来するプロテインＡ遺伝子の一
部からなり立つている。プラスミドｐＳＰＡ１０で、こ
のプロテインＡ遺伝子フラグメントは第７図で示した10
96位にあるSau３Ａを介してlacＺ′遺伝子と融合してい
る。
プラスミドｐＳＰＡ１０にはβ−ガラクトシダーゼをコ
ードするlacＺ遺伝子の全部は含まれておらず、そのう
ちのα−フラグメントをコードする遺伝子（lacＺ′）
のみが含まれ、Ｘgal基質を分割する活性をもち、前述
の条件下で青色を生ずる。
これは、このプラスミドによつてコードされるα−フラ
グメントと、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端フ
ラグメントを含む染色体遺伝子生成物との間の相補によ
つて活性酵素が生ずるからである。E.coliＲＲＩdelＭ
１５宿主菌株にはこのような染色体遺伝子物質があるた
めに、ｐＳＰＡ１０プラスミドのつくるα−フラグメン
トを相補して活性なβ−ガラクトシダーゼ分子を生ず
る。
以上の工程Ａ−Ｅによつて目的のプロテインＡフラグメ
ントを含むプラスミドベクターｐＳＰＡ１０（下流末端
に近いところに特異的EcoＲＩ部位を有する）がつくら
れた。以下のセクシヨンIIIで述べるごとくEcoＲＩとPs
tＩの部位の間にある不要フラグメント（lacＺ′遺伝子
とアンピシリン耐性の遺伝子を含む）をとり除くと同時
にその部位にＤＮＡリンカーを導入し、有利な融合ベク
ターを構築した。
Ｆ．フアージＭ１３mp８からのマルチ−リンカーを含む
ベクタープラスミドｐＳＰＡ１１（第５Ａ図）の構築 工程ＥからのプラスミドｐＳＰＡ１０ １μｇとフアー
ジベクターＭ１３mp８（New England Biolabs,Beverly,
ＭＡ，ＵＳＡ）２μｇとを制限酵素EcoＲＩで別々に切
断し、沈でんさせ、制限酵素PstＩ用の緩衝液中で溶解
した。PstＩ酵素で消化し、２つのＤＮＡ消化生成物を
混合し、連結し、これを用いてE.coliＨＢ101を形質転
換した。前述の方法手順に従つて分断、連結、形質転換
を行なつた。目的とする組換え体をテトラサイクリン耐
性、かつアンピシリン感受性として選別した。テトラサ
イクリン耐性コロニー５２ケをアンピシリン含有プレー
ト上に採取した。これらのコロニーのうち３ケはアンピ
シリン感受性であつたが、そのうちの一つについて制限
分析をしたところ、そのプラスミドは第５Ａ図の略図で
表わされることが判つた。このプラスミドはプロテイン
Ａ遺伝子の領域Ｃ（第２Ｂ図の1.8kbの位置）の末端部
にＭ１３マルチ−リンカーを挿入保持したもので、ｐＳ
ＰＡ１１と命名した。遺伝子融合後の正確な解読フレー
ムを得る指針とするため推測アミノ酸配列も示した。プ
ラスミドｐＳＰＡ１１は次の工程３で示す通り、プロテ
インＡフラグメントとの遺伝子融合に適したベクターで
ある。
III E.coli lacＺ遺伝子へのプラスミドｐＳＰＡ１１の
融合 プラスミドｐＳＫＳ104（特異的E.coliＲＩ部位をも
つ）１μｇを制限酵素EcoＲＩで消化した。このプラス
ミドは以下で用いるｐＳＫＳ106プラスミドと共に、E.c
oli lacＺ遺伝子とその他の遺伝子との遺伝子融合を助
成するための１セツトのプラスミドとなる。この融合で
できるハイブリツド蛋白質はカルボキシ末端に酵素活性
のあるβ−ガラクトシダーゼ（Ｎ−末端のアミノ酸のい
くつかを欠如）を含み、その酵素活性によつてアツセイ
することができる。別に工程２ＦからのプラスミドｐＳ
ＰＡ１１（やはり特異的EcoＲＩ部位を有する）１μｇ
を制限酵素EcoＲＩで消化した。この２つのＤＮＡ消化
生成物を加熱して失活させ、混合し、連結し、E.coliＸ
ＡＣlac（β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠く）の形質
転換に用いた。組換え体をテトラサイクリンとアンピシ
リンの両者を含むＸgalプレート上でカウントした。
これらのコロニーの約半分は明るい青色を呈し（分割ｐ
ＳＫＳ104の挿入は正しい方向のものと逆の方向のもの
が半々の確率で生ずる）、それらの一つについて行なつ
た制限分析の結果、このプラスミドは第６Ａ図で表わさ
れることが判つた。
このプラスミドはｐＳＰＡ１３と命名され、第２Ｂ図の
