DE69632827T2

DE69632827T2 - Materialen und methoden im zusammenhang mit bindung und präsentation von substanzen auf zelloberflächen

Info

Publication number: DE69632827T2
Application number: DE69632827T
Authority: DE
Inventors: Lothar Steidler; Erik Remaut; Jeremy Mark Wells
Original assignee: Individual
Current assignee: Intrexon Actobiotics NV
Priority date: 1995-09-07
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2016-09-07
Also published as: GB9518323D0; NZ316580A; BR9610133A; AU729449B2; ZA967562B; NO980976L; KR19990044528A; JP4180111B2; HK1014337A1; US6190662B1; CA2231372A1; WO1997009437A1; NO980976D0; JPH11511983A; CN1201493A; MX9801864A; EP0848756A1; AU6884496A; DE69632827D1; EP0848756B1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Substanzen für den Export, zum Anheften von Substanzen, insbesondere Proteine und Polypeptide, an die Zellwand und ihre Zurschaustellung auf der Zelloberfläche Gram-positiver Bakterien wie beispielsweise Lactococcus lactis. Es sind Verfahren offengelegt, die die Zellwandverankerung von Proteinen, einschließlich Antigene, spezifisch bindende Proteine und Enzyme, für die Oberflächenexpression bereitstellen.
Grundlagen der Erfindung
Die Zurschaustellung von Polypeptiden auf der Oberfläche von Bakterien ist seit mehreren Jahren Gegenstand der Forschung. Das Interesse ist entstanden, weil es mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie möglich ist, Bakterien als Fabriken für die billige Produktion eines großen Spektrums verschiedener Proteine zu nutzen. Die Arbeiten konzentrierten sich auf die Zurschaustellung von Polypeptiden auf der Oberfläche Gram-negativer Bakterien, siehe zum Beispiel die im US Patent 5348867 gegebene Übersicht. Allerdings hat es sich bei Gramnegativen Bakterien als schwierig erwiesen, ein anwendungsfähiges Verfahren zur Zurschaustellung von Polypeptiden auf der Oberfläche der Zellen zu finden, dass die Polypeptide auf der Oberfläche in hoher Dichte sicher gebunden sind.
Die Oberflächenexpression in hoher Dichte von rekombinanten Produkten auf der Bakterienoberfläche ist allerdings eine Voraussetzung für die Verwendung dieser Bakterien in bestimmten industriellen Anwendungen sowie auf den Gebieten der Impfstoffentwicklung, der Konstruktion von Peptid-Bibliotheken und der Herstellung von Adsorbenzien aus ganzen Bakterienzellen. Den Erfindern ist kein Stand der Technik bekannt, bei dem eine konsistente, stabile Expression mit hoher Dichte auf der Oberfläche von Bakterien und ganz besonders auf der Oberfläche Gram-positiver Bakterien, wie beispielsweise Lactococcus lactis und ähnliche oder verwandte Spezies, erhalten wird.
Frühere Arbeiten über die Präsentation von Polypeptiden auf der Bakterienoberfläche haben sich hauptsächlich auf die Verwendung von Gramnegativen Bakterien wie beispielsweise E. coli und Salmonella (Georgiou et al., 1993) konzentriert. In Gram-negativen Bakterien ist die Peptodoglycan-Zellwand von zwei separaten Lipidmembranen gebunden. Die äußere Membran ist für Moleküle mit einer relativen Molmasse größer als 500 (Mr) weitgehend impermeabel und folglich werden nur sehr wenige Proteine ins Wachstumsmedium abgegeben. Aufgrund des Vorhandensein einer äußeren Membran sind oberflächenexponierte Proteine Gram-negativer Bakterien entweder integrale Proteine der äußeren Membran oder Proteine-Fortsätze wie Pili oder Flagellen.
Die wenigen Proteine, die von Gram-negativen Organismen sezerniert werden, werden durch die äußere Membran mit Hilfe spezialisierter Transportsysteme transportiert, die bis zu 14 verschiedene Genprodukte umfassen (z. B. Pullulanase-Sekretion; Kornacker und Pugsley 1990a).
Die Möglichkeit der Zurschaustellung fremder Proteine mittels Herstellen C-terminaler Fusionen an integrale Membranproteine wird durch die Tatsache erschwert, dass die C-terminalen Regionen vieler integraler Membranproteine für die Zielbestimmung und den korrekten Zusammenbau des Proteins in der äußeren Membran erforderlich zu sein scheinen. Eine Möglichkeit um dieses Problem zu umgehen, ist die Verwendung der N-terminalen zielbestimmenden Sequenz des E. coli Hauptlipoproteins (Lpo) gewesen, um Fusionsproteine zur äußeren Membran zu leiten. Da Lpp die äußere Membran nicht überwindet, ist ebenfalls die Membran durchdringende Domäne eines äußere Membranproteins (OMP; z. B. E. coli OmpA) erforderlich, um ein Fusionsprotein an der Zelloberfläche zu lokalisieren. Nichtsdestoweniger ist der Nutzen dieser Lpp-OmpA Fusionen für die Zurschaustellung funktioneller Proteine, wie beispielsweise für β-Lactamase, für einen einzelkettigen Fv-Antikörper und für ein Cellulose bindendes Protein, gezeigt worden (Georgiou et al., 1990).
Andere Versuchsansätze zur Zurschaustellung von Polypeptiden haben die Herstellung von Aminosäure-Insertionen innerhalb äußerer Membranschlaufen von integralen Membranproteinen umfasst, wie beispielsweise Lam B oder in den Pili- oder Flagellinproteinen, die keine Transmembran-Domänen enthalten (Charbit et al., 1991; Thiry et al., 1989; Steidler et al., 1993 a, b). Das Hauptproblem bei diesem Versuchsansatz ist gewesen, dass große Aminosäure-Insertionen/Substitutionen die exakte Faltung und/oder Lokalisierung des Fusionsproteins derart stören, dass, wenn sie zur Immobilisierung der Bakterienzellen eingesetzt sind, die Fusionsproteine von der äußeren Membran extrahiert werden (Steidler, PhD Thesis, Universität Gent, Belgien).
Obwohl vor kurzem signifikante Fortschritte bei Entwicklung von Verfahren zur Zurschaustellung von Proteinen in Gram-negativen Bakterien gemacht worden sind, ist das Haupthindernis für die Verwendung von integralen Membranproteinen für derartige Zwecke, dass die Fusionsproteine nicht fest an die Zelloberfläche gebunden sind. Außerdem ist bekannt, dass der hohe Expressionslevel von Membranproteinen für die Zelle schädlich ist, ein Faktor, der die möglichen Anwendungen für derartige Systeme in Fällen einschränken kann, wo eine hochdichte Oberflächenexpression erforderlich ist.
Im Gegensatz dazu besitzen Gram-positive Bakterien keine äußere Membran und es wird geglaubt, dass Proteine, die auf der Zelloberfläche zur Schau gestellt sind, an die Zelloberfläche über ihren C-Terminus gebunden sind (Schneewind et al., 1992). Viele Oberflächenproteine von Gram-positiven Bakterien besitzen bestimmte allgemeine Merkmale, die für diese Organismen einzigartig sind. Jedes Molekül besitzt an seinem N-terminalen Ende ein Sekretions-Leader-Peptid, das als ein Exportsignal für die Zellsekretion dient, ein LPXTG-Motiv, eine C-terminale hydrophobe Domäne und geladene Aminosäuren am äußeren C-Terminus. Die meisten Arbeiten zur Charakterisierung und Funktion von diesen sind bei S. aureus unter Verwendung von Zellwandsortierungs- und Verankerungsdomänen von S. aureus Protein A durchgeführt worden (Navarra und Schneewind, 1994). Es ist gezeigt worden, dass Protein A an die Zellwand von S. aureus mit Hilfe eines noch aufzuklärenden Mechanismus kovalent gekoppelt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das feste Anheften fremder Proteine an die Oberfläche von L. lactis mittels Konstruktion chimärer Gene ermöglicht wird, die ein Fusionsprotein codieren und Nucleinsäure umfassen, die (1) ein N-terminales Sekretionssignal, (2) das auf der Oberfläche zu exprimierende Protein, und (3) die Zellwandsortierungs- und Verankerungsdomänen von S. aureus Protein A codiert.
