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Bereich der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Biotechnologie und genauer die Herstellung
von rekombinanten heterologen Proteinen durch Mikroben. Insbesondere
betrifft diese Erfindung die Sezernierung von löslichen, biologisch aktiven
heterologen Proteinen in das Periplasma und/oder auf eine Oberfläche/in ein
Kulturmedium von Gramnegativen Bakterien. Die Erfindung nutzt das
Sezernierungssystem von Gramnegativen Bakterien einschließlich periplasmatischen
Chaperonen und Usher/Sekretin-Proteinen des Systems.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
kommerzielle Produktion verschiedener medizinisch und industriell
wertvoller rekombinanter Proteine durch Mikroben ist eine der Schlüssel-Herausforderungen
der modernen Biotechnologie. Sogar obwohl solche Systeme bekannt
sind, gibt es schwerwiegende technische Probleme, auf die man innerhalb
der Nutzung der mikrobiellen Zellmaschninerie im großen Ausmaß trifft.
Es gibt bei Gram-negativen Bakterien verschiedene Sezernierungssysteme,
die potenziell für
die Sezernierung rekombinanter heterologer Proteine genutzt werden
können.
Die Systeme werden nachstehend kurz dargestellt.
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1. Sezernierung über die
innere Membran
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Die
Mehrzahl der in Escherichia coli sezernierten Proteine wird als
Vorläufer
mit einem klassischen N-terminalen Signalpeptid (SP) synthetisiert,
das für
den wirksamen Export wichtig ist und das während oder nach der Translokation über die
innere Membran gespalten wird. Die Translokation wird durch die
Sec-Translokase (SecA/Y/G/E) vermittelt. SecA ist eine peripher
assoziierte ATPase, die mit der Signalsequenz und dem reifen Teil
des Vorläufers
interagiert, das Polypeptid in den Translokator leitet und Energie
für das
Verfahren bereitstellt. Sec Y, E und G sind integrale Membranproteine,
die den Translokator selbst und einen zentralen wässrigen
Kanal bilden, durch den das Polypeptid transloziert wird. SecD und
F haben große
periplasmatische Domänen.
Vorgeschlagene Funktionen dieser beiden Proteine betreffen spätere Schritte
in dem Verfahren und schließen
die Freisetzung von der Membran und die Vermittlung des Energietransfers
von der protonenmotorischen Kraft ein. Polypeptide werden im „ungefalteten" Zustand überführt Somit
ist SecB ein cytosolisches Chaperon, das offensichtlich dem Sezernierungsweg
angehört,
der für
den Export einer Untergruppe an sezernierten Proteinen benötigt wird.
SecB hemmt sowohl eine prämature
Faltung und lenkt den Vorläufer
zu dem Membran-Translocase-Komplex. Es scheint nun, dass grundsätzliche
Prinzipien des Exportsystems universell sind. Obwohl die Translokation
in eukaryontischen Systemen vor allem co-translational ist und die
Lenkung zu dem Sezernierungsapparat vor allem über SRP (Signalerkennungsteilchen)
geht, ist der Kern-Translokator in beiden Systemen homolog (Hefe-Sec
61 α und γ sind Homologe
von Sec Y/E von E. coli). Ebenso sind E. coli-ffh und –4.5S-RNA zur eukaryontischen
54 kD-Untereinheit beziehungsweise zur 7S-RNA von SRP homolog. Über einen
Vergleich der eukaryontischen und prokaryontischen Systeme wurde
kürzlich
ausführlich berichtet
(Rapoport, T. et al. (1996) Annual Review of Biochemistry. 65:271–303; Schatz,
G., und B. Dobberstein (1996) Science. 271:1519–1526).
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Ähnlichkeiten
in der Basis-Funktion eukaryontischer und bakterieller Exportsysteme
bedeuteten, dass einige Säugerproteine
in das Periplasma von E.coli erfolgreich sezerniert werden können. Beispiele
umfassen menschliches Insulin. Oft wird jedoch eine Feineinstellung
wie die Optimierung des N-Terminus des reifen Proteins, die Entfernung
von positiv geladenen Resten am Ende des SP oder am Anfang des reifen
Proteins benötigt,
so dass das Vorhandensein einer guten Spaltstelle gewährleistet
wird. Häufig
wurde ein bakterielles Signalpeptid wie das OmpA-SP verwendet. Die
Caf1-Signalsequenz wurde ebenfalls erfolgreich verwendet, um Säuger-Cytokine
zu exportieren (siehe nachstehend). Ein Hauptproblem bei der rekombinanten
Expression in E. coli ist die unkorrekte Faltung mit einhergehendem
Proteinabbau oder -anhäufung
in einer unlöslichen
und inaktiven Form als Einschlusskörper.
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Zusätzlich zu
dem von sec abhängigen
Sezernierungssystem gibt es mindestens zwei weitere Systeme der
Protein-Translokation über
die innere Bakterienmembran. Das M13-Phagen-Hüllprotein wird ebenfalls mit
einem zusätzlichen
SP synthetisiert, jedoch ist die Anordnung dieses Proteins über die
Membran unabhängig
von der sec-Maschinerie. Kürzlich
wurde ein neuer Pfad, der an der Sezernierung von Cofaktor enthaltenden
Proteinen beteiligt ist, entdeckt (Santini, G., et al., (1998) EMBO
Journal 17:101–112;
Weiner, J. et al. (1998) Cell. 93:93–101). Proteine, die diesem
Pfad folgen, haben einen langen Leader, der ein charakteristisches „Zwillingsarginin"-Motiv enthält. Es ist
anzunehmen, dass eine Cofaktor-Anheftung im Cytosol vorkommt und
dass das vollständig
gefaltete Protein über
die innere Membran über
Produkte des mttABC-Operons transloziert wird. Zusätzlich gibt
es cytosolische Proteine von E. coli, die anscheinend an einer bevorzugten
Stelle lokalisiert sind, die auf osmotischen Schock empfindlich
ist. Deshalb kann es einen transienten Zugang zum Periplasma geben.
Solche Proteine umfassen Thioredoxin (Lunn, C.A., und V.P. Pigiet.
(1982) J. Biol. Chem. 257:11424–11430),
das bei der Disulfid-Reduktion von zellulären Bestandteilen beteiligt
ist, das cytosolische Chaperon DnaK (Yaagoubi, A. et al., (1994)
Journal of Bacteriology. 176:7074–7078), den Elongationsfaktor Tu
(Jacobson, G. et al. (1976) Biochemistry. 15:2297–2303) und
an die innere Membran gebundene Bestandteile des Enterobactin-Synthase-Komplexes
(Hantash, F., et al. (1997) Microbiology. 143:147–156) sowie
die Anordnung der Kapsel (Rigg, G., et al. (1998) Microbiology.
144:2905–2914).
Es wurde angenommen, dass dieses „Kompartiment" mit der transienten
Bildung von Anheftungszonen zwischen den bakteriellen inneren und äußeren Membranen
in Verbindung stehen könnte,
es ist jedoch weder hinsichtlich der Eigenschaften des Proteins,
das sie zu dieser Stelle lenkt, noch über die physikalische Natur
dieses „Kompartiments" etwas bekannt. Eine
Anzahl an „cytosolischen" rekombinanten Proteinen
(d.h. ohne SP) verhält
sich auch auf eine ähnliche
Weise und wird somit vermutlich auf dieselbe zelluläre Stelle
gelenkt. Diese umfassen die GST-Fusionsproteine, Interleukin 1β (Joseph-Liauzun,
E., et al. (1990) Gene. 86:291–295).
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Petrovskaia
et al. (Bioorganicheskaia Khimiia, 1995, 21:912–919) offenbaren die Sezernierung
von rekombinantem menschlichem Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor
(GM-CSF) in E. coli-Periplasma. Dies wird durch die Fusion des Signalpeptids
von Kapsel-Antigen von Yersinia pestis (Caf1) mit der Aminosäuresequenz
von GM-CSF erreicht.
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Pérez-Pérez et
al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 210:524–529) beschreiben
andererseits die Co-Expression der cytoplasmatischen Chaperone DnaK/DnaJ
bei der Verbesserung der Sezernierung von rekombinantem hG-CSF in
das Periplasma. Auch die EP-Patentanmeldungen 0 885 967 und 0 774
512 offenbaren die Verwendung von cytoplasmatischen Chaperonen bei
der Expression von Proteinen.
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2. Extrazelluläre Sezernierungssysteme
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In
Gram-negativen Bakterien wurden sechs verschiedene Pfade des Exports
von extrazellulären
Proteinen identifiziert. Jeder Pfad wurde bei unterschiedlichen
Typen von Bakterien identifiziert. Die Grundeigenschaften dieser
Systeme sind in 1 aufgelistet (ein Überblick
wurde kürzlich
von Lory (Lory, S. (1998) Current Opinion in Microbiology. 1:27–35) gegeben).
Der Pfad vom Typ II, von dem man annimmt, dass er die Hauptendverzweigung
des sec-abhängigen
Pfads ist, wird für
den Export vieler verschiedener nicht miteinander in Beziehung stehender
löslicher
Proteine verwendet. Er beteiligt ein gefaltetes periplasmatisches
Zwischenprodukt und benötigt
etwa 12 geeignete Gene für
den Export durch die OM. Zu dem sec-Pfad alternative terminale Verzweigungen
umfassen einen spezifischen Chaperonabhängigen Zusammenbau der Fimbrien und
den OM-Helferweg. Ersterer Pfad beteiligt ebenfalls ein periplasmatisches
Zwischenprodukt (zumindest teilweise gefaltet), jedoch wird das
sezernierte Polypeptid in diesem Fall assoziiert mit seinem eigenen
Chaperon/äußere Membran-Usher-Proteinsystem
spezifisch transportiert. Äußere Membran-Helfer
falten sich mit einhergehendem Aussetzen der Effektor-Domäne an der
Zelloberfläche
in die äußere Membran
und, im Fall von IgA-Protease,
setzen über
Eigenhydrolyse frei. Es wurde gezeigt, dass die Interaktion mit
allgemeinen periplasmatischen Chaperonen, z.B. DsbA, für viele
sec abhängige
Proteine ein kritischer Schritt im Sezernierungsweg ist.