1.8kbのヌクレオチツドにあるプロテインＡ遺伝子にlac
Ｚ遺伝子を挿入保持している。これは第７図で表わされ
るが、この融合点附近における推測アミノ酸配列を第８
図に示した。このクローン培養物はドイツ微生物収集所
（Deutsch Sammlung von Mikroorganismen（ＤＳＭ），
ゲツチンゲン，西ドイツ）に1983年２月４日付（寄託番
号No.ＤＳＭ2591）で寄託されている。
IV E.coli lacＺ遺伝子へのプラスミドｐＳＰＡ２の融
合 工程IIＡで構築され、第４図で示されるプラスミドｐＳ
ＰＡ２は、プロテインＡ遺伝子の1541の位置（第７図参
照）に特異的PstＩ部位を有している。従つてこのプラ
スミドはプラスミドｐＳＫＳ106のlacＺ遺伝子に対応す
るプロテインＡ遺伝子テラグメントを遺伝子融合するの
に用いられる。
工程IIＣからのプラスミドｐＳＰＡ９ １μｇとプラス
ミドｐＳＫＳ106１μｇをそれぞれ別々に制限酵素PstＩ
で切断した。得られるＤＮＡフラグメントを混合し、連
結し、前述の方法手順の項で述べたところに従つてE.co
liＸＡＣlacの形質転換に用いた。テトラサイクリンと
アンピシリンを含むＸgalプレート上で組換え体をカウ
ントした。セクシヨンIIIと同じく、これらのコロニー
の約半数は明るい青色を呈し、これらの一つについて制
限分析をした結果、第６Ｂ図で表わされることが判つ
た。ｐＳＰＡ１４と命名されたこのプラスミドは第２Ｂ
図の2.1kb位にあるプロテインＡ遺伝子にlacＺ遺伝子を
融合保持している。概略は第７図に示す通りである。融
合点附近の推測アミノ酸配列は第８Ｂ図に示される。こ
のクローン培養物はＤＳＭ，Gottingen，西ドイツに198
3年２月４日付（寄託番号No.ＤＳＭ2592）で寄託されて
いる。
Ｖ融合ベクタープラスミドｐＳＰＡ１２の構築（第５Ｂ
図） プラスミドｐＳＰＡ９のプロテインＡ遺伝子フラグメン
トの融合体をもつとつくりやすくするために、プラスミ
ドｐＳＰＡ１４からlacＺ遺伝子を切断し、この遺伝子
の５′−末端の前方にマルチ−リンカーを保持させるこ
とにより対応の融合ベクター、ｐＳＰＡ１１を構築し
た。
セクシヨンIVのプラスミドｐＳＰＡ１４ １μｇを制限
酵素EcoＲＩで切断し、連結し、方法手順の項で述べた
ところ従つてE.coliＸＡＣlac形質転換し、テトラサイ
クリン耐性でβ−ガラクトシダーゼ活性を欠くものをカ
ウントした。コロニーをテトラサイクリン含有Ｘgalプ
レートにまいた。これらのコロニーの約８０％は白色を
呈した。これらの一つについて制限分析を行なつたとこ
ろ第５Ｂ図に示すプラスミドであることが判つた。この
ｐＳＰＡ１２と命名されたプラスミドは第２Ｂ図の2.1k
b位にＭ１３マルチ−リンカーを含有する。融合点での
解読フレームを第５Ｂ図に示した。
VIプロテインＡコード遺伝子の全部をプラスミドｐＢＲ
322にサブクローニングしてプラスミドｐＳＰＡ８を構
築（第４図） 上記の融合ベクターｐＳＰＡ１１とｐＳＰＡ１２、およ
びそれに対応した融合遺伝子（プラスミドｐＳＰＡ１３
とｐＳＰＡ１４を含有）はすべて、原料プラスミドｐＳ
ＰＡ１から派生したプロテインＡ遺伝子の上流のE.coli
残部（E.coliプロモーターを含む）を欠如している。
比較のために、プロテインＡの構造遺伝子の全体とプロ
テインＡのプロモーターを含むが、上流のE.coliプロモ
ーターは欠如しているプロスミドをつくる目的で工程II
Ｂからの2.1kbプロテインＡフラグメントを次のように
してプラスミドベクターｐＢＲ322にクローンした。
工程IIＢからの2.1kbプロテインＡフラグメント（精
製）１μｇを制限酵素TagＩを用いて６０℃、１時間か
けて切断（スタフイロコツカス由来のＤＮＡ内で）し
た。等容量のフエノールて抽出して酵素を失活さ、エー
テル抽出をくり返してから、エタノールでＤＮＡを沈で
んさせ、ＴＥ緩衝液に溶かした。プラスミドｐＢＲ322
１μｇを制限酵素ClaＩとEcoＲＶ（これらは同じように
して切断し、相補性の付着端をつくる）で切断して（Ba
mＨＩ緩衝液中、８７℃、１時間）から６５℃、１０分
間加熱して失活させた。このＤＮＡ試料を混合し、連結
し、上述の“方法手順”の項で述べたところに従つてE.
