DE69634409T2

DE69634409T2 - Kombinierte ligand und rezeptor entfaltung

Info

Publication number: DE69634409T2
Application number: DE69634409T
Authority: DE
Inventors: Carl Borrebaeck; Anki Malmborg; Eskil SÖDERLIND
Original assignee: Bioinvent International AB
Current assignee: Bioinvent International AB
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2016-09-14
Also published as: AU698653B2; US20030224410A1; WO1997010330A1; US6607881B1; JPH11512288A; AU6939196A; DE69634409D1; CA2230483A1; EP0850299B1; EP0850299A1; ATE290075T1; SE9503151D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Selektion spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, sowie Kits zur Durchführung der Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Es besteht ein anhaltender Bedarf an hochwirksamen Selektionssystemen für das Screening von Proteinbibliotheken, z.B. Antikörperbibliotheken. Die derzeitigen Systeme basieren auf der Präsentierung von Antikörpern auf der Oberfläche von Mikroorganismen, die das Gen des Antikörpers enthalten. Spezifische Klone können dann mit immobilisierten Antigenen selektiert werden, beispielsweise durch ein Panning auf Mikrotiterplatten (Parmley und Smith, 1988, Gene 73, 305–318 und Barbas III et al., 1991, PNAS 88, 7978–7982), eine Selektion mit magnetischen Beads (Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226, 889–896), mittels Immunotubes (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581–597), Affinitätschromatographie (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552–554), eines Fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS), einer antigenspezifische Ausfällung (Kang et al., 1991, PNAS 88, 4363–4366) und SAP (Dueňas und Borrebaeck, 1994, Bio/Technology 12, 999–1002).
Verschiedene Antikörperbibliotheken sind auf der Oberfläche von Phagen konstruiert worden, z.B. eines Bakteriophagen wie fd (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552–554) oder M13 (Barbas III et al., 1991, PNAS 81, 7978–7982). Die Möglichkeit, Antikörper (scFv) auf der Oberfläche von Bakterien zu exprimieren, ist auch über Fusionen mit bakteriellen Membranproteinen, wie Lpp-Omp A (Francisco et al., 1993, PNAS 90, 10444–10448) und PAL (Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9, 1369–1372) demonstriert worden. Hinsichtlich einer jüngeren Übersichtsarbeit über Antikörper-präsentierende Systeme und das Screening von Antikörperbibliotheken siehe Little, 1994, Biotech. Adv. 12, 539–555.
Antigenbibliotheken sind nach im Wesentlichen den gleichen Prinzipien wie Antikörperbibliotheken konstruiert worden, z.B. Peptidbibliotheken auf der Oberfläche von Bakteriophagen (Smith, 1985, Science 228, 1315–1317). Die Expression von Antigenen auf der Oberfläche von Bakterien wurde demonstriert durch Fusionen mit LamB (Charbit et al., 1988, Gene 70, 181–189 und Bradbury et al., 1993, Bio/Technology, 1565–1568), Omp A (Pistor und Hoborn, 1989, Klin. Wochenschr. 66, 110–116), Fimbrien (Hedegaard und Klemm, 1989, Gene 85, 115–124 und Hofnung, 1991, Methods Cell Biol. 34, 77–105), der IgA-Protease-β-Domäne (Klauser et al., 1990, EMBO J. 9, 1991–1999) und Flagellen (Newton et al., 1989, Science 244, 70–72).
Viele der Selektionsschritte nach dem Stande der Technik, wie das Panning und die Affinitätschromatographie, sind jedoch nicht sehr wirksam, und sogar wenn die Ausbeute an Antikörper oder Antigen annehmbar ist, stellen diese Techniken keine Information über die Nucleinsäuresequenz, die für sie codiert, bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
In der Vergangenheit war es nicht möglich, eine Ligandenbibliothek mit einer Rezeptorbibliothek zu kombinieren, um nicht nur einen Partner des spezifischen Bindungpaars sowie ihre entsprechenden Nucleinsäuresequenzen, die für sie codieren, zu klonieren und zu selektieren, sondern tatsächlich beide.
Die vorliegende Erfindung stellt eine wirksame Screeningtechnik zur Gewinnung einander entsprechender Liganden/Rezeptormoleküle bereit und etabliert eine physische und logische Verbindung zwischen den beiden und ihren codierenden Sequenzen. Das hat den Vorteil, dass sie einfach und schnell ist, und es bietet Anwendungsmöglichkeiten wie das Auffinden neuer Liganden und/oder Rezeptoren, wobei beide unbekannt sind, sowie Verbesserungen bezüglich der Epitopkartierung, der Lokalisierung von Genprodukten und des Arzneimitteldesigns.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Selektion von Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, die imstande sind, spezifisch aneinander zu binden, bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Exprimieren in einem Wirtsmikroorganismus einer Nucleinsäure, die für ein Oberflächenmolekül codiert, das funktionell mit der Expression einer Nucleinsäure verknüpft ist, die für ein Liganden- oder Rezeptormolekül oder ein funktionelles Fragment von diesen codiert, so dass der Mikroorganismus das Oberflächenmolekül und das Liganden- oder Rezeptormolekül als eine Fusion exprimiert und es auf seiner Oberfläche präsentiert, wobei der Wirtsmikroorganismus so modifiziert ist, dass er das Oberflächenmolekül nicht in anderer Form als in Form einer Fusion mit dem Liganden- oder Rezeptormolekül exprimiert;
(b) In-Kontakt-bringen des modifizierten Wirtsmikroorganismus des Schrittes (a) mit einer oder mehreren replizierbaren genetischen Einheit(en), die imstande ist bzw. sind, eine Nucleinsäure zu exprimieren, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen codiert, wobei die Liganden- oder Rezeptormoleküle Kandidaten für eine spezifische Bindung an die Moleküle sind, die vom Wirtsmikroorganismus des Schrittes (a) präsentiert werden und als Fusionen mit einem Oberflächenprotein der replizierbaren genetischen Einheit exprimiert werden, wobei die Bindung der auf der Oberfläche präsentierten Liganden- und Rezeptormoleküle den Transfer der Nucleinsäure, die für den Liganden oder den Rezeptor codiert, von der replizierbaren genetischen Einheit zum Mikroorganismus vermittelt; und
(c) Selektieren des Wirtsmikroorganismus, der die Nucleinsäuresequenzen enthält, die für die Liganden- und Rezeptormoleküle oder die funktionellen Fragmente von diesen codieren.