Da relativ wenige heterologe Proteine mit hohem Level in L. lactis exprimiert worden sind im Vergleich mit E. coli, war es vor der vorliegenden Arbeit nicht möglich mit Sicherheit vorherzusagen, ob die Expression eines beliebigen bestimmten Proteins möglich wäre oder ob eine derartige Expression für die Zelle toxisch wäre. Eine derartige Toxizität liegt wahrscheinlich vor, wenn ein sezerniertes oder Membran-assoziiertes Protein mit hohem Level exprimiert wird, da ein Proteinexport die Integrität der Zellmembran oder die Funktion des allgemeinen sekretorischen Stoffwechselweges nachteilig beeinflussen kann.
Folglich zeigt die vorliegende Erfindung zum ersten Male, dass Proteine oder Polypeptide an die Zellwand von L. lactis fest angeheftet werden können, wenn sie als Fusionen mit einer Zellwand verankernden Domäne exprimiert sind. Wie es unten gezeigt ist, ist es nicht möglich, das Protein mittels Erhitzen der Zellen in Gegenwart eines ionischen Detergens zu entfernen, das normalerweise nicht-kovalent gebundene Proteine freisetzt. Da wir uns nicht an irgendeine bestimmte Theorie gebunden fühlen, glauben wir, dass L. lactis das/die notwendige(n) Enzym(e) zu besitzen scheint, die für ein (kovalentes) Binden der exprimierten Protein A Fusion an das Zellwand-Peptidoglycan erforderlich sind. Dieses Binden ließe sich nicht ohne weiteres aus dem Besitz von Protein A des LPXTG-Motivs und C-terminalen hydrophoben Domänen, die vielen Oberflächenproteinen Gramnegativer Bakterien gemeinsam sind, vorhersagen, da diese Motive lediglich notwendige aber nicht hinreichende Bedingungen für das Zustandekommen einer kovalenten Zellwandverankerung sind.
Dementsprechend ergibt sich die vorliegende Erfindung aus der Feststellung, dass es möglich ist, Proteine und Polypeptide von Interesse (einschließlich, aber nicht auf Adhäsine, Antigene, Enzyme und Liganden beschränkt) an die Außenseite der Peptidoglycan-Zellwand von Lactococcus lactis fest anzuheften, unter Verwendung eines chimären Gens, umfassend eine Nucleinsäure, die eine Sekretionssignal-Sequenz, ein erwünschtes Protein oder Polypeptid und eine Zellwandbindungsdomäne codiert, wie beispielsweise diejenige, die von Staphylococcus aureus Protein A abgeleitet ist.
Dementsprechend stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, umfassend Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, umfassend eine vom usp45 Protein abgeleitete Sekretionssignal-Sequenz, ein erwünschtes Protein oder Polypeptid und eine Zellwandbindungsdomäne von Staphylococcus aureus Protein A, so dass, wenn der Vektor in einen Lactococcus lactis Wirt transformiert und das Fusionsprotein exprimiert wird, das erwünschte Protein oder Polypeptid auf der Außenseite der Zellwand des Wirts gebunden und zur Schau gestellt wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen L. lactis Wirtsorganismus bereit, der mit einem oben beschriebenen rekombinanten Vektor transformiert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen oben beschriebenen L. lactis Wirtsorganismus bereit, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid exprimiert worden ist und kovalent an die Zellwand angeheftet und auf der Außenseite der Oberfläche des Wirtsorganismus zur Schau gestellt ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Gram-positiven Wirtsorganismus für die Zurschaustellung eines erwünschten Proteins oder Polypeptids auf seiner Oberfläche bereit, umfassend Transformieren des Wirtsorganismus mit rekombinanter Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein codiert, umfassend eine vom usp45 Protein abgeleitete Sekretionssignal-Sequenz, ein erwünschtes Protein oder Polypeptid und eine vom Staphylococcus aureus Protein A abgeleitete Zellwandbindungsdomäne, so dass der Wirt in der Lage ist, das Fusionsprotein zu exprimieren, wodurch die Zellwandverankerungsdomäne dem Wirt ermöglicht, das erwünschte Protein oder Polypeptid auf der Zellwandoberfläche zu binden und zur Schau zu stellen. Dieser Aspekt umfasst ebenfalls L. lactis Wirtsorganismus-Stämme, da sie mit diesem Verfahren zu erhalten sind.
Die Sekretionssignal-Sequenz ist in der Lage, das Protein für eine Sekretion über den sec-abhängigen Weg der Sekretion zu adressieren und ist von einer Signalsequenz eines natürlich sezernierten Proteins wie beispielsweise usp45 abgeleitet.
Die Zellwandverankerungsdomäne umfasst am C-Terminus eine Verankerungsdomäne, die vom Staphylococcus aureus Protein A abgeleitet ist.
Vorzugsweise ist die Nucleinsäure, die das Fusionsprotein codiert, an Kontrollsequenzen operativ gekoppelt, um ihre Expression zu regulieren. Ein Beispiel hierfür ist ein Lactococcus Wirtsorganismus, der außerdem mit Nucleinsäure, umfassend ein T7 oder T7-ähnliches Polymerase-Gen unter der Kontrolle eines im Lactococcus Wirt wirksamen, induzierbaren Promotors, worin die Kontrollsequenzen einen für besagte Polymerase spezifischen Promotor umfassen, der stromaufwärts der das Fusionsprotein codierenden Nucleinsäure zur Verfügung gestellt ist, wodurch der Promotor die Transcription der das Fusionsprotein codierenden Nucleinsäure als Folge der Expression der Polymerase selektiv reguliert (siehe GB-A-2278358).
Es ist festegestellt worden, dass der hohe Expressionslevel heterologer Proteine, der unter Verwendung des T7-Polymerase-Systems erzielt werden kann, hohe Expressionslevels des Protein A Fusionspolypeptids auf der Oberfläche der Bakterien liefert. Für viele angedachte Anwendungen der Erfindung wird die Rentabilität der damit verbundenen Verfahren wesentlich begünstigt, wenn die größt mögliche Oberflächendichte von Fusionsmolekülen auf den Bakterien erreicht wird. Allerdings kann bei manchen Anwendungen die Verwendung von konstitutiven oder weniger aktiven Promotoren zu zweckdienlichen Ergebnissen führen, besonders wo geringere Expressionslevel erforderlich sind.
Zahlreiche Variationen der offengelegten Vektoren könnten vom Fachmann unter Verwendung bekannter Techniken und der hier gemachten Offenlegung routinemäßig hergestellt sein. Außerdem können die von der obigen Nucleinsäure codierten Proteine oder Polypeptide durch Variieren ihrer Aminosäure-Sequenz ohne wesentliche Veränderung ihrer Eigenschaften modifiziert sein, z. B. durch Veränderung der Nucleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen durch Insertion, Addition, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Basenpaare oder Aminosäuren. Derartige Polypeptid-Derivate, die hier offengelegt sind, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wie oben erwähnt, besitzen die L. lactis Wirtsorganismen, die mit der die Fusionsproteine codierenden Nucleinsäure transformiert sind, eine weites Anwendungsspektrum als Impfstoffe, um biologisch aktive Moleküle auf Zelloberflächen zu präsentieren, als Adsorbenzien und um Enzyme auf Zelloberflächen zu präsentieren z. B. zur Verwendung als Katalysatoren.
Folglich stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung L. lactis Wirtsorganismen bereit, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid wenigstens ein Epitop umfasst, gegen das eine Entwicklung einer Immunantwort erwünscht ist. Bevorzugt ist das Protein oder Polypeptid ein Immunogen von einem Pathogen, ein Antigen oder Adhäsin.