coliＨＢ101を形質転換した。組換え体をアンピシリン
（３５μｇ／ml）上にストリークした。コロニーをそれ
ぞれテトラサイクリン１０μｇ／ml、アンピシリン３５
μｇ／mlを含むプレートに採取した。アンピシリン上で
は生育するが、テトラサイクリン上では生育しないもの
を組換え体とした。これらの組換え体１２ケのコロニー
のうちの４ケはＥＬＩＳＡ法によりプロテインＡ(+)で
あることが判つた。これらのコロニーの一つについて制
限分析（純粋なプラスミドを１ケ、２ケまたは３ケの制
限酵素で切断）を行なつた。このｐＳＰＡ８と命名され
たプラスミドの制限地図を第４図に示した。これらのプ
ラスミドはプロテインＡ遺伝子の上流にE.coliプロモー
ターを欠いている。プロテインＡ遺伝子フラグメントの
前方にはそれ自身のスタフイロコツカスプロモーターの
みが存在する。
VII E.coliクローンからのプロテインＡの検出と定量 プラスミドｐＳＰＡ１３とｐＳＰＡ１４のプロテインＡ
活性を検定するために、セクシヨンVIで得たプラスミド
ｐＳＰＡ８（プロテインＡの構造遺伝子の全体を含む）
とプラスミドｐＳＫＳ106（β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を含む）を用いてプロテインＡ全含有量とIgG−セフ
アロースカラムへの結合能の比較を行なつた。
グルコースは不添加、アンピシリン３５μｇ／ml含むＬ
Ｂ培地にそれぞれプラスミドｐＳＫ105，ｐＳＰＡ８，
ｐＳＰＡ１３およびｐＳＰＡ１４を含む細胞懸濁物300m
lを培養してＯＤ５５０＝1.0にする。細胞培養物をSorv
allＧＳＡ−ローター（6000rpm、10分間）で遠心分離し
てＴＥ（0.05Ｍトリス、pH8.5,0.05Ｍ ＥＤＴＡ）で細
胞ペレツトを洗い、再び遠心分離した。最後に細胞ペレ
ツトを蛋白質インヒビツター緩衝液（0.02Ｍ リン酸カ
リウム、pH7.5,0.1ＭNacl,0.5％デオキシコール酸ナト
リウム、１％トリトンＸ−100、0.1％ソデイウムドデシ
ルサルフエート(SDS)、１ｍＭフエニルメチルスルフオ
ニルフルオライト（ＰＭＳＦ））の１５ml中に再懸濁さ
せた。ＭＳＥソニケーターで細胞を超音波処理（氷浴
上、３０秒、３回）して、15000rpmで１０分間遠心分離
（Sorvall SS-３４ローター）した。
Hjelmらの報告（ＦＥＢＳ Lett，２８（1972））に従
つてIgG−セフアロース４Ｂカラム（ＰＢＳＴ緩衝液
にて平衡にしたもの）に、上記で得られた上澄部を通過
させた。カラムをＰＢＳＴで洗滌してから吸着した蛋白
質を３mlのグリシン緩衝液（0.1Ｍグリシン、２％Nacl,
pH＝３）で溶離した。溶離液をＰＢＳＴで一夜透析して
ＥＬＩＳＡ法でプロテインＡの濃度を測定した。
得られる培養物がプロテインＡ−β−ガラクトシダーゼ
融合蛋白質を含有しているかどうかをみるために、修飾
テストを行なつた。プロテインＡ−アルカリホスフアタ
ーゼコンジユゲート（抱合体）を加える前にＯＮＰＧ緩
衝液100μをミクロタイタープレートのウエルに加
え、β−ガラクトシダーゼ活性を示す色の変化（無色か
ら黄色）を肉眼でチエツクした。ＰＢＳＴで３回洗滌
後、プロテインＡ−アルカリホスフアターゼコンジユゲ
ート５０μを加え、前記の方法手順で述べたところに
従つてテストを行なつた。結果を表１に示す。
この表で“全体量”とは細胞溶解物についての値で、
“溶離液”とはIgG−セフアロースに結合させ溶離し
たものについての値である。β−ガラクトシダーゼ活性
(-)とは室温下で３０分間インキユベートした後にまつ
たく色の変化のないことを示しており、同(+)とは同じ
条件下で５分後に肉眼にはつきり判る色の変化のあるこ
とを示している。
テストの結果から判る通り、対照（ｐＳＫＳ106）から
β−ガラクトシダーゼはIgG被覆ウエルに認識できる程
度の結合を生じない。これに対して、プラスミドｐＳＰ
Ａ１３とｐＳＰＡ１４とを含む培養物からの融合蛋白質
はウエルに結合し、酵素活性が明らかである。IgG−セ
フアロースカラムからのグリシン−緩衝液で溶離して
もβ−ガラクトシダーゼ活性は回収できなかつた（表１
参照）。これはpH４のグリシン緩衝液中で酵素が失活す
るためである。
ＥＬＩＳＡテストによると同じプロモーターをもつた同
じプロテインＡ遺伝子配列を用いても３つのプロテイン
Ａ含有クローン（ｐＳＰＡ８，ｐＳＰＡ１３，ｐＳＰＡ
１４）間でプロテインＡ濃度が異つている。プロテイン
Ａ遺伝子（ｐＳＰＡ１３とｐＳＰＡ１４）と融合したla
cＺ遺伝子をもつ２つのクローンではプロテインＡの含
有量がｐＳＰＡ８クローンのそれよりも少ない。しかし
プロテインＡ含有クローン（ｐＳＰＡ８，ｐＳＰＡ１
３，ｐＳＰＡ１４）のプロテインＡはIgG−セフアロー