Somit stellt die Erfindung, in diesem Aspekt, ein Verfahren für das Selektieren von Nucleinsäuresequenzen bereit, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, wobei die Selektion aus einer solchen Modifikation des Wirtsmikroorganismus resultiert, dass die Infektion oder der Transfer der Nucleinsäure aus der replizierbaren genetischen Einheit stattfindet, wenn es zu einer Bindung zwischen dem Rezeptor- und dem Ligandenmolekül kommt. Somit wird eine Infektion über den normalen Weg, z.B. für E. coli über Wildtyp-Pili, durch eine Modifikation des Wirtsmikroorganismus verhindert, um die Präsentation eines gegebenen Typs eines Oberflächenmoleküls zu verhindern, so dass die einzigen Oberflächenmoleküle des Typs, die präsentiert werden, diejenigen sind, die mit dem Rezeptor oder Liganden fusioniert sind.
Bei einem bevorzugten Aspekt exprimiert und präsentiert der Wirtsmikroorganismus modifizierte Ligandenmoleküle, wobei die replizierbaren genetischen Einheiten die Kandidaten für Rezeptormoleküle exprimieren. Dieses stellt somit ein Verfahren für das Selektieren spezifischer, für Liganden und Rezeptoren codierender Sequenzen, bereit, wobei:

(a) die Expression einer für ein Oberflächenmolekül codierenden Sequenz mit einer für einen Liganden codierenden Sequenz oder einer Sequenz, die für ein funktionelles Fragment von diesem codiert, kombiniert wird, so dass der Wirtsmikroorganismus auf seiner Oberfläche modifizierte Ligandenmoleküle exprimiert;
(b) Infizieren des, oder das Transferieren von DNA auf anderem Wege in den, modifizierten Wirtsorganismus aus Schritt (a) mit einer genetisch modifizierten replizierbaren genetischen Einheit, die imstande ist, einen Rezeptor oder eine funktionelle Fragment von diesem, der bzw. die mit einem Oberflächenprotein der replizierbaren genetischen Einheit fusioniert ist; zu exprimieren, und
(c) Selektieren infizierter Wirtsorganismen, die spezifische, für Ligand und Rezeptor codierende Sequenzen oder Sequenzen, die für funktionelle Fragmente von diesen codieren, enthalten.

Bei den obigen Aspekten schließt das erfindungsgemäße Verfahren gegebenenfalls den zusätzlichen Schritt ein des

(d) Isolierens der Nucleinsäuresequenzen, die für die Liganden- oder Rezeptormoleküle codieren.

Bequemerweise kann die Isolierung über das Assoziieren unterschiedlicher Selektionsmarker (z.B. unterschiedlicher Marker für eine Resistenz gegen ein Antibiotikum) mit den Nucleinsäuresequenzen, die für die Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, erreicht werden. Somit können die Wirtsmikroorganismen, die Nucleinsäuresequenzen enthalten, die für ein spezifisches Bindungpaar codieren, selektiert werden, indem man sie in Gegenwart beider Antibiotika wachsen lässt. Danach können die Vektoren, die Nucleinsäure enthalten, die für den Liganden und den Rezeptor codiert, voneinander getrennt werden, indem man eines der beiden Antibiotika aus dem Wachstumsmedium weglässt.
In unterschiedlichen Ausführungsformen kann dieses Verfahren eingesetzt werden für das Screenen von:

(a) Mikroorganismen, die einen Typ eines Liganden- oder Rezeptormoleküls präsentieren, gegen Bibliotheken replizierbarer genetischer Einheiten, die unterschiedliche Rezeptor- oder Ligandenmoleküle präsentieren;
(b) Bibliotheken von Mikroorganismen, die unterschiedliche Liganden- oder Rezeptormoleküle präsentieren, gegen replizierbare genetische Einheiten, die einen Typ eines Rezeptor- oder Ligandenmoleküls präsentieren; oder
(c) Bibliotheken von Mikroorganismen, die unterschiedliche Liganden- oder Rezeptormoleküle präsentieren, gegen Bibliotheken von replizierbaren genetischen Einheiten, die unterschiedliche Liganden- oder Rezeptormoleküle präsentieren.