Mit diesem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls einen Impfstoff bereit, umfassend den obigen Wirtsorganismus in einer Mischung mit einem geeigneten Träger. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung obiger L. lactis Wirtsorganismen bei Herstellung eines Impfstoffes, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein Epitop ist, gegen das die Entwicklung einer Immunantwort erwünscht ist. Vorzugsweise sind die Impfstoffe intranasal oder parenteral oder über andere Mukosa-Pfade, wie beispielsweise oral oder vaginal, verabreicht.
Mit einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung L. lactis Wirtsorganismen bereit, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein biologisch aktives Molekül ist. Beispielsweise kann das biologisch aktive Molekül ein Medikament, ein Hormon, ein Enzym, DNA/RNA bindendes Protein oder eine Substanz sein, die in der Lage ist, sekundäre Modifikationen (Glycosylierung, Disulfid-Isomerisierung) an anderen coexprimierten und sezernierten Proteinen durchzuführen. Alternativ kann das Protein oder Polypeptid eine Ziel-bestimmende Gruppe sein, zum Beispiel Antikörper oder Fragmente davon oder für Rezeptoren spezifische Adhäsine.
Mit diesem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die L. lactis Wirtsorganismen, und ihre Verwendung in Verfahren zur medizinischen Behandlung.
Mit einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung L. lactis Wirtsorganismen bereit, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein spezifischer Bindungspartner für einen Liganden ist. Mit diesem Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung von L. lactis Wirtsorganismen in einem Verfahren zur Reinigung und Trennung eines Liganden, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein spezifischer Bindungspartner des Liganden ist, wodurch das Zurschaustellen des spezifischen Bindungspartners auf der Oberfläche des Organismus dem Bindungspartner erlaubt, an den Liganden zu binden.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Möglichkeit zur Immobilisierung der L. lactis Wirtsorganismen auf einer festen Phase bereit, z. B. durch Exprimieren von Streptavidin, das an eine Zellwandverankerungsdomäne fusioniert ist, so dass das auf der Zelloberfläche vorhandene Streptavidin an Biotin binden kann, das auf einer festen Phase immobilisiert ist. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Immobilisieren eines L. lactis Wirtsorganismus der Erfindung bereit, das Inkontaktbringen eines Wirtsorganismus dieses Aspekts der Erfindung mit einer festen Oberfläche umfasst, die einen hierauf immobilisierten Liganden besitzt. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis von Komplexen mit einem spezifischen Liganden (z. B. Biotin oder ein Immunglobulin) durch Coexpression einer Reporter-Aktivität wie beispielsweise Luciferase oder ein fluoreszierendes Protein in Zellen, die ebenfalls auf ihrer Oberfläche das an den nachzuweisenden Liganden bindende Protein (z. B. Streptavidin oder Protein A) exprimieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen L. lactis Wirtsorganismus bereit, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein Enzym ist. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst ebenfalls eine Zusammensetzung, umfassend den L. lactis Wirtsorganismus, worin das erwünschte Protein oder Polypeptid ein Enzym ist, das auf der Zelloberfläche des Wirtsorganismus exprimiert und zur Schau gestellt worden ist, und die Verwendung der Zusammensetzung in einer von dem Enzym katalysierten Reaktion, zum Beispiel ein Oberflächenenzym, das unerwünschte Nahrungsbestandteile wie beispielsweise Fett und Cholesterin aus dem umgebenden Milieu abbauen kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Durchmusterung einer Bibliothek von Substanzen bereit, wie beispielsweise Antikörper oder Antigene oder Fragmente davon, umfassend Transformieren der L. lactis Wirtsorganismen mit Nucleinsäure, die eine Fusion der Substanzen und eine Zellwandverankerungsdomäne codiert, Expression der Fusion, so dass die Substanz auf der Zelloberfläche zur Schau gestellt wird. Diese besondere Substanz, auf die durchmustert wird, kann dann unter Verwendung eines Erkennungsmittels, z. B. markierte Antikörper, nachgewiesen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Konstruktion der unten beschriebenen Genfusionen.
2 zeigt ein Western Blot von Proteinen, die aus (i) dem Wachstumsmedium, (ii) dem Überstand von Lyostaphin-behandelten Zellen, (iii) intakten Zellen, erhitzt in Laemmli SDS Puffer „cracking released", und (iv) dem Rückstand vom Zellpellet von den Lyostaphin behandelten Zellen gewonnen sind. Die gekennzeichneten Proteine (siehe Pfeilspitzen) wurden mittels Immunoblotting mit Kaninchen anti-Streptavidin Antiserum und einem zweiten Antikörper-Konjugat gemäß Standardverfahren detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das in L. lactis gebildete Streptavidin-Protein A Fusionsprotein fest an die Zelloberfläche angeheftet ist.
3 zeigt, dass ein Biotin-Konjugat in der Lage war, spezifisch an die Oberfläche von intakten Zellen zu binden, die ein Streptavidin-Protein A Fusion exprimieren, was demonstriert, dass das Protein auf der Oberfläche der Zelle vorhanden ist. Diese Figur zeigt einen Filter, auf dem Zellen, die die Streptavidin-Protein A Fusion (pL2SAX) oder Streptavidin (pL2SA) exprimieren, gesammelt und mit biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (B-POD) oder B-POD, die zuvor mit Streptavidin (SA) behandelt worden ist, um seine Bindungsstellen zu blockieren (siehe mit B-POD/SA markierte Vertiefungen) behandelt worden sind. Die B-POD bindenden Zellen wurden mittels Inkubation mit einem chromogenen Substrat für Meerrettich-Peroxidase detektiert. Nur intakte Zellen, die das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche exprimieren, banden das biotinylierte Enzymkonjugat B-POD.
4. Die Abbildung, markiertes pL2SAX, zeigt ein Foto von L. lactis Zellen, die die Streptavidin-Protein A Fusion auf ihrer Oberfläche exprimieren und an eine Polystyrol-Oberfläche gebunden haben, die mit einem biotinyliertem Meerrettich-Peroxidase Konjugat beschichtet ist. Es waren keine Zellen in der negativen Kontrolle zu erkennen, die für alle im Text beschriebenen Kontrollproben repräsentativ ist.
5(A) zeigt physikalische und genetische Karten des Vektors pTREX1, pTL2TT und PTITT mit breitem Gram-positiven Wirtsspektrum. Die Expressionskassette, Macrolid, Lincosamid und Streptogramin B (MLS) Resistenz-Determinante, TTFC-Gen, Sekretionssignal-Sequenz von usp45 (L2), S. aureus Protein A Anker (SPA-X) und das Replikon (Ori- „von pAMβ1") sind fett dargestellt.
5(B) ist eine schematische Darstellung der Expressionskassette in pTPREX1, welche die an der Genexpression beteiligten verschiedenen Sequenzelemente, die Orte der einzelnen Restriktionsendonuclease-Stellen, Shine Dalgorno (SD) Motiv und Translationsinitiation-Startcodon (ATG) zeigt.
5(C) zeigt die DNA-Sequenz und kartierte Restriktionsendonuclease-Stellen der pTREX1 Expressionskassette. Die Schlüssel-Expressionselemente sind ebenfalls in der Karte angegeben.
6 zeigt die Liste der für die PCR verwendeten Primer.
7 zeigt einen Filter, auf dem intakte Zellen, die TTFC intrazellulär (pTITT) exprimieren, TTFC sezernieren (pTIL2TT) oder ein TTFC-Protein A Fusionsprotein (pTTA) exprimieren, mit Kaninchen TTFC polyklonalen Antisera inkubiert, auf einer Membran gesammelt worden sind und dann mit einem Antikörper-Peroxidase-Konjugat und Substrat reagierten, um das Binden von anti-TTFC-Antikörper auf der Oberfläche der Zellen zu detektieren. Nur intakte Zellen, die die TTFC-Protein A Fusion exprimieren, zeigten TTFC auf ihrer Zelloberfläche.
