ITMI980180A1 - Proteine ricombinanti derivate da hgf e msp - Google Patents
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Classifications
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:
"PROTEINE RICOMBINANTI DERIVATE DA HGF E MSP"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a proteine ricombinanti derivate dalla combinazione di dominii strutturali delle subunità a e β di HGF e MSP.
In particolare, i fattori ingegnerizzati dell'invenzione sono ottenuti per combinazione dei dominii HL ( "harpin loop") e Κ1-Κ4 ("kringle")di entrambe le catene a di HGF e MSP,con le catene B di HGF e MSP in maniera da ottenere una struttura avente due superdominii con interposta una sequenza di legame ("linker") opzionalmente tagliabile. Inoltre, l'invenzione si riferisce a sequenze di DNA che codificano per -le proteine ricombinanti, a vettori di espressione comprendenti dette sequenze di DNA e alle cellule ospiti contenenti tali vettori dì espressione.
Le proteine ricombinanti della presente invenzione contengono dominii selezionati da HGF e MSP per proteggere cellule epiteliali e precursori di varia natura dalla morte (apoptosi) indotta da farmaci chemioterapici. Pertanto, queste molecole possono essere convenientemente utilizzate per prevenire o curare gli effetti collaterali tossici del trattamento chemioterapico dei tumori.
SFONDO DELL'INVENZIONE
I fattori di crescita cellulare "Hepatocyte Growth Factor" (HGF) e "Macrophage Stiraulating Protein" (MSP) sono proteine strutturalmente e funzionalmente altamente correlate fra di loro (Fig. l e 2). Entrambi questi fattori sono secreti sotto forma di un precursore inattivo, che viene processato da proteasi specifiche che riconoscono un sito di taglio all'interno della molecola, dividendo la proteina in due subunità. Queste subunità, denominate catena a e catena B, rimangono unite da un ponte disolfuro cisteina-cisteina e formano quindi una proteina dimerica. Solo la forma matura (dimerica) del fattore è in grado di attivare il suo recettore presente sulla superficie delle cellule bersaglio (le tirosina chinasi Met nel caso di HGF e Ron nel caso di MSP) e quindi di mediare risposte biologiche ("Naldini, L. et al., 1992, EMBO J. 11: 4825-4833"; "Wang, M. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269; 3436-3440"; "Bottaro, D. et al., 1991, Science 25: 802-804"; "Naldini, L. et al., 1991, EMBO J. 10: 2867-2878"; "Wang, M. et al., 1994, Science 256: 117-119"; "Gaudino, G. et al., 1994, EMBO J. 13: 3524-3532").
La catena a di entrambi i fattori è a sua volta formata da una struttura ripiegata a forcina chiamata "hairpin loop" (HL), e da quattro dominii con struttura rassomigliante ad un nodo denominati "kringle" (K1-K4) ( "Nakamura, T. et al., 1989, Nature 342: 440-443"; "Han, Ξ. et al., 1991, Biochemistry 30: 9768-9780").Nel precursore è presente anche una sequenza segnale (LS) di 31 amminoacidi (nel caso dell'HGF) o di 18 amminoacidi (nel caso dell'MSP), rimossa nel reticolo endopìasmatico rugoso, che indirizza il peptide neosintetizzato alla via secretiva. La catena 0 contiene un "box" con sequenza omologa a quella tipica di una serina protessi, ma non possiede nessuna attività enzimatica ("Nakamura, T. et al., 1989, Nature 342: 440-443"; "Han, S. et al., 1991, Biochemistry 30: 9768-9780"). Sia la catena a che quella 0 contribuiscono al legame del fattore di crescita con il rispettivo recettore (Met per HGF e Ron per MSP).
I polipeptidi HGF e MSP sono in grado di indurre una varietà di effetti biologici oltre alla proliferazione cellulare. Le principali attività biologiche di queste molecole sono le seguenti: stimolo della divisione cellulare (mitogenesi); stimolo della motilità (motogenesi o "scattering"); induzione della polarizzazione e del differenziamento cellulare; induzione delia formazione di tubuli di collagene (morfogenesi); incremento della sopravvivenza cellulare (protezione da apoptosi}. I tessuti che rispondono alla stimolazione con HGF e MSP sono tutti quelli le cui cellule esprimono i rispettivi recettori Met (HGF) e Ron (MSP). I più importanti tessuti bersaglio di questi fattori sono le cellule epiteliali di diversi organi quali il fegato, il rene, il polmone, la mammella, il pancreas e lo stomaco, e alcune cellule del sistema ematopoietico e nervoso. Una descrizione dettagliata degli effetti biologici di HGF e MSP nei vari tessuti si trova in "Tamagnone, L. & Comoglio, P., Cytokine & Growth Factor Reviews, 1997, 8: 129-142, Elsevier Science Ltd."; "Zarnegar, R, & Michalopoulos, G., 1995, J. Celi Biol. 129: 1177-1180"; "Medico, Ξ. et al., 1996, Mol. Biol. Celi, 7: 495-504"; "Banu,N. et al., 1996, J. limunol. 156: S2933-2940".
E' noto che nel caso dell'HGF, 1' "hairpin loop" e i primi due "kringle" contengono i siti di interazione diretta con il recettore Met ("Lokker, N. et al., 1992, EMBO J. 11: 2503-2510"; "Lokker, N. et al., 1994, Protein Engineering 7:895-903").
