EP0731837A1 - Bakterien zur herstellung stabiler fusionsproteine und verfahren zu deren nachweis - Google Patents

Bakterien zur herstellung stabiler fusionsproteine und verfahren zu deren nachweis

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EP0731837A1
EP0731837A1 EP95905579A EP95905579A EP0731837A1 EP 0731837 A1 EP0731837 A1 EP 0731837A1 EP 95905579 A EP95905579 A EP 95905579A EP 95905579 A EP95905579 A EP 95905579A EP 0731837 A1 EP0731837 A1 EP 0731837A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
bacteria
proteins
fusion
igass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95905579A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Klauser
Joachim Kramer
Thomas F. Meyer
Johannes Pohlner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP0731837A1 publication Critical patent/EP0731837A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to bacteria for the production of stable fusion proteins from a carrier protein and a passenger protein, the bacteria having the genetic marker fpt. Possession of this genetic marker enables the improved production of protein fusions that have a destabilizing effect on bacteria.
  • the present invention relates to bacteria for the production of fusion proteins in which the fusion protein is stably presented on the surface and the bacteria, in addition to the genetic marker fpt, have the markers "ompT and dsbA " .
  • the present invention also relates to methods for identifying bacteria which Present heterologous proteins with an affinity for a binding partner on their surface and methods for constructing vectors encoding these proteins Finally, the present invention also relates to bacteria which stably present at least one fusion protein on their surface and which have the genetic characteristics fpt, ompT and dsbA
  • the method according to the invention allows, for example, the production of protein fusions which are composed of portions of heavy and light antibody domains and the transport protein Igass and their export through the bacterial cell envelope.
  • a fundamental phenomenon of biological systems is specific interactions between receptor molecules and ligands. Even extremely complex processes in highly developed organisms can be reduced to simple molecular interactions and can be carried out on them
  • SPARE BLADE (RULE 26) Level can be analyzed and influenced effectively.
  • the material basis of such a system is formed by both the producer cells and the genetic information, in which the blueprint of a biomolecule is specified.
  • the producer cells must be capable of reproduction and at the same time be able to express heterologous genetic information and to present the corresponding biomolecules on their surface in an accessible manner. Ideally, they are easy to manipulate genetically, physico-chemically and genetically stable and undemanding in terms of their growth conditions.
  • a suitable microrgamsmus that this Escherichia coli is met.
  • Proteins are preferably suitable as biomolecules.
  • the underlying genetic information can range from a few codons to several genes, depending on whether a short peptide, a protein or a receptor consisting of several protein molecules is encoded. With the usual molecular biological methods, a large number of protein variants can be generated at the genetic level and the expression of the heterologous information can be made possible after introduction into the producer cells.
  • an essential prerequisite for the functioning of a cellular selection system is the presentation of relevant protein molecules on the cell surface. Accessibility for potential binding partners must be guaranteed and the binding properties must not be impaired by cellular determinants.
  • Escherichia coli various systems for the presentation of recombinant proteins were processed. The main feature of these systems is the use of protein fusions and the underlying gene fusions.
  • the fusions contain carrier protein portions. The carrier portions enable the export of the protein fusions from the cytoplasm over the two cell membranes of E. coli and their anchoring in the outer membrane.
  • Protein sequences attached to the carboxyl end of such an Lpp-OmpA fusion are accessible after export on the surface of recombinant E. coli cells (Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 2713- 2717).
  • the topological fixation of the amino end of the protein sequences to be presented to the membrane-anchoring OmpA sequence can have a negative effect, especially in cases where a free amino end is necessary for functional reasons.
  • OmpT protease a protein located in the outer membrane. Their activity directed towards the surface of the bacteria leads to the cleavage of Igass fusions and thus to the uncoupling of presented passenger proteins (Klauser et al., EMBO J. 11 (1992), 2327-2335). This activity prevents the physical coupling of binding properties of the passenger proteins with the cell proliferation apparatus. A selection of the producer cells is therefore excluded. This effect can be avoided by using OmpT-negative E. coli host cells.
  • the antibody fragments are in the form of protein fusions with the phage coat proteins g3p or g8p. In both cases it is possible to select from a population of recombinant phages those which have a desired specificity given by the surface-presented antibody fragment (Winter and Milstein, Nature 349 (1991), 293-299).
  • a decisive disadvantage of using phages as carriers of antibody fragments against bacterial cells is that phages do not replicate themselves but require host bacteria that only ensure their multiplication.
  • phages with the desired binding properties therefore requires complex cycles of selection (selection) and infection (phage multiplication). This disadvantage does not appear when whole bacterial cells are used as carriers of recombinant antibody fusions.
  • a method for identifying recombinant antibodies based on the phage Lamba does not allow the selection of specificities but requires complex screening procedures (Lerner et al., Science 252 (1991), 659-667).
  • the Igass domain or C-terminal portions of this domain are predestined as membrane anchors for the presentation of recombinant antibody domains on the surface of Gram-negative bacteria such as E. coli, Salmonella and Neisseries.
  • a bacterial system is characterized by the direct coupling of functional antibodies presented on the surface with the reproductive apparatus of living cells.
  • the antibody fragments can either be obtained from the cytoplasm in the form of inclusion bodies or from Pere periplasma as a soluble protein.
  • the antibody fragments present in the periplasm are correctly folded, therefore biologically active and can be purified directly from fractions of the periplasm.
  • the inclusion bodies present in the cytoplasm consist of denatured antibody fragments which show no biological activity. The latter can be achieved by simply cleaning the antibody fragments by de-and renaturation.
  • the recombinant antibody fragments are able to bind antigen with an affinity that is equivalent to the native antibody molecule.
  • the invention thus relates to a bacterium for producing at least one stable fusion protein from a carrier protein and a passenger protein, the bacterium having the genetic characteristic fpt.
  • the abbreviation fpt denotes a genetically determined property of E. coli which leads to the tolerance of the instability of the bacteria which occasionally occurs during the expression of exported fusion proteins. This marker is located between position 85 and 89 minutes of the gene map of the E. coli genome.
  • the genetic marker fpt can be used to produce bacteria that are tolerant of fusion proteins.
  • the term “carrier protein” denotes amino acid sequences within a fusion protein which do not belong to the passenger protein and which are important for the localization and the stability of the fusion protein in the bacteria.
  • the carrier protein portions include a signal peptide at the amino end of the fusions and the Igass transprotdomain at the carboxyl end of the fusions.
  • the carrier protein portions For fusion proteins that are transported into the periplasm, the carrier protein portions contain a signal peptide at the amino end of the fusions.
  • the term “passenger protein” denotes amino acid sequences within a fusion protein that do not belong to the carrier protein.
  • the passenger protein portions contain those sequences that interact with binding partners.
  • the cause is the formation of intramolecular disulfide bridges in the passenger proteins by the periplasmic disulfide oxidoreductase DsbA. This blockage of the translocation of passenger proteins by the outer membrane is not observed in bacterial cells which carry a mutation in the dsbA gene.
  • the present invention therefore relates to a bacterium with the genetic marker fpt, the fusion protein being stably presented on the surface, the bacterium being gram-negative and also having the genetic markers ompT- and dsbA-.
  • the term “presented on the surface” denotes the localization of a fusion protein or the passenger protein on the side of the outer bacterial membrane facing the medium.
  • Passenger proteins are freely accessible to binding partners in intact gram-negative bacteria.
  • ompT- denotes a genetic modification of E. coli cells that leads to a deficiency in the proteolytic activity of the protease OmpT.
  • dsbA denotes a genetic change in E. coli cells that leads to a deficiency in the activity of the periplasmic oxidoreductase DsbA.
  • the term dsbA is to be understood such that this does not only result in a deficiency in the activity due to a genetic change the oxidoreductase DsbA itself, but also by other factors that indirectly inhibit the activity of this oxidoreductase.
  • E. coli UT5600 has already mutated in one gene (ompT).
  • the transfer of the mutation in the dsbA gene to E. coli UT5600 was carried out by E. coli JCB571 (dsbA :: Kan; zihl2 :: Tnl0) using phage PI transduction. Positive transducers were selected for the cotransduction of a transposon Tn10 insertion near the dsbA gene locus. This also transferred the property determined by adjacent DNA sections that enables an E. coli cell, e.g. VH-Igass to produce stable fusions.
  • the bacterium is used to produce a fusion protein, the carrier protein obtained in the fusion protein containing the Igass protein or a fragment thereof which enables the fusion protein to be secreted.
  • Igass denotes the transport domain located at the carboxyl end of the Neisseria IgA protease precursor protein. This domain mediates the transport at the amino terminal -li ⁇ coupled proteins from the periplasm of gram-negative bacteria through the outer membrane.
  • the passenger protein produced by the bacterium according to the invention is a protein with an affinity for a binding partner, an antibody or an antigen-binding domain of an antibody, an antigen, a protein with enzymatic activity, an inhibitor, a receptor, a ligand or a nucleic acid binding protein.
  • binding partner denotes a molecule, a chemical compound or a macromolecule. Binding partners can be either freely soluble, bound to a matrix or associated with a biological membrane.
  • the term “antigen-binding domain” denotes at least the portion of an antibody molecule that is sufficient for the specific binding of an antigen.
  • variable antibody domains are exported as a monomeric ("single-chain Fv") scFv-Igass fusion, in which the domains VL and VH are covalently linked by a short peptide (eg a (Gly 4 Ser) 3 linker) or as two separate VL and VH Igass fusions within a bacterial cell. In the latter case, the antibody components of both fusions accumulate on the cell surface to form a functional Fv fragment.
  • a short peptide eg a (Gly 4 Ser) 3 linker
  • the bacterium used to produce the fusion protein is the E. coli JK 321 strain. This strain was obtained on December 22, 1993 from the DSM (German Collection of Microorganisms, 38124 Braunschweig, Ma ⁇ cher or Weg lb, Germany) under the deposit number DSM 8860.
  • Another object of the present invention is to provide the genetic marker fpt for producing a tolerance of bacteria to fusion proteins.
  • strains containing this marker which enables the stable surface exposure of fusion proteins, offers a number of possible uses. For example, it is conceivable to select a particular E. coli clone with certain properties from any immunoglobulin Igass library using any antigen.
  • a further object of the present invention is therefore to provide a method for the identification of bacteria which stably present proteins with an affinity for a binding partner on their surface, the method comprising the following steps:
  • step (c) culturing the bacterium from step (b), so that the bacteria of the culture obtained present the fusion protein or the fusion proteins stably on their surface;
  • the presentation of more than one fusion protein on the cell surface may, for example, be desirable in those cases in which individual chains of multimeric proteins are expressed separately and these then separate assemble the cell surface into a functional complex.