スに結合し、グリシン緩衝液（pH＝３）で効率よく溶
離できる（表１）。しかしｐＳＰＡ１３とｐＳＰＡ１４
のβ−ガラクトシダーゼは非可逆的に失活する。
以上の結果によると目的酵素は粗細胞溶解物からIgG−
アフイニテイカラムに直接固定化される。このようにIg
GとプロテインＡの間に特異的なアフイニテイが有るた
めに一段階の工程で純粋な固定化酵素が得られる。
VIII E.coliクローンからのβ−ガラクトシダーゼ活性I
gG−セフアロースに固定した後の）の検出と定量 セクシヨンVIIで述べたと同様にしてプラスミドｐＳＫ
Ｓ106，ｐＳＰＡ８，ｐＳＰＡ１３，ｐＳＰＡ１４をも
つ細胞を培養し、分解（リゼート）した。上澄液１０ml
を沈降IgG−セフアロース４Ｂ（Pharmacia AB,Uppsal
a,スウエーデン）（ＰＢＳＴ緩衝液で洗滌）１mlと混和
した。混合物を８℃で、１時間処理して転化し、上澄液
を集めた。１２mlのＰＢＳＴで４回洗滌後、最終洗滌の
上澄部を集めた。セフアロースを１０mlのＰＢＳＴに
懸濁させてその一部を小形チユーブに移した。前述の手
法に従つてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果
は次の表に示す。
プラスミドｐＳＫＳ106を含む細胞からのβ−ガラクト
シダーゼ（対照）はIgG被覆ウエルへの結合能をもたな
い（工程VII）ためにIgG−セフアロースには結合しな
い。これに対してプラスミドｐＳＰＡ１３とｐＳＰＡ１
４を含む細胞からのβ−ガラクトシダーゼ（プロテイン
Ａ融合蛋白質）は効率よく結合し、実際に７０％以上の
固定化が起る。
プラスミドｐＳＰＡ１３を介してつくられた蛋白質分子
の非IgG−結合域（図２のＸ）を欠く融合蛋白質はプラ
スミドｐＳＰＡ１４を介してつくられたプロテインＡの
実質全部を含む融合生成物よりも３〜４倍も生成物が多
い。この場合“スペーサー”域Ｘはあまり役立つていな
い。
IX IgG−セフアロースに結合したβ−ガラクトシダー
ゼ−プロテインＡ融合蛋白質の溶離 工程VIIIで得られたIgG−セフアロース懸濁物（融合
蛋白質に結合）の一定量をカラムに移した。５０μの
沈降ゲルに種々の濃度の純プロテインＡ（Pharmacia,Up
psala,スウエーデン）を含む緩衝液0.5mlを加え（室
温）て融合蛋白質を溶離した。溶離後、溶離液とIgG−
セフアロースゲルのβ−ガラクトシダーゼ活性を前手
法で述べた通りにして測定した。結果を表３に示す。各
値はセフアロースに結合したβ−ガラクトシダーゼ活
性の％で表現した。
この結果から、β−ガラクトシダーゼ活性の少くとも半
分はこの操作で溶離される。
実施例II Ｉ プロテインＡをコードする遺伝子とＩＧＦ−１との
間の融合を含むシヤトルプラスミドの構築 次の工程Ａ−ＤはＸ領域をもたずプロテインＡ遺伝子を
含みかつ修飾ＩＧＦ−１（ヒトのインシユリン様生長因
子１型）とそれが融合した形のプラスミドｐＵＮ201の
構築に関するものである。
Ａ ヒトＩＧＦ−１をコードする遺伝子の合成とコロー
ニング 反応試薬としてＮ−保護ヌクレオチツドクロロフオスフ
アイト（Elmbladら、Nucleic Acids Res.10,3291-330
1）を用い、KabiGenＡＢ，スウエーデン（Chow他、Nucl
eic Acids Res.9,2807-2817）の開発した自動式ＤＮＡ
合成装置により第１３Ａ図に示すオリゴマーを合成し
た。
このオリゴマーは精製、リン酸化後第１３Ｂ図に示す７
つのブロツクに集められ、それらは第１３Ｂ図に示すよ
うに連結された。
最終工程でブロツクＡとブロツクＢが連結されＩＧＦ−
１遺伝子となる。この配列鎖はEcoＲＩとHind IIIの制
限酵素で消化され、精製後プラスミドｐＵＣ８に挿入さ
れE.coliＪＭ８３に形質転換された。この組換え体はＡ
１５をプローブとしてコロニー・ハイブリゼーシヨンに
よりスクリーニングされ、陽性コロニーの一つ（ＪＭ８
３／ｐＫＧ３と命名）の配列がＩＧＦ−１遺伝子とマツ
チすることが判つた。
ＩＧＦ−１遺伝子の合成についてはスウエーデン特許願
No.8303626-9に記載されているが、その開示内容を本願
の引用文献として挙げる。このＩＧＦ−１遺伝子のＤＮ
Ａ配列と対応するアミノ酸配列はグリシン残基（Gly）
がアスパラギン酸残基（Asp）に変つている（次の工程
Ｄ参照）ことを除いては第１１図に示す通りである。
Ｂ 修飾ヒト−ＩＧＦ−１をコードする合成遺伝子のin
vitro突然変異誘発 成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸残基をコードする部分を
変えるために、クローン合成ＩＧＦ−１遺伝子について