Sono state descritte due forme tronche di HGF. La prima comprende il primo "kringle" (NK1-HGF "Cioce,V. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 13110-13115") mentre la seconda si estende fino al secondo "kringle" (NK2-HGF "Miyazawa,K. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 197: 15-22").NK2-HGF induce digestione della matrice connettìvale seguita da migrazione cellulare (scatter), ma non è mitogenica come il fattore di crescita completo ("Hartmann, G. et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 11574-11578"). Tuttavia, NK2-HGF recupera l'attività mitogenica in presenza di eparina, un glucosamminoglicano che lega HGF attraverso un ■dominio contenuto nel primo "kringle" e che probabilmente induce la dimerizzazione di NK2-HGF ("Schwall, R. et al., 1996, J. Celi Biol. 133: 709-718"). Inoltre NK2-HGF, essendo un agonista parziale di Met, si comporta come un inibitore competitivo di HGF dal punto di vista dell'attività mitogenica ("Chan, A. et al., 1991, Science 254: 1382-1385"). Anche per NK1-HGF sono state descritte deboli attività di stimolazione parziale di Met e di inibizione competitiva dell'attività mitogenica di HGF ("Cioce, V. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 13110-13115"). Nel caso dell'MSP, i siti di interazione con il recettore Ron sono meno chiari: alcuni studi preliminari suggeriscono che la situazione sia opposta rispetto a quella dell'HGF, ovvero che sia la catena B a legare direttamente il recettore mentre la catena a avrebbe la funzione di stabilizzare il complesso {"Wang, M. et al. .. 1997.. J. Bìol. Chem. 272 : 16999-17004" ) .
L'uso terapeutico di molecole quali HGF e MSP è potenzialmente indicato in una vasta gamma di patologie ("Abdulla, S., 1997, Mol. Med. Today 3: 233"). Tuttavia, numerose complicazioni rendono problematica 1'applicazione di queste molecole in campo clinico.
Per esempio si è visto che l'HGF può proteggere cellule renali dalla morte programmata (apoptosi) indotta da cis~pìatino, ma al tempo stesso potrebbe indurre la proliferazione indesiderata di cellule neoplastiche.Le forme tronche naturali NK1 e NK2 di HGF non presentano problemi di attivazione proteolitica, ma hanno un'attività biologica ridotta.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
L'invenzione qui descritta fornisce delle molecole ricombinanti derivate dalla combinazione di dominii strutturali delle subunità a e β di HGF e MSP, che superano gli svantaggi connessi con le molecole descritte nella sezione precedente.
Tali molecole condividono una struttura in cui due superdomini, comprendenti varie combinazioni dei dominii HL e delle subunità a di HGF e MSP e le catene β di HGF o MSP, sono uniti tramite una sequenza di legame che può contenere oppure no un sito di taglio proteolitico.
Le proteine ricombinanti della presente invenzione contengono dominii selezionati da HGF e MSP per interagire con entrambi i recettori Met e Ron, allo scopo di indurre risposte biologiche sinergiche e selettive rispetto ai fattori naturali e alle forme tronche della "prior art".
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a proteine ricombinanti (che di qui in avanti verranno chiamate indifferentemente proteine , molecole o fattori ricombinantì) caratterizzate dal fatto che la loro struttura comprende due superdomini, di cui uno costituito dalla combinazione dei dominii HL e delle catene a di HGF e MSP, l'altro dalla subunità j3 di HGF o di MSP, separati da una sequenza spaziatrice o di legame che può contenere oppure no un sito di taglio proteolitico.
In particolare, l'invenzione si riferisce alle proteine di formula
dove (le numerazioni degli amminoacidi che seguono vanno riferite alle sequenze di HGF e MSP come riportate rispettivamente in Fig. 1 e 2):
LS corrisponde all'intervallo di sequenza amminoacidica 1-31 di HGF o all'intervallo di sequenza 1-18 di MSP;
HL corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 32 e 70, 1'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 96 e 127; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 19 e 56, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 78 e 109;
K1 corrisponde a un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) ali amminoacidi 97 e 128, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 201 e 205; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 79 e 110, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 186 e 190;
K2 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 202 e 206, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) ali amminoacidi 283 e 299; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 187 e 191, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 268 e 282;
K3 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 284 e 300, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 378 e 385; oppure corrisponde a un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 269 e 283, l’altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 361 e 369;
K4 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo conpreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 379 e 386, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 464 e 487; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 362 e 370; l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 448 e 481;
m, n, o, p sono scelti tra 0 e 1;
la somma n+o+p è un numero intero compreso tra (o uguale a) 0 e 3, con la condizione che n > o > p;
B corrisponde alia sequenza 488-491 di KGF, alla sequenza 478-489 di MSP, ad una sequenza di consenso per proteasi oppure ad una sequenza non tagliabile;
[C] corrisponde alla sequenza della subunità β di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gii amminoacidi 490 e 492, l'altro estremo uguale all'amminoacido 723; oppure corrisponde alla sequenza delia subunità β di MSP avente un estremo compreso tra {o uguale a) gli amminoacidi 484 e 436, l'altro estremo uguale aLL'amminoacido 711; con la condizione che, quando [A] coincide con la catena a di HGF o di MSP, [C] corrisponde rispettivamente alla catena 8 di MSP'e HGF.
