ES2257734T3 - Activacion de los receptores de oligomerizacion por medio de los ligandos de receptores fusionados. - Google Patents
Activacion de los receptores de oligomerizacion por medio de los ligandos de receptores fusionados.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA ACTIVAR RECEPTORES SELECCIONADOS DE QUINASAS DE TIROSINA RECEPTORAS, RECEPTORS DE CITOQUINA Y MIEMBROS DE LA SUPERFAMILIA RECEPTORA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE LOS NERVIOS. SE CONTACTA UN CONJUGADO, COMPRENDIENDO LA FUSION DIRECTA DE, AL MENOS, DOS LIGANDOS CAPACES DE UNIRSE A LOS RECEPTRES A ACTIVAR, CON RECEPTORES, Y DE ESTA FORMA LOS LIGANDOS UNEN SUS RESPECTIVOS RECEPTORES, INDUCIENDO LA OLIGOMERIZACION RECEPTORA.
Description
Activación de los receptores de oligomerización
por medio de los ligandos de receptores fusionados.
Esta solicitud se refiere a conjugados para la
activación de un receptor. Más particularmente, la invención implica
conjugados para la oligomerización inducida por ligando de
receptores de superficie celular. La invención se refiere además a
procedimientos para realizar variantes de ligando que actúen como
agonistas de los ligandos nativos respectivos y a quimeras de
ligando-inmunoglobulina.
Muchos polipéptidos, como por ejemplo el factor
de crecimiento, los factores de diferenciación y las hormonas,
median sus acciones uniéndose a receptores de la superficie celular
y activándolos. Aunque el mecanismo de la activación del receptor
varía según el par receptor-ligando específico y a
menudo no se comprende completamente, es una característica común de
muchos receptores que necesiten formar oligómeros para activarse, o
que su actividad por dicha formación de oligómeros. Los receptores
del factor de crecimiento con actividad tirosina quinasa (receptores
tirosina quinasa) y determinados receptores de citocinas son
representantes típicos de dichos recepto-
res.
res.
Los receptores con actividad tirosina quinasa
tienen una topología molecular similar. Todos poseen un dominio de
unión a ligando extracelular, un domino transmembrana hidrófobo y un
dominio citoplásmico que contiene un dominio catalítico tirosina
quinasa y que se puede además clasificar basándose en la similitud
de secuencia y en las características estructurales distintivas
[Hanks, S.K. y col., Science 241, 42-52 (1988);
Yardan, Y. y Ollrich, A., Annu. Rev. Biochem. 57,
443-478 (1988)]. Los receptores monoméricos subclase
I tienen dos secuencias de repetición ricas en cisteína en el
dominio extracelular; los receptores subclase II tienen estructuras
tipo s2b2 heterotetraméricas unidas por enlaces disulfuro con
secuencias de repetición ricas en cisteína similares, mientras que
los dominios extracelulares de los receptores de subclase III y IV
tienen cinco o tres repeticiones tipo inmunoglobulina,
respectivamente. Por ejemplo, a esta familia pertenecen los
receptores de insulina, de factor de crecimiento epidérmico (EGF),
de factor de crecimiento derivado plaquetario (PDGF), de factor de
crecimiento tipo insulina (IGF-I), de factor 1
estimulador de colonias (CSF-1), y de factor de
crecimiento hepatocítico (HGF).
Debido a su configuración, uno puede imaginarse a
los receptores tirosina quinasa como enzimas alostéricos asociados
a la membrana. Como en estos receptores, a diferencia de las enzimas
hidrosolubles, el dominio de unión al ligando y el dominio
catalítico tirosina quinasa (con actividad tirosina quinasa sobre
proteínas) están separados por la membrana plasmática; la
activación del receptor producida por la unión del ligando
extracelular debe traducirse por la barrera que es la membrana, para
activar las funciones del dominio intracelular.
Según un modelo de oligomerización de receptores
alostéricos, la unión del ligando y la alteración conformacional
resultante del domino extracelular inducen la oligomerización del
receptor, que a su vez, estabiliza las interacciones entre dominios
citoplasmáticos adyacentes y conduce a la activación de la función
quinasa por interacción molecular. La oligomerización de receptores
permite la transmisión de un cambio conformacional desde el dominio
extracelular hasta el dominio citoplasmático sin la necesidad de
alterar la posición de los residuos aminoacídicos del dominio
transmembrana. Los receptores inactivos monoméricos están en
equilibrio con los receptores activados oligoméricos. La unión de
los factores de crecimiento a sus receptores correspondientes
estabiliza un estado oligomérico que posee una afinidad de unión al
ligando potenciada y una actividad tirosina quinasa elevada
[Schlessinger, J., J. Cell Biol. 103, 2067-2072
(1986); Yarden, Y. y Schlessinger, J., Biochemistry 26,
1434-1442 (1987); Yarden, Y. y Schlessinger, J.,
Biochemistry 26, 1443-1451 (1987)]. Se Schlessinger,
J., Trends Biochem. Sci. 13, 443-447 (1988) se
describe un modelo de oligomerización de receptores alostéricos más
general.
La oligomerización de receptores que, por
simplicidad, se ilustra comúnmente como una dimerización de
receptores, puede inducirse mediante ligandos monoméricos, como el
EGF, que induce cambios conformacionales que resultan en
interacciones receptor-receptor [Cochet, C. y col.,
J. Biol. Chem. 263, 3290-3295 (1988)]. Los ligandos
bivalentes, como el PDGF y el CSF-1 median la
diberización de receptores adyacentes [Heldin, C.H. y col., J. Biol.
Chem. 264, 8905-8912 (1989); Hammacher, A. y col.,
EMBO J. 8, 2489-2495 (1989)].
La universalidad de este modelo de activación de
receptores para todos receptores tirosina quinasa está respaldada
por informes sobre la construcción de receptores quiméricos
funcionales compuestos por los dominios principales de diferentes
subclases de receptores tirosina quinasa [Riedel, H. y col., EMBO J.
8, 2943-2954 (1989)]. Aunque en algunos casos
también se ha demostrado la formación de heterodímeros entre
receptores muy similares estructuralmente [Hammacher, A. y col.,
citado con anterioridad para los receptores PDGF tipo a y tipo b;
Soos, M.A. y Siddle, K., Biochem. J. 263, 553-563
(1989) para los receptores de insulina y IGF-1],
aunque no hay una prueba directa disponible de que tales recetores
híbridos sean efectivamente funcionales. En general, la complejidad
de estos sistemas asociados a membrana y la falta de una cantidad
suficiente de receptores naturales o recombinantes altamente
purificados han obstaculizado un análisis más detallado de las
alteraciones estructurales y de las necesidades de los cambios en
los receptores tirosina quinasa inducidos por ligando.
Para una revisión general de la transducción de
señales por los receptores con actividad tirosina quinasa, véase
Ullrich, A. y Schlessinger, J., Cell 81, 203-212
(1990), y Bormann, B.J. y Engelman, D.M., Annu. Rev. Biophys.
Biomol. Struct. 21, 223-266 (1992), y la
bibliografía citada en dichos artículos.
El receptor de HGF (HGFr), es un receptor
tirosina quinasa recientemente descubierto, que ha sido
identificado como el producto del protooncogén c-MET
[Bottaro y col., Science 251, 802-804 (1991);
Naldini y col., Oncogene 6, 501-504 (1991)]. MET
originalmente fue identificado como un gen transformador en una
línea celular de sarcoma osteogénico tratado químicamente que había
sufrido una traslocación cromosómica [Park, M. y col., Cell 45,
895-904 (1986)]. El HGFr maduro es un heterodímero
unido por puentes disulfuro que procede del procesamiento
proteolítico de un precursor de 190 kDa glicosilado en una subunidad
a de 50 kDa y una subunidad b de 145 kDa [Giordano, S. y col.,
Oncogene 4, 1383-1388 (1989)]. La subunidad a es
extracelular y la subunidad b contiene una región extracelular, un
dominio transmembrana único y un dominio tirosina quinasa. En
células normales, la unión de HGF es necesaria para activar la
actividad tirosina quinasa de HGFr. La proteína HGFr se fosforila
en los residuos de tirosina de la subunidad de 145 kDa al unirse
HGF.
La oligomerización de receptores (dimerización)
también parece ser crítica para la señalización de ciertos
receptores de citocinas particularmente en una superfamilia
recientemente descubierta de receptores transmembrana únicos,
denominada superfamilia de los receptores hematopoyéticos [Bazan, y
col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 788-795
(1989); D'Andrea, A.D., y col., Cell 58, 1023-1024
(1989); Gearing, D.P. y col., EMBO J. 8, 3667-3676
(1989); Itoh, N. y col., Science 247, 324-327 (190);
Idzerda, R. L. y col., J. Exp. Med. 171, 861-873
(1990); Godwin, R.G. y col., Cell 60, 941-951
(1990); Fukunaga, R. y col., Cell 61, 341-350
(1990); Bazan, J.F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87,
6934-6938 (1990); Patthy, L., Cell 61,
13-14 (1990); Abdel-Meguid, S.S. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84, 6434-6437
(1987); De Vos y col., Science 255, 306-312 (1992);
Cosman, D. y co., Trends Biochem. Sci. 15, 265-270
(1990)]. Los miembros de esta superfamilia incluyen a los
receptores de la hormona del crecimiento (GH), de la prolactina
(PRL), del lactógeno placentario (PL) y de otras citocinas y otros
receptores hematopoyéticos, como por ejemplo, los receptores de las
interleucinas 1 a 7 (IL-1, IL-2, la
subunidad b también se conoce como p75, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7), eritropoyetina (EPO), factor estimulador de
colonias granulocíticas (G-CSF), factor estimulador
de colonias macrofágicas (M-CSF) y factor
estimulador de colonias granulocíticas-macrofágicas
(GM-CSF). Estos receptores contienen dominios de
unión a ligando extracelulares homólogos y dominios intracelulares
altamente variables que no son homólogos con ninguna tirosina
quinasa conocida ni ninguna otra proteína.
Recientemente Cunningham, B.C. y col., Science
254, 821-825 (1991) publicaron pruebas de que la
dimerización es importante para la activación de hGH y otros
receptores de citocinas. Para analizar las necesidades
estructurales y el mecanismo de cambios inducidos por hormonas en
hGH, los autores usaron el dominio extracelular de un receptor de
gGH (proteína de unión a hGH, hGHbp) producida en altas cantidades
en E. coli. Los resultados de cristalización, cromatografía
de exclusión por tamaño, estudios de calorimetría y ensayos de
enfriamiento y fluorescencia mostraron que hGH forma un complejo
1:2 con el dominio extracelular de hGHbp. Basándose en estos y
otros estudios se concluyó que hGH contiene dos sitios diferentes
funcionales para unirse a dos sitios solapantes en el hGHbp para
formar el complejo hGH (hGHbp)^{2}, y que la formación de
un complejo receptor dimérico análogo en la superficie celular es
crítica para el mecanismo de transducción de la señal de hGH y
probablemente receptores de citocinas homólogos. El mecanismo de
dimerización de receptores se confirmó al descubrir que un análogo
a hGH sin el sitio de unión al segundo receptor (y por lo tanto
incapaz de dimerizar hGHbp) tenía una afinidad de unión al receptor
reducida y una regulación a la baja hasta saturación también
reducida.
Otro ejemplo es la superfamilia de superfamilia
de receptores relacionados con el receptor del factor de
crecimiento nervioso (NGFR), como los receptores del factor de
necrosis tumoral (TNF) TNFR-I y
TNFR-II, los productos de los genes Fas y Aps, y
varios antígeno de superficie de linfocitos T y B. Actualmente,
incluida en esta superfamilia están NGFR, que se encuentra en las
neuronas, el antígeno CD40 de los linfocitos B, el antígeno MRC
OX-40, que es un marcador de linfocitos T activados
de fenotipo CD4, TNFR-I y TNFR-II
que se encuentra en una variedad de tipos celulares, un ADNc
(4-1BB) que codifica una proteína de función
desconocida y se obtiene de clones de linfocitos T, y
SFV-T2, una pauta de lectura abierta del virus del
fibroma Shope. Los miembros de esta familia se caracterizan por
tres o cuatro motivos ricos en cisteína de aproximadamente 40
aminoácidos en el dominio extracelular de la molécula, y en algunos
casos por una región tipo bisagra pero sin otros tipos de dominios.
Funcionalmente, es normal que los miembros de esta superfamilia de
receptores que han caracterizado hace tanto tiempo sean capaces de
reaccionar con más de un ligando, y que estos ligandos sean
poliméricos por naturaleza. Se ha demostrado que los receptores de
TNF se activan por oligomerización porque se descubrió que los
anticuerpos anti TNFR bivalentes activaban a los TNFR pero no los
fragmentos monovalentes de anticuerpo (fragmentos Fab') [Engelman,
H. y col., J. Biol. Chem. 265, 14497-14504 (1990), y
la bibliografía que se cita]. Se sugirió que un trímero
TNF-a podía activar la transducción de la señal
entrecruzando dos moléculas de TNFR de la superficie celular
[Ashkenazi, A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88
10535-10539 (1991)]. De modo similar, los productos
de los genes Fas y Aps se pueden activar con anticuerpos.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar procedimientos para producir una oligomerización de
receptores inducida por ligando.
Es otro objeto proporcionar procedimientos para
hacer variantes de ligando que actúen como agonistas competitivos de
los ligandos nativos correspondientes.
Es además otro objeto proporcionar procedimientos
para recuperar sustancialmente la actividad biológica del ligando
perdida como resultado de una mutación.
Es otro objeto adicional proporcionar
procedimientos para convertir en agonistas los ligandos que sean
antagonistas competitivos de la acción de sus homólogos nativos.
Es otro objeto de la invención el incrementar la
semivida de los ligandos.
La presente invención está basada en las
observaciones obtenidas con una serie de variantes de huHGF
recombinantes (rhuHGF). La forma madura de huHGF, que corresponde
con la principal forma purificada a partir de suero humano, es un
heterodímero unido por puentes disulfuro derivado de un corte
proteolítico de la prohormona humana entre los aminoácidos R494 y
V495. Este proceso de corte genera una molécula compuesta por una
subunidad a de 440 aminoácidos (Mr 69 kDa) y una subunidad b de 234
aminoácidos (Mr 34 kDa). La secuencia nucleotídica del ADNc de hHGF
revela que tanto la cadena \alpha como la cadena \beta están
incluidas en una sola pauta abierta de lectura que codifica un
preproproteína precursora. En la estructura primaria teórica del
hGHF maduro, se forma un puente S-S entre las
cadenas entre la Cys 487 de la cadena \alpha y la Cys 604 de la
cadena \beta. El extremo N terminal de la cadena \alpha está
precedido de 54 aminoácido, que comienzan con un grupo metionina.
Este segmento incluye una señal guía hidrófoba característica de 31
residuos y la prosecuencia. La cadena \alpha comienza en el
aminoácido (aa) 55, y contiene cuatro dominios Kringle. El dominio
1 Kringle se extiende entre aproximadamente el aa 128 hasta
aproximadamente el aa 206, el dominio 2 Kringle está entre
aproximadamente el aa 211 y aproximadamente el aa 288, el dominio 3
Kringle se extiende por definición entre aproximadamente el aa 303
hasta aproximadamente el 383, el dominio 4 Kringle se extiende desde
aproximadamente el aa 391 hasta aproximadamente el aa 464 de
la
cadena \alpha.
cadena \alpha.
Las variantes rhuHGF se produjeron para
determinar la importancia estructural y funcional del corte de la
prohormona en el dímero a/b y de los dominios Kringle y tipo
proteasa. Se realizó una serie de truncamientos en el extremo C
terminal de huHGF delecionando la cadena \beta o la cadena \beta
además de un número progresivo de dominios Kringle, y se
introdujeron mutaciones en el sitio de corte de la cadena uno y de
la cadena dos, o en el dominio protea-
sa.
sa.
Algunas de las variantes huHGF conservaban la
capacidad de unirse a su receptor (HGFr) con alta afinidad, pero no
tenían actividad biológica HGF (mitogénica), y mostraron una
reducida capacidad de inducir la fosforilación de HGFr.
Se ha descubierto que se pueden hacer proteínas
quiméricas con una conformación correcta que comprendan la fusión
de dichas moléculas variantes HGF a la secuencia de un dominio
constante de una inmunoglobulina y que tales quimeras mantienen la
capacidad de unirse al HGFr.
Se ha descubierto además que la actividad
biológica de las variantes HGF que antes eran capaces de unirse a
su receptor pero que carecían o presentaban una actividad biológica
sustancialmente reducida tipo HGF en comparación con la huHGF
silvestre, se podría recuperar sustancialmente en forma de quimeras
de variante HGF-inmunoglobulina.
Aunque el mecanismo por el que la unión de HGF a
HGFr activa la tirosina quinasa intracelular no es del todo
comprendido, pero se cree que la activación del receptor por las
quimeras de variante HGF-inmunoglobulina probada se
debió a la capacidad estructural de los dímeros de la cadena pesada
de la inmunoglobulina de inducir la dimerización del receptor. Los
ligandos HGF acoplados (oligomerizados) por otros procedimientos,
por ejemplo, a través de puentes entre cisteínas, pueden inducir la
activación del receptor de forma análoga.
Otros receptores que requieren una
oligomerización para obtener una actividad biológica (completa)
también se pueden activar a través de secuencias de ligando
oligomerizadas (por ejemplo, dimerizadas), como por ejemplo por
moléculas quiméricas que comprendan el(los) dominio(s)
de unión al receptor de los ligandos nativos correspondientes o de
los nativos fusionados a una secuencia del dominio constante de una
inmunoglobulina. Tales receptores incluyen otros receptores con
actividad tirosina quinasa, como por ejemplo los receptores de
insulina, EGF, PDGF, IGF-1, CSF-1;
citocinas, por ejemplo, miembros de la superfamilia de receptores
hematopoyéticos, como por ejemplo hGH. hPRL, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
eritropoyetina, G-CSF, M-CSF, y
GM-CSF; y miembros de la superfamilia NGFR, como
por ejemplo GFR, TNFR-I,
TNFR-II.
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un conjugado para su uso en un procedimiento para el tratamiento
terapéutico de un paciente, comprendiendo el conjugado un primer
ligando unido mediante un enlazador heterólogo a un segundo
ligando, en el que el enlazador heterólogo es diferente de cualquier
enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo; el ligando
no es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento
hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un
antígeno para dicho anticuerpo; el primer y segundo ligando son
capaces de unirse a la primera y a la segunda molécula de receptor
del factor de crecimiento hepatocítico, respectivamente, en el que
la primera y la segunda molécula receptora son capaces de
oligomerizar la una con la otra; y en la que el conjugado es capaz
de activar un receptor del factor de crecimiento hepatocítico.
El enlazador heterólogo puede comprender, por
ejemplo, una secuencia de un dominio constante y/o variable de una
inmunoglobulina, un residuo de un agente reticulante no proteináceo,
un puente disulfuro entre el primer y el segundo ligando o una
secuencia espaciadora polipeptídica.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a un procedimiento para hacer un agonista de un ligando
nativo de un receptor del factor de crecimiento hepatocítico que
comprende la dimerización de una primera variante de ligando capaz
de unirse al receptor o de acoplarse la primera variante con una
segunda variante de ligando capaz de unirse al receptor.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a una molécula quimérica que comprende una fusión de un
primer ligando capaz de unirse a un receptor del factor de
crecimiento hepatocítico con una primera secuencia de un dominio
constante de una inmunoglobulina, y una fusión de un segundo ligando
capaz de unirse a dicho receptor con una segunda secuencia de un
dominio constante de una inmunoglobulina.
La figura 1 es una representación esquemática de
las subunidades a y b de huHGF. En la cadena \alpha se muestra la
secuencia de la señal (región con un recuadro) que incluye los
aminoácidos 1 - 31, el dedo teórico y cuatro dominios Kringle, cada
uno con sus tres puentes disulfuro respectivos. El sitio de corte
para la generación de la forma heterodimérica a/b de huHGF está
inmediatamente después del residuo R494 de corte P1. Este último
residuo se ha sustituido específicamente con otro E. D o A para
generar variantes de cadena sencilla HGF. La cadena \beta,
después del sitio de corte, tiene homología con las serina
proteasas. Se ha propuesto que las cadenas a y b se mantienen
juntas con un solo puente disulfuro entre C487(a) y
C604(b) (Nakamura y col., 1989, citado con anterioridad). Se
han sustituido tres residuos en la cadena \beta individualmente o
junto con la reconstitución de residuos auténticos de una serina
proteasa. A continuación se describen las representaciones
esquemáticas de las formas maduras de las variantes con truncamiento
en el extremo C terminal. El N-207, eliminado
después del primer Kringle; el N-303, eliminado
después del segundo Kringle; N-384, eliminado
después del tercer Kringle y la cadena \alpha. Además se muestran
las variantes en las que se introdujeron las deleciones de cada uno
de los Kringles (\DeltaK1, \DeltaK2, \DeltaK3 y \DeltaK4).
En cada caso, las deleciones eliminaron específicamente todo el
Kringle de C1 a C6. La figura 2 muestra los resultados de la
inmunotransferencia tipo Western del rhuHGF silvestre y las
variantes de cadena sencilla. Los medios acondicionados a partir de
células 293 con transfección simulada o las células 293 estables que
expresan o el rhuHGF silvestre (WT) o las variantes R494E, R494A o
R494D se volvieron a fraccionar en condiciones reductoras en un gel
de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8%, y se
transfirieron por adsorción. Se hizo reaccionar la transferencia
con un antisuero anti-HGF policlonal que reconoce
principalmente los epítopos de la cadena \alpha. Las masas
moleculares (kilodalton) de los marcadores están indicadas. También
se indican las posiciones de la cadena \alpha y de las formas de
huHGF de la cadena sencilla sin cortar. Apréciese que el anticuerpo
policlonal tiene una reacción cruzada con una banda no identificada
(*) presente incluso en las bandas de las células 293 transfectadas
como control, que no expresan cantidades detectables de huHGF.
Figura 3: Actividad mitogénica (A) y capacidad de unión competitiva
al receptor (B) de un rhuHGF silvestre (WT) y variantes de cadena
sencilla. (A) La actividad biológica se determinó por la capacidad
del rhuHGF WT y de las variantes de inducir la síntesis de ADN en
un cultivo de hepatocitos de rata como se describe en el ejemplo 2.