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Typ
I, Typ III- und die meisten Angehörigen des Typ IV-Pfads sind
von sec unabhängig
und vermitteln die Sezernierung eines spezifischen Proteins (Untergruppe
von Proteinen) oder DNA (Typ IV) direkt vom Cytosol. Typ I ergibt
die Sezernierung in das externe Medium, wohingegen Typ III nach
einer kontaktstimulierten Aktivierung des Sezernierungssystems das
sezernierte Protein direkt in die eukaryontische Zelle lenkt. Der
Typ III-Pfad teilt auch viele Merkmale mit den flagellären Zusammenbausystemen.
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3. Sezernierung von rekombinanten
heterologen Proteinen in Gram-negativen Bakterien
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Eine
unkorrekte Faltung der Proteine im Cytosol kann zu einem Abbau oder
der Bildung von miss-gefaltetem Protein als Einschlusskörper führen. Es
ist deshalb in vielen Beispielen wünschenswert, eine heterologe
Expression von rekombinanten Proteinen im bakteriellen Periplasma,
an der Zelloberfläche
oder in den extrazellulären
Medien zu haben, was eine korrekte Faltung und Bildung eines funktionellen
Produkts erlaubt. Proteine, die in das Periplasma von E. coli sezerniert
werden, sind im Vergleich zu der reduzierenden Umgebung des Cytosols
in einer oxidierenden Umgebung. Das Periplasma enthält Oxidoreduktasen
und Chaperone (Disulfid-Bindungs-Isomerase, DsbA und C, Peptidyl-prolyl-cis-transisomerase,
RotA, SurA und FkpA), die für die
richtige Faltung von Proteinen wichtig sind (Missiakis, D., und
S. Raina (1997) Journal of Bacteriology 179:2465–2471). Zusätzlich würden rekombinante Proteine,
die in dem Periplasma exprimiert oder in das extrazelluläre Medium
sezerniert werden, einen hohen prozentualen Anteil des Endproteingehalts
dieser jeweiligen Kompartimente darstellen. Somit sollte die Sezernierung
des Produkts in das Periplasma oder extern die Reinigungsprotokolle
stark erleichtern, wenn das Endziel ist, ein gereinigtes rekombinantes
Produkt zu erhalten. Obwohl einige Systeme für die periplasmatische Lokalisierung
von Proteinen verfügbar
sind, gibt es kein Hauptsystem für
die Sezernierung von extrazellulären
Produkten aus E. coli. Während
der letzten 10 Jahre gab es auch ein starkes Interesse an der Expression
von Proteinen und Peptiden auf der Oberfläche von Mikroorganismen. Phagen-Display-Technik
(Winter, G. et al. (1994) Annual Review of Immunology 12:433–455) verwendet
das Hüllprotein
von filamentösen
Bakteriophagen für
das Oberflächen-Display
von Proteinen oder Peptiden. Derartige Verfahren wurden bei der
Isolierung von spezifischen Antikörperfragmenten und der schnellen
Identifikation von Peptid-Liganden angewendet. Das Interesse an
dem Oberflächen-Display
bei E. coli (Georgiou, G. et al. (1993) Trends in Biotechnology.
11:6–10)
und anderen Gramnegativen Bakterien zentrierte sich um die Identifikation
von protektiven Epitopen und ihren Anwendungen als Lebend-Vakzine,
der Herstellung von bakteriellen Adsorptionsmitteln und Ganzzellen-Biokatalysatoren.
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Obwohl
es einigen Erfolg bei der Expression von Proteinen gab, gibt es
eine Anzahl von Beschränkungen
innerhalb der vorhandenen Systeme, wie nachstehend erörtert.
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Die
meisten sekretorischen/Zusammenbauwege von E. coli wurden auf ihre
potenzielle Nutzung als Sezernierungsvehikel für heterologe Proteine hin untersucht.
Diese umfassen Systeme, die das Protein in das Periplasma, an die
Zelloberfläche
oder in das extrazelluläre
Medium steuern.
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3.1 SP allein
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Mehrere
Expressionsvektoren verwenden ein bakterielles SP (häufig das
des OM-Proteins OmpA), um den Export über die innere Membran zu vermitteln.
Das Ziel des Proteins hängt
von der Beschaffenheit des Proteins selbst ab. Es ist nicht unüblich für Proteine,
die in großen
Mengen auf diesem Weg exportiert werden, als Ergebnis unvollständiger Faltung
unlösliche
Komplexe, Einschlusskörper,
im Periplasma zu bilden.
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3.2 Affinitätsreinigungs-Systeme
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Fusions-Expressionssysteme
wurden entwickelt, um die Reinigung von rekombinanten Produkten stromabwärts zu erleichtern.
Beispiele umfassen die Insertion einer His-Markierung für die Reinigung
auf einer Nickel-Säule
(Clontech, Qiagen, In vitrogen); Fusion mit MalE (New England Biolabs),
Maltose-Bindungsprotein
mit nachfolgender Reinigung auf einer Amylose-Säule; Thioredoxin-Fusionen mit PAO
(Phenylarsinoxid)-Harz und Chitin-Bindungsdomänenfusionen mit Chitinsäulen (New
England Biolabs). Durch den Einschluss oder den Ausschluss von SP
in den Vektor können
einige dieser Systeme (z.B. MalE, His-Markierung) für die periplasmatische
beziehungsweise cytosolische Expression adaptiert werden. Im Allgemeinen
enthalten solche Vektoren eine hochspezifische Protease-Spaltstelle
für die
Reinigung des Produkts stromabwärts. Fusionen,
die in beiden Domänen
funktional sind, z.B. MalE und sezernierte Domäne, können erhalten werden. Dies
hängt jedoch
von der Beschaffenheit des Proteins ab. Die Träger-Domäne kann mit der Faltung des rekombinanten
Proteins interferieren, was einen Proteinabbau, Unlöslichkeit
des Proteins auf Grund von Membran-Assoziierung oder die Bildung
von unlöslichen
Einschlusskörpern
bei höheren
Konzentrationen zur Folge hat.
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3.3 Oberflächen-Display
in E. coli
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Die
Insertion von Epitopen in Haupt-OM-Proteine (OmpA, LamB, PhoE),
Flagellen, Fimbrien. Diese Systeme beteiligen die Insertion von
Epitopen in eine permissive Stelle, d.h. Oberflächenschleife innerhalb von OM-Proteinen
oder Geißel-Fimbrien-Untereinheiten,
ohne die Anordnung des Membranproteins oder der Oberflächen-Anhängsel zu
beeinträchtigen.
Im Allgemeinen gibt es beträchtliche
Größenrestriktionen
der Insertion (10–60
Aminosäuren),
um Auswirkungen auf die Faltung und Anordnung des Proteins zu vermeiden. Es
gibt Berichte über
Oberflächen-Displays
ganzer Proteine durch die Herstellung terminaler Fusionen an einen
Teil des äußeren Membranproteins,
OmpA oder der IgA-Protease. Unter Verwendung eines Lpp-OmpA-Vektors
wurden zu der Oberfläche
von E. coli vollständige
Enzyme befördert,
die das Potenzial zum Oberflächen-Display
boten; diese Konstruktionen führten
jedoch zum Aufbrechen der äußeren Membran
mit einhergehender Toxizität
für die
Zelle und Entweichen von periplasmatischen Bestandteilen. Zusätzlich folgen
die Fusionsproteine dem Anordnungsweg der Proteine der äußeren Membran.
Dies begrenzt die maximale Anzahl an Oberflächenmolekülen und, was noch wichtiger
ist, es ist offensichtlich, dass vollständig gefaltete Proteine, die
Disulfidbindungen besitzen, nicht über diesen Weg über die äußere Membran
angeordnet werden können (Klauser,
T. et al. (1990) EMBO Journal. 9:1991–1999; Stathopoulos, C., et
al. (1996) Applied Microbiology and Biotechnology. 45:112–119).
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3.4. Extrazelluläre Sezernierung
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Es
gab eingeschränkte
Berichte über
die extrazelluläre
Sezernierung von nicht verwandten Proteinen durch einige der vorstehend
erwähnten
Sezernierungswege. Der Hly-Typ I-Sezernierungsweg wurde an die Freisetzung
von heterologen Antigenen adaptiert (Gentschev, I, et al. (1996)
Gene 179:133–140).
Obwohl offensichtlich erfolgreich, setzt dieses System Proteine
direkt aus dem Cytosol frei und würde jedes Protein ausschließen, das
für die
korrekte Faltung, z.B. die Bildung der Disulfidbindung, den Kontakt
mit dem periplasmatischen Raum benötigt.
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Nachstehend
sind einige der schwerwiegenden Rückschläge zusammengefasst, die mit
der rekombinanten Proteinexpression in Verbindung stehen:
- (i) Periplasmatische Expressionssysteme: Viele
heterologe Polypeptide, die in E. coli exporimiert werden, werden
entweder abgebaut oder sie bilden als ein Ergebnis der unkorrekten
Faltung Aggregate und Einschlusskörper. Dies kann auftreten,
obwohl das Protein auf eine bevorzugte Stelle, z. B. das Cytosol
(mit einer eher reduzierenden Umgebung) oder das Periplasma (mit
einer eher oxidierenden Umgebung und spezifischen Chaperonen, die
an der Faltung beteiligt sind) gerichtet ist. Die Verwendung einer
Signalsequenz bei Proteinen, die auf das Periplasma gerichtet sind,
ergibt verschiedene Wirksamkeitsgrade hinsichtlich der Prozessierung
des Vorläufers,
der Vervollständigung
der Translokation und der korrekten Faltung. Einige unkorrekt gefalteten
Proteine bleiben mit der inneren Membran verbunden und induzieren
Toxizität.