Genaue Beschreibung
Inaktivierte oder bakterielle Lebendimpfstoffe und Mittel für die Herstellung von anti-Polypeptid-Antikörpern
Die Erfindung kann zur Oberflächenexpression von Antigenen, Adhäsinen und biologisch aktiven Molekülen in L. lactis verwendet sein. Diese Bakterien gehören zu den Bakterien, die als Vehikel zum Überbringen von Impfstoff für eine mukosale Immunisierung vorgeschlagen worden sind (Wells et al., 1993). Antigene, die auf der Bakterienzelloberfläche exponiert sind, können vom Immunsystem viel leichter erkannt werden (als Antigene, die nur nach dem Absterben und Abbau der Bakterien freigesetzt werden), infolge der besseren Zugänglichkeit der Oberflächenantigene für ihre Rezeptoren auf Antigen erkennenden und verarbeitenden Zellen wie Makrophagen, dendritische Zellen und B-Lymphocyten. Die Oberflächenexpression von Antigenen und Epitopen kann deshalb die Immunogenität von Antigenen verstärken, die von Gram-positiven Bakterien, die als Impfstoffe dienen, exprimiert sind. Ganze Zellen, die Antigen auf ihrer Oberfläche exprimieren, sind ebenfalls zweckdienliche Immunogene, um polyklonale und monoklonale Antikörper in Tieren hervorzurufen (Charbit et al., 1987).
Bakterielles Überbringen von biologisch aktiven Molekülen
Die Oberflächenexpression von Adhäsinen, die für Rezeptoren spezifisch sind, die auf Zellen und/oder in Geweben im Darm und anderen Schleimhautgeweben (zum Beispiel Respirations-, Urogenital- und Nasaltrakt) vorhanden sind, zusätzlich zur Expression von Antigenen und/oder biologisch aktiven Molekülen, würde es ermöglichen, dass die rekombinanten Bakterien auf spezifische Zellen und Gewebe, z. B. Neoplasie, gezielt werden. Ein derartiges Zielen würde die Effizienz erhöhen, mit der diese Bakterien zum Überbringen von Antigenen und/oder biologisch aktiven Molekülen zu mukosalen Oberflächen verwendet sein können. In Fällen, wo die zu verwendenden Bakterien normalerweise nicht anhaften an oder proliferieren auf einer bestimmten mukosalen Oberfläche, würde ein derartiges Zielen die Kontaktzeit zwischen dem Bakterium und der mukosalen Oberfläche verlängern, was folglich das Überbringen und/oder die Aufnahme eines Moleküls oder von Molekülen, das/die vom Bakterium synthetisiert ist/sind, erleichtert.
Die Oberflächenexpression von zahlreichen biologisch aktiven Molekülen besäße ein großen Anwendungsspektrum bei der Therapie von Krankheiten, mittels Überbringen eines jeden von zahlreichen Hormonen, Cytokinen oder anderen immunmodulatorischen Molekülen, Zellrezeptoren und/oder ihren Liganden, Enzymen, zellspezifischen Toxinen. Derartige Moleküle könnten mit Invasinen oder anderen Proteinen coexprimiert sein, die Bakterien ein Eindringen in Zellen ermöglichen und/oder in das Cytoplasma aus dem Endosom freigesetzt werden, was folglich möglich macht, die Bakterien auf die Zellen und auf Kompartimente innerhalb der Zellen mit Mitteln dieser Erfindung zu zielen.
Zusätzlich könnten Oberflächen-Liganden mit einer adäquaten Bindungsaffinität verwendet sein, um eine Beschichtung der Bakterien mit einem großen Spektrum erwünschter Moleküle zu ermöglichen; zum Beispiel könnte eine Oberflächenexpression von einem DNA oder RNA bindenden Protein verwendet sein, um den Organismen ein Beschichten mit DNA oder RNA zu ermöglichen. Derartige Verfahren könnten in der Gentherapie oder Nucleinsäure-Impfung Verwendung finden.
Zurschaustellung von spezifischen Antigenen, Antikörpern und Liganden auf der Oberfläche
Die neue Entwicklung der Phagen-Display-Technik hat die Isolierung spezifischer Antigene, Antikörper und anderer Liganden von komplexen Bibliotheken mittels Panning auf rekombinante Bakteriophagen ermöglicht, die Gegenliganden exprimieren, die dann an einen immobilisierten Träger anhaften, der das Antigen, den Antikörper oder Rezeptor von Interesse enthält (Chiswell und McCafferty, 1992). Ein alternativer Versuchsansatz könnte die Verwendung von Gram-positiven Bakterien für die Oberflächen-Präsentation von Proteinen oder Peptiden sein. Die Vorteile der Bakterien-Display-Technik wären (i) Bakterien, die den erwünschten Liganden exprimieren, könnten unter Verwendung eines fluoreszierenden Gegenliganden als Sonde direkt detektiert werden, diese Bakterien könnten dann frei von nicht-Expressorzellen unter Verwendung eines FACS-Gerätes, das einzelne Bakterien sortieren kann, erhalten werden. Dieses Verfahren würde die notwendige Vermehrung des Phagens umgehen, um die klonierte DNA-Sequenz von Interesse zu gewinnen (ii) höhere Dichte von Oberflächenprotein-Expression ist in Bakterien im Vergleich zu Phagensystemen möglich und (iii) Probleme mit dem Unvermögen mancher rekombinanter Phagen, E. coli zu infizieren (damit sie sich vermehren können) treten nicht auf.
Die Verwendung von Bakterien als ganzzellige Adsorbenzien
Der Einsatz der Affinitätschromatographie bei der Reinigung von biologischen Produkten kann oftmals mehrstufige Verfahren in einstufige oder fast einstufige Verfahren zurückführen. Dies führt dann wieder zu einer Vereinfachung von nachfolgenden Verarbeitungsprozessen, die mit der Gewinnung biologischer Produkte verbunden sind, und bedeutet ebenfalls, dass große Einsparungen bei zu investierendem Kapital erzielt werden können; Betriebskosten können verringert werden und die Produkte selbst können schneller erhalten werden. In der Tat ist eines der besten Beispiele für diesen Versuchsansatz die Verwendung von Wildtyp Staphylococcus aureus, um Antikörper zu binden und zu reinigen.
Auf der Oberfläche von Bakterien gefundenes Protein A besitzt eine hohe Affinität für die Fc-Domäne bestimmter Immunoglobuline und Hitze abgetötete und stabilisierte S. aureus Zellen sind routinemäßig für die Reinigung von Antikörpern verwendet worden.
Allerdings kann die erforderliche überreichliche Bereitstellung einer immobilisierten Form des Liganden die Affinitätschromatographie unrentabel machen.
Die Expression der funktionellen Fragmente von Liganden oder Gegenliganden wie beispielsweise einzelkettige Antikörper, Protein-Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle etc. auf der Oberfläche von Bakterien würde es ermöglichen, diese Moleküle durch bakterielles Wachstum günstig zu replizieren; eingefangene Bakterienzellen könnten dann für die Bereitstellung einer kostengünstigen Form des Adsorbens verwendet sein.
Harmlose Gram-positive Bakterien wie beispielsweise L. lactis enthalten keine in E. coli vorhandenen Endotoxine, die anfangs alle rekombinanten Produkte kontaminieren, die in diesem Bakterium hergestellt sind, und welche im Verlauf der Reinigungsverfahren entfernt werden müssen. Daher führt die Verwendung von Gram-positiven Bakterien für die Zurschaustellung von Liganden auf der Oberfläche nicht zu einer Kontamination von Produkten mit Endotoxinen.