  • a bank of DNA sequences is used to construct the vector in step (a), in which the respective DNA sequences encode variants of the passenger protein or proteins, or variants of the carrier protein or the carrier proteins.
  • the term “variants of passenger proteins” denotes amino acid sequences which differ from passenger proteins and which have modified binding properties with respect to a binding partner.
  • variants of carrier proteins denotes carrier proteins modified in their amino acid sequence, which have changed transport properties with respect to coupled passenger proteins.
  • variants of the passenger protein for example, an antibody fragment with a given specificity could be optimized for a specific application by directed mutagenesis.
  • An evolution-like adaptation to an external factor through undirected mutations is possible through the continuous cultivation of E. coli cultures.
  • enzymatic activities can be presented, selected and modified.
  • the generation of variants of the carrier protein can result in a better adaptation to a given passenger protein or its variants, which can facilitate the secretion of the fusion protein.
  • the bacterium is grown in step (c) under conditions in which the DNA sequence encoding the fusion protein or the fusion proteins is mutated, so that the bacteria of the culture obtained variants of the Present fusion protein or the fusion proteins on their surface.
  • mutating conditions denotes cultivation conditions under which the addition of chemical substances and / or the action of ionizing radiation leads to an increased mutation rate in bacterial cultures.
  • the carrier protein contained in the fusion protein contains the Igass protein or a fragment thereof, which enables the fusion protein to be secreted.
  • the protein with an affinity for a binding partner is an antibody or an antigen-binding domain of an antibody, an antigen, a protein with enzymatic activity, an inhibitor, a receptor, a ligand or a nucleic acid. binding protein.
  • the bacteria which stably present the desired fusion protein on their surface can by interacting with the binding partner of the passenger protein bound to a matrix, by interacting with a fluorescence-labeled binding partner or by interacting with the Magnetic particle-bound binding partner of the passenger protein can be isolated.
  • Another object of the present invention is to provide gram-negative bacteria which stably present at least one fusion protein on their surface and which have the genetic markers fpt, ompT- and dsbA-.
  • a preferred embodiment relates to bacteria in which the carrier protein contained in the fusion protein contains the Igass protein or a fragment thereof which secretes of the fusion protein and / or the passenger protein enables a protein with an affinity for a binding partner, an antibody or an antigen-binding domain of an antibody, an antigen, a protein with enzymatic activity, an inhibitor, a receptor, a ligand or a nucleic acid-binding Is protein.
  • a further object of the present invention is the use of these bacteria for diagnostic purposes, for the production of proteins with an affinity for a binding partner, for the production of detergents, for the development of raw materials, for food processing or for the degradation or enrichment of pollutants.
  • the bacteria presenting specific antibody fragments according to the invention can be used to obtain these antibody fragments and these can then be used in the diagnostic or therapeutic field, if appropriate after purification.
  • Recombinant antibody fragments which, for example, specifically recognize surface structures of tumor cells, can be used in conjunction with a radionuclide or an effective toxin for therapeutic applications.
  • Binding specificities selected with the method according to the invention can be implanted ("humanized") by genetic engineering of the CDR (complementarity determining regions) regions in human immunoglobulin chains and used for the therapy of diseases.
  • Fig. 1 Schematic representation of the strategy for the construction of the VH-igass fusion in plasmid pJK165.
  • the VH gene fragment was fused at the 5 'end with the signal sequence of the ompA gene and at the 3' end with the igass gene fragment.
  • the DNA fragments required for this were linked together in a three-fragment ligation.
  • the non-coding region and the signal sequence of the ompA gene from E. coli DH5a were synthesized using chromosomal DNA as a template and the oligonucleotides JK20 and JK21 (Fig. 8) by PCR.
  • the PCR fragment obtained was inserted directly into the pCRIOOO vector without prior incubation with restriction enzymes (pJK129).
  • the VH gene fragment was also synthesized by PCR, in which case the corresponding cDNA served as a template and the oligonucleotides JK09 and JK17 (Fig. 8) were used.
  • the PCR fragment obtained was then incubated with Klenow poly erase to fill in protruding ends and, after restriction with EcoRI, inserted into the HincII / EcoRI sites of the pEMBL ⁇ vector.
  • the XhoI / EcoRI VH gene fragment was isolated from the plasmid pJK92 obtained and ligated together with the Clal / Xhol ompA gene fragment and an XhoI / EcoRI vector fragment from pTK59.
  • the plasmid pJK165 formed encodes a VH-igass fusion whose "-10 region" of the promoter was reconstituted in accordance with the starting plasmid pTK59.
  • Fig. 2 Schematic representation of the strategy for the construction of the VL-ig- necessarily fusion in the plasmids pJK78 and pJK257.
  • the plasmid pJK78 was created by incorporating a DNA fragment with the VL gene fragment of a monoclonal antibody into the Ndel / EcoRI vector fragment of the plasmid pTK59.
  • the VL gene fragment was generated using the oligonucleotides JK08 and JK14 (Fig. 8) in a polymerase chain reaction and cloned into the pCRIOOO vector (pJK56).
  • the corresponding DNA fragment of the VL gene was processed at the Ndel and EcoRI interfaces introduced by the oligonucleotides at the 5 'and 3' ends and ligated to the Ndel / EcoRI vector fragment of the plasmid pTK59.
  • the resulting plasmid was named pJK78. b.
  • the exchange of the gene of the b-lactamase (bla) and the ColEl replication origin on the plasmid pJK78 took place in two stages.
  • the gene of the chloramphenicol acetyl transferase (cat) of plasmid pACYC184 was amplified by PCR using the oligonucleotides JK32 and JK33 (Fig. 8).
  • the PCR fragment obtained was cloned into pJK78 vector fragment cut with HindIII.
  • the resulting plasmid pJK250 is characterized by the presence of two resistance genes (bla and cat) and the ColEl origin of replication.
  • the vector fragment (bla and ColEl) was deleted from pJK250 by restriction with Clal and Nhel and substituted from the plasmid pACYC184 by a Clal / Nhel question (pl5A origin).
  • the resulting plasmid pJK257 encodes a VL-igass fusion and allows its coexpression with the plasmid pJK165 (VH-iga ß ) within E. coli JK321 cells.
  • VH-Igass construct pJK165 was created by substituting the Clal / EcoRI fragment of pTK59 with the VH gene fragment and a DNA fragment that encodes the first 204 base pairs of the E. coli ompA transcript.
  • the VH-Igass fusion has at its N-terminus the signal peptide of the OmpA precursor protein, (ii)
  • the VL-Igass construct pJK78 was created by inserting the VL gene fragment into the Ndel / EcoRI interfaces of pTK59; the VL-Igass fusion formed in this way consequently carries the CtxB signal peptide.
  • E. coli JK321 Mode of action of a-protein on the surface of antibody-presenting E. coli JK321 by immunofluorescence labeling.
  • the cell suspension was placed in a rotary incubator for a further 30 min and then washed once in PBS.
  • Surface-bound antigen was fixed with paraformaldehyde (1%) / glutardialdehyde (0.5%) and detected with antigen-specific, polyclonal serum (anti-Fp80) and FITC-coupled mouse anti-rabbit IgG serum.
  • Fig. 6 Schematic representation of a method for the procedure of the antibody-presenting E. coli JK321.
  • Fig. 7 Selective enrichment of VL / VH-Igass coexpressing E. coli JK321 by antigen-labeled mitrocellulose. After separation of a-protein (about 10 ng / lane) by SDS-PAGE, the antigen was then blotted onto nitrocellulose. A nitrocellulose strip was developed with anti-Fp80 as an immunoblot in order to make the exact position of the a-protein band visible. To carry out the binding experiment, the E. coli strains UT5600 (pTK59; Rif S ), JK321 (pTK59; Rif R ) and JK321 (pJK165 / pJK257; Rif R ) were grown overnight as liquid cultures.
  • the two recombinant, Rif-resistant JK321 strains were diluted in a ratio of about 1: 2000 against the Rif-sensitive strain UT5600 (pTK59). After incubation of the bacterial suspension in PBS / BSA (1%) for 30 minutes, 1 ml of this was placed in 15 ml of PBS and placed in an empty petri dish together with a strip of nitrocellulose. After incubation with gentle shaking for 30 minutes at RT was washed three times with PBS (20 ml) and then the nitrocellulose was incubated on Rif-containing nutrient plates.
  • (+) and (-) refer to the coding or the complementary
  • VH-Igass fusion protein exerts a cytotoxic effect on the E. coli K12 irt ⁇ cells.
  • JK321 a section of the genome of an E. coli strain (JCB571) (Bardwell, loc. Cit.), Which carries a mutation in an unknown gene, was transferred to another E. coli strain (UT5600) ( Earhart, loc. Cit.).
  • UT5600 Earhart, loc. Cit.
  • Pl-phage transduction is usually used to map genes on the chromosome (Taylor and Trotter, Bacteriol. Reviews 31 (1967), 332- 344).
  • Pl phages multiply in bacterial cells, they pack not only viral DNA, but occasionally a piece of the host cell genome Virus envelope.
  • the length of the packed bacterial DNA is up to 2 minutes of the E. coli genome, which enables the co-transduction of two distant genetic markers. If this host cell DNA gets into another bacterial cell in a subsequent PI infection, this DNA fragment can recombine there into the chromosome.
  • E. coli JCB571 (d ⁇ bA :: Kan, zihl2 :: Tn10) was selected as the donor and E. coli UT5600 (ompT-) as recipient strain.
  • E. coli UT5600 (ompT-) was selected as the donor and E. coli UT5600 (ompT-) as recipient strain.
  • positive transductants which had reduced the mutated unknown gene locus in conjunction with the mutated d ⁇ bA gene and integrated into their chromosome, were grown with growth medium and growth medium on culture medium Tetracycline selected.
  • the strain JK321 After transformation with the plasmids pJK78 (VL-Igass) and pJK165 (VH-Igass), the stable expression of these Igass fusion proteins in E. coli JK321 could be shown (Fig. 4).
  • the strain JK321 also enables simultaneous coexpression of the plasmids pJK78 (VL-Igass) and pJK165 (VH-Igass) within a bacterial cell.
  • oligonucleotide JK21 (Fig. 8) was provided with an Xhol cleavage site, which enabled fusion with the 5 'end of the VH gene fragment.
  • a VH gene fragment was amplified by PCR using the oligonucleotides JK17 and JK09 (Fig.
  • the plasmid formed from this was designated pJK165 (Fig. 1).
  • E. coli JK321 After transformation of E. coli JK321 with plasmid pJK165 a high stability of the recombinant bacteria is observed. This effect does not occur in recombinant E. coli K12 wild-type cells.