Zusätzlich
werden sie stark abgebaut, was einen geringen Ertrag ergibt. Andere
häufen
sich in einer unnatürlichen
Konformation als unlösliche
Aggregate an. Systeme, die Fusionsproteine verwenden, sind verfügbar. Diese
können
in einigem Umfang die Löslichkeit
einiger rekombinanter Proteine verstärken, jedoch bleiben andere
auf Grund von unvollständiger
Faltung der heterologen Domäne
unlöslich.
Ein System, das nach der Translokation über die innere Membran zur
Stimulierung des frühen
Faltungsereignisses führte,
würde deutlich
die periplasmatische Expression vieler heterologer Polypeptide,
die sich bis jetzt einer erfolgreichen Expression in E. coli entzogen
haben, ermöglichen.
- (ii) Oberflächenlokalisation
in Gram-negativen Bakterien: im Allgemeinen gibt es eine strenge
Begrenzung der Größe von Epitopen,
die an der Zelloberfläche
unter Verwendung von nachgewiesenen Oberflächen-Expressionsvektoren exprimiert
werden können.
Systeme, die die Oberfläechnexpression
von ganzen Domänen
oder Proteinen gewährleisten,
indem sie sie an ein äußeres Membranprotein
fusionieren, führen
zur Permeabilisierung der Membran, Entweichen aus dem Periplasma
und Toxizität.
Zusätzlich
gibt es Beschränkungen
hinsichtlich der Menge, in der Proteine gefaltet werden können, wenn
sie über
diesen Pfad exportiert werden müssen.
Schließlich
sind diese Systeme, da sie alle integrale Membranproteine verwenden,
hinsichtlich der maximalen Expressionsmenge beschränkt und
es wäre
sehr aufwändig,
sie zu reinigen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Bakterienstämme für die Sezernierung von löslichen,
biologisch aktiven rekombinanten heterologen Proteinen in das Periplasma
oder auf eine Oberfläche/in
ein Kulturmedium von Bakterien zur Verfügung. Die Erfindung nutzt das
Sezernierungssystem von Gram-negativen Bakterien einschließlich periplasmatischer
Chaperone und Usher/Sekretinproteine. Um das Ziel zu erreichen,
exprimieren die Bakterienstämme
gleichzeitig das Fusionsprotein (Signalpeptid)-(reifes heterologes
Protein)-(Untereinheit einer bakteriellen Oberflächenstruktur, Caf1), periplasmatische
Chaperon, das für
die Untereinheit spezifisch ist, und das Usher/Sekretinprotein der äußeren Membran,
das für
die Untereinheit spezifisch ist. Die Sezernierung der Fusionsproteine:
(Signalpeptid von Caf1)-(reifes menschliches IL-1β)-(reifes
Caf1), (Signalpeptid von Caf1)-(reifes menschliches GM-CSF)-(reifes
Caf1) und (Signalpeptid von Caf1)-(reifes menschliches IL-1ra)-(reifes
Caf1), die gleichzeitig mit dem periplasmatischen Chaperon Caf1M
und dem Usher/Sekretinprotein Caf1A in Escherichia coli exprimiert
wurden, sind Beispiele für
die Verwendung der Erfindung.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1.
Extrazelluläre
Sezernierungsproteine in Gram-negativen Bakterien. Hauptbestandteile
umfassen: (i) Typ I (z.B. HlyA) – innere Membran (IM) ABC-Transporter (Hly
B und D) + ein äußeres Membran (OM)-Protein
(Tol C), kein periplasmatisches Zwischenprodukt nachgewiesen; (ii)
Typ II (z.B. Pullulanase) – Sec-System
für Translokation
durch IM; Translokation über
OM – 14
pul-Genprodukte
einschließlich
eines OM-Sekretins (PulC, S), acht IM-pul-Produkte (Pul C, E, F,
K-O) und vier Prepilin-ähnliche
Produkte (Pul G-J), Tatsachen unterstützen periplasmatisches Zwischenprodukt;
(iii) Typ III (z.B. Yops) – 24
Ysc-Proteine einschließlich
eines OM-Sekretins (YscC) und IM-ATPase (YscN), spezifische cytosolische
Syc-Chaperone und Yop B und D, die für die Freisetzung an eukaryontische
Zellen benötigt
werden (iv) Typ IV – neu
klassifizierte Gruppe einschließlich
Systeme, die beim DNA-Transfer in Pflanzen oder andere Bakterienzellen
beteiligt sind (z.B. T-DNA von Agrobacterium tumefaciens, 1l virB-Gene, die wahrscheinlich
nicht über
ein periplasmatisches Zwischenprodukt gehen) und beim Pertussis-Toxinexport
beteiligt sind (9 ptl-Gene, wahrscheinlich periplasmatische Anordnung
von Toxin. (v) OM-Helfer (z.B. IgA-Protease) – Sec-System für die Translokation über die
IM; keine spezifischen Begleitproteine; verwendet eine 'Helferdomäne' innerhalb des Proteins,
die voraussichtlich dem OM-Protein-Zusammenbauweg
folgt und sich in die OM faltet, wobei die sezernierte Domäne auf der
Oberfläche
exponiert wird; (vi) Spezifische, Chaperon-vermittelte Anordnung
(z.B. Pap pili) – Sec-System
für Translokation über die
IM; Translokation über
die OM – periplasmatisches
Chaperon (PapD), die Pilin-Untereinheiten, OM-Usher/Sekretinprotein (PapC) homolog
zu PulC bzw. Ysc von TypII- bzw. TypIII-Pfaden spezifisch erkennt.
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2.
Konstruktion von Hybridgenen, die s.p.Caf1-hIL-1β-Fusionsproteine
codieren.
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3. Expression von s.p.Caf1-hIL-1β-Fusionsproteinen.
A. Mit Coomassie-Blau gefärbte
SDS-PAGE von löslichen
(Bahnen 2–5)
und unlöslichen
(Bahnen 6–9)
Proteinen von E. coli-Zellen, die mit pKKmod (Bahnen 2, 6), pKKmod/s.p.Caf1-hIL-1β (Bahnen 3, 7), pKKmod/s.p.Caf1(–2)-hIL-1β (Bahnen 4, 8), und pKK/s.p.Caf1(+3)-hIL-1β (Bahnen
5, 9) transformiert sind. HIL-1β wurde
als Kontrolle aufgetragen (Bahnen 1, 10). B. Immun-Blots desselben
Gels, analysiert mit polyclonalen anti-hIL-1β-Kaninchenantikörpern. Die
Positionen von nicht prozessiertem (I) und prozessiertem (II) hIL-1β sind durch
Pfeile gezeigt.
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4 Sezernierung von s.p.Caf1-hIL-1β-Fusionsproteinen.
Immun-Blots von periplasmatischen (A) und löslichen cytoplasmatischen (B)
Proteinen von s.p.Caf1(+3)-hIL-1β- (Bahn 1), s.p.Caf1(–2)-hIL-1β- (Bahn 2) und s.p.Caf1-hIL-1β(Bahn 3)
Expressionsstämmen.
Entsprechende Proteine von Zellen, die pKKmod beherbergen, wurden
für den
Vergleich (Bahn 4) verwendet. HIL-1β wurde als Kontrolle aufgetragen
(Bahn 5). Die Proteine wurden mit polyclonalem anti-hIL-1β-Kaninchenantikörper. analysiert.
Die Positionen von nicht prozessiertem (I) und prozessiertem (II)
hIL-1β sind
durch Pfeile gezeigt.
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5.
Trypsinabbau von permeabilisierten Zellen. Unlösliche Proteine (Bahn 1–2) und
lösliche
Proteine (Bahn 3–4)
wurden von s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Expressionszellen vor (Bahnen 1, 3)
und nach (Bahnen 2, 4) Trypsinbehandlung erhalten.
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6.
Konstruktion von pCIC-Plasmid, das das s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Caf1-Fusionsprotein codiert.
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7.
Die N-terminale Sequenz von reifem CIC. Nach teilweiser Reinigung
von periplasmatischen Fraktionen auf einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia,
Schweden) wurden Proteine durch SDS-PAGE getrennt, gefolgt von Blotting
auf eine PVDF-Membran (Amersham, UK). Die gewünschten Banden wurden ausgeschnitten
und auf einen mit Polybren beschichteten, und vorher eingesetzten
Glasfaserfilter gegeben. Aminosäure-Sequenzanalysen
wurden mit einem Proteinsequenzierungsgerät von Applied Biosystems, Modell
477A, durchgeführt,
das mit einem on-line Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalysegerät von Applied
Biosystems, Modell 120A, ausgestattet war.
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8. Caf1M ermöglicht die Expression von s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Caf1 (CIC). A. Mit Coomassie-Blau
gefärbte
SDS-PAGE der periplasmatischen Fraktion von Zellen, die mit: pCIC
(Bahn 1), pFMA (Bahn 2), pMA-CIC (Bahn 3), pA-CIC (Bahn 4), pM-CIC (Bahn 5), pMA-PrCIC
(Bahn 6), pA-PrCIC (Bahn 7), pM-PrCIC (Bahn 8), pCIC, pCaf1M (Bahn
9), pCIC und pCaf1MA (Bahn 10) transformiert sind. B. Immun-Blots
desselben Gels, analysiert mit polyclonalem anti-hIL-1β-Kaninchenantikörper.
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9.
Graphische Darstellung von Plasmiden, die für Operon-ähnliche Co-Expressionsversuche mit Caf1M, Caf1A
und CIC konstruiert wurden. pFMA und pCIC sind zum Vergleich angegeben.
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10.
Nachweis von CIC im Periplasma mit monoclonalen anti-IL-Antikörpern unter
Verwendung von ELISA. Nachweis von CIC in Verdünnungen eines Periplasma-Aliquots
von Kontrollzellen, die pTrc99 mit Plasmid (Dreiecke) tragen, von
Zellen, die pCIC (Kreise) tragen, und von Zellen, die sowohl pCIC
als auch pCaf1AM (Quadrate) tragen.
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11.
Konstruktion von pFGMF1- und pFRF275-Plasmiden, die das scaf-GMCSF-Caf1- und scaf-IL1ra-Caf1-Fusionsprotein
codieren.