Se muestra el rpm promedio por duplicado de un ensayo
representativo. El sobrenadante simulado de las células control no
estimuló la síntesis de ADN en estas células (no hubo un aumento del
rpm sobre los niveles basales). (B) Para realizar la unión
competitiva, se incubaron varias diluciones de sobrenadantes de
células 293 humanas con un rhuHGF wt o sus variantes con 50 pM de
la proteína de fusión receptor de huHGF-IgG como se
describe en el ejemplo 2. Los datos representan la inhibición de la
unión como el porcentaje de cualquier ligando competidor de un
experimento representativo y se corrigieron restando los niveles
basales del control de las células 293. Figura 4:
Inmunotransferencia tipo Western de la fosforilación de la tirosina
inducida por ligando de la subunidad b de 145 kDa del receptor de
HGF por un rhuHGF silvestre, o variantes de huHGF de cadena sencilla
o de dominio proteasa. Se prepararon lisados de unas células A549
incubadas durante 5 minutos sin (-) o con 200 ng/ml de rhuHGF
silvestre purificado (WT), variantes de cadena sencilla (R494E) o
dobles proteasas (Y673S, V692S) y se inmunoprecipitaron con un
anticuerpo anti receptor de HGF y se revelaron con anticuerpos anti
fosfotirosina. Las masas moleculares (kilodalton) son las que se
indican. Figura 5: Expresión y estructuras propuestas de las
quimeras de HGF-IgG. A. Electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones
reductoras. B. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
(SDS-PAGE) en condiciones no reductoras. Calle M:
células 293 control (Simuladas); Calle 1: NK2-IgG;
Calle 2: HGF-IgG; Calle 3:
Y673S,V692S-IgG; Calle 4: R494E
HGF-IgG. C. Estructuras propuestas de las quimeras
de variante HGF-IgG. Figura 6: Ensayo de unión
competitiva. Se analizaron los sobrenadantes del cultivo celular de
las células 293 que expresan el rhuHGF silvestre y varias quimeras
de variante huHGF-IgG para comprobar su capacidad de
bloquear la unión de rhuHGF 125I expresado en células CHO al
dominio extracelular del HGFr humano fusionado a la región constante
Fc de una IgG1 humana, expresada y secretada a partir de células
293. Figura 7: Ensayo de asimilación de
timidina-H^{3}. Se analizaron los medios
acondicionados de células 293 que expresan rhuHGF silvestre y varias
quimeras de variantes de rhuHGF-IgG para comprobar
el efecto mitogénico en un ensayo de asimilación de
timidina-H^{3}. Simulada: células 293 de control.
Figura 8: Perfil del plásmido de expresión pf-NK1.
Para la expresión en bacterias de HGF/NK1, se usó un plásmido de
expresión que contiene el promotor de la fosfatasa alcalina (phoA)
acoplado a la secuencia codificadora del péptido guía stII para
obtener una secreción directa de la proteína expresada en el espacio
periplásmico. La secuencia codificadora del epítopo Flag se incluyó
para realizar un seguimiento de la expresión y de los pasos de
purificación. Esta secuencia Flag está seguida de la secuencia
codificadora del HGF/NK1 maduro (segmento sombreado) tal y como se
indica. Se muestra el ADN correspondiente y la secuencia
aminoacídica del péptido guía stII, el epítopo Flag (cursiva) y las
porciones HGF/NK1 (extremo N y C terminal, negrita). Figura 9:
Diagrama de flujo de la purificación de HGF/NK1 y del
fraccionamiento de la mezcla heparina-sefarosa por
cromatografía de intercambio catiónico con el sistema FPLC Mono S.
Se dializó la proteína eluida de la columna de
heparina-sefarosa con un gradiente de NaCl frente
una solución de acetato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCl 0,25 M y se
cargó una parte de esta solución en la columna de intercambio
catiónico con el sistema FPLC Mono S equilibrada con el mismo
tampón. Se usó un gradiente lineal desde 0,25 M hasta 1,5 M de NaCL
para eluir la proteína unida, y se recogieron fracciones de
aproximadamente 1,5 ml. Se muestra la absorbancia a 280 nM. Las
fracciones 6-9 se combinaron y se usaron en otros
experimentos. Figura 10: Análisis SDS-PAGE de los
extractos bacterianos crudos y muestras purificadas de HGF/NK1. Las
masas moleculares (kilodalton, kDa) de los marcadores se indican a
la izquierda de cada gel, y la posición de la migración de HGF/NK1
se muestra a la derecha. (A) Se muestras los resultados con lisados
celulares totales de células sin inducir (calle 1) y de células en
las que se indujo la expresión de HGF/NK1 (calles
2-6) por privación de fosfato. Las calles
2-6 muestran muestras del ciclo de fermentación que
se recogieron a una D.O: (550 nm) de 1,0; 7,2; 39; 66 y 72
respectivamente. Se fraccionaron cantidades iguales de extractos
proteicos de cada muestra en condiciones reductoras y se detectaron
con tinción con coomassie. (B) Los análisis de inmunotransferencia
tipo Western de los lisados crudos de células de E. coli
27C7 con el vector de expresión de HGF/NK1 (calles 1 y 3) o células
27C7 control con sólo el pBR322 (calles 2 y 4) se analizaron en
condiciones no reductoras y en condiciones reductoras tal y como se
indica. Las proteínas que tienen el epítopo FLAG se detectaron como
se describe en el ejemplo 7. (C) Se analizaron las fracciones de la
cromatografía tipo FPLC Mono S 7-11 mostradas en las
calles 1-5, respectivamente, en condiciones
reductoras. La proteína se detectó con tinción de plata. (D) Las
proteínas con el epítopo Flag presentes en las fracciones FPLC 1,
3, 5, 7, 9, 11, y 13 (calles 1-7) se detectaron como
en 10B. Figura 11: Unión competitiva de HGF etiquetado con
I^{125} en presencia de rhuHGF o HGF/NK1 al receptor HGF soluble
purificado (A) o al receptor HGF de células A549 (B). La unión se
realizó en presencia de 50 pM de radioligando y las concentraciones
indicadas de competidor sin marcar. Se muestran las curvas de
desplazamiento representativas del HGF-I^{125}
por los rhuHGF, HGF/NK1, y el Kringle 4 del plasminógeno (K4 plas)
purificado sin marcar radiactivamente tal y como se indica. La
unión se realizó en presencia de 100 pM de radioligando y las
concentraciones indicadas de competidor sin marcar. Las constantes
de disociación (kd) determinadas a partir de estos tres
experimentos independientes fueron 0,10 +/- 0,02 nM para rhuHGF y
1,10 +/- 0,04 nM para HGF/NK1 al receptor de HGF soluble (A), y
0,21 +/- 0,04 nM para rhuHGF y 1,60 +/- 0,08 nM para HGF/NK1 (B) al
receptor de células A549. Figura 12: Inmunotransferencia tipo
Western de la fosforilación inducida por ligando de la subunidad b
de 145 kDa del receptor de HGF por el rhuHGF silvestre (A) y el
HGF/NK1 purificado (B). Se prepararon los lisados de las células
inducidas e incubadas durante 15 minutos con los factores
anteriormente indicados y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo
anti receptor. Las inmunotransferencias tipo Western preparadas a
partir del gel SDS-PAGE se incubaron con la sonda
con los anticuerpo anti fosfotirosina. Las masas moleculares (kDa)
son las que se indican. Figura 13: Efecto del HGF/NK1 solo (A) o
junto con el rhuHGF (B) sobre la síntesis de ADN en un cultivo
primario de hepatocitos. Los hepatocitos se expusieron a
concentraciones crecientes de rhuHGF o HGF/NK1 solo (A) o
concentraciones crecientes de HGF/NK1 junto con una concentración
fija de HGF (0,64 nM que corresponde a la cantidad de HGF requerida
para un 50% de incorporación de timidina-H^{3},
B). Se muestran las curvas representativas de tres experimentos
independientes. Como control, se probó un Kingle 4 del plasminógeno
purificado para neutralizar la actividad de HGF.
Para el propósito de la presente invención, el
"receptor" es un receptor del factor de crecimiento
hepatocítico, cuya activación o señalización potencial está mediada
por oligomerización, con independencia del mecanismo real por el
cuál se induce la oligomerización del receptor, en el que
"oligomerización" incluye específicamente la dimerización así
como la formación de oligómeros mayores.
El término "citocina" es un término genérico
para aquellas proteínas, liberadas por una población de células,
que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Entre
las citocinas se incluyen la hormona del crecimiento, los factores
de crecimiento tipo insulina, las interleucinas, la hGH, la
N-metionil hGH, la hormona de crecimiento bovina,
la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina,
la relaxina, las hormonas glicoproteicas, como por ejemplo, la
hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora
del tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH), el factor de
crecimiento hematopoyético, el HGF, el factor de crecimiento
fibroblástico, la prolactina, el lactógeno placentario, el factor de
necrosis tumoral a y b (TNF-\alpha y -\beta),
la sustancia inhibición muelleriana, el péptido asociado a la
gonadotropina de ratón, la inhibina, la activina, el factor de
crecimiento del endotelio vascular, la integrina, la trombopoyetina,
los factores de crecimiento neuronal, como por ejemplo
NGF-\beta, PDGF, factores de crecimiento
transformadores TGF) como por ejemplo, TGF-\alpha
y TGF-\beta, factor de crecimiento tipo insulina 1
y 2 (IGF-1 y IGF-2),
eritropoyetina, factores osteoinductores, interferones (IFN) como,
IFN-\alpha, IFN-\beta y
IFN-\gamma, factores estimladores de colonias
(CSF) como, M-CSF, GM-CSF, y
G-CSF, interleucinas (IL), como
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8 y otros factores
polipeptídicos. Los receptores de citocinas son receptores que se
unen a las citocinas previamente definidas.
Las expresiones "receptor con actividad
tirosina (proteína) quinasa" y "receptor tirosina quinasa"
y otras variantes gramaticales, se usan indistintamente y se
refieren a receptores que tienen típicamente un gran dominio
extracelular de unión al ligando, una sola región transmembrana
hidrófoba y un dominio catalítico con actividad tirosina quinasa,
que se pueden clasificar en subclases (subclases
I-IV según el conocimiento actual) basándose en la
similitud de su secuencia y en las características estructurales
distintivas como se define en Schlessinger, J. (1988) citado con
anterioridad, y Ullrich, A. y Schlessinger, J. (1990), citado con
anterioridad. Entre otras secuencias altamente conservadas de
función desconocida, el dominio tirosina quinasa de estos recetores
contiene una secuencia de consenso
Gly-X-Gly-X-X-Gly-X(15-20)Lys
que funciona como parte del centro de unión de ATP. Las tirosina
quinasas de los receptores catalizan la fosforilación de sustratos
exógenos así como residuos de tirosina en sus propias cadenas
polipeptídicas. Esta familia incluye el receptor de la insulina
(insulina-R), el receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGF-R), los receptores A y B del factor
de crecimiento derivado de
plaquetas(PDGF-R-A y -B), el
receptor del factor de crecimiento tipo
insulina(IGF-1-R), el
receptor 1 del factor estimulador de
colonias(CSF-1-R), el
receptor del factor de crecimiento hepatocítico (HGFr), HER2/neu,
HER3/c-erbB-3, IRR, Xmrk y los
receptores del factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGF) y
básico FGF, denominados flg y bek. El mecanismo de oligomerización
implica la posible existencia de complejos híbridos entre
receptores estructuralmente muy similares como por ejemplo,
PGDF-R-A y -B, EGF-R
y HER2/neu, o insulina-R y
IGF-1-R [Hammacher y col. (1989),
citado con anterioridad; Soos, M.A. y Siddle, K., Biochem. J. 263,
553-563 (1989)].
EGF-R puede servir como modelo de
receptor de subclase I con la actividad tirosina quinasa activada
por un ligando monovalente. EGF-R es un polipéptido
de cadena sencilla de aproximadamente 170.000 kDa compuesto por un
gran dominio de unión a ligando extracelular, una sola región
transmembrana hidrófoba y una región citoplasmática con actividad
intrínseca tirosina quinasa sobre proteínas (Ullrich, A. y col.,
Nature 309, 418-425 (1984)]. Yarden y Schlessinger
[Biochemistry 26, 1434-1442 (1987); Biochemistry 24,
1443-1451 (1987)] demostraron que el
EGF-R purificado sufre una oligomerización rápida y
reversible inducida por EGF y que la oligomerización del receptor
es una propiedad intrínseca de EGF-R. Cochet, C. y
col obtuvieron resultados similares en células vivas.
[J. Biol. Chem. 263, 3290-3295
(1988)]. Basándose en anteriores estudios sobre la estructura y la
función y los datos iniciales de la caracterización por microscopía
electrónica del dominio extracelular purificado del receptor de
EGF, en Ullrich, A. y Schlessinger, J. (1990), citado con
anterioridad, se propuso un modelo de cuatro dominios para la
organización de la región extracelular del receptor de EGF. En este
modelo, se propone que el "dominio III y el ``dominio I"
contribuyen principalmente a los determinantes que hacen que el
receptor interacciones específicamente con su ligando (EGF o factor
de crecimiento transformador \alpha o
TGF-\alpha) y se sugiere que la región de unión a
EGF radica en el espacio formado entre los dominios III y I
HER2/neu [Lee, J. y col., EMBO J. 8, 167-173 (1989);
Hazan, R. y col., Cell. Growth Differ. 1, 3-7
(1990)], HER3/c-erbB-3 [Kraus, M.H.
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 9193-9197
(1989)] y Xmrk [Wittbrodt, J. y col., Nature 341,
415-421 (1989)] pertenecen a esta subclase.
Los representantes típicos de receptores con
actividad tirosina quinasa de la subclase II son el
insulina-R y IGF-1-R
[Ullrich y col., Nature 313, 756-761 (1985); Ullrich
y col., EMBO J. 5, 2503-2512 (1986); Ebina, Y. y
col., Cell 40, 747-758 (1985); Perdue, J.F., Can. J.
Biochem. Cell. Biol. 62, 1237-1245 (1984); Rechler,
M.M. y Nissley, S.P., Ann. Rev. Physiol. 47, 425-442
(1985), y la bibliografía citada en estos artículos de revisión;
Lee y col., Mol. Endocrinol. 2, 404-422 (1988);
Wilson y col., Mol. Endocrinol. 2, 1176-1185
(1988); Morgan y col., Nature 329, 3071-3072
(1987)]. La capacidad de unión del ligando a estos receptores, que
tienen una estructura heterotetramérica [Lammer, R. y col., EMBO J.
8, 1369-1375 (1989); Czech, M. Cell 59,
235-238 (1989)], induce una interacción alostérica
de las dos mitades ab en el complejo receptor estabilizado por el
puente disulfuro [Ullrich, A. (1990), citado con anterioridad]. Esta
subclase también incluye IRR, un receptor putativo de un ligando de
la familia de la insulina [Shier, P. y Watt, V.M., J. Biol. Chem.
264, 14605-14608 (1989)].
Los receptores con actividad tirosina quinasa de
subclase III unen ligandos diméricos que median la dimerización con
receptores adyacentes. Esta subclase está representada por
receptores de PDGF-A y -B, y CSF-1.
La PGDF humana aparece bajo tres isoformas que están formadas por
cadenas A y B unidas por puentes disulfuro. Las isoformas se unen a
dos receptores celulares de superficie diferentes pero
estructuralmente relacionados.
PGDF-R-A y
PGDF-R-B. El receptor de tipo A une
las tres isoformas PGDF-AA, PGDF-AB,
y PGDF-BB), mientras que el receptor de tipo B une
sólo PGDF-BB y PGDF-AB. Se ha
sugerido que PDGF es un ligando bivalente que activa a su receptor
por dimerización [Hammacher, A. y col., EMBO J. 8,
2489-2495 (1989)], y se ha demostrado que la
dimerización se produce después de la unión del ligando y está
estrechamente asociada con la activación de la quinasa del receptor
[Heldin, C-H y col., J. Biol. Chem. 264,
8905-8912 (1989)].
La subclase IV de los receptores con actividad
tirosina quinasa incluye los recientemente descritos receptores de
FGF ácido (FGF-R flg) y FGF básico
(FGF-R bek) (Ruta, M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 86, 8722-8726 (1989) y Pasquale, E. B. y
Singer, S.J., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86,
5449-5453 (1989), y la bibliografía citada en
dichos artículos]. Estos receptores presentan tres repeticiones de
secuencia relacionadas en sus dominios extracelulares, y presentan
una débil pero significativa homología con la región correspondiente
del receptor de IL-1.
La expresión "la superfamilia del receptor de
la hematopoyetina" se usa para definir receptores transmembrana
de paso único, con una arquitectura de tres dominios: un dominio
extracelular que une el ligando activador, un segmento
transmembrana corto y un dominio que reside en el citoplasma. Los
dominios extracelulares de estos receptores tienen una baja pero
significativa homología con sus dominios extracelulares de unión al
ligando que comprenden aproximadamente 200-210
aminoácidos. La región homóloga se caracteriza por cuatro residuos
de cisteína localizados en el extremo N terminal de la región, y un
motivo
Trp-Ser-X-Trp-Ser
(WSXWS) localizado justo fuera del dominio transmembrana. En
Cosman, D. y col., (1990), citado con anterioridad, se ofrecen
detalles estructurales y funcionales adicionales de estos tres
receptores. Los receptores de IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
prolactina, lactógeno placentario, hormona del crecimiento
GM-CSF, G-CSF,
M-CSF y eritropoyetina, por ejemplo, han sido
identificados como miembros de esta familia de receptores.
La oligomerización inducida por
IL-2 de un receptor de IL-2, se ha
descrito, por ejemplo, en Ogura, T. y col., Mol. Biol. Med. 5,
123-13 (1988). Demostraron que la unión con alta
afinidad de IL-2 a su receptor da lugar a la
formación de un complejo ternario, que comprende la subunidad a del
receptor de IL-2 (p55), la subunidad b (p75,
también conocida como el "conversor" e IL-2,
por un enlace cruzado químico) En Cunningham, B.C. y col., (1991),
citado con anterioridad, se propone la dimerización del dominio
extracelular de hGH-R por una sola molécula de hGH
como un hecho relevante para el mecanismo de transducción de señales
del receptor de hGH y otros receptores de citocinas
relacionados.
La expresión "superfamilia del receptor del
factor de crecimiento nervioso" (NGFR) se usa para describir una
familia de proteínas de membrana por la presencia de motivos ricos
en cisteína originalmente identificados en el NGFR de baja
afinidad. Esta superfamilia, descrita por primera vez en Mallett, S.
y Barclay, A. N., citado con anterioridad, incluye dos receptores
del factor de necrosis tumoral (TNFR-I y
TNFR-II) dos proteínas de linfocitos de función aún
sin determinar.
Los términos "primer receptor" y "segundo
receptor" se usan en esta memoria descriptiva y en las
reivindicaciones para designar receptores capaces de formar
heterooligómeros (heterodímeros) in vivo como resultado de
la activación del receptor inducida por ligando. Tales receptores
normalmente se localizan en tipos celulares similares
(preferentemente idénticos), y pueden, pero no es necesario,
presentar una homología estructural. En una forma de realización
específica, el primer y el segundo receptor presentan al menos
aproximadamente un 75% de homología y preferentemente al menos
aproximadamente un 80%, más preferentemente al menos un
aproximadamente 85% de homología en sus dominios activos, y
preferentemente tienen funciones fisiológicas similares. Antes se
ha mencionado que entre los receptores podrían existir complejos
heterorreceptores como por ejemplo
GDF-R-A y -B, EGF-R
y HER2/neu, o insulina-R e
IGF-1-R. Los receptores de HGF y una
proteína tipo HGF codificada por un gen recientemente identificado
en el locus DNF15S2 del cromosoma 3 humano 3p21) [Han, S. y col.,
Biochemistry 30, 9768-9780 (1991)] también son
candidatos para formar heterodímeros. La formación de heterodímeros
entre dos receptores se puede detectar con procedimientos
habituales de química analítica, por ejemplo, electroforesis en gel
no desnaturalizante. En un procedimiento preferente, la interacción
de los receptores se puede estabilizar usando un agente reticulante
covalente, esencialmente como se describe para EGF-R
en Cochet, C. y col. (1988), citado con anterioridad, y los
receptores entrecruzados y unidos covalentemente se pueden analizar
en una electroforesis en gel con SDS.
El término "ligando" se usa para designar
una molécula orgánica o un péptido o una secuencia polipeptídica
capaz de unirse específicamente a un receptor como previamente se ha
definido. La definición incluye cualquier ligando nativo de un
receptor o cualquier región o derivado que mantenga al menos una
capacidad de unión al receptor cualitativa. Se excluyen
específicamente de esta definición (agonista y antagonista) los
anticuerpos contra un receptor y los conjugados no covalentes de un
anticuerpo y un antígeno de dicho anticuerpo.
En las moléculas usadas según la presente
invención, el primer y el segundo ligando pueden ser idénticos o
diferentes, e incluyen dos dominios de unión a receptor diferentes
de los de un ligando bivalente nativo, o al menos los dominios de
unión al receptor de dos ligandos idénticos o diferentes para el
mismo receptor o dos diferentes, y derivados de dichas secuencias
nativas de unión al receptor. Se ha propuesto que podrían existir
complejos híbridos entre receptores estructural y funcionalmente
similares como parte del mecanismo de activación de la
oligomerización. Dichos receptores son, por ejemplo, los receptores
de PDGF tipo A y tipo B, EGF-R y HER2/neu,
insulina-R e
IGF-1-R. En algunos casos, al
formación de heterodímeros ya ha sido demostrada [Hammacher y col.
(1989), citado con anterioridad; Soos y Siddle (1989), citado con
anterioridad]. Las moléculas que comprenden los dominios de los
ligandos de unión al receptor para tales receptores estrechamente
relacionados, están específicamente incluidos en el alcance de la
presente memoria descriptiva.
El término "derivado" se usa para definir la
secuencia aminoacídica y las variantes de glicosilación y las
modificaciones covalentes de un ligando nativo.
El término "variante" se usa para definir la
secuencia aminoacídica y las variantes de glicosilación de un
ligando nativo.
Los términos "ligando nativo" y "ligando
silvestre" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia
aminoacídica del ligando que aparece de modo natural ("ligando de
secuencia nativa"), incluyendo las formas maduras, prepro y pro
de tales ligandos, purificados a partir de un origen natural,
sintetizados químicamente o producidos recombinantemente. Se
comprenderá que existen variantes alélicas naturales y que éstas
pueden aparecer en los individuos, como se demuestra en una o más
diferencias en la secuencia aminoacídica de cada individuo. Estas
variaciones alélicas entran específicamente en el alcance de la
presente memoria descriptiva.
Los términos "aminoácido" y
"aminoácidos" se refieren a todos los
L-\alpha-aminoácidos naturales.
Los aminoácidos se identifican con una sola letra o con
denominaciones de tres letras.
\newpage
| Asp | D | ácido aspártico | Ile | I | isoleucina |
| Thr | T | treonina | Leu | L | leucina |
| Ser | S | serina | Tyr | Y | tirosina |
| Glu | E | ácido glutámico | Phe | F | fenilalanina |
| Pro | P | prolina | His | H | histidina |
| Gly | G | glicina | Lys | K | lisina |
| Ala | A | alanina | Arg | R | arginina |
| Cys | C | cisteína | Trp | W | triptófano |
| Val | V | valina | Gln | Q | glutamina |
| Met | M | metionina | Asn | N | asparragina |
Estos aminoácidos se pueden clasificar según la
composición química y las propiedades de sus cadenas laterales. Se
clasifican en dos grandes grupos generales, con carga y sin carga.
Cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los
aminoácidos con más precisión:
Residuos ácidos: ácido aspártico, ácido
glutámico
Residuos básicos: lisina, arginina,
histidina
Residuos hidrófilos: serina, treonina,
asparragina, glutamina
Residuos alifáticos: glicina, alanina,
valina, leucina, isoleucina
Residuos apolares: cisteína, metionina,
prolina
Residuos aromáticos: fenilalanina,
tirosina, triptófano.