  • E. coli K12 wild-type cells which carry the plasmid pJK165 a destabilization of the recombinant bacteria and the formation of mutants which no longer synthesize the VH-Igass fusion protein are observed due to a cytotoxic effect of the VH-Igass fusion protein.
  • the molecular background of these mutations is the breakdown of the plasmid pJK165 into a smaller derivative, from which the VH-igass fusion is no longer expressed.
  • VL-igass fusion was constructed in two stages (plasmids pJK78 and pJK257): in the first step, the VL domain was connected to a signal peptide at the N-terminus and to the Igass domain at the C-terminus (plasmid pJK78). The signal peptide ensures the transport of the fusion protein through the cytoplasmic membrane and the Igass domain subsequently mediates the transport of the VL antibody domain through the outer membrane.
  • the ColE1 replication origin and the gene of the ⁇ -lactamase (bla) in the plasmid pJK78 were replaced by the pA15 replication origin and the gene of the chloramphenicol acetyl transferase (cat) of the cloning vector pACYC184 (Rose, Nucl. Acid Res 16 (1978), 355) in plasmid pJK257.
  • the detailed construction of both plasmids is described in the legends to Fig. 2a / b and Fig. 3.
  • the use of different replication origins and resistance genes in the plasmids pJK165 and pJK257 enables the copropagation of both plasmids within one bacterial cell. '
  • the developed E. coli strain JK321 enables the Igass-mediated exposure of variable antibody domains on the cell surface and the binding of the specific antigen.
  • VH or VL Igass fusion proteins e.g. pJK165 or pJK257
  • the simultaneous production of the VL and VH Igass fusions of two plasmids e.g. pJK165 and pJK257
  • the two fusion proteins are transported separately from one another into the outer membrane, where the individual VL and VH domains of the fusion proteins assemble to form an Fv fragment.
  • the VL and VH Igass fusions are exposed as an Fv-Igass heterodimer on the cell surface of E. coli JK321. Recombinant E.
  • E. coli JK321 which export heterodimeric VH / VL-Igass fusion proteins to the cell surface, bind the specific antigen via their immunoglobulin components (Fig. 5). Furthermore, recombinant E. coli JK321 cells, which coexpress the VH and VL-Igass fusion proteins within a bacterial cell of two plasmids, can be used by using the specific antigen from a dilution against E. coli JK321 cells, the other, non-specific Igass fusion proteins (e.g. export CtxB-Igass, plasmid pTK59), enrich (Fig. 7).
  • Example 5 Development of a method for the detection of the enriched, antibody-presenting E. coli JK321 cells.
  • E. coli JK321 cells have a resistance gene against the antibiotic Rifa picin. This was in E. coli JK321 cells have been transformed into a DNA fragment that bears such a resistance gene. The DNA fragment recombined into the genome of E. coli JK321 and led to the expression of the Rifa picin resistance.
  • a specific genetic marker eg antibiotic resistance
  • E. coli JK321 host cells only allows the selective growth of the recombinant E. coli clones on Rifa picin-containing medium, which simultaneously present VL and VH Igass fusions with a specificity selected before the experiment.
  • the recombinant control cells used eg E. coli UT5600
  • the use of host cells that are resistant to rifampicin (JK321) or sensitive (UT5600) enables the specific, antibody-presenting cells to be clearly identified (Fig. 6).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterien zur Herstellung von stabilen Fusionsproteinen aus einem Trägerprotein und einem Passagierprotein, wobei die Bakterien den genetischen Marker fpt aufweisen. Der Besitz dieses genetischen Markers erlaubt die verbesserte Herstellung von auf Bakterien destabilisierend wirkenden Proteinfusionen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Bakterien zur Herstellung von Fusionsproteinen, bei denen das Fusionsprotein stabil auf der Oberfläche präsentiert wird und die Bakterien neben dem genetischen Marker fpt die Marker ompT- und dsbA- aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Identifizierung von Bakterien, die heterologe Proteine mit einer Affinität zu einem Bindungspartner auf ihrer Oberfläche präsentieren und Verfahren zur Konstruktion von diese Proteine codierenden Vektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch Bakterien, die auf ihrer Oberfläche stabil mindestens ein Fusionsprotein präsentieren und die genetischen Merkmale fpt, ompT- und dsbA- aufweisen sowie deren Verwendung beispielsweise für diagnostische Zwecke.

Description

Bakterien zur Herstellung stabiler Fusionsproteine und Verfahren zu deren Nachweis
Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterien zur Herstellung von stabilen Fusionsproteinen aus einem Trägerprotein und einem Passagierprotein, wobei die Bakterien den genetischen Marker fpt aufweisen. Der Besitz dieses genetischen Markers erlaubt die verbesserte Herstellung von auf Bakterien destabilisierend wirkenden Proteinfusionen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Bakterien zur Herstellung von Fusionsproteinen, bei denen das Fusionsprotein stabil auf der Oberfläche präsentiert wird und die Bakterien neben dem genetischen Marker fpt die Marker ompT- und dsbA" aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Identifizierung von Bakterien, die heterologe Proteine mit einer Affinität zu einem Bindungspartner auf ihrer Oberfläche präsentieren und Verfahren zur Konstruktion von diese Proteine codierenden Vektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch Bakterien, die auf ihrer Oberfläche stabil mindestens ein Fusionsprotein präsentieren und die genetischen Merkmale fpt, ompT- und dsbA- aufweisen sowie deren Verwendung beispielsweise für diagnostische Zwecke. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise die Produktion von Proteinfusionen, die sich aus Anteilen schwerer und leichter Antikörperdomänen und des Transportproteins Igaß zusammensetzen, und deren Export durch die bakterielle Zellhülle. In einer spezifischen Ausführungsform wird letztlich die Präsentation bindungsaktiver rekombinanter Antikörperfusionen auf der Bakterienoberfläche von Escherichia coli Zellen möglich.
Ein grundlegendes Phänomen biologischer Systeme sind spezifische Wechselwirkungen zwischen Rezeptormolekülen und Liganden. Selbst außerordentlich komplexe Vorgänge in hochentwickelten Organismen lassen sich auf einfache molekulare Interaktionen reduzieren und können auf dieser
ERSATZBLÄTT(REGEL26) Ebene analysiert und wirkungsvoll beeinflußt werden. Die Spezifitat solcher Wechselwirkungen druckt sich in der Äffinitat zwischen den beteiligten Biomolekulen aus, d.h. der zwischen Rezeptoren und Liganden auftretenden Bindungskrafte.
Um biologische Prozesse gezielt untersuchen und manipulieren zu können, ist es notwendig für unterschiedlichste Rezeptoren und Liganden passende Analoga mit definierten Bindungseigenschaften herzustellen. Zu diesem Zweck werden kunstliche Systeme entwickelt, mit denen einerseits auf einfachem Wege die Herstellung einer Vielzahl von Rezeptor- oder Ligandenstrukturen und andererseits die Auslese und gezielte Vermehrung von Molekülen mit definierten Bindungseigenschaften möglich ist. Solche Systeme, m denen mit evolutionεahnlichen Mechanismen Biomolekule mit definierten Eigenschaften gewonnen werden können, lassen sich auf unterschiedliche Weise verwirklichen. Eine Strategie, die sich eng an Prinzipien lebender Systeme, wie z. B. an das Prinzip der klonalen Selektion im Immunsystem von Saugern anlehnt, besteht in der Kopplung eines auf der Zelloberflache präsentierten Biomolekuls in Form der codierenden genetischen Information mit dem Vermehrungsapparat lebender Zellen. Die Zellen übernehmen hierbei nicht nur die Aufgabe der Produktion strukturell variabler Biomolekule sondern ermöglichen auch die Auslese geeigneter Moleküle durch die Präsentation der Biomolekule auf der Zelloberfläche und im Rahmen ihrer Zellteilung auch die Vermehrung der zugrundeliegenden genetischen Information.
Die materiellen Grundlagen eines solchen Systems bilden sowohl die Produzentenzellen als auch die genetische Information, worin der Bauplan eines Biomolekuls vorgegeben wird. Die Produzentenzellen müssen vermehrungsfähig und gleichzeitig befähigt sein, heterologe genetische Information auszuprägen und die entsprechenden Biomolekule zuganglich auf ihrer Oberflache zu präsentieren. Idealerweise sind sie einfach genetisch zu manipulieren, physikalisch-chemisch und genetisch stabil und anspruchslos bezuglich ihrer Wachstumsbedingungen. Ein geeigneter Mikrorgamsmus, der diese Bedingungen erfüllt, ist Escherichia coli. Als Biomoleküle kommen vorzugsweise Proteine in Betracht. Die zugrundeliegende genetische Information kann sich von wenigen Codons bis zu mehreren Genen erstrecken, abhängig davon, ob ein kurzes Peptid, ein Protein oder ein aus mehreren Proteinmolekülen bestehender Rezeptor kodiert wird. Mit den gängigen molekularbiologischen Methoden kann eine Vielzahl von Proteinvarianten auf der genetischen Ebene erzeugt und die Ausprägung der heterologen Information nach Einbringung in die Produzentenzellen ermöglicht werden.
Wie oben bereits angeführt, ist eine wesentliche Voraus¬ setzung für das Funktionieren eines zellulären Selektionssystems die Präsentation betreffender Proteinmoleküle auf der Zelloberfläche. Die Zugänglichkeit für potentielle Bindungspartner muß gewährleistet sein und die Bindungseigenschaften dürfen durch zelluläre Determinanten nicht beeinträchtigt werden. In Escherichia coli wurden verschiedene Systeme zur Präsentation rekombinanter Proteine bearbeitet. Das Hauptmerkmal dieser Systeme ist die Verwendung von Proteinfusionen und der zugrundeliegenden Genfusionen. Neben den Proteinanteilen, die eine betreffende Rezeptor- oder Ligandenstruktur beinhalten, enthalten die Fusionen Trägerproteinanteile. Die Trägeranteile ermöglichen den Export der Proteinfusionen vom Cytoplasma über die beiden Zellmembranen von E. coli und ihre Verankerung in der äußeren Membran.