D rappresenta la sequenza W-Z, dove W è un sito proteolitico convenzionale, Z una qualsiasi sequenza utile per la purificazione della proteina su colonne di nichel o d'affinità; y può essere 0 o 1.
Esempi non limitanti di w sono rappresentati da sequenze di consenso per le proteasi enterochinasi, trombina, fattore Xa e proteasi IgA.
Tra le proteine di formula generale (I), sono preferite quelle in cui il dominio HL corrisponde alia sequenza 32 - 127 della catena a di HGF o alla sequenza 19 - 98 della catena a ài MPS; il dominio 3⁄4 corrisponde alla sequenza 12S - 203 della catena a di HGF, o alla sequenza 99 - 1S8 della catena a di MPS; il dominio 3⁄4 corrisponde alla sequenza 204 - 294 della catena a di KGF, o alla sequenza 189 - 274 della catena a ai MPS; il dominio K3 corrisponde alla sequenza 286 - 333 della catena a di HGF, o alia sequenza 275 - 367 della catena a dì MPS;
il dominio K4 corrisponde alla sequenza 384 - 487 della catena a di HGF, o alla sequenza 368 - 477 della catena a di,MPS;
C corrisponde alla sequenza 492-723 della catena B di HGF, oppure alia sequenza 486-711 della catena B hi MSP.
Tra le possìbili combinazioni dei dominii secondo la formula generale (I), sono preferite le seguenti (II) e (III), relative a due fattori ricombinanti denominati rispettivamente Alphabet-1 e Alphabet-RTKR:
Le molecole ibride dell’invenzione sono preparate con tecniche di ingegneria genetica secondo una strategia che prevede le seguenti fasi: a) costruzione del DNA codificante per la proteina d’interesse; b) inserimento del DNA in un vettore d’espressione;
c) trasformazione di una cellula ospite con il DNA ricombinante (rDNA); d) coltura della cellula ospite trasformata in modo da esprimere la proteina ricombinante;
e) estrazione e purificazione della proteina ricombinante prodotta.
Le sequenze di DNA corrispondenti ai dominii strutturali di HGF o di MSP possono essere ottenute per sintesi o a partire dai DNA codificanti per i due fattori naturali. Per esempio, si può operare uno screening di librerie di cDNA utilizzando opportune sonde, in modo da isolare i frammenti di cDNA di HGF o dì MSP contenenti i dominii che costituiscono la proteina ricombinante, oppure si può utilizzare cDNA ottenuto da mRNA purificato da opportune linee cellulari, quali leucociti umani, per trascrizione inversa, o ancora il cDNA può essere tagliato da pìasmidi o, in generale, vettori che contengono le sequenze di HGF o MSP.
I cDNA codificanti per i frammenti delle catene a di HGF e MSP possono essere amplificati per PCR ("Muìlis, K.B. e Faloona, F.A., Methods in Enzymol. 155 (1987) 335-350"), ed i prodotti di amplificazione ricombinati sfruttando opportuni siti di restrizione, presentì naturalmente nelle sequenze dei fattori oppure introdotti artificialmente nella sequenza degli oligonucleotidi utilizzati per 1'amplificazione.
In maggior dettaglio, una delle strategie sopra menzionate può essere la seguente:
le porzioni di DNA che codificano per i dominii LS, HL , K1, K2, K3 e K4 vengono amplificate per PCR dai cDNA di HGF o MSP e quindi fatte ricombinare in modo da ottenere le sequenze ibride corrispondenti ad [A]. Come 'primers " vengono utilizzate coppie di oligonucleotidi che riconoscono sequenze poste ai due estremi del dominio da amplificare. I "primers" vengono disegnati in modo da contenere una sequenza che permetta la ricombinazione fra il DNA di un dominio e quello adiacente. Tale ricombinazione si può effettuare per taglio endonucìeasico e successiva reazione ligasica, oppure sfruttando la tecnica della "recombinant PCI?' ("Innis, NA et al., in PCE Protocols, Academic Press, 1990, 177-183").
Successivamente si conduce l'amplificazione per PCR delle porzioni di cDNA codificanti per i dominii A e C, con l'accorgimento che il primer antisenso utilizzato per amplificare A e il primer senso utilizzato per amplificare C sono "ibridi", contengono cioè per metà la sequenza di A e per metà la sequenza di C. Il punto di transizione fra A e C contiene il dominio 3, cioè una sequenza amminoaclàica che può o meno costituire un sito di taglio proteolitico.
Si vengono così ad ottenere due amplificati che presentano una zona di identità inserita artificialmente con i primers utilizzati per l'amplificazione. La presenza questa sequenza comune ai due amplificati nel punto di giunzione consente la loro ibridazione e la successiva amplificazione del costrutto contenente i dominii [A], 3 e C.
Il costrutto ricombinante amplificato contenente i tre dominii [A], [B] e [C],viene quindi inserito in un opportuno vettore. In questa fase si può decidere se aggiungere o meno in coda al frammento [C] il dominio ]) ( "tao"}, ottenuto per via sintetica come oligonucleotide a doppia catena.
Il vettore di espressione ricombinante può contenere, oltre al costrutto ricombinante, un promotore, un sito di legame al ribosoma, un codone di inizio, un codone di terminazione, eventualmente un sito di consenso per intensificatori ( "enhancer") di espressione.