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12.
Fraktionierung von Proteinen, die in JM101-Zellen mit den Plasmiden
pFGMF1 (Bahnen 3, 4, 7, 8), pFRF275 (Bahnen 1, 2, 5, 6) und pCaf1M
(Bahnen 2, 4, 6, 8) exprimiert werden. Nach der Induktion wurden
die Zellen präzipitiert,
mit Lysozym in Puffer resuspendiert und auf Eis 1 Stunde inkubiert,
gefolgt von 1 min Beschallung. Lösliche
und unlösliche
Proteine wurden durch Zentrifugation getrennt, unlösliche Fraktion Bahnen
1–4, lösliche Fraktion
Bahnen 5–8.
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13. Expression des scaf1-GMCSF-Caf1-Fusionsgens.
A. SDS-PAGE-Analyse
von periplasmatischen Proteinen, die von Zellen, die pFGMF1 (Bahn
1), pFGMF1 und pCaf1M (Bahn 2) und pFGM13 (Bahn 3) beherbergten,
gewonnen werden. B. Protein-Immun-Blot, analysiert mit polyclonalen
anti-GMCSF-Kaninchenantikörpern. Bahnen
1, 2 – Gesamtzellproteine,
Bahnen 3–5 – periplasmatische
Proteine. Die Proteinfraktionen wurden von Zellen erhalten, die
pFGMF1 (Bahn 1, 4), pFGMF1 und pCaf1M (Bahn 2, 3) und pFGM13 (Bahn
5) beherbergten. C. Immunblot von periplasmatischen Proteinen, die
mit polyclonalem anti-Caf1-Kaninchenantikörper analysiert wurden. Die
Zellen produzierten GMCSF-Caf1-Fusionsprotein
ohne (Bahn 1) oder mit (Bahn 2) dem Caf1M-Chaperon.
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14. Expression des scaf1-IL1ra-Caf1-Fusionsgens.
A. SDS-PAGE von periplasmatischen Proteinen, die von Zellen, die
pFRF275 allein (Bahn 1) oder mit pCaf1M (Bahn 2) beherbergten, gewonnen
wurden. B. Immun-Blot desselben Gels, analysiert durch polyclonale
anti-IL1ra-Ziegenantikörper.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Sezernierung von Proteinen durch Gram-negative
Bakterien durch Adhesine über
den Chaperon/Usher-Pfad erzielt werden. Die periplasmatischen Chaperone
des Systems:
- • Vermitteln die Trennung von
entstehenden translozierten Untereinheiten aus der inneren Membran
heraus und in das Periplasma;
- • Helfen
bei der Faltung entstehender Untereinheiten in eine natürliche Konformation;
- • Schützen die
Untereinheiten vor proteolytischem Abbau.
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Das
Periplasma von Wildtyp-Bakterienstämmen enthält Oxidoreduktasen und zusätzliche
Chaperone (Disulfidbindungs-Isomerase, DsbA und C, Peptidyl-prolyl-cistransisomerase,
RotA, SurA und FkpA), die für die
korrekte Faltung von Proteinen wichtig sind.
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Das
caf-Operon ist im Vergleich mit der Größe der Operons, die zu den
meisten anderen extrazellulären
Sezernierungssystemen gehören,
das einfachste Operon (Karlyshev, A.V. et al. (1994) in Biological
Membranes: Structure, Biogenesis and Dynamic. NATO-ASI-Reihe, Bd.
H-82, Op den Kamp, J.A.F., Hrsg., S. 321–330, Springer-Verlag. Berlin).
Es umfasst ein caf1R, das einen Transkriptionsregulator codiert,
das strukturelle Gen für
das Caf1-Polypeptid (Galyov, E. E. et al. (1990) FEBS Lett. 277,
230–232)
und zwei Gene, die Produkte für
die spezifische Sezernierung von Caf1 codieren – das periplamatische Caf1M-Chaperon
(Galyov, E. E. et al. (1991) FEBS Lett. 286. 79–82) und äußeres Caf1A-Membranprotein
(Karlyshev, A.V. et al. (1992) FEBS Lett. 297. 77–80).
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Caf1-Polypeptid
wird mit einer spaltbaren 20As-SP synthetisiert. Nach der Translokation über die
innere Membran (voraussichtlich über
den sec-Weg) bindet Caf1M an reifes Caf1 und schützt es vor proteolytischer
Spaltung, indem es seine Faltung und ebenso seine Freisetzung von
der inneren Membran unterstützt (Zav'yalov, V. et al.
(1997) Biochem. J., 324, 571–578;
Chapman D. et al. (1999) J. Bacteriology, im Druck). Die Interaktion
der Untereinheit mit Caf1 M-Chaperon stimuliert dann ein Signal
für die
Interaktion mit dem OM-Protein Caf1A und Caf1A transloziert dann
Caf1 an die Zelloberfläche.
Auf der Oberfläche
angeordnetes Caf1 bildet eine amorphe, kapselähnliche Struktur auf der Oberfläche der
Bakterien. Diese Oberflächenstruktur
kann mit den Bakterienzellen gut gewonnen und von der Oberfläche abgewaschen
werden, so dass man eine relativ reine Herstellung des Caf1-Proteins
erhält.
Caf1M-Chaperon und Caf1A-Usher sind für die Caf1-Untereinheit spezifisch und von diesem
Gesichtspunkt her nicht für
eine Sezernierung von heterologen Proteinen geeignet. Überraschenderweise
wurde jedoch in der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die
Fusionen von drei verschiedenen heterologen Proteinen mit dem Caf1-Protein
in löslicher,
biologisch aktiver Form sezerniert und vor proteolytischem Abbau
geschützt
werden, wenn sie gleichzeitig mit dem Caf1M-Chaperon exprimiert
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann das Caf-System für:
- • die
Herstellung von rekombinanten, heterologen Proteinen im Periplasma
von Bakterien in einer löslichen, biologisch
aktiven Konformation;
- • Oberflächen-Display
von gesamten rekombinanten heterologen Proteinen auf Gram-negativen
Bakterien – zur
Gewinnung von heterologen abgeschwächten Lebendvakzinen, Konstruktion
von Ganzzellliganden, Ganzzell-Biokatalysatoren, Reinigung von rekombinantem
heterologem Protein von der Zelloberfläche durch Waschen von Fusionsprotein
aus der Zelloberfläche
oder proteolytischen Spaltung von Fusionsprotein;
- • Oberflächen-Display
von heterologen Aminosäuresequenzen
(Epitopen) in der Caf1-Untereinheit und Verwendung als Ligand, Impfstoffkandidat,
etc. angewendet werden.
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Mögliche Anwendungen des caf-Systems:
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- 1. Caf1SP-Export über die IM: Wie viele andere
sekretorische Proteine kann die Caf1-Signalsequenz direkt für die Sezernierung
von Proteinen über
die innere Bakterienmembran verwendet werden. Sie enthält an ihrem
C-Terminus keine positiv geladenen Reste, die den Export beeinträchtigen
könnten,
und kann deshalb direkt verwendet werden. Da das sezernierte Proteine
dem Sec-Pfad zum Periplasma folgen würde, würde die Exporteffizienz des
heterologen Proteins auch von den Eigenschaften des zu sezernierenden Proteins
abhängen.
Insbesondere würde
die Effizienz der Sezernierung von dem N-Terminus des reifen Polypeptids,
der Abwesenheit langer potenzieller Ankersequenzen innerhalb des
sezernierten Proteins und der Abwesenheit von Proteinfaltung vor
dem Export abhängen.
Den ersten beiden Merkmale kann man sich durch Verändern der
relevanten Sequenzen zuwenden. ,Prämatures' Falten ist schwerer zu kontrollieren, obwohl
ein Überschuss
an cytosolischem SecB-, GroEL-, DnaK-Chaperon in einigen Beispielen
die Faltung verzögern
kann. Nach der Translokation über
die IM und SP-Spaltung würde
die Freisetzung des heterologen Proteins von der IM und die Faltung
des Proteins wieder von den Eigenschaften des heterologen Proteins
selbst abhängen.
- 2. Caf1 M-Chaperoneinführung
im Periplasma: Das caf-System hat den zusätzlichen Vorteil, dass es ein periplasmatisches
Chaperon einschließt,
das spezifisch an die Caf1-Untereinheit bindet. Caf1 verhindert den
Abbau der Caf1-Untereinheit,
wahrscheinlich über
verstärkte
Faltung und Freisetzung von der IM. Die Chaperonerkennung findet über den
C-Terminus der Caf1-Untereinheit statt, obwohl eine Interaktion
mit anderen Teilen der Caf1-Untereinheit auch für die Hochaffinitätsbindung
benötigt
werden kann. Somit kann die Fusion der Caf1- Untereinheit C-terminal zu dem Protein,
das für
die Freisetzung bestimmt ist, die Faltung des heterologen Proteins
stimulieren, die Freisetzung des Proteins von der IM unterstützen, ihre
Löslichkeit
erhöhen
und die Aggregation (Bildung von periplasmatischen Einschlusskörpern) sowie
den proteolytischen Abbau verhindern.
- 3. Caf1A-Export von heterologen Proteinen extrazellulär über die äußere Membran:
Das Caf1M-Chaperon lenkt auch Caf1 zum OM-Sekretin Caf1A. Nach der
Interaktion des Komplexes mit Caf1A-Sekretin wird das Caf1 über die äußere Membran
transloziert und bildet eine große polymere Struktur auf der
Zelloberfläche – verankert über Caf1A.
Für den
Fall, dass die Verankerung nicht gewünscht wird, kann eine geeignete
Mutante von Caf1 hergestellt werden. Somit würde der Einschluss von Caf1A
in dem Expressionsvektor eine Lenkung des rekombinanten Proteins
zum Caf1A-Sekretin erlauben.