オリゴヌクレオチツド仲介in vitro突然変異誘発を行な
つた。このアミノ酸残基をグリシンからアスパラギン酸
に変えることによりアスパラギン酸−プロリンジペプチ
ツドが形成される。これによつて、精製の前後で蟻酸処
理（アスパラギン酸とプロリンの間を切断する）（Land
on,Methods in Enzymology47,132-145,1977）により分
断することのできるハイブリツド蛋白質をコードする遺
伝子融合が可能となる。かくてＮ−末端グリシンを欠如
した成熟ＩＧＦ−１が生成する。プラスミドｐＫＧ１０
μｇをEcoＲＩ，Hind IIIで分断し、0.22kbフラクシヨ
ンを５％ポリアクリルアミド（電気泳動後の）より切り
出した。国際出願PCT/SE83/00297（その開示内容は本願
の引例とする）に記載の方法に従つてこのフラグメント
を溶離し、精製した。精製後のフラグメント５０ngをフ
アージＭ１３mp 9 200ngと混合し、EcoＲＩ，Hind III
で分断した（全容量２０μ）．Ｔ4−リガーゼで処理
してからこのＤＮＡを用いてE.coliＪＭ８３を形質転換
し細胞をＡＸＩ−プレートにまいた。前述の手法に従つ
て分断、連結、形質転換を行なつた。白色のプラークか
らのフアージ精製も前述の手法に従つて行なつた。ユニ
バーサル・プライマー（Bio-Labs,New England,ＵＳ
Ａ）を用いてフアージ挿入が220bp合成ＩＧＦ−１遺伝
子であることを確認した。このフアージ（mp９／ＩＧＦ
−１と命名）を用いて、次の突然変異誘発を行なつた。
スウエーデン特許願No.8303626-9に従つて２つのオリゴ
ヌクレオチツドを合成し精製した。すなわち２４ケの塩
基（５′−GTGAATTCTATGGACCCCG-AAACT-３′）からなり
突然変異誘発に用いられるプライマーオリゴヌクレオチ
ツドと、１４ケの塩基（５′−AATTCTATGGACCC-３′）
からなり突然変異化フアージクローンをうまく同定する
のに用いられるプローブ(P)オリゴヌクレオチツドであ
る。合成ＩＦＧ−１遺伝子とプライマーとの間の不適正
は第９図に示す通りである。
mp９／ＩＦＧ−１の１６ｐモルとプライマー８０ｐモル
とを混合（全容８０μ，100mM Nacl,20mM Mgcl2,40mM
トリス−Hcl,pH7.5）した。この混合物を６５℃で３分
間加熱してら、２３℃に冷却（３０分間）した。氷浴に
移しH2O190μと、100mM Mgcl2,50mM DTT,20mMトリス
−Hcl,pH7.5の溶液３０μを加えた。クレノウフラグ
メント（Boehringher-Mannheim，西ドイツ）５０単位を
加えて氷浴上で１０分間放置してから試料を２３℃とし
た（３０分）。さらにクレノウフラグメント５０単位を
追加し２３℃で６０分間保持してからポリメラーゼを６
５℃、１０分間で失活させた。エタノールで沈でんさせ
EcoＲＩとHind IIIを用いて前述の方法で分断した。0.2
2kbフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル（電気
泳動後）から切り出し、このフラグメントをPCT/SE83/0
0297に記載の方法に従つて溶出し精製した。この精製フ
ラグメント５０ngをEcoＲＩ，Hind IIIで分割したフア
ージＭ１３mp９200ngと混合（全容２０μｇ）した。連
結（リゲーシヨン）後前述の方法でE.coliＪＭ８３を形
質転換し、青色プラークの背景の下、白色プラークを検
出した。白色のプラーク４８ケはさらに２つの合成プロ
ーブを用いて、Winterら（Nature299,1982年１０月２１
日）の方法でハイブリツト形成による分析を行なつた。
濾液を３２Ｐ−ラベルオリゴヌクレオチツドを用いて室
温下ハイブリツド化し、温度を色々に変えて洗滌した。
Ａ２プローブ；５′−ATGGGTCCCGAAAC-３′（スウエー
デン特許願No.8303626-9）を用いると、４ケを除いてク
ローンはすべて４４℃の洗滌後強いハイブリゼーシヨン
を示し、これらのクローンがオリジナルのＩＧＦ−１遺
伝子を含むことを証明した。プローブＰ，５′−AATTCT
ATGGACCC-３′を用いると先の４ケの陰性コロニーは顕
著なハイブリゼーシヨンを示した。この４ケのうち１ケ
（mp９／ＩＧＦ−１．Ｍ３と命名）についてユニバーサ
ル・プライマーを用い前述の方法を用いてその配列を調
べた。これは第９図の通り、突然変異誘発がうまく起つ
ていることを証明した。
フアージmp９／ＩＧＦ−１，Ｍ３200ngとプラスミドＰ
ＵＣ８200ngをEcoＲＩとHind IIIで別々に分割した。Ｔ
4−リガーゼで処理（全容２０μ）し、このＤＮＡを
用いてE.coliＪＭ８３を形質転換し、細胞をＡＸＩ−プ
レートにまいた。前述の方法で白色コロニーの制限分析