Il vettore può comprendere anche un marcatore per la selezione,per isolare le cellule ospiti contenenti il costrutto di DNA. Come vettori possono essere impiegati plasmidi di batteri come Escherichia Coli, di lievito, batteriofagi, virus, retrovirus, oppure può essere utilizzato il DNA come tale.
I vettori vengono clonati preferibilmente in cellule batteriche, per esempio in Escherichia coli, come descritto in "Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982", e le colonie possono essere selezionate per esempio per ibridazione con sonde oligonucleotidiche marcate con radioisotopi; successivamente, la sequenza del rDNA estratto dalle colonie positive viene determinata con metodi noti.
II vettore con il costrutto ricombinante può essere introdotto nella cellula ospite con il metodo della cellula competente [("J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)"], il metodo del protoplasto ["PNAS, USA, 75, 1929 (1978)"], il metodo del calcio fosfato ["Science, 221, 551 (1983)"], il metodo DEAE-destrano ["Science, 215, 166 (1983)"], il metodo degli impulsi elettrici ["PNAS, 81, 7161 (1984)"], il metodo del "packaging" in vitro ["PNAS, 72, 581'(1975)"], il metodo del vettore virale ["Celi, 37, 1053 (1984)"], il metodo di miero-iniezione ["Exp. Celi. Ees., 153, 347 (1984)"], ed altri.
Le cellule ospiti possono essere procariote od eucariote, come batteri, lieviti, cellule di insetto (espressione mediante baculovirus ricombinante) o cellule di mammifero, e saranno tali da produrre efficacemente la proteina ricombinante.
Dopo la trasformazione, le cellule vengono fatte crescere in un appropriato terreno nutritivo, che può essere per esempio MBM, DMEM o KPMI 1640 nel caso le cellule ospiti siano di mammifero.
La proteina ricombinante viene secreta nel terreno di coltura da cui può essere recuperata e purificata con diversi metodi, come la cromatografia a esclusione di massa, d'adsorbimento, d'affinità, con il "saltìng-out", precipitazione,dialisi,ultrafiltrazione.
Un sistema semplice e rapido per la produzione delle molecole dell'invenzione è per esempio 1'espressione transiente in cellule di mammifero.
Il piasmide scelto, per esempio PMT2 ("Sambrook, S. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989"), contenente il frammento di DNA ricombinante viene trasfettato in cellule recipienti appositamente predisposte, come Cos7 ("Sambrook, J. et al., suora") tramite la tecnica del calcio fosfato o altre tecniche equivalenti. Alcuni giorni dopo la trasfezione, il terreno condizionato delle cellule trasfettate viene raccolto, chiarificato per centrifugazione e analizzato il contenuto di fattore. Per questa analisi, si possono utilizzare anticorpi diretti contro HGF o MSP, oppure contro l'eventuale sequenza "tag": il surnatante viene immunoprecipitato e poi analizzato per "western blot " con lo stesso anticorpo. Il surnatante contenente il fattore ricombinante può anche essere utilizzato direttamente per saggi biochimici e biologici. La proteina può essere purificata ad esempio sfruttando una sequenza "tag" di poli-istidina, tramite adsorbimento su di una colonna di resina al nichel e successiva eluizione con imidazolo.
Le proprietà biochimiche dei fattori ricombinanti dell'invenzione sono state indagate in relazione alla possibilità di ottenere fattori ibridi contenenti dominii leganti entrambi i recettori Met e Rcn, correttamente sintetizzati e maturati incellule eucariote.
In particolare, si è visto che fattori ibridi contenenti la catena a di HGF e la catena β di MSP, cioè i dominii più direttamente coinvolti nel legame con Met e Ron rispettivamente, vengono correttamente sintetizzati da cellule eucariote. La maturazione (taglio del sito proteolitico) avviene in presenza di siero, su una frazione ridotta ma significativa di tali proteine.
Si è inoltre verificato che la modifica della sequenza del sito proteolitico consente di ottenere la maturazione del fattore ibrido anche in assenza di siero.
Tra le applicazioni delle molecole ricombinanti dell'invenzione, si possono citare:
prevenzione della mielotossicità; in particolare, possono essere usate per l'espansione di progenitori midollari, per incrementare la proliferazione dei precursori emopoietici o stimolarne la immissione in circolo;
prevenzione della tossicità epatica, renale e delle mucositi conseguenti a trattamenti antineoplastici; in particolare i fattori ricombinanti possono essere usati per prevenire la tossicità (apoptosi) sugli elementi cellulari differenziati del fegato, del rene e della mucosa del tratto gastroenterico, e per stimolare gli elementi staminali della cute e delle mucose per permettere la rigenerazione degli strati germinativi;
prevenzione della neurotossicità da chemioterapici.
Nel complesso, si possono citare i seguenti vantaggi legati alle proteine dell'invenzione, rispetto alle molecole parentali HGF e MSP: la capacità di legare entrambi i recettori Met e Ron conferisce a queste molecole uno spettro di azione più ampio;
- modificando il sito proteolitico, è possibile ottenere fattori ibridi che vengono attivati da proteasi del reticolo endoplasmatico (come ad esempio le furine), contestualmente alla sintesi; eliminando il sito proteolitico è possibile ottenere forme permanentemente immature dei fattori, con potenziale attività di agonista parziale o antagonista;
ingegnerizzando le molecole in combinazioni di dominii funzionali diversi, si possono modulare gii effetti biologici, aumentando quelli favorevoli e rilucendo quelli indesiderati (per esempio, la protezione da apoptosi verso la proliferazione cellulare).