El término "variante de secuencia
aminoacídica" se refiere a moléculas con diferencias en sus
secuencias aminoacídicas en comparación con una secuencia
aminoacídica nativa. Normalmente, las variantes de secuencia
aminoacídica poseerán al menos aproximadamente un 70% de homología
con al menos un dominio de unión al receptor de un ligando nativo,
y preferentemente, tendrán al menos aproximadamente un 80%, más
preferentemente al menos aproximadamente un 90% de homología con un
dominio de unión al receptor de un ligando nativo. Las variantes de
secuencia aminoacídica poseen sustituciones, deleciones y/o
inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia
aminoacídica del ligando nativo.
Se define "homología" como el porcentaje de
residuos en la secuencia aminoacídica candidata que son idénticos a
los residuos de la secuencia aminoacídica de un dominio de unión al
receptor de un ligando nativo tras alinear las secuencias e
introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje
de homología máximo. Los procedimientos y programas informáticos
para establecer dicha alineación son bien conocidos en la
técnica.
Las variantes por sustitución son en las que al
menos se elimina un residuo aminoacídico de una secuencia nativa y
se inserta un aminoácido diferente su lugar y en la misma posición.
Las sustituciones pueden ser únicas, en las que sólo se sustituye
un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se
sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Las variantes por inserción son aquellas en las
que se inserta uno o más aminoácidos inmediatamente después de un
aminoácido en una posición particular de la secuencia nativa de un
ligando. Inmediatamente después de un aminoácido significa
conectado al grupo funcional \alpha-carboxi o
\alpha-amino del aminoácido.
Las variantes por deleción son aquellas en las
que se elimina uno o más aminoácidos de la secuencia aminoacídica
nativa del ligando. Normalmente, las variantes por deleción tendrán
uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la
molécula.
El término "variante por glicosilación" se
usa para referirse a un ligando con un perfil de glicosilación
distinto del ligando nativo. La glicosilación de polipéptidos es
generalmente por enlace tipo N o tipo O. Por enlace tipo N se
refiere al anclaje del residuo glucídico en la cadena lateral de un
residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptidos
asparragina-X-serina y
asparragina-X-treonina, en las que X
es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de
reconocimiento para las uniones enzimáticas del residuo glucídico a
la cadena lateral de asparragina. La glicosilación por enlace tipo O
se refiere al anclaje de uno de los azúcares:
N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un
hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también
se puede utilizar 5-hidroxiprolina y
5-hidroxilisina. Cualquier diferencia en la
localización y/o naturaleza de los residuos glucídicos presentes en
un ligando en comparación con su homólogo nativo está incluida en
el alcance de la presente memoria descriptiva.
El patrón de glicosilación de los ligandos
nativos se puede determinar por técnicas muy conocidas de química
analítica, incluyendo la cromatografía HPAE [Hardy, M.R. y col.,
Anal. Biochem. 170, 54-62 (1988)], methylation
analysis to determine glycosyl-linkage composition
[Lindberg, B., Meth. Enzymol. 28, 178-195 (1972);
Waeghe, T.J. y col., Carbohydr. Res. 123, 281-304
(1983)), espectroscopía por RMN, espectrometría de masas, etc.
Por comodidad, los cambios en el patrón de
glicosilación de un ligando nativo por lo general se realizan a
nivel del ADN, esencialmente usando las técnicas abordadas
previamente con respecto a las variantes de secuencia
aminoacídica.
La adición química o enzimática de glicósidos a
los ligandos de la presente invención también puede usarse para
modificar o incrementar el número o el perfil de los grupos
glucídicos. Estos procedimientos tiene la ventaja de que no
necesitan producir el polipéptido que sea capaz de glicosilarse por
enlace tipo O (o tipo N). Dependiendo del modo de adición usado,
el(los) glúcido(s) se puede enlazar a (a) arginina e
histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c), grupos hidroxilo
libres como por ejemplo, de cisteína, (d) grupos sulfidrilo libres
como los de la serina, treonina, o la hidroxiprolina, (e) residuos
aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f)
el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en
el documento 87/05330 (publicado el 11 de septiembre de 1987), y en
Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs.
259-306
Los residuos glucídicos presentes en un ligando
también se puede eliminar química o enzimáticamente. La
desglicosilación química requiere la exposición al ácido
trifluorometansulfónico o a un compuesto equivalente. Este
tratamiento produce la escisión de la mayoría o de todos los
glúcidos, salvo el glúcido de enlace, mientras que el polipéptido
queda intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin
y col., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) y en Edge y col.,
Anal. Biochem. 118, 131 (1981). Los residuos glucídicos se pueden
eliminar usando varias endo y exoglicosidasas como se describe en
Thotakura y col., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987). La glicosilación
se suprime con tunicamicina como se describe en Duskin y col., J.
Biol. Chem. 257, 3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación
de los enlaces N-glicosídicos de las proteínas.
Las variantes por glicosilación de los ligandos
de la presente memoria descriptiva también se pueden producir
seleccionando las células hospedadoras apropiadas. La levadura, por
ejemplo, introduce una glicosilación que varía significativamente
de la de los sistemas de mamíferos. De modo similar, habitualmente
se analizan células de mamífero con un origen diferente de la
fuente del ligando, ya sea de especie (por ejemplo, hámster,
murino, insecto, porcino, bovino u ovino) o de tejido (por ejemplo,
pulmón, hígado, linfático, mesenquimal o epidérmico), para
comprobar su capacidad de introducir un patrón de glicosilación
variante.
Los términos "variante de ligando" y
"ligando variante", que se usan indistintamente, incluyen
tanto variantes de secuencia aminoacídica como variantes de
glicosilación de un ligando nativo.
Los "derivados covalentes" incluyen
modificaciones de un ligando nativo con un agente derivatizante
orgánico proteináceo o no proteináceo, y modificaciones
postraduccionales. Las modificaciones covalentes tradicionalmente
se introducen haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos diana
del ligando con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de
reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los
residuos terminales, o por mecanismos tipo arnés de modificaciones
postraduccionales que funcionan en las células hospedadoras
recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes
son útiles en los programas dirigidos a la identificación de
residuos importantes para la actividad biológica, para
inmunoanálisis, o para la preparación de anticuerpo anti ligando
para purificar por inmunoafinidad la glicoproteína recombinante.
Tales modificaciones son conocidas por cualquier experto en la
materia y para su realización no es necesaria mucha experiencia.
Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la
acción de las células hospedadoras recombinantes sobre el
polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparraginilo
frecuentemente se desamidan tras la traducción a los residuos
glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos
residuos se desamidan en condiciones levemente ácidas. Cualquier
forma de estos residuos puede estar presente en los ligandos usados
según la presente invención. Otras modificaciones postraduccionales
incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, fosforilación
de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la
metilación de los grupos \alpha-amino de las
cadenas laterales de la lisina, la arginina y la histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86
(1983)].
Los derivados covalentes específicamente incluyen
las moléculas de fusión en las que los ligandos de la invención se
unen covalentemente a polímeros no proteináceos. El polímero no
proteináceo normalmente es un polímero hidrófilo sintético, es
decir un polímero que no se encontraría en la naturaleza. Sin
embargo, son útiles los polímeros que existen en la naturaleza y se
producen por procedimientos recombinantes o in vitro, ya que
son polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de
polivinilo hidrófilos están incluidos en el alcance de esta
invención, por ejemplo alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona.
Son particularmente útiles los éteres de polivinilalquileno como
por ejemplo, el polietilenglicol (macrogol) o
polipropilenglicol.
Los ligandos se pueden unir a varios polímeros no
proteináceos, como por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol
o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes de EE.UU.
Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó
4.179.337.
Los ligandos nativos y los derivados que pueden
activar receptores según la presente invención son muy conocidos en
la técnica o se pueden preparar con procedimientos muy conocidos en
la técnica.
La operabilidad de la presente invención se
demostró primero con los pares receptor/ligando HGFr/HGF o HGF
variante. Inicialmente se identificó a HGF como un mitógeno en
hepatocitos [Michalopoulos y col., Cancer Res. 44,
4414-4419 (1984); Russel y col., J. Cell. Physiol.
119, 183-192 (1984) y Nakamura y col., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 122: 1450-1459 (1984)]. En
Nakamura y col., citado con anterioridad, se describió la
purificación de HGF a partir de suero de ratas parcialmente
hepatectomizadas. Posteriormente, HGF se purificó a partir de
plaquetas de rata, y se determinaron sus subunidades estructurales
[Nakamura y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 83,
6489-6493 (1986); y Nakamura y col., FEBS Letters
224, 311-316 (1987)]. La purificación de HGF humana
(huHGF) a partir de plasma humano se describió por primera vez en
Gohda y col., J. Clin. Invest. 81, 414-419
(1988).
Se ha subclonado tanto la HGF de rata como la
huHGF, incluyendo la clonación y secuenciación de una variante
natural que carece de 5 aminoácidos denominada "\Delta5 HGF"
[Miyazawa y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163,
967-973 (1989); Nakamura y col., Nature 342,
440-443 (1989), Seki y col, Biochem. y Biophys.
Res. Commun. 172, 321-327 (1990); Tashiro y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 3200-3204 (1990);
Okajima y col., Eur. J. Biochem. 193, 375-381
(1990)].
La forma madura de huHGF, que corresponde con la
principal forma purificada a partir de suero humano, es un
heterodímero unido por puentes disulfuro derivado de un corte
proteolítico de la prohormona humana entre los aminoácidos R494 y
V495. Este proceso de corte genera una molécula compuesta por una
subunidad a de 440 aminoácidos (Mr 69 kDa) y una subunidad b de 234
aminoácidos (Mr 34 kDa). La secuencia nucleotídica del ADNc de hHGF
revela que tanto la cadena \alpha como la cadena \beta están
incluidas en una sola pauta abierta de lectura que codifica un
preproproteína precursora. En la estructura primaria teórica del
hGHF maduro, se forma un puente S-S entre las
cadenas entre la Cys 487 de la cadena \alpha y la Cys 604 de la
cadena \beta (véase Nakamura y col., Nature, citado con
anterioridad). El extremo N terminal de la cadena \alpha está
precedido de 54 aminoácidos, comenzado con un grupo metionina. Este
segmento incluye una señal guía hidrófoba característica de 31
residuos y la prosecuencia. La cadena \alpha comienza en el
aminoácido (aa) 55, y contiene cuatro dominios Kringle. El dominio
1 Kringle se extiende entre aproximadamente el aa 128 hasta
aproximadamente el aa 206, el dominio 2 Kringle está entre
aproximadamente el aa 211 y aproximadamente el aa 288, el dominio 3
Kringle se extiende por definición entre aproximadamente el aa 303
hasta aproximadamente el 383, el dominio 4 Kringle se extiende
desde aproximadamente el aa 391 hasta aproximadamente el aa 464 de
la cadena \alpha. Se comprenderá que la definición de los varios
dominios Kringle está basada en su homología con los dominios tipo
Kringle de otras proteínas (protrombina, plasminógeno), por lo
tanto, los límites anteriores son sólo aproximaciones. Por ahora,
no se ha determinado la función de estos dominios Kringle. La cadena
\beta de huHGF tiene una alta homología con el dominio catalítico
de las serina proteasas (38% de homología con el dominio serina
proteasa del plasminógeno). Sin embargo, dos de los tres residuos
que forma la tríada catalítica de serina proteasas no están
conservadas en HGF. Por lo tanto, a pesar de su dominio tipo serina
proteasa, hHGF no parece tener actividad proteolítica y todavía se
desconoce el papel preciso de la cadena \beta. HGF contiene
cuatro sitios de glicosilación putativos, que se localizan en las
posiciones 294 y 402 de la cadena \alpha y en las posiciones 566
y 653 de la cadena \beta.
En una porción de ADNc aislado a partir de
leucocitos humanos se observó una deleción de 15 pares de bases en
pauta de lectura. La expresión temporal de la secuencia de ADNc en
células COS-1 reveló que la molécula HGF codificada
(\DeltaHGF) que carecía de 5 aminoácidos en el dominio 1 Kringle
era totalmente funcional (Seki y col., citado con
anterioridad).
Recientemente se ha identificado una variante
natural de huHGF que corresponde al transcrito de huHGF de ayuste
alternativo que contiene las secuencias codificadoras del dedo N
terminal y los dos primeros dominios Kringle del huHGF maduro [Chan
y col., Science 254, 1382-1385 (1991); Miyazawa y
col., Eur. J. Biochem. 197, 15-22 (1991)]. Esta
variante, denominada HGF/NK2, ha sido propuesta como un antagonista
competitivo del huHGF humano.
La comparación de la secuencia aminoacídica del
HGF de rata con la de huHGF reveló que las dos secuencias están muy
conservadas y que tienen las mismas características estructurales.
La longitud de los cuatro dominios Kringle del HGF de rata es
exactamente la misma en huHGF. Además, los residuos de cisteína se
localizan exactamente en las mismas posiciones; como una indicación
de estructuras tridimensionales similares (Okajima y col., supra;
Tashiro y col., citado con anterioridad).
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "factor de crecimiento hepatocítico", "HGF"
y "huHGF" se refieren a un factor de crecimiento (humano) capaz
de unirse específicamente al receptor de un HGF silvestre (humano),
teniendo típicamente dicho factor de crecimiento una estructura con
seis dominios (dominios dedo, Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3,
Kringle 4 y serina proteasa), pero, sin embargo, puede tener un
menor número de dominios o puede tener alguno de sus dominios
repetido si mantiene su cualitativa capacidad de unión de unión al
receptor de HGF. Esta definición incluye específicamente el
\Delta5 huHGF como se desvela en Seki y col., citado con
anterioridad. Los términos "factor de crecimiento hepatocítico"
y "HGF" incluyen además el factor de crecimiento hepatocítico
de cualquier especie animal no humana, y en particular el HGF de
rata.
Los términos "factor de crecimiento
hepatocítico humano silvestre", "factor de crecimiento
hepatocítico humano nativo", "huHGF silvestre (wt)", y
"huHGF nativo" se refiere a la secuencia nativa humana de HGF,
es decir, el codificado por la secuencia de ADNc publicada en
Miyazawa, y col. 1989, citado con anterioridad, o Nakamura y col.,
1989, citado con anterioridad, incluyendo sus formas madura, pre,
pre-pro, y pro, purificado a partir de un origen
natural, sintetizado químicamente o producido recombinantemente. Las
secuencias descritas en Miyazawa y col. y Nakamura y col. difieren
en 14 aminoácidos. La razón para las diferencias no es del todo
clara; entre las posibilidades se encuentran el polimorfismo, o los
artefactos de clonación. Ambas secuencias se incluyen
específicamente en los términos anteriores como se define para el
propósito de la presente invención. Se comprenderá que existen
variantes alélicas naturales y que éstas pueden aparecer en los
individuos, como se demuestra en una o más diferencias en la
secuencia aminoacídica de cada individuo. Las posiciones
aminoacídicas en las moléculas de huHGF variantes de la presente
memoria descriptiva están indicadas según la numeración de Miyazawa
y col. 1989, citado con anterioridad.
Durante el transcurso de un reciente estudio de
la relación estructura-actividad y
estructura-capacidad de unión al receptor en
variantes de secuencia aminoacídica de HGF, cuyos resultados se
desvelan en los ejemplos siguientes, en la secuencia aminoacídica
de HGF silvestre se han identificado dominios críticos para la
capacidad de unión del ligando y/o de la activación. Se realizaron
varios truncamientos del extremo C terminal de HGF delecionando la
cadena \beta o la cadena \beta junto con un número progresivo de
dominios Kringle. La deleción del primer dominio Kringle (variante
\DeltaK1) de HGF afectó principalmente a la actividad biológica,
mostrando al menos una reducción de 100 veces (SA< 0,2% de rhuHGF
wt). De modo similar, la capacidad de unión de esta variante
también se vio afectada ya que no es capaz de competir por la unión
con rhuHGF wt. La deleción del resto de dominios Kringle (variantes
\DeltaK2, \DeltaK3 o \DeltaK4) también induce una drástica
reducción de la actividad mitogénica. Sin embargo, las afinidades de
unión al receptor (Kd) de estas variantes por deleción fueron
próximas a las observadas con el rhuHGF wt. Estos datos mostraron
que los dominios Kringle K3 y K4 no son necesarios para la
capacidad de unión al receptor y concordaban con las observaciones
previas de Miyazawa y col., 1991 citado con anterioridad, Chan y
col., 1991 citado con anterioridad, en el sentido de que la
variante N- 303, cuya secuencia aminoacídica es muy similar a
HGF/NK2, conserva la capacidad de competir eficientemente por la
unión al receptor de HGF (Kd-280 pM). Además, las
observaciones de que N-303 es suficiente para la
unión al receptor y que el segundo dominio kringle no es necesario
para la unión al receptor de HGF (en el contexto del resto de la
molécula) sugieren que el dominio de unión al receptor está
contenido en el dominio del dedo y el primer dominio Kringle de
huHGF.
Para elucidar la importancia funcional del
dominio proteasa de HGF, se realizaron varias mutaciones sencillas,
dobles y triples para reconstituir un sitio potencial serina
proteasa. Las sustituciones de aminoácidos se realizaron en las
posiciones 534, 673 y 692 de la secuencia aminoacídica de hHGF
silvestre. En la mayoría de los casos, la actividad biológica se
redujo sustancialmente sin una sustancial disminución de la afinidad
de unión del ligando. La actividad biológica de las variantes
dobles Q534H, Y673S y Y673S, V692S y de la triple variante Q534H,
Y673S, V692S fue menor del 3% en comparación con el rhuHGF WT. Sin
embargo, la Kd de estas variantes no fue significativamente
diferente de la Kd de la molécula de HGF humana silvestre. Estos
resultados indican que ciertas mutaciones en la cadena \beta de
HGF bloquean la actividad mitogénica pero no tienen un efecto
significativo sobre la afinidad de unión al receptor de HGF. De este
modo, parece que estos mutantes carecen de una actividad posterior
a la unión al receptor.
Las alteraciones que aumentan potencialmente la
capacidad de unión al receptor de HGF, de dan, por ejemplo, en la
región aminoacídica que corresponde al sitio activo potencial serina
proteasa. Esta región incluye los aminoácidos Q534, Y673 y V692 en
la secuencia aminoacídica del huHGF silvestre. Se cree que la
sustitución de estos aminoácidos por otro aminoácido, y
preferentemente por aminoácidos con un tamaño o una polaridad
diferente mejora adicionalmente las propiedades de unión al receptor
de la variante de HFG.
Puede haber alteraciones adicionales en el
extremo C terminal y/o en los dominios Kringle de la molécula de
HGF. Además de los mutantes por deleción antes mencionados, son de
gran interés las variantes de HGF con alteraciones en el dominio
kringle. Como hemos descubierto que el dominio de unión al receptor
está contenido en las regiones dedo y Kringle 1 de la molécula de
HGF, se espera que las alteraciones de aminoácidos en estos
dominios alteren significativamente las propiedades de unión al
receptor (y la actividad biológica) de las variantes de la presente
invención. Es particularmente probable que las alteraciones en los
residuos que están más expuestos hacia el interior de la estructura
kringle (residuos con carga principalmente) provoquen cambios
profundos en las propiedades de unión receptor y/o en la actividad
biológica de las variantes de HGF.
Hay comercialmente disponibles otros ligandos
para receptores con actividad tirosina quinasa (por ejemplo,
insulina) y/o están caracterizados por sus secuencias nucleotídicas
las aminoacídicas deducidas. También se conocen sus actividades
biológicas.
Se conoce a EGF y a proteínas relacionadas
[Carpenter, G. y Cohen, S. Ann. Rev. Biochem. 48,
193-216 (1979); Massanque, J., J. Biol. Chem. 255,
21393-21396 (1990); Gray, A. y col., Nature 303,
722-725 (1983); Bell, G. I. y col., Nucl. Acid.
Res. 14, 8427-8446 (1986)].
La secuencias aminoacídicas y la preparación de
factores de crecimiento humano tipo insulina 1 y 2
(IGF-I e IGF-II) se describe, por
ejemplo en el documento EP128.733 (publicado el 19 de diciembre de
1984).
Los ligandos para HER2/neu (p185HER2) se han
denominado polipéptidos "herregulina-2" (HRG2),
e incluyen HRG2-\alpha y
HRG2-\beta1, -\beta2 y -\beta3. La estructura,
preparación y uso de estos ligandos y sus derivados, incluyendo las
variantes de secuencias aminoacídicas se desvelan en las solicitudes
de EE.UU. copendientes con Nº de serie: 07/705.256 (depositada el
24 de mayo de 1991); 07/790.801 (depositada el 8 de noviembre de
1991) y 07/880.917 (depositada el 11 de mayo de 1992). La secuencia
aminoacídica de HRG comparte varias características con la familia
de factores de crecimiento transmembrana de EGF. La alineación de
las secuencias aminoacídicas en la región del motivo EGF y el
dominio transmembrana flanqueante de varias proteínas relacionadas
con el EGF humano presentan un grado de homología relativamente
grande con el factor de crecimiento tipo EGF de unión a la heparina
(HB-EGF) [Higashiyama y col., Science 251,
936-939 (1991); amphiregulin (AR) [Plowman, G.D. y
col., Mol. Cell. Biol. 10. 1969-1981 (1990)]; factor
alfa de crecimiento transformador (TGF-\alpha);
EGF [Bell, G.I. y col. (1986), citado con anterioridad] y el factor
de crecimiento derivado de schwanoma [Kimura, H. y col., 348,
257-260 (1990)].
Un representante típico de ligandos bivalentes
para receptores con actividad tirosina quinasa es el factor de
crecimiento plaquetario (PDGF). El PDGF es un mitógeno principal del
suero para el cultivo de células derivadas de tejido conectivo
[véase Ross, R. y col., Cell 46, 155-169 (1986) para
una revisión]. Es un dímero de 30 kDa compuesto por cadenas
polipeptídicas A y B unidas por puentes disulfuro. Se han
identificado y purificado las tres isoformas posibles de las dos
cadenas, PDGF-AA, PDGF-AB, y
PDGF-BB a partir de de fuentes naturales [Heldin,
C.-H. y col., Nature 319, 511-514 (1986); Hammacher,
A. y col., Eur. J. Biochem. 176, 1790186 (1988); Stroobant, P. y
Waterfield, M.D., EMBO J. 3, 2963-2967 (1984)]. Se
ha descubierto que las diferentes isoformas difieren en las
actividades funcionales, muy probablemente debido a diferentes
especifidades de unión para dos clases diferentes de receptores
[Nister, M. y col., Cell 52, 791-799 (1988); Heldin,
C.-H. y col., EMBO J. 7, 1387-1393 (1988); Hart,
C.E. y col., Science 240, 1529-1531 (1988)]. El
receptor de PDGF tipo A une las tres isoformas de PDGF, mientras
que el receptor tipo B une PDGF-BB con mayor
afinidad y PDGF-AB con menor afinidad pero no une
PDGF-AA con ninguna afinidad apreciable.