- 4. Hybridproteine, die durch dieses System exportiert werden,
könnten,
um Caf1 zu entfernen, durch Einführen
einer geeigneten Spaltstelle zwischen Caf1 und dem Protein von Interesse
proteolytisch gespalten werden. Für Proteine, die auf der Zelloberfläche von
E. coli angeordnet sind, stellt dies ein äußerst wirksames Verfahren zur
Reinigung aus isolierten Zellen bereit. Auf der Zelloberfläche lokalisiertes
Hybrid könnte ebenfalls
für die
Impfstoffherstellung, Ligandenbindung oder als Ganzzell-Biokatalysator
verwendet werden. Proteine, die von der Zelle sezerniert oder vom
Periplasma gewonnen werden, würden
bereits in einer hoch gereinigten Form vorliegen. Alle Proteine,
die durch dieses System sezerniert werden, würden dem Periplasma ausgesetzt
werden, das das Milieu für
die korrekte Faltung von sezernierten Proteinen bereitstellt. Verwendet
man dieses System, so würde
die Wahrscheinlichkeit der Faltung in ein funktionelles Protein/eine
funktionelle Domäne
auf Grund der Interaktion mit dem Caf1M-Chaperon für einige
Fusionsproteine weiter erhöht.
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Zusätzlich zur
Sezernierung ganzer Proteine oder Domänen als eine N-terminale Fusion
an die Caf1-Untereinheit (oder möglicherweise
einer kleineren Domäne
davon), wird sich zweifellos auch zeigen, dass kurze Epitope in
zulässige
Stellen innerhalb der Caf1-Untereinheit inseriert werden können was
ein Oberflächen-Display
von Epitopen erlaubt. Ähnlich
können
kurze Peptide in die FGL-Stelle
des Caf1M-Chaperons inseriert werden.
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Zusammenfassung
möglicher
Vorteile des caf-Systems, wie bei der heterologen Sezernierung in Gram-negativen
Bakterien angewendet:
- • Trotz der Tatsache, dass Protein
hIL-1β im
Periplasma unlöslich
ist und ein Fusions-hIL-1β-Caf1
auch unlöslich
ist, führte
die Co-Expression mit dem Caf1M-Chaperon überraschenderweise zu einem
löslichen Produkt.
Somit katalysiert das Caf1M-Chaperon die Faltung, nicht nur die
der Träger-Caf1-Domäne, sondern
auch die der IL-1β-Domäne, was
eine Freisetzung von der Membran und die Bildung eines prozessierten
löslichen
Produkts ergibt. Auf Grund der korrekten Faltung wird das heterologe
Fusionsprotein nicht abgebaut und häuft sich in großen Mengen
an. D.h. Caf1M kann die Faltung, die Membranfreisetzung und die
Löslichkeit
von heterologen Polypeptiden, die als Caf1-Fusionsproteine exprimiert
werden, stimulieren:
- • Während erhältliche
Systeme des Oberflächen-Displays
ganzer Proteine in E. coli Probleme des Integritätsverlusts der äußeren Membran
und Begrenzungen hinsichtlich des Ausmaßes der Faltung des exportierten
Proteins haben, hat das caf-System solche Begrenzungen nicht. Das
Fusionsprotein wird an die Zelloberfläche verankert oder als lösliches
Protein, ohne die Membran aufzubrechen, freigesetzt. Ähnlich folgt die
Anordnung nicht dem Faltungsweg äußerer Membranproteine
und ein vollständig
gefaltetes Fusionsprotein wird exportiert;
- • Option
der einfachen Expression großer
Mengen an rekombinantem Protein im Periplasma (Caf1M allein) oder
an der Zelloberfläche/in
das Medium (Caf1M + Caf1) unter Verwendung desselben Systems;
- • Einfache
Reinigung von der Zelloberfläche
durch proteolytische Spaltung oder Gewinnung in großen Mengen
von periplasmatischen Fraktionen (welche auch immer bevorzugt werden);
- • Ausgesprochen
einfach im Vergleich mit anderen potenziellen extrazellulären Sezernierungsvektoren
unter Verwendung von nur einem periplasmatischen Chaperon (Caf1M)
und äußerem Membranprotein (Caf1A);
- • Fähigkeit,
extrazellulär
ein ganzes Protein oder einen Teil davon zu sezernieren
- • Transiente
oder permanente periplasmatische Lokalisierung von Fusionsprotein
erlaubt die korrekte Faltung und Oxidation von sekretorischen Proteinen.
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Die
Erfindung ist weiterhin hier im Folgenden mit spezifischen, nicht-limitierenden Beispielen
veranschaulicht. Die Beispiele beschreiben die Sezernierung der
Fusionsproteine (Signalpeptid von Caf1)-(reifes menschliches IL-1β)-(reifes
Caf1), (Signalpeptid von Caf1)-(reifes GM-CSF)-(reifes menschliches
Caf1) und (Signalpeptid von Caf1)-(reifes menschliches IL-1ra)-(reifes
Caf1), die in Escherichia coli gleichzeitig mit dem periplasmatischen
Chaperon Caf1M und dem Usher/Sekretinprotein Caf1A exprimiert werden,
als die Beispiele der Verwendung des Systems. Sogar obwohl die Beispiele
die Sezernierung von drei Proteinen beschreiben, ist es offensichtlich,
dass jedes andere Protein unter Verwendung dieses Systems sezerniert
werden kann. Zusätzlich,
obwohl E. coli als Wirts-Bakterie verwendet wird, die das Expressionssystem
in diesen Beispielen enthält,
ist es offensichtlich, dass auch andere Zellen, die geeigneten periplasmatischen
Raum für
die Beherbergung des caf-Expressionssystems haben, verwendet werden
können.
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BEISPIEL 1
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Fusion von hIL-1β mit dem
Signalpeptid des Caf1-Proteins
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Das
Caf1-Signalpeptid (s.p.Caf1) wurde in drei
Varianten mit hIL-1β fusioniert
(2). 1. s.p.Caf1-hIL-1β war eine
direkte Fusion, wobei die letzte Aminosäure des Caf1-Signalpeptids
mit der ersten Aminosäure
von hIL-1β verbunden
war. 2. s.p.Caf1(–2)-hIL-1β war eine direkte Fusion mit
einer Mutation im Caf1-Signalpeptid Asn(–2)Asp. 3. s.p.Caf1(+3)hIL-1β war die
Fusion, die in der Verbindungsregion drei N-terminale Aminosäuren von
reifem Caf1 enthielt, um die natürliche
Prozessierungsstelle zu erhalten.
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Hier
und danach wurden DNA-Manipulationen und die Transformation von
E. coli gemäß Maniatis,
T. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor durchgeführt. Restriktionsenzyme,
Mungbohnen-Nuclease und T4-DNA-Ligase wurden von Promega (USA) bezogen.
Taq-DNA-Polymerase (Hytest, Finnland) wurde für Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Versuche
verwendet. Nucleotidsequenzierung wurde unter Verwendung des TagTrack-Sequenzierungskits
(Promega, USA) durchgeführt.
Die Elution von DNA-Fragmenten von Agarosegelen wurde mit dem USBClean-Kit
(USB, USA) durchgeführt.
Folgende Oligonucleotide wurden in den BEISPIELEN 1 und 2 verwendet:
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Die
genetischen Konstrukte, die drei Fusionsproteine s.p.Caf1-hIL-1β codieren,
wurden gemäß dem Schema
in 2 hergestellt. Das EcoRI-PstI-Fragment (etwa 110
Bp), das die untranslatierte Caf1-5'-Region codiert, und der N-terminale
Teil des Caf1-Signalpeptids mit der Mutation Asn(–2)Asp wurde
durch PCR unter Verwendung von CAF-RI und IL-Pst-Oliogonucleotiden
und des Matrizen-Plasmids pKM4 (Karlyshev, A. V., et al. (1992)
FEBS Letters 297, 77–80)
erhalten, gefolgt von einer Spaltung des PCR1-Produkts mit EcoRI
und PstI. Das PstI-HindIII-Fragment, das den C-terminalen Teil der
Caf1-Signalpeptidverbindung mit dem N-Terminus von hIL-1β codiert,
wurde durch PCR erhalten, wobei CAF-PST- und IL-Primer-, Oligonucleotide
und das Matrizenplasmid pPR-TGATG-hIL-1β-tsr (Mashko, S.V. et al. (1991)
Gene 97, 259–266)
verwendet wurden. Das PCR2-Produkt wurde mit PstI und HindIII gespalten.
Die beiden Fragmente wurden mit einem pUC19/EcoRI-HindIII-Vektorfragment
miteinander ligiert. Die Nucleotidstruktur der entstandenen EcoRI-HindIII-Insertion wurde
durch DNA-Sequenzierung überprüft. Das
wie beschrieben erhaltene EcoRI-HindIII-Fragment und das HindIII-BamHI-Fragment,
das von pPR-TGATG-hIL-1β-tsr
isoliert wurde, wurden mit dem Eco-RI-BamHI-Vektorfragment von pUC19ΔHindIII (einem
Derivat von pUC19, bei dem die HindIII-Stelle durch Ausfüllen von klebrigen Enden gefolgt
von Ligierung der stumpfen Enden gelöscht wurde) miteinander ligiert.
Das so erhaltene EcoRI-BamHI-Fragment codierte das s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Fusionsprotein.
Die Punktmutation G zu A, die das s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Gen in das
Caf1-hIL-1β-Gen
konvertiert, wurde unter Verwendung des BLUNT-Oligonucleotids und
von zwei flankierenden Primern (M13-Sequenzprimer und IL-Primer) mit pUC19ΔHindIII/s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Plasmid als Matrize durch ein
zweistufiges PCR-Verfahren erzielt (Landt, O., Grunert, H.-P. und
Hahn, U. (1990) Gene 96, 125–128).