Bei den obigen Aspekten exprimieren die Wirtsmikroorganismen nicht die normalen (Wildtyp-)Oberflächenmoleküle, die dazu eingesetzt werden, Liganden- oder Rezeptormoleküle als Fusionen auf ihrer Oberfläche zu präsentieren. Das bedeutet, dass die replizierbaren genetischen Einheiten, die dazu eingesetzt werden, Kandidaten für Bindungspartner des Liganden- oder Rezeptormoleküls zu präsentieren, die Mikroorganismen nur dann infizieren, wenn eine Bindung zwischen dem Liganden oder Rezeptor und einem Bindungspartner erfolgt, d.h. eine Infektion über das normale Oberflächenmolekül des Mikroorganismus ist nicht möglich, da es nicht präsentiert wird.
Somit ist bei einer Ausführungsform der Wirtsmikroorganismus ein E.-coli-Stamm, bei dam das F-Episom im traA-Gen, das die Pilin-Moleküle aufbaut, mutiert ist, der aber die anderen Gene enthält, die für eine Infektion durch Bakteriophagen benötigt werden, z.B. traL, traE, traY etc.
Dementsprechend sind diese E.-coli-Stämme F^–, d.h., sie bilden keine funktionellen Pili, außer wenn sie mit Vektoren transformiert werden, die eine Nucleinsäure aufweisen, die für Fusionen des Pilin mit dem Liganden- oder Rezeptormolekül codiert. Das ermöglicht es, Wildtyp-Bakteriophagen (z.B. M13, fd etc.), die die Kandidaten für Bindungspartner präsentieren, die an einem Phagen-Oberflächenprotein (z.B. dem pIII- oder pVIII-Protein) befestigt sind, einzusetzen, da der Bakteriophage selektiv nur diejenigen E.-coli-Zellen infizieren wird, die über die spezifische Wechselwirkung der Bindungspartner an den Phagen binden. Da die E. coli keine Wildtyp-Pili besitzen, hindert das den Bakteriophagen daran, das E. coli nicht-selektiv zu infizieren. Somit verlässt sich die vorliegende Erfindung nicht darauf, gentechnologisch die replizierbaren genetischen Einheiten zur Beschränkung ihrer Infektiosität zu modifizieren und so eine Selektivität des DNA-Transfer zu erhalten, was dabei hilft, die Schwierigkeiten zu vermeiden, denen man sich beim Erzeugen großer Bibliotheken deletierter Bakteriophagen, wie pIII-deletierter M13-Phagen, gegenübersehen kann.
Bei Ausführungsformen der Erfindung, die die Pili des Mikroorganismus für das Präsentieren der Liganden- oder Rezeptormoleküle einsetzen, wird eine überraschend gute Selektivität erhalten, wenn die Liganden- oder Rezeptor-Nucleinsäure als eine Fusion am Carboxyterminus der Pili exprimiert wird.
Vorzugsweise haben die Vektoren, die die Nucleinsäure aufweisen, die für die Liganden- und Rezeptormoleküle codiert, unterschiedliche Replikationsorigins (pMB1, p15A, PSC101), so dass beide Vektoren stabil beibehalten werden können, wenn sie in den Wirtsmikroorganismus transferiert worden sind.
Bei dem Verfahren können die Schritte (a) und (b) gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Allerdings wird der Wirtsmikroorganismus bequemerweise so kultiviert, dass er die Liganden- oder Rezeptormoleküle vor der Infektion mit den replizierbaren genetischen Einheiten präsentiert.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Nucleinsäuresequenzen bereit, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, die imstande sind, spezifisch aneinander zu binden. Das entwickelte System ermöglicht die Passage von DNA durch Zellmembranen und wird als „Cellular Linkage of ligand-receptor Affinity Pairs" (CLAP) bezeichnet. Die DNA, die von der replizierbaren genetischen Einheit durch die Zellmembran transloziert wird, wird als „membrane passage DNA" (mp-DNA) bezeichnet, und diese genetische Information außerhalb der Zelle kann mittels gentechnologischer Verfahren definiert, konstruiert und entwickelt werden. Der Typ der spezifischen DNA, der durch die Zellmembran transloziert wird, wird über die genetische Information, die DNA, im Inneren der Zelle festgelegt. Diese genetische Information im Inneren der Zelle kann mittels gentechnologischer Verfahren definiert, konstruiert und entwickelt werden und wird als „translocation determining DNA" (td-DNA) bezeichnet. Somit wird, bei einer bevorzugten Ausführungsform, diese Selektivität des DNA-Transfers durch die Verwendung eines Stammes von E. coli erreicht, der eine Mutation im F-Episom trägt, so dass er keine funktionellen Pili präsentiert. Das bedeutet, dass sie, wenn sie mit einem Vektor transformiert werden, der Nucleinsäure aufweist, die für einen Liganden oder Rezeptor für eine Expression als Fusion mit den Pili codiert, nur diese modifizierten Pili auf der E.-coli-Oberfläche präsentiert werden.
Basierend auf der Fähigkeit der spezifischen td-DNA, den spezifischen Typ der mp-DNA zu bestimmen, der in Zellen transloziert werden soll, kann das CLAP-System dazu eingesetzt werden, eine genetische Bibliothek aus td-DNA zur Bestimmen der Translokation von spezifischer mp-DNA aus einer genetischen Bibliothek von mp-DNA zu konstruieren. Somit ist es, in einer einzigen Reaktion, möglich, eine replizierbare genetische Einheit oder replizierbare genetische Einheiten, die für (eine) genetische Bibliotheken) aus td-DNA codieren, und (eine) genetische Bibliotheken) aus mp-DNA zu mischen, und diese Bibliotheken codieren für Proteine/Peptide, die aus der (den) genetischen Bibliotheken) exprimiert werden. Die jeweilige td-DNA in einzelnen Zellen bestimmt die Translokation der jeweiligen mp-DNA in jede einzelne Zelle.
Somit werden die entsprechenden Paare aus td-DNA und mp-DNA in der gleichen Zelle verknüpft. Individuelle td-DNAs und mp-DNAs können über den Einsatz von Selektionsmarkern getrennt und isoliert werden, und deshalb kann sowohl die td-DNA als auch die mp-DNA aus der gleichen Zelle abgetrennt, analysiert, definiert, umgestaltet und rekonstruiert werden. Die Möglichkeit, zwei Genbibliotheken in einem Reaktionsschritt gegeneinander zu screenen, ermöglicht die Selektion von Liganden-Rezeptor-Paaren ohne Informationen über die jeweiligen Klone, die das Liganden-Rezeptor-Paar produzieren. Die td-DNA kann aus Genen bestehen, die für Proteine oder Peptide mit unterschiedlichen Größen codieren. Individuelle Zellen codieren für spezifische Proteine/Peptide, die durch die td-DNA in der Zelle definiert werden, und dieses Protein oder Peptid wird auf der Zelloberfläche exponiert. Diese exponierten Proteine/Peptide können als mp-DNA konstruiert und auf der Oberfläche einer replizierbaren genetischen Einheit präsentiert werden. Diese Proteine/Peptide können als Rezeptoren angesehen werden, und sie können dann mit exponierten Ligandenmolekülen, die durch die td-DNA codiert werden, auf der Zelloberfläche in Wechselwirkung treten. Wenn es zu solchen Wechselwirkungen kommt, vermittelt die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung den Durchtritt von Rezeptor-DNA (mp-DNA) in die Zelle.
Bei einer Ausführungsform sind die Moleküle auf der Zelloberfläche Rezeptoren, und die Moleküle auf der replizierbaren genetischen Einheit sind Liganden. Eine td-DNA kann aus einer cDNA-Bibliothek bestehen, und die mp-DNA kann aus einer Genbibliothek von Antikörperfragmenten bestehen, wobei die Spezifitäten der Antikörperfragmente gegen verschiedene Protein/Peptid-Liganden selektiert werden können. Die td-DNA kann auch aus einer DNA bestehen, die für einen Peptidtyp codiert, der Biotin und biotinylierte chemische Verbindungen binden kann. Die Biotin-Peptid-Wechselwirkung ermöglicht die Immobilisierung biotinylierter chemischer Verbindungen auf der Zelloberfläche, und diese immobilisierten Verbindungen können als Liganden/Rezeptoren zur Bestimmung der Translokation von mp-DNA, die für Rezeptoren/Liganden codiert, dienen. Antikörperfragmente mit Affinität für die immobilisierte chemische Verbindung können aus einer genetischen Bibliothek selektiert werden, die für unterschiedliche Antikörperspezifitäten/-affinitäten codiert. Die mp-DNA, die für die Spezifität/Affinität des selektierten Antikörperfragments codiert, wird dann im Inneren der Zelle, die das biotinbindende Peptid präsentierte, das die biotinylierte chemische Verbindung band, repliziert. Es können andere Typen von Modifikationen der chemischen Verbindungen, die das biotinbindende Peptid binden, eingesetzt werden, und es können andere Typen von Peptiden, die die modifizierte chemische Verbindung binden, auf der Zelloberfläche präsentiert werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit bereit, der Vektoren für den Einsatz in den hier beschrieben Verfahren enthält.
In diesem Aspekt umfasst ein bevorzugter Kit:

(a) einen Wirtsmikroorganismus, der so modifiziert ist, das er nicht ein Oberflächenprotein vom Wildtyp präsentiert,
(b) einen Vektor, der für das genannte Oberflächenprotein codiert und Restriktionsstellen für die Insertion von Nucleinsäuren aufweist, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen codieren, so dass, wenn er in den Wirtsmikroorganismus transformiert wird, das Oberflächenmolekül und das Liganden- oder Rezeptormolekül als eine Fusion exprimiert und auf der Oberfläche des Mikroorganismus präsentiert werden,
(c) einen Bakteriophagen, der eine Stelle für die Insertion einer Nucleinsäure aufweist, die für Kandidaten für die Bindung an den Liganden oder Rezeptor codiert, so dass die Bindungspartner auf der Oberfläche des Bakteriophagen als eine Fusion mit einem Oberflächenprotein des Bakteriophagen exprimiert präsentiert werden.

Das obige Verfahren kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, unter anderem:

(1) cDNA-Bibliotheken, die z.B. von Genomsequenzen, humanem oder anderem Gewebe abstammen, können in den Fusionsvektor kloniert und anschließend in den Wirtsmikroorganismus transfiziert werden. Somit können wir diese Zellen, über den Weg einer Expression von Molekülen, die sich von cDNA ableiten, als Fusionsproteine mit Pilin als Exprimierer von Liganden verwenden. Anschließend werden Bakteriophagen, die Antikörperfragmente präsentieren, die von immunisierten oder naiven B-Zellen humanen oder sonstigen Ursprungs abstammen, gebildet, und man lässt sie mit dem Wirtsmikroorganismus, der die von der cDNA abgeleiteten Moleküle exprimiert, in Wechselwirkung treten. Das Infektionsereignis findet nur bei spezifischen Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und Bakteriophagen statt und wird durch diese vermittelt. Die genetische Information für jedes Paar aus Ligand und Rezeptor kann dann isoliert werden.
(2) cDNA-Bibliotheken, die von Krebspatienten stammen und differentiell mittels PCR gegen normales Gewebe selektiert werden, können wie oben beschrieben auf Bakterien präsentiert werden. Auf die gleiche Weise lässt man auf Bakteriophagen präsentierte Antikörper-Bibliotheken, die von normalen Patienten oder Krebspatienten stammen, mit den cDNA-präsentierenden Mikroorganismen in Wechselwirkung treten, und die Infektion wird wiederum über spezifische Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermittelt.
(3) cDNA, die von Gensequenzen, die für Allergene codieren, abstammen, können wie oben auf Bakterien präsentiert werden. Auf die gleiche Weise lässt man auf Bakteriophagen präsentierte Antikörper-Bibliotheken, die von normalen oder atopischen Patienten stammen, mit den cDNA-präsentierenden Mikroorganismen in Wechselwirkung treten, und die Infektion wird wiederum über spezifische Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermittelt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung der CLAP-Infektion.
2 zeigt die Infektiosität von VCS M13-Helferphagen von E. coli, die die Plasmide (a) JFLO, (b) pTRAP und JCFLtraA1 und (c) pTRAPCMV und JCFLtraA1 tragen.
3 zeigt die Infizierbarkeit von E. coli, das die Plasmide pTRAPCMV und JCFtraA1 trägt, durch eine spezifische Phagenpräparation (anti-CMV) und zwei unspezifische Phagenpräparationen (anti-lys und anti-ox).
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
So wie der Begriff „Bibliothek" hier verwendet wird, bedeutet er eine Anzahl von Fragmenten einer Liganden- oder Rezeptorpopulation, entweder ihre codierenden Sequenzen oder ihre entsprechenden Protein- oder Peptidsequenz, die auf einer Oberfläche präsentiert werden. Typischerweise umfassen Bibliotheken eine beträchtliche Anzahl derartiger Nucleinsäuresequenzen oder Peptide. Beispielsweise können Bibliotheken nach den Prinzipien konstruiert werden, die von Huse et al., 1989, Science 246, 1275, umrissen wurden.
Die Ausdrücke „Ligand" und „Rezeptor" beziehen sich auf Paare von Molekülen oder funktionellen Teilen von diesen, die fähig zur spezifischen Bindung aneinander sind. Beispiele für solche spezifischen Liganden-Rezeptor-Paare sind Antikörper-Antigen, Hormon-Hormonrezeptor, Wachstumsfaktor-Wachstumsfaktorrezeptor, Enzym-Substrat und Biotin-Avidin etc.
„Wirtsmikroorganismen" schließen Bakterien wie E. coli oder andere Gram-negative Bakterien, Gram-positive Bakterien sowie einzellige Mikroorganismen eukaryotischen Ursprungs, wie Hefe, ein.