を行なつたところ予期した通り、0.22kb EcoＲＩ／Hind
III（挿入）を含んだｐＵＣ８プラスミドであることが
判つた。このプラスミドをｐＫＧ１１と命名し、次の工
程で使用した。
Ｃ ｐＫＧ１１を含むシヤトルプラスミドｐＵＮ200の
構築 工程ＢからのｐＫＧ１１ １μｇ（共にHind IIIで消
化）を混合し（全容100μ）、＋１４℃で一夜連結し
た。EcoＲＶで消化してから、このＤＮＡ混合物をE.col
iＨＢ101に形質転換し、５０μｇアンピシリン／mlを含
むＬＡプレートに採取した。５２ケのコロニーをクロラ
ムフエニコール１０μｇ／mlとアンピシリン５０μｇ／
mlを含有するＬＡプレートに採取した。２８℃で２日
後、一つのクローンが現れたので、そのプラスミドを制
限分析にかけた。第１０図に示すプラスミドｐＵＮ200
である。ＩＧＦ−１遺伝子を含むこのプラスミドはE.co
liとS.aureusの両者で複製できる。
Ｄ シヤトルプラスミドｐＵＮ201とｐＵＮ202の構築 ｐＵＮ200１μｇとプラスミドｐＳＰＡ１μｇ（いずれ
もEcoＲＩで消化）を混合（全容量100μ）し、連結し
た（１４℃、一夜）。このリガーゼを６５℃、１０分間
加熱して失活させた。EcoＲＶで消化してバツクグラン
ドクローン（ｐＳＰＡ１６含有）の数を減らしてからこ
のＤＮＡ混合物をE.coliＨＢ101に形質転換し、５０μ
ｇのアンピシリンを含むＬＡプレートにまいた。４８ケ
のクローンのプラスミドを制限地図により解析し、その
うちの３つが1.1kb EcoＲＩ挿入（ｐＳＰＡ１６より）
をもつｐＵＮ200（プロテインＡ遺伝子の５′−末端に
対応）を含むことが判つた。これらの３つのプラスミド
の挿入配向性をHind IIIで分断して分析し、このうちの
２つがプロテインＡをコードする遺伝子とＩＧＦ−１の
間に予測通り融合を有することが判つた。このプラスミ
ドはｐＵＮ201と命名された（第１０図）。このヌクレ
オチツド配列とこの遺伝子融合の推測アミノ酸配列を第
１１図に示した。この成熟ハイブリツド蛋白質の分子量
は38701と推測される。
これら３つのクローンのうち一つは（ｐＵＮ202と命
名）ＩＧＦ−１遺伝子に対して反対の方向にプロテイン
Ａ遺伝子をもつている（第１０図）。このプラスミドは
分子量30963で、トランケートプロテインＡをコードす
る（第１２図）。
IIシヤトルプラスミドｐＵＮ201，ｐＵＮ202によるS.au
reusＳＡ113の形質転換 工程ＩＤからのプラスミドｐＵＮ201とｐＵＮ202の１０
μｇを用いGotz，Ｆらの方法（J.Bacteriol.145,７４−
８１（1981））と“国際特許出願PCT/SE83/00297”の方
法に従つてS.aureusＳＡ113を形質転換した。（工程III
Ａ）３７℃、３日後にクロラムフエニコール耐性クロー
ンを検出し、これらの組換え体をクロラムフエニコール
（10μｇ／ml）を含むＴＳＡ−プレート（Trypticase S
oy Agar）に画線した。それぞれのプラスミド（ｐＵＮ2
01，ｐＵＮ202）について一ケの組換え体を選んで、さ
らに分析を行なつた。純粋なプラスミドの制限地図によ
りS.aureusＳＡ113宿主にインタクトプラスミドが導入
されたことが判つた。
IIIｐＵＮ201とｐＵＮ202をもつクローンからのプロテ
インＡ活性の定量と位置決定 それぞれｐＵＮ200，ｐＵＮ201，ｐＵＮ202（工程Ｉ
Ｃ，Ｄからのもの）を含むE.coli細胞とｐＵＮ201また
はｐＵＮ202を含むS.aureus細胞を液体培地200mlで一夜
培養した。E.coli株はアンピシリン（５０μｇ／ml）を
含むＬＢ培地で培養し、S.aureus株はクロラムフエニコ
ール（１０μｇ／ml）を含むＴＳＢ（Trypticase Soy B
roth）で培養した。SorwallＧＳＡ−ローターで6000rp
m、１０分間遠心分離して細胞をペレツトとし、上澄培
地は保存した。細胞ペレツトをＰＢＳ＋ＴＷＥＥＮ１０
mlで洗滌しもう一度遠心分離した。次に、細胞ペレツト
をプロテアーゼインヒビツター緩衝液〔0.02Ｍリン酸カ
リウム、pH7.5,0.1ＭNacl,0.5％デオキシコール酸ナト
リウム、１％トリトンＸ−100,0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）、１ｍＭフエニルメチルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）〕１０mlに再懸濁させた。この
細胞を氷浴上でＭＳＥソニケーターで超音波処理（４０
秒、４回）し、15000rpmで１０分間（SorvallＳＳ−３
４ローター）遠心分離した。上澄の細胞抽出物を集めＥ