Im ersten Schritt wurde ein Zwischen-PCR-Produkt von dem mutagenen BLUNT-Oligonucleotid
und dem M13-Sequenzprimer erhalten. Nach der Reinigung von einem
Agarosegel wurde das Zwischen-PCR-Produkt mit dem IL-Primer im zweiten
PCR-Schritt verwendet. Letzteres PCR-Produkt wurde mit EcoRI und HindIII
gespalten, gefolgt von einer Ligierung in das Vektorfragment, das
durch Restriktion des pUC19ΔHindIII/s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Plasmids mit denselben Enzymen hergestellt
wurde. Somit wurde das EcoRI-HindIII-Fragment, das die Asn(–2)Asp-Mutation
in dem s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Fusionsprotein bereitstellt,
durch das entsprechende Fragment, das das natürliche Caf1-Signalpeptid codiert, ersetzt, und das s.p.Caf1-hIL-1β-Gen wurde erhalten. Das s.p.Caf1(+3)hIL-1β-Gen wurde auf ähnliche
Weise unter Verwendung des 3AA-Oligonucleotids
als mutagenen Primer und pUC19ΔHindIII/s.p.Caf1-hIL-1β-Plasmids als Matrize konstruiert.
In allen drei Hybridgenen wurden die EcoRI-HindIII-Fragmente sequenziert,
um korrekte Nucleotidstrukturen nachzuweisen.
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EcoRI-BamHI-Fragmente,
die die Fusionsproteine codieren, wurden von Plasmiden, die vorstehend beschrieben
sind, ausgeschnitten und in pKKmod (ein Derivat von pKK223-3 (Pharmacia),
das durch Deletion von BamHI- und SalI-Stellen in der tet-Genregion
und durch Ersetzen des pKK 223-3-Polylinkers mit dem pUC18-Polylinker hergestellt
wurde, überführt. Die
Expressionsplasmide pKKmod/s.p.Caf1(–2)hIL-1β, pKKmod/s.p.Caf1-hIL-1β und pKKmod/s.p.Caf1(+3)hIL-1β wurden somit
erhalten und E. coli JM105 [F' traD36]lacqΔ(lacZ)M15,
proA+B+/thi, rpsL(Str+), endA, sbcB, sbcC, hsdR4(rk– mk+), Δ(lac–proAB)]
(NE Biolabs) wurden mit diesen Plasmiden transformiert.
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Die
Expression und Prozessierung von s.p.Caf1-hIL-1β-, s.p.Caf1(–2)hIL-1β- und s.p.Caf1(+3)hIL-1β-Fusionsproteinen
wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Immun-Blotting überwacht.
Die rekombinanten E. coli-Stämme
wurden bei 600 nm auf etwa 0,5 AU gezüchtet, IPTG (0,5 mM) wurde
zugesetzt und die Zellen wurden weiter gezüchtet. Lösliche und unlösliche Proteinen
wurden als getrennte Fraktionen analysiert, die wie folgt erhalten
wurden. Nach bestimmten Zeitintervallen wurden Proben der Wachstumskultur
mit einer festgelegten Menge an Zellen gezogen, die Zellen wurden
präzipitiert
und in 25 mM Tris-Cl, pH 7,5/100 mM NaCl/1 mM EDTA gewaschen. Erneut
präzipitierte
Zellen wurden in 50 mM H3PO4-Tris,
pH 6,8, suspendiert und unter Verwendung eines Labsonic U Generator
(B. Braun Diessel Biotech) beschallt. Die beschallten Proben wurden bei
14.000 g 10 min zentrifugiert. Der Überstand enthielt lösliche Proteine.
Unlösliche
Proteine wurden mit dem SDS-PAGE-Probenpuffer,
der 2% SDS und 5% β-Mercaptoethanol
enthielt, vom Pellet extrahiert.
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Hier
und danach wurde eine 10–15%
SDS-PAGE der Proteine sowohl von den löslichen als auch von den unlöslichen
Fraktionen gemäß dem Laemmli-Verfahren
in Mini-PROTEAN II-Geräten
(BIO-RAD) durchgeführt.
Die Proteine wurden durch Elektro-Blotting in einer mini-Trans-Blot
Electrophoretic Transfercell (BIO-RAD) auf eine Hybond-C-Membran
(Amersham) überführt, gefolgt
von einem Immunnachweis. Die Ergebnisse der Immun-Blots wurden mit
dem ECL-Kit (Amersham) gezeigt. Polyclonale Kaninchen-Antikörper gegen
hIL-1β (Calbiochem)
und monospezifische Antikörper
gegen Caf1 wurden für
das Sichtbarmachen von IL-1β-
und Caf1-enthaltenden
Fusionsproteinen verwendet. Polyclonale Kaninchen-Antikörper gegen
Caf1M und polyclonale Maus-Antikörper
gegen Caf1A wurden für
den Nachweis von Caf1M bzw. Caf1A verwendet. Die Bindungen der primären Antikörper wurden
durch Kaninchen (Calbiochem)- und Maus (Amersham)-Konjugat sichtbar
gemacht.
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Eine
starke Expression wurde bei allen drei Fusionsproteinen (etwa 20–30% des
gesamten Zellproteins) beobachtet. In allen drei rekombinanten Stämmen enthielten
jedoch die Fraktionen an löslichen
Proteinen keine signifikanten Mengen an rekombinanten Proteinen
(3A und B, Bahnen 1–4). Das rekombinante hIL-1β-Protein wurde in
Fraktionen von unlöslichen
Zellproteinen (3A und B, Bahnen 6–9) entdeckt.
Ein zusätzliches
hIL-1β-enthaltendes
Protein war in allen drei Konstrukten deutlich zu sehen. Es war
höchstwahrscheinlich
ein Produkt einer ziemlich spezifischen Proteolyse von nicht prozessiertem
Fusionsprotein, das im Cytoplasma angereichert war.
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Die
direkte Fusion schien nicht prozessiert zu werden (3A und
B. Bahnen 7), wohingegen das Entfernen von Caf1-Signalpeptiden von
hIL-1β-Einheiten
in den beiden anderen Produkten beträchtliche Werte erzielte (3A und
B, Bahnen 8, 9).
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Um
die Sezernierung von prozessierten rekombinanten hIL-1β-Proteinen
zu erklären,
wurden periplasmatische Proteine durch osmotisches Schockverfahren,
wie folgt, von cytoplasmatischen Proteinen getrennt. Zellen, die
von 10 ml Wachstumsmedium präzipitiert
wurden, wurden in 200 μl
20% (Gew./Vol.) Saccharose/0,3 M Tris-HCl, pH 8,0/0,5 mM EDTA suspendiert
und 10 min bei Raumtemperatur gehalten. Mit Saccharose behandelte
Zellen, die durch Zentrifugation gewonnen wurden, wurden in eiskaltem
10 mM MgCl2/0,1 mM PMSF suspendiert und
10 min in Eiswasser inkubiert. Nach der Zentrifugation wurden periplasmatische Proteine
in Überstandfraktionen
gewonnen. Die Pellets wurden in 50 mM H3PO4-Tris, pH 6,8 suspendiert und nach der Zentrifugation
bei 14.000 g über
10 min beschallt. Diese Überstände enthielten
lösliche
cytoplasmatische Proteine. Die Aktivität des cytoplasmatischen Enzyms,
Glucose 6-Phosphat-Dehydrogenase, wurde als Kontrolle der Reinheit
der periplasmatischen Fraktion überprüft (Naglak
T. J. et al. 1990, 12, 603–611).
Die erhaltenen Proben der periplasmatischen Fraktion zeigten nicht
mehr als 0,25 % der cytoplasmatischen Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität.
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Western-Blot-Analyse
von periplasmatischen und löslichen
cytoplasmatischen Proteinen (4) zeigte,
dass nur kleine Teile der prozessierten Fusionsproteine in löslicher
Form in Periplasmen von s.p.Caf1(–2)hIL-1β- und s.p.Caf1(+3)hIL-1β-Expressionsstämmen gefunden wurden (4A,
Bahnen 1, 2). Kein prozessiertes Protein wurde im Periplasma des s.p.Caf1-hIL-1β-Expressionsstammes (4A,
Bahn 3) nachgewiesen. Prozessierte hIL-1β-Proteine waren in cytoplasmatischen
Fraktionen abwesend (4B).
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Die
erhaltenen Daten zeigen, dass die s.p.Caf1(–2)hIL-1β- und s.p.Caf1(+3)hIL-1β-Fusionsproteine
teilweise prozessiert waren (im Gegensatz zum Caf1-hIL-1β-Fusionsprotein).
Prozessierte Produkte wurden in das Periplasma sezerniert. Die Mehrheit
des prozessierten rekombinanten hIL-1β akkumulierte jedoch in unlöslicher
Form. Darüber
hinaus wird dieses unlösliche
Protein von der Flüssigphase
des Periplasmas verborgen, da es während der Trypsinbehandlung
permeabilisierter Zellen nicht abgebaut wird (5).
Eine Variierung der Wachstumstemperatur und der Konzentration des
Induktors erleichterte die Entfernung des Caf1-Signalpeptids und
die Sezernierung von hIL-1β nicht
(Daten nicht gezeigt).
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BEISPIEL 2
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Fusion von s.p.Caf1(–2)hIL-1β mit der
Caf1-Proteinsequenz und Expression von fusioniertem Protein in Gegenwart
von Chaperon- und Usher-Proteinen.
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Das
CIC (s.p. Caf-IL-1β-Caf)-Protein
wurde hergestellt, wobei die s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Aminosäuresequenz
(N-Terminus der Fusion) mit der Caf1-Proteinsequenz (C-Terminus
der Fusion) durch einen Spacer GlyGlyGlyGlySer, der dreimal wiederholt
wurde, verbunden wurde. Der Spacer wurde inseriert, um mögliche Konformationsprobleme
der beiden Proteine, die in CIC fusioniert waren, zu minimieren.