Otro ligando bivalente es la hormona del
crecimiento humana (hGH). La hGH es un miembro de una familia de
hormonas homólogas que incluye los lactógenos placentarios, las
prolactinas y otras variantes específicas y genéticas de la hormona
del crecimiento, y normalmente se denomina familia de las
hematopoyetinas, incluyendo las hormonas hipofisarias y
hematopoyéticas [Nicoll, C.S. y col., Endocrine Reviews 7, 169
(1986)]. Se ha expresado el gen de hGH clonado en una forma de
secreción en E. coli [Chang, C.N. y col., Gene 55, 189
(1987)], y se han descrito sus secuencias nucleotídica y
aminoacídica [Goeddel y col., Nature 281, 544 (1979); Gray y col.,
Gene 39, 247 (1985)]. Se ha descrito el patrón de plegamiento
tridimensional de la hormona del crecimiento porcina (pGH)
[Abdel-Meguid, S.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 84 6434 (1987)]. Se ha identificado el receptor de hGH y los
centros de unión a anticuerpo con mutagénesis de exploración de
homología [Cunningham, B. y col., Science 243, 1330 (1989)]. Se
conocen variantes de GH con truncamientos en el extremo N terminal
o con mutaciones en la región N terminal [Gertler y col.,
Endocrinology 118, 720 (1986); Ashkenazi, A. y col., Endocrinology
121, 414 (1987); y Binder, Mol. Endo. 7, 1060-1068
(1990)]. Las variantes antagonistas de hGH se describieron en Chan
y col., Mol. Endo. 5, 1845 (1991) y en la bibliografía citada en
dicho artículo, y en el documento WO 91/05853. Las variantes de hGH
también se desvelan en Cunningham y col., Science 244, 1081 (1989);
y Science 243, 1330-1336 (1989).
Recientemente se han determinado las estructuras
de otros varios ligandos hematopoyéticos. El factor estimulador de
colonias granulocíticas-macrofágicas
(GM-CSF) e IL-4 tienen
aproximadamente 60 residuos menos que la hormona del crecimiento.
Tanto la estructura cristalizada de GM-CSF
[Diederichs, K. y col., Science 254, 1779-1782
(1991); Walter, M. R. y co., J. Mol. Biol. 224,
1075-1085 (1992)], y la estructura por RMN de
IL-4 [Powers, R. y col., Science 256,
1673-1677 (1992); Smith, L. J. y col., J. Mol. Biol.
224, 899-904 (1992)] revelan la misma topoligía que
GH, pero con un motivo estructural adicional no visto antes: un
segmento corto en lámina \beta formado por residuos con largas
conexiones entrecruzadas. A partir de esta evidencia, parece que
existen dos sitios de unión al receptor convervados topológicamente
comunes en todas las hematopoyetinas. Mientras que hGH usa estos dos
sitios para unirse a dos copias del mismo receptor, en muchos otros
casos como IL-2, IL-3,
GM-CSF y otros, los segmentos equivalentes pueden
formar puntos de contacto y unión para dos subunidades de receptores
diferentes.
Los dominios de unión al receptor en una
secuencia de un ligando nativo se pueden determinar con
procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo estudios de rayos
X, análisis mutacionales y estudios de unión a anticuerpos. Los
enfoques mutacionales incluyen técnicas de mutagénesis por
saturación aleatoria acoplada a la selección de mutantes de escape,
mutagénesis por inserción, y mutagénesis por exploración de
homología (sustitución de secuencias de ligandos humanos, que se
unen a los receptores correspondientes, con secuencias no
conservadas de un ligando correspondiente de otra especie animal,
por ejemplo, el ratón, que no se una al receptor humano). Otra
estrategia adecuada para identificar dominios de unión a receptor en
ligandos se conoce como mutagénesis por barrido de alanina
[ALA-scan, Cunningham y wells, Science 244,
1081-1985 (1989)]. Este procedimiento implica la
identificación de regiones que contengan cadenas laterales con
aminoácidos con carga. Los residuos con carga de cada región
identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se reemplazan
(una región por por molécula mutante) por alanina y se estudia la
capacidad de unión al receptor de los ligandos obtenidos, para
valorar la importancia de una región particular en la unión al
receptor. Otro procedimiento para identificar dominios activos en
los polipéptidos entre varias variantes de hGH se desvela en el
documento WO90/04788 (publicado el 3 de mayo de 1990). Según este
procedimiento, se determinan los dominios activos (por ejemplo,
dominios de unión al receptor) en un polipéptido sustituyendo
segmentos de aminoácidos seleccionados del polipéptido con un
segmento polipeptídico análogo de un análogo del polipéptido que
tenga una actividad diferente con la sustancia diana (por ejemplo,
un receptor) en comparación con el polipéptido parental. Un potente
procedimiento adicional para la localización de dominios de unión a
un receptor en un ligando se realiza mediante el uso de anticuerpos
monoclonales (mAbs) neutralizantes (bloqueantes). Normalmente, se
usa una combi-
nación de estos procedimientos y otros similares para localizar los dominios importantes para la unión a un receptor.
nación de estos procedimientos y otros similares para localizar los dominios importantes para la unión a un receptor.
Los derivados, como por ejemplo las variantes de
secuencia aminoacídica, de los anteriores y otros ligandos para
receptores que requieren una oligomerización para la activación de
la función del receptor también son conocidos o se pueden preparar
fácilmente empleando procedimientos conocidos en la técnica, como
por ejemplo la mutagénesis dirigida del ADN que codifica el
precursor o el ligando parental, produciendo así el ADN que
codifica la variante. Las modificaciones del ADN que codifica las
moléculas de ligando variantes no se deben situar en la secuencia
fuera de pauta de lectura, y preferentemente no crearán regiones
complementarias que pudieran producir estructuras secundarias en el
ARNm. El ADN que codifica el ligando variante se inserta en un
vector de expresión apropiado, y se transfectan células hospedadoras
adecuadas con dicho ADN. El cultivo de las células hospedadoras en
un medio apropiado tendrá como resultado la producción de los
polipéptidos codificados por el ADN, y la secreción de los
polipéptidos
en el medio de cultivo de las células hospedadoras. Estas técnicas se describen con más detalle en lo sucesivo.
en el medio de cultivo de las células hospedadoras. Estas técnicas se describen con más detalle en lo sucesivo.
Alternativamente, las variantes aminoacídicas de
las moléculas del ligando nativo se preparan por síntesis in
vitro usando procedimientos de síntesis peptídica en fase sólida
habituales como se describe en (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 [1963]),
aunque se pueden emplear otros procedimientos de síntesis química
conocidos en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a
partir del extremo C terminal del péptido uniendo un
\alpha-aminoácido protegido a una resina adecuada.
Los aminoácidos se unen a la cadena peptídica usando técnicas muy
conocidas en la técnica para la formación de puentes peptídicos.
Las variantes por glicosilación de las moléculas
del ligando nativo se pueden preparar mediante técnicas conocidas
en la técnica. La adición de glicósidos química y enzimática a
proteínas se puede realizar usando una variedad de grupos
activados, por ejemplo, como describieron Alpin y Wriston en CRC
Crit. Rev. Biochem. págs. 259-306 (1981). Las
ventajas de las técnicas de adición química son que son
relativamente simples y que no necesitan la complicada maquinaria
enzimática necesaria para la glicosilación natural por enlaces tipo
O y N. Dependiendo del modo de adición usado, el(los)
glúcido(s) se puede enlazar a (a) arginina e histidina, (b)
grupos carboxilo libres, como los del ácido glutámico y el ácido
aspártico (c), grupos sulfidrilo libres como los de la cisteína,
(e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o
triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos
procedimientos están descritos en el documento WO87/05330 (publicado
el 11 de septiembre de 1987). Los carbohidratos presentes en una
molécula de un ligando nativo se pueden eliminar, por ejemplo,
usando una endoglicosidasa, como por ejemplo la endoglicosidasa H
(Endo-H), que es capaz de eliminar (parcialmente)
oligosacáridos ricos en manosa e híbridos. Este tratamiento se
realiza mediante técnicas conocidas per se, por ejemplo,
según el procedimiento de Tarentino y col., J. Biol. Chem. 249, 811
(1974), Trimble y col., Anal. Biochem. 141, 515 (1984) y Little y
col., Biochem. 23, 6191 (1984). Más preferentemente, las variantes
por glicosilación de ligandos se realizan con mutaciones apropiadas
a nivel del ADN, para proporcionar una proteína con el patrón de
glicosilación alterado deseado.
Según la presente invención, se puede fusionar
directamente uno con otro un primer y un segundo ligando (que
pueden ser iguales o diferentes). Dichas moléculas de fusión se
pueden preparar mediante la expresión de la secuencia codificadora
de ADN en un microorganismo adecuado o en un cultivo celular,
empleando técnicas habituales en la tecnología del ADN
recombinante. Alternativamente, se pueden obtener por síntesis
química.
El término "enlazador heterólogo" se usa
para referirse a cualquier molécula enlazadora orgánica o
inorgánica que unan dos ligandos (como se definió anteriormente),
siempre que sean diferentes de un enlazador que conecte los
ligandos en su entorno nativo, por ejemplo un ligando bivalente. Si
los dos ligandos se conectan en su entorno nativo con una secuencia
aminoacídica, las variantes codificadas por una secuencia de ADN
capaces de hibridar en condiciones restrictivas con la secuencia de
ADN que codifica dicha secuencia aminoacídica conectora se excluyen
específicamente del término "enlazador heterólogo". Se entiende
por "condiciones restrictivas" la incubación durante la noche
a 37ºC en una solución que comprende: 40% de formamida, SSC 5X (NaCl
150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH
7,6), solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano y 20
mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguida de un
lavado de los filtros con SSC 1X aproximadamente a 50ºC.
En una forma de realización preferente, el
enlazador comprende una secuencia de inmunoglobulina.
El término "inmunoglobulina" generalmente se
refiere a polipéptidos que comprenden una cadena ligera o una
cadena pesada unidas normalmente por puentes disulfuro en la
configuración nativa tipo "Y", aunque en el alcance de la
presente memoria descriptiva se incluyen otro tipo de enlaces,
incluyendo tetrámeros o sus agregados.
Se conocen inmunoglobulinas (Ig) y determinadas
variantes de las mismas y se han preparado en cultivo celular
recombinantes. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. Nº 4.745.055;
el documento EP256.654; Faulkner y col., Nature 298:286 (1982); los
documentos EP120.694; EP125.023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979);
Köhler y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU 77:2197 (1980); Raso y
col., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison y col., Ann. Rev.
Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison y
col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 81:6851 (1984); los documentos
EP255.694; EP266.663; y WO88/03559. También se conocen cadenas de
inmunoglobulina reiterativas. Véase por ejemplo la patente de EE.UU.
Nº 4.444.878, el documento WO88/68.763 y la bibliografía citada en
dichos documentos. El residuo de inmunoglobulina en las quimeras de
la presente invención se puede obtener a partir de
IgG-1, IgG-2, IgG-3
or IgG-4 subtipos, IgA, IgE, IgD o IgM, pero
preferentemente IgG-1 o IgG-3.
En la técnica se conocen las quimeras construidas
a partir de una secuencia de receptor enlazada a una secuencia de
un dominio constante de una inmunoglobulina apropiado
(inmunoadhesinas). Las inmunoadhesinas descritas en la bibliografía
incluyen fusiones de receptores* de linfocitos T [Gascoigne y col.,
Proc. Natl.Acad. Sci. EE.UU. 84, 2936-2940 (1987)];
CD4* [Capon y col., Nature 337, 525-531 (1989);
Traunecker y col., Nature 339, 68-70 (1989);
Zettmeissl y col., DNA Cell Biol. EE.UU. 9, 347-353
(1990); Byrn y col., Nature 344, 667-670 (1990)];
L-selectina (receptor de migración celular) [Watson
y col., J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990);
Watson y col., Nature 349, 164-167 (1991)]; CD44*
[Aruffo y col., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; CD28* y
B7* [Linsley y col., J. Exp. Med. 173, 721-730
(1991)]; CTLA-4* [Lisley y col., J. Exp. Med. 174,
561-569 (1991)]; CD22* [Stamenkovic y col., Cell
66. 1133-1144 (1991)]; receptor de TNF [Ashkenazi y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 10535-10539
(1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27,
2883-2886 (1991); Peppel y col., J. Exp. Med. 174,
1483-1489 (1991)]; receptores de NP [Bennett y col.,
J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)]; cadena* a
del receptor de IgE [Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115, resumen.
1448 (1991)]; receptor de HGF [Mark, M.R. y col., 1992, J. Biol.
Chem. enviado], en los que el (*) indica que el receptor es miembro
de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Estas inmunoadhesinas
se fabricaron con diferentes propósitos, sin embargo, todas tienen
en común que pueden poseer muchas de las propiedades químicas y
biológicas de los anticuerpos humanos.
Las quimeras
ligando-inmunoglobulina se desvelan en las
solicitudes copendientes con Nº de serie: 07/834.902 depositada el
13 de febrero de 1992 (para ligandos L-selectina);
07/884.811 y 07/885,971 ambas depositadas el 18 de mayo de 1992
(para variantes de HGF). Estas quimeras se pueden realizar de modo
similar a la construcción de las quimeras
receptor-inmunoglobulina.
Normalmente, el extremo C terminal del ligando se
fusiona al extremo N terminal de la región constante de una
inmunoglobulina en lugar de la región variable, sin embargo también
son deseables las fusiones de variantes de selectina al extremo N
terminal.
Típicamente, tales fusiones conservan al menos
una región bisagra funcionalmente activa y los dominios CH2 y CH3
de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina.
Las fusiones también se realizan al extremo C terminal de la
porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente después del
extremo N terminal del CH1 de la cadena pesada o a la región
correspondiente de la cadena ligera. Normalmente esto se realiza
construyendo la secuencia de ADN apropiada y expresándola en el
cultivo celular recombinante. Alternativamente, sin embargo, las
quimeras ligando-inmunoglobulina de esta invención
se pueden sintetizar siguiendo procedimientos conocidos.
El sitio preciso en el que se realiza la fusión
no es crítico; hay sitios particulares muy conocidos y se pueden
seleccionar para optimizar la actividad biológica, la secreción o
las características de unión de las quimeras
ligando-inmunoglobulina.
En algunas formas de realización, las
inmunoglobulina híbridas se ensamblan como monómeros, o hetero/homo
multímeros y particularmente como dímeros o tetrámeros,
esencialmente como se ilustra en el documento WO91/
08298.
08298.
En una forma de realización preferente, el
extremo C terminal de la secuencia de un ligando que contiene
el(los) sitio(s) de unión para un receptor, se fusiona
al extremo N terminal de la porción C terminal de un anticuerpo (en
particular el dominio Fc), con las funciones efectoras de una
inmunoglobulina, por ejemplo, la inmunoglobulina G1
(IgG-1). Es posible fusionar toda la región
constante de la cadena pesada a la secuencia con el(los)
sitio(s) de unión al receptor. Sin embargo, más
preferentemente, para la fusión se usa una secuencia que comience
en la región bisagra justo antes de la región de corte por papaína
(que define químicamente el Fc de una IgG; residuo 216, tomando el
primer residuo de la región constante de la cadena pesada al 114
[Kobet y col., citado con anterioridad], u otros sitios análogos de
otras inmunoglobulinas). En una forma de realización
particularmente preferente, se fusiona la secuencia aminoacídica que
contiene el(los) sitio(s) de unión al receptor a la
región bisagra y CH2 y CH3 o CH1, la región bisagra, los dominios
CH2 y CH3 de la cadena pesada de una IgG-1, una
IgG-2, o una IgG-3. El sitio preciso
en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo se
puede determinar con una experimentación habitual.
En algunas formas de realización, las quimeras
ligando-inmunoglobulina se ensamblan como
heteromultímeros, y particularmente como heterodímero o
heterotetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas
se conocerán como unidades estructurales. Una unidad estructural de
cuatro cadenas básica es la forma en la que encuentran IgG, IgD, e
IgE. En las inmunoglobulinas de mayor peso molecular se repite una
unidad de cuatro cadenas; IgM generalmente existe como un pentámero
de unidades básicas de cuatro cadenas unidas por puentes disulfuro.
La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden
aparecer en formas multiméricas en el suero. En el caso de un
multímero, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o
diferente.
A continuación se representan esquematizados
varios ejemplos de quimeras ligando-inmunoglobulina
ensambladas.
- (a)
- AC_{L}-AC_{L};
- (b)
- AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
- (c)
- AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
- (d)
- AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}CL-AC_{H}];
- (e)
- V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y
- (f)
- [A-Y]n-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
en
donde
cada A representa secuencias aminoacídicas
idénticas o diferentes capaces de unirse selectivamente a dicho
receptor;
V_{L} es un dominio variable de la cadena
ligera de una inmunoglobulina
V_{H} es un dominio variable de la cadena
pesada de una inmunoglobulina
C_{L} es un dominio constante de la cadena
ligera de una inmunoglobulina
C_{H} es un dominio constante de la cadena
pesada de una inmunoglobulina
n es un número entero mayor que 1;
Y designa el residuo de un agente reticulante
covalente.
Para mayor brevedad, las anteriores estructuras
solo presentan rasgos clave, no indican puntos de unión (J) u otros
dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los puentes
disulfuro. Sin embargo, cuando dichos dominios sean necesarios para
la actividad de unión, se construirán como se presentan en las
posiciones habituales que ocupan en las moléculas de
inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de ligando de la
presente invención se pueden insertar entre las secuencias de la
cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina de modo
que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada
quimérica. En esta forma de realización, las secuencias del ligando
se fusionan al extremo 3' de la cadena pesada de una
inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, o entre la
región bisagra y el dominio CH2, o entre los dominios CH2 y CH3. Se
han descrito construcciones similares en Hoogenboom, H. R. y col.,
Mol. Immunol. 28, 1027-1037 (1991).
Las quimeras
ligando-inmunoglobulina de la presente invención se
construyen de modo similar a la construcción de anticuerpos
biespecíficos, como por ejemplo, lo desvelado en los documentos
EP125.023 (publicado el 14 de noviembre de 1984); US4.444.878
(concedida el 24 de abril de 1984); Munro, A,, Nature 312, 597
(1984); Morrison, y col., Science 229, 1202-1207
(1985); Berg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88,
4723-4727 (1991)].
El ADN que codifica un ligando nativo de la
presente memoria descriptiva se puede obtener a partir de una
genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se crea posee
el ARNm del ligando deseado y que lo exprese a un nivel detectable.
Las genotecas se estudian con sondas designadas para identificar el
gen de interés o la proteína por él codificada. Para las genotecas
de expresión de ADNc, las sondas idóneas normalmente incluyen
anticuerpos mono clonales y policlonales que reconozcan y se unan
específicamente a la proteína deseada; oligonucleótidos de
aproximadamente 20-80 bases que codifiquen porciones
conocidas o teóricas del ADNc del ligando de la misma o distinta
especie; y/o ADNc complementarios u homólogos de sus fragmentos que
codifiquen el mismo gen o uno similar.
Un medio alternativo para aislar el gen que
codifica un ligando activo deseado es usar la metodología de la
reacción en cadena por la polimerasa (PCR) como se describe en la
patente de EE.UU. Nº 4.683.195, concedida el 28 de julio de 1987,
en el apartado 14 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. New York, 1989, o en el capítulo 15 de Current Protocols in
Molecular Biology, Ausubel y col. eds., Greene Publishing Associates
y Wiley- Interscience 1991.
Otra alternativa es sintetizar químicamente el
gen que codifica el ligando deseado (nativo o variante) usando uno
de los procedimientos descritos en Engels y col., Agnew. Chem. Int.
Ed. Engl. 28, 716 (1989). Estos procedimientos incluyen
procedimientos con triéster, fosfito, fosforamidita y
H-fosfonato, PCR y otros procedimientos con
autocebadores, y la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida.
Estos procedimientos se pueden usar si se conoce toda la secuencia
del ácido nucleico del gen, o si hay disponible la secuencia
nucleotídica complementaria a la hebra codificadora, o
alternativamente, si se conoce la secuencia aminoacídica diana, se
pueden inferir los residuos codificadores preferentes para cada
residuo de aminoácido.
Las variantes de la secuencia aminoacídica de los
ligandos de esta invención se construyen preferentemente mutando la
secuencia de ADN que codifica la proteína central de un ligando
silvestre. Generalmente, las regiones o sitios particulares del ADN
identificados por los procedimientos abordados anteriormente, serán
el objetivo de la mutagénesis, y así la metodología general empleada
para esto se denomina mutagénesis dirigida. Las mutaciones se
realizan usando enzimas modificadores del ADN como por ejemplo
endonucleasas de restricción (que cortan el ADN en posiciones
particulares), nucleasas (que degradan el ADN) y/o polimerasas (que
sintetizan ADN).
A continuación se presenta una breve discusión de
ciertas técnicas de la tecnología del ADN recombinante comúnmente
usadas que se pueden usar para hacer dímeros del ligando de la
presente invención. Éstas y otras técnicas similares son igualmente
adecuadas par hacer variantes de los dominios de unión al receptor
de los ligandos nativos, fusiones de ligandos nativos o variantes,
con o sin un enlazador, incluyendo enlazadores que proceden de una
inmunoglobulina. Hay más detalles de éstas y otras técnicas
similares en libros de texto generales, como por ejemplo, Sambrook
y col., citado con anterioridad, y Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel y col. eds., citado con anterioridad.
La preparación de variantes y de dímeros de
ligandos que incluyen dichas variantes de ligando de esta manera
preferentemente se logra por mutagénesis dirigida del ADN que
codifica una variante previamente preparada o una versión no
variante de la proteína. La mutagénesis dirigida permite la
producción de variantes con el uso de secuencias oligonucleotídicas
que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como
un número suficiente de nucleótidos adyacentes para proporcionar una
secuencia de cebador de un tamaño y una complejidad de secuencia
suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión
que se está explorando. Típicamente, se prefiere un cebador de
aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, con aproximadamente 5 a 10
residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se está
alterando. En general, la técnica de la mutagénesis dirigida es muy
conocida en la técnica como muestran los ejemplos de publicaciones
como Adelman y col., DNA, 2: 183 (1983).
Como podrá apreciarse, la mutagénesis dirigida
emplea típicamente un vector fágico que existe tanto en forma de
cadena simple y de cadena doble. Los vectores típicamente útiles en
la mutagénesis dirigida incluyen vectores como por ejemplo el fago
M13, por ejemplo, como se desvela en Messing y col., Third Cleveland
Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A.Walton,
Blsevier, Amsterdam (1981). Estos fagos están comercialmente
disponibles y su uso es muy conocido entre los expertos en la
materia. Alternativamente, los vectores plasmídicos que contienen
un origen de replicación fágico de cadena sencilla (Veira y col.,
Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)) se pueden emplear para obtener un
ADN de cadena sencilla.
En general, la mutagénesis dirigida puede
realizarse, por ejemplo, obteniendo primero un vector de cadena
sencilla que incluya en su secuencia una secuencia de ADN que
codifique la selectina relevante. Un cebador oligonucleotídico con
la secuencia mutada deseada se prepara, generalmente sintéticamente,
por ejemplo, con el procedimiento de Crea y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. (EE.UU.), 75: 5765 (1978). Después el cebador se hibrida con
el vector que contiene la secuencia del ligando de cadena sencilla,
y se trata con enzimas de polimerización del ADN como por ejemplo
el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para
completar la síntesis de la cadena con la mutación. De este modo, se
forma un heterodúplex en el que una cadena codifica la secuencia no
mutada original y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este
vector heterodúplex se usa después para transformar las células
apropiadas, como las células JM101 y se seleccionan los clones, por
hibridación a una sonda radiactiva compuesta por el cebador de la
mutagénesis etiquetado con P^{32}, que incluye vectores
recombinantes con la secuencia mutada introducida.