Die Ausprägung von Genfusionen in rekombinanten Zellen wie E. coli wird häufig von Problemen begleitet und ist in manchen Fällen nicht möglich. Zwei Gründe können in diesem Zusammenhang angeführt werden: Einerseits kann die Bildung von Proteinfusionen speziell im Zusammenhang mit Membrantransport¬ prozessen zur Beeinträchtigung der Lebens- und Vermehrungsfähigkeit der Zellen führen. Als Folge werden aus einer Population rekombinanter Zellen Mutanten selektioniert, die keine oder eine verringerte Expression der Genfusionen zeigen. Ein bekanntes Beispiel für dieses Problem bilden Fusionen von Anteilen schwerer Immunglobulinketten mit Trägerproteinanteilen aus dem Protein A (Plückthun et al., Cold Spring Harbor Symposia 52 (1987) , 105-112) . Das andere häufig zu beobachtende Problem ist die Instabilität der Proteinfusionen nach ihrer Produktion. In diesem Zusammenhang sind insbesondere die Sensitivität rekombinanter Proteine gegenüber Proteasen und die unnatürlichen Faltungseigenschaften solcher Proteinfusionen von Bedeutung. Um dennoch auch solche kritischen Proteinfusionen produzieren zu können, ist es notwendig, durch gezielte Veränderungen den genetischen Hintergrund der Produzentenzellen den Erfordernissen anzupassen. Die Verwendung von Zellen mit verringerter Proteaseaktivität ist nur ein Beispiel.
Für die Präsentation rekombinanter Proteine auf der Zelloberfläche wurden verschiedene Systeme verwendet. Den Transport von Proteinfusionen durch die innere Membran ermöglicht ein Signalpeptid am Aminoende während andere Anteile die Einlagerung und Verankerung in der äußeren Membran übernehmen. Als Trägeranteile wurden in vielen Fällen Proteine der äußeren Membran von E. coli, wie z. B. LamB (Charbit et al., EMBO J. 5 (1986) , 3029-3037), PhoE (Agterberg et al. , Gene 88 (1990), 37-45) und OmpA (R. Freudl, Gene 82 (1989), 229-236) verwendet. Die Anwendungsmöglichkeiten sind in diesen Fällen jedoch stark eingeschränkt da zusätzliche Proteinsequenzen nur in oberflächenexponierten Schlaufen integriert werden können. Einerseits wird dadurch die Länge zusätzlicher Proteinsequenzen limitiert und andererseits werden diese auf beiden Seiten durch Trägerproteinsequenzen eingerahmt, wodurch sowohl Amino- als auch Carboxylende dieser Sequenzen topologisch fixiert sind. Fusionen mit Anteilen des Peptidoglykan assoziierten Lipoproteins (PAL) führen zwar zum Transport zur äußeren Membran, eine Präsentation nativer Proteinsequenzen auf der Oberfläche von E. coli wird dadurch jedoch nicht erreicht (Fuchs et al., Bio/Technology 9 (1991), 1369-1372) . Ein System mit dem offensichtlich eine Oberflächenpräsentation auch größerer Proteine in E. coli durchgeführt werden kann basiert auf Fusionen mit Anteilen aus Lpp und OmpA. Proteinsequenzen, die an das Carboxylende einer solchen Lpp-OmpA Fusion angehängt werden, sind nach dem Export auf der Oberfläche rekombinanter E. coli Zellen zugänglich (Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 2713- 2717) . Die topologische Fixierung des Aminoendes der zu präsentierenden Proteinsequenzen an die membranverankernde OmpA-Sequenz kann sich negativ auswirken, vor allem in Fällen in denen ein freies Aminoende aus funktionellen Gründen notwendig ist.
Eine besondere Stellung bei der Verwendung von E. coli zur Präsentation von Proteinen nehmen Fusionen mit der Transportdomäne des IgA-Proteasevorläufers Igaß ein (Klauser et al., EMBO J. 9 (1990) , 1991-1999) . Mit diesem Transportsystem lassen sich selbst große Passagierproteine an die Oberfläche von E. coli Zellen befördern, wenn sie am Aminoende mit einem Signalpeptid und am Carboxylende mit der Igaß-Do äne oder mit Teilen dieser Domäne fusioniert werden. Im Gegensatz zu dem oben angeführten Lpp-O pA-System verfügen die mit Hilfe von Igaß (Membrananker) präsentierten Proteine über ein freies Aminoende während das Carboxylende mit dem Membrananker (Igaß) verbunden ist. Ein wichtiger Faktor, der die Verankerung von Igaß-Fusionen auf der Oberfläche von E. coli Zellen beeinflußt, ist die OmpT-Protease, ein Protein das in der äußeren Membran lokalisiert ist. Ihre zur Oberfläche der Bakterien gerichtete Aktivität führt zur Spaltung von Igaß-Fusionen und damit zur Abkopplung präsentierter Passagierproteine (Klauser et al., EMBO J. 11 (1992), 2327- 2335) . Durch diese Aktivität wird die physische Kopplung von Bindeeigenschaften der Passagierproteine mit dem Vermehrungsapparat der Zellen unterbunden. Eine Selektion der Produzentenzellen ist somit ausgeschlossen. Dieser Effekt kann durch die Verwendung von OmpT-negativen E. coli Wirtszellen umgangen werden.
Verfahren zur Oberflächenpräsentation von Proteinen in E. coli sind bei der Suche und Manipulation von Polypeptiden mit therapeutischer und diagnostischer Anwendbarkeit von besonderer Bedeutung. Die umfangreichen Erkenntnisse auf den Gebieten der Immunologie und Zellbiologie haben eine Vielzahl von Proteinen als potentielle Kandidaten identifiziert. Eine Proteinfamilie, der in diesem Zusammenhang große Aufmerksamkeit zuteil wird, sind die Immunglobuline. Die Herstellung von Immunglobulinen mit rekombinanten Methoden hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Interessant ist in diesem Zusammenhang vor allem die Möglichkeit, ganze Antikörperbanken in Mikroorganismen zu etablieren mit der Möglichkeit, geeignete Antikörper neu zu generieren, zu modifizieren, zu selektieren und zu vermehren.
Zum gegenwärtigen Stand der Forschung stellt die Präsentation von Antikörperfragmenten auf der Oberfläche von filamentösen bakterionphagen (fd) das am besten entwickelte System dar. Die Antikörperfragmente liegen hierbei in Form von Proteinfusionen mit den Phagen-Hüllproteinen g3p oder g8p vor. In • beiden Fällen ist es möglich, aus einer Population rekombinanter Phagen, solche zu selektionieren, die eine gewünschte, durch das oberflächenpräsentierte Antikörperfragment gegebene Spezifitat besitzen (Winter and Milstein, Nature 349 (1991) , 293-299) . Ein entscheidender Nachteil der Verwendung von Phagen als Träger von Antikörperfragmenten gegenüber Bakterienzellen ist, daß Phagen nicht selbst replizieren sondern Wirtsbakterien benötigen, die erst ihre Vermehrung gewährleisten. Die Gewinnung von Phagen mit gewünschten Bindungseigenschaften erfordert daher aufwendige Zyklen von Selektion (Auswahl) und Infektion (Phagen-Vermehrung) . Dieser Nachteil tritt bei der Verwendung ganzer Bakterienzellen als Träger rekombinanter Antikörperfusionen nicht in Erscheinung. Ein auf dem Phagen Lamba beruhendes Verfahren zur Identifizierung rekombinanter Antikörper erlaubt hingegen keine Selektion von Spezifitäten sondern erfordert aufwendige Screening-Prozeduren (Lerner et al., Science 252 (1991), 659-667). Wie kaum ein anderes System sind die Igaß-Domäne oder C- terminale Anteile dieser Domäne als Membrananker zur Präsentation rekombinanter Antikörperdomänen auf der Oberfläche gramnegativer Bakterien wie E. coli, Salmonellen und Neisserien prädestiniert. Gegenüber den oben beschriebenen Phagensystemen zeichnet sich ein bakterielles System durch die direkte Kopplung funktioneller, an der Oberfläche präsentierter Antikörper mit dem Vermehrungsapparat lebender Zellen aus. Auf der Ebene der Bakterien besteht neben der Möglichkeit zur direkten Selektion und Manipulation weitergehend die Möglichkeit, größere Mengen funktioneller Antikörperfragmente zu gewinnen. Die Antikörperfragmente können entweder aus dem Cytoplasma in Form von Einschlußkörpern (inclusion bodies) oder aus ύe Periplasma als lösliches Protein gewonnen werden. Die im Periplasma vorliegenden Antikörperfragmente sind korrekt gefaltet, von daher biologisch aktiv und können direkt aus Fraktionen des Periplasmas gereinigt werden. Die im Cytoplasma vorliegenden Einschlußkörper bestehen aus denaturierten Antikörperfragmenten, die keine biologische Aktivität zeigen. Letztere erreicht man nach einfacher Aufreinigung der Antikörperfragmente durch De- und Renaturierung. Die rekombinanten Antikörperfragmente sind imstande, Antigen mit einer Affinität zu binden, welche dem nativen Antikörpermolekül gleichkommt.
In Wirtsstämmen tritt jedoch nach Transformation mit Plasmiden, die beispielsweise eine VH-Igaß Fusion ausprägen, eine starke Instabilität dieser Plasmide und Lyse der rekombinanten Bakterien auf. Ein identischer Phänotyp wurde von einer anderen Arbeitsgruppe in Zusammenhang mit dem Export einer Fusion zwischen einer VH-Domäne und dem Protein A von Staphylococcus aureus beschrieben. Dieses Phänomen wird offenbar von der gestörten Signalpeptid-abhängigen Sekretion von VH-Domänen, die an eine Exoprotein-Determinante fusioniert sind, hervorgerufen. Der vorliegenden Erfindung lag somit das technische Problem zugrunde, Bakterien bereitzustellen, die diese Nachteile nicht aufweisen, das heißt, die allgemein eine erhöhte Stabilität bei der Expression eines aus einem Trägerprotein und einem Passagierprotein gebildeten Fusionsprotein aufweisen. Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Möglichkeit, die Zell-destabilisiernde Wirkung von Fusionsproteinen zu verhindern, der Einsatz bestimmter Wirtszellen darstellt, die den genetischen Marker fpt aufweisen.
Somit betrifft die Erfindung ein Bakterium zur Herstellung von mindestens einem stabilen Fusionsprotein aus einem Trägerprotein und einem Passagierprotein, wobei das Bakterium das genetische Merkmal fpt aufweist.
Die Abkürzung fpt bezeichnet erfindungsgemäß eine genetisch determinierte Eigenschaft von E. coli, die zur Toleranz der bei der Expression exportierter Fusionsproteine gelegentlich auftretenden Instabilität der Bakterien führt. Dieser Marker befindet sich zwischen Position 85 und 89 Minuten der Genkarte des E. coli-Genoms. Der genetische Marker fpt kann zur Herstellung von Bakterien, die tolerant gegenüber Fusionsproteinen sind, verwendet werden.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Trägerprotein" Aminosäuresequenzen innerhalb eines Fusionsproteins, die nicht zum Passagierprotein gehören und die für die Lokalisation und die Stabilität des Fusionsproteins in den Bakterien von Bedeutung sind. Für Fusionsproteine, die auf der Bakterienoberfläche präsentiert werden, beinhalten die Trägerproteinanteile ein Signalpeptid am Aminoende der Fusionen und die Igaß-Transprotdomäne am Carboxylende der Fusionen. Für Fusionsproteine, die ins Periplasma transportiert werden, beinhalten die Trägerproteinanteile ein Signalpeptid am Aminoende der Fusionen. Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Passagierprotein" Aminosäuresequenzen innerhalb eines Fusionsproteins, die nicht zum Trägerprotein gehören. Für Fusionsproteine, die auf der Bakterienoberfläche präsentiert werden, beinhalten die Passagierproteinanteile diejenigen Sequenzen, die mit Bindungspartnern interagieren.