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Der
pCIC-Expressionsvektor wurde gemäß dem Schema
in 6 konstruiert. Der IL-Teil von CIC wurde unter
Verwendung von IL-Pst- und IL-BamHI-Oligonucleotiden als Primern und dem pUC19ΔHindIII/s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Plasmid als Matrize durch PCR
erhalten. Der Caf1-Teil von CIC wurde unter Verwendung von BamHI-Caf1
und Caf1-SalI-Oligonucleotiden als Primern und dem pKM4-Plasmid
als Matrize durch PCR erhalten. Die PCR-Produkte wurden, wie in 3 gezeigt, mit Restriktasen gespalten,
gefolgt von einer dreifachen Ligierung mit dem pUC19ΔHindIII/s.p.Caf1(–2)hIL-1β-Vektor, der durch Spaltung
mit PstI und SalI erhalten wurde. Um pCIC herzustellen wurde das
EcoRI-SalI-Fragment von dem pUC19ΔHindIII/CIC-Plasmid
ausgeschnitten und in den EcoRI-SalI-Vektor ligiert, der von dem pTrc99ΔNco-Plasmid
(einem Derivat von pTrc99a (Pharmacia), das durch Spaltung mit NcoI
gefolgt von Behandlung mit Mungbohnen-Nuclease und Ligierung der
stumpfen Enden erzeugt wurde) erhalten wurde.
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Nach
der IPTG-Induktion produzierten E. coli-JM105-Zellen, die pCIC beherbergten,
das CIC-Fusionsprotein, das erfolgreich prozessiert war. Eine präzise Entfernung
des Signalpeptids wurde durch N-terminale Sequenzierung des löslichen
periplasmatischen CIC (7) nachgewiesen. Es wurde jedoch
nur ein geringer Teil des reifen IL-1β-Caf1-Proteins durch ein osmotisches
Schockverfahren (8B, Bahn 1) extrahiert. Der Hauptteil
des Proteins wurde in der Membranfraktion (Daten nicht gezeigt), ähnlich dem
reifen hIL-1β,
gefunden.
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Die
Expression/Sezernierung von CIC in Gegenwart des Chaperons (Caf1M)
und des Usher-Proteins (Caf1A) wurde in zwei Systemen untersucht.
a) Caf1m- und Caf1a-Gene wurden auf ein pACYC-Plasmid platziert,
das mit dem pTrc99-Derivat, das CIC codiert, kompatibel ist. b)
caf1m-, caf1a- und cic-Gene zusammen bildeten ein künstliches
Operon.
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In
kompatiblen Plasmidversuchen wurden E. coli-JM105-Zellen gleichzeitig
mit pCIC und pCaf1M (einem Plasmid, der das caf1m-Gen unter dem
tac-Promotor in einem pACYC184-Derivat trägt, vgl. BEISPIEL 3) transformiert,
um den Einfluss des Chaperons auf die Sezernierung von hIL-1β-Fusionsprotein
zu untersuchen. Weiterhin wurde pCaf1MA, ein Caf1M-Caf1A-Expressions/Sezernierungsplasmid,
wie folgt gebildet. ApaLI-ApaLI-Fragment, das caf1m- und caf1a-Gene
unter dem trc-Promotor
enthielt, wurde von dem pFMA-Plasmid ausgeschnitten (Chapman D.,
et al. „Structural
and functional significance of the FGL-Sequence of the periplasmic
chaperone, Caf1M, of Yersinia pestis" J. Bacteriology, im Druck) und in den
Vektor ligiert, der durch Spaltung von pCaf1M mit ApaLI erhalten
wurde. E. coli-JM105-Zellen
wurden gleichzeitig mit pCIC und pCaf1MA transformiert, um eine
Co-Expression aller
drei Proteine zu erhalten.
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Verschiedene
Plasmide wurden konstruiert, um die Expression und Sezernierung
von CIC-, Caf1M- und Caf1A-Proteinen zu untersuchen, die von einem
künstlichen
Operon hergestellt wurden (9). Um das caf1-Gen
durch einen synthetischen SBEKP-Polylinker zu ersetzen, wurde durch
dreifache Ligierung eines pFMA/PstI-SpeI-Vektors, eines SpeI-PstI-Fragments
von pFMA und von SBEKP-1- und
SBEKP-2-Oligonucleotiden, die miteinander aneliert waren, ein pMA-Verbindung-Plasmid
erhalten. Durch Ausschneiden eines SalI-SalI-Fragments, das das
Caf1A-Protein codiert, wurde das Plasmid pM-Verbindung aus dem pMA-Verbindung-Plasmid
gewonnen, gefolgt von Selbst-Ligierung des Vektors. Durch Ausschneiden
eines BamHI-BamHI-Fragments, das den C-terminalen Teil von Caf1M-Protein
codiert, wurde ein pA-Verbindung-Plasmid aus dem pMA-Verbindung-Plasmid gewonnen.
Um den Caf1M-Translationsrahmen zu unterbrechen, wurde das Stopp-Codon
durch Ligierung eines selbst-komplementären STOP-Oligonucleotids in
die BamHI-Stelle inseriert. Die Insertion des STOP-Oligonucleotids
ergab den Verlust der BamHI-Stelle. Ein Fragment, das das CIC-Protein
codiert, wurde mit EcoRI und SalI von pCIC ausgeschnitten, in pBCSK+ (Stratagene, USA) cloniert und mit EcoRI
und KpnI gewonnen. Um pMA-CIC-, pM-CIC- und pA-CIC-Plasmide zu erhalten,
wurde das EcoRI-KpnI-Fragment in die entsprechenden Stellen von
pMA-Verbindung,
pM-Verbindung und pA-Verbindung cloniert. Ein pM-PrCIC-Plasmid unterschied
sich durch die Anwesenheit von zusätzlichem trc-Promotor vor dem
CIC-Gen von pM-CIC
und wurde wie folgt erhalten. Ein DNA-Fragment, das den trc-Promotor und die 5'-Region des cic-Gens
codierte, wurde unter Verwendung von TRC- und CAF-Pst-Oligonucleotiden
als Primer und pCIC als Matrize durch PCR erhalten. Das PCR-Produkt
wurde mit BglII und EcoRI gespalten, gefolgt von einer Ligierung
des BglII-EcoRI-Fragments, das den trc-Promotor codiert, in entsprechende
Stellen von pM-CIC. PMA-PrCIC und pA-PrCIC wurden durch Ligierung
des BglII-KpnI-Fragments von pM-PrCIC in entsprechende Stellen von
pMA-Verbindung und pA-Verbindung erhalten. E. coli NM522 [F', proAB, lacqΔ(lacZ)M15/supE,
thi-1, Δ(lac–proAB), Δ(hsdSM–mcr8)5,
(rk– mk–)]
(Stratagene, USA) wurde als Wirtsstamm für hierin beschriebene Plasmide
verwendet.
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Ähnliche
Ergebnisse wurden in beiden Co-Expressionsverfahren erhalten. Gleichzeitige
Expression von CIC und Caf1M erhöhte
die Konzentration des reifen CIC im Periplasma beträchtlich.
Die Ergebnisse zeigten, dass periplasmatisches molekulares Chaperon
eine Freisetzung des sezernierten Proteins von der inneren Membran
förderte
sowie den Abbau und unspezifische Aggregation von Protein verhinderte.
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In
Gegenwart von Caf1M wurde ein bedeutender Teil des reifen CIC-Proteins
in einer periplasmatischen Fraktion nachgewiesen (8B,
Bahnen 3, 4, 6, 7, 9, 10). Eine gesteigerte Menge an sezerniertem
und löslichem
CIC, das mit Caf1M coexprimiert wird, zeigt, dass das periplasmatische
molekulare Chaperon eine Freisetzung des sezernierten Proteins von
einer inneren Membran fördert.
Die kritische Rolle des Caf1-Teils in dem CIC-Protein bei dieser
Förderung
wurde in einem ähnlichen
Versuch mit einem Plasmid, das sich von pCIC durch die Deletion
von einem Basenpaar im Spacer unterschied, bewiesen. Die Deletion
ergab eine Rasterverschiebung des Caf-Teils des fusionierten Gens.
Es wurde keine hIL-1β-Sezernierung beobachtet,
wenn Zellen das mutierte Plasmid beherbergten (Daten nicht gezeigt).
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Caf1M
verhinderte den Abbau von CIC. Wie in 8B, Bahn
1 gezeigt, baute sich das reife CIC-Protein in der periplasmatischen
Fraktion schnell in eine verkürzte
Form mit einem Molekulargewicht von etwa 20–23 kDa ab. In Gegenwart von
Caf1M verschwand die verkürzte
Form (8B, Bahnen 3, 4, 6, 7, 10).
Die Menge der abgebauten Form entsprach der Menge an Caf1M. Zum
Beispiel wurde, wenn Caf1M in einer geringen Menge von pCaf1M exprimiert
wurde, die verkürzte
Form gefunden (8B, Bahn 9). Die Caf1M-Menge
war jedoch ausreichend, um eine Freisetzung des Fusionsproteins
von der Membran zu ermöglichen.
Der spezifische Abbau des reifen CIC fand an einer Stelle im Caf1-Teil
des Fusionsproteins statt, da die verkürzte Form gut durch die IL-Antikörper, jedoch
nicht durch die Caf1-Antikörper
nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt). Höchstwahrscheinlich war die
Spaltung auf die Wirkung von Protease DegP zurückzuführen, von der gezeigt wurde,
dass sie durch ungefaltete sezernierte kapsuläre oder Pilus-Untereinheiten
induziert wird und sie spaltet (Soto, G.E. et al. (1998) EMBO J.,
17, 6155–6167).
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Der
hIL-1β-Teil
von CIC, der in Gegenwart von Caf1M sezerniert wurde, war korrekt
gefaltet. Das reife CIC-Protein wurde mit monoclonalen Antikörpern gegen
hIL-1β in
einem ELISA (10) nachgewiesen. Der ELISA
wurde unter Verwendung von monoclonalen Maus-Antikörpern gegen
hIL-1β (HyTest,
Finnland) durchgeführt,
wie zuvor beschrieben wurde (Zav'yalov,
V. et al. (1997) Biochem. J., 324, 571–578).
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CIC
wurde auf eine Zelloberfläche
ausgeschieden, wenn es sowohl mit Caf1M als auch Caf1A exprimiert
wurde. Die Gegenwart des molekularen Chaperons und des Usher-Proteins
in Zellen, die mit pMA-CIC oder mit pCIC und pCaf1MA zusammen transformiert
wurden, wurde durch Immun-Blotting mit anti-Caf1M- und anti-Caf1A-Antikörpern bewiesen
(Daten nicht gezeigt). Um die Ausscheidung von CIC auf eine Zelloberfläche zu beweisen,
wurden Zell-Agglutinierungsversuche mit monoclonalem Retikulocyten-Diagnostikum
für den
Nachweis von Yersinia pestis (Middle Asian Research Institute, USSR)
durchgeführt.