„Replizierbare genetische Einheit" umfasst Viren und Bakteriophagen, wie M13, fl und fd, aber auch Bakterien sowie einzellige Mikroorganismen eukaryotischen Ursprungs, wie Hefe.
„Membrane passage-DNA (mp-DNA)" sind Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen codieren, wobei diese Nucleinsäure zunächst in einer replizierbaren genetischen Einheit enthalten ist und in den Wirtsmikroorganismus transferiert wird, wenn die Bindung zwischen dem präsentierten Liganden-Rezeptor-Paar erfolgt.
„Translocating determining DNA (td-DNA)" sind Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen codieren, wobei diese Nucleinsäure in einem Wirtsmikroorganismus enthalten und mit Sequenzen assoziiert ist, die den Transfer von mp-DNA aus einer replizierbaren genetischen Einheit vermitteln, wenn die präsentierten Liganden- und Rezeptormoleküle aneinander binden.
Das „Oberflächenmolekül" hängt von der Wahl des Wirtsmikroorganismus und der replizierbaren genetischen Einheit ab. Wenn der Wirtsorganismus E. coli ist, dann können geeignete Oberflächenmoleküle aus der Gruppe OmpA, Lipoprotein, Lpp, IgA-Protease, LamB, Fimbrien, Flagellen oder Pilin ausgewählt werden. Pilin wird bevorzugt. In Abhängigkeit von der Wahl der replizierbaren genetischen Einheit kann das Oberflächenmolekül jedes beliebige Oberflächenmolekül sein, das in die Infektion des Wirts oder die Transformation von DNA in den Wirt involviert ist. Bevorzugte replizierbare genetische Einheiten sind filamentöse Bakteriophagen, wie fd und M13, und geeignete Oberflächenmoleküle dieser Phagen können Protein III oder Protein VIII sein. Am stärksten bevorzugte wird das Protein III des filamentösen Bakteriophagen M13.
Die „Selektion" von Wirtorganismen, die infiziert oder auf sonstige Weise mit DNA transformiert worden sind, hängt von der Tatsache ab, dass sich nur Paare aus Wirtsorganismus und replizierbarer genetischer Einheit, die ein Rezeptor-Liganden-Paar gebildet haben, gegenseitig infizieren.
Wirtsorganismen, die infiziert oder auf sonstige Weise mit DNA transformiert worden sind, können über den Einsatz verschiedener Selektionsmarker, wie unterschiedlicher Resistenzen gegen ein Antibiotikum, z.B. Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol, auf verschiedenen DNA-Typen „isoliert" werden.
Die „Bestimmung" der codierenden Sequenzen kann mittels eines herkömmlichen, manuellen oder automatischen Geräts zur Sequenzierung von DNA (oder RNA) mittels bekannter Verfahren durchgeführt werden.
„Codierende Sequenz" kann die entsprechende DNA-Sequenz eines Protein oder einer RNA oder die komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz von diesen bedeuten.
„Protein" bedeutet jede beliebige Sequenz von Aminosäuren, einschließlich beliebiger Peptidfragmente von ihr.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung bereit gestellt, und sie sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken. Fachleute auf diesem Gebiet werden alternative Routineverfahren kennen, die anstelle der in den folgenden Beispielen beschriebenen eingesetzt werden können.
Beispiel 1
Vektorkonstruktionen

(a) Es wurde ein Vektor (pTRAPchI^R) konstruiert, der die Information für das Molekül der Pili, Pilin, von E. coli trägt. Das traA-Gen, das für das Pilin codiert, wurde mittels PCR von dem Plasmid pBF203 amplifiziert unter Verwendung von 5'-TCA CGG AAG CTT TCA TCA GAG GCC AAC GAC GGC CAT AC als 3'-Primer und 5'-GTC GAC CTG CAG ACA GAG TTA TTG ATC ATT TGA TCA AGT TTC CTG ATT TTT A als 5'-Primer.

Das amplifizierte Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III/Pst I geschnitten, gereinigt und in die Hind-III/Pst-I-Stelle des Plasmids pAM18chI^R insertiert. Der neue Vektor wurde pTRAPchI^R genannt und bildete funktionelle Pili, wenn mit einem JCFLtraA1 genannten F-Episom, das eine Punktmutation im traA-Gen trägt (siehe Achtman et al., J. Bacteriol. 106, 529–538 (1971)) cotransformiert wurde. Das mutierte Episom enthält außer dem traA alle die Gene, die für die Infektionsprozedur benötigt werden, wobei das traA für den Aufbau der Pilin-Moleküle verantwortlich ist.
Der Vektor pAM18chI^R wurde konstruiert, indem das Hae-II-IacZ-α-Peptidfragment aus pUC18 isoliert, mit S1-Nuclease behandelt und in die „filled-in" Hind-III/BamH-I-Stelle von pACYC 184 ligiert wurde.