Die Herstellung eines optimierten E. coli Wirtsstamms, der eine stabile Oberflächenpräsentation von Fusionsproteinen ermöglicht, erfordert neben der Existenz dieser Mutation die Einführung zusätzlicher genetischer Veränderungen. In Untersuchungen zur Sekretion von Igaß-Fusionsproteinen in E. coli wurde gezeigt, daß die Igaß-Domäne in der äußeren Membran durch OmpT-Protease gespalten und somit das Passagierprotein vom Membrananker Igaß abgekoppelt wird. Desweiteren ist die Translokation von Passagierproteinen auf die Zelloberfläche nur in ihrer entfalteten Konformation möglich. Erfolgt die Igaß-vermittelte Sekretion variabler Antikörperdomänen in E. coli K12 Wildtypstämmen oder in E. coli (ompT-) , werden die I.jnunglobulinanteile von unspezifischen periplasmatischen Proteasen degradiert. Die Ursache stellt die Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken in den Passagierproteinen durch die periplasmatische Disulfid-Oxidoreduktase DsbA dar. Diese Blockade der Translokation von Passagierproteinen durch die äußere Membran wird in bakteriellen Zellen, die eine Mutation im dsbA Gen tragen, nicht beobachtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Bakterium mit dem genetischen Marker fpt, wobei das Fusionsprotein stabil auf der Oberfläche präsentiert wird, das Bakterium gram-negativ ist und außerdem die genetischen Marker ompT- und dsbA- aufweist.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "auf der Oberfläche präsentiert" die Lokalisation eines Fusionsproteins bzw. des Passagierproteins auf der dem Medium zugewandten Seite der äußeren Bakterienmembran. An der Oberfläche präsentierte Passagierproteine sind in intakten gram-negativen Bakterien für Bindungspartner frei zugänglich.
Die Abkürzung ompT- bezeichnet eine genetische Veränderung von E. coli Zellen, die zu einer Defizienz in der proteolytischen Aktivität der Protease OmpT führt.
Die Abkürzung dsbA" bezeichnet eine genetische Veränderung von E. coli Zellen, die zu einer Defizienz in der Aktivität der periplasmatischen Oxidoreductase DsbA führt. Erfindungsgemäß ist der Begriff dsbA" so zu verstehen, daß dieser nicht nur eine Defizienz in der Aktivität durch eine genetische Veränderung der Oxidoreductase DsbA selbst, sondern auch durch andere Faktoren, die die Aktivität dieser Oxidoreductase indirekt inhibieren, mit einschließt.
Die Vereinigung der Mutationen in den drei angesprochenen Genen im Chromosom einer Bakterienzelle erfolgte erfindungsgemäß in E. coli UT5600 (ompT-) . E. coli UT5600 ist selbst schon in einem Gen (ompT) mutiert. Die Übertragung der Mutation im dsbA Gen nach E. coli UT5600 erfolgte von E. coli JCB571 (dsbA::Kan; zihl2::Tnl0) mit Hilfe von Phagen Pl- Transduktion. Positive Transduktanten wurden auf die Kotransduktion einer, nahe dem dsbA Genlokus gelegenen Transposon TnlO Insertion, selektioniert. Dadurch wurde auch die durch angrenzende DNA-Abschnitte determinierte Eigenschaft übertragen, die es einer E. coli Zelle ermöglicht, z.B. VH- Igaß Fusionen stabil zu produzieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Bakterium zur Herstellung eines Fusionsproteins verwendet, wobei das im Fusionsprotein erhaltene Trägerprotein das Igaß- Protein enthält oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionεproteins ermöglicht.
Die Abkürzung Igaß bezeichnet die am Carboxylende des Neisseria IgA-Proteasevorläuferproteins gelegene Transport¬ domäne. Diese Domäne vermittelt den Transport aminoterminal -li¬ angekoppelter Proteine vom Periplasma gramnegativer Bakterien durch die äußere Membran.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das von dem erfindungsgemäßen Bakterium hergestellte Passagierprotein ein Protein mit einer Affinität für einen Bindungspartner, ein Antikörper oder eine Antigen-bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Rezeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Bindungspartner" ein Molekül, eine chemische Verbindung oder ein Makromolekül. Bindungspartner können sowohl frei löslich, gebunden an eine Matrix oder aber assoziiert mit einer biologischen Membran vorliegen.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Antigen-bindende Domäne" mindestens den Anteil eines Antikörpermoleküls, der hinreichend für die spezifische Bindung eines Antigens ist.
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die stabile Produktion und Präsentation von Immunglobulindomänen auf der Oberfläche gramnegativer Bakterien. Die praktische Durchführung ist auf zwei verschiedenen Wegen möglich. Entweder erfolgt der Export der variablen Antikörperdomänen als monomere ("single-chain Fv") scFv-Igaß Fusion, in der die Domänen VL und VH durch ein kurzes Peptid (z.B. ein (Gly4Ser) 3-Linker) kovalent verbunden sind oder als zwei getrennte VL- und VH-Igaß Fusionen innerhalb einer Bakterienzelle. Im letzteren Fall lagern sich die Antikörperanteile beider Fusionen auf der Zelloberfläche zu einem funktioneilen Fv-Fragment zusammen. Die Verwendung verschiedener E. coli K12 Stämme führte mit den VL- und scFv- Igaß Konstrukten zu stabilen Transformanten.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das zur Herstellung des Fusionsproteins verwendete Bakterium der Stamm E. coli JK 321. Dieser Stamm wurde am 22. Dezember 1993 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, 38124 Braunschweig, Maεcheroder Weg lb, Deutschland) unter der Hinterlegungsnummer DSM 8860 hinterlegt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung des genetischen Markers fpt zur Erzeugung einer Toleranz von Bakterien gegenüber Fusionsproteinen.
Die Entwicklung von Stämmen, die diesen Marker enthalten, der die stabile Oberflächenexposition von Fusionsproteinen ermöglicht, bietet eine Reihe von Einsatzmöglichkeiten. So ist es zu Beispiel denkbar, mit Hilfe eines beliebigen Antigens aus einer Immunglobulin-Igaß Bibliothek einen bestimmten E. coli Clon mit bestimmten Eigenschaften zu selektionieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Bakterien, die Proteine mit einer Affinität für einen Bindungspartner stabil auf ihrer Oberfläche präsentieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Konstruktion mindestens eines Vektors mit min¬ destens einer DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein aus einem Trägerprotein und einem Passa¬ gierprotein codiert, das stabil an der Oberfläche der Bakterien präsentiert werden kann;
(b) Einbringen des Vektors in diese Bakterien;
(c) Anzucht des Bakteriumε aus Schritt (b) , so daß die Bakterien der erhaltenen Kultur auf ihrer Oberfläche das Fusionsprotein oder die Fusions- proteine stabil präsentieren;
(d) Isolierung von Bakterien, die das gewünschte Fusionsprotein oder die Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche präsentieren.
Die Präsentation von mehr als einem Fusionsprotein auf der Zelloberfläche kann beispielsweise in solchen Fällen wünschenswert sein, in denen einzelne Ketten multimerer Proteine getrennt exprimiert werden und diese sich dann auf der Zelloberfläche zu einem funktioneilen Komplex zusammenlagern.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird zur Konstruktion des Vektors in Schritt (a) eine Bank von DNA-Sequenzen verwendet, in der die jeweiligen DNA-Sequenzen Varianten des Passagierproteins oder der Passagierproteine codieren, oder Varianten des Trägerproteins bzw. der Trägerproteine.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Varianten von Passagierproteinen" von Passagierproteinen abweichende Aminosäuresequenzen mit bezüglich eines Bindungspartners modifizierten Bindungseigenschaften.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "Varianten von Trägerproteinen" in ihrer Aminosäuresequenz modifizierte Trägerproteine, die veränderte Transporteigenschaften bezüglich angekoppelter Passagierproteine aufweisen.
Durch die Konstruktion von Varianten des Passagierproteins könnte zum Beispiel ein Antikörperfragment mit gegebener Spezifitat durch gerichtete Mutagenese bezüglich einer bestimmten Anwendung optimiert werden. Eine evolutionsähnliche Anpassung an eine externen Faktor durch ungerichtete Mutationen ist durch kontinuierliche Züchtung von E. coli Kulturen möglich. Weiterhin können nicht nur Antikörperfusionen mit diesem Verfahren bearbeitet werden, sondern auch enzymatische Aktivitäten präsentiert, selektioniert und modifiziert werden. Die Erzeugung von Varianten des Trägerproteins kann eine bessere Adaption an ein gegebenes Passagierprotein oder dessen Varianten ergeben, was die Sezernierung des Fusionsproteins erleichtern kann.
In einer weitern bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens erfolgt die Anzucht des Bakteriums in Schritt (c) unter Bedingungen, bei denen die das Fusionsprotein bzw. die die Fusionsproteine codierende DNA-Sequenz mutiert wird, so daß die Bakterien der erhaltenen Kultur Varianten des Fusionsproteins oder der Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche präsentieren.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff "mutierende Bedingungen" Kultivierungsbedingungen unter denen es durch Zusatz chemischer Substanzen und/oder Einwirkung ionisierender Strahlung zu einer erhöhten Mutationsrate in Bakterienkulturen kommt.
In einer bevorzugten Ausführungsform diese Verfahrens enthält das im Fusionsprotein enthaltene Trägerprotein das Igaß-Protein oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionsproteins ermöglicht.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Protein mit einer Affinität für einen Bindungspartner ein Antikörper oder eine Antigen- bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Rezeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein.
Schließlich können in einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens die Bakterien, die das gewünschte Fusionsprotein stabil auf ihrer Oberfläche präsentieren, durch Interaktion mit dem an eine Matrix gebundenen Bindungspartner des Passagierproteins, durch Interaktion mit einem fluoreszenz-markierten Bindungspartner oder durch Interaktion mit dem an Magnetpartikel gebundenen Bindungspartner des Passagierproteins isoliert werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von gram-negativen Bakterien, die auf ihrer Oberfläche stabil mindestens ein Fusionsprotein präsentieren und die genetischen Marker fpt, ompT- und dsbA- aufweisen.
Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft Bakterien, bei denen das im Fusionsprotein enthaltene Trägerprotein das Igaß- Protein enthält oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionsproteins ermöglicht und/oder das Passagierprotein ein Protein mit einer Affinität für einen Bindungspartner, ein Antikörper oder eine Antigen-bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Rezeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein ist.
Schließlich ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung die Verwendung dieser Bakterien für diagnostische Zwecke, zur Herstellung von Proteinen mit einer Affinität für einen Bindungspartner, zur Waschmittelherstellung, zur Erschließung von Rohstoffen, zur Lebensmittelverarbeitung oder zum Abbau oder der Anreicherung von Schadstoffen.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen, spezifische Antikörperfragmente präsentierenden Bakterien zur Gewinnung dieser Antikörperfragmente verwendet werden und diese dann, gegebenenfalls nach Aufreinigung, im diagnostischen oder therapeutischen Bereich eingesetzt werden. Rekombinante Antikörperfragmente, die beispielsweise spezifisch Oberflächenstrukturen von Tumorzellen erkennen, können in Verbindung mit einem Radionuklid oder einem wirksamen Toxin für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren selektionierte Bindungs- spezifitäten könne durch gentechnische Übertragung der CDR (complementarity determining regions) Regionen in menschliche Immunglobulinketten eingepflanzt ("humanisiert") werden und zur Therapie von Krankheiten verwendet werden.
Beschreibung der Figuren
Fig. l: Schematische Darstellung der Strategie zur Konstruktion der VH-igaß Fusion in Plasmid pJK165. Im Zuge der Konstruktion von Plasmid pJK165 wurde das VH-Genfragment am 5'-Ende mit der Signalsequenz des ompA Gens und am 3'-Ende mit dem igaß Genfragment fusioniert. Die hierzu benötigten DNA-Fragmente wurden in einer Drei-Fragmente-Ligation miteinander verbunden. Die Synthese der nicht-kodierenden Region und der Signalseguenz des ompA Gens von E. coli DH5a erfolgte mit Hilfe chromosomaler DNA als Matrize und den Oligonukleotiden JK20 und JK21 (Abb. 8) durch PCR. Das erhaltene PCR-Fragment wurde ohne vorherige Inkubation mit Restriktionsenzymen direkt in den pCRIOOO-Vektor inseriert (pJK129) . Die Synthese des VH-Genfragments erfolgte ebenfalls durch PCR wobei in diesem Fall die entsprechende cDNA als Matrize diente und die Oligonukleotide JK09 und JK17 (Abb. 8) eingesetzt wurden. Das erhaltene PCR-Fragment wurde danach mit Klenow-Poly erase inkubiert, um überstehende Enden aufzufüllen und nach Restriktion mit EcoRI in die HincII/EcoRI Schnittstellen des pEMBLδ-Vektors inseriert. Aus dem gewonnenen Plasmid pJK92 wurde das XhoI/EcoRI VH-Genfragment isoliert und zusammen mit dem Clal/Xhol ompA-Genfragment und einem XhoI/EcoRI-Vektorfragment aus pTK59 ligiert. Das gebildete Plasmid pJK165 kodiert eine VH-igaß Fusion, deren "-10-Region" des Promoters gemäß dem Ausgangsplasmid pTK59 rekonstituiert wurde.
Fig. 2: Schematische Darstellung der Strategie zur Konstruktion der VL-ig-aß Fusion in den Plasmiden pJK78 sowie pJK257. a.) Das Plasmid pJK78 entstand durch den Einbau eines DNA- Fragments mit dem VL-Genfragment eines monoklonalen Antikörpers in das Ndel/EcoRI-Vektorfragment des Plasmids pTK59. Zunächst wurde das VL-Genfragment mit Hilfe der Oligonukleotide JK08 und JK14 (Abb. 8) in einer Polymerase-Ketten-Reaktion erzeugt und in den pCRIOOO-Vektor kloniert (pJK56) . Das entsprechende DNA- Fragment des VL-Genε wurde an den durch die Oligonukleotide an den 5'- und 3 '-Enden eingeführten Ndel- und EcoRI-Schnittstellen prozessiert und mit dem Ndel/EcoRI-Vektorfragment des Plasmids pTK59 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pJK78 bezeichnet. b. ) Der Austausch des Gens der b-Lactamase (bla) und des ColEl Replikationsorigins auf dem Plasmid pJK78 erfolgte in zwei Etappen. Im ersten Schritt wurde mit Hilfe der Oligonukleotide JK32 und JK33 (Abb. 8) das Gen der Chloramphenicol-Acetyl- Transferase (cat) von Plasmid pACYC184 durch PCR amplifiziert.
ERSATZBLÄΓT (REGEL 26) Daε gewonnene PCR-Fragment wurde in daε mit Hindlll geschnittene pJK78-Vektorfragment kloniert. Das reεultierende Plaεmid pJK250 zeichnet εich durch daε Vorliegen zweier Resistenzgene (bla und cat) sowie den ColEl Replikationsorigin aus. Durch Restriktion mit Clal und Nhel wurde aus pJK250 das Vektorfragment (bla und ColEl) deletiert und durch ein Clal/Nhel-Frag ent (pl5A-Origin) aus dem Plasmid pACYC184 subεtituiert. Das hierbei entstandene Plasmid pJK257 kodiert eine VL-igaß Fusion und erlaubt seine Koexpression mit dem Plasmid pJK165 (VH-igaß) innerhalb von E. coli JK321 Zellen.
Fig. 3: Struktur von wesentlichen Sequenzmotiven der verwendeten VH- und VL-igaß Fusionen: Alle dargestellten Konstrukte sind Derivate des Plasmidε pTK59 und zeigen verschiedene wichtige Übergangsbereiche der jeweiligen Fuεionen. (i) Daε VH-igaß Konεtrukt pJK165 entstand durch Substitution des Clal/EcoRI- Fragments von pTK59 durch das VH-Genfragment und einem DNA- Fragment, das die ersten 204 Basenpaare des E. coli ompA Transkripts kodiert. Dadurch verfügt die VH-Igaß Fusion an ihrem N-Terminus über daε Signalpeptid deε OmpA Vorläuferproteins, (ii) Das VL-igaß Konstrukt pJK78 enstand durch Insertion deε VL- Genfragmentε in die Ndel/EcoRI Schnittstellen von pTK59; die hierbei gebildete VL-Igaß Fusion trägt folglich das CtxB Signalpeptid. (iii) In Plasmid pJK257, einem VL-igaß Derivat von pJK78, wurde das Vektorfragment (bla und ColEl) durch die cat und pl5A Marker deε Plasmidε pACYC184 erεetzt, wodurch die Koexpreεεion der Plaεmide pJK257 und pJK165 innerhalb einer Zelle ermöglicht wird. Die ϋbergangεbereiche in dieεer VL-igaß Genfuεion εind identiεch zu pJK78 und werden daher nicht gesondert aufgeführt. Die Spaltstellen der Signalpeptidase sind durch Pfeile gekennzeichnet. Um eine effiziente Prozessierung durch die Signalpeptidase zu gewährleisten, wurden zwei Aminosäuren der nativen OmpA- und CtxB-Proteine am N-Terminus der Antikörperdomänen belasεen (durch Sterne bezeichnet) . Kurεiv geεchriebene Ziffern geben jeweils die erste und letzte Aminoεäurepoεition der variablen Antikörperdomänen in den Igaß- Fuεionen und fett gedruckte Aminoεäuren die eingeführte Spaltεtelle der IgA-Protease an (Pohlner et al. , Bio/Technology 10 (1992) , 799-804) .
Fig. 4: Sensitivität der oberflächenexponierten Antikorperdomanen gegenüber Trypsin in physiologisch intakten E. coli JK321. Die Immunoblotanalyse von JK321 Zellyεaten mit den Plaεmiden pTK59 (Spur 1 und 4) , pJK78 (Spur 2 und 5), pJK165 (Spur 3 und 6) mit anti-Fp42 zeigt die Igaß-Hybridproteine vor (Spuren 1 biε 3) , εowie nach Inkubation der rekombinanten Bakterien mit Proteaεe (Spuren 4 biε 6) . Die Analyse der Zellysate mit anti-OmpA Serum (Spuren 7 biε 9) zeigt, daß in den einzelnen Bakterienklonen das periplasmatiεche Carboxylende des OmpA Proteins für Trypεin nicht zugänglich ist und bestätigt somit die extrazelluläre Lokalisierung der Antikörperdomänen.
Fig. 5: Machweis von a-Protein auf der Oberfläche antikörperpräsentierender E. coli JK321 durch Immunfluoreszenz- Markierung. Reko binante E. coli JK321 Zellen, die Genfuεionen zwiεchen ctxB-igaß (Plaεmid pTK59) εowie VH- und VL-igaß (Plasmide pJK165 und pJK257) exprimierten, wurden über Nacht bei 28°C in LB-Medium, pH=8,5, in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (7,5 mM) und den jeweils benötigten Antibiotika angezogen. Nach einmaligem Waschen in PBS wurden die Bakterien in PBS/BSA (1%) inkubiert, um unspezifiεche Bindungsstellen auf der Zelloberfläche abzusättigen. Nach Zugabe des spezifischen Antigens (a-Protein, 100 ng/ml) wurde die Zellsuspension für weitere 30 Min in einen Drehinkubator gestellt und danach einmal in PBS gewaschen. Oberflächengebundenes Antigen wurde mit Paraformaldehyd (1%)/Glutardialdehyd (0,5%) fixiert und mit antigenspezifiεchem, polyklonalem Serum (anti-Fp80) und FITC- gekoppeltem Mauε-anti-Kaninchen-IgG Serum nachgewiesen.
Fig. 6: Schematische Darstellung eines Verfahrens zum Machweis der antikörperpräsentierenden E. coli JK321. Um die
Anreicherung spezifischer, VL-/VH-Igaß produzierender E. coli JK321 Zellen durch das spezifiεche Antigen verfolgen zu können, tragen diese rekombinanten Bakterien einen Rifampicin- Marker (Rif) im Chromosom, der ihr selektives Wachstum auf Nährplatten (Rif) ermöglicht. Demgegenüber wachsen die Kontrollzellen nur auf Rif-freiem Medium. Somit kann aus dem Verhältnis der Rif-resiεtenten zu Rif-εensitiven Bakterien¬ kolonien die selektive Anreicherung der spezifischen VL-/VH- Igaß koexprimierenden JK321 Zellen bestimmt werden. Im Schema werden zu Beginn der Selektion die spezifischen, Rif- resiεtenten E. coli JK321 in einem Verhältniε von 1:10000 gegen Kontrollzellen E. coli UT5600, die VL-/VH-Igaß Fusionen anderer Antigenspezifität produzieren, verdünnt und in Wachεtumεmedium kultiviert. Anεchließend werden die spezifischen E. coli JK321 mit Hilfe von immobilisiertem Antigen aus der Zellsuεpension "gefischt" , in friεches Nährmedium überführt und erneut angezogen. Diese Prozedur wird mehrmals wiederholt und jedesmal ein Aliquot auf Nährplatten mit und ohne Rifampicin ausplattiert. Dabei sollte eine kontinuierliche Zunahme Rif-resiεtenter gegenüber Rif- sensitiver Bakterienklone beobachtet werden.