Después de seleccionar dicho clon, se puede sacar
la región mutada y colocarla en un vector apropiado para la
producción de la variante deseada, generalmente un vector de
expresión del tipo que típicamente se emplean para la
transformación de un hospedador eucariota apropiado. En el contexto
de la presente invención, se prefieren células de ovario de hámster
chino (CHO) o células 293 (células de riñón humano descritas en
Graham y col., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)) para la preparación de
productores a largo plazo de polipéptidos estables. Sin embargo, la
invención no se limita a la producción en células CHO, y se conocen
muchos otros tipos celulares que pueden usarse igualmente,
particularmente si se desea sólo una producción temporal del enzima
con fines analíticos. Por ejemplo, a continuación se describe un
sistema de expresión temporal que emplea células 293 que ofrece un
sistema conveniente para producir variantes del ligando o dímeros
del ligando, por ejemplo, quimeras
ligando-inmunoglobulina con fines analíticos.
Otro procedimiento para hacer mutaciones en la
secuencia de ADN que codifica un ligando incluye el corte del ADN
en la posición correspondiente por digestión con enzimas de
restricción, recuperando el ADN propiamente cortado, sintetizando
un oligonucleótido que codifica el aminoácido deseado y regiones
flanqueantes como por ejemplo sitios de clonación múltiple con
extremos romos (o, en lugar de usar sitios de clonación múltiple,
digiriendo el oligonucleótido sintético con las enzimas de
restricción también usadas para cortar el ADN que codifica el
ligando, creando así un extremo cohesivo, y ligando el ADN sintético
en el resto del gen estructural que codifica el ligando.
La mutagénesis por PCR es además adecuada para
hacer ligandos incluyendo dímeros del ligando para la práctica de
la presente invención. Aunque la siguiente discusión se refiere a
ADN, se entiende que la técnica también tiene aplicación con ARN.
La técnica de la PCR generalmente se refiere al siguiente
procedimiento. Cuando se usan cantidades pequeñas de ADN molde como
material de inicio en una PCR, se pueden usar cebadores que
difieren ligeramente de la secuencia correspondiente en un ADN molde
para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de
ADN específico que difiera de la secuencia del molde sólo en las
posiciones en las que los cebadores se diferencien del molde. Para
la introducción de una mutación en un ADN plasmídico, uno de los
cebadores está diseñado que modo que solape la posición de la
mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro
cebador debe ser idéntica a un fragmento de la secuencia de la
cadena complementaria del plásmido, pero esta secuencia se puede
colocar en cualquier sitio del plásmido. Es preferente, sin embargo,
que la secuencia del segundo cebador se localice a menos de 200
nucleótidos de la de la primera, de modo que en el extremo toda la
región amplificada del ADN unido por los cebadores se pueda
secuenciar fácilmente. La amplificación por PCR usando un par de
cebadores como lo descrito produce una población de fragmentos de
ADN que difieren en la posición de la mutación determinada por el
cebador, y posiblemente en otras posiciones, ya que la copia del
molde es propensa a introducir errores.
Si la relación entre el molde y el producto es
extremadamente baja, la gran mayoría del producto de los fragmentos
de ADN incorporarán la mutación deseada. Este producto se usa para
reemplazar la región correspondiente del plásmido que sirvió como
molde para la PCR usando la tecnología del ADN habitual. Se pueden
introducir mutaciones en posiciones diferentes simultáneamente
usando un segundo cebador mutante o realizando una segunda PCR con
dos cebadores mutantes diferentes y ligando los dos fragmentos de la
PCR simultáneamente al fragmento del vector en una tercera (u otra)
ligación.
Aunque en última instancia se prefiere la
expresión en células de ovario de hámster chino (CHO) y en la línea
celular 293 de células renales embrionarias humanas [Urlaub y
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77, 4216 (1980); Graham y
col., J. Gen. Virol., 36, 59 (1977)], los vectores y procedimientos
desvelados en la presente memoria descriptiva son adecuados para su
uso en las células hospedadoras de una gran gama de organismo
eucariotas.
En general, se prefieren a los procariotas para
la clonación inicial de la secuencia de ADN y para la construcción
de vectores útiles para la invención. Por ejemplo, so
particularmente útiles la cepa de E. coli K12 294 (ATCC Nº
31.446) y la cepa de E. coli (ATCC Nº 27.325) Otras cepas
microbianas adecuadas incluyen las cepas de E. coli como
E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC Nº 31.537). Estos
ejemplos pretenden, por su puesto ser ilustrativos y no
limitantes.
Los procariotas además son útiles para la
expresión. Las cepas antes mencionadas, así como bacilos como por
ejemplo, Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas como
por ejemplo, Salmonella typhimurium o Serratia
marcesans, y varias especies de Pseudomonas son ejemplos
de células hospedadoras útiles para la expresión.
En general, se usan vectores plasmídicos con un
replicón y secuenciase de control que proceden de especies
compatibles con la célula hospedadora junto con ésta. El vector
normalmente tiene un sitio de replicación, así como secuencias
marcadoras que son capaces de ofrecer una selección fenotípica de
las células transformadas. Por ejemplo, E. coli normalmente
se transforma con pBR322, un plásmido que procede de una especie de
E. coli (véase por ejemplo, Bolivar y col., Gene, 2: 95
(1977)). pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y a
la tetraciclina y ofrece así un medio sencillo de identificar las
células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos
microbianos o fágicos, además debe contener, o modificarse para que
contengan, promotores usados por el organismo para la expresión de
sus propias proteínas.
Los promotores más comúnmente usados en la
construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores
de la b-lactamasa (penicilinasa) y de la lactasa
(Chang y col., Nature, 375: 615 (1978); Itakura y col., Science,
198: 1056 (1977); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)) y un
sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids
Res., 8: 4057 (1980); Nº publicación de la solicitud EPO 36.776), y
los sistemas de la fosfatasa alcalina. Mientras que éstos son los
más comúnmente usados, se han descubierto y usado otros promotores
microbianos, y se han publicado detalles relacionados con sus
secuencias nucleotídicas, posibilitando a un experto la ligación
funcional de los mismos con vectores plasmídicos (véase, por
ejemplo, Siebenlist y col., Cell, 20: 269 (1980)).
Además de los microorganismos procariotas, los
eucariotas, como las levaduras, son idóneamente usados en la
presente memoria descriptiva. Saccharomyces cerevisiae, o
levadura del pan común, es el más comúnmente usado entre los
microorganismos eucariotas, aunque hay varias cepas diferentes
comúnmente disponibles. Por ejemplo, para la expresión en
Saccharomyces, el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., Nature,
282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y
col., Gene, 10: 157 (1980)) es comúnmente usado. Este plásmido ya
contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección
para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de
crecer en un medio sin triptófano, por ejemplo, Nº ATCC 44.076 o
PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). La
presencia de la alteración trp1 como una característica del
genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona un entorno
eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en
ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en los
vectores de levadura incluyen los promotores de la
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol.
Chem., 255: 2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col.,
J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland y col., Biochemistry,
17: 4900 (1978)), como por ejemplo la enolasa, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosa-fosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa
y la glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión
adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes
están ligadas además al vector de expresión en el extremo 3' de la
secuencia que se desea expresar para proporcionar la poliadenilación
del ARNm y la terminación. Otros promotores que tienen la ventaja
adicional de estar transcripcionalmente controlados por las
condiciones de crecimiento son la región promotora de la alcohol
deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas
degradadoras asociadas al metabolismo del nitrógeno y la ya
mencionada gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y otras enzimas responsables del uso de la maltosa y
la galactosa. Cualquier vector plasmídico con un promotor compatible
con levadura, origen de replicación, y secuencias de terminación es
adecuado.
Además de los microorganismos, también se usan
cultivos de células derivadas de organismos multicelulares como
células hospedadoras. En principio, cualquier cultivo celular es
válido, tanto un cultivo de células de vertebrado, como de
invertebrado. Sin embargo, hay mucho más interés en las células de
vertebrados y la propagación de las células de vertebrado en cultivo
(cultivo de tejidos) es actualmente un procedimiento habitual en los
últimos años [Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson,
editores (1973)]. Los ejemplos de dichas líneas celulares
hospedadoras útiles son las células VERO y HeLa, líneas celulares
CHO y líneas celulares W138, BHK, COS-7, (ATCC CRL
1651), 293, y MDCK (ATCC CCL 34). Los vectores de expresión para
tales células incluyen normalmente (si fuera necesario) un origen de
replicación, un promotor localizado delante del gen que se va a
expresar, junto con cualquier sitio de unión a ribosomas necesario,
sitios de ayuste del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de
terminación de la transcripción.
Para usar en células de mamífero, las funciones
de control de los vectores de expresión a menudo se suministran en
material vírico. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados
proceden de polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente del virus
simio 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40
son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a
partir de virus como un fragmento que además contiene el origen de
replicación vírico del SV40 (Fiers y col., Nature, 273: 113 (1978)).
También son adecuados fragmentos del SV40 más pequeños o más
grandes, siempre que incluyan la secuencia de aproximadamente 250 pb
que va desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI
localizado en el origen de replicación vírico. Además, también es
posible, y a menudo deseable, usar promotores o secuencias de
control asociadas normalmente con la secuencia del gen deseado,
siempre que las secuencias de control sean compatibles con los
sistemas de la célula hospedadora.
Un origen de replicación se suministra
típicamente construyendo el vector para que incluya un origen
exógeno, como por ejemplo derivado del SV40 u otro origen vírico
(por ejemplo Polioma, Adeno, VSV, BPV), o por el mecanismo de
replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector se
integra en el cromosoma de la célula hospedadora, esto último es
suficiente.
Se producen cantidades satisfactorias de
variantes o dímeros del ligando en cultivos celulares, sin embargo,
se puede refinar, usando una secuencia codificadora secundaria, que
sirva para aumentar aún más los niveles de producción. La secuencia
codificadora secundaria comprende la dihidrofolato reductasa (DHFR)
que se ve afectada por un parámetro controlado externamente, como
por ejemplo metotrexato (MTX), permitiendo así el control de la
expresión controlado la concentración de MTX.
En la elección de una célula hospedadora
preferente para la transfección con los vectores de la invención
que comprenda secuencias de ADN que codifican tanto la selectina
variante como la proteína DHFR, es apropiado considerar el tipo de
proteína DHFR empleado. Si se emplea una proteína DHFR silvestre, es
preferible seleccionar una célula hospedadora que sea deficiente en
DHFR, permitiendo así el uso de la secuencia que codifica la DHFR
como un marcador para una correcta transfección en un medio
selectivo que carece de hipoxantina, glicina y timidina. Una célula
hospedadora apropiada en este caso en la línea celular CHO,
deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada, como se
describe en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 77:
4216 (1980).
Por otro lado, si se usa una proteína DHFR con
una afinidad de unión baja al MTX como la secuencia de control, no
es necesario usar células deficientes en DHFR. Porque el mutante
DHFR es resistente al MTX, se pueden usar medios con MTX como un
medio de selección, siempre que las células hospedadoras sean
sensibles al MTX. La mayoría de las células eucariotas que son
capaces de absorber MTX parecen se sensibles al MTX. Una de esas
líneas celulares válidas es la línea CHO, CHO-K1
(ATCC Nº CCL 61).
Se usan células de mamífero como células
hospedadoras, la transfección generalmente se realiza con el
procedimiento de precipitación con fosfato de calcio como se
describe en Graham y Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Sin
embargo, se pueden usar otros procedimientos para introducir el ADN
en las células, como por ejemplo la inyección nuclear, la
electroporación o la fusión con protoplastos.
Si se usa una levadura como célula hospedadora,
la transfección se realiza generalmente usando polietilenglicol,
como se muestra en Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75:
1929-1933 (1978).
Si se usan células procariotas o células con una
pared celular considerable, el procedimiento de transfección
preferente es el tratamiento con calcio usando el calcio como se
describe en Cohen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 69: 2110
(1972), o más recientemente por electroporación.
La construcción de vectores adecuados con las
secuencias codificadoras y de control deseadas, se basa en las
técnicas de ligación habituales. Los plásmidos o los fragmentos de
ADN aislados se cortan, se rellenan y se religan de la forma
deseada para formar los plásmidos necesarios.
El corte se realiza tratando con un enzima de
restricción (o varios) en un tampón adecuado. En general, se usa
aproximadamente 1 mg de plásmido o de fragmento de ADN con
aproximadamente 1 unidad de enzima en unos 20 ml de tampón y
sustrato para enzimas de restricción particulares, según lo
especifique el fabricante. Los tiempos de incubación de
aproximadamente una hora a 37 ºC son válidos. Después de la
incubación, se elimina la proteína con una extracción de fenol y
cloroformo, y el ácido nucleico se recupera de la fase acuosa
precipitando con
etanol.
etanol.
Si se necesitan extremos romos, la preparación se
puede tratar durante 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del
fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (Klenow), se extrae con
fenol-cloroformo y se precipita con etanol.
Para separar los fragmentos cortados según el
tamaño se emplea un gel de poliacrilamida al seis por ciento como
se describe en Goeddel y col., Nucleic Acids Res., 8: 4057
(1980).
Para la ligación, se tratan cantidades
aproximadamente equimolares de los componentes deseados, con los
extremos rellenados correctamente, para facilitar un emparejamiento
correcto, con aproximadamente 10 unidades de la ADN ligasa del T4
por cada 0,5 mg de ADN. (Cuando se usan los vectores cortados como
componentes, puede ser útil evitar la religación del vector cortado
con un tratamiento previo con una fosfatasa alcalina
bacteriana).
Como ya se ha comentado anteriormente, las
variantes del ligando se producen preferentemente mediante mutación
dirigida, las variantes útiles en la práctica de la presente
invención se originan más fácilmente mediante el uso de una
secuencia oligonucleotídica específica que codifique la secuencia de
ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de
nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia con un
tamaño y complejidad suficiente para formar un dúplex estable en
ambos extremos de la mutación que se está explorando.
Para analizar y confirmar las secuencias
correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se
usan típicamente para transformar E. coli K12 (ATCC 31.446) u
otras cepas adecuadas de E. coli, y se selecciona a los
transformantes correctos por su resistencia en medios con ampicilina
o tetraciclina cuando sea apropiado. Los plásmidos de los
transformantes se prepararán y analizan mediante mapas de
restricción y/o secuenciación del ADN con el método de Messing y
col., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o con el método de Maxam y
col., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).
Después de la introducción del ADN en la célula
hospedadora de mamífero y de la selección en un medio para los
transformantes estables, se efectúa una amplificación de la
secuencia que codifica la proteína DHFR creciendo los cultivos
celulares en presencia de aproximadamente concentraciones de MTX de
20.000 a 500.000 nM, un inhibidor competitivo de la actividad DHFR.
El intervalo efectivo de concentración depende mucho, por supuesto,
de la naturaleza del gen DHFR y de la proteína y de las
características de la célula hospedadora. Claramente, los límites
superior e inferior generalmente no pueden precisarse con
exactitud. También se pueden usar concentraciones adecuadas de
otros análogos del ácido fólico u otros compuestos que inhiban la
DHFR. Sin embargo, MTX es conveniente, fácilmente disponible y
eficaz.
En una forma de realización particular, las
moléculas quiméricas ligando-inmunoglobulina se
usan según la presente invención. Las quimeras
ligando-inmunoglobulina preferentemente se recuperan
a partir del medio de cultivo como proteínas de secreción, aunque
también se pueden recuperar a partir de lisados celulares cuando se
expresan directamente sin una señal de secreción. Cuando la quimera
se expresa en una célula recombinante que no tenga origen humano,
la variante queda así completamente libre de proteínas de origen
humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante a partir de
las proteínas de la célula recombinante para obtener preparaciones
que sean sustancialmente homogéneas en relación a la proteína. Como
primer paso, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para
eliminar partículas de restos celulares.
La quimera se purifica después a partir de las
proteínas solubles contaminantes, por ejemplo, con una combinación
apropiada de procedimientos de cromatografía convencionales, por
ejemplo, filtración en gel, intercambio iónico, interacciones
hidrófobas, afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, HPLC en fase
reversa, precipitación, por ejemplo, precipitación con etanol,
precipitación con sulfato de amonio, o preferentemente,
inmunoprecipitación con anticuerpos anti HGF (policlonales o
monoclonales) unidos covalentemente a Sefarosa. Debido a su gran
afinidad por la heparina, HGF se puede purificar convencionalmente
con heparina, como por ejemplo, una columna de sefarosa con
heparina. Un experto en la materia comprenderá que los
procedimientos de purificación adecuados de una HGF nativa pueden
requerir alguna modificación para tener en cuenta los cambios en
las características de HGF o de sus variantes una vez expresadas en
el cultivo celular recombinante.
En una forma de realización adicional, los dos
ligandos (idénticos o diferentes) se unen con un enlazador que no
sea una inmunoglobulina. El enlazador puede ser el residuo de un
agente reticulante covalente capaz de enlazar los dos ligandos sin
dañar a la función de unión al receptor o un enlace cuya formación
se induce por dichos agentes reticulantes. En Tae, H. Jr. in Meth.
Enzymol. 580-609 (1983) y en la bibliografía citada
en dicho artículo se ofrece una concisa revisión de los agentes
reticulantes incluyendo una guía para seleccionar dichos agentes y
procedimientos para su preparación. La selección del reactivo más
apropiado para un propósito específico a partir de la amplia
variedad de agentes reticulantes disponible, depende del criterio
del experto.
En general, se prefieren los agentes reticulantes
de longitud cero, homofuncionales o heterofuncionales para el
propósito de la presente invención. Los reactivos reticulantes de
longitud cero inducen la conjugación directa de los ligandos sin la
introducción de ningún material extrínseco. Los agentes que
catalizan la formación de puentes disulfuro pertenecen a esta
categoría. Otro ejemplo son los reactivos que inducen la
condensación de los grupos carboxi y amino primarios para formar un
puente amida, como por ejemplo, carbodiimidas, etilcloroformato,
reactivo de Woodward K1, carbonildiimidazol, etc. Los reactivos
homobifuncionales incluyen dos grupos funcionales idénticos,
mientras que los reactivos heterofuncionales contienen grupos
funcionales distintos. Una gran mayoría de los agentes reticulantes
heterobifuncionales contiene un grupo reactivo amina y un grupo
reactivo tiol. En Heindel, N.D. y col., Bioconjugate Chem. 2,
427-430 (1991)] se desveló un novedoso enlazador
heterofuncional para enlaces formilo-tiol.En una
forma de realización preferida, los agentes reticulantes covalentes
se seleccionan de reactivos capaces de formar puentes disulfuro
(-S-S-), glicol
(-CH[OH]-CH[OH]-), azo (-N=N-),
sulfona (-S[=O2]-), o éster (-C[=O]-O-).
En un enfoque diferente, los ligandos se enlazan
a través de oligosacáridos. La oxidación química o enzimática de
oligosacáridos en ligandos polipeptídicos con aldehídos produce
grupos funcionales únicos en la molécula, que pueden reaccionar con
compuestos que contengan, por ejemplo, aminas, hidrazinas,
hidrazidas o semicarbazidas. Ya que los sitios de glicosilación
están bien definidos en las moléculas polipeptídicas, los enlaces
selectivos a través de residuos de oligosacáridos oxidados
producirán un producto más uniforme que otros procedimientos de
enlace, y se espera que tengan menos efectos secundarios en las
propiedades de unión al receptor de los ligandos. Los agentes
reticulantes heterobifuncionales dirigidos por carbohidratos se
desvelan por ejemplo, en la solicitud de patente copendiente con Nº
de serie 07/926.077 depositada el 5 de agosto de 1992.
Se entenderá que es posible el enlace de más de
dos secuencias de ligando con varias secuencias unidas, por ejemplo,
reactivos reticulantes, y está incluido en el alcance de la presente
invención.
En una forma de realización adicional, dos o más
ligandos se conectan a través de secuencias enlazadoras
polipeptídicas, y por consiguiente, se presentan a su receptor como
una molécula polipeptídica multifuncional. Las funciones del
enlazador polipeptídico como un "espaciador" cuya función es
separar los dominios del ligando funcionales de modo que puedan
asumir independientemente su correcta conformación terciaria. El
enlazador polipeptídico normalmente comprende entre aproximadamente
5 y aproximadamente 25 residuos, y contiene preferentemente al
menos aproximadamente 10, más preferentemente al menos
aproximadamente 15 aminoácidos, y está compuesto por residuos
aminoacídicos que juntos confieren una región relativamente
desestructurada hidrófila. Las secuencias aminoacídicas de enlace
con pocas o sin estructuras secundarias funcionan bien. Si lo desea,
en el enlazador polipeptídico se puede incluir uno o más sitios de
corte reconocibles por un agente de corte específico (por ejemplo
una proteasa). Los aminoácidos específicos del espaciador pueden
variar, sin embargo, se deben evitar las cisteínas. La secuencia
espaciadora puede mimetizar la estructura terciaria de una secuencia
aminoacídica normalmente enlazada a dos dominios de unión a
receptor en un ligando bifuncional nativo. Esto se puede designar
para asumir una estructura deseada, como por ejemplo una estructura
helicoidal. Los enlazadores polipeptídicos adecuados se desvelan,
por ejemplo, en el documento WO88/09344 (publicado el 1 de diciembre
de 1988), como son los procedimientos para la producción de
proteínas multifuncionales que comprendan dichos enlazadores.
En una forma de realización específica, los
ligandos se dimerizan a través de hélices anfífilas. Se sabe que
las copias recurrentes del aminoácido leucina (Leu) en las proteínas
reguladoras de genes pueden servir como dientes para "alinearse
como en una cremallera" dos moléculas de proteínas para formar un
dímero. La cremallera de leucina se descubrió en primer lugar
cuando se ajustó un pequeño segmento de la proteína C/EBP en una
hélice alfa hipotética. Sorprendentemente, las leucinas, que se
pueden ensamblar cada siete aminoácidos de la proteína, alineados
en una columna. Posteriormente, se identificaron dos proteínas
asociadas a C/EBP adicionales y demostraron que tenían una función
similar. Una de ellas, GCN4 es un gen regulador de proteínas de
levadura, la otra, es el producto de un protooncogen jun. Se ha
descubierto que las regiones cremallera se asocian en paralelo
cuando se combinan, es decir, las leucinas de moléculas opuestas se
alinean lado a lado. También se ha demostrado que las proteínas no
idénticas pueden "alinearse como en una cremallera" para
formar heterodímeros. Dichas cremalleras de leucina son
particularmente adecuadas para preparar dímero de ligando incluidos
en el alcance de la invención. Alternativamente, se puede tomar la
secuencia de la hélice anfipática a partir de un diseño en haz de
cuatro hélices, esencialmente como se describe en Pack P. y
Pluckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992).