(b) Es wurde ein Vektor (pTRAPV3chI^R) konstruiert, der Nucleinsäure enthält, die für das Pilinmolekül codiert, mit einer zusätzlichen Nucleinsäuresequenz, die für einen Teil der V3-Schleife von HIV-1 codiert (V3 ist die variable Schleife des gp120 von HIV-1 (LA1)). Die für die V3-Schleife codierende Nucleinsäure wurde so angeordnet, dass sie am C-terminalen Ende des Pilinmoleküls exprimiert wurde. Das wurde über eine PCR-Amplifizierung des traA-Gens aus dem Plasmid pBF203 mit einem 5'-Primer, wie er oben beschrieben wurde, und dem folgenden 3'-Primer: 5'-TCA CGG AAG CTT TCA TCA AAC GAA AGC ACG ACC CGG ACC ACG CTG GAT ACG GAT AGA TTT ACG GAG GCC ACC GAC GGC CAT AC erreicht, der 45 Basen, die für 15 Aminosäuren der V3-Schleife codieren, einschließt. Dieses amplifizierte Fragment wurde, wie oben beschrieben, in pAM18chI^R insertiert. Dieser Vektor wurde pTRAPV3chI^R genannt.
(c) Es wurde ein Vektor (pTRAPCMVchI^R) konstruiert, der Nucleinsäure trägt, die für ein Pilinmolekül codiert, mit einer zusätzlichen Sequenz eines Teils des gB-Proteins des CMV (Cytomegalovirus). Die für das gB-Fragment codierende Nucleinsäure wurde so angeordnet, dass sie am C-terminalen Ende des Pilinmoleküls exprimiert wurde. Das wurde über eine PCR-Amplifizierung des traA-Gens aus dem Plasmid pBF203 mit einem 5'-Primer, wie er oben beschrieben wurde, und dem folgenden 3'-Primer: 5'-TCA CGG AAG CTT TCA TCA TCC GTA CTT GAG GGT AGT GTT GTA GAT AGT CTC GTT GGC GAG GCC AAC GAC GGC CAT AC erreicht, der 39 Basen, die für 13 Aminosäuren des gB-Proteins codieren, einschließt. Dieses amplifizierte Fragment wurde, wie oben beschrieben, in pAM18chI^R insertiert. Dieser Vektor wurde pTRAPCMVchI^R genannt.

Beispiel 2
Vektorkonstruktion
Konstruktion von Vektoren, die für Antigenfragmente codierende Nucleinsäuren enthalten.

(a) Es wurde ein Vektor (pTRAPtet^R) konstruiert, der die Information für das Molekül der Pili, Pilin, von E. coli trägt. Das traA-Gen, das für das Pilin codiert, wurde mittels PCR von dem Vektor pTRAPchI^R (Beispiel 1) amplifiziert unter Verwendung von 5'-TCA CGG CCA TGG ATG CCG GCC ACG ATG CGT CCG als 3'-Primer und 5'-GTC CAC CCA TGG CTC ATG TTT GAC AGC TTA TCA TC als 5'-Primer.

Das amplifizierte Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym Ncol geschnitten, gereinigt und in die Ncol-Stelle des Plasmids pACYC184ΔHindIII insertiert. Der neue Vektor wurde pTRAPtet^R genannt und war imstande, funktionelle Pili zu bilden, wenn er mit einem pOX38A::CAT genannten F-Episom, bei dem eine CAT-Kassette in sein traA-Gen insertiert wurde, um seine Funktion auszuschalten, cotransformiert wurde.
pACYC184ΔHindIII wurde konstruiert, indem das Plasmid pACYC184 mit HindIII geschnitten, mit Klenow behandelt und wieder ligiert wurde, um die einmal vorkommende HindIII-Stelle auszuschalten.

(b) Es wurde ein Vektor (pTRAPV3tet^R) konstruiert, der die Information für das Pilinmolekül trägt, mit der zusätzlichen Sequenz eines Teils der V3-Schleife von HIV-1 (V3 ist die variable Schleife des gp120 von HIV-1 (LAD), und zwar so konstruiert, dass sie am C-terminalen Ende des Pilinmoleküls exprimiert wird. Das wurde über eine PCR-Amplifizierung des traA-Gens und der für das V3-Peptid codierenden Sequenz des Vektors pTRAPV3chI^R mit den im Beispiel 2a beschriebenen Primern erreicht. Dieses amplifizierte Fragment wurde wie oben beschrieben in pACYC184ΔHindIII insertiert. Dieser Vektor wird pTRAPV3tet^R genannt.
(c) Es wurde ein Vektor (pTRAPCMVtet^R) konstruiert, der die Information für das Pilinmolekül trägt, mit der zusätzlichen Sequenz eines Teils des gB-Proteins des CMV (Cytomegalovirus), und zwar so konstruiert, dass sie am C-terminalen Ende des Pilinmoleküls exprimiert wird. Das wurde über eine PCR-Amplifizierung des traA-Gens und der für das CMV-Peptid codierenden Sequenz des Vektors pTRAPCMVchI^R mit den im Beispiel 2a beschrieben Primern erreicht. Dieses amplifizierte Fragment wurde wie oben beschrieben in pACYC184ΔHindIII insertiert. Dieser Vektor wurde pTRAPCMVtet^R genannt.
(d) Es wurde ein Vektor (pAM18tet^R) über eine PCR-Amplifizierung des pUC-Inserts aus pAM18chI^R, das ein Fragment des lacZ-α-Peptids enthält, unter Verwendung der im Beispiel 2a beschriebenen Primer konstruiert. Dieses amplifizierte Fragment wurde wie oben beschrieben in pACYC184ΔHindIII insertiert. Dieser Vektor wurde pAM18tet^R genannt.