Die E. coli-Zellen, die CIC, Caf1M, Caf1A exprimierten, waren in
der Lage, Retikulocyten mit oberflächengebundenen Antikörpern gegen
Caf1 in einer Konzentration von etwa 107 Zellen/ml
zu präzipitieren.
Darüber
hinaus wurde, gemäß ELISA,
durchgeführt
mit monoclonalen anti-hIL-1β-Antikörpern, eine
kleine Menge an hIL-1β im
Kulturmedium nachgewiesen.
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BEISPIEL 3
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Co-Expression von hGMCSF-Caf1-Fusionsprotein
und dem Chaperon
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Das
Expressionsplasmid für
das hGM-CSF-Caf1-Fusionsprotein basierte auf pFGM13, beschrieben in:
Petrovskaya L.E. et al. (1995) Russian Journal of Bioorganic Chemistry,
21, 785–791.
Das pFGM13-Plasmid enthielt ein synthetisches Gen, das hGMCSF mit
der Caf1-Signalsequenz (scaf1), cloniert in die HindIII- und XbaI-Stellen
von pUC19, codierte. Die Transkription wurde durch den lac-Promotor
kontrolliert und war mit IPTG induzierbar. Die Translation des scaf1-gmcsf-Gens
in pFGM13 begann am ersten Methionin-Codon des lacZ-Gens und verwendet
seine Shine-Dalgarno-Sequenz. Die primäre Struktur der Signalsequenz
(scaf1), die durch dieses Gen codiert wird, unterschied sich vom
Wildtyp 1 an ihrem N-Terminus, der sieben Extra-Reste vom β-Galaktosidase-N-Terminus
enthielt.
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Die
Konstruktion des pFGMF1-Plasmids, das das gmcsf-caf1-Gen codiert,
wird in 11 gezeigt. Das scaf1-gmcsf-Gen
von pFGM13 wurde für
die folgende Clonierung des Fragments von pCIC, das einen Spacer (4GlySer)3 und die Caf1-Codierungsregion enthielt, modifiziert.
Die Kpn2I-Stelle wurde am 3'-Terminus
des gmcsf-Gens durch PCR unter Verwendung von zwei Primern (5'ATCGGAAATGTTCGACCTTCAAG
und 5'ATTATTCCGGACTCCTGCACTGGTTCCCAGC)
und pFGM13 als Matrize eingeführt.
Pfu-DNA-Polymerase wurde für
maximale Genauigkeit verwendet. Das PCR-Fragment wurde mit Kpn2I
behandelt, gefolgt von Ligierung in das große EcoRV-SalGI-Fragment von
pFGM13 zusammen mit dem Kpn2I-SalGI-Fragment von pCIC. Das Endplasmid
(pFGMF1) enthielt das Gen, das einen Hybrid-Vorläufer codierte, der aus der
scaf1-Signalsequenz, GMCSF mit 2 N-terminalen Aminosäureveränderungen
(Ala2Pro3 zu Asp),
einem Ser(4GlySer)3-Spacer und Caf1 bestand.
Die Plasmidstruktur wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung
der amplifizierten Regionen bestätigt.
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Die
Expression des Hybrid-Vorläufergens
in JM101-E. coli-Zellen, die pFGMF1 beherbergen, wurde mit 0,2 mM
IPTG induziert, nachdem die Zellkultur eine optische Dichte von
0,5–0,8
erreichte. Das Wachstum mit IPTG dauerte 3 weitere Stunden an. Zellen
aus 1 ml wurden durch Zentrifugation aufgefangen und das Pellet
(gesamte Zellproteinprobe) wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert.
Eine Fraktion von periplasmatischen Proteinen wurde durch das Verfahren
mit kaltem osmotischem Schock (vgl. BEISPIEL 1) von dem Zellpellet,
das vom Rest der Kultur erhalten wurde, isoliert.
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SDS-PAGE-Analyse
der gesamten Zellproteinprobe von E. coli-Zellen, die pFGMF1 beherbergen, zeigte
die Gegenwart einer großen
Menge des Fusionsproteins mit einer molekularen Masse, die dem hGMCSF-Caf1-Fusionsprotein (31
kDa) entsprach. Als die Zellen durch Beschallung zerstört wurden,
wurde dieses Protein in einer unlöslichen Fraktion geortet (12,
Bahnen 3, 4).
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Die
Untersuchung von periplasmatischen Extrakten durch SDS-PAGE und
Western-Blot zeigte, dass etwas hGMCSF-Caf1-Fusion zum Periplasma
transloziert wurde. Ihre elektrophoretische Mobilität war die
gleiche wie die des unlöslichen
Proteins. Die Fusion interagiert sowohl mit polyclonalen anti-hGMCSF-
als auch anti-Caf1-Antikörpern (13B, Bahn 1; 14C, Bahn 1). Das Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 18 kDa wurde ebenfalls mit anti-hGMCSF-Antikörpern (13B, Bahn 4) nachgewiesen. Wir können annehmen, dass
dieses Protein das Produkt des proteolytischen Abbaus der hMCSF-Caf1-Fusion
ist.
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Um
den Einfluss des Caf1M-Chaperons auf die Expression des gmcsf-caf1-Gens zu untersuchen, wurde
das caf1m-Gen in den pACYC-trx inseriert, einen Vektor mit einer
geringen Kopiezahl und kompatibel mit pBR322-basierten Plasmiden.
PACYC-trx war ein pACYC184-Derivat, das das trx-Gen unter der Kontrolle des
tac-Promotors enthielt. Die Trx-codierende Region, flankiert von
KpnI und Alw44I-Stellen, wurde wie folgt durch das DNA-Fragment
ersetzt, das das Caf1 M-Chaperon codiert. Das caf1m-Gen wurde durch
PCR amplifiziert, die die Pfu-DNA-Polymerase,
zwei Primer (GTTGTCGGTACCATTCCGTAAGGAGG und 5'-GTTAACGTGCACACAGGAACAGC)
und das pFS2-Plasmid (Galyov EE et al. (1990) FEBS Letters. 277, 230–232) enthielt.
Das PCR-Fragment wurde mit KpnI und Alw44I behandelt und in das
große
KpnI-Alw44I-Fragment von pACYC-trx cloniert. Das erhaltene Plasmid
wurde pCaf1M genannt.
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JM101-E.
coli-Zellen wurden sowohl mit pFGMF1- als auch mit pCaf1M-Plasmiden transformiert,
gefolgt von einer Analyse der rekombinanten Zellproteine, wie vorstehend
beschrieben. Co-Expression des Chaperon-Gens von dem Caf1M-Plasmid führte zu
einer deutlichen Zunahme der Menge des hGMCSF-Caf1-Fusionsproteins voller
Länge im
Periplasma (13B, Bahn 3; 13C, Bahn 2). Die Menge
an Protein von 18 kDa, das Produkt des proteolytischen Abbaus der
hGMCSF-Caf1-Fusion nahm ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass Caf1M
die korrekte Faltung von hGMCSF-Caf1 fördert und die Stabilität des Fusionsproteins
verstärkt.
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BEISPIEL 4
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Co-Expression von hIL1ra-Caf1-Fusionsprotein
und dem Chaperon
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Basierend
auf pFGM13 wurde das pFRA275-Plasmid erhalten. In diesem Plasmid
enthielt der terminale 5'-Teil
der reifen, hIL-1ra-codierenden-Region die AlaAspAsp-Codierungssequenz
an Stelle des ersten Arg-Codons, um die N-terminale positive Ladung von hIL1ra
zu neutralisieren. Der lac-Promotor kontrollierte die Expression
des scaf-hil1ra-Gens in pFRA275.
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Das
Expressionsplasmid pFRF275, das das scaf-hil1ra-caf1-Gen codierte,
wurde, wie in 11 gezeigt, konstruiert. Am
3'-Ende des hil1ra-Gens
wurde die Kpn2I-Stelle des pFRA275-Plasmids mit den Primern 5'-GGAATCCATGGAGGGAAGAT und 5'-ATTATTCCGGACTCGTCCTCCTGAAAGTAG durch
PCR eingeführt.
Das amplifizierte Fragment wurde mit NcoI und Kpn2I geschnitten
und mit dem großen
HindIII-Kpn2I-Fragment von pFGMF1 zusammen mit dem HindIII-NcoI-Fragment
von pFRA275 ligiert. Das entstandene Plasmid (pFRF275) enthielt
ein Gen, das den Hybrid-Vorläufer
codiert, der aus der scaf-Signalsequenz, hll-1ra, mit den vorstehend
erwähnten
Aminosäureveränderungen,
einem Ser(4GlySer)3-Spacer und Caf1 besteht.
Die Plasmidstruktur wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung
von amplifizierten Regionen bestätigt.
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Die
Expression des scaf-hil1ra-caf1-Gens in JM101-E. coli-Zellen wurde
wie in BEISPIEL 3 beschrieben, analysiert. Wurden die Zellen mit
pFRF275 allein transformiert, häufte
sich das hIL1ra-Fusionsprotein hauptsächlich in einer unlöslichen
Form (35 kDa, 12, Bahnen 1, 2) an. Ein Teil
des Fusionsproteins wurde jedoch in das Periplasma überführt, wo
es dem Abbau unterworfen wurde (14B,
Bahn 1). Wenn pFRF275 und pCaf1M (vgl. BEISPIEL 3) gleichzeitig
in rekombinanten Zellen vorhanden waren, verringerte Caf1M die Menge
an spaltbaren Produkten deutlich (14B,
Bahn 2).