L'invenzione deve intendersi diretta anche alle sequenze amminoacidiche e nucleotidiche riferite alla formula (I), recanti delle modificazioni, che per esempio possono derivare dalla degenerazione del codice genetico,pertanto senza che la sequenza amminoacidica venga modificata, o dalia delezione istituzione, inserzione, inversione o aggiunta d nucieotidi, e/o basi secondo tutti i possibili metodi noti nell'arte. Inoltre, l'invenzione è estesa ai vettori d’espressione comprendenti '-ina sequenza codificante per una proteina di formula generale (I}, che, come detto, possono essere plasmidi, batteriofagi, virus, retrovirus, o altri, e alle cellule ospiti contenenti tali vettori d'espressione.
Infine, l'invenzione è riferita all'uso delle proteine rìcombinanti come agenti terapeutici, ed alle composizioni farmaceutiche contenenti una quantità efficace delle proteine rìcombinanti insieme ad eccipienti farmacologicamente accettabili.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
(Nella descrizione che segue "-Bis" posto dopo il nome dei fattori parentali, troncati o ricombinanti, o dei plasmidi, indica che le rispettive sequenze contengono il "tag" di poli-istidina).
Fig. 1:
a) Sequenza nucleotidica e amminoacidics di HGF umano (Gene Bank # M73239; Weidner, K.M., et al . , 1991, Proc. Acad. Sci. USA, 88:7001-7005). A differenza della referenza citata, nella numerazione 'quii utilizzata il nucleotide No. 1 è la prima base del codone di inizio (la A del primo ATG). Il primo amminoacido è la corrispondente metionina. Le regioni non tradotte al 5'e al 3'del cDNA non sono né rappresentate, né considerate nella numerazione.
b) Sequenza nucleotidica e amminoacidica di MSP umano (Gene Bank # L11924; Yoshimura, T., et al. , 1S93, J. Biol. Chsm. , 268:15461-15468).A differenza della referenza citata, nella numerazione utilizzata nel presente documento il nucleotide No. 1 è la prima base del codone di inizio (la A del primo ATG). Il primo amminoacido è la corrispondente metionina. Le regioni non tradotte al 5' e al 3' del cDNA non sono né rappresentate né considerate nella numerazione.
Fig. 2:
a) Struttura molecolare del fattore Alphabet-1.
Il dominio [A] è costituito dalla catena a di HGF, il dominio B è costituito dal "cleavage site" naturale di KGF, il dominio C è costituito dalla catena (3 di MSP e il dominio D è costituito da una sequenza "rag" di poli-ìstidina (GNSAVDHHHHHH).
b) Sequenza nucleotidica e amminoacidica del Fattore Alp<'>nabet-1.
Sono sottolineati i codoni di inizio (ATG)e di terminazione (TGA).
Fig. 3:
a) Struttura molecolare del Fattore Aohabet-RTKR.
tome .differenza rispetto al fattore Alphabet-1, il dominio β comprende il "cleavage site" naturale di HGF e un sito di taglio per le proteasi di tipo Furinico.
b) Sequenza nucleotidica e amminoacidica del Fattore Alphabet-RTKR.
Fig. 4:produzione dei fattori ricombinanti dell'invenzione· a) Amplificazione dei dominii A e C per la successiva congiunzione.
Il frammento denominato PCR1 viene ottenuto per PCR da un plasmide contenente un costrutto codificante il dominio A (catena a), mentre quello denominato PCR2 viene ottenuto per PCR da un plasmide contenente un costrutto codificante il dominio C (catena β). I primers B e C introducono nei due amplificati una sequenza comune (zona di identità), rappresentante il punto di transizione fra A e C,. e contenente il potenziale sito di taglio proteolitico (dominio B, colorato in nero), b) Ibridazione dei frammenti e amplificazione del fattore ricombinante. I due amplificati PCR1 e PCR2 vengono mescolati e vanno incontro ai seguenti trattamenti: (1) denaturazione iniziale a 95°C per 3 min. e successiva ibridazione per 30 sec.; (2)elongazione a 72°C per 2 min. in presenza di una DNA polimerasi termostabile. I passaggi (1) e (2) sono ripetuti altre quattro volte con l'unica modifica delle condizioni di denaturazione, che viene effettuata a 94eC per 30 sec.; (3) successivamente alla miscela vengono'aggiunti i primers A e D già usati per l'amplificazione iniziale dei costrutti e viene effettuata una PCR tradizionale per amplificare il costrutto ricombinante.
Fig. 5:Produzione del fattore ricombinante Alnhabet-1.
Le proteine marcate metabolicamente sono state adsorbite su beads di Sepharose-eparina e rivelate per autoradiografia dopo elettroforesi su gel di poìiacrilammide. Sono indicate le forme immature di HGF (Pro-HGF, controllo) e Alphabet-1 (Pro-αβ-Ι), e le catene a e β di HGF e Alphabet-1.
Fig. 6: Produzione del fattore ricombinante Alphabet-RTKR.