Es wurde der E.-coli-Stamm TG1 für die genetischen Konstruktionen eingesetzt.
Beispiel 3
Konstruktion Antikörperfragmente präsentierender filamentöser Bakteriophagen
Der filamentöse Bakteriophage VCS M13 (Helferphage) wurde von Stratagene bezogen.
Die M13-Phagen, die Fab gegen die V3-Schleife des HIV (anti-V3), Fab gegen Phenyloxazolon (anti-ox), Fab gegen Hühnerei-Lysozym (anti-lys) bzw. scFv gegen das gB des CMV (anti-CMV) exprimieren, wurden wie folgt präpariert:
Zellen des E.-coli-Stamms XL1 Blue wurden (nach Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557–580) mit dem Vektor pEXmide III (Söderlind et al., 1993, Bio/Technology 11, 503–507) transformiert, der die VH- und VL-Sequenzen von anti-V3, anti-ox bzw. anti-lys trägt, oder mit dem Vektor pEXmide 4 (Ohlin, M., Owman, H., Mach, M. und Borrebaeck, C.A.K., 1996, „Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition", Mol. Immunol. 33, 47–56 (1996)), der die VH- und VL-Sequenzen für anti-CMV trägt, und über Nacht bei 37°C in LB-Medium, das Ampicillin, Tetracyclin und Glucose enthielt, wachsen gelassen. Die Bakterien wurden reinokuliert und bis zu einer OD (600 nm) von 0,5 wachsen gelassen, mit LB gewaschen und in LB, das Ampicillin und Tetracyclin enthielt, resuspendiert und dann mit VCS M13 im Verhältnis 20 Phagen/Zelle superinfiziert. Nach einem einstündigen Wachstum bei 37°C wurde Kanamycin zugesetzt, und das Wachstum wurde über Nacht fortgesetzt. Der phagenhaltige Überstand wurde durch eine zehnminütige Zentrifugation bei 8000 Upm gewonnen.
Die erhaltenen Phagen tragen die Fab-Antikörperfragmente, über die konstante Domäne der schweren Kette mit dem N-Terminus des Proteins III (pIII) verknüpft, oder die scFv-Antikörperfragmente, über die variable Domäne der leichten Kette mit dem N-Terminus von pIII verknüpft.
Beispiel 4
Infektionstests
Um die Funktion der oben erwähnten genetischen Konstruktionen zu beweisen, wurden drei Typen von E.-coli-Zellen etabliert: (a) der E.-coli-Stamm JG 3272, der das nicht-mutierte F-Episom (JCFLO) enthält, (b) der E.-coli-Stamm ED 2601, der das im traA-Gen mutierte F-Episom (JCFLtraA1) enthält und mit dem pTRAP-Vektor transformiert ist, und (c) der E.-coli-Stamm ED 2601, der das im traA-Gen mutierte F-Episom (JCFLtraA1) enthält und mit dem pTRAPCMV-Vektor transformiert ist.
Die Funktion eines jeden Typs von E. coli wurde anhand seiner Fähigkeit, funktionelle F-Pili zu exprimieren und somit durch filamentöse Bakteriophagen infiziert zu werden, untersucht.
Es wurden Infektionstests durchgeführt, indem 100 μl E. coli mit 10 μl Phagenpräparation bei Raumtemperatur 45 Minuten inkubiert wurden, gefolgt vom Ausplattieren auf LB-Agar-Platten mit den entsprechenden Antibiotika (Kanamycin für die Helferphagen, Ampicillin für die spezifischen Phagen und Chloramphenicol für die pTRAP-Konstrukte). Die Zahl der koloniebildenden Einheiten, cfu, pro Platte wurde nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C gezählt.
Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 gezeigt. Die 2 (a) zeigt, dass der Wildtyp von VCS M13, der das pIII auf der Oberfläche exprimiert, die E. coli infiziert, die das F-Episom, JCFLO, enthalten. Bei 2 (b) werden E. coli; die das im traA-Gen mutierte F-Episom, JCFLtraA1, enthalten und mit dem pTRAP-Vektor cotransformiert sind, mit VCS M13 infiziert. Dieses Konstrukt führte somit zur Bildung funktioneller F-Pili, während die Cotransformation mit pTRAPCMV in der 2 (c) die Infektion mit dem Wildtyp-VCS-M13-Phagen vollständig blockierte. Somit zeigt ein Vergleich der 2 (a) und (b), dass die Zahl der cfu, die bei Einsatz der erfindungsgemäßen Konstrukte (2 (b)) erhalten wurde, mit derjenigen bei der Wildtyp-Situation (2 (a)) vergleichbar war.
Die 3 zeigt die Spezifität der Infektion. Die E. coli, die das mutierte F-Episom, JCFLtraA1, enthalten und mit pTRAPCMV cotransformiert sind, bilden Pili, die das aus 13 Aminosäuren bestehende Peptid des gB des CMV tragen. Die anti-ox- und anti-lys-enthalten Phagen, die die mit der pIII-Oberfläche verbundenen Anti-Phenyloxazolon- oder Anti-Lysozym-Antikörperfragmente exprimieren, infizierten aufgrund mangelnder Spezifität den Wirt, der das gB des CMV auf den Pili trug, nicht. Die antigenspezifische Infektion, die durch das aus 13 Aminosäuren bestehende Peptid des gB auf dem Pilinmolekül vermittelt wird, wurde eindeutig durch die Anti-CMV-Phagen demonstriert, die zu > 700 cfu/Platte führten. Somit waren die zwei Plasmide, die für das gB-Peptid (Ligand) und das Anti-CMV-scFv (Rezeptor) codieren, im Inneren der E.-coli-Zellen physisch durch die Grenzen der Zellmembran miteinander verknüpft.