Para más detalles a nivel molecular, por ejemplo, las cremalleras de
leucina, que pueden servir de enlazadores heterólogos para el
propósito de la presente invención, véase por ejemplo: Landshculz,
W.H., y col. Science 240, 1759-1764 (1988); O'Shea,
E.K. y col., Science 243, 538-542 (1989); McKnight,
S.L., Scientific American 54-64, Abril de 1991;
Schmidt-Dorr. T. y col., Biochemistry 30,
9657-9664 (1991); Blondel, A. y Bedouelle, H.
Protein Engineering 4, 457-461 (1991), Pack, P. y
Pluckthun, A., citado con anterioridad, y la bibliografía citada en
estos artículos.
En una forma de realización específica, la
presente invención ofrece procedimientos para la conversión de
variantes del ligando capaces de unirse a sus receptores pero que
carecen o tienen un capacidad de activación del receptor reducida
frente al potente agonista de los respectivos ligandos nativos. Los
ligandos diana conservan preferentemente sustancialmente toda la
afinidad de unión al receptor del ligando nativo.
La expresión "conservar sustancialmente toda la
afinidad de unión al receptor del ligando nativo" y las
variantes gramaticales se usan en la presente memoria descriptiva
para indicar que la afinidad de unión al receptor de la variante
del ligando no inferior a aproximadamente el 70%, preferentemente no
inferior a aproximadamente el 80%, más preferentemente no inferior
a aproximadamente el 90%, más preferentemente no inferior a
aproximadamente el 95% de la afinidad con la que el ligando nativo
correspondiente se une a su receptor.
La capacidad de unión al receptor se puede
determinar en ensayos habituales, como por ejemplo, los ensayos de
unión competitiva desvelados en los ejemplos:
Los términos "sustancialmente incapaz de
activar el receptor", y "sustancialmente desprovisto de
actividad biológica" indican que la actividad de un ligando
variante es inferior a aproximadamente el 20%, preferentemente,
inferior a aproximadamente el 15%, más preferentemente inferior a
aproximadamente el 10%, más preferentemente inferior a
aproximadamente el 5% de la actividad respectiva del ligando nativo
correspondiente en un ensayo realizado de activación del receptor o
de actividad biológica del ligando.
La operabilidad de la presente invención se
demostró en primer lugar activando el receptor del factor de
crecimiento hepatocítico (HGFr) con moléculas quiméricas formadas
por la fusión de los ligandos HGF silvestres y sus secuencias
aminoacídicas variantes frente a las secuencias del dominio
constante de la inmunoglobulina.
La actividad biológica de HGF puede, por ejemplo,
determinarse en un ensayo in vitro o in vivo de
estimulación del crecimiento hepatocítico. Se han usado extensamente
cultivos primarios de hepatocitos de ratas adultas para buscar
factores que regulasen la proliferación de hepatocitos. Por
consiguiente, el efecto mitogénico de una variante de HGF se puede
determinar convenientemente en un ensayo adecuado para probar la
capacidad de inducción de la síntesis de ADN en cultivos primarios
de hepatocitos de rata de una molécula de HGF, como se describe,
por ejemplo, en el ejemplo 2. Los hepatocitos humanos se pueden
obtener también a partir de perfusión hepática total de órganos que
no se puedan transplantar, disminuciones de hígados adultos usados
en transplantes en niños, restos de hígados e hígados fetales
extirpados quirúrgicamente para otras indicaciones. Los hepatocitos
humanos se pueden cultivar de modo similar a los procedimientos
establecidos para preparar cultivos primarios de hepatocitos
normales de rata. La síntesis de ADN en hepatocitos puede
analizarse, por ejemplo midiendo la incorporación de
timidina[H^{3}] al ADN, con controles de hidroxiurea
apropiados para la síntesis replicativa.
El efecto de las variantes de HGF sobre el
crecimiento de los hepatocitos también se puede analizar in
vivo, en modelos animales de alteraciones hepáticas y
regeneración, como por ejemplo, en ratas que han sido sometidas a
una hepatectomía parcial, o lesiones hepáticas provocadas con
tetracloruro de carbono, en modelos de fallos hepáticos agudos
inducidos por D-galactosamina, etc. Según un
protocolo adecuado, se administra a las ratas un veneno hepático,
por ejemplo, \alpha-naftilisotiocianato (ANIT) en
una concentración predeterminada capaz de provocar un aumento
significativamente reproducible de las enzimas hepáticas y de los
niveles de bilirrubina. Las ratas se tratan después con la variante
de HGF para después estudiarlas. Se sacrifican y se determinan los
niveles de enzimas hepáticas y de bilirrubina. Se realiza una
observación adicional en busca de lesiones hepáticas.
La actividad biológica de otros ligandos y
variantes de ligando se puede ensayar por procedimientos conocidos
en la técnica.
Los compuestos de la presente invención son
capaces de activar a sus respectivos receptores y mimetizar de este
modo la actividad biológica de los ligandos nativos
correspondientes. Se pueden formular según procedimientos conocidos
para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, a través de
las cuales las variantes de ligando unidas se combinan en una
mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co.,
editado por Oslo y col. se describen vehículos adecuados para estas
formulaciones. Estas composiciones contendrán típicamente una
cantidad eficaz del compuesto, por ejemplo, del orden de
aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml, junto con una cantidad suficiente de
vehículo para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables
adecuadas para la administración eficaz al paciente. Los compuestos
se pueden administrar vía parenteral o por otros procedimientos
para garantizar su llegada al torrente sanguíneo de forma eficaz,
siguiendo esencialmente las vías de administración conocidas para
los ligandos nativos correspondientes.
Las composiciones particularmente idóneas para la
administración clínica de los compuestos de la presente invención
son los mismos, o que se pueden desarrollar basándose en, las
formulaciones conocidas para los ligandos nativos
correspondientes.
La dosificación y las concentraciones de fármaco
deseadas de las composiciones farmacéuticas pueden variar
dependiendo del uso particular potencial. Las dosis preliminares se
pueden determinar en pruebas con animales, y se puede llevar a cabo
una extrapolación interespecífica de las dosis de maneras conocidas
en la técnica, por ejemplo, como se desvela en Mordenti y col.,
Pharmaceut. Res. 8, 1351 (1991) y en la bibliografía citada en dicho
artículo.
Los siguientes ejemplos meramente ilustran el
mejor modo actualmente contemplado para la práctica de la invención,
pero no se deben interpretar como una limitación de la
invención.
El aislamiento de ADN plasmídico, se usó
electroforesis en gel de poliacrialmida como se desvela en Sambrook
y col., citado con anterioridad.
Para la mutagénesis de huHGF se usó el plásmido
de expresión en mamíferos pRK5.1 con un promotor CMV Genentech,
Inc.) que permite la secreción de las variantes de HGF en el medio
de cultivo y ensayar directamente la actividad biológica y la
capacidad de unión. Este vector de expresión es un derivado del
pRK5, cuya construcción se desvela en el documento EP307.247
publicado el 15 de marzo de 1989. pRK5.1 deriva del RK5 por
inserción del oligonucleótido autocomplementario
5'-AGCTTGCCTCGAGGCA- 3' (Identificador de secuencia
Nº: 14). La secuencia nucleotídica que codifica este vector pRK5.1
se desvela en la solicitud copendiente con Nº de serie 07/885.971
depositada el 18 de mayo de 1992.
El ADNc de huHGF usado corresponde a la forma de
728 aminoácidos como ya se ha publicado antes (Miyazawa y col.,
1989, citado con anterioridad).
La mutagénesis se realizó según el método de
Kunkel que usa la cepa de E. coli dut ung [Kunkel y col.,
Method. Enzymol. 154, 367-382 (1987)]. Los
oligonucleótidos sintéticos usados para la mutagénesis in
vitro y los cebadores para la secuenciación se prepararon usando
el sintetizador de ADN 380A de Applied Biosystem como se describe
en Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103,
3185-3191 (1981). Para la generación de los
mutantes deseados, se sintetizaron los oligonucleótidos de las
secuencias que codifican las sustituciones aminoacídicas deseadas y
se usaron como cebadores. Se hibridaron los oligonucleótidos con un
pRK 5.1-huHSA de cadena sencilla que ha sido
preparada por procedimientos habituales [Viera y col., Method.
Enzymol. 142, 3 (1987)].
Se combinó una mezcla de tres
desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP),
deoxirriboguanosina
(dGTP), y deoxirribotimidina (dTTP), con tiodesoxirribonuleosina llamada dCTP(aS) incluida en el kit del fabricante, y se añadió al pRK 5.1-huHGF de cadena sencilla al que se hibridó el oligonucleótido.
(dGTP), y deoxirribotimidina (dTTP), con tiodesoxirribonuleosina llamada dCTP(aS) incluida en el kit del fabricante, y se añadió al pRK 5.1-huHGF de cadena sencilla al que se hibridó el oligonucleótido.
Tras la adición de la ADN polimerasa a esta
mezcla, se generó una cadena de ADN idéntica a pRK
5.1-huHGF salvo en las bases mutadas. Además, esta
nueva cadena de ADN contiene dCTP(aS) en lugar de dCTP, que
sirvió para protegerla de la digestión por endonucleasas de
restricción. Después de cortar la cadena molde del heterodúplex de
cadena doble con un enzima de restricción adecuado, se digirió la
cadena molde con la nucleasa ExoIII en la región anterior al
oligómero mutagénico. Se detuvo la reacción para permitir que una
caperuza molecular fuera sólo parcialmente de cadena sencilla.
Después, se formó un homodúplex de ADN de cadena doble con una ADN
polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos
trifosfato, ATP, y una ADN ligasa.
Se prepararon los siguientes oligonucleótidos
para usarlo como cebadores para generar moléculas variantes de pRK
5.1-huHGF.
La variante de huHGF Y673S, V692S se obtuvo a
partir de un huHGF silvestre como molde, usando los oligonucleótidos
usados para generar ambas mutaciones.
Se transformó la cepa MM294tonA de E. coli
con las construcciones de huHGF mutantes generadas usando el
anterior protocolo, usando el procedimiento de cloruro de calcio
habitual (Sambrook y col., citado con anterioridad) para la
preparación y transformación de las células competentes. MM294tonA
(que es resistente al fago T1) se preparó por la inserción y
posterior escisión imprecisa de un transposón Tn10 en el gen TonA.
Este gen se insertó después, usando mutagénesis por inserto de
transposón [Kleckner y col., J. Mol. Biol. 116,
125-159 (1977)], en la célula hospedadora E.
coli MM294 (ATCC 31.446).
La extracción del ADN de las colonias
individuales de los transformantes bacterianos usando el
procedimiento habitual de miniprep de Sambrook y col, citado con
anterioridad. Los plásmidos se purificaron adicionalmente
pasándolos a través de una columna de centrifugación Sephacryl CL6B
y después analizándolos por secuenciación y por digestión con
endonucelasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa.
Los plásmidos con la secuencia correcta se usaron
para transfectar células 293 renales embrionarias humanas con el
procedimiento del fosfato de calcio. Las células 293 crecieron hasta
un 70% de confluencia en placas de 6 pocillos. Se disolvieron 2,5
mg de la variante de ADN plasmídico de huHGF en 150 ml de
Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. Se
añadió (gota gota con agitación) 150 ml de tampón HEPES 50 mM (pH
7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se dejo que se formara un
precipitado durante diez minutos a 25ºC. El precipitado
resuspendido se añadió a las células en los pocillos individuales de
la una placa de 6 pocillos. Las monocapas celulares se incubaron
durante 4 horas en presencia del precipitado de ADN, se lavaron una
vez con PBS y se cultivaron en medio sin suero durante 72 horas.
Cuando se obtuvieron poblaciones estables, se subclonó el ADN de
HGF en un plásmido episomal bajo el control del promotor CMV, el
pCisEBON (G. Cachianes, C, Ho, R. Weber, S. Williams, D. Goeddel, y
D. Lueng, en preparación). pCisEBON es un derivado del pRK5 que
incluye secuencias que codifican un marcador de selección que
codifica la neomicina fosfotransferasa (NEO), un origen de
replicación derivado del origen del virus de Epstein Barr (ori P) y
el gen vírico EBNA-1. El producto del gen
EBNA-1 promueve la replicación estable y episomal de
los plásmidos con la secuencia ori P [véase Cachianes, G. y col.,
Technique, in press (1992)]. La secuencia nucleotídica que codifica
el pCisEBON se desvela en la solicitud copendiente con Nº de serie
07/885.971 depositada del 18 de mayo de 1992. Las poblaciones se
seleccionaron directamente en un medio selectivo con neomicina.
En vista de las actividades pleiotrópicas de HGF,
una molécula con una estructura diferente de cualquier otro factor
de crecimiento, es importante comprender la interacción molecular de
este factor con su receptor. Las variantes de huHGF producidas como
se describe en el ejemplo 1 se analizaron para estudiar su
capacidad para inducir la síntesis de ADN en cultivos primarios de
hepatocitos y para competir en la unión con una forma soluble del
receptor de huHGF.
Se usó un ELISA tipo sándwich de huHGF bilateral
específico usando dos anticuerpos monoclonales para cuantificar el
huHGF recombinante silvestre (rhuHGF WT), de cadena sencilla y
variantes por sustitución por proteasas. Las placas de
microtitulación (Maxisorb. Nunc) se revistieron con 10 mg/ml de un
anticuerpo A 3.1.2 anti rhuHGF monoclonal (fenotipo IgG2a,
afinidad): 3,2 x 10^{-8} mol) en un tampón carbonato 50 mM, pH
9,6, durante la noche a 4ºC. Después de bloquear las placas con BSA
(seroalbúmina bovina de Sigma) al 0,5%, 0,01% de timerosal en PBS,
pH 7,4 y posteriores lavados, se prepararon diluciones en serie por
duplicado de las muestras de HGF y se expresaron en paralelo en
células CHO rhuHGF (40-0,1 ng/ml) y se usaron como
un estándar. Se incubaron simultáneamente cincuenta microlitros de
estas diluciones con 50 ml de una dilución 1:1500 de peroxidasa de
rábano picante conjugada con el anticuerpo B 4.3 anti rhuHGF
(fenotipo IgG1, afinidad: 1,3 x 10^{-8} mol) durante 2 horas a
temperatura ambiente (TA). Se preparó el sustrato añadiendo 0,04%
de dihidrocloruro de o-fenilenediamina (Sigma) y
0,012% (v/v) de hidrogenperoxido (Sigma) a PBS y se añadieron 100
ml a las placas lavadas durante 15 minutos a TA. Se detuvo la
reacción añadiendo 50 ml de ácido sulfúrico 2,25 M a cada pocillo.
La absorbancia a 490 nm, restando la absorbancia a 405 nm como
ruido, se determinó en un lector de placas de microtitulación
(Vmax, Molecular Devices, Menlo Park, CA). Los datos se redujeron
usando un programa de ajuste a una curva según cuatro parámetros
desarrollado por Genentech, Inc.
Se usó un ELISA tipo sándwich policlonal de HGF
para cuantificar todas las variantes por deleción de dominios
kringle y por truncamientos del extremo C terminal. Brevemente, se
revistieron las placas de microtitulación (Nunc) con 5 mg/ml de una
preparación de anticuerpos IgG (anti rhuHGF expresado en células
CHO) policlonal de cobaya (Genentech, Inc.) como se describe
anteriormente. Este anticuerpo reconoce a rhuHGF así como a las
formas truncadas de HGF cuando se comparan en una inspección visual
de inmunotransferencias tipo Western, haciéndolo idea para estudiar
las variantes HGF. Se bloquearon las placas y se añadieron
diluciones enserie por duplicado de los sobrenadantes de las
células (1:103-6,106) y se incubaron durante la
noche a 4ºC. Se usó un rhuHGF (100-0,78 ng/ml)
expresado en células CHO y purificado como estándar y se incubó en
paralelo. Se lavaron las placas y se incubaron con una dilución de
1:500 del mismo anticuerpo policlonal (aprox. 400 ng/ml) pero en
este caso con el conjugado de peroxidasa de rábano picante para la
detección de las variantes (véase con anterioridad). Se realizó una
transferencia por adsorción tipo Western para determinar el tamaño
de las variantes de HGF expresadas. Para esto, se realizaron
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS e
inmunotransferencias tipo Western usando procedimientos habituales
con la preparación de anticuerpos IgG policlonales (500 ng/ml). Se
usó un procedimiento de detección por quimioluminiscencia (Amersham)
y un conjugado de IgG-peroxidasa de rábano picante
anti cobaya (1:5000) para el desarrollo de una inmunotransferencia
como describe el fabricante.
Los estudios previos sobre la capacidad de unión
a un HGF han demostrado que huHGF podría unirse a su receptor de
superficie celular con una alta afinidad
(Kd-24-32 pM; Higuchi and Nakamura,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 174, 831-838 (1991)).
Preferimos examinar la capacidad de unión de HGF usando una forma
soluble del receptor debido a la unión inespecífica de HGF a los
proteoglicanos de sulfato de heparina de la superficie celular
[Naldini y col., EMBO J. 10, 2867-2878 (1991)].
Se analizaron los sobrenadantes celulares
(concentrados con filtros Amicon si la concentración era inferior a
600 ng/ml) para estudiar su capacidad de bloquear en solución la
unión de rhuHGF I^{125} expresado en células CHO
(2-5 x 10^{3} Ci/mmol, amablemente facilitado por
T. Zioncheck, Genentech, Inc.) al dominio extracelular del receptor
de HGF humano (huHGFr) fusionado a la región constante Fc de una IgG
humana, expresada y secretada en células 293.
Se construyó un clon de ADNc de longitud completa
que codifica el huHGFr uniendo ADNC parciales aislados de genotecas
de ADNc y por amplificación con PCR. Las secuencias codificadoras de
los aminoácidos 1-270 se aislaron de una genoteca de
ADNc de placenta (facilitado por T. Mason, Genentech) analizada con
un oligonucleótido de 50 mer
5'-ATGAAGGCCCCCGCTGTGCTTGCACCTGGCATCCTCGTGCTCCTGTTTACC-3')
(Identificador de secuencia Nº: 15). Las secuencias que codifican
los aminoácidos 809-1390 se aislaron de una genoteca
de hígado humano (Stragagen) analizada con la sonda
oligonucleotídica
(5'-CACTAGTTAGGATGGGGGACATGTCTGTCA
GAGGATACTGCACTTGTCGGCATGAACCGT-3'). (Identificador de secuencia Nº: 16).
GAGGATACTGCACTTGTCGGCATGAACCGT-3'). (Identificador de secuencia Nº: 16).
Las condiciones para la siembra en placas de las
genotecas, y para la hibridación y los lavados de los filtros
fueron como ya se ha descrito [Godowski y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 86, 8083-8087 (1989)]. Se uso la PCR
para aislar un clon de ADNc con los residuos 271-808
del HGFr (c-met) a partir de células A549. Se
usaron diez mg de ARN total para la transcripción reversa usando un
cebador específico para el HGFr
(5'-TAGTACTAGCACTATGATGTCT-3')
(Identificador de secuencia Nº: 17) en una reacción de 100 ml usando
la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina Moloney y
los tampones suministrados por Bethesda Research Laboratories. Una
décima parte de las mezclas de reacción se usaron para la
amplificación por PCR. La reacción de PCR se llevó a cabo en un
volumen de 100 ml con 10 ml de la reacción de la transcriptasa
reversa, KCl 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8),
(NH_{4})SO_{4} 10 mM, MgSO_{4}, 6 mM, 0,1% de Trition
X-100, 1 U de ADN polimerasa Vent (New England
Biolabs) y 50 pmol del cebador directo
(5'-TTTACTTCTTGACGGTCCAAAG-3'
(Identificador de secuencia Nº: 18) y el cebador reverso
(5'-CAGGGGGAGTTGCAGATTCAGCTGT-3')
(Identificador de secuencia Nº: 19). Después de treinta ciclo de
desnaturalización (95 ºC, 1 m), hibridación (55ºC, 45 s) y
elongación (72ºC, 2 m), se recuperó el producto de la PCR a partir
de geles de agarosa de baja temperatura de fusión. Se subclonó el
ADNc de HGFr de longitud completa en el vector pRK7 (véase el
documento WO90/02798, publicado el 22 de marzo de 1990) y la
secuenciación de la cadena doble se realizó con el procedimiento del
didesoxinucleótido.
Se fusionó la secuencia codificadora del dominio
extracelular de huHGFr con la de la cadena pesada de una IgG1
humana en un proceso de dos pasos. Se uso una PCR para generar
fragmento con un sitio único BstEII en 3' de las secuencias
que codifican el aminoácido 929 de HGFr. Se usó el cebador 5'
(localizado en el vector en dirección 5' de las secuencias
codificadoras) y el cebador 3'
(5'-AGTTTTGTCGGTGACCTGATCATTCTGATCTGGTTGAAC
TATTAC-3') (Identificador de secuencia Nº: 20) en una reacción de 100 ml como se describe con anterioridad salvo que el tiempo de elongación a 72ºC fueron 3 minutos y como molde se usaron 40 ng del vector de expresión de HGFr. En la siguiente amplificación, el producto de la PCR se unió al ADNc de la cadena pesada de la IgG1 \gamma1 humana a través del sitio BstEII en esa construcción [Bennett y col., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)]. La construcción resultante contiene las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-929 de huHGFr fusionados a través del sitio BstEII (añadiendo las secuencias codificadoras para los aminoácidos V y T) para las secuencias que codifican los aminoácidos 216-443 de la cadena pesada de una IgG1 \gamma1 humana. La secuenciación de la construcción se llevó a cabo como se describe anteriormente.
TATTAC-3') (Identificador de secuencia Nº: 20) en una reacción de 100 ml como se describe con anterioridad salvo que el tiempo de elongación a 72ºC fueron 3 minutos y como molde se usaron 40 ng del vector de expresión de HGFr. En la siguiente amplificación, el producto de la PCR se unió al ADNc de la cadena pesada de la IgG1 \gamma1 humana a través del sitio BstEII en esa construcción [Bennett y col., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)]. La construcción resultante contiene las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-929 de huHGFr fusionados a través del sitio BstEII (añadiendo las secuencias codificadoras para los aminoácidos V y T) para las secuencias que codifican los aminoácidos 216-443 de la cadena pesada de una IgG1 \gamma1 humana. La secuenciación de la construcción se llevó a cabo como se describe anteriormente.
El ensayo de unión se realizó en placas de
microtitulación (Nunc) desechables revestidas durante la noche a
4ºC con 1 mg/ml de un anticuerpo específico anti Fc de IgG humana
(Jackson Immunoresearch) y se lavaron plas placas cuidadosamente
con PBS con un 0,05% de Tween 20 (Biorad). Después de bloquear con
PBS con 0,1% de BSA, se añadió en el mismo tampón
rhuHGF-I^{125} 50pM a razón de 25 ml por pocillo.
A cada pocillo se añadió y por duplicado 50 ml de diluciones
seriadas (1:25-1:6000) de sobrenadantes celulares,
rhuHGF expresado en células CHO purificado
(25.000-0,064 pM) o medio selectivo. Posteriormente,
se añadieron 25 ml de la proteína de fusión receptor de HGF:IgG 50
pM y se incubaron las placas con una ligera agitación. Después de 4
horas, cuando se alcanzó el equilibrio, se lavaron las placas y los
pocillos, se realizaron recuentos individuales en un contador
gamma. La cantidad de radiactividad unida inespecíficamente se
estimó incubando la proteína de fusión receptor de HGF:IgG con un
exceso de rhuHGF sin marcar. La constante de disociación (Kd) de
cada análogo se calculó a la CI50 a partir de las curvas de
inhibición ajustadas usando la concentración determinada por el
ELISA.