ＬＩＳＡ−テストで前述の手法に従つて試料のプロテイ
ンＡの量を測定した。結果は表４に示す通りである。
表４はE.coli,S.aureusのいずれの場合も、得られるプ
ロテインＡの量はプロテインＡ遺伝子含有フラグメント
（プラスミドｐＵＮ201対ｐＵＮ202）の配向によつて影
響されないことを示している。すなわち、ｐＵＮ201で
コードされるプロテインＡＩＧＦ−１ハイブリツド蛋白
質はｐＵＮ202でコードされるトランケートプロテイン
Ａとほぼ同じレベルでつくられる。両方の蛋白質は期待
通りE.coliの細胞抽出物とS.aureusの培地で見出され
た。
IV IgG−アフイニテイクロマトグラフイーと蟻酸処理で
ＩＧＦ−１の精製 工程IIIから得られた、それぞれｐＵＮ201とｐＵＮ202
を含むS.aureusＳＡ113の培地をそれぞれ、予め酢酸ナ
トリウム緩衝液（0.1Ｍ酢酸ナトリウム、２％Nacl,pH＝
5.5）で平衡にしたIgG−セフアロース４Ｂカラム（Ph
armaciaＡＢ，Uppsala，スウエーデン）〔Hjelmら、Ｆ
ＥＢＳLett.２８，７３−７６（1972）〕に通した。カ
ラムを同じ緩衝液で洗滌してからグリシン緩衝液（0.1
Ｍグリシン、２％Nacl,pH＝3.0）で吸着プロテインＡを
溶離した。溶出フラクシヨンを蒸溜水で透析してから２
つに分けて凍結乾燥した。そのうちの一つについて１３
％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析（100Ｖ、１
２時間）した。アミドブラツク（0.1％、４５％メタノ
ール−１０％酢酸中）で発色した。ｐＵＮ210について
は分子量38701の蛋白質が、ｐＵＮ202については分子量
30963の蛋白質が主要部であることが判つた。これはＤ
ＮＡ配列から推測される大きさと一致する（ＩＤ工程参
照）。
もう一つの試料については７０％蟻酸0.5mlに懸濁し、
３７℃で２日間インキユベートした。この処理でアスパ
ラギン酸−プロリンの間のジペプチド鎖が分断される。
ｐＵＮ201でコードされた蛋白質から得られた分解生成
物は、Ｎ−末端グリシンを欠くＩＧＦ−１部とは別に、
５つのオリゴペプチド（分子量6800,6600,6600,6600お
よび600）からなる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動は、前述の通り主要蛋白質バンドが約38000から700
0附近の数ケのバンドへとシフトすることを示してい
る。
蟻酸で処理した蛋白質を凍結乾燥し、蒸溜水に再懸濁し
た。ｐＵＮ201からの試料は前述の通りIgG−セフアロー
ス４Ｂカラムに通した。通過液と溶出物（グリシン緩
衝液と共に）は次の分析にとつておいた。
Ｖラジオレセプターアツセイ（ＲＲＡ）による蛋白質生
成物の分析 ヒト胎盤膜の粒フラクシヨンをマトリツクスとしてHall
ら（J.clin.Endocrinol.Metab.４８，271-278(1974)）
の方法に従つてラジオレセプターアツセイ（ＲＲＡ）を
行なつた。標準試料として力価が一単位(U)ＩＧＦ／ml
の正常ヒト血清を用いた。ラベルに用いたペプチドはCo
hnフラクシヨン１Ｖから精製（500μ／mg蛋白質（ＲＲ
Ａによる））で）した。ペプチドのラベル化はThorell
ら（Biochem.Biophys.Acta 251,363-369(1971))の方法
で行なつた。トレーサーはカルボキシメチルセルロース
カラムを用いグラデイエント（0.1ＭNH4OAcでpH4.0から
6.8に）法で溶離し、精製した。トレーサーの活性はほ
ぼ２０μci／μｇの値であつた。次の方法でアツセイを
行なつた。
標準試料または未知（被検）試料（100μ）胎盤膜100
μ、ラベルＩＧＦ−１100μと一緒に４℃で一夜イ
ンキユベートした。遠心分離後ペレツトを一回洗滌し、
α−カウンターで測定した。“インハウス”コンピユー
タープログラムで力価の計算をした。
工程IVの試料の蟻酸処理前後のものについて、ＲＲＡテ
ストでの分析を行ない、表５に示す結果を得た。
表５から判る通り、ｐＵＮ201でコードしたハイブリツ
ド蛋白質にはＩＧＦ−１活性がみられなかつた。蟻酸処
理でＩＧＦ−１活性が生じ、この活性の大部分はIgGア
フイニテイカラムに結合せず、プロテインＡとＩＧＦ−
１部との間にうまく分断の起ることを示した。
以上実施例によつて本発明を説明したが、本発明はこれ
ら実施例によつて限定されるものではなく、請求の範囲
から逸脱しない範囲内で多くの変更、修飾の可能である