Claims

Verfahren zur Selektion von Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, die imstande sind, spezifisch aneinander zu binden, wobei das Verfahren umfasst: (a) Exprimieren in einem Wirtsmikroorganismus einer Nucleinsäure, die für ein Oberflächenmolekül codiert und die mit einer Nucleinsäure verknüpft ist, die für ein Liganden- oder Rezeptormolekül oder ein funktionelles Fragment von diesen, das eine spezifische Bindungseigenschaft des Liganden oder des Rezeptors hat, codiert, so dass der Mikroorganismus das Oberflächenmolekül und das Liganden- oder Rezeptormolekül als eine Fusion exprimiert und es auf seiner Oberfläche präsentiert, wobei der Wirtsmikroorganismus so modifiziert ist, dass er das Oberflächenmolekül nicht in anderer Form als in Form einer Fusion mit dem Liganden- oder Rezeptormolekül exprimiert; (b) In-Kontakt-bringen des modifizierten Wirtsmikroorganismus des Schrittes (a) mit einer oder mehreren replizierbaren genetischen Einheit(en), die imstande ist bzw. sind, eine Nucleinsäure zu exprimieren, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung bewahrt haben, codiert, wobei die Liganden- oder Rezeptormoleküle Kandidaten für eine spezifische Bindung an die Moleküle sind, die vom Wirtsmikroorganismus des Schrittes (a) präsentiert werden und als Fusionen mit einem Oberflächenprotein der replizierbaren genetischen Einheit exprimiert werden, wobei die Liganden- oder Rezeptormoleküle am Carboxyterminus des genannten Oberflächenproteins mit dem Oberflächenprotein fusioniert sind und das genannte Oberflächenprotein die Fähigkeit besitzt, die Infektion eines Wirtsmikroorganismus zu vermitteln, wobei die Bindung der auf der Oberfläche präsentierten Liganden- und Rezeptormoleküle den Transfer der Nucleinsäure, die für den Liganden oder den Rezeptor codiert, von der replizierbaren genetischen Einheit zum Mikroorganismus vermittelt; und (c) Selektieren des Wirtsmikroorganismus, der die Nucleinsäuresequenzen enthält, die für die Liganden- und Rezeptormoleküle oder die funktionellen Fragmente von diesen codieren.
Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich den folgenden Schritt umfasst: (d) Isolieren der Nucleinsäuresequenzen, die für die Liganden- oder Rezeptormoleküle codieren.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Nucleinsäuresequenzen, die für den Liganden und/oder Rezeptor codieren, mit Selektionsmarkern assoziiert sind.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren dazu verwendet wird, eine Bibliothek von Mikroorganismen, die unterschiedliche Liganden- oder Rezeptormoleküle präsentieren, gegen Bibliotheken von replizierbaren genetischen Einheiten zu screenen, die Kandidaten für spezifische Bindungspartner für die Liganden- oder Rezeptormoleküle präsentieren.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei die für das Oberflächenmolekül codierende Sequenz des Schrittes (a) mit einer für einen Rezeptor codierenden Sequenz oder einem funktionellen Fragment von dieser vereinigt wird und die für das Oberflächenmolekül codierende Sequenz des Schrittes (b) mit einer für einen Liganden codierenden Sequenz oder einem funktionellen Fragment von dieser fusioniert wird.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirtsmikroorganismus so modifiziert ist, dass er den Liganden oder Rezeptor über einen Bakteriendisplayvektor präsentiert.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirtsmikroorganismus das Bakterium E. coli ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oberflächenmolekül des Wirtsmikroorganismus aus der Gruppe aus OmpA, IgA-Protease oder Pilin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Oberflächenmolekül Pilin ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei die replizierbare genetische Einheit ein Phagendisplayvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Phagendisplayvektor ein filamentöser Bakteriophage ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der filamentöse Bakteriophage fd, f1 oder M13 ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oberflächenmolekül der replizierbaren genetischen Einheit pIII ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ligand ein Antigen ist und der Rezeptor ein Antikörper ist.
Kit für den Einsatz in einem Verfahren zur Selektion von Nucleinsäuresequenzen, die für Liganden- und Rezeptormoleküle codieren, die imstande sind, spezifisch aneinander zu binden, wobei der Kit umfasst: (a) einen Wirtsmikroorganismus, der so modifiziert ist, das er nicht ein Oberflächenprotein vom Wildtyp präsentiert; (b) einen Vektor, der für das genannte Oberflächenprotein codiert und Restriktionsstellen für die Insertion von Nucleinsäuren aufweist, die für Liganden- oder Rezeptormoleküle oder funktionelle Fragmente von diesen, die eine spezifische Bindungseigenschaft des Liganden oder des Rezeptors haben, codieren, so dass, wenn er in den Wirtsmikroorganismus transformiert wird, das Oberflächenmolekül und das Liganden- oder Rezeptormolekül als eine Fusion exprimiert und auf der Oberfläche des Mikroorganismus präsentiert werden, wobei die Liganden- oder Rezeptormoleküle am Carboxyterminus des genannten Oberflächenproteins mit dem Oberflächenprotein fusioniert sind; (c) einen Bakteriophagen, der eine Stelle für die Insertion eines Kandidaten für die Bindung an den Liganden oder Rezeptor aufweist, so dass die Bindungspartner auf der Oberfläche des Bakteriophagen als eine Fusion mit einem Oberflächenprotein des Bakteriophagen präsentiert werden, wobei das genannte Oberflächenprotein die Fähigkeit hat, die Infektion eines Wirtsmikroorganismus zu vermitteln.