Enzym-beschichtete Bakterien als Biokatalysatoren
Viele Enzyme, die von Gram-positiven Bakterien und anderen Organismen produziert werden, werden von diesen Organismen in ihre Umgebung sezerniert, wo sie die verschiedensten biochemischen Transformationen vermitteln. Diese chemischen Umwandlungen können für das Überleben und Wachstum essenziell sein oder sie ermöglichen den Organismen, effektiver mit anderen Organismen in ihrer Umgebung zu konkurrieren.
Die für die Ernährung erforderlichen Enzyme umfassen zum Beispiel Enzyme, die biologische Polymere wie beispielsweise Kohlenhydrate, Lipide, Nucleinsäuren und Proteine in ihre Bestandteile zerlegen können und Nährstoffe für die wachsenden Organismen liefern.
Sezernierte Enzyme erfüllen ebenfalls ein Spektrum unterschiedlicher Funktionen wie beispielsweise die Biosynthese von Schleimen und Mucinen (Glycoproteine oder Proteoglycane), die Bakterien und anderen Organismen ermöglichen, sich an günstigen Oberflächen in ihrer Umgebung festzusetzen. Sie inaktivieren ebenfalls antimikrobielle Substanzen wie beispielsweise Antibiotika oder Toxine, die von anderen Organismen freigesetzt sind, und sie können toxische oder abträgliche Substanzen abbauen, die in die Umwelt durch geologische oder industrielle Prozesse gelangt sind.
Viele dieser sezernierten Enzyme besitzen eine industrielle Bedeutung, sollten aber Idealerweise in einer festen Phase vorliegen, dass flüssige Reaktionspartner, die diese Phase passieren, einer katalytischen Umwandlung mit dem immobilisierten Enzym unterzogen werden können.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist, dass die Verwendungsfähigkeit von Enzymen in industriellen Prozessen verbessert wird durch Bereitstellen – in Form von Bakterien, die die Enzyme in immobilisierter Form herstellen können – der für derartige Biotransformationsprozesse erforderlichen aktiven Komponenten.
Verwendung immobilisierter Zellen für die Produktion sezernierter Proteine
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion sezernierter Proteine von L. lactis bereit, die an einem immobilisierten Träger gebunden sind. Zum Beispiel könnten Zellen, die Streptavidin auf ihrer Oberfläche zur Schau stellen und ebenfalls ein Enzym oder ein anderes Protein von Interesse sezernieren, an einer Biotinbeschichteten festen Phase gebunden werden. Ein Vorteil dieses Versuchsansatzes ist, dass die Aufarbeitung des Wachstumsmediums, das das sezernierte Protein enthält, keine Zentrifugation zum Entfernen der Bakterienzellen erfordert.
Zusammenbau heterodimerer Proteine mit bifunktionellen aminoterminalen Domänen auf der Bakterienoberfläche
Bei diesem Aspekt der Erfindung ist ein Partner des Heterodimers z. B. ein Fusionspolypeptid, das ein Signalpeptid, einen einzelkettigen Antikörper, die Gelenkdomäne und/oder konstanten Domänen der schweren Kette und die Zellwandverankerungsdomäne von Staphylococcus aureus Protein A umfasst, auf der Bakterienoberfläche exprimiert und der andere Partner wird sezerniert und ist aus einem ähnlichen Fusionspolypeptid zusammengesetzt, z. B. ein anderer einzelkettiger Antikörper (der ein anderes Antigen erkennt) oder eine andere Enzymaktivität aber keinen Zellwandanker besitzt. Die beteiligten Partnerpolypeptide können entweder in der selben veränderten Zelle oder in einer anderen veränderten Zelle, die in Co-Kultur wächst, synthetisiert sein.
In diesem Beispiel dient die Bakterienoberfläche als Ort des Zusammenbaus für ausschließlich heterodimere Moleküle mit bifunktionellen aminoterminalen Domänen. Die zusammengebauten Proteine können dann von den gesammelten Bakterien spezifisch freigesetzt und gereinigt werden, z. B. durch Wirkung von Lysostaphin. Alternativ und bevorzugt kann die Freisetzung durch Einwirkung einer spezifischen Protease auf die ganze Zelle z. B. Faktor Xa, Enterokinase, Kollagenase, Igase (von Neisseria gonorrhoeae), Thrombin, TEV (Tobacco Etch Virus) Protease erfolgen, wobei die Erkennungsstelle für die Protease in das Fusionspolypeptid genau stromaufwärts des Zellwandankers eingebaut ist. Die erwünschten Proteine können mit Hilfe herkömmlicher Trennungstechniken gereinigt werden.
Obwohl Verfahren zur Herstellung bifunktioneller Heterodimere bekannt sind, gibt es zurzeit keine allgemein anwendbare Verfahren, die zur Trennung der Heterodimere von unvermeidlich mit produzierten homodimeren (daher monofunktionellen) Molekülen verfügbar sind.
Zusätzlich könnte dieses Verfahren zum Zusammenbau von homomultimeren Proteinen auf der Oberfläche eines Bakteriums angewandt werden.
Beispiel 1
Konstruktion von Expressionsplasmiden
Schritt 1: Klonierung der S. aureus Protein A Verankerungsdomäne
Ein DNA-Fragment, das den Staphylococcus Protein A (SPA) Anker von S. aureus Stamm Cowan I NCTC 8530 codiert, wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern erhalten, die auf der publizierten Sequenz (Saiki et al., 1985) basieren. Durchgeführt wurde die PCR mit thermostabiler Vent DNA-Polymerase (New England BioLabs) in 100 μl vom Hersteller gelieferten Puffer, der jeweils 2,5 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 1 μM sense (und antisense) Primer und 1 μg genomische DNA enthielt, die aus S. aureus Stamm Cowan I NCTC 8530 mit Hilfe des Verfahrens von Marmur et al., (1961) isoliert wurde. Die sense und antisense Primer waren so gestaltet, dass sie Restriktionsendonuclease-Stellen für BamHI und XbaI an ihren 5'-Enden in dieser Reihenfolge enthalten, um die folgenden Klonierungsschritte zu erleichtern. Nach 20 Runden Denaturierung (94°C, 45 Sekunden), Primer-Assoziation (68°C, 30 Sekunden) und DNA-Polymerisierung (72°C, 45 Sekunden) wurde ein PCR amplifiziertes DNA-Produkt erwarteter Größe (621 bp) mittels Agarose-Gelelektrophorese detektiert. Das gereinigte DNA-Fragment wurde dann unter Verwendung von Standardverfahren kloniert und sequenziert (Maniatis). Die DNA-Sequenz des klonierten DNA-Fragmentes, das die C-terminale Region (nt 1043 bis 2252) von S. aureus Protein A codiert, war mit dem zuvor berichteten Fragment identisch (Shuttleworth et al.).
Schritt 2: Klonierung und Manipulation des Streptavidin-Gens
Streptavidin wurde als Reporter-Protein gewählt, um die Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. Streptavidin ist einfach zu detektieren und bindet bekanntlich Biotin, für das Antisera im Handel erhältlich sind. Die Streptavidin-Genfragmente wurden aus verschiedenen Plasmiden erhalten, in denen das Streptavidin-Gen mutiert worden war, um verschiedene Restriktionsendonuclease-Stellen am Beginn und Ende der codierenden Sequenz des reifen Proteins einzubauen.
Ein Genfragment, das die reife Form von Streptavidin codiert, wurde in Nael verdautes L. lactis Expressionsplasmid pLET2N ligiert (Steidler et al., 1995), um eine Fusion im Leserahmen der usp45 Signalsekretion-Signal-Leader (in pLET2N vorhanden) und der Streptavidin codierenden Sequenz zu erzeugen (1). Das resultierende Plasmid, als pL2SAX bezeichnet, kann zur Expression und Sekretion von Streptavidin in L. lactis verwendet sein (siehe unten). Plasmid pL2SAX, das die S. aureus Protein A C-terminale Verankerungsdomäne (als die X-Domäne bezeichnet) fusioniert an das 3'-Ende des Streptavidin-Gens in pL2SA enthält, wurde dann mittels Klonierung des PCR amplifizierten DNA-Fragmentes, das die Protein A Anker-Region codiert, konstruiert (siehe Schritt 1 und 1). Ein das pL2SAX beherbergender Lactococcus-Expressionsstamm exprimiert ein Streptavidin-Protein A C-terminale Domäne Fusionsprotein, das fest an die Zellwand angeheftet ist (siehe unten).