La actividad biológica de huHGF WT y de las
variantes se midió en función de su capacidad de inducir la
síntesis de ADN en cultivos primarios de hepatocitos de rata. Los
hepatocitos se aislaron según las técnicas de perfusión publicadas
con ligeras modificaciones [Garrison y Haynes, J. Biol. Chem. 150,
2269-277 (1975)]. Brevemente, se realizó una
perfusión en hígados de ratas hembras Sprague Dawley
(160-180 g) a través de la vena portal con 100 ml
de una solución salina tamponada con HEPES sin Ca^{++} con un
0,02% de colagenasa tipo IV Sigma). Después de 20 minutos se
extirparon los hígados, se colocaron en un tampón y se agitaron
suavemente para separar los hepatocitos del tejido conectivo y de
los vasos sanguíneos, y se filtraron por una malla de nailon. Se
lavaron las células por centrifugación, se resuspendieron a razón de
1x10^{5} células/ml en medio Williams E (Gibco) con penicilina
(100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), L-glutamina
(2 mM), oligoelementos (0,01%), transferrina (10 mg/ml) y
aprotinina (1 mg/ml). Se incubaron los hepatocitos en placa de
microtitulación de 96 pocillos (Falcon) en presencia de diluciones
seriadas de rhuHGF expresado en células CHO y purificado,
(1-0,031 mg/ml), sobrenadantes de células 293
(1:4-1:256) o medio. Después de 48 horas de
incubación a 37ºC, se añadió TdR-H^{3} 0,5 mCi (15
Ci/mmole, Amersham) a cada pocillo y se incubaron durante 16 horas
adicionales. Se recogieron las células en papel de filtro, que se
lavaron a continuación, se secaron y se recontaron en un contador
Beckman tras la adición de un líquido de centelleo. Para cada
variante huHGF, la actividad específica (AE) expresada en
unidades/mg se calculó a la proliferación semimáxima (definida como
1 unidad/ml) usando la concentración de HGF obtenida en el
ELISA.
Se cultivaron monocapas de células de carcinoma
de pulmón humano (A549) en un medio RPMI 1640 con un 10% de suero
fetal bovino y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda con un
5% de CO_{2}. Las células sin suero se incubaron con o sin 200
ng/ml de rhuHGF durante 5 minutos a 37ºC y se extrajeron con tampón
de lisis con HEPES 50 mM, NACl 150 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, EGTA 1 mM;
glicerol al 10%, Triton X-100 al 1% y una
combinación de inhibidores de proteasas. Se inmunoprecipitaron los
lisados con anticuerpos anti Met COOH y se transfirieron por
adsorción y se revelaron con anticuerpos anti fosfotirosina (véase
la transferencia por adsorción tipo Western, en los apartados
anteriores).
Los sitios de corte de proteasas normalmente
contienen un residuo básico en la posición P1 y dos residuos de
aminoácidos hidrófobos rn las posiciones P'1 y P'2, que están
después del enlace peptídico cortado. El sitio de corte propuesto
para huHGF (P1 R494, P'1 V495, P'2 V496) se ajusta a este consenso.
Decidimos intentar bloquear el corte de huHGF reemplazando el P1
R494 con D, E, o A. La forma principal de rhuHGF expresada en estas
células se corta en dos cadenas como se deduce de la presencia de la
cadena \alpha con una masa molecular aparente de 69 kDa (fig. 2).
Cada una de estas mutaciones parecía bloquear el procesamiento de
rhuHGF ya que en condiciones reductoras estas variantes miigraban
como una sola banda a 94 kDa, el tamaño teórico de una cadena
sencilla de HGF. Estas variantes carecían totalmente de la capacidad
de inducir la proliferación de hepatocitos en cultivos primarios
(fig. 3A). Sin embargo, cuando se analizaron estas variantes para
estudiar su capacidad de competir con el rhuHGF WT en la unión a la
proteína de fusión receptor de HGF:IgG, sus curvas de inhibición
eran aproximadamente similares a las del rhuHGF WT (fig. 3B). La Kd
determinada a partir de estas curvas mostró que rhuHGF WT se une a
la proteína de fusión con una gran afinidad (50-70
pM) mientras que todas las variantes de cadena sencilla mostraron
aproximadamente un Kd de 2 a 10 veces superior
(100-500 pM) en comparación con el rhuHGF WT. Los
resultados a partir de al menos tres ensayos independientes se
resumen en la tabla I como actividad proliferativa de los
hepatocitos y capacidad de unión al receptor en comparación con el
rhuHGF WT.
Nuestros estudios de unión demostraron que rhuHGF
WT se unía a la proteína de fusión del receptor soluble con una
sola clase de sitios de unión de alta afinidad
(50-70 pM), similares a los descubiertos en
hepatocitos por Higushi y Nakamura (1991). Sin embargo, la capacidad
de unión de HGF en células puede ser ligeramente diferente ya que
el receptor soluble es realmente un dímero unido el puente disulfuro
de la región bisagra de la región constante Fc de la IgGA.
La comparación directa de la actividad específica
(AE) frente a los cocientes de Kd de todas las variantes de cadena
sencilla demostró que eran inactivas a las concentraciones mayores
probadas (AE<3%) mientras que las afinidades de unión al
receptor sólo disminuyeron en un factor de 2-3.
Estos resultados justifican fuertemente que el
corte de HGF en la forma de dos cadenas es necesario para la
actividad mitogénica, es decir, que el HGF de cadena sencilla es un
promitógeno y que la forma sin cortar de HGF se une al receptor de
HGF, aunque con una afinidad reducida.
La forma principal de HGF aislada de placenta
[Hernandez y col., (1992) J. Cell Physiol., en prensa] o expresada
en células CHO transfectadas [Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 88, 415-419 (1991)] se encuentra en forma de
cadena sencilla. Cuando se analizó en ensayos mitogénicos, esta
forma de HGF de cadena sencilla se biológicamente activa. Esto
sugiere, junto con nuestros datos, que este HGF de cadena sencilla
se activa en la forma de doble cadena durante el ensayo
mitogénico.
Una segunda observación es que las variantes de
cadena sencilla conservan una capacidad sustancial de unirse al
receptor de HGF, como lo sugieren nuestros ensayos de unión
competitiva. Esto ofrece la interesante posibilidad de que un HGF
de cadena sencilla se pueda unir a un receptor de HGF de la
superficie celular in vivo en un estado inactivo y que
posteriormente se puede cortar en la forma activa de cadena doble
con la proteasa apropiada.
Para elucidar la importancia funcional del
dominio proteasa de HGF, se realizaron varias mutaciones sencillas,
dobles y triples para reconstituir un sitio potencial serina
proteasa. La construcción de estas variantes se describe en el
ejemplo 1.
Reemplazamos los residuos de HGF Q534 con H, Y673
con S, o V692 con S como mutaciones simples, dobles o triples. El
análisis de sus efectos sobre la actividad mitogénica y la capacidad
de unión al receptor demostró que la mutación simple Q534H no
alteraba significativamente ni la AE (5,2 x 10^{4} unidades/mg)
ni la Kd (60 pM) en comparación con el rhuHGF WT (respectivamente
3,3 10^{4} unidades/mg y 70 pM) mientras que Y673S y V692S
mostraron una AE reducida aproximadamente 5 y 10 veces,
respectivamente. De hecho, estas dos variantes nunca alcanzaron el
nivel estable máximo visto en el rhuHGF WT (aproximadamente 50% del
nivel estable de rhuHGF WT). Curiosamente, estas variantes
mostraron una Kd similar a la de rhuHGF WT. El resto de variantes
doble y triple mutantes también conservaron la capacidad de unirse
al receptor de HGF pero mostraron una AE claramente reducida (tabla
I). La AE residual de las variantes dobles Q534H, Y673S y Y673S,
V692S y de la triple variante Q534H, Y673S, V692S fue menor del 3%
en comparación con el rhuHGF WT. Sin embargo, la Kd de estas
variantes no fue significativamente diferente de la de rhuHGF WT
(tabla I). Estas variantes indican que las mutaciones en la cadena
\beta de HGF bloquean la actividad mitogénica pero son capaces de
unirse al receptor de HGF. De este modo, parece que estos mutantes
carecen de una actividad posterior a la unión al receptor.
Estos resultados muestran que aunque la cadena
\beta no sea necesaria para la unión al receptor, determinados
residuos (por ejemplo, Y673 y V692) son críticos para la estructura
y/o la actividad de HGF. La sustitución del residuo apolar V692 con
el residuo polar S podría haber causado una transición estructural
si se hubieran introducido nuevos puentes de hidrógeno en el sitio
activo del residuo D594, como el que se encuentra en las serina
proteasas. La sustitución de Y673 con el residuo más pequeño S
podría además introducir alguna modificación estructural local. Por
otro lado, la sustitución del residuo polar Q534 con otro residuo
polar H de amaño similar probablemente no causaría ninguna
diferencia drástica en la conformación de HGF ya que este residuo
estaría expuesto; de hecho la variante Q534H fue similar a rhuHGF
(tabla I).
Para afirmar si la cadena \alpha es necesaria
para la unión o para la actividad de HGF, se realizaron
truncamientos en el extremo C terminal como se describe en el
ejemplo 1, produciendo variantes con la cadena \alpha sola, o
variantes truncadas después del tercer (N-384) o el
segundo (N-303) dominio Kringle.
Se realizaron varios truncamientos en el extremo
C terminal delecionando la cadena \beta o la cadena \beta y un
número progresivo de dominios kringle como se ilustra en la fig. 1.
Una variante (N-207) correspondiente al dominio N
terminal con el primer dominio kringle no expresó la proteína a
niveles detectables ni por transferencia por adsorción tipo Western
ni por ELISA usando una preparación de anticuerpos policlonales y
no se continuó con su investigación. La expresión de las variantes
con los dos primeros dominios kringle (N-303), tres
dominios Kringles (N-384) o la cadena \alpha
completa de HGF fue de 250-600 ng/ml. En la tabla I
se presenta un resumen de la AE residual y de la Kd de estas
variantes en comparación con rhuHGF WT. A la concentración probada
no se observó actividad por encima de los niveles basales lo que
indica que estas variantes han perdido su actividad biológica. Sin
embargo, los estudios de competición por la unión demostró que las
variantes N-303, N-384 o la cadena
\alpha conservaban una sustancial capacidad de unión (hasta un 23%
en comparación con el rhuHGF WT). De este modo, los residuos 272
del extremo N terminal de HGF (la forma madura de la variante
N-303) son suficientes para la una alta afinidad de
unión al receptor de HGF.
Los resultados de la deleción de cada dominio
Kringle se muestran en la tabla I. La deleción del primer dominio
Kringle (variante \DeltaK1) de HGF afectó principalmente a la
actividad biológica, mostrando al menos una reducción de 100 veces
(SA< 0,2% de rhuHGF wt).
De modo similar, la capacidad de unión de esta
variante también se vio afectada ya que no fue capaz de competir
por la unión con rhuHGF wt hasta una concentración de 2 mg/ml. La
deleción del resto de dominios Kringle (variantes \DeltaK2,
\DeltaK3 o \DeltaK4) también induce una drástica reducción de la
actividad mitogénica (tabla I). Sin embargo, las Kd de estas
variantes por deleción fueron próximas a las observadas con el
rhuHGF wt.
Estos datos demuestran que los dominios kringle
K3 y K4 no son necesarios para la unión al receptor. Nuestros datos
apoyan las observaciones previas realizadas por Miyazawa y col.,
1991 citado con anterioridad, y Chan y col., 1991 citado con
anterioridad, en el sentido de que la variante
N-303, cuya secuencia aminoacídica es muy similar a
la de HGF/NK2, conserva la capacidad de competir eficazmente por la
unión al receptor de HGF Kd~280 pM). Además, las observaciones de
que N-303 es suficiente para la unión al receptor y
que el segundo dominio kringle no es necesario para la unión al
receptor de HGF (en el contexto del resto de la molécula) sugieren
que el dominio de unión al receptor está contenido en el dominio del
dedo y el primer dominio Kringle de huHGF. Desafortunadamente, no
hemos sido capaces de detectar la expresión de esta variante usando
nuestro antisuero policlonal lo que sugiere que la variante
N-207 (la deleción tras el segundo dominio Kringle)
no se expresó en las células 293.
\vskip1.000000\baselineskip
| Variantes (var) | AE var/AE wt +/- D.T. | Kdwt/Kdvar +/- D.T. |
| Cadena sencilla | ||
| R494A | <0,03 | 0,32 +/- 0,18 |
| R494D | <0,03 | 0,51 +/- 0,21 |
| R494E | <0,02 | 0,31 +/- 0,13 |
| Proteasa | ||
| Q534H | 1,19 +/- 0,44 | 1,48 +/-0,85 |
| Y673S | 0,27 +/- 0,07* | 1,35 +/- 0,72 |
| V692S | 0,08 +/- 0,04 | 1,02 +/- 0,13 |
| Q534H,Y673S | <0,03 | 2,24 +/- 1,11 |
| Y673S,V692S | <0,02 | 1,76 +/- 0,63 |
| Q534H, Y673S, | <0,02 | 1,91 +/- 1,28 |
| V692S | ||
| Truncamiento del extremo C terminal | ||
| N-303 | <0,05 | 0,23 +/- 0,03 |
| N-384 | <0,05 | 0,25 +/- 0,02 |
| cadena á | <0,04 | 0,25 +/- 0,03 |
| Deleción de dominios kringle | ||
| ÄK1 | <0,002 | <0,03 |
| ÄK2 | <0,05 | 0,41 +/- 0,18 |
| ÄK3 | <0,03 | 0,56 +/- 0,36 |
| ÄK4 | <0,07 | 0,86 +/- 0,46 |
Determinamos si las variantes R494E o Y673S,
V692S, que se unen al receptor de HGF in vitro pero carecen
de actividad mitogénica, podían estimular la fosforilación de las
tirosinas del receptor de HGF en células A549. Se trataron células
sin suero con rhuHGF WT purificado o con variantes y los
inmunoprecipitados de receptor de HGF se inmunotrasfirieron y
revelaron con anticuerpos anti fosfotirosina. La estimulación con
rhuHGF wt condujo a la fosforilación de la tirosina de la subunidad
\beta de 145 kDa del receptor de HGF (fig. 4). Ambas variantes
presentaron una reducida capacidad para inducir la fosforilación del
receptor de HGF.
La estimulación de la fosforilación de la
tirosina de la subunidad \beta del receptor de HGF ya había sido
previamente descrita [Bottaro y col., Science 251,
802-804 (1991), Naldini y col., 1991 citado con
anterioridad]. Los presentes datos muestran que las variantes R494E
y Y673S, V692S se puede unir a proteína receptor soluble de HGF:
IgG in vitro pero no son eficaces a la hora de estimular la
fosforilación de la tirosina en células A549. Una interpretación de
este resultado es que estas variantes son capaces de unirse al
receptor de HGF en células A549, pero carecen de la función
necesaria para inducir una fosforilación eficaz, por ejemplo,
dimerización del receptor. Se ha demostrado para otras proteínas
receptoras con una actividad intrínseca tirosina quinasa como por
ejemplo, el factor de crecimiento derivados de plaquetas epitelial,
que las interacciones receptor-receptor o la
dimerización es necesaria para la activación de la función quinasa
[para un revisión véase Ulrich y Schlessinger, Cell 61
203-212 (1990)]. Alternativamente, puede que estas
variantes no sean capaces de unirse al receptor de HGF asociado a la
superficie celular.
La estructura única de HGF sugiere que hay
múltiples factores que regulan la actividad biológica de esta
molécula. Una etapa temprana de regulación puede ser el paso de
corte para generar la forma de dos cadenas biológicamente activa.
Curiosamente, el corte no simplemente regula la unión al receptor
sino un posterior control necesario para activar al receptor de
HGF. Nuestros datos también sugieren que la cadena \beta, que no
es requerida en absoluto para la unión al receptor, contribuye en la
etapa de activación del receptor. Estas variantes pueden ser útiles
para diseccionar los eventos en la señalización del receptor de
HGF.
Materiales.
Heparina-sefarosa comprada a
Bio-Rad. Columnas de intercambio catiónico Mono S y
equipamiento para HPLC de Pharmacia. Tubo de diálisis SpectraPor/10
(peso molecular de corte: 10.000) de Spectrum. Todas las enzimas de
restricción fueron obtenidas de New England Biolabs y usadas según
las instrucciones del fabricante.
Los anticuerpos monoclonales M2 anti Flag fueron
de IBI, Kodak. El HGF recombinante humano se fabricó en Genentech,
Inc., South San Francisco. El dominio kringle 4 purificado del
plasminógeno fue cedido amablemente por Frank Castellino.
Cepas bacterianas. La cepa 294 de E.
coli (end A1 thi-1 hsdR
F-supE44; ATCC 31446) se empleó para las
transformaciones rutinarias y preparaciones plasmídicas. La cepa de
E. coli 27C7 carente de proteasas (tonAD phoADE15
D(argF-lac)169 ptr3 degP41 anR ompTD)
se usó para la expresión de HGF/NK1 bajo el control del promotor
phoA.
Construcción de plásmidos y expresión de NK1. El
aislamiento del ADN plasmídico y las electroforesis de geles del
poliacrilamida y agarosa como se ha descrito Maniatis y col.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1982). La expresión en bacterias se realizó usando el
plásmido de expresión pb0720 [Chang y col., Gene 55,
189-196 (1987)] en el que se subclonó, en 3' la
secuencia señal de la enterotoxina termoestable (stII), una
secuencia modificada del epítopo Flag de 10 residuos aminoacídicos
(S-D-Y-K-D-D-D-D-K-L)
(Identificador de secuencia Nº: 26) y la secuencia madura [Yoshiyama
y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 660-667
(1991)] de HGF/NK1 humana (residuos 32-210 del
extremo N terminal de HGF humano que contienen la horquilla
completa del extremo N terminal) y los dominios kringle 1) como se
resume en la fig. 8 (a las secuencias mostradas en la figura 8 se
les han asignado los Identificador de secuencia Nº: 27, 28 y 29,
respectivamente). El epítopo Flag [Hopp y col., Biotechnology 6,
1205-1210 (1988)] se usó para seguir la secreción y
secreción de la HGF/NK1. La inducción de la expresión de HGF/NK1 se
realizó por privación de fosfato como se ha descrito (Chang y col.,
citado con anterioridad). Para la subclonación, se digirió el
plásmido pb0720 con NsiI y BamHI y se trató con
fosfatasa de intestino de ternera. El fragmento de HGF/NK1 se aisló
por PCR usando un cebador 5' específico
(5'-CCCGGGATGCATCA
GACTACAAGGACGACGATGACAAGCTTCAAAGGARAAGRAGRAAT-3') (Identificador de secuencia Nº: 30) que codifica un sitio de restricción para la endonucleasa NsiI junto a la secuencia del epítopo Flag y los primeros seis residuos del HGF maduro. El cebador 3' reverso (5'-CCCGGGAGGCCTCTATTCAACTTCTGAACACTG-3') (Identificador de secuencia Nº: 31) codifica los últimos residuos de la secuencia HGF/NK1 (incluyendo los 4 residuos posteriores a la última cisteína del dominio kringle 1 adyacente a un codón de parada y a un sitio de restricción para la endonucleasa StuI, fig. 8). El plásmido pRK.huHGF con la secuencia completa del ADNc de HGF se usó como molde [Lokker y col, EMBO J. 11, 2403-2510 (1992)]. El producto de PCR Flag-NK1 aislado se digirió posteriormente con NsiI y StuI, y se ligó con un fragmento terminador StuI-BamHI (414 pb; Scholtissek y Grosse, Nucl. Acids Res. 15, 318 (1987) en el plásmido de expresión pb0720 antes descrito. El plásmido pf-NK1 generado se secuenció después para verificar la autenticidad de la secuencia de HGF/NK1 usando el equipo de la secuenasa (United States Biochemical Corporation). Las secuencias de ADN y las secuencias aminoacídicas deducidas del plásmido de expresión pf-NK1 generado se representan en la fig. 8.
GACTACAAGGACGACGATGACAAGCTTCAAAGGARAAGRAGRAAT-3') (Identificador de secuencia Nº: 30) que codifica un sitio de restricción para la endonucleasa NsiI junto a la secuencia del epítopo Flag y los primeros seis residuos del HGF maduro. El cebador 3' reverso (5'-CCCGGGAGGCCTCTATTCAACTTCTGAACACTG-3') (Identificador de secuencia Nº: 31) codifica los últimos residuos de la secuencia HGF/NK1 (incluyendo los 4 residuos posteriores a la última cisteína del dominio kringle 1 adyacente a un codón de parada y a un sitio de restricción para la endonucleasa StuI, fig. 8). El plásmido pRK.huHGF con la secuencia completa del ADNc de HGF se usó como molde [Lokker y col, EMBO J. 11, 2403-2510 (1992)]. El producto de PCR Flag-NK1 aislado se digirió posteriormente con NsiI y StuI, y se ligó con un fragmento terminador StuI-BamHI (414 pb; Scholtissek y Grosse, Nucl. Acids Res. 15, 318 (1987) en el plásmido de expresión pb0720 antes descrito. El plásmido pf-NK1 generado se secuenció después para verificar la autenticidad de la secuencia de HGF/NK1 usando el equipo de la secuenasa (United States Biochemical Corporation). Las secuencias de ADN y las secuencias aminoacídicas deducidas del plásmido de expresión pf-NK1 generado se representan en la fig. 8.
Purificación de NK1. El plásmido de
expresión pf-NK1 resumido en la fig. 8 se usó para
transformar la cepa 27C7 de E. coli carente de proteasas. La
cepa transformada creció en 10 l de medio con baja cantidad de
fosfato a 37ºC en un fermentador. Las células se recogieron 36 horas
después de la inoculación y se almacenaron sedimentadas a -20ºC. Se
obtuvo aproximadamente 1 kg de sedimendo celular a partir de los 10
l del fermentador. Una purificación típica se inició a partir de
100 g de sedimento celular en peso húmedo y se resume en la fig. 9.