ことは勿論である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スジエクイスト、ジヨーン スウエ−デン国、エス−752 52ウプサラ、 ローゼンヴエーゲン ９ (56)参考文献 特開 昭54−92696（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−45395（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ・Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．73，Ｐ．343−351（1977) Ｅｕｒ・Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．78，Ｐ．471−490（1977)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】目的とする蛋白質またはポリペプチドをコ
    ードするＤＮＡ配列と免疫グロブリンの定常領域に結合
    しうるプロテインＡをコードするＤＮＡ配列を調節可能
    に連結し、両ＤＮＡ配列がいっしょに、目的とする蛋白
    質またはポリペプチドとプロテインＡとのＩｇＧに結合
    し得る融合生成物をコードする組換えベクターをつく
    り； この組換えベクターを用いて、上記融合蛋白質またはポ
    リペプチドをコードする結合ＤＮＡ配列が宿主により発
    現されるように適合性宿主を形質転換し、そして適当な
    生長培地中で形質転換された宿主を培養して上記融合蛋
    白質またはポリプチドを生産させ； キャリアー物質上に固定化されたＩｇＧのＦｃ−部に吸
    着させることにより上記融合蛋白質またはポリペプチド
    を選択的に単離し； 所望により、上記ＩｇＧ−支持キャリアーから融合蛋白
    質またはポリペプチドを脱着させる；工程からなること
    を特徴とする、目的の蛋白質またはポリペプチドまたは
    それらの誘導体を製造し選択的に分離する方法。
  2. 【請求項２】培養宿主の細胞溶解物または生長培地を用
    いて融合蛋白質またはポリペプチドを単離することを特
    徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】結合ＤＮＡ配列でコードされる融合蛋白質
    またはポリペプチドが、前記プロテインＡ部分と前記目
    的蛋白質またはポリペプチド部分との間に目的蛋白質な
    らびに、好ましくはプロテインＡ部分には存在しない特
    異的切断部位を有しており、融合蛋白質またはポリペプ
    チドの残部がキャリアーに吸着されるときまたはそれを
    キャリアーから脱着した後のいずれかにおいて、前記目
    的蛋白質またはポリペプチド部を融合蛋白質またはポリ
    ペプチドの残部から分断することを特徴とする請求の範
    囲第１項または第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記特異的分断部位がプロテアーゼ、ヒド
    ロキシルアミン、臭化シアンまたは蟻酸からなる群から
    選ばれた分割剤に対して感受性のアミノ酸またはアミノ
    酸配列であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】プロテインＡをコードする機能的ＤＮＡ配
    列と、このプロテインＡをコードする配列のいずれかの
    ストップコドンの前方に位置するマルチリンカー配列と
    を含む発現ベクターをつくり；前記目的蛋白質またはポ
    リペプチドをコードするＤＮＡ配列を上記マルチリンカ
    ー配列の適当な制限部位に挿入し；所望によりプロテイ
    ンＡをコードするＤＮＡ配列と目的蛋白質またはポリペ
    プチドをコードするＤＮＡ配列との間に前記特異的分断
    部位をコードするＤＮＡ配列を挿入し、かつ好ましくは
    前記分断部位コード配列を発現ベクター挿入前に該発現
    ベクターまたは目的蛋白質またはポリペプチドコードベ
    クターの接合末端として調製することを特徴とする請求
    の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】キャリアーを低ｐＨ条件、高い塩類濃度条
    件、カオトロピツクイオンでの処理、または過剰の可溶
    性プロテインＡ，ＩｇＧまたはそれらのフラグメントの
    競合溶離に付することによって、該融合蛋白質またはポ
    リペプチドをキャリアーから脱着することを特徴とする
    請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。
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