Expression von Streptavidin und Streptavidin-Protein A Fusionsproteinen in L. lactis
Plasmide pL2SA und pL2SAX wurden von E. coli Stamm MC1022 isoliert und zur Transformation mittels Elektroporation von L. lactis T7 Expressionswirtsstamm MG1820, der pILPol beherbergt, (Stamm UCP1000; Wells et al., 1993) verwendet. Expression von Streptavidin und Streptavidin-Protein A Fusionsprotein wurde in L. lactis durch Ersetzen von Lactose durch Glucose im Wachstumsmedium induziert (Steidler et al., 1995). Um die Expression von Streptavidin und den Streptavidin-Proteinprodukten in L. lactis zu detektieren, wurde Zellfraktionierung und Immunoblotting mit Zellen durchgeführt, die 3 Stunden induziert worden waren. Zehn Milliliter Zellen wurden zuerst mittels Zentrifugation pelletiert und der Überstand ein zweites Mal bei 100.000 g 1 Stunde zentrifugiert, um jegliches unlösliches Material zu entfernen. Proteinfraktionen wurden dann aus dem Hochgeschwindigkeitsüberstand mittels Phenolextraktion gewonnen, wie bereits beschreiben (Steidler et al., 1995). Die im ersten Schritt erhaltenen Zellpellets wurden drei Mal in Tris gepufferter Saline (TBS: 0,15 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl pH 7,5) gewaschen und in 250 μl 0,6 mg Lysostaphin (Sigma, St. Louis, USA) haltiger 10% Sucrose, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um die Zellwand enzymatisch zu verdauen.
Nach Behandlung mit Lysostaphin wurden die Zellen (als der Rückstand bezeichnet) von dem enzymatisch freigesetzten Zellwandmaterial mittels Zentrifugation getrennt und durch Erhitzen mit Laemmli Cracking-Puffer lysiert. Die Überstände, als die „Lysostaphin freigesetzte Proteinfraktionen" bezeichnet, wurden mit Cracking-Puffer ähnlich behandelt. Die aus dem Wachstumsmedium gewonnenen Proteine, Lysostaphin freigesetzte Fraktionen und Zellreste wurden mittels Immunoblotting mit Antisera gegen Streptavidin unter Anwendung von Standardverfahren analysiert. Es ist gezeigt worden, dass Lysostaphin Proteine spezifisch freisetzt, die an das Pentaglycin-Peptid gebunden sind, das im Peptidoglycan der Zellwand vorliegt (Schneewind et al., 1993).
Die Ergebnisse von Zellfraktionierung und Immunoblotting von Proteinen, die von pL2SA beherbergendem L. lactis Expressionsstamm UCP1000 gewonnen waren, zeigten, dass ein Protein mit der erwarteten Größe für Streptavidin produziert war und in das Wachstumsmedium von L. lactis sezerniert wurde. Streptavidin wurde nicht in den Gesamtzellproteinrückständen von Lysostaphin behandelten Zellen detektiert und nur Spurenmengen von Protein wurden in dem Lysostaphin freigesetzten Zellwandmaterial detektiert (siehe 2). Bei diesem Stamm mag der relativ kleine Anteil der Gesamtmenge an sezerniertem Streptavidin, das durch Behandlung der Zellen mit Lysostaphin freigesetzt wurde, eine Folgeerscheinung von Streptavidin sein, das nicht durch die Zellwand nach Transport durch die Zellmembran diffundierte.
Im Gegensatz zu diesen Feststellungen wurde das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein, das vom pL2SAX tragenden Stamm produziert wurde, nicht in das Wachstumsmedium sezerniert. Dieses Fusionsprotein war allerdings in beträchtlichen Mengen in dem Material vorhanden, das von der Zellwand mittels Lysostaphin-Behandlung freigesetzt wurde, was darauf hindeutet, dass es mit der Zellwand assoziiert worden war (2). Das Fusionsprotein wurde ebenfalls im Pellet (Rückstand) von Lysostaphin behandelten Zellen detektiert, was vermuten lässt, dass ein Teil des freigesetzten Proteins während der Inkubation mit Lysostaphin nicht nach außen von der Zellwand diffundiert hatte. Wenn gewaschene Zellen, die das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein exprimierten, in Laemmli Cracking-Puffer erhitzt wurden, hatte das mittels Immunoblotting detektierte Protein anscheinend ein Molekulargewicht, das höher war als das Protein, das im Überstand der Fraktion von Lysostaphin behandelten Zellen detektiert wurde (2). Dieses höhermolekulare Polypeptid mag ein Intermediat im Stoffwechselweg darstellen, was das Fusionsprotein sortiert und an der Zellwand verankert. Beide Formen des Proteins werden in der erhitzten Zellpellet (Rückstand)-Fraktion der Lysostaphin behandelten Zellen festgestellt, was darauf hindeutet, dass die eher vorsichtige enzymatische Behandlung der Zellen mit Lysostaphin nicht die höhermolekulare Form des Fusionsproteins in den Überstand freisetzt.
Zurschaustellung von Streptavidin auf der Oberfläche von L. lactis
Um zu zeigen, dass die Fusion von Streptavidin an die C-terminale Domäne von S. aureus Protein A zur Zurschaustellung des exprimierten Proteins auf der Zelloberfläche führen würde, wurden L. lactis Stämme, die Streptavidin oder das Streptavidin-Protein A Fusionsprodukt exprimieren, drei Mal in 1% bovines Serumalbumin (BSA) haltiger TBS gewaschen und dann mit biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (1 μg) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Kontrollproben der Zellen wurden ebenfalls mit biotinylierter Meerrettich-Peroxidase in Gegenwart von löslichem Streptavidin inkubiert, um zu zeigen, dass die Bindung an Zellen durch Kompetition mit dem freien Substrat gehemmt werden kann. Die Zellen wurden dann drei Mal mit 1% BSA haltiger TBS gewaschen und auf einem Cellulosenitrat-Filter mit Hilfe einer Vakuum-Apparatur geerntet. Das Binden von Biotin an die Zelloberfläche wurde durch Inkubation des Filters in einer TMB-Lösung (Meerrettich-Peroxidase-Substrat) gemäß Herstellerempfehlung nachgewiesen. Die Ergebnisse in 3 zeigen, dass das Biotin-Meerrettich-Peroxidase Konjugat an die Oberfläche intakter Zellen, die das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein exprimierten, aber nicht an Streptavidin exprimierenden Zellen band. Die Möglichkeit, dass das Biotin-Meerrettich-Peroxidase Konjugat nicht spezifisch an die Zelloberfläche von L. lactis Zellen bindet, die das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein exprimieren, kann ausgeschlossen werden, da ein Binden in Gegenwart von löslichem Streptavidin gehemmt war.