Le proteine inarcate metabolicamente sono state adsorbite su beads di Sepharose-eparina e rivelate per autoradiografia dopo elettroforesi su gel di poìiacrilammide; Sono indicate le forme immature di Alphabet-1 (Pro-αβ-Ι) e Alphabet-RTKR (Pro-a^-RTKR), e le catene a e β di Alphabet-RTKR.
Gli esempi di seguito riportati illustrano in maggior dettaglio i ' invenzione .
Esempio 1
Ottenimento del costrutto ricombinante codificante per il Fattore Aph.pabet-1
Come DNA di partenza sono stati utilizzati i cDNA di HGF e MS? illustrati nelle Figure 1 e 2. Il cDNA di HGF è stato ottenuto con la tecnica di RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR; in: Innis, M.A., et al., PCR Protocols, Academic Press, 1990, 21-27) da una lìnea cellulare di fibroblasti di polmone umano (MRC5; Naldini, L. et al., 1991, ΞΜΒ0 J.
10: 2867-2S78). Il cDNA di MSP è stato ottenuto con la stessa tecnica da legato umano (Gaudino,G., et al., 1994, BHBO J.13: 3524-3532).
Il frammento corrispondente alla catena a di HGF è stato amplificato per PCR dal cDNA di HGF, subclonato nel plasmide pBluescript SK (GenBsnk #52325)nel sito EcoRV utilizzando ì seguenti primers:
Nel Primer A, derivato dalla sequenza del polycloning site del plasmide pBluescript, la sequenza sottolineata rappresenta il sito di restrizione per l'enzima XbaI, presente a monte del sito EcoRV da cui inizia il cDNA di HGF. La sequenza sottolineata nel Primer B corrisponde alla zona di sovrapposizione con il Primer C (in minuscolo la sequenza corrispondente alle prime basi della catena β di MSP). La sequenza corrispondente al cieavage site (TTGCGAGTGGTT) viene generata dalla sovrapposizione fra i Primers B e C nella loro zona di identità. Il prodotto di PCR (PCPi) è stato quindi purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio.
Il frammento corrispondente alla catena [l di MSP è stato amplificato per PCR dal cDNA di MSP utilizzando i seguenti primers:
La sequenza sottolineata nel Primer C corrisponde alla zona di sovrapposizione con il Primer B (in minuscolo la sequenza corrispondente alle ultime basi della catena a di HGF). Nel Primer D, la sequenza "AAGCTT" corrisponde al sito di restrizione per l'enzima HindiII, la sequenza codificante il tag è sottolineata e la porzione in minuscolo corrisponde alle ultime basi della catena (3 di MSP. Il prodotto di PCR (PCR2) è stato quindi purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio.
I due amplificati PCR1 e PCR2 sono stati mescolati e sottoposti ai seguenti trattamenti: (1) denaturazione iniziale a 95°C per 3 min. e successiva ibridazione a 68°C (temperatura di ibridazione calcolata in base alla zona di identità fra i Primers B e C) per 30 sec.; (2) elongazione a 72°C per 2 min. in presenza di una DNA polimerasi termostabile. I passaggi (1) e (2) sono stati ripetuti altre quattro volte con modifica delle condizioni di denaturazione, effettuata a 92°C per 1 min., e abbassando a ogni ciclo di i°C la temperatura di ibridazione; (3) successivamente alla miscela sono stati aggiunti i primers A e D già usati per l'amplificazione iniziale dei costrutti ed è stata effettuata una PCR tradizionale per amplificare il costrutto ricombinante.
Il prodotto di PCR così ottenuto è stato digerito con gli enzimi di restrizione XbaI e HindlII, purificato tramite elettroforesi su gei di agarosio e subclonato nei siti XbaI-HindiII del vettore di espressione pcDNA3.1(-) (Invitrogen), ottenendo così un plasmide ricombinante, contenente l'Alphabet-l completo (qui dì seguito denominato pcDNAB-Alphabet-1).
Esempio 2
Ottenimento del costrutto ricombinante codificante per il fattore Alphabet-RTKR
Come DNA di partenza è stato utilizzato il plasmide pCDNA3-Alphabet-1 descrìtto in precedenza. All'interno del cDNA di Alphabet-1 sono presenti due siti di restrizione per l'enzima BglII, rispettivamente in posizione 1204 e 1744. Sfruttando questi siti è stato possibile sostituire la sequenza 1204-1744 originale (contenente ai suo interno il cleavage site) con una "cassetta" in cui la sequenza RTKR (consenso per il taglio da parte delie proteasi di tipo furinico) fosse aggiunta per mutagenesi sito-specifica a monte del sito naturale di taglio delI'HGF.
A tale scopo sono stati prodotti per PCR due amplificati dal cDNA di Alphabet-1. Il primo (PCR3), corrispondente al frammento BglII1204 clevage site di Alphabet-1, è stato amplificato utilizzando i seguenti
La sequenza sottolineata nel Primer G rappresenta il sito di restrizione per l'enzima BglII. Nel Primer H le basi in neretto corrispondono alle mutazioni puntiformi inserite nell’oligonucleotide per creare la sequenza RTKR a monte della sequenza di taglio dell'HGF, mentre la sequenza sottolineata corrisponde alla zona di identità con il Primer I. Il prodotto di PCR (PCR3) è stato quindi purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio.