Fig. 7: Selektive Anreicherung VL-/VH-Igaß koexprimierender E. coli JK321 durch antigenmarkierte Mitrocellulose. Nach Auftrennung von a-Protein (etwa 10 ng/Spur) durch SDS-PAGE wurde das Antigen anschließend auf Nitrocellulose geblottet. Ein Nitrozelluloεeεtreifen wurde mit anti-Fp80 alε Immunoblot entwickelt, um die exakte Poεition der a-Protein Bande εichtbar zu machen. Zur Durchführung des Bindungsexperimentε wurden die E. coli Stämme UT5600 (pTK59 ; RifS) , JK321 (pTK59 ; RifR) und JK321 (pJK165/pJK257; RifR) über Nacht alε Flüεεigkulturen angezogen. Bei einer O.D.600 von 0,8 wurden die beiden rekombinanten, Rif-reεiεtenten JK321 Stämme in einem Verhältniε von etwa 1:2000 gegen den Rif-εenεitiven Stamm UT5600 (pTK59) verdünnt. Nach Inkubation der Bakterienεuεpenεion in PBS/BSA (1%) für 30 Minuten wurde davon 1 ml in 15 ml PBS gegeben und zusammen mit einem Nitrocelluloseεtreifen in eine leere Petrischale gegeben. Nach Inkubation unter leichtem Schütteln für 30 Minuten bei RT wurde dreimal mit PBS (20 ml) gewaschen und anschließend die Nitrocellulose auf Rif-haltigen Nährplatten inkubiert.
Fig. 8: DNA-Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide.
Name Verwendungszweck Länge (bp) und Sequenzabfolge <5' nach 3')
JK008 PCR (-) 35 GCAGCAGAATTCCGTTTCAGCTCCAGCTTG
GTCCC JK009 PCR (-) 44 GCAGCAGAATTCGCAGAGACAGTGACAGT
(G/A)GTGCCTTGGCCCCA JK014 PCR (+) 44 GGTTATGCATATGCACATGGAACACCTGAT
(A/G)TTGTGAT(G/A)ACCCA JK017 PCR (+) 50 GGTTATGCATATGCACATGGAACACCTCAG
GTCCAACTTCTCGAGTCAGG JK020 PCR (+) 44 GCAGCAATCGATGAGTAATACTTGCGCGCC
AAGGGTGCTCGGCA JK021 PCR (-) 42 TGCTGCCTCGAGAAGTTGGACCTGCGGAGC
GGCCTGCGCTAC JK032 PCR (-) 50 GCAGCAAGCTTCGGACGGCATTTTTGATCA
CCCGACGCACTTTGCGCCGA JK033 PCR (+) 30 GCAGCAAGCTTCAGGGCTAGCACCAGGCGT
a
(+) und (-) beziehen sich auf den kodierenden bzw. den dazu komplementären
DNA-Strang. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Beispiel 1
Herstellung des E. coli Stamms JK321 durch Übertragung einer Stabilitätsdeterminante mit Hilfe von Pl-Phagen- Transduktion.
Zur Igaß-Domäne-vermittelten Präsentation variabler Antikörperfragmente jder anderer pharmakologiεch relevanter Proteine auf der Zelloberfläche von E. coli ist es erforderlich, die Gene mehrerer Enzyme, die im Periplasma und der äußeren Membran lokalisiert sind, zu inaktivieren. Hierbei εind insbesondere die periplasmatiεche Diεulfid-Oxidoreduktaεe (DεbA) (Bardwell et al., Cell 67 (1991) , 581-589) oder eine äußere Membran-Proteaεe (OmpT) (Earhart et al. , FEMS Microbiol. Let 6 (1979), 277-280) ; Grodberg und Dünn, J. Bacteriol. 171 (1989), 2903-2905) anzuführen. Neben der Inaktivierung dieser beiden Faktoren ist es jedoch speziell für die Igaß-vermittelte Oberflächenexposition der variablen schweren Antikörperdomäne (VH) notwendig, zusätzlich ein weiteres Gen im E. coli Genom auszuεchalten. Anderenfallε übt dieεeε VH-Igaß Fuεionεprotein eine cytotoxiεche Wirkung auf die E. coli K12 irtεzellen aus. Bei der Herstellung des E. coli Stammeε JK321 wurde ein Abschnitt deε Genomε eineε E. coli Stammes (JCB571) (Bardwell, a.a.O.), der eine Mutation in einem nicht näher bekannten Gen trägt, in einen anderen E. coli Stamm (UT5600) (Earhart, a.a.O.) überführt. Erεt die Einführung dieεer Mutation ins Genom von E. coli K12 ermöglicht in diesen genetiεch veränderten Wirtszellen die stabile Produktion von VH-Igaß Fuεionεproteinen.
Ein Verfahren, größere Fragmente der chromoεomalen DNA zwiεchen zwei E. coli Stämmen auεzutauεchen, bildet die Transduktion mittels Pl-Phagen, die gewöhnlich zur Kartierung von Genen auf dem Chromosom eingesetzt wird (Taylor und Trotter, Bacteriol. Reviews 31 (1967) , 332-344) . Wenn sich Pl-Phagen in Bakterienzellen vermehren, verpacken sie nicht nur virale DNA, sondern gelegentlich auch ein Stück des Wirtszell-Genoms in die Virushulle. Die Lange der eingepackten Bakterien-DNA betragt bis zu 2 Minuten des E. coli Genoms, was die Kotransduktion von zwei entfernten genetiεchen Markern ermöglicht. Gelangt diese Wirtszellen DNA in einer darauffolgenden Pl-Infektion in eine andere Bakterienzelle, kann dieses DNA-Fragment dort in das Chromosom rekombinieren.
Zur Durchfuhrung der Pl-Transduktion wurde E. coli JCB571 (dεbA::Kan, zihl2::TnlO) alε Donor- und E. coli UT5600 (ompT-) alε Rezipientenstamm ausgewählt. Im Anεchluß an die Herstellung eines JCB571-spezifiεchen Pl-Phagenlyεatε und der Infektion von UT5600 Zellen, wurden poεitive Tranεduktanden, welche den mutierten unbekannten Genlokuε in Verbindung mit dem mutierten dεbA Gen kotranεduziert und in ihr Chromoεom integriert hatten, durch Wachεtum auf Nährmedium mit Kanamycin und Tetracyklin selektiert. Aufgrund der nahen Lokalisierung des dsbA (Kan) Gens und einer Tranεpoεon Inεertion zihl2::TnlO, (Tet) zu der, für die VH-Igaß Stabiliεierung verantwortlichen Mutation im E. coli Chromoεom, waren diese zwei Antibiotika Resistenzen (Kan und Tet) als Marker für die Kotransduktion verwendet worden. Der auf dieεem Wege hergeεtellte Klon (E. coli JK321) zeigte die, zuvor nur in E. coli JCB570 (wt) und JCB571 (dsbA) beobachtete Toleranz gegenüber der VH-Igaß Fuεion. Nach Transformation mit den Plasmiden pJK78 (VL-Igaß) und pJK165 (VH-Igaß) konnte die εtabile Expression dieser Igaß Fusionsproteine in E. coli JK321 gezeigt werden (Abb. 4) . Ebenfalls ermöglicht der Stamm JK321 die simultane Koexpression der Plaεmide pJK78 (VL-Igaß) und pJK165 (VH-Igaß) innerhalb einer Bakterienzelle.
Beispiel 2
Konstruktion einer VH-igaß Genfusion und Expression in E. coli JK321.
Zur Präsentation rekombinanter Antikörper-Fragmente auf der Zelloberflache von E. coli JK321 ist es erforderlich, die VH- oder VL-Domanen mit verschiedenen Transportsignalen zu versehen. In den hergestellten Proteinfusionen tragen daher die Antikorperdomanen am N-Terminus ein Signalpeptid, das den Transport der Fusionsproteine durch die cytoplasmatische Membran gewahrleistet und am C-Terminus die Igaß-Domane, die anschließend den Transport der Antikorperdomanen durch die äußere Membran vermittelt.
Die Konstruktion der Fusion zwischen einem VH-Genfragment und igaß erfolgte in Plasmid pJK165 (Abb. 13) . Hierbei wurde die Region des ompA Gens von E. coli (Mowa et al., J. Biol. Chem. 255, (1980), 27-33), die für die Signalseguenz kodiert, mit dem 5'-Ende von igaß verbunden. Zur Amplifizierung der Region, die für die ompA Signalseguenz kodiert und der davor befindlichen nicht-kodierenden Region (Cole et al., Mol. Gen. Genet. 188, (1982), 472-479) in einer PCR, wurde die Struktur des 5'- terminalen Oligonukleotids JK20 (Abb. 8) so gewählt, daß nach Insertion des entsprechenden Genfragments in die Clal- Schnittstelle von pTK59 die "-10-Region" des Pτκ-Promoters zur Expression von igaß Genfusionen vollständig rekonstituiert wurde (Klauser et al., EMBO J. (1990), 1991-1997). Das 3'-terminale Oligonukleotid JK21 (Abb. 8) wurde mit einer Xhol-Schnittstelle versehen, welche die Fusion mit dem 5'-Ende des VH-Genfragments ermöglichte. Dazu wurde mit Hilfe der Oligonukleotide JK17 und JK09 (Abb. 8) ein VH-Genfragment durch PCR amplifiziert und über eine Xhol-Schnittstelle am 5'-Ende mit dem ompA-spezifischen DNA-Fragment und über eine EcoRI-Schnittstelle am 3 '-Ende mit igaß fusioniert. Das hieraus gebildete Plasmid wurde mit pJK165 bezeichnet (Abb. 1) .