Spezifische immobilisierung von L. lactis Zellen, die Streptavidin auf ihrer Zelloberfläche exprimieren
Um eine feste Oberfläche für das spezifische Binden der Bakterienzellen bereitzustellen, die Streptavidin auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wurden Petri Schalen (20 mm, Maxisorp, Nunc, Dänemark) mit 1 μg/ml biotinylierter alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim, Deutschland) 1 Stunde in 1 ml TBS bei Raumtemperatur beschichtet. Nicht spezifische Bindungsstellen wurden dann durch Inkubation der Platten mit 1% BSA haltiger TBS 2 h bei Raumtemperatur blockiert. 10 ml Zellen, die entweder Streptavidin oder Streptavidin-Protein A Fusionsprotein exprimierten, wurden drei Mal in TBS gewaschen und in 1 ml 1% BSA haltiger TBS 1 Stunde bei Raumtemperatur resuspendiert. Während dieses Inkubationsschrittes wurden die Zellen durch 6 Sekunden Schütteln pro Minute in Suspension gehalten. Schließlich wurde die Zellsuspension auf 10 ml mit TBS verdünnt und 1 ml dieser Suspension zu vorbehandelten Petri Schalen (siehe oben) 1 Stunde bei Raumtemperatur gegeben. Die Petri Schalen wurden dann drei Mal mit 1 ml TBS 10 Minuten auf einem Rundschüttler gewaschen, bevor sie lichtmikroskopisch geprüft wurden. Die Ergebnisse (4 & Tabelle 1) zeigen, dass das Streptavidin-Protein A Fusionsprotein exprimierende L. lactis an die Oberfläche der mit Biotin-alkalischer Phosphatase beschichteten Petri Schale bindet aber nicht an Petri Schalen, die mit diesem Konjugat nicht behandelt waren. Zellen, die Streptavidin exprimierten und sezernierten, banden nicht an die Oberfläche von beschichteten oder nicht beschichteten Petri Schalen. Das Binden von Streptavidin-Protein A Fusionsprodukt exprimierenden Zellen wurde durch Zugabe von löslichem Streptavidin blockiert, was darauf hindeutet, dass das Binden spezifisch war und durch das Binden von Biotin an Streptavidin, das auf der Oberfläche der Zellen vorhanden war, vermittelt wurde (Tabelle 1).
Tabelle 1
Beispiel 2
Zurschaustellung von Tetanustoxin-Fragment C (TTFC) Antigen auf der Oberfläche von L. lactis
Dieses zusätzliche Beispiel liefert den Beweis, dass Protein-Antigene an die Oberfläche von L. lactis fest angeheftet werden können mittels Konstruktion chimärer Gene, die ein Fusionsprotein codieren, umfassend Nucleinsäure, die (1) ein N-terminales Sekretionssignal, (2) das Protein-Antigen, das auf der Oberfläche exprimiert werden soll, und (3) die Zellwandsortierungs- und Verankerungsdomäne von S. aureus Protein A codiert.
Schritt 1: Klonierung und genetische Manipulation von TTFC und der S. aureus Protein A Verankerungsdomäne
(1a) Konstruktion von pTREX und pTREX1
Synthetische Oligonucleotide, die eine mutmaßliche RNA stabilisierende Sequenz, eine Translationsinitiationsregion und eine multiple Klonierungsstelle für Ziel-Gene codieren, wurden durch Erhitzen von jeweils 20 μg Oligonucleotid in 200 μl 1 × TBE, 150 mM NaCl und Abkühlen lassen auf Raumtemperatur assoziiert. Assoziierte Oligonucleotide wurden unter Verwendung von Tfl DNA-Polymerase in 1 × Tfl Puffer, der 250 μM Desoxynucleotidtriphosphate und 1,5 mM MgCl₂ enthielt, jeweils 1 Minute bei 35°C, 45°C, 55°C und 65°C und anschließend 10 Minuten bei 72°C verlängert. Die sense und antisense Oligonucleotide enthielten die Erkennungsstellen für NheI und BamHI an ihren 5'-Enden in dieser Reihenfolge, um weiteres Klonieren zu erleichtern.
Das resultierende ds DNA-Fragment wurde mit NheI und BamHI geschnitten und zwischen den XbaI und BamHI Stellen in pUC19NT7 kloniert, ein Derivat von pUC19, das die T7-Expressionskassette von pLET1 (Wells et al., 1993c), kloniert zwischen den EcoRI und HindIII Stellen enthält. Das resultierende Konstrukt wurde als pUCLEX bezeichnet. Die vollständige Expressionskassette in pUCLEX wurde dann durch Schneiden mit HindIII und Erzeugen von stumpfen Enden entfernt, anschließend mit EcoRI geschnitten, bevor es in die EcoRI und SacI (stumpfes Ende) Stellen von pIL253 kloniert wurde, um den Vektor pTREX zu erzeugen. Um den Expressionsvektor zu konstruieren, wurde ein PCR-amplifiziertes DNA-Fragment, das den Lactococcus Promotor P1 enthielt, zwischen den in der Expressionskassette von Vektor pTREX vorhandenen EcoRI und BglII Stellen kloniert (5). Dieser Promotor war zuvor unter Verwendung der Promotor-Sonde Vektor pSB292 isoliert und durch Primer-Extension und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert worden (Waterfield et al., 1995).
(1b) Konstruktion von Plasmid pT1L2TT
Ein DNA-Fragment, das das Tetanustoxin-Fragment C Gen codiert und an die Lactococcus Signalsekretion-Leadersequenz des usp45 Gens fusioniert ist, wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Plasmid pLET2-TTFC als ein Template und den publizierten Sequenzen (Wells et al., 1993b) erhalten. Durchgeführt wurde die PCR mit thermostabiler vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) in 100 μl vom Hersteller gelieferten Reaktionspuffer, der jeweils 2,5 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 1 μm sense und antisense Primer (X) und ungefähr 50 ng Plasmid pLET2-TTFC als Template-DNA enthielt. Der antisense Primer war so gestaltet, dass er eine BamHI Stelle an seinem 5'-Ende enthielt, um die nachfolgenden Klonierungsschritte zu erleichtern. Nach 30 Runden Denaturierung (94°C, 45 Sekunden), Primer-Assoziierung (50°C, 30 Sekunden) und DNA-Polymerisierung (72°C, 120 Sekunden) wurde ein PCR amplfiziertes DNA-Produkt mit der erwarteten Größe (1478 bp doppelsträngiger DNA) mittels Agarose-Gelelektrophorese detektiert. Das gereinigte DNA-Fragment wurde dann mit Restriktionsendonuclease BamHI verdaut und in das Lactococcus Expressionsplasmid pTREX1 kloniert, das zuerst mit SphI geschnitten, stumpfe Enden erzeugt und dann mit BamHI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pT1L2TT bezeichnet und ist in 5 gezeigt.
(1c) Konstruktion von pT1TT
Ein Fragment vom Tetanustoxin-Fragment C (TTFC) wurde mittels PCR (unter Anwendung von Standardverfahren, siehe oben) erzeugt, das XbaI und BamHI Stellen am 5'- beziehungsweise 3'-Ende codierte. Ein Stopp-Codon wurde am 3'-Ende der TTFC-Sequenz vor der BamHI Stelle eingebaut. Das TTFC PCR-Fragment wurde zunächst zwischen der XbaI und BamHI Stelle von pUCLEX kloniert und dann durch Schneiden mit SphI-BamHI entfernt und wieder in SphI und BamHI verdautes pTREX1 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pT1TT bezeichnet und ist in 5 gezeigt.
(1d) Konstruktion von pTTA
Ein DNA-Fragment, das den Staphylococcus Protein A (SPA) Anker von S. aureus Stamm Cowan I NCTC 8530 codierte, wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die auf der publizierten Sequenz (X) basieren, erhalten. Die sense und antisense Primer waren so gestaltet, dass sie Restriktionsendonuclease-Stellen für BamHI unf BglII an ihren 5'-Enden in dieser Reihenfolge enthielten, um die nachfolgenden Sequenzierungsschritte zu erleichtern. Durchgeführt wurde die PCR mit thermostabiler vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) in 100 μl vom Hersteller gelieferten Reaktionspuffer, der jeweils 2,5 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP, 1 μm sense und antisense Primer (6) und ungefähr 50 ng Plasmid pL2SAX (näher in diesem Patent beschrieben) als Template-DNA enthielt. Nach 30 Runden Denaturierung (94°C, 45 Sekunden), Primer-Assoziierung (55°C, 30 Sekunden) und DNA-Polymerisierung (72°C, 35 Sekunden) wurde ein PCR amplifiziertes DNA-Produkt mit der erwarteten Größe mittels Agarose-Gelelektrophorese detektiert. Das gereinigte DNA-Fragment wurde dann mit Restriktionsendonucleasen BamHI und BglII verdaut und in Plasmid pT1L2TT kloniert, das zuerst mit BamHI geschnitten und unter Verwendung von Kälber intestinaler Phosphatase (Boehringer Mannheim) gemäß Herstelleranleitung dephosphoryliert worden war. Das resultierende, als pTTA bezeichnete Plasmid enthält die S. aureus Protein A C-terminale Domäne (als X-Domäne bezeichnet) an das 3'-Ende des TTFC-Gens fusioniert.