Nel Primer I le basi in neretto corrispondono alle mutazioni puntiformi inserite nell'oligonucleotide per creare la sequenza RTKR, mentre la sequenza sottolineata corrisponde alla zona di identità con il Primer H. La sequenza sottolineata nel Primer L rappresenta il sito di restrizione per l'enzima BglII. Il prodotto di PCR (PCR4) è stato quindi purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio.
I due amplificati PCR3 e PCR4 sono stati mescolati e sottoposti ai seguenti trattamenti: (1) denaturazione iniziale a 95’C per 3 min. e successiva ibridazione a 68 “C (temperatura di ibridazione calcolata in base alla zona di identità fra i Primers H e I) per 30 sec.; (2) elongazione a 72°C per 2 min. in presenza di una DNA polimerasi termostabile. I passaggi (1) e (2) sono stati ripetuti altre quattro volte con modifica delle condizioni di denaturazione/ effettuata a 92°C per 1 min., e abbassando a ogni ciclo di 1°C la temperatura di ibridazione; (3} successivamente alla miscela sono stati aggiunti i primers G e L già usati per l’amplificazione iniziale dei costrutti ed è stata effettuata una PCR tradizionale per amplificare il costrutto ricombinante. Il prodotto di PCR ricombinante così ottenuto è stato digerito con l'enzima di restrizione BglII/ purificato tramite elettroforesi su gel di agarosio e subclonato nel plasmide pCDNAB-Alphabet-1 in sostituzione del frammento BglII1204~Bg9III1744 originariamente presente.
Esempio 3
Produzione delle molecole ricombinanti
II vettore d'espressione pcDNA3 contiene il promotore,dei geni immediate-eariy del citomegalovirus umano (CMV) e il sito di origine di replicazione episomale del virus SV40. Pertanto/ questo plasmide si presta particolarmente per l'espressione di proteine in cellule che esprimono il large T antigen del virus SV40, come le cellule di epitelio renale BQSC (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989}. Le molecole Alphabet-1 e Alphabet-RTKR subclonate in pcDNA3 possono essere quindi prodotte tramite trasfezione transiente in cellule BOSC.
Per la trasfezione, IO<6 >cellule per piastra da 100 mm di diametro vengono seminate al giorno 0 in 30% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-10% siero fetale bovino (10 ml/piastra). Il giorno 1, le cellule vengono trasfettate con 10 pg/piastra di pcDNA3-Alphabet-1 (oppure pcDNA3-Alphabet-RTKR) tramite lipofezione, utilizzando il protocollo fornito dalla ditta produttrice di lipofectina (Gibco-BRL). Il giorno 2, il terreno contenente il DM viene sostituito con terreno fresco. Il giorno 4 (48 ore dopo la fine della trasfezione), il terreno viene prelevato, chiarificato per centrifugazione, e analizzato per il suo contenuto in Alphabet-1 oppure Alphabet-RTKR.
Questa analisi può essere compiuta in modi diversi. Ad esempio, si può marcare metabolicamente la proteina ricombinante incubando le cellule trasfettate con terreno contenente ^S-Metionina (0,25 mCi/ml). La proteina così marcata può quindi essere parzialmente purificata per adsorbimento su beads di Sepharose-eparina e rilevata per autoradiografia dopo elettroforesi su gel di poliacrilammide (Figg. 5 e 6).
Nell’esempio mostrato nella figura 5, 10<6 >cellule BOSC trasfettate rispettivamente con pcDNA3-HGF (controllo) e pcDNA3-Alphabet-l sono state incubate .dal giorno 2 per 24 h in 4 mi di DMEM-Cys-Ket in presenza di 0,25 raCi/ml di <3>5Met-i-Cys (Promix, Amersham) e 10% FCS (Sigma). 3,5 mi di surnatante (chiarificato per centrifugazione, tamponato in 25 mM HEPES e addizionato di cocktail di inibitori delle proteasi) sono stati incubati (4 ore a 4“C in presenza di 500 mM NaCl) con 50 yi di beads di Sepharose-epsrina (Pierce). Quindi le beads sono state lavate con tampone apposito (500 mM NaCl; 20 mM HEPES pH 7.4; 0,1% Triton X-100; 10% glicerolo) e scaldate per 2 minuti a 90“C in 50 yl di Laemmli buffer in presenza di 2-mercaptoetanolo. Le proteine così eluite sono state separate per SDS-PAGE su un gel al 10% di poliacrilamide e analizzate tramite autoradiografia. Come si può vedere nella figura, Alphabet-1 viene secreto principalmente come precursore non tagliato, nonostante la presenza di siero fetale ad alta concentrazione (10%) nei terreno di produzione.