Nach Transformation von E. coli JK321 mit Plasmid pJK165 wird eine hohe Stabilität der rekombinanten Bakterien beobachtet. Dieser Effekt tritt in rekombinanten E. coli K12 Wildtyp-Zellen nicht auf. In E. coli K12 Wildtyp-Zellen, welche das Plasmid pJK165 tragen, wird aufgrund einer cytotoxischen Wirkung des VH-Igaß Fusionsproteins eine Destabilisierung der rekombinanten Bakterien und die Bildung von Mutanten beobachtet, die das VH-Igaß Fusionsprotein nicht mehr synthetisieren. Der molekulare Hintergrund dieser Mutationen stellt der Zerfall des Plasmids pJK165 in ein kleineres Derivat dar, von dem aus die VH-igaß Fusion nicht mehr exprimiert wird.
ERSATZBLÄΓT (REGEL 26) Beispiel 3
Konstruktion einer VL-igaß Genfusion und Expression in E. coli JK321.
Zur simultanen Oberflächenprasentation von VH- und VL-Igaß Fusionsproteinen innerhalb einer Bakterienzelle war es erforderlich, neben der, unter Punkt 2.) beschriebenen VH-Igaß Fusion, auch eine Fusion zwischen der VL-Domäne eines Antikörpers und Igaß herzustellen. Die Konstruktion einer VL- igaß Fusion erfolgte in zwei Stufen (Plasmide pJK78 und pJK257) : Im ersten Schritt wurde die VL-Domane am N-Terminus mit einem Signalpeptid und am C-Terminus mit der Igaß-Domane verbunden (Plasmid pJK78) . Das Signalpeptid gewährleistet den Transport des Fusionsproteins durch die cytoplasmatische Membran und die Igaß-Domäne vermittelt anschließend den Transport der VL- Antikörperdomäne durch die äußere Membran. Im zweiten Schritt erfolgte der Austausch des ColEl-Replikationorigins und des Gens der ß-Lactamase (bla) im Plasmid pJK78 gegen den pA15- Replikationsorigin und das Gen der Chloramphenicol-Acetyl- Transferase (cat) des Klonierungsvektors pACYC184 (Rose, Nucl. Acid Res. 16 (1978), 355) im Plasmid pJK257. Die detailierte Konstruktion beider Plasmide ist in den Legenden zu Abb. 2a/b sowie Abb. 3 beschrieben. Der Einsatz verschiedener Replikationsorigins und Resistenzgene in den Plasmiden pJK165 und pJK257 ermöglicht die Kopropagierung beider Plasmide innerhalb einer Bakterienzelle. '
Beispiel 4
Der entwickelte E. coli stamm JK321 ermöglicht die Igaß- vermittelte Exposition variabler Antikörperdomänen auf der Zelloberfläche und die Bindung des spezifischen Antigens.
Der Einsatz des entwickelten E. coli Stammes JK321 ermöglicht die Präsentation von Antikörperfragmenten auf der
ERSATZBLÄTT(REGEL26) Zelloberflache (Abb. 4 und 5) . Hierbei ist sowohl die Produktion einzelner VH- oder VL-Igaß Fusionsproteine (z.B. pJK165 oder pJK257) , als auch die simultane Produktion der VL- und VH-igaß Fusionen von zwei Plasmiden (z.B. pJK165 und pJK257) innerhalb einer Bakterienzelle möglich. Im letzteren Fall werden beide Fusionsproteine voneinander getrennt in die äußere Membran transportiert, wo sich die einzelnen VL- und VH-Domänen der Fusionsproteine zu einem Fv-Fragment zusammenlagern. Dabei erfolgt die Exposition der VL- und VH- Igaß Fusionen als ein Fv-Igaß Heterodimer auf der Zelloberfläche von E. coli JK321. Rekombinante E. coli JK321, die heterodimere VH-/VL-Igaß Fusionsproteine auf die Zelloberfläche exportieren, binden über ihre Immunglobulinanteile das spezifische Antigen (Abb. 5) . Ferner lassen sich rekombinante E. coli JK321 Zellen, welche die VH- und VL-Igaß Fusionsproteine innerhalb einer Bakterienzelle von zwei Plasmiden koexprimieren, durch Einsatz des spezifischen Antigens aus einer Verdünnung gegen E. coli JK321 Zellen, die andere, unspezifische Igaß-Fusionsproteine (z.B. CtxB-Igaß, Plasmid pTK59) exportieren, anreichern (Abb. 7) .
Beispiel 5 Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis der angereicherten, antikörperpräsentierenden E. coli JK321 Zellen.
Im Anschluß von Experimenten zur Selektion von rekombinanten Bakterien, die Antikörperfragmente mit einer definierten Antigenspezifität auf der Zelloberfläche präsentieren, ist es erforderlich, die Identität der, mit Hilfe des spezifischen Antigens, angereicherten Klone festzustellen. Eine Möglichkeit, exklusiv E. coli Zellen nachzuweisen, die Antikörperfragmente mit einer definierten Spezifitat auf der Oberfläche präsentieren, besteht darin, die verwendeten Wirtszellen mit einem bestimmten genetischen Marker (z.B. einer Antibiotika-Resistenz) zu versehen. Entsprechend verfügen die E. coli JK321 Zellen über ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Rifa picin. Dazu war in E. coli JK321 Zellen ein DNA-Fragment transformiert worden, das ein solches Resistenzgen trägt. Das DNA-Fragment rekombinierte in das Genom von E. coli JK321 und führte zur Ausprägung der Rifa picin-Resistenz. Diese zusätzliche Eigenschaft der E. coli JK321 Wirtszellen erlaubt nur das selektive Wachstum der rekombinanten E. coli Klone auf Rifa picin-haltigem Medium, die simultan VL- und VH-Igaß Fusionen mit einer, vor dem Experiment ausgewählten, definierten Spezifitat präsentieren. Die verwendeten rekombinanten Kontrollzellen (z.B. E. coli UT5600) , die simultan VL- und VH-Igaß Fusionen mit einer anderen Antigenspezifität auf der Zelloberfläche präsentieren, sind sensitiv gegenüber Rifampicin. Der Einsatz von Wirtszellen, die gegenüber Rifampicin resistent (JK321) oder sensitiv (UT5600) sind, ermöglicht die eindeutige Identifizierung der spezifischen, antikörperpräsentierenden Zellen (Abb.6).

Claims

Patentansprüche
1. Bakterium zur Herstellung von mindestens einem sta¬ bilen Fusionsprotein aus einem Trägerprotein und einem Passagierprotein, wobei das Bakterium das ge¬ netische Merkmal fpt aufweist.
2. Bakterium nach Anspruch 1, wobei daε Fusionsprotein stabil auf der Oberfläche präsentiert wird, das Bakterium gram-negativ ist und außerdem die genetischen Marker ompT" und dsbA" aufweist.
3. Bakterium nach Anspruch 1 oder 2 , wobei das im Fusionsprotein enthaltene Trägerprotein das Igaß- Protein enthält oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionsproteins ermöglicht.
4. Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei das Passagierprotein ein Protein mit einer Affinität für einen Bindungspartner, ein Antikörper oder eine Antigen-bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Rezeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein ist.
5. E. coli JK 321 (DSM 8860).
6. Genetischer Marker fpt zur Erzeugung einer Toleranz von Bakterien gegenüber Fusionsproteinen, der sich zwischen Position 85 und 89 Minuten der Genkarte des E. coli-Genoms befindet.
7. Verwendung des genetischen Markers nach Anspruch 6 zur Herstellung von Bakterien, die tolerant gegenüber Fusionsproteinen sind.
8. Verfahren zur Identifizierung von Bakterien, die Proteine mit einer Affinität für einen Bindungs¬ partner stabil auf ihrer Oberfläche präsentieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Konstruktion mindestens eines Vektors mit min¬ destens einer DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein aus einem Trägerprotein und einem Passa¬ gierprotein codiert, das stabil an der Oberfläche eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 2 bis 5 präsentiert werden kann;
(b) Einbringen des Vektors in Bakterien nach einem der Ansprüche 2 bis 5;
(c) Anzucht des Bakteriums aus Schritt (b) , so daß die Bakterien der erhaltenen Kultur auf ihrer Oberfläche das Fusionsprotein oder die Fusions- proteine stabil präsentieren;
(d) Isolierung von Bakterien, die das gewünschte Fusionsprotein oder die Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche präsentieren.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei zur Konstruktion des Vektors in Schritt (a) eine Bank von DNA-Sequenzen verwendet wird, in der die jeweiligen DNA-Sequenzen Varianten des Passagierproteins oder der Passagierproteine codieren.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei zur Kon¬ struktion des Vektors in Schritt (a) eine Bank von DNA-Sequenzen verwendet wird, in der die jeweiligen DNA-Sequenzen Varianten des Trägerproteins oder der Trägerproteine codieren.
11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Anzucht des Bakteriums in Schritt (c) unter Bedingungen erfolgt, bei denen die das Fusionsprotein bzw. die die Fusiosproteine codierende DNA-Sequenz mutiert wird, so daß die Bakterien der erhaltenen Kultur Varianten des Fusionsproteins oder der Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche präsentieren.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das im Fusionsprotein enthaltene Trägerprotein das Igaß-Protein enthält oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionsproteins ermöglicht.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das Protein mit einer Affinität für einen Bindungs- partner ein Antikörper oder eine Antigen-bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Re¬ zeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Bakterien, die das gewünschte Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche präsentieren, isoliert werden durch Interaktion mit dem an eine Matrix gebundenen Bindungspartner des Passagierproteins, durch Interaktion mit einem fluoreszenz-markierten Bindungspartner oder durch Interaktion mit dem an Magnetpartikel gebundenen Bindungspartner des Passagierproteins.
15. Gram-negatives Bakterium, das auf seiner Oberfläche stabil mindestens ein Fusionsprotein präsentiert und die genetischen Merkmale fpt, ompT- und dsbA" aufweist.
16. Bakterium nach Anspruch 15, wobei das im Fusionsprotein enthaltene Trägerprotein das Igaß- Protein enthält oder ein Fragment davon, das die Sezernierung des Fusionsproteins ermöglicht.
17. Bakterium nach Anspruch 15 bis 16, wobei das Passagierprotein ein Protein mit einer Affinität für einen Bindungspartner, ein Antikörper oder eine Antigen-bindende Domäne eines Antikörpers, ein Antigen, ein Protein mit enzymatischer Aktivität, ein Inhibitor, ein Rezeptor, ein Ligand oder ein Nucleinsäure-bindendes Protein ist.
18. Verwendung von Bakterien nach einem der Ansprüche 15 bis 17 für diagnostische Zwecke, zur Herstellung von Proteinen mit einer Affinität für einen Bin¬ dungspartner, zur Waschmittelherstellung, zur Er¬ schließung von Rohstoffen, zur Lebensmittelverar¬ beitung oder zum Abbau oder der Anreicherung von Schadstoffen.
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