Schritt 2: Expression und Oberflächen-Präsentation des TTFC-Protein A Fusionsproteins in L. lactis
Um zu zeigen, dass die Fusion von TTFC an die C-terminale Domäne von S. aureus Protein A zur Präsentation des exprimierten Proteins auf der Zell oberfläche führen würde, wurden L. lactis Stämme, die TTFC intrazellulär exprimieren (d. h. sie tragen Plasmid pT1TT), TTFC sezernieren (d. h. sie tragen Plasmid pT1L2TT) oder das TTFC-Protein A Fusionsprodukt sezernieren (d. h. sie tragen Plasmid pTTA), mittels Zentrifugation geerntet, drei Mal in 1% BSA haltiger TBS (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) gewaschen und dann mit 1 μg Kaninchen-anti-TTFC 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann drei Mal mit 1 ml TBS gewaschen und in 1 ml TBS resuspendiert. Die Zellen in 100 μl dieser Zellsuspension wurden auf einer Cellulosenitrat-Membran (0,22 μm) mit Hilfe einer Vakuum-Apparatur geerntet. Die Membran wurde dann 1 Stunde bei Raumtemperatur in 5 ml PBS-2,5% Magermilchpulver, enthaltend 5 μg anti-Kaninchen IgG an Meerrettich-Peroxidase konjugiert (Boehringer Mannheim), inkubiert. Das Binden von anti-Kaninchen-Peroxidase an Kaninchen anti-TTFC-Antikörper, die auf der Oberfläche von intakten L. lactis Zellen gebunden waren, die pTTA aber nicht pT1L2TT und pT1TT trugen, wurde durch Inkubation des Filters in einer TMB-Lösung (Meerrettich-Peroxidase Substrat) gemäß Herstelleranleitung detektiert. Die in 7 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass TTFC nur auf der Oberfläche intakter Zellen, die das TTFC-Protein A Fusionsprotein exprimieren, detektiert wird.
Referenzen

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Claims

Rekombinanter Vektor, der eine Nukleinsäure beinhaltet, die ein Fusionsprotein kodiert, das eine Sekretionssignal-Sequenz, ein erwünschtes Protein oder Polypeptid und eine Zellwand-Anheftungsdomäne umfasst, wobei diese Domäne wenigstens die C-terminale Verankerungsdomäne umfasst, welche von dem Protein A von Staphylococcus aureus abgeleitet ist, wobei der Vektor dadurch gekennzeichnet ist, dass das Sekretionssignal vom usp45-Protein abgeleitet ist, so dass, wenn ein Lactococcus lactis-Wirtsorganismus mit diesem Vektor transformiert und das Fusionsprotein exprimiert wird, das erwünschte Protein oder Polypeptid auf der äußeren Oberfläche der Zellwand des Wirts angeheftet und zur Schau gestellt wird.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure, die das Fusionsprotein kodiert, operativ an Kontrollsequenzen gekoppelt ist, die seine Expression regulieren.
Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure ferner ein unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehendes T7- oder T7-ähnliches Polymerase-Gen umfasst, wobei dieser Promotor der Fusionsprotein-kodierenden Nukleinsäure vorgeschaltet zur Verfügung gestellt wird.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert wird, transformiert ist.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid exprimiert wurde und kovalent an die Zellwand angeheftet ist und auf der äußeren Seite der Oberfläche des Wirtsorganismus zur Schau gestellt wird.
Verfahren, einen Lactococcus lactis-Wirtsorganismus herzustellen, der ein erwünschtes Protein oder Polypeptid auf seiner Oberfläche zur Schau stellt, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, Lactococcus lactis mit einer rekombinanten Nukleinsäure zu transformieren, die ein Fusionsprotein kodiert, das (i) eine Sekretionssignal-Sequenz, welche von der Signal-Sequenz des Proteins usp45 abgeleitet ist, (ii) ein erwünschtes Protein oder Polypeptid und (iii) eine Zellwand-Anheftungsdomäne umfasst, die wenigstens die C-terminale Verankerungsdomäne umfasst, welche von dem Protein A von Staphylococcus aureus abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, welches die Transformation von Lactococcus lactis, mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfasst.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid wenigstens ein Epitop beinhaltet, von dem gewünscht wird, dass es eine immunologische Reaktion hervorrufen soll.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 8, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid ein Immunogen eines Pathogens, ein Antigen oder ein Adhäsin, ist.
Vakzin, das einen Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9 in einem Gemisch mit einem geeigneten Träger umfasst.
Verwendung eines Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 8 oder Anspruch 9 für die Zubereitung des Vakzins.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid ein solches ist, für das gewünscht wird, dass es Toleranz auslöst.
Verwendung eines Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 12 für die Zubereitung eines Medikaments, das eine Toleranz gegenüber dem Protein oder Polypeptid auslöst.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid ein biologisch aktives Molekül ist.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 14, wobei das biologisch aktive Molekül ein Arzneimittel, ein Hormon, ein Enzym oder ein DNA/RNA-bindendes Protein ist.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid eine Ziel-bestimmende Gruppe ist, welche die Bindung des Wirtsorganismus an die Zielstelle reguliert.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 16, wobei die Ziel-bestimmende Gruppe ein Antikörper oder ein Fragment davon ist, der/das an ein Zielantigen oder an ein Hapten bindet oder ein Adhäsin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß einem der Ansprüche 4, 5, 12 oder 14 bis 17 umfasst.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß einem der Ansprüche 4, 5, 8, 9, 12 oder 14 bis 17 für die Verwendung in der Medizin.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid ein spezifischer Bindungspartner eines Liganden ist.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 20, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid den Wirtsorganismus an eine feste Oberfläche bindet.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 21, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid Streptavidin und der Ligand Biotin oder ein Biotinkonjugat ist.
Verfahren für die Immobilisierung eines Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, den Wirtsorganismus mit einer Oberfläche in Kontakt zu bringen, auf welcher der Ligand immobilisiert wurde.
Verwendung eines Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 für die Aufreinigung oder Separation eines Liganden.
Verwendung eines Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5 für den Nachweis von Komplexen, die einen spezifischen Liganden haben, wobei die Nukleinsäure ferner ein Gen umfasst, das zu einer Reporteraktivität führt, wenn es exprimiert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 25, wobei die Reporteraktivität ein fluoreszierendes Protein oder Luciferase und das erwünschte Protein Streptavidin ist.
Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das erwünschte Protein oder Polypeptid ein Enzym ist.
Zusammensetzung, die einen Lactococcus lactis-Wirtsorganismus gemäß Anspruch 27 umfasst, wobei das Enzym exprimiert wurde und auf der Zelloberfläche des Wirtsorganismus zur Schau gestellt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 28 in einer Reaktion, die durch das Enzym katalysiert wird.
Verfahren für die Durchmusterung einer Antikörper- oder Antigen-Bank oder einer Bank aus Fragmenten davon, das die Schritte umfasst, (i) den Lactococcus lactis-Wirtsorganismus mit Nukleinsäuren zu transformieren, die ein Fusionsprotein der Antikörper oder Antigene oder Fragmente davon und eine Zellwand-Verankerungsdomäne kodieren, die wenigstens die C-terminale Verankerungsdomäne umfasst, welche von dem Protein A von Staphylococcus aureus abgeleitet ist und (ii) das Fusionsprotein auf der Zelloberfläche zu exprimieren.