Se descongeló el sedimento celular y se resuspendió en 1 l de tampón
enfriado nn hielo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 5
mM, NaCl 0,5 M). Se homogenizó la suspensión tissumizer, Tekmar) y
se agitó en hielo durante 1 hora. La solución se centrifugó a
13.000 rpm durante 30 minutos en un rotor Sorvall GSA. Se lavó el
sobrenadante con un filtro Nalgene 0,2 mM (con prefiltro) y se
diluyó con Tris- HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM hasta NaCl 0,15 M. La
fracción soluble se cargó en una columna de afinidad (2,5 x 10 cm)
de heparina-sefarosa equilibrada a 4ºC a una
velocidad de flujo de 20 ml/h. La columna se lavó con Tris- HCl 10
mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 0,15 M, hasta que la absorbancia a 280
nm alcanzó valores basales. El material unido se eluyó con
Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 2 M. Las
fracciones que contenían la HGF/NK1 se identificaron por
transferencia por adsorción tipo Western usando el anticuerpo
monoclonal M2 anti Flag (IBI/Kodak). Se combinaron las fracciones
positivas, y se dializaron frente a Tris- HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5
mM, NaCl 0,15 M y se cargaron en una segunda columna de heparina (1
x 5 cm). Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal
de NaCl desde 0,15 M hasta 2,0 M en Tris-HCl 10 mM
pH 7,6, EDTA 5 mM. En esta etapa, se estimó que la preparación de
HGF/NK1 era aproximadamente un 80% pura en una electroforesis en
gel de poliacrilamida con SDS (PAGE) seguida de tinción con
Coomassie y plata. Se combinaron las fracciones con HGF/NK1, se
dializaron en acetato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCl 0,25 M (tampón
de carga) y se cromatografiaron en una columna de intercambio
catiónico FPLC Mono S de Pharmacia (tamao 5/5). La proteína se
eluyó con un gradiente lineal de NaCl desde 0,25 M hasta 1,5 M a
una velocidad de flujo de 0,6 ml/m. Se recogieron fracciones entre 1
y 1,5 ml. Las fracciones positivas para HGF/NK1, se combinaron y
dializaron frente a Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5
mM, NaCl 0,25 M. La tinción con plata de la muestra final de
HGF/NK1 indicó al menos un 95% de pureza. La concentración de
proteína se determinó por el método de Bradford con HGF como
estándar y un análisis de la composición aminoacídica como se
describe a continuación.
Capacidad de unión al receptor, la
autofosforilación del receptor de HGF y ensayos biológicos. Los
ensayos de unión al receptor soluble y al A549, la inducción de
fosforilación de tirosina sobre células A549 y la proliferación
estimulada por HGF un cultivo primario de hepatocitos se realizó
exactamente como se describe en los anteriores ejemplos y en Lokker
y col., citado con anterioridad (1992) y Mark y col., J. Biol.
Chem. 267, 26166-26171 (1992). A partir de los
ensayos de unión, la constante de disociación aparente del
competidor sin marcar (kd) se determinó usando la ecuación
Kd=IC50/(1 + [L]/Kd) para la inhibición competitiva entre dos
ligandos de un tipo de receptor [Cheng y Prusoff, Biochem.
Pharmacol. 22, 3099 (1973)) en la que CI50 es la concentración de
competidor sin marcar necesaria para un desplazamiento del 50% de la
unión de HGF marcado con I^{125}. [L] es la concentración de HG
marcado radiactivamente, y la Kd es la constante de disociación
aparente para HGF-I^{125}.
Isoelectroenfoque (IEF) de NK1. El patrón
de IEF de HGF/NK1 se examinó en un gel de poliacrilamida de EIF (pH
3-10) usando el sistema de gel Novex según el
procedimiento del proveedor.
Análisis de proteínas por
SDS-PAGE. El fraccionamiento de las muestras de
HGF/NK1 se realizó por electroforesis en gel de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE) con geles con un gradiente de glicina
de 8-16% (Novex) en un aparato para minigeles Novex
y las proteínas. Para la transferencia por adsorción tipo Western,
se transfirieron las proteínas a un papel de nitrocelulosa con un
aparato Novablot de Pharmacia LKB Biotechnology Inc. La
transferencia se bloqueó con una solución salina con tampón Tris y
un 3% de leche desnatada en polvo durante la noche a temperatura
ambiente. Para la detección de la proteína de fusión
Flag-HGF/NKl se usó el anticuerpo M2 monoclonal (1
mg/ml, IBI/Kodak) 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres
lavados en esta solución salina con tampón Tris, se incubó la
transferencia con un anticuerpo anti IgG de ratón conjugado a la
peroxidasa de rábano picante (1: 5000, Amersham) durante 20 minutos
a temperatura ambiente y se lavó cuatro veces. La
inmunotransferencia tipo Western se desarrolló con un sistema de
detección quimioluminiscente como se describe en las instrucciones
del fabricante (Amersham).
Secuenciación del extremo N terminal de la
proteína. La secuenciación automática de la proteína se realizó
en los modelos 470A y 477A de secuenciadores de Applied Biosystems
equipados con analizadores PTH en línea. Se secuenciaron las
proteínas transferidas por adsorción en el cartucho para
inmunotransferencias. Se integraron los picos con el programa
Justice Innovation usando los interfaces Nelson analytical 760. La
interpretación de la secuenciación se realizó en un cromatógrafo VAX
8650 J. 404, 41-52 [Henzel y col., (1987)].
Análisis de aminoácidos. Se hidrolizaron
los péptidos durante 24 horas con HCl 6 N en ebullición constante a
110ºC en condiciones de vacío usando una estación de trabajo
Millipore Picotag. Se secaron los hidrolizados en un concentrador
Savant Speed-Vac y se analizaron en un analizador de
aminoácidos Beckman modelo 6300 equipado con un detector de
ninhidrina usando un programa automatizado de 45 minutos.
Cromatografía de líquidos/Espectrometría de
masas (LC-MS). Las muestras se inyectaron en un
sistema de cromatografía de líquidos capilar [Henzel y co., Anal.
Biochem. 187, 228 (1990)] y se analizaron directamente usando un
espectrómetro de masas triple cuádruple Sciex API III. Para la
calibración del equipo se usaron múltiples iones cargados de
mioglobina de caballo (PM = 16951 kDa).
Caracterización de la HGF/NK1 expresada en
E. coli - Para seguir la expresión y la purificación de
HGF/ NK1 en E. coli, construimos un gen que contiene las
secuencias codificadoras del epítopo "Flag" inmunorreactivo
fusionado en dirección 5' de los residuos 32-210 del
HGF humano como se describe en la fig. 8. Ya que HGF/NK1 contiene
10 residuos de cisteína, usamos una secuencia guía stII para dirigir
la secreción de la proteína al espacio periplásmico y para
purificar la forma soluble a partir de la fracción sometida a un
choque térmico (fig. 9). La tinción con Coomassie y el análisis de
inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo monoclonal
anti Flag sugirió que se logró una inducción eficaz de HGF/NK1
creciendo la cepa transformada en un medio con poco fosfato (fig.
10A y 10B). El nivel de expresión de HGF/NK1 se estimó entre
100-500 mg/l. Usando el protocolo resumido en la
fig. 9, se purificaron aproximadamente 500 mg de HGF/NK1 a partir
de de la fracción soluble sometida a choque osmótico de 100 g de
sedimento celular. La HGF/NK1 purificada a partir del paso de
cromatografía de intercambio catiónico FPLC Mono S tiene un peso
molecular aparente de 22 kDa según se determinó en una
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS- PAGE) y se
estimó que al menos pura en un 95% (fig. 10C). HGF/NK1 migra como
un monómero según indica la electroforesis en gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) en condiciones no reductoras (fig. 10B).
La proteína purificada también fue inmunorreactiva con un
anticuerpo monoclonal contra la secuencia Flag que confirma su
identidad como HGF/NK1 (fig. 10D).
Caracterización bioquímica de la HGF/NK1
purificada - El punto isoeléctrico (pI) de HGF/NK1 oscila entre
8,2 y 8,6 como se estima a partir del gel IEF (datos no
presentados). La proteína aislada tiene la composición aminoacídica
prevista y la secuencia aminoacídica en el extremo N terminal de la
HGF/NK1 correctamente procesada (fig. 8). La masa molecular se
estimó en 21.872 Da por espectrometría de masas con
electronebulización. Esta cifra es idéntica a la masa molecular
calculada del fragmento de 32-210 de HGF humano
unido al aminoácido 10 epítopo Flag.
Capacidad de unión al receptor de of
HGF/NK1 - Analizamos la preparación de HGF/NK1 para un estudio
de unión competitiva a una forma soluble del receptor de HGF así
como para estudiar la unión a los receptores de HGF de la
superficie celular de células A549. Las curvas de inhibición a
partir de experimentos representativos se muestran en la fig. 11A
y 11B e indican que HGF/NK1 es capaz de competir por la unión al
receptor de HGF con el HGF silvestre marcado radiactivamente,
aunque con afinidad reducida (de 8 a 11 veces en comparación con el
HGF silvestre). Como se esperaba, un dominio kringle 4 purificado a
partir de plasminógeno humano no compitió por la unión al receptor
de HGF soluble o al asociado a la célula. Las constantes de
disociación (Kd) estimadas a partir de estas curvas en al menos
tres ensayos independientes indican que en solución, HGF/NK1 se une
con un Kd de 1,10 +/- 0,04 nM frente a 0,10 +/- 0,02 nM del HGF
silvestre. De modo similar, en células A549, HGF/NK1 se une con un
Kd de 1,6 +/- 0,08 nM frente a 0,21 +/- 0,04 nM del HGF silvestre.
Estos datos demuestran que la región NK1 de HGF es suficiente para
mediar la unión al receptor de HGF.
Autofosforilación inducida por ligando del
receptor de HGF - El receptor de HGF sufre autofosforilación en
la subunidad \beta de 145 kDa tras la unión del ligando. En
células A549, la respuesta máxima se observó a una concentración de
1-4 nM (fig. 12). A estas concentraciones de HGF/NK1
la autofosforilación del receptor de HGF no fue detectable. Sin
embargo, a concentraciones mayores (20 y 100 nM; fig. 12) se detecta
algo de autofosforilación.
Propiedades biológicas de HGF/NK1 -
Mientras que HGF estimula la incorporación de
timidina-H^{3} en un cultivo primario de
hepatocitos con un efecto semimáximo (IB_{50}) a 0,64 nM, HGF/NK1
en condiciones idénticas no causa un aumento de la síntesis de ADN
a concentraciones del orden de 110 nM (fig. 13A). Posteriormente
analizamos HGF/NK1 para estudiar la actividad antagonista usando
cultivos primarios de hepatocitos (fig. 13B). HGF/NK1 antagoniza
completamente la actividad mitogénica inducida por HGF con un
IB_{50} de 6 nM, correspondiente a un exceso 10 veces molar de
HGF/NK1 sobre HGF para neutralizar el 50% de la síntesis de ADN en
hepatocitos. Como control, mostramos que el dominio kringle 4
purificado a partir de plasminógeno humano no antagonizó la
mitogénesis inducida por HGF. Además, el efecto de HGF/NK1 fue
específico ya que no neutralizó la mitogénesis inducida por HGF
(datos no presentados). De este modo, HGF/NK1 es un potente y
específico antagonista de la actividad de HGF.
El sitio único KpnI en la secuencia
codificadora del huHGF silvestre se enlazó al sitio único
BstEII del ADNc de la cadena pesada de una
IgG-\gamma1 humana a través de un enlazador de
cadena doble sintético
5'-CACAGTCG-3' (Identificador de
secuencia Nº: 21) y
5'-GTGACCGACTGTGGTAC-3'
(Identificador de secuencia Nº: 22)]. La construcción resultante
contenía las secuencias codificadoras de los 728 aminoácidos de HGF
fusionados por dos aminoácidos (V y T) a los aminoácidos
216-443 de la cadena pesada de la
IgG-\gamma1.
Las secuencias codificadoras de las variantes de
HGF R494E, y Y673S,V692S (preparadas como se describe en el ejemplo
1) se fusionaron de modo idéntico a la
IgG-\gamma1.
Para construir NK2 HGF-IgG (para
abreviar también denominada NK2-IgG), se uso un
enlazador sintético de cadena doble
5'-ACTGTGCAATTAAAACATGCGAGACG-3'
(Identificador de secuencia Nº: 23)
5'-GTGACCGTCTCG
CATGTTTTAATTGCACAGT-3' (Identificador de secuencia Nº: 24) para unir el sitio único ScaI de IGF al sitio
BstEII del ADNc de la cadena pesada de la construcción IgG-\gamma1 descritas anteriormente. Esto reconstituye la secuencia codificadora de la variante HGF/NK2 natural descrita por Miyazawa y col., citado con anterioridad.
CATGTTTTAATTGCACAGT-3' (Identificador de secuencia Nº: 24) para unir el sitio único ScaI de IGF al sitio
BstEII del ADNc de la cadena pesada de la construcción IgG-\gamma1 descritas anteriormente. Esto reconstituye la secuencia codificadora de la variante HGF/NK2 natural descrita por Miyazawa y col., citado con anterioridad.
NK1 HGF-IgG (también denominada
NK1-IgG), se construyó por mutagénesis por deleción
tipo "fuera de bucle" usando un molde HGF-NK2
de cadena sencilla. El oligonucleótido mutagénico usado fue
5'-GTCGGTGACCGTCTC
TTCAACTTCTGAACA-3' (Identificador de secuencia Nº: 25). El ADNc resultante contenía las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-210 de HGF unidos a las que codifican los aminoácidos 216-443 de la IgG-\gamma1 a través de secuencias enlazadoras que codifican los aminoácidos E, T, V y T.
TTCAACTTCTGAACA-3' (Identificador de secuencia Nº: 25). El ADNc resultante contenía las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-210 de HGF unidos a las que codifican los aminoácidos 216-443 de la IgG-\gamma1 a través de secuencias enlazadoras que codifican los aminoácidos E, T, V y T.
La expresión en células 293 se realizó como se
describe con anterioridad.
Las células 293 control y las que expresaban las
quimeras HGF-IgG se analizaron por electroforesis
en un gel SDS PAGE del 8% en condiciones reductoras (figura 5A) y no
reductoras (figura 5B). La calle M (Mock -simulado-) demuestra que
no se detectó expresión en las células control. Las otras calles
representan las siguientes quimeras:
- Calle 1: N-303-IgG
- Calle 2: HGF-IgG
- Calle 3: Y673S,V692S HGF-IgG
- Calle 4: R494E HGF-IgG.
Los resultados de la electroforesis en gel de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) indican claramente
que las quimeras se expresaron como dímeros.
Las estructuras propuestas para algunas de estas
quimeras de HGF variante-inmunoglobulina se muestran
en la figura 5C.
Se estudió la capacidad de unión del HGF humano
recombinante silvestre (rhuHGF wt) o de las quimeras variante de
HGF-IgG de competir por la unión de un rhuHGF
marcado con I^{125} en células A549 esencialmente como se
describe en Naldini, L. y col., EMBO J. 10,
2867-2878 (1991) con pequeñas modificaciones. Se
cultivaron células A549, inoculadas en placas de 24 pocillos a una
densidad de 104 células/pocillo, durante la noche en DMEM y después
se transfirieron a medios sin suero durante 2 horas. La unión se
realizó en ligera agitación a 4 ºC durante 3 horas en medio Hanks
con HEPES 20 mM, 0,2% de BSA y 0,02% de NaN_{3} pH 7,0. Cada
pocillo recibió 50 pM de rhuHGF-I^{125} o
variante HGF y las concentraciones indicadas de competidor. Las
extracciones y lavados se realizaron como se describe en Naldini y
col., citado con anterioridad.
Los resultados que aparecen en las figuras 6ª y
6B demuestran que las quimeras HGF-IgG probadas se
unen a HGFr endógeno en células A549 de modo similar al HGF humano
silvestre (rhuHGF wt).
Se cuantificaron las moléculas de HGF variantes y
las quimeras HGF variante-IgG en un ensayo de ELISA
bilateral tipo sándwich de huHGF coom se describe en el ejemplo ``a.
Se analizaron los medios condicionados de las células 293 que
expresaban rhuHGF wt, las variantes HGF indicadas, y las quimeras
HGF variante-IgG para estudiar los efectos
mitogénicos en cultivos primarios de hepatocitos de rata en ensayos
de incorporación de timidina H^{3} como se describe en el ejemplo
2C. Los resultados se muestran en las figuras 7ª, 7B y 7C.
Como se demostró en la figura 7ª, los medios
condicionados de células trasformadas con un plásmido que codifica
un huHGF silvestre estimuló la incorporación de H^{3} en cultivos
primarios de hepatocitos de rata. Como se muestra con anterioridad,
la variante de HGF de cadena sencilla R494E HGF y la variante de
dominio proteasa Y673S,V692S HGF carecían de actividad mitogénica
(figura 7B). Sin embargo, curiosamente, la actividad mitogénica de
estas variantes se recuperó completamente cuando se expresaron como
una proteína de fusión con IgG. Similarmente, los medios
condicionados de las células que expresaban la variante
NK2-IgG (figuras 7A y 7C), la variante
NK1-IgG (figura 7C), pero no NK2 o NK1 solas (véase
ejemplo 7 para HGF/NK1), también presentaron una actividad
mitogénica sustancial. Los experimentos además muestran que no todas
las proteínas de fusión con IgG actúan como mitógenos hepáticos
debido a que el control CD4-IgG no indujo
proliferación hepática. Se cree que estos datos indican que la
fusión de la región de la cadena pesada de la IgG a las variantes
de HGF restaura la actividad mitogénica haciendo que estas variantes
se expresen como dímeros.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc., Paul J. Godowski
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Activación de receptores
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco Sur
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 5,25 pulgadas y 360 Kb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: patin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/884811
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 18/05/1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/885971
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 18/05/1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/950572
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 21/09/1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dreger, Ginger R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.055
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 773P1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415/225-3216
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415/952-9881
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 910/371-7168
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGAATCCC ATTTACAACC TCGAGTTGTT TCGTTTTGGC ACAAGAT
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATCCCATT TACGACGTCC AATTGTTTCG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCATTTACA ACTGCCAATT GTTTCG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAGGGAAA CAGTGTCGTG CA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGGCCAC CCAGAATCCCC CT
\hfill22
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACGACCA GGAGAAATGA CAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATTCAAACT TCTGAGTTTC TAATGTAGTC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATAGTATTG TCAGCTTCAA CTTCTGAACA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCATGTGAC ATATCTTCAG TTGTTTCCAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGGTATCA CCTTCATCTT GTCCATGTGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCTTGGATG CATTAAGTTG TTTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGTCCATGT GATTAATCAC AGT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTCGTGTTG GGATCCCATT TACCTATCGC AATTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGCCTC GAGGCA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAAGGCCC CCGCTGTGCT TGCACCTGGC ATCCTCGTGC TCCTGTTTAC
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTAGTTAG GATGGGGGAC ATGTCTGTCA GAGGATACTG CACTTGTCGG
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGAACCGT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTACTAGC ACTATGATGT CT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTACTTCTT GACGGTCCAA AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGGGAGT TGCAGATTCA GCTGT
\hfill25
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTTTGTCG GTGACCTGAT CATTCTGATC TGGTTGAACT ATTAC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGTCG
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGACCGACT GTGGTAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGTGCAAT TAAAACATGC GAGACG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGACCGTCT CGCATGTTTT AATTGCACAG T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGGTGACC GTCTCTTCAA CTTCTGAACA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCAAAAAGA ATATCGCATT TCTTCTTGCA TCTATGTTCG TTTTTTCTAT
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTACAAAT GCCTATGCA
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGCTT CAAAGGAAAA GA
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGAAGTTG AATAGAGGTT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGGATGC ATCAGACTAC AAGGACGACG ATGACAAGCT TCAAAGGAAA
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAGAAAT
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia
Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGGAGGC CTCTATTCAA CTTCTGAACA CTG
\hfill33
Claims (17)
1. Un conjugado para su uso en un procedimiento
para el tratamiento terapéutico de un paciente, comprendiendo el
conjugado un primer ligando unido mediante un enlazador heterólogo a
un segundo ligando, en el que el enlazador heterólogo es diferente
de cualquier enlazador que conecte los ligandos en su entorno
nativo; el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del factor
de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de un
anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo; el primer y segundo
ligando son capaces de unirse a la primera y a la segunda molécula
de receptor del factor de crecimiento hepatocítico, respectivamente,
en el que la primera y la segunda molécula receptora son capaces de
oligomerizar la una con la otra; y en la que el conjugado es capaz
de activar un receptor del factor de crecimiento hepatocítico.
2. Un conjugado según la reivindicación 1, en el
que al menos uno de los ligandos carece sustancialmente de actividad
biológica en la forma monomérica.
3. Un conjugado según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho enlazador comprende la secuencia
del dominio variable o del dominio constante de un
inmunoglobulina.
4. Un conjugado según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho enlazador comprende un puente
disulfuro entre dichos primer y segundo ligando.
5. Un conjugado según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicho enlazador es un espaciador
polipeptídico.
6. Un conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dichos primer y segundo
ligando son derivados o variantes del factor de crecimiento
hepatocítico.
7. Un conjugado según la reivindicación 3, en el
que dicho conjugado se selecciona del grupo formado por:
- (a)
- AC_{L}-AC_{L};
- (b)
- AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
- (c)
- AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
- (d)
- AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}];
- (e)
- V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y
- (f)
- [A-Y]n-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
en donde
cada A representa secuencias aminoacídicas del
ligando idénticas o diferentes;
V_{L} es un dominio variable de la cadena
ligera de una inmunoglobulina
V_{H} es un dominio variable de la cadena
pesada de una inmunoglobulina
C_{L} es un dominio constante de la cadena
ligera de una inmunoglobulina
C_{H} es un dominio constante de la cadena
pesada de una inmunoglobulina
n es un número entero mayor que 1;
Y designa el residuo de un agente reticulante
covalente.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Una molécula quimérica que comprende una
fusión de un primer ligando capaz de unirse a una primera molécula
de un receptor del factor de crecimiento hepatocítico con una
primera secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina, y
una fusión de un segundo ligando capaz de unirse a una segunda
molécula de dicho receptor con una segunda secuencia de un dominio
constante de una inmunoglobulina, uniéndose los dos ligandos a
través de sus secuencias de inmunoglobulina, en el que el ligando no
es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento
hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un
antígeno para dicho anticuerpo; y en el que el primer y segundo
ligando son moléculas capaces de de oligomerizar la una con la
otra.
10. La molécula quimérica de la reivindicación 9,
en la que al menos uno de dichos primer y segundo ligando carecen
sustancialmente de actividad biológica en la forma monomérica.
11. La molécula quimérica de la reivindicación 9
o de la reivindicación 10 seleccionada del grupo formado por
HGF-IgG; NK2-IgG;
NK1-IgG; \DeltaK2-IgG; Y673S,
V692S HGF-IgG; y R494E HGF-IgG.
12. Una molécula quimérica según una cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11 para su uso en un procedimiento para
el tratamiento terapéutico de un paciente.
13. Una composición farmacéutica que comprende
una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones
9 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un procedimiento para hacer un agonista de un
ligando nativo de los receptores del factor de crecimiento
hepatocítico que comprende la dimerización de una primera variante o
el enlace de dicha primera variante con una segunda variante de
ligando; en el que las variantes de ligando dimerizadas son capaces
de unirse a la primera y segunda molécula de receptor del factor de
crecimiento hepatocítico, respectivamente; la primer y segunda
molécula de receptor son capaces de oligomerizar la una con la otra;
conectándose dichas variantes de ligando con un enlazador
heterólogo, en el que el enlazador heterólogo es diferente de
cualquier enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo; y
en el que el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del
factor de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de
un anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que al menos una de dichas primera y segunda variantes de ligando
carecen sustancialmente de actividad biológica en la forma
monomérica.
16. El procedimiento de la reivindicación 14 o de
la reivindicación 15, en el que dicho ligando es una variante de
hHGF.
17. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en el que el enlazador heterólogo
comprende una secuencia de inmunoglobulina.
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