Nell'esempio mostrato nella figura 6, 10 cellule BOSC trasfettate rispettivamente con pcDNA3-Alphabet-l (controllo) e pcDNA3-Alphabet-RTKR sono state incubate dal giorno 2 per 24h in 4ml di DMEM-Cys<~>--Met<~ >in presenza di 0,25 mCi/ml di <3>^SMet+Cys (Promix, Amersham) e 2% FCS (Sigma). 3,5 mi di surnatante (chiarificato per centrifugazione, tamponato in 25 mM HEPES e addizionato di cocktail dì inibitori delle proteasi) sono stati incubati (4 ore a 4’C in presenza di 500 mM NaCl) con 50 yl di beads di Sepharose-eparina (Pierce). Quindi le beads sono state lavate con tampone apposito (500 mM NaCl; 20 mM KEPES pH 7,4; 0,1% Triton X-100; 10% glicerolo) e scaldate per 2 minuti a 90"C in 50 yl di Laemmli buffer in presenza di 2-mercaptoetanolo. Le proteine così eluite sono state separate per SDS-PAGE su un gel al 10% di poliacrilamide e analizzate tramite autoradiografia. Come si può vedere nella figura, nonostante la bassa concentrazione di siero fetale (2%) nel terreno di produzione, il precursore Pro-Alphabet-RTKR viene tagliato a costituire la forma matura in maniera significativa seppur ridotta, contrariamente all'Alphabet-1,presente esclusivamente come precursore.
La procedura di adsorbimento su beads di Sepharose-eparina può essere utilizzata, oltre che per l'analisi, anche per la purificazione iniziale della proteina ricombinante. La molecola può essere addizionalmente purificata sfruttando l'affinità delia poliistidina per i metalli pesanti quali il nichel. La proteina contenente il tag di poliistidina può essere adsorbita su di una colonna di resina al nichel (Invitrogen) e successivamente eluita con imidazolo (il protocollo dettagliato è fornito dalla ditta produttrice).
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Proteine ricombinanti caratterizzate dal fatto che la loro struttura comprende due superdomini, di cui uno costituito dalla combinazione dei dominii HL e Κ-^-ί^ delle catene a di HGF e MSP, l'altro dalla subunità β di HGF e di MSP separati da una sequenza di legame che eventualmente contiene un sito di taglio proteolitico. 2. Proteine ricombinanti secondo la rivendicazione 1, di formula generale (I):dove (le numerazioni degli amminoacidi che seguono vanno riferite alle sequenze di HGF e MSP come riportate rispettivamente in Fig.1 e 2): LS corrisponde all’intervallo di sequenza amminoacidica 1-31 si HGF o all'intervallo di sequenza 1-18 di MSP; HL corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 32 e 70, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 36 e 127; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 19 e 56, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 78 e 109; K1 corrisponde a un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 37 e 128, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 201 e 205; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 79 e 110, l’altro estremo compreso tra (o uguale a} gli amminoacidi 186 e 190; K2 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 202 e 206, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 283 e 299; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 187 e 191, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 268 e 282; K3 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 284 e 300, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 378 e 385; oppure corrisponde a un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a} gli amminoacidi 269 e 283, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 361 e 369; K4 corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 379 e 386, l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 464 e 487; oppure corrisponde ad un intervallo di sequenza della subunità a di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 362 e 370; l'altro estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 448 e 481; m, n, o,p sono scelti tra 0 e 1; la somma n+o+p è un numero intero compreso tra (o uguale a) 0 e 3, con la condizione che n > o > p; B corrisponde alia sequenza 488-491 di KGF, alla sequenza 478-489 di MSP, ad una sequenza dì consenso per protessi oppure ad una sequenza non tagliabile; [C] corrisponde alla sequenza della subunità £3di HGF avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 490 e 492, l'altro estremo uguale all 'amminoacido 723; oppure corrisponde alla sequenza della subunità di 3 di MSP avente un estremo compreso tra (o uguale a) gli amminoacidi 484 e 486, l'altro estremo uguale all'amminoacido 711; con la condizione che, quando [A] coincide con la catena di a di HGF o di MSP, [C] corrisponde rispettivamente alla catena β di MSP e HGF; D rappresenta la sequenza W-Z, dove W è un sito proteolìtico convenzionale, Z una qualsiasi sequenza utile per la purificazione della proteina su colonne di nichel o d'affinità; y può essere 0 o 1. 3, Proteine ricombinanti secondo le rivendicazioni 1-2, in cui il dominio HL corrisponde alla sequenza 32 - 127 della catena a di HGF o alla sequenza 19 - 98 della catena a di MPS; il dominio K-1 corrisponde alla sequenza 128 - 203 della catena a dì HGF, o alla sequenza 99 - 188 della catena a di MPS; il dominio 3⁄4 corrisponde alla sequenza 204 - 294 della catena a di HGF,o alla sequenza 189 - 274 della catena a di MPS; il dominio K3 corrisponde alla sequenza 286 - 383 della catena a di HGF, o alla sequenza 275 - 367 della catena a di MPS; il dominio £4 corrisponde alla sequenza 384 - 487 della catena a di HGF, o alla sequenza 368 - 477 della catena di MPS; C corrisponde alla sequenza 492-723 della catena β di HGF, oppure alla sequenza 486-711 della catena S di MSP,6. Sequenza nucleotidica codificante per le proteine ricombinantì delle rivendicazioni 1-5. 7. Vettori dì espressione comprendenti le sequenze nucleotìdiche della rivendicazione 6. 8. Cellula ospite eucariota o procariota contenente un vettore d’espressione della rivendicazione 7. 9. Uso delle proteine ricombinanti delle rivendicazioni 1-5 come agenti terapeutici. 10. Composizioni farmaceutiche contenenti una quantità efficace delle proteine ricombìnanti delle rivendicazioni 1-5, insieme ad eccipienti farmacologicamente accettabili.
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